ES2373553T3

ES2373553T3 - Compuestos que inhiben la unión de sap para tratar la osteoartritis.

Info

Publication number: ES2373553T3
Application number: ES04736527T
Authority: ES
Inventors: Mark B. Pepys; Philip Nigel Hawkins
Original assignee: Pentraxin Therapeutics Ltd
Current assignee: Pentraxin Therapeutics Ltd
Priority date: 2003-06-10
Filing date: 2004-06-10
Publication date: 2012-02-06
Anticipated expiration: 2024-06-10
Also published as: AU2004244815B2; WO2004108131A1; EP1633345B1; US20080249003A1; ATE525071T1; JP2006527250A; GB0600229D0; CA2528706C; CA2528706A1; AU2004244815A1; EP1633345A1; US7659299B2; GB2420498A; GB0313386D0; GB2420498B

Abstract

El uso de D-prolina de fórmula: en la que R es o y el grupo R1 es hidrógeno o halógeno; X-Y-X' es un enlazador que tiene al menos 4, de manera ventajosa al menos, de manera ventajosa al menos 6, hasta 20 atomos de carbono de cadena lineal o sencilla, en la que X es - (CH2) n-; -CH (R2) (CH2) n-; CH2O (CH2) n-; CH2NH-; bencilo; -C (R2) =CH-; -CH2-CH (OH) - o tiazol-2, 5diilo; Y es -S-S-;- (CH2) n-; -O-; -NH-; -N (R2) -;-CH=CH-; -NHC (O) NH-;-N (R2) C (O) N (R2) -; -N[CH2C6H3 (OCH3) 2]; -N (CH2C6H5) -; N (CH2C6H5) C (O) N (CH2C6H5) -; -N (alcoxialquilo) -; N (cicloalquil-metilo) -; 2, 6-piridilo; 2, 5furanilo; 2, 5-tienilo; 1, 2-ciclohexilo; 1, 3-ciclohexilo; 1, 4-ciclohexilo;1, 2-naftilo; 1, 4-naftilo; 1, 5-naftilo; 1, 6 naftilo; bifenileno 6 1, 2-fenileno, 1, 3-fenileno y 1, 4-fenileno, en el que los grupos fenileno se encuentran sustituidos de manera opcional por 1-4 sustituyentes, escogidos entre halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxilo, carboxi, -COO-alquilo inferior, nitrilo, 5-tetrazol (acido 2-carboxilico pirrolidin-1-il) -2ºxo-etoxi, N-hidroxicarbamimiodilo, 5-oxo[1, 2-oxadiazolilo, 2-oxo[1, 2, 3, 5]oxotiadiazolilo, 5tioxo[1, 2, 4]oxadiazolilo y 5-terc-butilsulfanil-[1, 2, 4]oxadiazolilo; X' es - (CH2) n-; - (CH2) n-CH (R2) -; - (CH2) nOCH2-, -NHCH2-; bencilo; -CH=C (R2) -; CH (OH) CH2; o tiazol-2, 5-diilo; R2 es alquilo inferior, alcoxi inferior o bencilo y n es 0-3. o una de sus sales aceptables farmaceuticamente o de sus mono-o o diesteres que son capaces de inhibir la unión del ligando SAP o la disminución de SAP en el plasma de una persona, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de osteoartritis en la persona.

Description

Compuestos que inhiben la uni6n de SAP para tratar la osteoartritis

La presente invenci6n se refiere al tratamiento y prevenci6n de la osteoartritis.

Campo de la invenci6n

5 La osteoartritis es la forma mas comun de artritis y se detecta radiol6gicamente en 80 % de los individuos con edad por encima de 55 en las poblaciones de Occidente. La osteoartritis sintomatica de la rodilla, que es dolor con anormalidades radiograficas, se encuentra presente en aproximadamente 6 % de los individuos con edad por encima de 30 tanto en EE.UU. como en Reino Unido. En EE.UU, aproximadamente 21 millones de personas presentan osteoartritis diagnosticada por el medico, presentado la mayoria de los casos dolor y discapacidad. De

10 hecho, en alrededor de 12 % de los sujetos con limitaci6n de actividad, la causa es osteoartritis y supone una mayor dependencia para andar y subir escaleras que en el caso de otras enfermedades. El coste anual estimado de la osteoartritis en EE.UU. fue de 15,5 millones de d6lares en 1994, que se aproxima a 1 % del PIB, debiendose mas que 50 % de los costes a perdidas de tipo laboral. El problema se hace inevitablemente mas grave a medida que la poblaci6n envejece y con una incidencia de la osteoartritis claramente relacionada con la edad (1).

15 La patologia de la osteoartritis comprende la perdida de cartilago articular y procesos complejos de reparaci6n con fibrocartilago y formaci6n 6sea reactiva, conduciendo a la alteraci6n de la articulaci6n normal y de las arquitectura peri-articular. Esto se asocia a dolor, derrames sinoviales y disfunci6n.

