CN113388025B - 多肽、组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及多肽、组合物及其应用。该多肽如(ⅰ)或(ⅱ)所示：(ⅰ)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的序列；(ⅱ)将如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽。该多肽具有抗细胞死亡的作用效果。

Description

多肽、组合物及其应用
技术领域
本申请总地涉及生物制药领域，具体涉及小分子多肽的开发及其应用、包括该多肽的剂型、用量、疾病的治疗效果。
背景技术
多肽是由多个氨基酸通过肽键连接而形成的一类化合物，通常由10-100个氨基酸分子组成，其连接方式与蛋白质相同，相对分子质量低于10000。近年来，随着多肽合成技术的发展和成熟，多肽药物已成为药物研发的热点之一，其因安全性高、适应证广、疗效显著，已广泛应用于肿瘤、心脑血管疾病、肝炎、糖尿病、艾滋病等疾病的预防、诊断和治疗。并且这些多肽在人体生理学方面发挥着关键作用，其可作为激素、神经递质、生长因子、离子通道配体，或具有抗感染作用。
但并未见多肽药物对治疗细胞死亡相关疾病的报道。
败血症是由细菌等多种病原微生物感染引起的多器官功能性障碍疾病。病死率死亡率极高。败血症是机体面对微生物感染而表现出来的从免疫过分增强到免疫过分抑制的过程。目前临床上对败血症的治疗主要依赖抗生素及其他辅助治疗措施，而这些手段往往因抗药性、抗生素毒性和败血症复杂性等不能发挥很好的治疗作用。败血症可以分为早期和晚期，早期机体针对微生物感染会产生大量的趋化因子，细胞因子等，而晚期的败血症，免疫系统会出现大量的细胞死亡，进而引起免疫器官等多器官功能性障碍。且这种凋亡发生在不同的组织器官中，包括肝脏、脾脏、胸腺、淋巴结和肠相关淋巴组织等。败血症引起的细胞凋亡既能通过死亡受体介导的途径，也能通过线粒体介导的途径。大量的研究发现抑制免疫器官及免疫细胞的凋亡能够提高败血症的存活率。
发明内容
随着多肽类药在临床上应用范围的不断扩大，多肽合成相关技术(如固相多肽合成技术的产生)、设备和工艺等方面的迅速发展，使得多肽药物研发成本和生产成本大幅度下降。其次相对于蛋白和单抗药，多肽化学合成技术现在已经成熟，且产品容易与杂质分离，纯度高，容易引入非天然氨基酸进行改造。
本申请的目的在于提供多肽的开发及药理学作用、包括该多肽剂型、小鼠败血症模型上的治疗效果。本申请所开发的多肽已经完成药物研发，用药计量，半致死剂量及小鼠败血症适应症的疗效研究。
本申请提供了一种多肽，所述多肽如(ⅰ)或(ⅱ)所示：(ⅰ)氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示的序列；(ⅱ)将如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽。
可选地，根据前述的多肽，所述多肽为将如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少一端经过至少一个氨基酸残基的缺失，且具有相同功能的多肽。
可选地，根据前述的多肽，所述氨基酸残基的缺失数量为1-5。
可选地，根据前述的多肽，所述多肽为将如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少一端经过至少一个氨基酸残基的添加，且具有相同功能的多肽。
可选地，根据前述的多肽，所述氨基酸残基的添加数量为1-13。
本申请还提供了一种组合物，包括前述的多肽。
可选地，根据前述的组合物，还包括与所述多肽偶联的报告基团和/或活性物质。
可选地，根据前述的组合物，所述报告基团为荧光标签或生物素。
可选地，根据前述的组合物，所述报告基团选自FITC、FAM、TAMRA、Biotin、MCA、Rhodamine B、CY3、CY5和CY5.5中的一种或多种。
可选地，根据前述的组合物，其特征为，所述组合物的结构为FITC-QGPPGPAGPAGER，QGPPGPAGPAGER-FITC，
FAM-QGPPGPAGPAGER，QGPPGPAGPAGER-FAM，
Biotin-QGPPGPAGPAGER，QGPPGPAGPAGER-Biotin，
TAMRA-QGPPGPAGPAGER，QGPPGPAGPAGER-TAMRA，
MCA-QGPPGPAGPAGER，QGPPGPAGPAGER-MCA，
Rhodamine B-QGPPGPAGPAGER，QGPPGPAGPAGER-Rhodamine B，
CY3-QGPPGPAGPAGER，QGPPGPAGPAGER-CY3，
CY5-QGPPGPAGPAGER，QGPPGPAGPAGER-CY5，
CY5.5-QGPPGPAGPAGER，或QGPPGPAGPAGER-CY5.5。
可选地，根据前述的组合物，还包括连接体，所述报告基团或活性物质通过所述连接体偶联所述多肽。
可选地，根据前述的组合物，所述连接体选自6氨基乙酸、Lys、乙二胺、Cys中的一种或多种。
