JP4744443B2 - 毒素中和性ペプチドのスクリーニング方法とｓｔｘ２阻害性ペプチド並びにベロ毒素中和剤 - Google Patents

Description

本発明はベロ毒素やコレラ毒素、百日咳毒素等の毒素を阻害することのできる毒素中和性ペプチドのスクリーニング方法に関するものである。
また、本発明はＳＴＸ２阻害性ペプチドとベロ毒素中和剤に関するものである。さらに詳しくは、ベロ毒素の細胞への接着を競合的に阻害してベロ毒素を効果的に阻害することのできるＳＴＸ２阻害性ペプチドと、経口投与も可能な新しいベロ毒素中和剤に関するものである。

腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７が産生するベロ毒素は、赤痢菌由来志賀毒素と類似した細菌毒素のＡＢ_５ファミリーに属するタンパク質であって、これらの毒素は、各種標的臓器の血管内皮細胞上のグロボトリオシルセラミド（Ｇｂ_３，Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｃｅｒ）中のグロボ３糖部分を認識し、接着することにより細胞内に取込まれ毒性を示すことが知られている。
そして、このような志賀様毒素は二種類存在し、これらの毒素が出血性大腸炎やその後の一連の微小血管障害である重症合併症〔たとえば、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）〕などを引き起こす。ＳＴＸ１として表記される毒素は、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ Ｔｙｐｅ Ｉ）の産生する志賀毒素とアミノ酸配列が同一である。一方、ＳＴＸ２と表記される毒素は、ＳＴＸ１とアミノ酸配列が５０〜６０％の相同性が認められている。これらの毒性は、そのアミノ酸配列のわずかな違いがあるものの、タンパク質合成阻害による細胞毒性や腸管毒性などの活性を示す。Ｓｔｘは、二種類のサブユニット（ＡとＢ）から構成されるＡＢ_５型の毒素であり、Ａサブユニット１分子の周りにＢサブユニット５分子が疎水性結合により取り囲んでいる。毒素活性を担っているのがＡサブユニットであり、Ｂサブユニットは、細胞表層上に存在する糖鎖受容体に結合する役目を担っている。毒素のＸ線結晶構造解析などによる詳細な検討により、Ｂサブユニット１分子中に糖鎖の結合部位が３ケ所存在していることが解明されてきている。すなわち、１分子中のＳＴＸ２中には、５分子のＢサブユニットが存在することから、合計１５箇所の結合部位を提示していると推定される。
すなわち、ＳＴＸはＳＴＸ１，２の２つのファミリーに分類されるが、重篤な合併症を引き起こすのはＳＴＸ２産生菌がほとんどであり、臨床的にはＳＴＸ２のほうがより重要である。従って、ＳＴＸ２に対する阻害剤の開発が急務である。これらＳＴＸはＡ−Ｂ_５型の毒素で、Ｂサブユニットが細胞膜上の受容体、Ｇｂ_３（ｇｌｏｂｏｔｒｉａｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ：Ｇａｌα（１−４）−Ｇａｌβ（１−４）−Ｇｌｃβ１−Ｃｅｒａｍｉｄｅ）に結合することにより細胞内に取り込まれる。またＢサブユニットペンタマーはＧｂ３の糖鎖部（グロボ３糖：Ｇａｌα（１−４）−Ｇａｌβ（１−４）−Ｇｌｃβ１−）を特異的に認識する。従って、グロボ３糖を高密度で集積させた化合物は、ＳＴＸに高親和性で結合し、その作用を阻害するＳＴＸ阻害剤となりうる。
このような毒素のサブユニット構成とその機能が解明されるにともなって、細胞表層上の糖鎖受容体への結合機能を有しているＢサブユニットの結合を選択的に阻害する方法が注目され、様々な観点からの検討が進められている。
この出願の発明者も前記のような毒素の糖鎖結合部位に対して効果的に糖鎖を結合させ、毒素の宿主細胞への接着を阻害する人工糖鎖クラスターの構築を行ってきた。そして、これまでに、カルボシランを糖鎖担持骨格としたデンドリマー型化合物群や、水溶性のポリマー化合物を提案している（特許文献１−２、非特許文献１）。
たとえば、次式で表わされるＳＵＰＥＲ ＴＷＩＧ（１）６等である。このものはＯ１５７：Ｈ７感染実験において有効性が証明された初めての化合物である。