Los tratamientos tradicionales son: adelgazamiento, ejercicio y ayuda fisico-social; analgesicos simples; farmacos anti-inflamatorios no esteroidales; corticoesteroides intra-articulares; acido hialur6nico; lavado de la articulaci6n;

20 asistencia fisicas y dispositivos. No obstante, estos enfoques conservadores resultan inadecuados en una parte importante de pacientes para los cuales la cirugia se convierte en apropiada, incluyendo sinovectomia, reparaci6n de desgarros meniscales, osteotomia de reposici6n y recolocaci6n articular considerablemente total. Unicamente la ultima es una soluci6n para la osteoartritis, y obviamente no resulta aplicable en algunas articulaciones y en algunos individuos.

25 Otros enfoques terapeuticos experimentales y menos validados incluyen la administraci6n glucosamina y sulfato de condroitina, para favorecer de manera ostensible la supervivencia o incluso para reparar el cartilago danado y tetraciclina, antagonistas de interleucina-1 e inhibidores de colagenasa y otras proteina de matriz. Kelly describe el papel de sulfato de glucosamina y sulfato de condroitina en el tratamiento de una enfermedad degenerativa de las articulaciones en Alternative Medicine Review, Vol 3(1), Febrero de 1998, paginas 27-29. Se discute el efecto de la

30 heparina de bajo peso molecular y de heparina de pesos moleculares diferentes sobre la actividad de agrecanasa en Blood, 100(11), resumen nO. 3849 (2002). Askarov y Samtsov informan sobre el tratamiento de Osteoartritis Deformans con heparina en Kazanskii Meditsinskii Zhurnal, 67, 190-192 (1986). Natchus et al describen el desarrollo de inhibidores de metaloproteinasa de matriz de hidroxamato procedentes de 4-aminoprolinas funcionalizadas.

De este modo, existe una evidente y gran necesidad de nuevos medicamentos que puedan modificar el avance de

35 las osteoartritis, y, de manera importante, alivien los sintomas de dificultad e incapacidad del dolor, deformaciones en la articulaci6n y derrames, limitaci6n de actividad y discapacidad.

El componente P amiloide del suero (SAP) es un miembro de la familia (2) de pentraxina conservada y evolucionadamente antigua de las proteinas de plasma, cuyos otros miembros son proteina C-reactiva (CRP), la clasica proteina de fase aguda (3). Las proteina hom6logas que comparten el mismo pliegue 3D (4, 5), ensamblaje 40 oligomerico y capacidad para unir ligandos dependientes de calcio, se encuentran presentes en todos los vertebrados (6) e incluso en el cangrejo cacerola, Limulus polyphemus (7), que se encuentra separado en cuanto a evoluci6n de los primates aproximadamente 600 millones de anos. No se ha descrito todavia deficiencia o polimorfismo de proteina de SAP en humanos, y su componente de carbohidrato es la glucoproteina (8) mas invariante de cualquiera de las conocidas. Esto supone una evidencia convincente de que SAP presenta funciones

45 beneficiosas que contribuyen a la supervivencia.

No obstante, el nombre de SAP procede del hecho de que se encuentra presente de forma universal en los dep6sitos de tejidos patol6gicos de amiloide en el estado de enfermedad de amiloidosis (9). El conjuntos de estos dep6sitos consiste en fibrillas amiloides formadas por proteina autologa desdoblada y suplementada con pliegue de cruce-� (10) patonom6nico, junto con glucosaminoglucanos unidos fuertemente de los tipos de sulfato de heparano y 50 sulfato de dermatano (11).SAP experimenta uni6n especifica dependiente de calcio con estas fibrillas, tanto in vivo

(12) como in vitro (13, 14), y se ha aprovechado esta propiedad para desarrollar SAP con radiomarcaje como marcador gammagrafico, altamente especifico, sensible y cuantitativo usado para el diagn6stico y control de los dep6sitos de amiloidosis (15) sistemica y extra-cerebral local.

Una de las formas de amiloidosis extra-cerebral local que es la que presenta mayor importancia clinica es la

55 amiloidosis asociada a dialisis, una complicaci6n muy grave, dolorosa y que conduce a paralisis de la dialisis a largo plazo para lesiones renales en etapa terminal. Esto tipo de amiloide se confina en gran medida en las articulaciones y estructuras peri-articulares, produciendo compresi6n de los nervios y quistes 6seos que dan lugar a la alteraci6n de la articulaci6n y a fracturas patol6gicas. Se han estudiado en gran medida la amiloidosis de dialisis usando SAP radiomarcado, mostrando que la captaci6n al interior y alrededores de las articulaciones es especifica para dep6sitos amiloides histol6gicamente comprobados en estas localizaciones (16, 17).