可选地，根据前述的组合物，所述活性物质选自小分子药物、多肽、蛋白质、siRNAs和纳米粒子中的一种或多种。
本申请还提供了前述多肽或前述组合物在制备药物中的应用。
可选地，根据前述的应用，所述药物为抗细胞死亡或治疗细胞死亡疾病的药物。
可选地，根据前述的组合物，所述药物为抗细胞凋亡、抗细胞坏死、抗细胞焦亡、抗细胞自噬的药物。
可选地，根据前述的组合物，所述药物为治疗选自败血症、脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿氏舞蹈病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、癌症、自身免疫病、伴有炎症释放综合症的疾病和二型糖尿病的一种或多种疾病的药物。
可选地，根据前述的组合物，所述药物剂型为胶囊、片剂或注射液。
一方面，本申请的多肽具有抗细胞死亡的作用效果，本申请选择小鼠败血症模型及多种细胞模型在体内外鉴定多肽药的抗细胞死亡效果。本申请所公开的多肽对细胞死亡相关疾病的治疗具有较大的潜力。
多肽药物具有较高的安全性和较高的靶标亲和力，多肽药物主要通过蛋白水解降解和肾过滤来清除，水解的产物为氨基酸，因此一般不考虑多肽药物的代谢产物是否有毒性。本申请的多肽在化学结构及理化性质上不同于小分子化药，它为亲水性的小分子，具有组织相容性好，吸收快且稳定的特性。本申请多肽的氨基酸序列无常见精氨酸，酪氨酸，谷胱氨酸等常见蛋白酶酶切位点，即比一般多肽药稳定且只能被外肽酶水解，从而半衰期较长药效相对稳定。
综上所述，本申请的多肽有望成为临床用于抑制细胞死亡的临床用药。
另一方面，本申请的多肽分子量小，且能透过细胞膜及靶器官(胸腺，脾脏，血脑屏障等)。利用这些特性，该多肽可视为活性物质进入细胞发挥生物学活性的细胞穿膜肽使用，因此上述多肽的另一个功能为作为穿膜肽，其能有效促进活性物质吸收，显著提高活性物质的生物利用度。
附图说明
图1：1A为本申请中多肽分离鉴定的模式流程图，1B为不同分子量滤膜分离出3个分子量大小不同的组分对双氧水损伤的保护作用；
图2：2A经离子交换色谱对上述A组分进行分离得到A1和A2组分的色谱图，2B为上述2个组分A1和A2对双氧水损伤的保护作用；
图3：3A经反相色谱对上述A1组分进行分离得到A11、A12、A13和A14组分的色谱图，3B为上述4个组分A11、A12、A13和A14组分对双氧水损伤的保护作用；
图4：4A为实施例4将质谱鉴定出的多肽取置信值较高的8个多肽进行化学合成，并通过ATP检测呈现他们对双氧水损伤的保护作用，4B为经上述ATP检测鉴定出抗细胞死亡效果最好的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的质谱检测结果；
图5：5A为实施例5多肽治疗败血症小鼠的模式流程图，5B为多肽通过抵抗免疫器官细胞的死亡进而显著提高小鼠幸存率的实验结果；
图6：6A为实施例6本申请多肽的DNA Ladder凝胶电泳检测结果，表明多肽处理能显著降低败血症小鼠胸腺基因组的凋亡程度，6B为本申请多肽的败血症小鼠炎症因子IL-1β和TNF-αELASI检测结果；
图7：为本申请多肽在小鼠体内经不同给药方式的靶器官富集情况，7A和7B为采用腹腔注射方式给药2h和10h后分别能在小鼠胸腺、脾脏和大脑中检测到多肽的存在；7C和7D为采用灌胃方式给药2h和10h后分别能在小鼠胸腺、脾脏和大脑中检测到多肽的存在。以上实验结果表明本申请多肽能透过细胞，组织及血脑屏障进而在靶器官发挥抗细胞死亡的药理学作用；
图8：为实施例8的实验结果。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本申请的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本申请的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本申请的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商购买得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《细胞生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。
本申请提及的方法中各步骤的执行顺序，除特别说明外，并不限于本文的文字所体现出来的顺序，也就是说，各个步骤的执行顺序是可以改变的，而且两个步骤之间根据需要可以插入其他步骤。
本申请中所述的“偶联”、“连接”，除非另有明确的规定或限定，应作广义理解，可以是直接相连，也可以是通过中间媒介相连。在本申请的描述中，需要理解的是，“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶端”、“底端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的序列或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和合成，因此不能理解为对本申请的限制。
