JP2006527250A - 変形性関節症を治療するためのものであり、ｓａｐの結合を阻害する化合物 - Google Patents

Abstract

患者の変形性関節症を治療または予防する薬品を製造するために、血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）リガンド結合活性を阻害できる薬剤または患者の血漿からＳＡＰを消失させることができる薬剤を使用する方法。

Description

本発明は、変形性関節症の治療または予防に関するものである。

変形性関節症は関節症の最も代表的な形態であり、欧米人種では、５５歳以上の人口のうち８０％においてＸ線写真により検出され得る。膝の変形性関節症は、Ｘ線写真にて確認できる異常と共に痛みを伴う症状を示し、米国とイギリス両国における３０歳以上の人口のうち約６％がその症状を有する。米国においては、約２．１千万人が医師により変形性関節症と診断されており、その内のほとんどの人がかなりの痛みと身体的障害に苛まれている。実際、全患者のうちの約１２％の人が変形性関節症のために行動を制限されており、他のいかなる疾患よりも歩行や階段の昇降の際に介護を要する原因となっている。１９９４年の米国における変形性関節症にかかる年間コストの推定は、ＧＮＰのほぼ１％である１５５億ドルであり、そのうち５０％超のコストは労働損失による。この問題は、老齢人口にとっては必然的により厳しいものとなり、年齢は明らかに変形性関節症の発症と関連する（参考文献１）。

変形性関節症の病状としては、関節軟骨の消耗や、繊維軟骨と活発な骨形成を伴う複雑な修復過程の消失が挙げられ、それにより正常な関節と関節周辺の構造の破壊が引き起こされる。これには痛み、滑液の滲出、および機能損失が伴う。

伝統的な治療法としては、減量、運動および心理社会的サポート；鎮痛剤；非ステロイド性抗炎症薬；関節内コルチコステロイド；ヒアルロン酸；関節洗浄；人的支援および器具の使用が挙げられる。しかしながら、これらの保守的な治療法は、多くの患者にとり不十分になってきており、骨膜切除、半月板の裂傷の修復、再編成のための骨切断といった手術を必要とし、遂には全関節の置換を必要とすることがある。変形性関節症にとっては後者が唯一の治療法であるが、ある限られた関節と個人にのみ適用可能であることは明らかである。

実験的であまり有効ではない他の治療方法としては、損傷を受けた軟骨の維持或いは修復という触れ込みによるグルコサミンおよびクロンドロイチン硫酸の投与があり、またテトラサイクリン、インターロイキン−１拮抗薬、コラゲナーゼおよび他のプロテイナーゼ阻害剤の投与が挙げられる。

よって、変形性関節症の進行を緩和することができ、さらに重要なことには、痛み、関節変形や滲出液、行動の制限や身体的障害といった、痛ましく通常生活を妨げる症状を軽減できる新たな薬物療法が強く求められている。

血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）は、血漿タンパク質のうちあまり進化せず進化学的に古来からあるペントラキシンファミリーの１つであり（参考文献２）、他のペントラキシンファミリーとしては、古典的な急性期タンパク質であるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）がある（参考文献３）。同じ３Ｄフォールド（参考文献４，５）、オリゴマー集合体、そしてカルシウム依存性リガンド結合能という性質を有する相同タンパク質は、全ての脊椎動物が備えており（参考文献６）、約６億年前に進化の過程で霊長類から分かれたカブトガニの一種であるアメリカカブトガニでさえ備えている（参考文献７）。ヒトにおいては、ＳＡＰの欠如或いはタンパク質多型は未だ文献報告されておらず、その炭水化物成分はいかなる既知の糖タンパク質の中で最も不変である（参考文献８）。このことは、ＳＡＰが生存に貢献する有利な作用効果を有するということの有力な証拠となる。

しかしながらＳＡＰの名称は、アミロイドーシスの病状において、ＳＡＰが病理学的組織のアミロイド沈着中に必ず存在することに由来している（参考文献９）。これらの沈着の塊には、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸型のグリコサミノグリカンが堅固に結合しており（参考文献１１）、特徴的なクロス−βフォールドを有しミスフォールドして凝縮した自己由来のタンパク質からなるアミロイド原繊維により構成されている（参考文献１０）。ＳＡＰは、in vitro（参考文献１２）とin vivo（参考文献１３，１４）の両方において、これら原繊維に特異なカルシウム依存性結合をする。かかる性質は、全身性および局所性の脳以外におけるアミロイドーシスでの沈着を診断し、また観察するための特異的な高感度で且つ定量的なin vivoシンチグラフィトレイサーとしての放射線標識化ＳＡＰを開発するために利用されてきた（参考文献１５）。

臨床上最も重要である脳以外の局所性アミロイドーシスの１つの形態として、透析アミロイドーシスがある。これは非常に深刻で苦痛を伴い、末期腎不全のための長期間の透析の致命的な合併症である。このタイプのアミロイドは、概して関節と関節周辺の構造で起こり、神経圧迫や骨嚢胞を起こし、遂には関節の破壊や病理学的骨折を引き起こす。透析アミロイドーシスは放射線標識化ＳＡＰを使用して広く研究されており、関節やその周辺における取り込みが、これらの位置における組織学的に証明されたアミロイド沈着に特異的であることが示されている（参考文献１６，１７）。

ＳＡＰにより結合される薬剤は、アルツハイマー病を含むアミロイドーシスの治療を目的として開発されてきた。ＷＯ９５／０５３９４には、アミロイドーシスの治療用および診断用の薬剤であり、ＳＡＰによるアミロイド原繊維への結合を阻害する分子を含む薬剤が記載されている。ＥＰ−Ａ−０９１５０８８Ａには、アルツハイマー病および成人発生型糖尿病を含む中枢性および全身的アミロイドーシスの治療および予防に使用されるＤ−プロリンおよびその誘導体が記載されている。ＷＯ０３／０１３５０８には、血漿から不要なタンパク質を減少させるための治療剤であり、それに含まれる二官能性物質が複数のタンパク質と複合体を形成し、患者の血漿からそのタンパク質を減少させる治療剤が記載されている。上記文献では、Ｒ−１−［６−Ｒ−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−６−オキソヘキサノイル］ピロリジン−２−カルボン酸が、in vivoで特異的にＳＡＰを標的とし、天然五量体ＳＡＰ分子の凝縮を引き起こして十量体ＳＡＰ薬剤複合体とし、かかる複合体が肝臓により速やかに除去されることが開示されている。

本発明は、患者における変形性関節症を治療または予防する薬品を製造するための、薬剤の使用方法に関するものである。当該薬剤は、ＳＡＰリガンド結合活性を阻害することができ、または患者の血漿からＳＡＰを消失することができる。

驚くべきことに、変形性関節症の患者の治療において、上記薬剤の使用により病状の緩和に大きな効果を得られることが見出だされた。

第一の態様においては、本発明薬剤はＳＡＰリガンド結合活性を阻害することができる。ＳＡＰリガンド結合活性の阻害が可能である薬剤としては、ＳＡＰに存在する結合部位に結合するリガンドにより結合され得るものと、その他の位置で結合されてＳＡＰのリガンド結合活性をブロックしたり阻害するものとがある。従って、ＳＡＰリガンド結合活性の阻害は、直接阻害によっても或いはアロステリック阻害によってもよい。この阻害は競合的または非競合的であってもよく、また、可逆的または不可逆的であってもよい。

変形性関節症を治療または予防するために使用されるものであり、ＳＡＰリガンド結合活性を阻害できる薬剤の一般的な選択方法は、被検化合物の存在下、ＳＡＰのリガンド結合が許容される条件で、血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）を標的リガンドに接触させること；ＳＡＰリガンド結合の試験；および、被検化合物がＳＡＰの標的リガンドへの結合を阻害した場合、被検化合物をＳＡＰ阻害剤として選択することを含む。

本発明はさらに、抗変形性関節症薬剤の製造プロセスを提供する。そのプロセスは、（ｉ）上記方法に従って化合物を選択することによって、ＳＡＰ阻害剤を同定すること、および（ii）ＳＡＰ阻害剤または薬学的に許容されるその誘導体を提供することにより、抗変形性関節症薬剤を製造することを含む。

それゆえ本発明は、被検化合物の存在下でのＳＡＰリガンド結合試験を含む方法であり、ＳＡＰ阻害剤を選択する方法を使用する実施形態に関する。ＳＡＰのリガンド結合を阻害するものであれば、いかなる被検化合物でも阻害剤として選択してよい。例えば、被検化合物は、同定された後に化学的または生化学的合成により大規模に製造され得るものを選択してもよいし、或いは、抗変形性関節症薬剤として直接的に製剤化するための物理学的な理由で選択されてもよい。上記薬剤の製造プロセスに従って、被検化合物を薬学的用途のために製剤化すればよく、或いは薬学的に許容される誘導体を製造するために誘導体化してもよく、または化学修飾してもよい。また、例えば化合物の溶解度を変えるなど、薬剤をより製剤し易くすべく、新たな官能基を組み込むため或いは既存の官能基を変換するため、上記のような誘導体化が求められることもある。このような種類の誘導体化は、化合物の毒性の減少、化合物の安定性の変更、または化合物の薬理学的活性の修正などに用いられてもよい。上記のように誘導体化または修正を行った化合物については、本発明の方法に従って再検査を行う必要がある。

ＳＡＰをリガンドと接触させるステップでは、被検化合物無しでＳＡＰリガンド結合が許容されるような十分な条件を備えておかなければならない。こうすることにより、被検化合物の存在下ではＳＡＰリガンド結合が起こらず、または起こったとしても予想より少なければ、この効果は被検化合物に起因すると考えられる。ここにおいて、結合の阻害は広く解釈され、いかなる特定の機構にも限定されるべきではない。本発明では、結合の阻害はいかなる結合範囲で減少してもよい。一般的に、結合の阻害はコントロール値（被検化合物無しでの最大結合値）を基準として測定され、好ましくはＩＣ₅₀がμｍｏｌ以下であり、さらに好ましくはｎｍｏｌ以下である。接触は、ＳＡＰの特異的なカルシウム依存性結合を許容するために、遊離カルシウムイオンを十分含む条件下で行われる。加えて、単離されたＳＡＰに特徴的なカルシウム依存性の自動凝集（参考文献１８，１９）を防ぐために、十分な量の血清アルブミンを確保することが必要である。接触における好ましい緩衝剤は、生理緩衝食塩水である。ＳＡＰは、単離精製された形態で、または全血清に取り込まれた形態で提供されてもよい。