ＳＵＰＥＲ ＴＷＩＧをはじめ、これまでのＳＴＸ阻害剤開発は、生体内における阻害活性を発揮させるためにＳＴＸ結合ユニットであるグロボ３糖をいかに集積させるか、というコンセプトに基づいていた。しかしながら、グロボ３糖単独でのＳＴＸとの親和性（Ｋｄ）は１０^−３Ｍと必ずしも高くはなく、またその化学合成は非常に困難である。このことが臨床応用のための大きな障害となっている。従って臨床応用可能な治療薬開発のためには、グロボ３糖よりも合成が容易で、ＳＴＸに対する結合能力に優れた新たなＳＴＸ結合ユニットの開発が必要である。
そしてまた、以上のような課題は、ベロ毒素特有のものではなく、ベロ毒素ＳＴＸの他に受容体結合部がサブユニット構造をもつと考えられるコレラ毒素（Ａ−Ｂ５型）受容体：ＧＭ１、毒素原性大腸菌易熱性下痢原因毒素ＬＴ（Ａ−Ｂ５型）受容体：ＧＭ１、百日咳毒素（Ａ−Ｂ５型）受容体、炭疽菌毒素（７量体型）受容体：ＶＷＡドメインを有する蛋白（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）等の場合には共通すると推察される。
このような状況において、この出願の発明者は、これら毒素のレセプターとしての処方物質を構築すべく検討を進めてきた。
ＷＯ ０２／０２５８８ 特願２００４−１０８４８３号出願 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００２；９９：７６６９−７４

本発明は、以上のような背景から、発明者によるこれまでの検討を踏まえ、合成が容易で、ベロ毒素等の受容体結合部がサブユニット構造をもつ毒素を効果的に阻害することのできる毒素中和剤を実現するため新しいスクリーニング方法を提供することを課題としている。
また、本発明は、発明者によるこれまでの検討を踏まえ、合成が容易で、ベロ毒素を効果的に阻害することのできる新しいＳＴＸ阻害剤、すなわちベロ毒素中和剤を提供することを課題としている。
この出願の発明者は、前記課題を解決するために、毒素中和性のペプチドを実現することの可能性について検討を進めてきた。ペプチドへの着目は、合成が比較的容易であることと、一般に、薬物としての適用に際して安全性が高いということが大きな理由であった。
そして、発明者による鋭意検討の結果から、この出願は、前記の課題を解決するものとして、まず、以下の毒素中和性ペプチドのスクリーニング方法を提供し、さらにより具体的に、ＳＴＸ２阻害性ペプチドとベロ毒素中和剤を提供するものである。
第１：受容体結合部が複数のサブユニット構造をもつ毒素を中和することのできるペプチドのスクリーニング方法であって、次のステップ；
（１）ミューテーションの導入による受容体結合サイトの特定
（２）ペプチドライブラリー法により野性型サブユニットに結合するペプチドモチーフと前記結合サイトが機能的に欠損したミュータントに結合するペプチドモチーフとの対比によるアミノ酸選択比に基づく結合サイト特異性ペプチドモチーフの特定を含むことを特徴とする毒素中和性ペプチドのスクリーニング方法。
第２：前記（２）のステップを複数回行い、順次にアミノ酸選択比のより高い結合サイト特異性ペプチドモチーフを特定することを特徴とする毒素中和性ペプチドのスクリーニング方法。
第３：前記（２）のステップにおいては、リジン（Ｌｙｓ）を複数個結合した核構造を形成し、その末端アミノ酸に複数個のペプチドライブラリーを結合した、多価の一次ペプチドライブラリーを用いることを特徴とする毒素中和性ペプチドのスクリーニング方法。
第４：前記多価の一次ペプチドライブラリーにおいては、ペプチドライブラリーはスペーサー分子を介して末端アミノ基に結合していることを特徴とする毒素中和性ペプチドのスクリーニング方法。
第５：リジン（Ｌｙｓ）３分子がペプチド結合された分子核構造部に、少なくとも７個のアミノ酸のペプチド結合によって構成されるペプチドモチーフであって、その配列において、少なくとも２個の塩基性アミノ酸が結合したクラスター部を２箇所有し、Ｃ−末端側が塩基性アミノ酸であるペプチドモチーフが組込まれていることを特徴とするＳＴＸ２阻害性ペプチド。
第６：クラスター部の塩基性アミノ酸として少なくともアルギニン（Ａｒｇ）を含むことを特徴とするＳＴＸ２阻害性ペプチド。
第７：クラスター部がＡｒｇ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｎであることを特徴とするＳＴＸ２阻害性ペプチド。
第８：Ｎ−末端側が疎水性アミノ酸であることを特徴とするＳＴＸ２阻害性ペプチド。
第９：リジン（Ｌｙｓ）３分子がペプチド結合された分子核構造部に、次の４種のアミノ酸配列のペプチドモチーフのいずれかが組込まれていることを特徴とするＳＴＸ２阻害性ペプチド。
（１）ＦＲＲＮＲＲＮ（配列番号１）
（２）ＰＰＰＲＲＲＲ（配列番号２）
（３）ＰＰＲＲＮＲＲ（配列番号３）
（４）ＫＲＲＮＰＲＲ（配列番号４）
第１０：ペプチドモチーフがスペーサー分子を介して組込まれていることを特徴とするＳＴＸ２阻害性ペプチド。
第１１：スペーサー分子は、ペプチドまたはアミノ基とカルボキシル基とを有し、炭素数４〜１０の炭化水素鎖構造を持つ分子によるものであることを特徴とするＳＴＸ２阻害性ペプチド。
第１２：ペプチドモチーフが末端修飾分子を有していることを特徴とするＳＴＸ２阻害性ペプチド。
第１３：末端修飾分子は電荷を有していない分子によるものであることを特徴とするＳＴＸ２阻害性ペプチド。
第１４：ペプチドモチーフは、アミノ酸シーケンス用分子を有していてもよいことを特徴とするＳＴＸ２阻害性ペプチド。
第１５：次式（ａ）（ｂ）
（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｘｏ−Ａｌａ−ＡＨＡ−）_４−３Ｌｙｓ （ａ）
（ａｃｅｔｙｌ−Ｘｏ−ＡＨＡ−）_４−３Ｌｙｓ （ｂ）
〔式中のＡＨＡは、アミノ−ヘキサンカルボン酸基を示し、Ｘｏは、前記ペプチドモチーフ（１）（２）（３）（４）のいずれかを示し、３Ｌｙｓは、次式（１）