在本申请中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来说明本申请多肽的药理学作用。为了简化本申请的公开，下文中对特定例子的部件和设置进行描述。当然，它们仅仅为示例，并且目的不在于限制本申请。此外，本申请可以在不同例子中重复参考数字和/或参考字母，这种重复是为了简化和清楚的目的，其本身不指示所讨论各种实施方式和/或设置之间的关系。此外，本申请提供了的各种特定的工艺和材料的例子，但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的应用和/或其他材料的使用。
本申请公开了一种多肽，其如下(ⅰ)或(ⅱ)所示：
(ⅰ)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的多肽；(ⅱ)将SEQ ID NO：1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽。
在一些实施例中，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其质谱检测结果如图4所示。
在一些实施例中，该多肽为将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少一端经过至少一个氨基酸残基的缺失，且具有相同功能的由其衍生的多肽。例如，氨基酸残基的缺失数量为1-5，则依据氨基酸残基的缺失数量，该多肽为十二肽、十一肽、十肽、久肽或八肽。
例如，可以是在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的N端或者C端缺失氨基酸残基，也可以是在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的N端和C端两端同时缺失氨基酸残基，在此并不为限。
举例来说，N端缺失氨基酸的本申请多肽具体可为：GPPGPAGPAGER；PPGPAGPAGER；PGPAGPAGER；GPAGPAGER；PAGPAGER。
C端缺失氨基酸的本申请多肽具体可为：QGPPGPAGPAGE；QGPPGPAGPAG；QGPPGPAGPA；QGPPGPAGP；QGPPGPAG。
在一些实施例中，多肽为将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少一端经过至少一个氨基酸残基的添加，且具有相同功能的由其衍生的多肽。例如，氨基酸残基的添加数量为1-13，则依据氨基酸残基的添加数量，该多肽为十四、十五肽、十六肽、十七肽，以此类推直至二十六肽。
例如，可以是在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的N端或者C端添加氨基酸残基，也可以是在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的N端和C端两端同时添加氨基酸残基，在此并不为限。
根据本申请，上述多肽来源没有特别的限制，可以从现有蛋白序列中进行截取得到，也可以由编码该多肽的的DNA转录并翻译得到，也可以按照常规方法合成得到。例如，在本申请实施例中，采用胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解胶原蛋白1后质谱分析获得其氨基酸序列，并通过工业化学合成获得多肽粉末，该多肽目前合成技术、生产工艺和产品纯度及扩大合成均达到多肽药开发指标(如纯度98％-99％，最大合成量6g)。
上述多肽属于抗细胞死亡的广谱小分子多肽，并通过细胞实验，分子实验，动物实验等分别从不同水平验证了多肽药抗细胞死亡的药效，在小鼠败血症模型中多肽药的代谢组织不仅包括肝、肾、和胃肠道组织，也包括肺、血管、血管内皮及其他组织器官。因此，上述多肽的功能之一为抗细胞死亡。根据实验证明，在双氧水诱导的细胞死亡模型中，上述多肽具有较强的抗细胞死亡的作用；在小鼠败血症模型中，上述多肽可在给药后2h在小鼠胸腺、脾脏和大脑中检测到多肽的富集，能够在靶器官发挥抗细胞死亡的作用进而降低败血症的严重程度从而显著改善小鼠的幸存率。由于上述多肽分子量较小，例如SEQ ID NO.1所示的多肽仅有13个氨基酸，所以能透过细胞及靶器官组织进而发挥抗细胞死亡的药理学作用。
并且上述多肽没有目前常见消化酶的酶切位点，所以可在细胞及组织中稳定存在，例如存在12小时及以上，从而半衰期较长药效相对稳定。该多肽能通过口服给药的方式对败血症小鼠进行治疗，但由于口服经过肠及肝代谢，多肽能快速到达靶器官并达到峰值但半衰期可能会相应减弱。
多肽主要通过蛋白水解降解和肾过滤来清除，水解的产物为氨基酸，因此一般不考虑多肽药物的代谢产物是否有毒性。且该多肽氨基酸数量较少，所以不会造成氨基酸数量较多引起的免疫原性反应。因此，该多肽具有较高的安全性和较高的靶标亲和力。