ＳＡＰが結合するリガンドで適切なものとしては、ヒトまたは他の哺乳類由来のもの、下等動物または微生物起源に由来するもの、および合成物質が挙げられる。高分子リガンドには、ＤＮＡ、クロマチン、アミロイド原繊維、グリコサミノグリカン（特にヘパリン硫酸、ヘパラン硫酸、およびデルマタン硫酸）、アガロース、およびＳＡＰにより特異的に認識されるカルボキシエチリデン環を有する他の炭化水素が含まれる。合成リガンドには、固相に結合したカルボキシル基への共有結合的なカルボジイミドカップリングにより固定化されたホスフォエタノールアミン基が含まれる。微生物のようなリガンドを有する適切な固体物質と共に、細菌のような全生命体を使用することができ、これにより実際のリガンド分子の精製を行う必要がなくなるという便宜が図られる。ＳＡＰが強く結合する細菌として適切なものとしては、化膿連鎖球菌（参考文献２０）および髄膜炎菌（参考文献２１）が挙げられる。ＳＡＰ用リガンドを有するウィルスとして最も適切なものは、ヒトのインフルエンザウィルス（参考文献２２）である。

ＳＡＰ、標的リガンドおよび被検化合物が接触する順序は重要ではない。基本的に３つ全ての成分が同時に混合されてもよく、３つの化合物のうち２つを混合し、３つ目の成分を加える前にプレインキュベートしてもよい。接触は、一般的に３つの化合物のうち少なくとも１つは液相である条件下で行われる。しかしながら、ＳＡＰまたはリガンドの何れかにとっては、一部が固相を形成する方が便利である。なぜなら、試験過程において、ＳＡＰリガンド結合の範囲の試験を容易にするために、結合したものを結合していないものから分離する技術として相分離が可能になるからである。

従って、ＳＡＰまたはリガンドのうちの１つを含む第１の成分は固相として存在し、液相の一部として他の物質を含む第２の成分に接触させることが好ましい。次いで、ＳＡＰリガンド結合を試験するステップとして、第２成分の固相への結合を検出することを含んでいてもよい。第２成分の固相への結合の検出は、固相上の第２成分の結合を検出することによって、或いは、固相に結合しなかった第２成分の量を求め、初めに固相へ加えられた第２成分から実際に固相に結合した量を差し引くことにより行なえばよい。

この実施形態では、固相は好ましくは固形支持体に結合した第１成分を含み、その固形支持体は粒子の支持体または固体表面を含んでいてもよい。利便性の高い実施形態では、固体表面はマイクロタイタープレートウェルなどの容器の内部表面を含む。

利便性のために、ＳＡＰリガンド結合を試験するステップは、結合しなかった物質を除去するための固相の洗浄をさらに含む。

第２成分は、上述したように、放射線標識、蛍光色素、または酵素等の検出可能な標識で標識化されてもよい。或いは、第２成分の固相への結合は、固相へ結合するのと同様に第２成分へ結合する抗体により、または第２成分のうち固相へ結合しないものの量の定量免疫学的測定により、免疫学的に検出されてもよい。

本発明は、ヒトまたは他の動物由来ＳＡＰの標的リガンドへの結合を阻害する作用を有する化合物を検出するためのin vitroスポット試験、低処理量スクリーニング過程、および高処理量スクリーニング過程を提供する。これらの方法は、有機、無機および生体起源の天然化合物の試験化合物のライブラリ、また従来の合成化合物またはコンビナトリアルケミストリーのあらゆる態様により創出された化合物ライブラリをスクリーニングするために適している。また、これらの方法は、スクリーニングまたはスポット試験により同定されたリード化合物から、潜在的なまたは実際の医薬品を化学的および医薬品化学的に開発する際において、ＳＡＰ結合の阻害メカニズムの解析や、阻害の有効性を評価することにも適している。本発明はまた、ヒトや実験動物におけるＳＡＰ結合、血漿の代謝回転および異化代謝に関して、ＳＡＰ阻害化合物が有する効果と有効性を試験するためのin vivo方法も提供する。

さらなる実施形態では、本発明は、複数の被検化合物から抗変形性関節症の化合物を選択する方法を提供する。その方法では、反応帯列と複数の被検化合物を用意し、ＳＡＰリガンド結合が許容される条件で被検化合物のうちの１つの存在下、各反応帯でＳＡＰをリガンドと接触させ、各反応帯でＳＡＰリガンド結合を試験し、ＳＡＰのリガンドへの結合を阻害した被検化合物を抗変形性関節症の化合物として選択する。

この方法は、複数の被検化合物としてスクリーニング用の被検化合物ライブラリを含むものを用いる高処理量スクリーニング処理に適している。反応帯列および複数の被検化合物を用意し、各反応帯において本発明の方法を実施することによって、抗変形性関節症の化合物を選択することができる。こうすることにより、本発明の方法は高処理に拡大され、マイクロタイタープレートウェルアレイなどの容器列を利用した自動または半自動装置により実施することが可能になる。

適切な化合物は、ＳＡＰに結合されることによりＳＡＰとリガンド間の相互作用部位を遮ることができ、或いはＳＡＰに結合してその構造を変化させることによって、リガンドへの結合を阻害または抑制してもよい。ＳＡＰ分子は、それを介してＳＡＰがリガンドへ結合する特異的なカルシウム依存性のリガンド結合部位を有することが知られている。本発明を使用して同定できる化合物の多くは、ＳＡＰのカルシウム依存性リガンド結合部位により結合される物質を含むので、ＳＡＰのリガンドへの結合が阻害される。しかしながら本発明は、上述した他のメカニズムによりＳＡＰ結合を阻害する化合物を検出および研究するためにも用いられる。

本発明の有用な被検化合物は、ＷＯ９５／０５３９４に記載の候補化合物を含む。このＰＣＴ出願には、Ｘ線結晶学によるＳＡＰの三次元構造の完全解析が記載されている。また、ＳＡＰがin vitroでアミロイド原繊維へ結合することによって、プロテイナーゼの存在下でも、それら原繊維のタンパク質分解が妨げられることも実証されている。ＳＡＰによる斯かる保護は、ＳＡＰリガンド結合活性を阻害できる化合物により無効になる可能性がある。それ故にそのような化合物は、ＷＯ９５／０５３９４に記載されるアッセイにより検出することができる。そのアッセイ用またはここで記載されるスクリーニング方法用の被検化合物の候補は、ＷＯ９５／０５３９４で同定されているリガンド結合部位の構造についての知識から得られる。このＰＣＴ出願はさらに、ＳＡＰのアミロイド原繊維への結合を阻害する分子の製造方法も提供する。この方法は、ＳＡＰの三次元構造を使用したコンピュータによる分子デザインを行い、そのデザインされた分子を合成し、その分子がＳＡＰのアミロイド原繊維への結合を阻害する能力、および／またはその分子がアミロイド原繊維へ結合する能力があるかどうかを試験する。よって、ＷＯ９５／０５３９４の分子は、そこで述べられているカルシウム結合部位またはその周辺で、ＳＡＰと相互作用する分子である。その様な分子は、例えば、ヒトのＳＡＰのＡｓｐ５８、Ａｓｎ５９、Ｇｌｕ１３６、Ａｓｐ１３８およびＧｌｎ３７残基のうち１つまたは複数と、或いは他の種のＳＡＰにおける同等の残基と、および／または上記残基領域中の１つまたは複数の塩基性残基と相互作用し得る。ＷＯ９５／０５３９４の分子は、ヒトのＳＡＰのＴｙｒ６４およびＴｙｒ７５のヒドロキシ基、または他の種のＳＡＰの同等の残基と水素結合を形成し得る。

好ましい態様では、薬剤は、置換若しくは非置換Ｄ−プロリン、またはその立体類似体を含む。そのような薬剤は、患者における変形性関節症の治療または予防に効果的であるならば、ＳＡＰリガンド結合活性の阻害、または患者の血漿からのＳＡＰの消失が可能であってもなくてもよい。しかしながら、そのような薬剤は、ＳＡＰリガンド結合活性を阻害できるか、患者の血漿からＳＡＰを消失させることができることが好ましい。よって上記薬剤は、ここに述べられるスクリーニング方法のうちのいずれかひとつの方法によって得ることができる。

本発明におけるＤ−プロリン化合物の好ましい基は、ＥＰ−Ａ−０９１５０８８に記載されている。このヨーロッパ特許出願には、下記式を有するＤ−プロリン類、その薬学上許容される塩、そのモノエステル、またはそのジエステルが記載されている。