の構造を示している。〕
のいずれかで表わされるＳＴＸ２阻害性ペプチド。
第１６．前記いずれかのペプチドを有効成分として含有することを特徴とするベロ毒素中和剤。

図１は、ペプチドモチーフ（１）ＦＲＲＮＲＲＮ（配列番号１）化合物のマススペクトル図である。
図２は、ペプチドモチーフ（２）ＰＰＰＲＲＲＲ（配列番号２）化合物のマススペクトル図である。
図３は、ペプチドモチーフ（３）ＰＰＲＲＮＲＲ（配列番号３）化合物のマススペクトル図である。
図４は、ペプチドモチーフ（４）ＫＲＲＮＰＲＲ（配列番号４）化合物のマススペクトル図である。
図５は、ペプチドモチーフを有していないＭｅｔ−Ａｌａ化合物のマススペクトル図である。
図６は、ＳＴＸ２Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔに対する親和性を例示した図である。
図７は、Ｖｅｒｏ細胞に対するＳＴＸ２の細胞毒性の阻害効果を例示した図である。

本発明は前記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
＜毒素中和性ペプチドのスクリーニング＞
まず基本的なことは、本発明の毒素中和性ペプチドのスクリーンニング方法においては、前記第１の発明のように、次のステップ；
（１）ミューテーションの導入による受容体結合サイトの特定
（２）ペプチドライブラリー法により野性型サブユニットに結合するペプチドモチーフ
と前記結合サイトが機能的に欠損したミュータントに結合するペプチドモチーフとの対比によるアミノ選択比に基づく結合サイト特異性ペプチドモチーフの特定を含んでいることである。
より好適な形態としては、
前記（２）のステップはこれを複数回行い、順次にアミノ酸選択比のより高い結合サイト特異性ペプチドモチーフを特定することが考慮される。
また、サブユニットと受容体間の結合にはクラスター効果が存在するとの知見が得られていることから、前記（２）のステップのための初期（一次）ペプチドライブラリーは、このクラスター効果に対応するものとして、アミノ酸の複数個の結合による核構造をもつものとすることが望ましい。
このような核構造については、たとえばその設計や合成の容易性、そしてなによりも実際的なクラスター効果のための分子サイズの観点から、リジン（Ｌｙｓ）を複数個、たとえば好適には２〜５個結合したものを用い、ペプチドライブラリー自体を多価にしたものとすることが考慮される。
すなわち、前記（２）のステップにおいては、リジン（Ｌｙｓ）を複数個結合した核構造を形成し、その末端アミノ酸に複数個のペプチドライブラリーを結合した、多価の一次ペプチドライブラリーを用いることである。この多価の一次ペプチドライブラリーにおいては、ペプチドライブラリーはスペーサー分子を介して末端アミノ基に結合していてもよい。この場合、たとえばスペーサー分子は、ペプチドまたはアミノ基とカルボキシル基とを有し、炭素数４〜１０の炭化水素鎖構造を持つ分子によるものとすることが好適な例の一つとして示される。
また、前記のステップ（１）における受容体結合サイトの特定は、公知のものとして対応してもよいし、実際に異変を導入し受容体との結合に及ぼす影響が大きいサイトとして特定してもよい。この出願の発明者らによれば、ベロ毒素ＳＴＸの場合には、受容体の結合サイトの特定は、グロボ３糖の結合としてすでに見出されている。
＜ベロ毒素中和性ペプチドのスクリーニングとＳＴＸ２阻害性ペプチド＞
そこで、以下にベロ毒素を阻害ペプチドのスクリーニングについての例を示し、さらに詳しく本発明について説明する。
Ｏ１５７：Ｈ７などの腸管出血性大腸菌の感染は出血性大腸炎をひき起こすばかりでなく、時に溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）や脳症を併発させ、むしろこれらの合併症が患者を死いたらしめる大きな原因となっている。ベロ毒素（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ；Ｓｔｘ）は腸管出血性大腸菌の産生する主要な病原因子であり、血中に侵入したベロ毒素による腎や脳の微小血管内皮の障害が前記合併症の原因と考えられている。従って、腸管内で産生されたＳＴＸを強力に吸着してＳＴＸの血中への侵入を阻害するＳＴＸ吸着剤や、すでに血中に侵入したごく微量のＳＴＸに結合してその作用を阻害するＳＴＸ中和剤は、腸管出血性大腸菌感染症の有効な治療薬になると期待される。