上述多肽分子量小，且能透过细胞膜及靶器官(胸腺，脾脏，血脑屏障等)。利用这些特性，该多肽可视为活性物质，例如其他药物(如小分子药物、多肽、蛋白质、siRNAs、纳米粒子)进入细胞发挥生物学活性的细胞穿膜肽使用，因此上述多肽的另一个功能为作为穿膜肽，其能有效促进活性物质吸收，显著提高活性物质的生物利用度。
本申请还提供了上述多肽在制备药物中的应用。该药物可为抗细胞死亡的药物，例如，该药物具有抗细胞凋亡作用，抗细胞坏死作用，抗细胞焦亡作用，抗细胞自噬作用，尤其是包括细胞线粒体自噬作用。该药物也可进行其与细胞死亡相关疾病的治疗，例如临床常见病败血病的治疗，神经性退行疾病的治疗(包括脑卒中、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿氏舞蹈病(HD)和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS))，癌症，自身免疫病，二型糖尿病及伴有炎症释放综合症的疾病等)。细胞死亡在临床常见病的发生发展中扮演重要的作用，若及时抑制细胞的死亡数量可显著降低疾病的严重程度。
根据一些实施例，该药物仅包括上述多肽，小鼠败血症模型腹腔给药治疗或灌胃-肠内给药治疗剂量均为3mg/kg/每天，30mg/kg/每天，每天给药一次。根据本申请研究结果表明两种给药方式中，30mg/kg/每天剂量的治疗效果优于3mg/kg/每天剂量。
本申请还提供了一种组合物，其包括上述多肽。
根据一些实施例，该组合物还包括活性物质，与上述多肽偶联。该多肽可视为活性物质(如小分子药物、多肽、蛋白质、siRNAs、纳米粒子)进入细胞发挥生物学活性的细胞穿膜肽使用。
根据一些实施例，该组合物还包括报告基团，与上述多肽偶联。报告基团例如可为荧光标签和/或生物素。该组合物可实现多肽在小鼠体内靶器官的可视化及半衰期研究，增强药物的靶向性，提高有效性和降低不良反应。报告基团是用于与多肽结合所引起的化学或生物微环境变化等转变为人易感知(例如，颜色变化)或仪器易检测的信号。报告基团可连接在多肽的N端、C端或多肽的中间。
举例来说，荧光报告基团可用MCA，FITC，FAM，TAMRA，Rhodamine B，CY3，CY5，CY5.5，Biotin等。荧光报告基团可直接连接在多肽氨基酸残基的氨基端或者羧基端。
表1示出了荧光报告基团的激发波长、发射波长以及相应颜色。
表1荧光报告基团
Figure BDA0002409441590000081
Figure BDA0002409441590000091
由于本申请的多肽可与多种荧光报告集团连接，但经本申请研究表明仅有多肽N端连接Biotin标签既能实验多肽在组织中的可视化又能发挥抗细胞死亡的作用，而其他标签只能发挥多肽的可视化作用如图8。
根据示例实施例，本申请组合物还包括连接体(linker)，报告基团通过连接体连接多肽。例如，连接体一端可连接在多肽的N端、C端或多肽的中间，另一端连接报告基团。连接体可选自6氨基乙酸LC、赖氨酸Lys，乙二胺ED，半胱氨酸Cys中的一种或多种。
表2示例性示出了本申请多肽中荧光报告基团和多肽的连接方式。
表2荧光报告基团和多肽的连接方式
Figure BDA0002409441590000092
Figure BDA0002409441590000101
根据示例实施例，本申请所述组合物包括本申请所公开的多肽、表1所示的荧光报告基团按照表2所示的连接方式进行组合。
举例来说，激发光波长为560nm探针的分子结构式可为QGPPGPAGPAGER-乙二胺-TAMRA或QGPPGPAGPAGER-Lys-TAMRA。该探针的最大的激发波长为560nm，最大的发射波长为582nm。用QGPPGPAGPAGER-Lys-TAMRA多肽可检测小鼠靶器官中多肽的富集情况和半衰期研究，如图7所示。
又例如，Biotin-多肽的分子结构式可为Biotin-QGPPGPAGPAGER或QGPPGPAGPAGER-Lys-Biotin。该多肽可视化的方法依照生物素与链霉亲和素特异性结合实现。
根据一些实施例，在该组合物中，本申请多肽可同时与活性物质和报告基团偶联，在此并不为限。
本申请还提供了上述组合物在制备药物中的应用。该药物可为抗细胞死亡的药物，例如，该药物具有抗细胞凋亡作用，抗细胞坏死作用，抗细胞焦亡作用，抗细胞自噬作用，其包括细胞线粒体自噬作用。该药物也可进行其与细胞死亡相关疾病的治疗，例如治疗临床常见病败血病，神经性退行疾病(包括脑卒中、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿氏舞蹈病(HD)和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS))，癌症，自身免疫病，二型糖尿病及伴有炎症释放综合症的疾病等)。细胞死亡在临床常见病的发生发展中扮演重要的作用，若及时抑制细胞的死亡数量度可显著降低疾病的严重程度。
本申请多肽及组合物均可采用工业合成制得。多肽及组合物均可制成片剂、胶囊和生理盐水配制的注射液形式保存。例如片剂为10mg*28s每片或10mg/胶囊*28s，注射液为生理盐水配制的0.3g/ml储存液，5ml/每瓶。本申请片剂、胶囊和注射液可室温避光保存24月内有效。给药方式包括口服、注射等。