［式中、
Ｒは

基を示し；
Ｒ¹は水素原子またはハロゲン原子を示し；
Ｘは、−（ＣＨ₂）_n−；−ＣＨ（Ｒ²）（ＣＨ₂）_n−；−ＣＨ₂Ｏ（ＣＨ₂）_n−；−ＣＨ₂ＮＨ−；ベンジル；−Ｃ（Ｒ²）＝ＣＨ−；−ＣＨ₂ＣＨ（ＯＨ）−；またはチアゾール−２，５−ジイルを示し；
Ｙは、−Ｓ−Ｓ−；−（ＣＨ₂）_n−；−Ｏ−；−ＮＨ−；−Ｎ（Ｒ²）−；−ＣＨ＝ＣＨ−；−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−；−Ｎ（Ｒ²）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ²）−；−Ｎ［ＣＨ₂Ｃ₆Ｈ₃（ＯＣＨ₃）₂］−；−Ｎ（ＣＨ₂Ｃ₆Ｈ₅）−；−Ｎ（ＣＨ₂Ｃ₆Ｈ₅）Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ₂Ｃ₆Ｈ₅）−；−Ｎ（アルコキシアルキル）−；−Ｎ（シクロアルキル−メチル）−；２，６−ピリジル；２，５−フラニル；２，５−チエニル；１，２−シクロヘキシル；１，３−シクロヘキシル；１，４−シクロヘキシル；１，２−ナフチル；１，４−ナフチル；１，５−ナフチル；１，６−ナフチル；ビフェニレン；または１，２−フェニレン，１，３−フェニレンおよび１，４−フェニレンを示し、当該フェニレン基は、ハロゲン原子、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、−ＣＯＯ−低級アルキル、ニトリロ、５−テトラゾール、（２−カルボン酸ピロリジン−１−イル）−２−オキソ−エトキシ、Ｎ−ヒドロキシカルバミミドイル、５−オキソ［１，２，４］オキサジアゾリル、２−オキソ［１，２，３，５］オキサチアジアゾリル、５−チオキソ［１，２，４］オキサジアゾリルおよび５−ｔｅｒｔ−ブチルスルファニル−［１，２，４］オキサジアゾリルから選択される１〜４の置換基により置換されていてもよい；
Ｘ’は、−（ＣＨ₂）_n−；−（ＣＨ₂）_nＣＨ（Ｒ²）−；−（ＣＨ₂）_nＯＣＨ₂−；−ＮＨＣＨ₂−；ベンジル；−ＣＨ＝Ｃ（Ｒ²）−；−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂；またはチアゾール−２，５−ジイルを示し；
Ｒ²は、低級アルキル、低級アルコキシまたはベンジルを示し
ｎは０〜３を示す］。

本発明には、Ｄ−プロリン類の立体類似体も含まれる。

上記式において、「低級アルキル」の語は、直鎖状または分枝鎖状の飽和炭化水素残基を示し、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、２−ブチル、イソブチルおよびｔ−ブチルなどの１〜４炭素原子を有するものが好ましい。ハロゲンは、塩素原子、ヨウ素原子、フッ素原子および臭素原子を示す。式１−Ａおよび１−Ｂの化合物は、例えばナトリウムまたはカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウムまたはマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩などの金属、例えばｎ−エチルピペリジン、プロカインまたはジベンジルアミンなどのアミン塩などの有機塩基との塩、アルギニンまたはリジンとの塩のような塩基性アミノ酸との塩を形成することができる。当該化合物は、脂肪族または芳香族エステルのようなエステルの形で使用することもできる。これらエステルには、例えばアルキルおよびフェノールエステルが含まれる。最も好ましいエステルは、Ｃ_1-4アルカノールに由来するアルキルエステルであり、特にメチルおよびエチルエステルである。

これらの化合物はまた、１つまたは両方のカルボニル基におけるプロドラッグの形態で使用することができる。

これら化合物の詳細例およびその合成物は、ＥＰ−Ａ−０９１５０８８に記載されている。

本発明において、薬剤としては、共に共有結合する複数のリガンドを有することによって、ＳＡＰおよび、好ましくはＳＡＰである第２タンパク質と複合体を形成できるものが特に好ましい。当該リガンドの少なくとも２つは同一であるか又は異なるものであり、当該リガンドの１つがＳＡＰに存在するリガンド結合部位により結合され得るものであり、他の１つが第２タンパク質に存在するリガンド結合部位により結合され得るものである。このタイプの薬剤は、ＳＡＰリガンド結合活性を阻害でき、および／または患者の血漿からＳＡＰを消失させることができる。ＷＯ０９／０１３５０８およびPepysらによる文献（参考文献２３）に記載されているように、かかる薬剤は、標的タンパク質を迅速に除去することによって、in vivoで循環系から消失させる点に大変有効性のあることが見出されている。当該リガンドの少なくとも１つがＳＡＰに存在するリガンド部位により結合され、他のリガンドがＳＡＰまたは第２タンパク質に存在するリガンド結合部位により結合され得ると、迅速な除去と破壊を命じる身体独自の生理的メカニズムにより識別され、複合体が形成される。よって、ＳＡＰが患者から除去され、変形性関節症の治療または予防の効果がもたらされる。化合物（Ｒ）−１−［６−［（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−６−オキソヘキサノイル］ピロリジン−２−カルボン酸（ＷＯ０９／０１３５０８および参考文献２３）において、各端のカルボン酸基を含むピロリジン環は、ＳＡＰのカルシウム依存性リガンド結合部位により結合され、その結果、ＳＡＰ分子の一組が向かい合わせで架橋結合し、それはゲル濾過や複合体のＸ線結晶学による原子解析により確認することができる。この架橋結合により、ＳＡＰは明らかにin vivoで血漿から除去され迅速に異化代謝される。これは、本発明の実施形態による化合物の望ましい効果である。

上記リガンドが各標的タンパク質に対し特異的であれば、各リガンド−タンパク質結合部位における相互作用の親和性は特に高くある必要はない。１０ｍｍｏｌまでの解離定数であれば十分であるといえる。しかしながら、解離定数は、好ましくは１ｍｍｏｌ未満、さらに好ましくは１００μｍｏｌ未満、最も好ましくは１０μｍｏｌ未満が好ましい。親和性は、好ましくはおおよそμｍｏｌ以上が好ましい。親和性は可能な限り高い方が望ましいことは明らかであるが、ＳＡＰの場合はμｍｏｌの親和性で十分であるとされる。

本発明の薬剤は、複数のリガンドが共有結合により相互に直接結合されていてもよいが、リンカーにより相互に共有結合されていることが好ましい。そうすることにより、リガンドは十分な間隔をもって離され、１つのタンパク質が他のタンパク質の結合を妨げずに、複数の標的タンパク質が薬剤へ結合することができる。一般的に、リンカーは反応性基を含まないことが好ましいが、厳密な構造は重要ではない。リンカーには、直鎖状または分枝鎖状の２価炭化水素基であり、その炭素原子の１または２以上がヘテロ原子により置換されていてもよいものが含まれる。リンカー鎖長は、２〜２０原子の範囲であってよい。有利な鎖長と化学的な組成は、薬剤と複合体を形成するタンパク質に応じて、実験により決定することができる。薬剤が２つのリガンドを有する場合は、リンカーは通常直鎖状である；好ましい一般的な構造は、リガンド− リンカー −リガンドである。これは、本発明の目的のための「パリンドローム」として便宜的に表される。３つ、４つ以上の標的タンパク質が複合体を形成することができるならば、適切な分枝状リンカーで３つ、４つまたはそれ以上のリガンドを含む他の構造も考えられる。

医薬品組成物は、本発明の薬剤と、薬学上許容される賦形剤、希釈剤または基材を任意に組み込んで製剤化してもよい。その医薬品組成物は、被投与者により代謝されるときのみ活性化される薬剤またはその誘導体を含むプロドラッグの形態であってもよい。そのような医薬品組成物の成分の正確な性質や量は実験により決定すればよく、組成物の投与経路に一部依存する場合もある。被投与者への投与経路としては、経口、口腔、舌下、吸入、局所（点眼を含む）、直腸、膣、鼻腔、非経口（静脈、動脈、筋肉内、皮下、関節内を含む）がある。使用上の便宜のために、本発明における投薬は経口が好ましいが、実際の薬剤とその生体利用性によって決められる。

本発明のこの態様において、ＳＡＰ上のリガンド結合部位により結合され得るリガンドは、置換または非置換Ｄ−プロリン、またはその立体類似体を含むことが好ましい。特に好ましいＤ−プロリンは、（Ｒ）−１−［６−（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−６−オキソヘキサノイル］ピロリジン−２−カルボン酸、その薬学上許容される塩、そのモノエステル、またはそのジエステルである。

本発明において好適な、ＳＡＰ結合を阻害する或いはＳＡＰを消失させる他の望ましい方法としては、ＳＡＰにより結合される或いはＳＡＰへ結合する高分子の使用がある。当該高分子の第１カテゴリーは、in vivoでのタンパク質分解に抗するために、カルボキシ末端のＤ−プロリン残基、好ましくは複数のＤ−アミノ酸から構成されている構造を１つ、好ましくは１以上含む様々な大きさのタンパク質である。ＳＡＰに対するリガンドは、ＳＡＰに結合されるに当たり、本明細書に記載されているＤ−プロリンを含む低分子量化合物と同様に機能し、ＳＡＰがin vivoで他のリガンドに結合することを阻害し、循環からＳＡＰの迅速な除去を促進して、変形性関節症に対する有利な効果を示す。ＳＡＰはさらに、先端部分にアスパラギン酸および他の残基を有するβターンを含む他のタンパク質モチーフを認識し結合する。それ故、これらの種類のペプチド配列も望ましい。第２カテゴリーは、ＳＡＰに結合し消失させる高分子であり、ヒトのＳＡＰに特異な抗体を含む。そして、ここで望まれる治療目的のために、これらの抗体は、ヒト化されているか完全にヒトのものであるモノクローナル抗体、またはＦｖフラグメントのようなＳＡＰに対して特異的な結合能力を持つ抗体分子の低分子量フラグメントであることが好ましい。注射剤の投与後、これらの部分はin vivoのＳＡＰを認識して結合し、循環系からＳＡＰを迅速に除去し消失させるよう促進する。一般的に、本発明で有用なＳＡＰに対する抗体は、in vivoのＳＡＰに結合する際に起こる可能性がある有害な炎症誘発効果を避けるために、補体を活性化させないものである方がよい。さらに当該抗体は、ＳＡＰ分子を産生する身体の通常の組織構造を認識して結合したり、および損傷したりしない方が好ましい。

ＳＡＰのリガンドへの結合を証明するための方法
ＳＡＰのリガンド結合を阻害する化合物を同定するためには、先ず、かかる結合を証明するための方法を確立することが必要である。