このような大腸菌ベロ毒素中和性のペプチドのスクリーニングに際しては、発明者による前記のＳＵＰＥＲ ＴＷＩＧ（１）６についての分子構造と作用機序との関係についての詳細な検討を踏まえることができる。
以下、詳細に説明する。
１）ＳＵＰＥＲ ＴＷＩＧ（１）６のＳＴＸ１Ｂ及び２Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔに対する結合サイトの同定
一つのＢ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｍｏｎｏｍｅｒ上にはサイト１、２、３と名付けられた３種類のグロボ３糖結合サイトが存在する。従って、Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｐｅｎｔａｍｅｒでは計１５個のグロボ３糖が結合しうることが知られている。新しいＳＴＸ結合ユニットを開発するためには、まずどのサイトを標的とするかが非常に問題となる。そこで、各サイトにｓｉｎｇｌｅ，ｄｏｕｂｌｅ，ｔｒｉｐｌｅｍｕｔａｔｉｏｎを導入して各種ｍｕｔａｎｔ Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔを調製し、これらｍｕｔａｎｔとＳＵＰＥＲ ＴＷＩＧ（１）６との結合親和性を比較検討した。その結果、ＳＵＰＥＲ ＴＷＩＧ（１）６とＳＴＸ１Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔとの結合には「サイト１及び２」または「サイト３単独」が使用されていること、またＳＴＸ２Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔとの結合には「サイト３単独」が使用されるのみであることが明らかとなった。つまり、臨床的にもより重要なＳＴＸ２に対す新規結合ユニットを開発するためには、サイト３を標的にすればよいことが判った。
２）新規なＳＴＸ結合ユニットの開発
臨床的な重要性、ならびに前記１）で明らかにされた結合サイトの特異性を考え、ＳＴＸ２Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔに結合し、ＳＴＸ２の毒性を阻害することのできる新しい物質をペプチド構造を有するものとして探索することにした。このペプチドへの着目は、その合成が比較的容易であって、一般的に医薬としての適用にも大きな障害がないことが、さらには、そのバリエーション、誘導体の展開についても可能性が大きいことが主要な理由であった。
このような観点からの活性ペプチドの探索のために、ペプチドライブラリーの新しい展開を行った。
すなわち、１）で得られた知見に基づき、ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ＳＴＸ２Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔに結合するペプチドモチーフから、サイト３が機能的に欠損したｍｕｔａｎｔ ＳＴＸ２Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔに結合するペプチドモチーフをサブトラクトすることにより、ＳＴＸ２Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔのサイト３特異的な結合モチーフを決定することとした。
すなわち、まず、発明者は、すでにｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅの触媒部位などの機能ドメインに対して直接結合モチーフを決定する方法、ペプチドライブラリー法を開発している（Ｋ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ，Ｃｅｌｌ，６，９６９−２０００）。そこで、このペプチドライブラリー法の知見を踏まえて、ベロ毒素中和剤においては、前記のとおりのＢサブユニットペンタマーとグロボ３糖間の結合にはクラスター効果が存在することを利用し、ペプチドライブラリー自体を多価にした新たな概念に基づいたペプチドライブラリーを開発した。
まず、前記のＳＵＰＥＲ ＴＷＩＧ（１）６における核分子構造のサイズ等を考慮して、ペプチドライブラリーを多価にするために使用する核構造として、次式