本申请多肽、组合物以及药物的剂型和药物传递系统，给药方式，半衰期等均在小鼠水平进行试验验证，并通过加入荧光报告基团可视化追踪多肽进入体内稳定性和半衰期，半致死剂量。
材料和试剂：
RAW264.7细胞：购于国家实验细胞资源共享平台(北京协和医学院)
J774A.1细胞：购买于上海中乔新舟，此细胞株与ATCC上对J774A.1细胞形态和性质描述相一致。
BALB/c小鼠：6周龄，体重18-20g，购于维通利华。
DMEM培养基：购于Gibco公司，为DMEM高糖培养基
DMEM完全培养基：DMEM培养基，10％FBS(Gibco公司胎牛血清)，1％PS(Penicillin-Streptomycin,青链霉素(双抗),Gibco)
0.6mM H2O2诱导细胞损伤的培养基：DMEM培养基，10％FBS，1％PS，终浓度0.6mMH2O2
ATP检测试剂：购于Promega公司(货号：G7571)
ELASI试剂盒：货号EPX170-26087-901名称
Figure BDA0002409441590000111
Planar Array MouseCytokine Panel 1购于Quanterix,Cat公司
生理盐水：购于石家庄鹏海制药有限公司
琼脂糖：购于Gibco公司，货号：17852
本申请多肽QGPPGPAGPAGER、QGPPGPAGPAGER-Lys-TAMRA和Biotin-QGPPGPAGPAGER由上海吉尔生化有限公司和北京亚光多肽生物科技有限公司合成。
实施例1胶原蛋白1活性成分的逐级分离
(1)首先将驴胶原蛋白1(Advanced Biomatrix公司货号：5005)溶解在50℃去离子水中得到胶原蛋白溶液，冷却至37℃，调节胶原蛋白溶液的pH值为2.0(建议用pH剂进行精确测定，并用1N的稀盐酸进行pH值的调节)，按照胃蛋白酶与胶原蛋白溶液的重量比1:250的比列加入胃蛋白酶(Sigma公司，货号EC3.4.23.1)，在37℃条件下，消化2小时；然后将所得混合液的pH值调节至6.8，在按照胰蛋白酶与胶原蛋白溶液的重量比1:250的比例加入胰蛋白酶(Sigma公司，货号EC3.4.21.4)同样在37℃度下消化2h。随后将胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后的胶原蛋白溶液加热到100℃灭酶活1小时待溶液自然冷却后，8000转/分离心10min去除沉淀杂质。
(2)随后将上述上清液用透析器通过100Da MWCO滤膜(Ashahi ChemicalIndustry Co，东京，日本)去除盐离子。随后通过两个分子量不同的滤膜超滤12h(5,000Da和10,000Da)，最后将消化物分为3个组分(A，分子量≥10,000Da；B，5，000Da<分子量≤8,000Da；C，分子量≤5,000Da)。将A、B和C组分冻干并在-20℃下保存直至使用。流程图参见图1A。
(3)ATP检测3个组分A、B和C对双氧水损伤的保护作用：
a.将培养在37℃，5％CO2孵箱中的J774A.1细胞进行传代处理，此细胞培养在10％FBS(Gibco公司胎牛血清货号：10099-041),5％PS(Gibco公司青霉素链霉素双抗货号：15140122)高糖DMEM培养基(货号：11995-065)中，用完全的DMEM培养基进行吹打，将细胞制备成均一的细胞悬液。
b.利用血细胞计数板进行计数，将J774A.1细胞，以6×104的细胞数种入24孔板中进行培养，同时多肽组按300μg/ml进行预孵育，24小时待细胞正常贴壁后，采用0.6mM的双氧水进行刺激12h，同时多肽处理组按300μg/ml在刺激时加入。
c.ATP检测试剂的配制，按照ATP检测说明书将10ml实验缓冲液加入到棕色冻干粉瓶中，轻轻混匀并在平衡至室温。随后向24孔板中分别加入100ul ATP的检测试剂，室温条件下将24孔细胞培养板至于摇床上避光孵育10min，进行细胞存活率的评估。不同处理组每孔分别吸出3份样品即3个重复，每份100ul到检测化学发光的白色96孔板中。利用酶标仪Infinite M200 PRO Microplate reader(TECAN)对不同处理组，进行ATP含量进行检测。
d.该实验独立进行3次，利用GraphPad Prism 6.0进行统计，统计结果以mean±SEM表示。
实验结果参见图1B。ATP检测结果表示在双氧水诱导的细胞死亡模型中，A组分的抗细胞死亡效果最好，细胞存活率最高，其次为B组分，C组分未观察到抗细胞死亡的保护效果。以上实验结果说明A组分中含有抗细胞死亡的活性成分。图1B中，Con(即H2O2-；300μg/ml0)为正常细胞培养组12h ATP含量检测数据；H2O2(即H2O2+；300μg/ml0)为氧化损伤诱导的细胞死亡组12h ATP含量检测数据；A、B和C三个组分双氧水刺激12h后ATP含量检测结果。
实施例2抗细胞死亡A组分进行离子交换色谱分离