１）ＳＡＰの固相リガンドへの結合
本発明の課題解決のためには、ヒト全血または動物血清或いは単離精製したＳＡＰを固相リガンドへ接触させることによって、試験リガンドへのＳＡＰの結合を直接実証できなければならない。かかる接触は、ＳＡＰによるリガンド結合に必須である十分な遊離カルシウムイオン（約２ｍｍｏｌ／ｌ）を含む生理食塩水中で行なう。単離されたヒトＳＡＰの場合では、溶液中のＳＡＰを維持するために、緩衝液にはヒトまたはウシの血清アルブミンも４０ｇ／ｌ含有させなければならない；カルシウムの存在下では、アルブミン濃度がこれより低いと、ヒトＳＡＰは速やかに自己凝集して沈殿する（参考文献１８，１９）。ＳＡＰが典型的なカルシウム依存性の結合を示す適切なリガンドには、アガロース（参考文献２４）、ホスフォエタノールアミン（参考文献２５）、ＤＮＡ（参考文献２６）、クロマチン（参考文献２７）、およびアミロイド原繊維（参考文献１２，２８）が含まれる。それらは、アガロース、アクリルアミド、ポリスチレン、ラテックス、セルロース、または他のビーズの様な粒子、或いは膜、フィルター、或いはマイクロタイタープレートや個々のチューブなどのプラスチックやその他の固体表面、或いは直接使用できる細菌やアガロースゲルの様な固体粒子の複合成分の上にも固定化される。可溶化リガンドの固定化や、利便性の面から用いられる微粒子リガンドの二次的な固定化においては、リガンドはおそらく直接非特異的に結合しているか、或いはリガンド分子が直接連結されるアミノ基、ヒドロキシル基または他の化学基を介して、または固相材料へスペーサーリンカーを介して共有結合的に結合している。ＳＡＰを固相または固定化リガンドへ接触させた後、結合していないＳＡＰは、結合を実施した緩衝液と同様の緩衝液で洗浄除去し、また、リガンドに結合したＳＡＰの存在を検出し定量化する。かかる洗浄には、固体粒子の遠心分離や浸漬、膜、フィルター、およびプラスチック表面等の固体表面の貫流や表面流の様な相分離が含まれる。ＳＡＰの結合は、ＳＡＰ源が検出可能なマーカーで標識されているＳＡＰを含むのであれば、直接検出することができる。その様なマーカーとしては、ガンマカウンターによる検出のための¹²⁵Ｉや¹³¹Ｉの様なガンマ線放出同位元素；ベータまたはシンチレーションカウンターによる検出のための¹⁴Ｃや³Ｈの様なベータ線放出同位元素；フルオロメーター、フローサイトメーター、または蛍光励起細胞ソーターによる検出のための蛍光色素；特異的な酵素活性による検出のためのペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼの様な酵素が含まれる。これらの場合において、ＳＡＰを直接標識するプロセスが生理学的な結合特性を変化させないことを証明することは不可欠である。かかる証明は、カルボジイミドを使ってカルボキシヘキシル−セファロース^TMへ結合したホスフォエタノールアミンの様な固相リガンドへ固定化されたリガンドへの、標識されたＳＡＰと非標識ＳＡＰの結合を比較することによって為される。ＳＡＰの結合は、提供されたＳＡＰ源からのＳＡＰの減少と、カルシウム含有緩衝液により最初に洗浄した後、カルシウムイオンに配位するＥＤＴＡを含む緩衝液でリガンド物質を溶出する際の結合ＳＡＰの回復を示す免疫化学的アッセイにより直接証明することもできる。また、結合したＳＡＰは、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、テンジクネズミまたは他の動物に由来するものであり、試験される種のＳＡＰに特異的な抗体を使って、間接的に検出することもできる。この目的のために、抗ＳＡＰ抗体自体を、放射性同位元素、酵素、蛍光色素または他の検出マーカーで直接標識してもよいし、また、抗ＳＡＰ抗体のＳＡＰへの結合を、一次抗ＳＡＰ試薬の種の免疫グロブリンに対する二次抗体を使って検出してもよい。使用するマーカーに適する機器での検出や定量化に加えて、微生物やその構成要素に対するＳＡＰの結合は、光学、蛍光または電子顕微鏡を用いて直接または間接的に視覚化できる。酵素で標識されたＳＡＰや抗ＳＡＰ抗体は、光学または電子顕微鏡のために用いることができ、蛍光色素で標識された試薬は蛍光色素顕微鏡法のために、金（またはその他の電子リッチ粒子）標識は電子顕微鏡のために用いることができる。

２）固定化ＳＡＰによるリガンドの結合
ＳＡＰによるリガンド結合を証明するためのその他のアプローチとしては、ＳＡＰを固相に固定化した後、直接標識するか、或いは、例えばリガンドに対する特異的な抗体を使って検出可能なリガンドに結合させる方法がある。即ち、ヒトまたは他の動物から単離精製されたＳＡＰは、直接的な非特異的吸着により、または共有結合により、または固相上に固定化された特異的な抗ＳＡＰ抗体（参考文献２９）で捕捉することにより、ビーズ、粒子、膜、フィルター、またはプラスチック若しくは他の固体表面に固定化することができる。上記１）に記載の条件を使って、適切なリガンドを固定化ＳＡＰに接触させ、結合させることができる。

リガンドへのＳＡＰの結合の阻害
ＳＡＰによるリガンド結合を示すためのものとして上記１）と２）に記載した全ての方法は、かかる結合を阻害する化合物の性能を試験するために用いることができる。しかし、異なる目的に対するそれら方法の適正と同様に、技術が異なればその試験にかかる時間や容易性はかなり異なる。従って、多数の化合物を選別するためには、マイクロタータープレートを使用するものなど高処理能の方法が不可欠である。このタイプの具体的な方法としては、プレートに固定化したリガンドを用い、ＳＡＰの４０％が結合する様な条件の下で各ウェルに一定量のＳＡＰを供給する方法がある。試験すべき化合物はウェルに添加され、標識されたＳＡＰの添加の前にプレインキュベートされる。そして、続くＳＡＰの結合に対するそれら化合物の存在による効果をモニターする。その他の態様では、試験すべき化合物を、プレートに添加される前に、標識されたＳＡＰとプレインキュベートする。ＳＡＰが固定化されているその逆の態様も、有益である。この態様では、試験化合物は、検出可能なリガンドが添加される前に固定化ＳＡＰとプレインキュベートされる。これら異なるアプローチによって、異なるメカニズムによりＳＡＰのリガンド結合を阻害する化合物の検出が可能になり、また、それ自体がＳＡＰの特異的なリガンドである化合物、その他の経路によりＳＡＰ分子に影響を与える化合物、およびリガンドに作用してＳＡＰによるリガンドの認識を妨害する化合物とを区別できる様になる。

ＳＡＰによるリガンド結合とその阻害の直接の検出
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の処理能力は低いが、本発明の解決課題のためには、カルシウム依存的に或いはカルシウムに依存せず、ＳＡＰに結合されるかまたはそれ自体がＳＡＰに結合する化合物を同定するための強力に有益な方法である。例えば、本発明に関する標的リガンドを含む巨大分子リガンドへのＳＡＰの結合を阻害する低分子化合物は、固相に固定化されたリガンドへの流体相ＳＡＰの結合により発せられるシグナルの効果により検出可能である（実験例Ａ）。さらに、ＳＡＰ自体がＳＰＲ機器で固相に固定化されている場合には、流体相へ供給される試験分子とＳＡＰとの相互作用によって、検出および定量が可能なシグナルが発せられる。ＳＰＲ機器に固定化された精製ＳＡＰは、ＳＡＰと複合体を形成する他の分子と接触すると、定量可能なシグナルを発し、複合体が形成されない場合の様にシグナルが無い場合と区別される。この技術によって、化合物のＳＡＰとの相互作用能をスクリーニングできる様になる。またこの技術は、特にＳＡＰのカルシウム依存性のリガンド結合部位の様な、ＳＡＰとの相互作用の特定の態様に依存しないことから、カルシウム依存性のＳＡＰ結合に限定される試験システムでは検出できない可能性のある分子が検出できる。処理能力は低いが強力で直接的な他の方法としては、溶液中におけるＳＡＰと本発明化合物との相互作用による熱を測定する等温熱量測定がある。結合親和性は、潜在的な有用性の指針として正確に測定され得る。ＳＡＰと様々な化合物との解離定数Ｋ_dを測定する本方法による典型的な結果は、以下の通りである。

化合物 Ｋ_d μｍｏｌ／ｌ（反復測定結果）
ホスフォエタノールアミン 36，27，48
ホスフォコリン 結合無し
N-アセチル-D-プロリン 16，23，17
Ro-63-8695 0.0139，0.0059，0.0065，0.0088
Ro-64-2856 0.019，0.02。

最後の２つの化合物は、ＥＰ−Ａ−９１５０８８のものであり、Ｒｏ−６３−８６９５は（Ｒ）−１−［６−［（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−６−オキソヘキサノイル］ピロリジン−２−カルボン酸であり、Ｒｏ−６４−２８５６は（Ｒ）−１−［［４−［２−［（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−２−オキソエトキシ］フェノキシ］アセチル］ピロリジン−２−カルボン酸である。

in vitroにおけるＳＡＰ−リガンド結合を阻害する化合物のin vivoＳＡＰに対する効果
本発明の課題解決のために、標的リガンドに対するＳＡＰ結合を阻害する化合物を、ヒトＳＡＰを発現するトランスジェニックマウスによりin vivo試験する。即ち、参考文献２３の記載に従って、血漿ＳＡＰ濃度とその代謝回転およびその異化代謝に対する化合物の効果を測定する。化合物が本質的な毒性を示さないレベルの投与量は確立されているので、様々な量をヒトＳＡＰトランスジェニックマウスに投与する。ＳＡＰの免疫化学的なアッセイのために、一定間隔で血清を取得する。また、微量の放射線標識ＳＡＰを、薬剤投与量に関連して様々な時間で静脈注射投与し、血漿半減時間とＳＡＰの体内消失をモニターするために、体重測定と血液採取を行う（参考文献１４，３０）。また、微量のＳＡＰを、様々な量の試験化合物とプレインキュベートした後、ＳＡＰの消失に対する薬剤の結合効果を試験するために、薬剤投与を受けていないマウスに注射する。本発明によって、in vivoでＳＡＰ消失を促進し、および／または血漿ＳＡＰ濃度を低減することによって、ＳＡＰのin vivoでの利用を減ずる化合物を、治療の面から価値があるものとすることができる。