Se han desarrollado farmacos que son fijados por SAP con el fin de tratar la amiloidosis, incluyendo la enfermedad

5 de Alzheimer. El documento WO 95/05394 describe agentes terapeuticos y diagn6sticos para la amiloidosis que comprenden moleculas que inhiben la uni6n de SAP a las fibrillas amiloides. El documento EP-A-0915088 describe D-prolinas y sus derivados para su uso en el tratamiento o prevenci6n de amiloidosis central y sistemica que incluyen la enfermedad de Alzheimer, y Diabetes mellitus de aparici6n con la madurez. El documento WO 03/013508 describe agentes terapeuticos para la disminuci6n de poblaciones de proteinas no deseadas en el plasma en el que

10 los agentes bifuncionales formar un complejo con una pluralidad de proteinas para provocar su disminuci6n en el plasma de la persona. Se describe que acido R-1-[6-R-2-carboxi-pirrolidin-1-il]-6-oxo-hexanoil]pirrolidin-2-carboxilico se dirige de manera especifica a SAP in vivo para provocar la agregaci6n de moleculas de SAP pentamericas nativas en complejos SAP-farmaco que posteriormente son eliminados de forma rapida por el higado. Esto tambien es documentado por Pepys et al en Nature, 417, 254-259 (2002).

15 Sumario de la invenci6n

La presente invenci6n se refiere al uso de D-prolina de f6rmula:

o

en la que R

20 y el grupo

R1 es hidr6geno o hal6geno;

X-Y-X' es un enlazador que tiene al menos 4, de manera ventajosa al menos 5, de manera ventajosa al menos 6, hasta 20 atomos de carbono de cadena lineal o sencilla, en la que

X es -(CH2)n-; -CH(R2)(CH2)n-; CH2O(CH2)n-; CH2NH-; bencilo; -C(R2)=CH-; -CH2-CH(OH)- o tiazol-2,525 diilo;

Y es -S-S-;-(CH2)n-; -O-; -NH-; -N(R2)-;-CH=CH-; -NHC(O)NH-;-N(R2)C(O)N(R2)-; -N[CH2C6H3(OCH3)2]; -N(CH2C6H5)-; N(CH2C6H5)C(O)N(CH2C6H5)-; -N(alcoxialquilo)-; N(cicloalquil-metilo)-; 2,6-piridilo; 2,5furanilo; 2,5-tienilo; 1,2-ciclohexilo; 1,3-ciclohexilo; 1,4-ciclohexilo;1,2-naftilo; 1,4-naftilo; 1,5-naftilo; 1,6naftilo; bifenileno 6 1,2-fenileno, 1,3-fenileno y 1,4-fenileno, en el que los grupos fenileno se encuentran

30 sustituidos de manera opcional por 1-4 sustituyentes, escogidos entre hal6geno, alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxilo, carboxi, -COO-alquilo inferior, nitrilo, 5-tetrazol (acido 2-carboxilico pirrolidin-1-il)-2oxo-etoxi, N-hidroxicarbamimiodilo, 5-oxo[1,2-oxadiazolilo, 2-oxo[1,2,3,5]oxotiadiazolilo, 5tioxo[1,2,4]oxadiazolilo y 5-terc-butilsulfanil-[1,2,4]oxadiazolilo;

X' es -(CH2)n-; -(CH2)n-CH(R2)-; -(CH2)nOCH2-, -NHCH2-; bencilo; -CH=C(R2)-; CH(OH)CH2; o tiazol-2,5-diilo;

35 R2 es alquilo inferior, alcoxi inferior o bencilo y

n es 0-3.

o una de sus sales aceptables farmaceuticamente o de sus mono-o o diesteres que son capaces de inhibir la uni6n del ligando SAP o la disminuci6n de SAP en el plasma de una persona, para la preparaci6n de un medicamento para

el tratamiento o la prevenci6n de osteoartritis en la persona.

De manera sorprendente se han encontrado que el uso de dichos agentes para tratar pacientes con osteoartritis presenta un efecto dramatico para aliviar los sintomas de la enfermedad en los pacientes. En un segundo aspecto, la invenci6n proporciona D-prolina y f6rmula:

en la que R es

y el grupo

R1 es hidr6geno o hal6geno;

10 X-Y-X' es un enlazador que tiene al menos 4, de manera ventajosa al menos 5, de manera ventajosa al menos 6, hasta 20 atomos de carbono de cadena lineal o sencilla, en la que

X es -(CH2)n-; -CH(R2)(CH2)n-; CH2O(CH2)n-; CH2NH-; bencilo; -C(R2)=CH-; -CH2-CH(OH)- o tiazol-2,5diilo;

Y es -S-S-;-(CH2)n-; -O-; -NH-; -N(R2)-;-CH=CH-; -NHC(O)NH-;-N(R2)C(O)N(R2)-; -N[CH2C6H3(OCH3)2]