(1)将A组分(分子量≥10,000Da)经离子交换色谱进行逐级分离，离子交换色谱(IEX)使用IEX技术纯化生物分子，根据其表面净电荷的差异将其分离。本申请使用AKTA-pure(GE Healthcare，美国)配备了High-Performance Q(GE healthcare,美国)阴离子交换柱(100mm*10mm Sepax，美国)。在室温下以3ml/min的流速用50％恒定梯度的1M NaCl，50Mm Tris pH 7.4进行洗脱。并在214和280nm处监测吸光度。将A1和A2两个收集峰值处的部分透流，然后进行冻干。将冻干液溶解在超纯水中进行分析。分析结果参见图2A。
(2)通过ATP检测2个组分A1和A2对双氧水损伤的保护作用：检测步骤与上述相同，仅将上述多肽更换成3μg/ml的A1组分和A2组分即可。
实验结果参见图2B。ATP检测结果表示在双氧水诱导的细胞死亡模型中A1组分的保护效果优于A2组分。推断A1组分中大概率含有抗细胞死亡的活性成分。以上实验结果说明A1组分中含有抗细胞死亡的活性肽需要进一步进行分离。图2B中，Con(即H2O2-；3μg/ml0)为正常细胞培养组12h ATP含量检测数据；H2O2(即H2O2+；3μg/ml0)为氧化损伤诱导的细胞死亡组12h ATP含量检测数据；A1和A2为双氧水刺激12h后ATP含量检测结果。
实施例3A1组分进行反相色谱进一步分离
(1)将A1组分经反相色谱进行逐级分离，RPC根据物质的疏水性对馏分进行分离。本申请采用AKTA-pure(GE healthcare,USA)配备了Source30-RPC(GE healthcare,USA)的反相色谱柱(65mm*10mm Sepax)进行分馏。即先用0-10％的linner进行梯度洗脱，再用含有20％、30％、50％和60％乙腈的10mM Na2HPO4(pH7.0)缓冲液进行恒定梯度洗脱，室温流速为3ml/min。最后测量214和280nm处吸光度。收集高峰馏分，然后进行冻干。将冻干液溶解在超纯水中进行分析。分析结果参见图3A。
(2)通过ATP检测4个组分A11、A12、A13和A14对双氧水损伤的保护作用：检测步骤与上述相同，仅将上述多肽更换成3μg/ml的A11、A12、A13和A14组分即可。
实验结果参见图3B。ATP检测结果表明在双氧水诱导的细胞死亡模型中除A14组分以外，A11、A12和A13均具有抗细胞死亡的保护作用。所以将A11、A12和A13组分进行质谱分析，将三者独有或A12中特有的肽进行体外化学合成进而筛选具有抗细胞死亡作用的活性肽。图3B中，Con(即H2O2-；3μg/ml0)为正常细胞培养组12h ATP含量检测数据；H2O2(即H2O2+；3μg/ml0)为氧化损伤诱导的细胞死亡组12h ATP含量检测数据；A11、A12、A13和A14为双氧水刺激12h后ATP含量检测结果。
实施例4体外合成质谱检测到的活性肽并进行药理学作用检测
(1)经质谱对A11、A12和A13组分的检测将置信值最高的8个活性肽进行体外化学合成(上海吉尔股份有限公司)，将合成肽粉末用PBS(Gibco公司，货号：70011069)溶解成30mg/ml的储存液进行抗细胞死亡效果的ATP检测。
(2)具体实验方法如上所述：仅将上述不同组分更换成300μg/ml的8种多肽即可。
实验结果参见图4A，ATP检测结果表明在双氧水诱导的细胞死亡模型中1号多肽具有较强的抗细胞死亡作用效果，其次3号多肽有部分保护作用，其他多肽未观察到抗细胞死亡的作用。以上实验结果表明1号肽是各组分中抗细胞死亡的活性成分。图4A中，Con(即H2O2-；300μg/ml-)为正常细胞培养组12h ATP含量检测数据；H2O2(即H2O2+；300μg/ml-)为氧化损伤诱导的细胞死亡组12h ATP含量检测结果；1-8号多肽为双氧水处理12h后的ATP检测结果。图4B为1号多肽氨基酸序列的质谱检测图。
1号多肽的氨基酸序列如SEQ ID.1所示。
实施例51号多肽在小鼠败血症模型中抗细胞死亡效果鉴定
(1)小鼠败血症模型的建立和实验方法如下
本申请实验动物购于潍通利华，BALB/c小鼠，6周龄，18～20g。BALB/c小鼠是药理学、毒理学研究中公认的标准动物之一，同时它的免疫系统比较敏感便于后期的败血症模型的建模。BALB/c小鼠在首都医科大学动物中心SPF级动物房内饲养。室温21℃～24℃，相对湿度46％～56％，光照12小时，黑暗12小时；饲养于325x 210x 180mm标准小鼠笼内，每笼饲养小鼠5只；自由饮水、摄食。动物实验开始前检疫5天，适应性饲养1周，随机分组为对照组，建模组，以及两组多肽实验组；每组50只小鼠。多肽分别以腹腔注射和灌胃的方式进行给药处理1周(给药剂量3mg/kg和30mg/kg)，随后腹腔注射5mg/kg LPS建立败血症模型，急性败血症模型小鼠表型为体温升高，活动量减少，发抖等临床败血症常见症状；进而可根据行为和外表的症状观察模型建立是否成功。分别在建模后的12h和24h两个时间点取材进行胸腺组织凋亡程度检测(如DNA ladder实验，血清学炎症因子检测和幸存率统计)。