正式な毒性試験を受け、ヒトの治療に適することが分かった化合物は、その血漿ＳＡＰ濃度、半減期、代謝回転および異化代謝に対する効果に関して評価される。単離されたヒトＳＡＰは、¹²⁵Ｉおよび／または¹²³Ｉにより僅かに放射線標識され、静脈注射され、参考文献１５，２３，３１に記載されている通り、続いて血漿代謝回転実験や全身シンチグラフィックイメージングが行なわれる。

実験例Ａ カルシウムに依存するＳＡＰのリガンド結合の阻害を検出するための表面プラズモン共鳴の使用
合成Ａβ−４２アミロイド原繊維（参考文献２８）を、Ｆｉｓｏｎｓ ＩＡｓｙｓの表面プラズモン共鳴機器の反応体表面に共有結合により固定化し、次いで、単離したＳＡＰ（参考文献３２）のＴｒｉｓ−緩衝生理食塩水溶液を、カルシウムの非存在下（図中ではＴＮ／Ｎとして示す）で接触させた。ＳＡＰの結合は起こらなかったことから、シグナルは発せられなかった。そこへカルシウムを導入したところ、固定化されたアミロイド原繊維に対してＳＡＰが特異的に結合し、直ぐにシグナルが生じた（図１）。１−［（Ｓ）−３−メルカプト−２−メチルプロピオニル］−Ｄ−プロリン（図中ではＲｏ−３４７９と表す）は、カルシウム依存性のＳＡＰによるリガンド結合の特異的な阻害剤である。カルシウムを含むＴｒｉｓ−緩衝生理食塩水中（図中ではＴＣ）、５００μｍｏｌ／ｌの１−［（Ｓ）−３−メルカプト−２−メチルプロピオニル］−Ｄ−プロリン（Ｒｏ−３４７９）を添加することによって、ＳＡＰの結合に相当するシグナルは完全に無くなった（図１）。カルシウムの非存在下でＳＡＰに続いて１００μｍｏｌ／ｌのＲｏ０３４７９を加え、システムを平衡化させた後に、カルシウム依存性のＳＡＰの特異的なリガンド結合を可能にするため更にカルシウムを加えると、シグナルは消失する（図２）。このことは、Ｒｏ−３４７９がＳＡＰ結合を解離させるだけでなく、阻害することを示す。固相をＴｒｉｓ−緩衝生理食塩水で洗浄し（図中ではＴＥ）、次いでＴＮ緩衝液と続いてカルシウムに再び曝すことによって、固相リガンドは、さらにカルシウム依存性のリガンド結合を再び起こした。ＳＡＰによるリガンド結合を反映する典型的なシグナルが再び観察され、次いで５０μｍｏｌ／ｌのＲｏ−３４７９の添加により完全に無くなった（図３）。

実験例Ｂ マイクロタイタープレートに固定化された髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）に対する¹²⁵Ｉ放射性標識化ＳＡＰの結合の阻害剤のスクリーニング
熱殺菌された髄膜炎菌のＰＢＳ１ｍｌ当り１×１０⁸個の懸濁液を、１ウェル当り５０μｌでポリスチレンマイクロタイタープレートに分注し、４℃で一晩静置した。次に、全てのウェルを、４％ｗ／ｖのＢＳＡと０．０５％／ｖのＴｗｅｅｎ２０（ＴＣＢＴ緩衝液）を含み、０．０１ＭのＴｒｉｓで緩衝化したｐＨ８．０の０．１４Ｍ ＮａＣｌ／０．００２Ｍ ＣａＣｌ₂（ＴＣ緩衝液）による２分間の平衡化に先立って、０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０を含む２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。各ウェルに以下の試薬を加える前に、ウェルは空にした。阻害されず最大の結合を示すコントロールでは：３５μｌのＴＣＢＴ緩衝液（２．３ｍＭのＣａＣｌ₂、５．７２％ｗ／ｖのＢＳＡ、０．０７２％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０を含む）と、１０μｌのＴＣと、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓで緩衝化されたｐＨ８．０の０．１４Ｍ ＮａＣｌ（ＴＮ緩衝液）中で¹²⁵Ｉにより放射線標識されたＳＡＰを５μｌであり、ＢＳＡの最終濃度を４％；Ｃａ²⁺を２ｍＭ；Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％としたもの。非特異的で、非カルシウム依存性であり、ＥＤＴＡの存在下で結合させるバックグラウンドでは：ＴＮ中の放射線標識されたＳＡＰ５μｌと、１１．１ｍＭのＥＤＴＡ，４．４％ｗ／ｖのＢＳＡおよび０．０６％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０を含み、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓで緩衝化されたｐＨ８．０の０．１４Ｍ ＮａＣｌ（ＴＥＢＴ緩衝液）を４５μｌであり、ＥＤＴＡの最終濃度を１０ｍＭ；ＢＳＡを４％；Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％としたもの。阻害剤の試験のためには：３５μｌのＴＣＢＴ（２．３ｍＭのＣａ²⁺、５．７２％のＢＳＡおよび０．０７２％のＴｗｅｅｎ２０を含む）と、１０ｍＭ、１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭまたは１μＭの試験化合物を含むＴＣを１０μｌと、ＴＮ中の放射線標識化ＳＡＰを５μｌとしたもの。全てのウェルは、２００μｌ量のＴＣＢＴで３回洗浄する前に室温で２時間インキュベートし、室温で１時間乾燥した後、結合した放射性標識ＳＡＰを計数する。

ここに示す本実験で試験した化合物は、アミロイド原繊維へのＳＡＰ結合の阻害剤として開発された分子ファミリーに属するものであり、以下に識別表示する初期のリード分子は、米国特許６，１２６，９１８の多数の化合物ライブラリーを高処理能スクリーニングしたものである。最初にヒットしたのは、１−［（Ｓ）−３−メルカプト−２−メチルプロピオニル］−Ｄ−プロリン（Ｒｏ−１５−３４７９）であった。また、ジアステレオ異性体の２量体である（Ｒ）−１−［（Ｓ）−３−［（Ｓ）−３−［（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−２−メチル−３−オキソプロピルジスルファニル］−２−メチルプロピオニル］ピロリジン−２−カルボン酸（Ｒｏ−６３−３３００）は、より可能性があるものとして見出された。その他の２つのジアステレオ異性体は、ＳＡＰによるリガンド結合を阻害しなかった。化学的なプログラムによって、（Ｒ）−１−［６−（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−６−オキソヘキサノイル］ピロリジン−２−カルボン酸（Ｒｏ−６３−８６９５）（ＥＰ−Ａ−９１５０８８の実施例８ｂ）と、その関連分子ファミリーを得、ここで試験した。それらの化学名とコード記号を以下に示す：
Ｒｏ−６４−４３８３： （Ｒ）−１−［［２，５−ジヒドロキシ−４−［２−［（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−２−オキソエチル］フェニル］アセチル］ピロリジン−２−カルボン酸
Ｒｏ−６４−２８５６： （Ｒ）−１−［［４−［２−［（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−２−オキソエトキシ］フェノキシ］アセチル］ピロリジン−２−カルボン酸
Ｒｏ−６３−３３００： （Ｒ）−１−［（Ｓ）−３−［（Ｓ）−３−［（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−２−メチル−３−オキソプロピルジスルファニル］−２−メチルプロピオニル］ピロリジン−２−カルボン酸
Ｒｏ−１５−３４７９： １−［（Ｓ）−３−メルカプト−２−メチルプロピオニル］−Ｄ−プロリン
Ｒｏ−６４−２８４８： （Ｒ）−１−［［３−［２−［（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−２−オキソエトキシ］−２−メチルフェノキシ］アセチル］ピロリジン−２−カルボン酸
Ｒｏ−６４−２６６８： （Ｒ）−１−［［３−［２−［（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−２−オキソエチル］フェニル］アセチル］ピロリジン−２−カルボン酸
Ｒｏ−６４−２８４５： （Ｒ）−１−［［２−［２−［（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−２−オキソエトキシ］−３−メトキシフェノキシ］アセチル］ピロリジン−２−カルボン酸
Ｒｏ−６４−２６００： （Ｒ）−１−［ｃｉｓ−４−［（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−カルボニル］シクロヘキサンカルボニル］ピロリジン−２−カルボン酸
Ｒｏ−６４−５６０７： （Ｒ）−１−［［４−［２−［（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−２−オキソエチル］ナフタレン−１−イル］アセチル］ピロリジン−２−カルボン酸
Ｒｏ−６４−５４４５： （Ｒ）−１−［［５−［２−［（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−２−オキソエトキシ］ナフタレン−１−イルオキシ］アセチル］ピロリジン−２−カルボン酸
Ｒｏ−６３−８５９３： （Ｒ）−１−［［２−［２−［（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−２−オキソエトキシ］フェノキシ］アセチル］ピロリジン−２−カルボン酸
Ｒｏ−６３−７７７７： （Ｒ）−１−［［４−［２−［（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−２−オキソエチル］フェニル］アセチル］ピロリジン−２−カルボン酸