で表わされるリジン（Ｌｙｓ）を３個結合させた構造を用い、スペーサーを介して４個のペプチドライブラリーを結合した化合物を合成した。この化合物は、前記式におけるＬｙｓ核分子構造における末端アミノ基に、次式
ＭＡＸＸＸＸＡ−ＡＨＡ−（配列番号５）
で表わされる４個のペプチドライブラリー（Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ）を結合したもの：（ＭＡＸＸＸＸＡ−ＡＨＡ）_４−３Ｌｙｓである。この化合物については、式中のＡＨＡは、ａｍｉｎｏ−ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄを示しており、スペーサー分子を構成している。
ＡＨＡ（ａｍｉｎｏ−ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）はＣａｒｂｏｎ６個分のながさで、ＳＵＰＥＲ ＴＷＩＧの最適条件に合致させるために使用している。また、末端のＭＡ（Ｍｅｔ−Ａｌａ）は、アミノ酸シークエンスを行ったときにちゃんとシークエンスが行われているかどうかのチェックのために、スクリーニング時に導入している。ＡＨＡ−の前のＡ（Ａｌａ）も同様の理由による。その形状、核構造に存在する分岐鎖間距離、ライブラリーの価数、ライブラリー間の距離、すべての点においてＳＵＰＥＲ ＴＷＩＧの最適構造に合致するようにデザインしている。また得られた化合物をアミノ酸
シークエンスにかけたところ、アミノ酸をｄｅｇｅｎｅｒａｔｅしたｐｏｓｉｔｉｏｎでは使用した１９種のアミノ酸（Ｃｙｓを除く）が効率よくランダマイズされていることが確認できた。
この１次ペプチドライブラリーを用いて、まずｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ＳＴＸ２Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔに結合するペプチドモチーフを、またサイト３のｍｕｔａｎｔ ＳＴＸ２Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔに結合するペプチドモチーフを決定した。すなわち、まずビーズにつけた２Ｂおよび２Ｂ−ｍｕｔａｎｔ（Ｗ３２Ａ）の各々を３−５ｍｇ相当調整し、この各々をカラムにつめてａｆｆｉｎｉｔｙカラムを作製する。
そこに、５０ｍｇ程度の１次スクリーニング用ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｙ：（ＭＡＸＸＸＸＡ−ＡＨＡ−）_４−３Ｌｙｓを加えて十分に結合させる。そのあとＰＢＳ等で十分に洗浄し、結合しなかったｌｉｂｒａｒｙを洗い流す。
最後にカラムに止まっているｌｉｂｒａｒｙを３０％酢酸で溶出する。回収された画分をｄｒｙｕｐし、アミノ酸配列解析を行う。その結果、各ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎについて、どのアミノ酸がどの程度の強さで選択されてくるか、数値化された結果が得られる。１９種のアミノ酸すべての値をたすと１になるようにｎｏｒｍａｌｉｚｅする。
そして、２Ｂを用いるときに、前記のようにして得られた、各ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎの各アミノ酸の値を、ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ：Ｗ３２Ａを用いたときに、前記のようにして得られた、対応するｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎの、対応するアミノ酸の値で割る。その結果、そのアミノ酸が２ＢではＷ３２Ａにくらべて何倍選択されるようになったかが数値化である。つまり、前者のモチーフ中に存在している各アミノ酸の選択比を後者のモチーフ中に存在している対応するアミノ酸の選択比で除することによって、ＳＴＸ２Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔのサイト３特異的な結合モチーフを決定することができる。
その他の１８種のアミノ酸について同様の検討をおこない、最後に１９種のアミノ酸の値をすべてたすと１９になるようにｎｏｒｍａｌｉｚｅする。このとき、各アミノ酸の間で、選択性に差がないと値は１となる。一般にこの値が１．５を越えると強い選択性がみられたと判断する。その結果を示したものが表１である。なお、以下の表１〜表４、さらには図６〜図７においては、アミノ酸は一文字標記としている。

ついで得られたモチーフを基にして、表２に示す２次ライブラリーを作製した。実際には、１次クリーニングで、Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ｐｈｅなどのアミノ酸が選択されてきたので、これらのアミノ酸をｆｉｘｅｄ ｐｏｓｉｔｉｏｎとして２次スクリーニングに導入する。するとｌｉｂｒａｒｙ全体としての２Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔに対する結合性が増加するので、より特異的なモチーフが得られやすくなる。

この２次ペプチドライブラリーを用いて、前記と同様にｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ＳＴＸ２Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔに結合するペプチドモチーフを、またサイト３のｍｕｔａｎｔ ＳＴＸ２Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔに結合するペプチドモチーフを決定した。前者のモチーフ中に存在している各アミノ酸の選択比を後者のモチーフ中に存在している対応するアミノ酸の選択比で除することによって、１次ペプチドライブラリーを用いて得られたモチーフよりもより選択性高く、ＳＴＸ２Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔのサイト３特異的な結合モチーフを決定することができた。その結果を示したものが表３である。