小鼠败血症模型实验流程图参见图5A。
半致死量实验方法具体如下：
20只野生型BALB/c小鼠分别腹腔注射600mg/kg的1号多肽，即观察一周，其中有4只死于12小时，有6只死于注射多肽后24小时，其他小鼠在多肽注射24小时后进入恢复阶段，接近36小时注射肽小鼠与未注射多肽的正常组小鼠没有任何行为区别。由此可知，半致死剂量为600mg/kg。
(2)各组败血症小鼠幸存率统计，两个样品之间的统计比较利用双侧非配对t检验。两个样品以上的显著性差异比较使用的是post-hocTukey–Kramer test单因素ANOVA检验的。利用Kaplan–Meier log-rank方法统计小鼠幸存率。所有分析使用SPSS(version 20,IBM)进行统计。
实验结果参见图5B，对照组小鼠未出现死亡；与败血症模型组相比多肽实验组小鼠幸存比例显著增加。以上实验结果表明，多肽可以显著提高败血症小鼠的幸存率。
实施例6 1号多肽降低败血症小鼠细胞死亡程度及血清中炎症因子水平
(1)小鼠败血症模型的建立和实验方法如实施例5所述，其中，小鼠随机分组为对照组，腹腔注射30mg/kg多肽但未注射脂多糖组，建模组，以及两组多肽实验组；每组50只小鼠。多肽分别以腹腔注射和灌胃的方式进行给药处理1周(给药剂量3mg/kg和30mg/kg)。
DNA Ladder检测多肽实验组小鼠胸腺基因组的凋亡程度。提取腹腔注射LPS(lipopolysaccharides)24h后败血症小鼠的胸腺组织，利用QIAGEN公司的
Figure BDA0002409441590000161
Fast DNA Tissue Kit组织DNA提取试剂盒，提取小鼠胸腺的gDNA，提取过程详见产品说明书。随后配制1％琼脂糖凝胶，120U电泳30min，利用Biorad凝胶成像仪检测各组小鼠胸腺基因组DNA片段化的程度。
实验结果参见图6A，对照组小鼠胸腺基因组DNA未出现片段化；实验组(即图中多肽药3mg/kg和多肽药30mg/kg)与败血症模型组(即图中脂多糖)相比，小鼠胸腺基因组DNA片段化程度被显著降低，以上实验结果表明多肽能显著降低败血症小鼠胸腺组织的凋亡程度。
(2)ELISA法检测小鼠血清中炎症因子水平，将腹腔注射LPS 12h、24h后的败血症小鼠，经眼球静脉取血，将血放入灭菌的2ml EP管中，室温静止1～2h，使血液自然凝固；4℃4,000rpm离心10min，将上层血清加入新的1.5ml EP管中再次离心去除红细胞。将获得的血清进行ELISA实验(Mouse IL-10ELISA KIT 96tests ELISA 31.25-2000pg/ml 15.6pg/ml，货号LEM100-2，LAIZEE公司)。详细的操作步骤参见产品说明书。
实验结果参见图6B，对照组及腹腔注射30mg/kg多肽但未注射脂多糖组小鼠血清中IL-1β和TNF-α含量较低，腹腔注射脂多糖的败血症模型组小鼠血清中两种炎症因子明显升高(脂多糖注射后12h和24h)。然而，给药多肽的实验组小鼠血清中这两种炎症因子被显著降低，此实验结果表明多肽不仅能提高败血症小鼠的幸存率，降低小鼠胸腺基因组DNA的片段化程度同时也能降低血清中IL-1β和TNF-α两种炎症因子的水平。
实施例7多肽-TAMRA在BALB/c小鼠体内的半衰期及给药方式研究(1)本申请BALB/c小鼠(6周龄，18～20g)购于潍通利华。动物实验开始前检疫5天，适应性饲养1周，随机分组为多肽-TAMRA(QGPPGPAGPAGER-Lys-TAMRA)腹腔注射组，多肽-TAMRA灌胃组(给药剂量均为3mg/kg)。小鼠分别在给药后2h和10h进行胸腺、脾脏和大脑的取材。将小鼠组织用SAKURATissue-
Figure BDA0002409441590000171
公司的OCT包埋剂进行包埋。使用leica CM3050S冰冻切片机进行冰冻切片。将10um厚的组织切片贴在PDL包被的载玻片上，4％多聚甲醛室温固定15min后；PBS洗3遍。DAPI室温染色10min，PBS洗3遍。利用ZEISS公司的Airyscan激光共聚焦显微镜进行拍摄，多肽-TAMRA(λex＝560/λem＝582m)发红色荧光及DAPI(λex＝350/λem＝461nm)发出蓝靛色荧光。
实验结果参见图7A、7B、7C、和7D，无论腹腔注射多肽-TAMRA还是灌胃给与多肽-TAMRA，在给药后2h均能在小鼠胸腺、脾脏和大脑中检测到多肽的富集，这说明多肽能够穿透细胞膜和组织，具有吸收快，生物相容性强，且能透过血脑屏障进而发挥抗细胞死亡的药理学作用。此外，在给药后10h依然能检测到多肽的富集，但相对于腹腔注射给药，灌胃给药，其多肽能快速富集在胸腺和脾脏，但由于灌胃给药经过肠和肝代谢，所以多肽的半衰期短于腹腔注射给药方式。然而，腹腔注射给药其多肽在小鼠体内作用的时间较长，半衰期为12h。
实施例8多肽衍生肽(多肽-TAMRA和Biotin-多肽)能透过细胞，且Biotin-多肽具有抗细胞死亡作用