15 ; -N(CH2C6H5)-; N(CH2C6H5)C(O)N(CH2C6H5)-; -N(alcoxialquilo)-; N(cicloalquil-metilo)-; 2,6-piridilo; 2,5furanilo; 2,5-tienilo; 1,2-ciclohexilo; 1,3-ciclohexilo; 1,4-ciclohexilo;1,2-naftilo; 1,4-naftilo; 1,5-naftilo; 1,6naftilo; bifenileno 6 1,2-fenileno, 1,3-fenileno y 1,4-fenileno, en el que los grupos fenileno se encuentran sustituidos de manera opcional por 1-4 sustituyentes, escogidos entre hal6geno, alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxilo, carboxi, -COO-alquilo inferior, nitrilo, 5-tetrazol (acido 2-carboxilico pirrolidin-1-il)-2

20 oxo-etoxi, N-hidroxicarbamimiodilo, 5-oxo[1,2-oxadiazolilo, 2-oxo[1,2,3,5]oxotiadiazolilo, 5tioxo[1,2,4]oxadiazolilo y 5-terc-butilsulfanil-[1,2,4]oxadiazolilo;

R2 es alquilo inferior, alcoxi inferior o bencilo y

n es 0-3.

25 o una de sus sales aceptables farmaceuticamente o uno de sus mono-o diesteres que son capaces de inhibir la uni6n del ligando SAP o la disminuci6n de SAP en el plasma de una persona, para su uso en el tratamiento o la prevenci6n de osteoartritis en la persona.

De acuerdo con la f6rmula anterior, la expresi6n "alquilo inferior" indica residuos de hidrocarburo saturado de cadena lineal o de cadena ramificada, preferentemente con 1 a 4 atomos de carbono, tal como metilo, etilo, propilo, 30 isopropilo, n-butilo, 2-butilo, isobutilo y t-butilo. Hal6geno indica cloro, yodo, fluor y bromo. Los compuestos de f6rmula 1-A y 1-B pueden formar sales con metales, por ejemplo sales de metales alcalinos tales como sales de sodio o de potasio, o sales de metales alcalino terreos tales como sales de calcio o magnesio, con bases organicas, por ejemplo sales con aminas, tales como n-etilpiperidina, procaina o dibencilamina o sales con amino acidos basicos tales como sales con arginina o lisina. Los compuestos tambien se pueden usar en forma de ester, siendo 35 dichos esteres alifaticos o aromaticos. Estos esteres incluyen, por ejemplo, esteres de alquilo y fen6licos. Los

esteres mas preferidos con esteres de alquilo procedentes de alcanoles C1-4, especialmente esteres de metilo y etilo.

Estos compuestos tambien se pueden usar en forma de sus pro-farmacos en una o ambas funciones de carbonilo.

El documento EP-A-0915088 describe detalles de estos compuestos y de sus sintesis.

Acido Carboxi-pirrolidin-1-il]-6-oxo-hexanoil] pirrolidin-2-carboxilico o una de sus sales aceptables farmaceuticamente o uno de sus mono-o diesteres.

Breve descripci6n de los dibujos

A continuaci6n se describe la presente invenci6n con mas detalle, a modo unicamente de ejemplo, haciendo referencia a los siguiente Ejemplos y a los dibujos adjuntos, en los que:

Las Figuras 1 y 3 muestran trazas de experimentos de resonancia de plasm6n superficial que evaluan el efecto de 1[(S)-3-mercapto-2-metilpropionil]-D-prolina (designada como Ro-3479 en estas figuras) sobre la uni6n de SAP a fibrillas amiloides en presencia y en ausencia de calcio;

La Figura 4 muestra un imagen de gammagrafia de las manos de un paciente con osteoartritis 24 horas despues de la inyecci6n intravenosa de SAP con marcaje de 123I; y

La Figura 5 muestra la proporci6n de la concentraci6n de varias proteinas en el fluido sinovial y en el suero de pacientes con varias formas de derrames que provocan artritis.

Descripci6n detallada de la invenci6n

Ejemplos

Metodos para mostrar la uni6n de SAP a los ligandos

Con el fin de identificar los compuestos que inhiben la uni6n de ligando de SAP, en primer lugar es necesario disponer de metodos para mostrar dicha uni6n.