得られたペプチドモチーフは、そのアミノ酸配列が
（１）ＦＲＲＮＲＲＮ（配列番号１）
（２）ＰＰＰＲＲＲＲ（配列番号２）
（３）ＰＰＲＲＮＲＲ（配列番号３）
（４）ＫＲＲＮＰＲＲ（配列番号４）
である。なお、モチーフ（１）ＦＲＲＮＲＲＮ（配列番号１）については、２次スクリーニングでも塩基性アミノ酸、Ｐｒｏ、疎水性アミノ酸が選択されてくるものの、ベストなモチーフとして各ｐｏｓｉｔｉｏｎについて一番数値の高いものを取出してゆくと、疎水性アミノ酸が好まれるという情報が反映されなくなってしまうので、各ｌｉｂｒａｒｙを通して得られるｃｏｎｓｅｎｓｕｓ配列としてＰｈｅを導入したものである。
そこで、得られたモチーフを３個のＬｙｓを結合した前記式の分子核構造に、
Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｘｏ−Ａｌａ−ＡＨＡ−
（Ｘｏは前記モチーフのいずれかを示し、ＡＨＡは前記のものを示す。）
として組み込んだ化合物を合成した。その際には、Ｌｙａ３の核構造はビーズに結合した状態で市販されているので、通常のアミノ酸合成装置でＣ末端から順次合成し、つまり、３Ｌｙｓの式において４本一度に鎖をのばす。ＡＨＡもアミノ基とカルボキシル基を有するので同様にアミノ酸合成装置の使用が可能である。
これら化合物については質量分析により同定を行った。図１、図２、図３および図４は、各々、前記のペプチドモチーフ（１）（２）（３）（４）の場合のマススペクトルを示したものである。また、図５は、参考として、前記のペプチドモチーフのいずれも有さない化合物（Ｍｅｔ−Ａｌａ）：Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＡＨＡの場合のマススペクトルを示したものである。
＜ＳＴＸ２阻害性ペプチドとベロ毒素中和剤＞
以上の化合物の各々についてＳＴＸ２Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔに対する親和性を調べたところ、高い親和性で結合することが示された。さらにｖｅｒｏ細胞に対するＳＴＸ２の細胞毒性を効率よく阻害することが明らかとなった。
表４および図６は、ＳＴＸ２Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔに対する親和性を示している。測定方法は次のとおりである。
すなわち、まず図６に示す量の合成ペプチドをＥＬＩＳＡ用ｐｌａｓｔｉｃ ｐｌａｔｅにコートする。１％ＢＳＡでブロッキング後、０．１ｍｉｃｒｏｇｒａｍ／ｍｌのｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ２Ｂ−Ｈｉｓまたはｓｉｔｅ ３ ｍｕｔａｎｔ Ｗ３２Ａ−Ｈｉｓをくわえて室温１時間結合させる。洗浄後、結合した各２Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔを抗ＳＴＸ２ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙを用いたＥＬＩＳＡ法にて検出する。
図６中の小図は、既知量のｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ２Ｂ−Ｈｉｓまたはｓｉｔｅ ３ ｍｕｔａｎｔ Ｗ３２Ａ−Ｈｉｓに対しては抗ＳＴＸ２ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙは同様に反応することを示している。
また、図７Ａは、ｖｅｒｏ細胞に対するＳＴＸ２細胞毒性の阻害効果を示したものである。この図７の結果の測定においては、培養ｖｅｒｏ ｃｅｌｌに、１ｐｇ／ｍｌのＳＴＸ２、及び各濃度の各合成ｐｅｐｔｉｄｅを存在させ、３日間培養し、培養後の生存細胞をＷＳＴーａｓｓａｙ（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ ｋｉｔ）にて定量している。
ＳＴＸ２（−）の条件での定量値を１００％、ＳＴＸ２、１ｐｇ／ｍｌ単独の場合（つまりｉｎｈｉｂｉｔｏｒなし）を０％として、表示してある。
また、図７Ｂは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７感染のマウスを対象にした検証結果を示したものである。手順は以下のとおりである。すなわち、０日目：タンパク質カロリー欠乏マウスに、致死量のＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ Ｎ−９株を胃内感染させた。２日目〜４日目：マウスに、試料ペプチド、トリサッカロイド類似体（体重あたり、７５μｇ／ｇ）、または、サリンのみを１日２回、胃内投与した。２日目〜５日目：ＰＰＲ−ｔｅｔまたはＰＰＰ−ｔｅｔ（体重あたり、２２５μｇ／ｇ）を１日２回、胃内投与した。
本発明の試料ペプチドの優れた作用効果が確認される。
なお、図６および図７中の表示；ＭＡは前記のペプチドモチーフ（１）（２）（３）（４）のいずれも有していない、図５にマススペクトルを示した参考化合物（Ｍｅｔ−Ａｌａ）：Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＡＨＡによるコントロールの場合を示している。また、図７におけるＰＰＲ−ｔｅｔ等の表示は、表４に示したものに対応している。