結果
試験化合物の髄膜炎菌へのＳＡＰ結合の阻害能をパーセンテージで表す。このパーセンテージによれば、ＳＡＰ結合は、阻害剤が存在しない場合の結合よりも減っていた（表１）。全ての結合はＥＤＴＡにより阻害され、特異的で、カルシウム依存性であり、相互作用の本質を裏付けるものであった。ＳＡＰのリガンドとして知られているホスフォエタノールアミン（参考文献２５，３２）は、高濃度で阻害を示したが、希釈すると中程度の効果しか示さなかった。ＳＡＰが生理的条件下でホスフォコリンを認識し結合するという証拠は他にないことから予想されたことであったが、ＳＡＰに極めて近い他のヒト血漿ペントラキシンタンパク質であるＣ反応性タンパク質の特異的リガンドであるホスフォコリンは、ほとんど効果を示さなかった。Ｒｏ−６３−８６９５のファミリー分子は、いくつかのケースで数μｍｏｌの範囲のＩＣ₅₀価で阻害可能な阻害剤であった。従って、これら化合物は、本発明のさらなる試験の候補化合物である。

表１ 様々な化合物による、髄膜炎菌に固定化された放射性標識ＳＡＰの結合の阻害率

実験例Ｃ ¹²⁵Ｉで放射線標識されたＳＡＰの、マイクロタイタープレートに固定化されたクロマチンへの結合の阻害剤のスクリーニング

材料と方法
１００μｇ／ｍｌのチキン赤血球の野生型ロングクロマチン（参考文献２７）を含むＰＢＳ溶液であり、ｐＨ９に調節したものを、Ｎ−オキシスクシンイミドで活性化された表面を有するマイクロタイタープレートへウェル当り５０μｌで分注し、室温で１時間静置した。次いで、全てのウェルを、０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０を含み、ｐＨ７．４で２００μｌ量のＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、各ウェルにおいて、反応していない活性部位を、ｐＨ７．４のＢＳＡの２％ｗ／ｖＰＢＳ溶液５０μｌを加え、室温で３０分間ブロックした。次に、４％ｗ／ｖＢＳＡと０．０５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０（ＴＣＢＴ緩衝液）を含み、０．０１ＭのＴｒｉｓで緩衝化したｐＨ８．０の０．１４Ｍ ＮａＣｌ／０．００２Ｍ ＣａＣｌ₂（ＴＣ緩衝液）で２分間の平衡化をする前に、２００μｌのＰＢＳＴでウェルを３回洗浄した。各ウェルに以下の試薬を加える前に、ウェルは空にした。阻害されず最大の結合を示すコントロールでは：３５μｌのＴＣＢＴ緩衝液（２．３ｍＭのＣａＣｌ₂、５．７２％ｗ／ｖのＢＳＡ、０．０７２％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０を含む）と、１０μｌのＴＣと、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓで緩衝化されたｐＨ８．０の０．１４Ｍ ＮａＣｌ（ＴＮ緩衝液）中で¹²⁵Ｉにより放射線標識されたＳＡＰを５μｌであり、ＢＳＡの最終濃度を４％；Ｃａ²⁺を２ｍＭ；Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％としたもの。非特異的で、非カルシウム依存性であり、ＥＤＴＡの存在下で結合させるバックグラウンドでは：ＴＮ中の放射線標識されたＳＡＰ５μｌと、１１．１ｍＭのＥＤＴＡ、４．４％ｗ／ｖのＢＳＡおよび０．０６％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０（ＴＥＢＴ緩衝液）を含み、ｐＨ８．０の０．０１Ｍ Ｔｒｉｓで緩衝化された０．１４Ｍ ＮａＣｌを４５μｌであり、ＥＤＴＡの最終濃度を１０ｍＭ；ＢＳＡを４％；Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％としたもの。阻害剤の試験のためには：３５μｌのＴＣＢＴ（２．３ｍＭのＣａ²⁺、５．７２％のＢＳＡおよび０．０７２％のＴｗｅｅｎ２０を含む）と、１０ｍＭ、１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭまたは１μＭの試験化合物を含むＴＣを１０μｌと、ＴＮ中の放射線標識化ＳＡＰを５μｌとしたもの。全てのウェルは、２００μｌ量のＴＣＢＴで３回洗浄する前に室温で２時間インキュベートし、室温で１時間乾燥した後、結合した放射性標識ＳＡＰを計数する。ここに示す本実験で試験した化合物は、上記実験例Ｂで特定したものと同様である。

結果
クロマチンへの試験化合物のＳＡＰ結合の阻害能をパーセンテージで表す。このパーセンテージによれば、ＳＡＰ結合は、阻害剤が存在しない場合の結合よりも減っていた（表２）。全ての結合はＥＤＴＡにより阻害され、特異的で、カルシウム依存性であり、相互作用の本質を裏付けるものであった。クロマチンが存在しないコントロールウェルでありＢＳＡでブロックされたものへの結合は、ＥＤＴＡまたは特異的阻害剤により完全に阻害された場合に見られるバックグラウンドレベルと同様であった。ＳＡＰのリガンドとして知られているホスフォエタノールアミン（参考文献２５，３２）は、高濃度で阻害を示したが、希釈すると中程度の効果しか示さなかった。ＳＡＰが生理的条件下でホスフォコリンを認識し結合するという証拠は他にないことから予想されたことであったが、ＳＡＰに極めて近い他のヒト血漿ペントラキシンタンパク質であるＣ反応性タンパク質の特異的リガンドであるホスフォコリンは、ほとんど効果を示さなかった。Ｒｏ−６３−８６９５のファミリー分子は、いくつかのケースで数μｍｏｌの範囲のＩＣ₅₀価で阻害可能な阻害剤であった。従って、これら化合物は、興味深いことに本アッセイは固定化リガンドとして髄膜炎菌を用いた場合よりも感受性は低かったものの、本発明のさらなる試験の候補化合物である。

表２ 様々な化合物による、野生型ロングクロマチンに固定化された放射性標識ＳＡＰの結合の阻害率

実験例Ｄ ¹²⁵Ｉで放射線標識されたＳＡＰの、マイクロタイタープレートに固定化されたインフルエンザウィルスへの結合の阻害剤のスクリーニング

材料と方法
ＰＢＳ１ｍｌ当り１０ｍｇのタンパク質を有する精製インフルエンザウィルスであるＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／２４／９０の濃縮懸濁液を、１：５０でＰＢＳにより希釈し、次いで、１ウェル当り５０μｌずつポリスチレンマイクロタイタープレートへ分注し、４℃で一晩静置した。次に、各ウェルにＢＳＡの２％ｗ／ｖＰＢＳ溶液２００μｌを加え室温で１時間インキュベートすることによりブロックする前に、全てのウェルを空にした。全てのウェルを、４％ｗ／ｖのＢＳＡと０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０（ＴＣＢＴ緩衝液）を含み、０．０１ＭのＴｒｉｓで緩衝化したｐＨ８．０の０．１４Ｍ ＮａＣｌ／０．００２Ｍ ＣａＣｌ₂（ＴＣ緩衝液）で２分間平衡化する前に、０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０を含む２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。各ウェルに以下の試薬を加える前に、ウェルは空にした。阻害されず最大の結合を示すコントロールでは：３５μｌのＴＣＢＴ緩衝液（２．３ｍＭのＣａＣｌ₂、５．７２％ｗ／ｖのＢＳＡ、０．０７２％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０を含む）と、１０μｌのＴＣと、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓで緩衝化されたｐＨ８．０の０．１４Ｍ ＮａＣｌ（ＴＮ緩衝液）中で¹²⁵Ｉ（参考文献３２）により放射線標識されたＳＡＰを５μｌであり、ＢＳＡの最終濃度を４％；Ｃａ²⁺を２ｍＭ；Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％としたもの。非特異的で、非カルシウム依存性であり、ＥＤＴＡの存在下で結合させるバックグラウンドでは：ＴＮ中の放射線標識されたＳＡＰ５μｌと、１１．１ｍＭのＥＤＴＡ、４．４％ｗ／ｖのＢＳＡおよび０．０６％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０（ＴＥＢＴ緩衝液）を含み、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓで緩衝化されたｐＨ８．０の０．１４Ｍ ＮａＣｌ（ＴＥＢＴ緩衝液）を４５μｌであり、ＥＤＴＡの最終濃度を１０ｍＭ；ＢＳＡを４％；Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％としたもの。阻害剤の試験のためには：３５μｌのＴＣＢＴ（２．３ｍＭのＣａ²⁺、５．７２％のＢＳＡおよび０．０７２％のＴｗｅｅｎ２０を含む）と、１０ｍＭ、１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭまたは１μＭの試験化合物を含むＴＣを１０μｌと、ＴＮ中の放射線標識化ＳＡＰを５μｌとしたもの。全てのウェルは、２００μｌ量のＴＣＢＴで３回洗浄する前に室温で２時間インキュベートし、室温で１時間乾燥した後、結合した放射性標識ＳＡＰを計数する。ここに示す本実験で試験した化合物は、上記実験例Ｂと特定したものと同様である。

結果
固定化されたインフルエンザウィルスへのＳＡＰ結合における試験化合物の阻害能をパーセンテージで表す。このパーセンテージによれば、ＳＡＰ結合は、阻害剤が存在しない場合の結合よりも減っていた（表３）。全ての結合はＥＤＴＡにより阻害され、特異的で、カルシウム依存性であり、相互作用の本質を裏付けるものであった。ウィルスが存在しないコントロールウェルでありＢＳＡでブロックされたものへの結合は、ＥＤＴＡまたは特異的阻害剤により完全に阻害された場合に見られるバックグラウンドレベルと同様であった。ＳＡＰのリガンドとして知られているホスフォエタノールアミン（参考文献２５，３２）は、高濃度で阻害を示したが、希釈すると中程度の効果しか示さなかった。ＳＡＰが生理的条件下でホスフォコリンを認識し結合するという証拠は他にないことから予想されたことであったが、ＳＡＰに極めて近い他のヒト血漿ペントラキシンタンパク質であるＣ反応性タンパク質の特異的リガンドであるホスフォコリンは、ほとんど効果を示さなかった。Ｒｏ−６３−８６９５のファミリー分子は、いくつかのケースで数μｍｏｌ、高ｎｍｏｌの範囲のＩＣ₅₀価で阻害可能な阻害剤であった。従って、これら化合物は、本発明のさらなる試験の候補化合物であり、興味深いことに本アッセイは、固定化リガンドとして髄膜炎菌または野生型ロングクロマチンを用いた場合よりも感受性が高かった。