1) Uni6n de SAP a ligandos de fase s6lida

Para los fines de la invenci6n, se puede demostrar la uni6n de SAP a ligandos de ensayo directamente permitiendo el contacto de SAP, proporcionado bien por suero de origen humano o animal, o aislado en forma purificada, con el ligando de fase s6lida. El contacto tiene lugar en una disoluci6n salina tamponada fisiol6gicamente que contiene suficientes iones calcio libres (aproximadamente 2 mmol/l), que resulta esenciales para la uni6n del ligando por medio de SAP. En el caso de SAP humano aislado, el tamp6n debe contener tambien 40 g/l de albumina de suero humano o bovino, con el fin de mantener SAP en la disoluci6n; a concentraciones de albumina bajas el SAP humano aislado experimenta autoagregaci6n de forma rapida y precipita en presencia de calcio (18, 19). Ligandos apropiados para los que SAP muestra su uni6n tipica dependiente de calcio incluyen agarosa (24), fosfoetanolamina (25), ADN (26), cromatina (27) y fibrillas amiloides (12, 28). Se inmovilizan sobre las particulas, tales como agarosa, acrilamida, poliestireno, latex, celulosa u otras perlas, o sobre membrana, filtros, o plastico u otras superficies s6lidas tales como placas de microvaloraci6n o tubos individuales, o pueden ser componentes integrales de particulas s6lidas, tales como bacterias o gel de agarosa, que se pueden usar de forma directa. La inmovilizaci6n de ligandos solubles, o la inmovilizaci6n secundaria de ligandos en forma de particulas con fines de conveniencia puede tener lugar por medio de adherencia directa no especifica del ligando, o mediante uni6n covalente por medio de grupos amino, hidroxilo u otros grupos quimicos de las moleculas de ligando que se acoplan de forma directa o por medio de enlazadores de espaciador con el material de la fase s6lida. Tras poner en contacto el s6lido o los ligandos inmovilizados, se lava el SAP que no se ha unido, haciendo uso de la misma disoluci6n tamp6n en la que tuvo lugar la uni6n, y se detecta la presencia de SAP unido a los ligandos y se cuantifica. El lavado implica la separaci6n de fase, tal como la centrifugaci6n de particulas s6lidas, o la inmersi6n, el flujo a traves o sobre superficies s6lidas tales como membranas, filtros y superficies plasticas. Se puede detectar SAP unido directamente si la fuente de SAP contiene SAP que ha sido marcado con un marcador detectable. Dicho marcadores incluyen is6topos que emiten gamma tales como 125I o 131I para la detecci6n en un contador gamma; is6topos que emiten beta tales como 14C o 3H para la detecci6n en un contador de centelleo o beta, fluorocromos para la detecci6n en un fluorimetro, cit6metro de flujo o en un dispositivo de clasificaci6n celular activado por fluorescencia; enzimas tales como peroxidadas o fosfatasa alcalina para la detecci6n por medio de su actividad catalitica especifica. En todos estos casos, resulta esencial demostrar que el proceso de marcar directamente el SAP no altera sus propiedades de uni6n fisiol6gicas. Esto se hace comparando la uni6n de SAP marcado y no marcado con un ligando de fase s6lida inmovilizado, tal como fosfoetanolamina unida, usando carbodiimida, a carbohexil-SepharoseTM. Tambien se puede demostrar la uni6n de SAP directamente por medio de ensayo inmunoquimico que muestra la disminuci6n de SAP a partir de la fuente ofertada de SAP, y la recuperaci6n de la SAP unido cuando, despues de lavar primero con disoluci6n tamp6n que contiene calcio, se eluye el material de ligando con disoluci6n tamp6n que contiene EDTA para provocar la formaci6n de quelatos de iones de calcio. De manera alternativa, el SAP puede ser detectado indirectamente, usando anticuerpos desarrollados en conejos, ovejas, cabras, ratas, ratones, cobayas u otros animales, especificos

para el SAP de las especies objeto de ensayo. Para este fin, los propios anticuerpos anti-SAP se pueden marcar directamente con un is6topo radiactivo, enzima, fluorocromo u otro marcador detectable, o se puede detectar la uni6n de los anticuerpos anti-SAP con el SAP usando un segundo anticuerpo dirigido contra la inmunoglobulina de las especies del reactivo anti-SAP principal. Ademas de la detecci6n y el conteo en los instrumentos apropiados para el marcador usado, se puede visualizar la uni6n de SAP a los micro-organismos o sus otros componentes, de forma directa o indirecta usando microscopia 6ptica, electr6nica o de fluorescencia. Se puede usar SAP marcado con enzima o anticuerpos anti-SAP para microscopia 6ptica o electr6nica, reactivos marcados con fluorocromo para microscopia de fluorescencia y marcaje de oro (u otras particulas de densidad electr6nica) para microscopia electr6nica.

2) Uni6n de ligandos mediante SAP inmovilizado

Un enfoque alternativa para demostrar la uni6n del ligando por parte de SAP consiste en inmovilizar el SAP sobre la fase s6lida y posteriormente permitir la uni6n con ligandos que se encuentran marcados directamente o que se pueden detectar, por ejemplo usando anticuerpos especificos dirigidos contra estos ligandos. De este modo, se puede inmovilizar SAP purificado aislado de origen humano o animal sobre perlas, particulas, membranas, filtros, plastico u otras superficies, por medio de la adherencia directa o mediante acoplamiento covalente, o por medio de atrapamiento con anti-cuerpos especificos anti-SAP inmovilizados sobre la fase s6lida (29). Por medio del uso de las condiciones especificadas en 1] anteriormente, se pueden poner en contacto ligandos apropiados con el SAP inmovilizado y se puede permitir la uni6n por parte del mismo.