前記例示の化合物についてはＡＨＡ（ａｍｉｎｏ−ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）をスペーサー分子として、そしてこのＡＨＡとペプチドモチーフＸｏとの間に介在するＡｌａ並びにペプチドモチーフＸｏの末端修飾分子Ｍｅｔ−Ａｌａをアミノ酸シークエンスの確認のために導入しているが、これらは各種であってよい。スペーサー分子としてのＡＨＡは、アミノ基とカルボキシル基を有する炭素数６個の鎖長のものとしてＳＵＰＥＲ ＴＷＩＧとの対比検討から選択されたものであるが、この炭素数は、６個がより好ましいとしても、４〜１０個の範囲程度であってもよい。
また、ペプチドモチーフＸｏと分子核構造部３ＬｙｓによるＳＴＸ２阻害活性を損なわない限り、スペーサー分子については他の各種の分子によるものであってもよい。
また、スクリーニング時のアミノ酸シーケンスのために導入している末端Ｍｅｔ−ＡｌａそしてＡＨＡに結合しているＡｌａについては他の適宜なものであってよい。これらは、ＳＴＸ２の阻害活性そのものを有していないため、スクリーニングの後には不要なものである。だたモチーフの末端にＮＨ_２が露出するとプラス電荷になることから、電荷調節の観点からは、末端のＭＡもしくは他種のものが存在することが好適である。これらは、一般的には電荷がないもの、さらには疎水性にも大きな影響を与えないものがさらには好適に考慮される。
このような修飾等は各種考慮されてよい。
たとえば、経口投与にともなう消化管内でのプロテアーゼによる分解を抑えるための安定化を目的としてＮ−末端のＭｅｔのＮＨ_２基をアセチル基により保護してしまうことが考えられる。
そして発明者が確認したところでは、アセチル化すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＳＴＸ２による細胞障害活性を阻害する作用（活性）は約５倍増大する。そして感染実験によっても効果の増大が確認されている。
このようなことからも、たとえば（ａｃｅｔｙｌ−Ｘｏ−ＡＨＡ）_４３Ｌｙｓ、あるいはａｃｅｔｙｌを他の保護基に変更したり、ＡＨＡを別のスペーサーに変更した場合、さらにはスペーサーを用いない場合についても好適に考慮されることになる。
そして本発明者の検討によれば、以上のとおりのスクリーニング法によって導かれたＳＴＸ２阻害性ペプチドについては、その活性が発現されるものとしてさらに各種のバリエーションが見出されるている。
すなわち、より一般的には、ＳＴＸ２阻害性ペプチドとしては、リジン（Ｌｙｓ）３分子がペプチド結合された分子核構造部に、少くとも７個のアミノ酸のペプチド結合によって構成されるペプチドモチーフであって、その配列において、少くとも２個の塩基性アミノ酸、たとえばアスパラギン（Ａｒｇ）や、リジン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）が結合したクラスター部を２箇所有し、Ｃ−末端側が塩基性アミノ酸であるペプチドモチーフが組込れているものとして考慮されることが見出されている。
なかでも、クラスター部を構成する塩基性アミノ酸としてはアルギニン（Ａｒｇ）を含むことが好適に考慮される。このため、たとえば好適なクラスター部は、−Ａｒｇ−Ａｒｇ−、−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−等である。
また、本発明のＳＴＸ２阻害性ペプチドにおいてはＣ−末端側は塩基性アミノ酸、たとえばアルギニン（Ａｒｇ）等であり、Ｎ−末端側が疎水性アミノ酸、たとえばプロリン（Ｐｒｏ）等であることが好ましい。
Ｃ−末端側が塩基性アミノ酸であることが望ましいことは、結合する相手であるＳＴＸ２ Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔのグロボ３糖結合部位３（Ｓｉｔｅ３）付近に酸性アミノ酸のクラスターが存在することから、両者が静電的な相互作用をして親和性を増加させるためであると考えられる。また、Ｎ−末端側が疎水性アミノ酸が望ましい理由としては、ＳＴＸ２Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔのグロボ３糖結合部位３（Ｓｉｔｅ３）で中心的な役割を果たしている、トリプトファン（Ｔｒｐ）と疎水性の相互作用することによって考えられる。
以上のことからも、本発明においては、前記の（１）（２）（３）（４）のペプチドモチーフが好適なものの一つとして提供されることになる。
なお、本発明におけるペプチドモチーフは、ＳＴＸ２阻害作用についての分子サイズ効果を考慮して前記のとおりの少くとも７個のアミノ酸により構成されているが、前記の７個以上であってもＳＴＸ２阻害性を大きく損わない限り、薬剤等への利用としてさらにアミノ酸数が多くしてもよく、また、前記のように各種のスペーサや末端修飾基を有していてもよいことは改めて言うまでもない。
そして、本発明においては、以上のように、ＳＴＸ２阻害活性を有するペプチドを有効成分とするベロ毒素中和剤としては、各種の剤型が採用されてよく、経口投与では、賦型剤等とともに成形して、錠剤や粉末としてもよいし、精製水等との組成物として液剤としてもよい。これらの組成物や剤型については従来公知のものをはじめとする各種の配合成分が用いられてよいし、そのための各種の方法が採用されてもよい。
ベロ毒素中和剤としての投与量については、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７感染が発見されてから、一般的には５〜５００ｍｇ／ｋｇ−体重程度となるように処方することが考慮されてよい。もちろん症状によって適宜としてよい。
なお、近年、微量で強力な生理活性を有するペプチドが数多く発見され、また遺伝子組換え技術や細胞融合などのバイオテクノロジーの急速な進歩によるペプチドの大量供給が可能になり、これら生理活性ペプチドを医薬品として疾病の治療に応用しようとする試みがなされている。しかしながら、こうしたペプチド性医薬品を経口投与しても十分な吸収率が得られないことが知られている。この原因は、これらペプチド性医薬品が消化管内の消化酵素やタンパク分解酵素により速やかに分解を受けたり、あるいは水溶性で高分子であるため消化管粘膜を透過しにくいことによると考えられる。このため、これら医薬品の投与法は、臨床上ほとんどすべてが筋肉投与、皮下投与及び静脈内投与などの注射による投与に限られているのが現状である。しかしながら、これら注射による投与は、患者に苦痛を伴い、またアレルギー反応やアナフィラキシーショックなどの重篤な副作用を発現するという欠点を有する。そこで最近では、こうした注射に代わる投与経路として経口投与をはじめとする経粘膜投与が注目されているが、注射に比べると十分な吸収率が得にくいのが現状である。したがって、現在では経口並びに経粘膜投与後の生理活性ペプチドの吸収率を改善するため、種々の方法が試みられているが、それらを大別すると、（１）吸収促進剤やタンパク分解酵素阻害剤などの製剤添加物の利用、（２）薬物の新規投与経路の開発、（３）薬物の分子構造修飾、（４）薬物の剤形修飾に分類できる。
本発明においても実際の薬剤としての投与に際して、経口投与を可能にするためにこれまでの技術知見を踏まえた様々な形態を採用することができる。たとえば吸収促進剤として代表的な界面活性剤や胆汁酸、キレート剤、脂肪酸等の炭化物を用いることや、タンパク分解酵素阻害剤としてグリココール酸ナトリウムやバシトラシン、大豆トリプシンインヒビター、カモスタット、アプロチニン等を添加すること、あるいはリポソームやエマルジョンに包含させたり、カプセルに封入して使用することなどの適宜な手段が採用されてよい。