表３ 様々な化合物による、インフルエンザウィルスに固定化された放射性標識ＳＡＰの結合の阻害率

実験例Ｅ 関節炎の罹患患者の関節における標識化ＳＡＰの蓄積
標識化ＳＡＰの蓄積は、透析アミロイドーシスを伴わない患者の関節で観察された。かかる患者は、関節炎の他の形態に罹患しており：５人は変形性関節炎（図４）、１２人は関節リウマチ、そして１人には外傷性の浸出液が見られた。これらそれぞれの患者においては、原因はともかくとして著しい浸出液が見られる全ての関節で標識化ＳＡＰが検出された。このこと自体は、血漿タンパク質が関節滲出液へ入ることが知られていることから、驚くべきことではない。しかし、様々なタイプの関節症患者の３０人中２０人で、臨床的には滲出液が観察されなかった関節において標識化ＳＡＰの取り込みも観察された。

図４は、¹²³Ｉ−標識化ＳＡＰを静脈注射してから２４時間後における変形性関節炎患者の手のシンチグラフィックイメージを示す。ＳＡＰの取り込みと滞留は、第二中手指節関節と指骨間関節の両方の手根骨領域で観察された。

血液から罹患関節へのＳＡＰの局在化のメカニズムとして考えられるものの１つは、関節および関節周辺におけるアミロイド沈着にある。老人の滑膜、関節軟骨および／または関節包において、顕微鏡観察で見られるアミロイド沈着の広い分布に関して強い証拠がある（参考文献３３〜４４）。しかし、これら病理解剖および／または切除標本の観察的な研究からの総体的な印象では、アミロイド沈着は主に患者の加齢と関連し、変形性関節炎の臨床的または病理学的な兆候の程度や重大度とは特に関係しない。その代わり、またはそれに加えて、ＳＡＰは、炎症または損傷した関節に存在するアミロイド原繊維以外の構造上でリガンドへ結合している。in vitroにおけるカルシウム依存性のＳＡＰのグルコサミノグリカンへの結合が報告されているが（参考文献４５）、この結合は、それぞれ軟骨と滑液に最も豊富な硫酸クロマチンとヒアルロン酸よりも、ヘパランやデルマタン硫酸に特異的であった。それにも関わらず、グルコサミノグリカンは関節組織に偏在しており、異常に顕在化していることから、罹患関節とその周辺でＳＡＰのリガンドを提供することになる。in vitroと同様にin vivoにおいてもＳＡＰがよく結合するその他のリガンドは、死亡細胞により提示される際（参考文献４６）の遊離の及びクロマチン内のＤＮＡ（参考文献２６，２７）である。ＳＡＰは、in vivoでアポトーシス細胞にも結合する（参考文献４７）。アポトーシスでもまたはネクローシスでも、クロマチンを提示する炎症関節で増加した死亡細胞は、リガンド濃度を以上に増加させ、それによりＳＡＰ沈着を集中させる。

実験例Ｆ 罹患関節におけるリガンドへのＳＡＰの結合
ＳＡＰが罹患関節でリガンドに結合するか否かを試験するために、先ず、２人の患者において、放射線標識したヒト血清アルブミンの分布をＳＡＰの分布と比較した。アミロイドと関係することが立証された透析にかかっている１人において、ＳＡＰの関節での取り込みはアルブミンよりも顕著に多く、ＳＡＰの局在化がアミロイドに特異的であることを示した。対照的に、関節リウマチに罹患中であり滲出液を伴う様々な疾病に冒された関節を有する患者において、通常の関節ではアルブミンよりもＳＡＰの滞留が高かったものの、アルブミンとＳＡＰの局在化は同程度であり、２つのタンパク質にとり滑液スペースへの滲出プロセスは同様で非特異的であることが示された。さらに、放射性標識化ＳＡＰを注射されてから２４時間後に膝関節滲出液を吸引され乾燥された患者に１人において、その関節ではＳＡＰが強く局在したままであった。第２に、我々は、様々な原因による関節滲出液を伴う１５人の患者からの２つの試料において、滑液と血漿におけるＳＡＰおよび他のタンパク質の濃度を測定し、また、滑液：血漿の割合を計算した。この割合とタンパク質の分子量には逆の直線関係があり、血流から関節スペースへの拡散によりそれらが接近することは比較的容易に示せることは、よく知られている。しかしこの割合は、そのＳＡＰと同様の分子量を有するタンパク質から期待されるよりも、ＳＡＰにとり顕著かつ大幅に少ない（図５）。このことは、滑液へ確かに接近できるＳＡＰは、標識化ＳＡＰに関する我々の実験で示した様に、関節内の構造へおそらく結合しており、その結果、滑液自体を用いる検出やアッセイには役に立たない。

図５は、滲出液を伴う様々な形態の関節炎患者からの滑液と血漿における様々な血漿タンパク質の濃度の割合を示す。ＳＡＰを除き、ここで示す全てのタンパク質で、相対的な分子量と滑液／血漿濃度の割合との間には、ｒ＝０．６２で直線関係がある。滑液におけるＳＡＰ濃度は、その分子量と血漿濃度から予測されるよりも顕著に少ない。（キーワード：α₁ＡＧ、α₁−酸 グリコプロテイン；Ａ１ｂ、アルブミン；Ｔｒｆ、トランスフェリン；Ｃｅｒ、セルロプラスミン；α₂Ｍ、α₁−マクログロブリン）。

老人および変形性関節炎の関節で非常に一般的であり顕微鏡観察で見られるアミロイド沈着は、変形性関節炎の病因または兆候とはこれまで考えられていなかった。関節におけるアミロイド原繊維や他の構造に対するＳＡＰの結合が、いかにして変形性関節炎の病因となるのかも明らかでない。人為的に凝集させたＳＡＰは、補体システムを活性化することができることから（参考文献４８）、起炎症性のものであり得る。あらゆる既知リガンドへのＳＡＰの結合は、補体を活性化するのみでなく、実は基質による補体の活性化を阻害する（参考文献４９，５０）。また、変形性関節炎患者では、局所的にも全身的にも補体を活性化するという証拠はない。それにも関わらず、我々による関節におけるＳＡＰの局在化と予想より低い滑液での遊離ＳＡＰ濃度の観察の観点から、我々はＳＡＰが変形性関節炎に関与するか否かを試験した。

実験例Ｇ 変形性関節炎患者の治療
２つの実施例により、かかる治療の効果が実証される。

１）ニュージーランドに住む引退した一般開業医であり６４歳のＲＪは、長年にわたる骨と関節の損傷の経験を有し、子供時代と１０代を農場で暮らし、大人になりラグビーとスキーをしていた。４２歳から手仕事の後や特に寒い時には以前に損傷した関節に痛みや腫れを感じる様になった。左中指と右薬指の近位指節間関節、右肘および胸部中部の椎間関節が、最も罹患していた。症状と兆候は２２歳を過ぎてから次第に悪くなったことから、肉体的な仕事が制限される様になり、冬季には非ステロイド抗炎症剤による治療をしばしば或いは継続的に受けなければならなくなった。これらは、何れも変形性関節炎の兆候である。２０００年には腎機能障害が見出され、最終的には、別途、フィブリノーゲンＡ α鎖の遺伝子の変異による遺伝的な全身性アミロイドーシスの完全な診断も受けた。このタイプのアミロイドーシスは関節とその発症には影響を与えず、臨床的な兆候は変形性関節炎と全く関連しない。

彼は、２００１年１０月９日に、（Ｒ）−１−［６−［（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−６−オキソヘキサノイル］ピロリジン−２−カルボン酸を１０ｍｇずつ１日２回皮下注射するというアミロイドーシスの実験的な治療を開始した。２００２年の１月に、この効能あるＳＡＰの除去剤投与から３ヶ月が経過し、彼の血漿ＳＡＰ濃度は確実に９５％まで減少した。彼は、先ず、関節炎の病状が以前よりも軽減されたことに気付いた。かかる改善は持続して更に良くなり、ニュージーランドでは秋である２００２年４月までには、かかる印象は揺ぎ無いものとなった。長年無かったことであるが、冬季を通じて、彼は非ステロイド抗炎症剤による治療を必要とせず、代わりに肉体的な活動も増えていった。彼は（Ｒ）−１−［６−［（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−６−オキソヘキサノイル］ピロリジン−２−カルボン酸による治療を現在（２００３年６月）まで続けており、彼の変形性関節炎の全ての症状は、顕著に沈静化していった。過去数ヶ月にわたって、かれは尋常でない肉体的活動のストレスさえもなく、以前彼を悩ませていた痛みや腫れを感じることなく、フェンシングや、重いものを持ち上げたり運んだりする造園といった陸上でのハードな肉体的活動を日常的に継続している。

２）ウェールズ出身のサービス労働者で４９歳のＣＤは、６〜８年にわたる痛みと、いくつかの関節における機能低下の経験があった。特に手を上に伸ばしたり頭の後ろに持っていく際に彼女の両肩は痛み、髪を乾かすことや家事が苦痛で困難となった。彼女は胸部中部の後ろや両側の踵にほとんど一日中痛みを感じ、通常、長い間立つことにより痛みは起こった。かなりの仕事を行う際には右の手首にも痛みを感じることがあり、特に瓶を開ける操作が困難であった。これら症状は、全て変形性関節炎に合うものである。