Inhibici6n de la uni6n de SAP a los ligandos

Se puede usar cualquiera de los metodos explicados anteriormente en 1] y 2] para mostrar la uni6n del ligando por parte de SAP con el fin de evaluar la capacidad de los compuestos para inhibir dicha uni6n. No obstante, la velocidad y facilidad de uso de las diferentes tecnicas varien en gran medida, asi como tambien aptitud para los diferentes fines. De este modo, para la detecci6n de grandes numeros de compuestos, los metodos de alto rendimiento, tales como los basados en placas de microvaloraci6n, resultan esenciales. Un metodo tipico de este tipo implica disponer de ligando inmovilizado sobre las placas, y ofrecer a cada pocillo una cantidad de SAP radiomarcado en condiciones tales que aproximadamente 40 % del mismo se encuentre unido. Se anaden los compuestos objeto de ensayo a los pocillos y se someten a pre-incubaci6n en los mismos antes de la adici6n del SAP radiomarcado y se controla el efecto de su presencia en la uni6n posterior de SAP. En otra configuraci6n, se pre-incuban los compuestos a ensayar con el SAP marcado antes de anadir la mezcla a las placas. La configuraci6n contraria, en la que se inmoviliza SAP, tambien resulta informativa. En este momento, se pre-incuban los compuestos de ensayo con SAP inmovilizado antes de anadir el ligando detectable. Estos diferentes enfoques permiten la detecci6n de los compuestos que bloquean la uni6n de ligando por parte de SAP mediante diferentes mecanismos, y contribuyen a distinguir entre los que son propiamente ligandos especificos para SAP, los que afectan a la molecula de SAP de otro modo y los que interactuan con el ligando para evitar su reconocimiento por parte de SAP.

Detecci6n directa de la uni6n del ligando por parte de SAP y su inhibici6n

La resonancia de plasm6n superficial (SPR) es un metodo informativo muy potente aunque de bajo rendimiento para identificar compuestos que se unen por medio de, o que ellos mismos se unen a SAP, de forma dependiente o independiente del calcio, para los fines de la presente invenci6n. Por ejemplo, los compuestos de bajo peso molecular que inhiben la uni6n de SAP a sus ligandos macromoleculares, que incluyen ligandos objetivo relevantes para la presente invenci6n, pueden ser detectados por su efecto sobre la senal generada por medio de la uni6n de SAP en fase fluida al ligando inmovilizado sobre la fase s6lida (Ejemplo A). Ademas, cuando el propio SAP queda inmovilizado sobre la fase s6lida en un instrumento de SPR, la interacci6n con el mismo de moleculas de ensayo proporcionadas en al fase de fluido genera una senal que puedes ser detectada y cuantificada. El SAP purificado inmovilizado en el interior de un instrumento SPR proporciona una senal cuantificable cuando se expone a otra molecula que forma un complejo con el SAP, y esto es distinto de la ausencia de dichas senal en caso de que no se forme complejo. Esta tecnica permite la detecci6n de compuestos en cuanto a su capacidad para interactuar con SAP, y no depende de ningun modo especifico de interacci6n con SAP, en particular el que implica el sitio de uni6n de ligando dependiente de calcio de SAP, de manera que detecta moleculas que podrian no encontrarse en los sistemas de ensayo que requieren una uni6n de SAP dependiente de calcio. Otro metodo directo potente y de bajo rendimiento es la calorimetria isotermica que mide el calor de interacci6n en la disoluci6n entre SAP y los compuestos de ensayo de acuerdo con la presente invenci6n. Se mide de forma precisa la afinidad de uni6n como indicativo de la eficacia potencial. Lo resultados tipicos por medio de este metodo para las constantes de disociaci6n, Kd, entre SAP y varios compuestos son como se muestran a continuaci6n:

Compuesto: Kd en micromoles por litro (mediciones repetidas)

Fosfoetanolamina: 36, 27, 48

Fosfocolina: Sin uni6n

N-acetil-D-prolina: 16, 23, 17

Ro-63-8695: 0,0139, 0,0059, 0,0065, 0,0088

Ro-64-2856: 0,019, 0,02

Los dos ultimos componentes proceden de EP-A-915088, en el que Ro-63-8695 es acido (R)-1-[6-(R)-2-carboxipirrolidin-1-il]-6-oxo-hexanoil]pirrolidin-2-carboxilico y Ro-64-2856 es acido (R)-1-[[4-[2-(R)-2-carboxi-pirrolidin-1-il]-2oxo-etoxi]-fenoxil]-acetil]-pirrolidin-2-carboxilico.