本発明の方法によれば、前記のとおりのベロ毒素やコレラ毒素、百日咳毒素、炭疽菌毒素等の受容体結合部がサブユニット構造をもつ毒素の阻害性を有し、その合成がペプチド合成として容易であって、治療薬としても有効な毒素中和性のペプチドをスクリーニングすることが可能とされ、これらペプチドの提供が可能とされる。
そして、前記のとおりの本発明のペプチドはＳＴＸ２阻害性を有し、その合成がペプチド合成として容易であって、腸管出血性大腸菌感染症の治療薬として有効なベロ毒素中和剤を提供することができる。

Claims (13)

1. 複数の受容体結合サイトを有し、この受容体結合サイトが細胞の受容体と多価結合する毒素を中和することのできるペプチドのスクリーニング方法であって、以下のステップ：
   （１）毒素の受容体結合サイトのうちの一つにミューテーションを導入し、ミュータントを作成するステップ；
   （２）野性型毒素と前記ミュータントに、degenerate positionを含むペプチドモチーフを複数有する多価ペプチドライブラリーを反応させるステップ；および
   （３）野性型毒素と結合した多価ペプチドライブラリーのペプチドモチーフと、前記ミュータントと結合した多価ペプチドライブラリーのペプチドモチーフとを対比し、アミノ酸選択比の高いアミノ酸をペプチドモチーフのdegenerate position のアミノ酸として特定するステップ
   を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
2. 前記（３）のステップは、アミノ酸選択比の高いアミノ酸をペプチドモチーフにおけるfixed positionとした多価ペプチドライブラリーを作成し、この多価ペプチドライブラリーを再び野性型毒素と前記ミュータントに反応させて、アミノ酸選択比の高いアミノ酸をペプチドモチーフのdegenerate position のアミノ酸として特定するステップを含むことを特徴とする請求項１のスクリーニング方法。
3. 多価ペプチドライブラリーは、リジン（Ｌｙｓ）が複数個結合した分子核構造の末端にペプチドモチーフを有することを特徴とする請求項１または２のスクリーニング方法。
4. 多価ペプチドライブラリーは、分子核構造とペプチドモチーフが、スペーサーを介して結合していることを特徴とする請求項３のスクリーニング方法。
5. 毒素がベロ毒素ＳＴＸ１またはＳＴＸ２であることを特徴とする請求項１のスクリーニング方法。
6. リジン（Ｌｙｓ）３分子によって形成された以下の分子核構造、
   

   

   における末端のＮＨ−の各々に、以下の（１）から（４）のペプチドモチーフ
   （１）ＦＲＲＮＲＲＮ（配列番号１）
   （２）ＰＰＰＲＲＲＲ（配列番号２）
   （３）ＰＰＲＲＮＲＲ（配列番号３）
   （４）ＫＲＲＮＰＲＲ（配列番号４）
   のいずれかが結合していることを特徴とするＳＴＸ２阻害性ペプチド。
7. 前記（１）から（４）のペプチドモチーフは、スペーサー分子を介して分子核構造と結合していることを特徴とする請求項６のＳＴＸ２阻害性ペプチド。
8. スペーサー分子は、ペプチドまたはアミノ基とカルボキシル基とを有し、炭素数４〜１０の炭化水素鎖構造を持つ分子であることを特徴とする請求項７のＳＴＸ２阻害性ペプチド。
9. ペプチドモチーフが末端修飾分子を有していることを特徴とする請求項６から８のいずれかＳＴＸ２阻害性ペプチド。
10. 末端修飾分子は電荷を有していない分子であることを特徴とする請求項９のＳＴＸ２阻害性ペプチド。
11. ペプチドモチーフは、Ｎ末端にMet−Alaを有していることを特徴とする請求項６から１０のいずれかのＳＴＸ２阻害性ペプチド。
12. 分子核構造の末端のＮＨ−の各々に、次式（ａ）（ｂ）のいずれかが結合していることを特徴とする請求項５のＳＴＸ２阻害性ペプチド。
    Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｘｏ−Ａｌａ−ＡＨＡ− （ａ）
    ａｃｅｔｙｌ−Ｘｏ−ＡＨＡ− （ｂ）
    〔式中のＡＨＡは、アミノ−ヘキサンカルボン酸基を示し、Ｘｏは、前記のペプチドモチーフ（１）（２）（３）（４）のいずれかを示す。
13. 請求項６から１２のうちのいずれかのペプチドを有効成分として含有することを特徴とするベロ毒素ＳＴＸ２中和剤。

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