ＣＤは、２００１年１０月の慢性腎機能障害の検査において、アポリポタンパク質ＡＩの遺伝子の変異により引き起こされる遺伝的な全身性アミロイドーシスに罹患していると診断された。このタイプのアミロイドーシスは関節には影響を与えず、関節炎の病状を起こすこともしない。彼女は、２００１年１０月２２日に、（Ｒ）−１−［６−［（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−６−オキソヘキサノイル］ピロリジン−２−カルボン酸を１５ｍｇずつ１日２回皮下注射するというアミロイドーシスの実験的な治療を開始した。２００１年の１２月には、この効能あるＳＡＰの除去剤投与から２ヶ月が経過し、彼女の血漿ＳＡＰ濃度は確実に９５％まで減少した。彼女は、先ず、関節の病状が以前よりも顕著に軽減されたことに気付いた。かかる改善は持続して更に良くなり、２００２年１月までには彼女は痛みから解放され、関節は正常な機能を取り戻した。（Ｒ）−１−［６−［（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−６−オキソヘキサノイル］ピロリジン−２−カルボン酸におよる治療は２００２年１０月に終了し、顕著な回復は現在（２００３年６月）まで続いている。

本発明は、実施例と付随する図面を参照して、あくまで例示としてさらに詳細に説明される。

図１〜３は、１−［（Ｓ）−３−メルカプト−２−メチルプロピオニル］−Ｄ−プロリン（図中、Ｒｏ−３４７９と示す）が、カルシウムの存在する場合および存在しない場合におけるＳＡＰのアミロイド原繊維への結合に及ぼす効果を評価する表面プラズモン共鳴実験のトレースを示す。

図４は、変形性関節症に罹患した患者の手のシンチグラフィ画像を示す図であり、¹²³Ｉ標識化ＳＡＰを静脈注射してから２４時間後の図である。

図５は、様々な形態の関節炎が原因の滲出液を伴う患者の滑液と血清中における様々なタンパク質の濃度比を示す図である。

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３９． Takeda，T．，Sanada，H．，Ishii，M．，Matsushita，M．，Yamamoto，T．，Shimizu，K．およびHosokawa，M．（1984年）外科的に切除した椎間板ヘルニアにおける加齢に伴うアミロイド沈着，Arthritis Rheum．，第27巻：第1063-1065頁
４０． Bartley，C．J．，Orford，C．R．およびGardner，D．L．（1985年）老化する関節軟骨におけるアミロイド，J．Pathol．，第145巻：第lO7A頁
４１． Cary，N．R．B．（1985年）大腿骨頭におけるアミロイド沈着の臨床病理学的重要性，J．Clin．Pathol．，第38巻：第868-872頁
４２． Mitrovic，D．R．，Stankovic，A．，Quintero，M．およびRyckewaert，A．（1985年）ヒトの膝および股関節におけるアミロイド沈着，Rheumatol．Int．，第5巻：第83-89頁
４３． Ladefoged，C．（l986年）剖検時の膝関節のアミロイド沈着，Ann．Rheum．Dis．，第45巻：第668-672頁
４４． Lakhanpal，S．，Li，C．Y．，Gertz，M．A，Kyle，R．A．およびHunder，G．G．（1987年）アミロイド関節症の診断のための滑液分析，Arthritis Rheum．，第30巻：第419-423頁
４５． Hamazaki，H．（1987年）Ｃａ²⁺を介したヒトの血清アミロイドＰ成分とヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸との関連性，J．Biol．Chem．，第262巻：第1456-1460頁
４６． Breathnach，S．M．，Kofler，H．，Sepp，N．，Ashworth，J．，Woodrow，D．，Pepys，M．B．およびHintner，H．（1989年）全身性エリテマドーデスにおける血清アミロイドＰ成分は、in vitroにおいて細胞核へ結合し、また、in vivoにおいて細胞外クロマチンの沈着へ結合する，J．Exp．Med．，第170巻：第1433-1438頁
４７． Hintner，H．，Booker，J．，Ashworth，J．，Aubock，J．，Pepys，M．B．，およびBreathnach，S．M．（1988年）アミロイドＰ成分は、ヒトの皮膚中のケラチン組織および単離されたin vitroケラチンフィラメント凝集体へ結合する，J．Invest．Dermatol．，第91巻：第22-28頁
４８． Ying，S．-C．，Gewurz，A．T．，Jiang，H．およびGewurz，H（1993年）ヒトの血清アミロイドＰ成分オリゴマーは、ＣｌｑのＡ鎖コラーゲン様領域の残基１４〜２６および７６〜９２を経由して古典的な補体活性化経路と結合し活性化する，J．Immunol．，第150巻：第169-176頁
４９． Butler，P．J．G．（1983年）クロマチンのフォールディング，CRC Crit．Rev．Biochem．，第15巻：第57-91頁
５０． de Haas，C．J．C．，van Leeuwen，E．M．M．，van Bomme1，T．，Verhoef，J．，van Kesse1，K．P．M．およびvan Strijp，J．A．G．（2OOO年）グラム陰性細菌に結合した血清アミロイドＰ成分は、リポ多糖体媒介の古典的な補体活性化経路の活性化を阻害する，Infect．Immun．，第68巻：第1753-1759頁

Claims (13)

1. 患者の変形性関節症を治療または予防する薬品を製造するために、ＳＡＰのリガンド結合活性を阻害できる薬剤または患者の血漿からＳＡＰを消失させることができる薬剤を使用する方法。
2. 上記薬剤がＳＡＰに存在するリガンド結合部位により結合され得るものである請求項１に記載の使用方法。
3. 上記薬剤が、共に共有結合している複数のリガンドを有することによって、ＳＡＰおよび第２タンパク質と複合体を形成できるものであり、当該リガンドの少なくとも２つが同一であるか又は異なるものであり、当該リガンドの１つがＳＡＰに存在するリガンド結合部位により結合され得るものであり、他の１つが第２タンパク質に存在するリガンド結合部位により結合され得るものである請求項２に記載の使用方法。
4. 上記第２タンパク質がＳＡＰである請求項３に記載の使用方法。
5. 上記複数のリガンドが、リンカーを介して共に共有結合している請求項３または４に記載の使用方法。
6. 上記リンカーが、直鎖状または分枝鎖状の２価炭化水素基であり、その炭素原子の１または２以上がヘテロ原子により置換されていてもよいものを含む請求項５に記載の使用方法。
7. 上記薬剤が２つのリガンドを有する請求項１〜６のいずれかに記載の使用方法。
8. 上記薬剤が、一般式：リガンド − リンカー − リガンドの構造を有する請求項６に記載の使用方法。
9. ＳＡＰに存在するリガンド結合部位により結合され得る上記リガンドが、置換若しくは非置換Ｄ−プロリン、またはその立体類似体を含むものである請求項３〜８のいずれかに記載の使用方法。
10. 上記薬剤が下記式のＤ−プロリン、その薬学上許容される塩、そのモノエステル、またはそのジエステルである請求項９に記載の使用方法。
    

    

    式中、
    Ｒは
    

    

    基を示し；
    Ｒ¹は水素原子またはハロゲン原子を示し；
    Ｘは、−（ＣＨ₂）_n−；−ＣＨ（Ｒ²）（ＣＨ₂）_n−；−ＣＨ₂Ｏ（ＣＨ₂）_n−；−ＣＨ₂ＮＨ−；ベンジル；−Ｃ（Ｒ²）＝ＣＨ−；−ＣＨ₂ＣＨ（ＯＨ）−；またはチアゾール−２，５−ジイルを示し；
    Ｙは、−Ｓ−Ｓ−；−（ＣＨ₂）_n−；−Ｏ−；−ＮＨ−；−Ｎ（Ｒ²）−；−ＣＨ＝ＣＨ−；−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−；−Ｎ（Ｒ²）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ²）−；−Ｎ［ＣＨ₂Ｃ₆Ｈ₃（ＯＣＨ₃）₂］−；−Ｎ（ＣＨ₂Ｃ₆Ｈ₅）−；−Ｎ（ＣＨ₂Ｃ₆Ｈ₅）Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ₂Ｃ₆Ｈ₅）−；−Ｎ（アルコキシアルキル）−；−Ｎ（シクロアルキル−メチル）−；２，６−ピリジル；２，５−フラニル；２，５−チエニル；１，２−シクロヘキシル；１，３−シクロヘキシル；１，４−シクロヘキシル；１，２−ナフチル；１，４−ナフチル；１，５−ナフチル；１，６−ナフチル；ビフェニレン；または１，２−フェニレン，１，３−フェニレンおよび１，４−フェニレンを示し、当該フェニレン基は、ハロゲン原子、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、−ＣＯＯ−低級アルキル、ニトリロ、５−テトラゾール、（２−カルボン酸ピロリジン−１−イル）−２−オキソ−エトキシ、Ｎ−ヒドロキシカルバミミドイル、５−オキソ［１，２，４］オキサジアゾリル、２−オキソ［１，２，３，５］オキサチアジアゾリル、５−チオキソ［１，２，４］オキサジアゾリルおよび５−ｔｅｒｔ−ブチルスルファニル−［１，２，４］オキサジアゾリルから選択される１〜４の置換基により置換されていてもよい；
    Ｘ’は、−（ＣＨ₂）_n−；−（ＣＨ₂）_nＣＨ（Ｒ²）−；−（ＣＨ₂）_nＯＣＨ₂−；−ＮＨＣＨ₂−；ベンジル；−ＣＨ＝Ｃ（Ｒ²）−；−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂；またはチアゾール−２，５−ジイルを示し；
    Ｒ²は、低級アルキル、低級アルコキシまたはベンジルを示し
    ｎは０〜３を示す。
11. 上記Ｄ−プロリンが、（Ｒ）−１−［６−（Ｒ）−２−カルボキシピロリジン−１−イル］−６−オキソヘキサノイル］ピロリジン−２−カルボン酸、その薬学上許容される塩、そのモノエステル、またはそのジエステルである請求項１０に記載の使用方法。
12. 上記薬剤が、置換若しくは非置換Ｄ−プロリン、またはその立体類似体を含むものである請求項２に記載の使用方法。
13. 患者の変形性関節症を治療または予防するための方法であって、ＳＡＰのリガンド結合活性を阻害できる薬剤または患者の血漿からＳＡＰを消失させることができる薬剤を含有する治療上有効量の薬品を患者へ投与することを含む方法。

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