JP5718574B2 - ペプチドのスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
(A)以下(1)〜(3)のステップ、
(1)野生型の標的タンパク質の受容体結合サイトのうちの一つにミューテーションを導入し、ミュータントを作成するステップ、
(2)野性型と前記ミュータントに、degenerate positionを含むペプチドモチーフを複数有する多価ペプチドライブラリーを反応させるステップ、および
(3)野性型と結合した多価ペプチドライブラリーのペプチドモチーフと、前記ミュータントと結合した多価ペプチドライブラリーのペプチドモチーフとを対比し、アミノ酸選択比の高いアミノ酸をペプチドモチーフのdegenerate position のアミノ酸として特定するステップ、
を含むランダム多価ライブラリー法を用いて、1以上のアミノ酸非特定部位が存在する標的タンパク質結合モチーフを決定するステップ;
(B)シート上のアミノ基から、直接またはスペーサーを介して、2価ペプチドの合成核構造または4価ペプチドの合成核構造を形成し、このペプチド合成核構造から、標的タンパク質結合モチーフのアミノ酸配列からなる2価または4価ペプチドを伸長させて、ペプチド毎にアミノ酸非特定部位のアミノ酸(Cysを除く)が異なる多価ペプチドライブラリーを作成するステップ;
(C)多価ペプチドライブラリーの各々の2価ペプチドまたは4価ペプチドに標的タンパク質をブロットするステップ;
(D)標的タンパク質が結合したペプチドが、目的ペプチドであると決定するステップ;
を含む。
(A)ランダム多価ライブラリー法を用いて、1以上のアミノ酸非特定部位が存在する標的タンパク質結合モチーフを決定するステップ;
(B)シート上のアミノ基から、直接またはスペーサーを介して、2価ペプチドの合成核構造または4価ペプチドの合成核構造を形成し、このペプチド合成核構造から、標的タンパク質結合モチーフのアミノ酸配列からなる2価または4価ペプチドを伸長させて、ペプチド毎にアミノ酸非特定部位のアミノ酸(Cysを除く)が異なる多価ペプチドライブラリーを作成するステップ;
(C)多価ペプチドライブラリーの各々の2価ペプチドまたは4価ペプチドに標的タンパク質をブロットするステップ;
(D)標的タンパク質が結合したペプチドが、目的ペプチドであると決定するステップ;
を含む。
(1)2価ペプチドの合成
特許文献1の多価型ランダムペプチドライブラリーの欠点を改善するため、図1の概要図に示すように、配列既知の2価、4価ペプチドをセルロースシート上にスポット合成することを検討した。図1の合成核構造は、Fmocが除去されたリジンを示している。
Stx1 B-subunit(1BH)を標的タンパク質とした場合の、シート上ペプチドの集積密度を最適化するため、3種の密度で2価ペプチドを合成した。これは、ペプチド合成を2価で行った場合の立体障害の影響を評価するためである。このとき、標的タンパク質の結合モチーフとして、配列番号1:Met-Met-Ala-Arg-Arg-Arg-Arg(MMARRRR)を採用した。
(3)スペーサー長の最適化
シート上に合成されるペプチドのシートからの距離(自由度)を最適化するため、3種のスペーサー長を持つ2価ペプチドを合成した。図4に示すようにβAlaと分岐点となるLys(Fmoc)との間に存在するスペーサーとしてのAhx(amino hexanoic acid [NH2-(CH2)5-COOH])の数を1、2、3で合成し、1BHでブロットした際の結合の強さを比較した。
(4)前記(2)(3)の結果を踏まえて、シート上の2価ペプチドは、図6に示すように、密度100%とし、スペーサー(Ahx)の数は1個とした。
<2>ランダム多価ペプチドライブラリー法を用いたSTX1のサイト2特異的結合モチーフの同定
先願(WO2006/001542公報)の手順に従い、ランダム多価ペプチドライブラリー法を用いてSTX1のサイト2を標的とした結合モチーフの同定を行った。スクリーニングには、多価ペプチドライブラリーとして、以下の化学式、
価のペプチド性化合物(以下、KRR-tetと記す)を合成した。
<3>2価ペプチドライブラリーのシート合成技術を用いたSTX1のサイト2特異的結合阻害薬の同定
上記<2>のスクリーニング結果から、STX1のサイト2に結合するためには、図7に示すように、position 4-7にArg(R)が選択されてくるという点に着目した。
入れ、4価のペプチド化合物11種を、最終的なSTX1サイト2特異的阻害薬候補として合成した。
Claims (4)
- クラスター効果を有する標的タンパク質との結合性を有するペプチドのスクリーニング方法であって、以下のステップ:
(A)以下(1)〜(3)のステップ、
(1)野生型の標的タンパク質の受容体結合サイトのうちの一つにミューテーションを導入し、ミュータントを作成するステップ、
(2)野性型と前記ミュータントに、degenerate positionを含むペプチドモチーフを複数有する多価ペプチドライブラリーを反応させるステップ、および
(3)野性型と結合した多価ペプチドライブラリーのペプチドモチーフと、前記ミュータントと結合した多価ペプチドライブラリーのペプチドモチーフとを対比し、アミノ酸選択比の高いアミノ酸をペプチドモチーフのdegenerate position のアミノ酸として特定するステップ、
を含むランダム多価ライブラリー法を用いて、1以上のアミノ酸非特定部位が存在する標的タンパク質結合モチーフを決定するステップ;
(B)シート上のアミノ基から、直接またはスペーサーを介して、2価ペプチドの合成核構造または4価ペプチドの合成核構造を形成し、このペプチド合成核構造から、標的タンパク質結合モチーフのアミノ酸配列からなる2価または4価ペプチドを伸長させて、ペプチド毎にアミノ酸非特定部位のアミノ酸(Cysを除く)が異なる多価ペプチドライブラリーを作成するステップ;
(C)多価ペプチドライブラリーの各々の2価ペプチドまたは4価ペプチドに標的タンパク質をブロットするステップ;
(D)標的タンパク質が結合したペプチドが、目的ペプチドであると決定するステップ;
を含むことを特徴とするペプチドのスクリーニング方法。 - ペプチド合成核構造は、リジンを含むことを特徴とする請求項1のスクリーニング方法。
- 標的タンパク質は、STX1またはSTX2、STX1c、STX2c、 STX2e、STX2d、STX2f、コレラ毒素、易熱性エンテロトキシン、HAタンパク質、gp120、セレクチン、アディポネクチンのうちの1種または2種以上であることを特徴とする請求項1のスクリーニング方法。
- 請求項1のスクリーニング方法に使用されるキットであって、シート上のアミノ基から、直接またはスペーサーを介して、2価ペプチドの合成核構造または4価ペプチドの合成核構造が形成されている特徴とするスクリーニング用キット。
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