Efectos sobre SAP in vivo en compuestos que bloquean la uni6n in vitro de ligando de SAP

Para los fines de la presente invenci6n, se someten a ensayo los compuestos que bloquean la uni6n de SAP con ligandos diana in vivo en SAP humano de expresi6n de rat6n transgenico, como se describe en otra parte (23), en cuanto a sus efectos sobre las concentraciones de SAP en plasma y la renovaci6n y catabolismo de SAP. Habiendose establecido por medio de dosificaciones medidas que los compuestos no son intrinsecamente t6xicos, se administran varias dosificaciones al rat6n transgenico con SAP humano. Se toma el suero a intervalos regulares para el ensayo inmunoquimico de SAP. Ademas, se puede inyectar por via intravenosa SAP humano radiomarcado en forma de traza en diferentes momentos con relaci6n a la dosificaci6n de farmaco, y se llevan a cabo tanto el conteo en cuerpo como la toma de muestra de sangre para controlar el periodo de semivida en plasma y la eliminaci6n corporal de SAP (14, 30). Ademas, se pre-incuba el SAP de marcador con diferentes cantidades de los compuestos sometidos a ensayo, y posteriormente se inyecta en ratones que no reciben farmaco alguno, con el fin se evaluar el efecto que la uni6n del farmaco presenta sobre la eliminaci6n de SAP. De acuerdo con la presente invenci6n, es probable que los compuestos que aceleran la eliminaci6n de SAP in vivo o que rebajan la concentraci6n de SAP en plasma, reduciendo de este modo la disponibilidad in vivo de SAP, presenten valor terapeutico.

Se evaluan los compuestos que han sido sometidos a ensayos de toxicidad formal y que se han resultado aceptables para administraci6n en humanos, en cuanto a sus efectos sobre la concentraci6n de SAP en plasma, el periodo de semivida, la renovaci6n y el catabolismo. Se somete SAP humano aislado a radiomarcaje de traza con 125I y/o 123I y se inyecta por via intravenosa, seguido de estudios de renovaci6n de plasma y formaci6n de imagenes de gammagrafia de cuerpo entero, como se describe en otras referencias (15, 23, 31).

Ejemplo A. Uso de resonancia de plasm6n superficial para detectar la inhibici6n de uni6n de ligando dependiente de calcio por parte de SAP.

Se inmovilizaron covalentemente fibrillas amiloides A�-42 sinteticas (28) sobre la superficie de reaccionante del instrumento de resonancia de plasm6n superficial Fisons IAsys y posteriormente se expusieron a SAP aislado (32) en disoluci6n en disoluci6n salina de fisiol6gica con tamp6n Tris en ausencia de calcio (mostrado como TN/N en las Figuras). No tuvo lugar uni6n de SAP y de este modo no se gener6 senal. La introducci6n de calcio permiti6 que el SAP se enlazara de forma especifica a las fibrillas amiloides inmovilizadas, generando una senal facilmente detectable (Fig. 1). 1-[(S)-3-mercapto-2-metilpropionil]-D-prolina (designando en la Figuras como Ro-3479) es una inhibidor especifico de la uni6n de ligando dependiente de calcio por parte de SAP. La adici6n de 1-[(S)-3-mercapto2-metilpropionil]-D-prolina (Ro-3479) a 500 Imol/l en disoluci6n salina fisiol6gica de tamp6n de Tris que contiene calcio (TC en las Figuras) invirti6 por completo la uni6n de SAP y la correspondiente senal (Fig. 1). Tras la adici6n de SAP en ausencia de calcio, seguido de Ro-3479 a 100 Imol/l, y posteriormente permitiendo el equilibrio del sistema, la adici6n posterior de calcio para permitir la uni6n especifica de ligando dependiente de calcio por parte de SAP no fue seguido de senal alguna (Fig. 2), lo que indica que Ro-3479 no solo disocia la uni6n de SAP sino que tambien la inhibe. Se regener6 el ligando de fase s6lida para la uni6n posterior de ligando dependiente de calcio, mediante lavado con EDTA en disoluci6n salina fisiol6gica tamponada con Tris (TE en las Figuras) y posteriormente se reexpuso a SAP en tamp6n TN seguido de calcio. Se observ6 de nuevo la senal tipica que refleja la uni6n del ligando por parte de SAP y posteriormente se invirti6 por completo mediante la adici6n de Ro-3479 a 50 Imol/l (Fig. 3).

Ejemplo B. Detecci6n de inhibidores de la uni6n de SAP radiomarcado con 125I a organismos de Neisseria meningitidis inmovilizados en placas de microvaloraci6n.

Materiales y metodos

Se reparti6 una suspensi6n de Neisseria meningitidis a 1 x 108 organismo s por ml en PBS en placas de microvaloraci6n de poliestireno en volumenes de 50 Il por pocillo, y se dej6 durante la noche a 4 oC. Posteriormente, se lavaron todos los pocillos tres veces con volumenes de 200 Il de PBS que contenia 0,05 % v/v de Tween 20, antes de equilibrio durante 2 min con NaCl 0,14 M/CaCl2 0,002 M tamponado con Tris 0,01 M a pH 8,0 (tamp6n TC),