(1)QGPPGPAGPAGER-Lys-TAMRA(多肽-C-TAMRA)和Biotin-QGPPGPAGPAGER(Biotin-N-多肽)由上海吉尔生化有限公司合成后的衍生肽粉末，用PBS缓冲液进行溶解，配置成30mg/ml的储存液用于检测其抗凋亡作用效果及作为细胞穿膜肽的特性。通过ATP检测2个衍生肽Biotin-N-多肽和多肽-C-TAMRA对双氧水损伤的保护作用：检测步骤与实施例2相同，仅将上述A1组分和A2组分更换成30μg/ml的前述多肽即可。
(2)通过ATP检测2个多肽对双氧水损伤的保护作用：检测步骤与上述相同，仅将上述多肽更换成30μg/ml的Biotin-N-多肽和多肽-C-TAMRA即可。
实验结果参见图8A：Con(即H2O2-；-μg/ml)为正常细胞培养组12h ATP含量检测数据；H2O2(即H2O2+；-μg/ml)为氧化损伤诱导的细胞死亡组12h ATP含量检测数据；Biotin-N-多肽和多肽-C-TAMRA为双氧水刺激12h后ATP含量检测结果。实验结果表明：ATP检测结果表示在双氧水诱导的细胞死亡模型中多肽N端连接Biotin标签既能实验多肽在组织中的可视化又能发挥抗细胞死亡的作用，而多肽-C-TAMRA未观察到抗细胞死亡的作用，其只能起到多肽示踪及半衰期研究的作用。
图8B为两种衍生多肽，Biotin-N-多肽和多肽-C-TAMRA超高分辨显微成像的实验结果。实验结果表明两种衍生多肽可进入细胞，并稳定存在，其可实现多肽在细胞，靶器官等可视化追踪及半衰期研究。同时说明该多肽QGPPGPAGPAGER可视为活性物质(如小分子药物、多肽、蛋白质、siRNAs、纳米粒子)进入细胞发挥生物学活性穿膜肽使用。如实验所示其可将报告集团(荧光标签和生物素)带入细胞内。
具体实验方法如下：
(1)将培养在37℃，5％CO2孵箱中的J774A.1细胞进行传代处理，此细胞培养在在10％FBS(Gibco公司胎牛血清货号：10099-041),5％PS(Gibco公司青霉素链霉素双抗货号：15140122)高糖DMEM培养基(货号：11995-065)中，用完全的DMEM培养基进行吹打，将细胞制备成均一的细胞悬液。
(2)利用血细胞计数板进行计数，将J774A.1细胞，以15×104的细胞数种入Confocal皿中进行培养，24小时待细胞正常贴壁后将细胞培养基更换成如下含有两种衍生多肽的培养基的染色液37℃孵育1h，
衍生多肽(Biotin-N-多肽和多肽-C-TAMRA)染色液配制：用PBS缓冲液溶解Biotin-N-多肽和多肽-C-TAMRA衍生多肽粉末存储液浓度为30mg/ml，再用高糖DMEM稀释按照1:1000稀释成30ug/ml的工作液，两种衍生多肽1：1加入细胞中37℃，染色30min。去除衍生多肽染色液后，用PBS洗涤细胞三遍，每遍5min。
(4)随后通过尼康A1-SIM-STORM对细胞进行超高分辨拍摄。实验结果如图8B。
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本申请所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本申请的保护范围之中。
序列表
<110> 北京鲲达宇科技有限公司
<120> 多肽、组合物及其应用
<130> 200068CI
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 驴(Equus caballus)
<400> 1
Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Glu Arg
1 5 10

Claims (9)

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽如（ⅰ）所示：
（ⅰ）氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的序列。
2.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的多肽。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，还包括与所述多肽偶联的生物素报告基团。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征为，所述组合物的结构为
Biotin- QGPPGPAGPAGER，QGPPGPAGPAGER - Biotin。
5.根据权利要求3所述的组合物，还包括连接体，所述报告基团或活性物质通过所述连接体偶联所述多肽。
6.根据权利要求5所述的组合物，所述连接体选自6氨基乙酸、Lys、乙二胺、Cys中的一种或多种。
7.权利要求1所述多肽或权利要求2-6任一项所述组合物在制备败血症药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，所述药物为抗细胞死亡的药物。
9.根据权利要求7所述的应用，所述药物剂型为胶囊、片剂或注射液。
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