que contenia BSA 4 % p/v y 0,05 % /v de Tween 20 (tamp6n TCBT). Se vaciaron los pocillos antes de anadir a cada uno de ellos los siguientes reactivos. Para la uni6n maxima inhibida de control: 35 Il de tamp6n de TCBT (que contenia CaCl2 2,3 mM, BSA 5,72 % p/v, Tween 20 0,072 % v/v), 10 Il de TC y 5 Il de SAP radiomarcado con 125I en NaCl 0,14 M tamponado con Tris 0,01 M a pH 8,0 (tamp6n TN), para proporcionar concentraciones finales de BSA, Ca2+ 4 %, 2 mM; Tween 20, 0,05 %. Para la uni6n de de EDTA de fondo, no dependiente de calcio, no especifica: 5 Il de SAP radiomarcado en TN y 45 Il de NaCl 0,14 M tamponado con Tris 0,01 M a pH 8,0 que contenia EDTA 11,1 mM, BSA 4,4 % p/v y Tween 20 0,06 % p/v (tamp6n TEBT) para proporcionar concentraciones finales de EDTA, 10 mM; BSA, 4 %; Tween 20, 0,05 %. Para evaluar los inhibidores; 35 Il de TCBT (que contenia Ca2+ 2,3 mM, BSA 5,72 % y Tween 20 0,072 %), 10 Il de TC que contenia los compuestos de ensayo a 10 mM, 1 mM, 100 mM, 10 IM o 1 IM, y 5 Il de SAP radiomarcado en TN. A continuaci6n, se incubaron todos los pocillos a temperatura ambiente durante 2 h antes de ser lavados tres veces con volumenes de 200 Il de TCBT, se dejaron secar durante 1 h a temperatura ambiente, y se unieron a SAP radiomarcado y posteriormente se contaron.

Los compuestos sometidos a ensayo en el experimento mostrados en el presente documento fueron una familia de moleculas desarrollada como inhibidores de la uni6n de SAP a fibrillas amiloides, seguido de la identificaci6n de una molecula con derivaci6n inicial durante la detecci6n de elevado rendimiento de una biblioteca de compuestos de gran tamano de acuerdo con la patente de EE.UU. 6.126.918. El exito inicial fue 1-[(S)-3-mercapto-2-metilpropionil]D-prolina, (Ro-15-3479), y un dimero de uno de sus estereois6meros, se encontr6 que el acido (R)-1-[(S)-2-[(S)-3[(R)-2-carboxi-pirrolidin-1-il]-2-metil-3-oxo-propildisulfanil]-2-metil-propionil]-pirrolidin-2-carboxilico (Ro-63-3300) era mucho mas potente. Los otros dos diastereois6meros no inhibieron la uni6n de ligando por parte de SAP. Posteriormente se produjo un programa de quimica, acido (R)-1-[6-(R)-2-carboxi-pirrolidin-1-il]-6-oxohexanoil]pirrolidin-2-carboxilico (Ro-63-8695) (Ejemplo 8b de EP-A-915088) y una familia de moleculas relacionadas, que se sometieron a ensayo en el presente documento. Sus nombre quimicos y designaciones codificadas se muestran a continuaci6n:

Ro-64-4383: acido (R)-1-[[2,5-dihidroxi-4-[2-[(R)-2-carboxi-pirrolidin-1-il]-2-oxo-etil]-2-fenil]-acetil]-pirrolidin-2carboxilico.

Ro-64-2856: acido (R)-1-[[4-[2 [(R)-2-carboxi-pirrolidin-1-il]-2-oxo-etoxi]-fenoxi]-acetil]-pirrolidin-2-carboxilico.

Ro-64-3300: acido (R)-1-[(S)-3-[(S)-3-[(R)-2-carboxi-pirrolidin-1-il]-2-metil-3-oxo-propildisulfanil]-2-metil-propionil]pirrolidin-2-carboxilico.

Ro-15-3479: 1-[(S)3-mercapto-2-metilpropionil]-D-prolina.

Ro-64-2848: (R)-1-[[3-[2-[(R)-2-carboxi-pirrolidin-1-il]-2-oxo-etoxi]-2-metil-fenoxi]-acetil]-pirrolidin-2-carboxilico.

Ro-64-2668: (R)-1-[[3-[2-[(R)-2-carboxi-pirrolidin-1-il]-2-oxo-etil]-fenil]-acetil]-pirrolidin-2-carboxilico.

Ro-64-2845: (R)-1-[[2-[2-[(R)-2-carboxi-pirrolidin-1-il]-2-oxo-etoxi]-2-metoxi-fenoxi]-acetil]-pirrolidin-2-carboxilico.

Ro-64-2600 (R)-1-[cis-4-[(R)-2-carboxi-pirrolidin-1-carbonil]-ciclohexanocarbonil]-pirrolidin-2-carboxilico.

Ro-64-5607: (R)-1-[[4-[2-[(R)-2-carboxi-pirrolidin-1-il]-2-oxo-etil]-naftalen-1-il]-acetil]-pirrolidin-2-carboxilico.

Ro-64-5445: (R)-1-[[5-[2-[(R)-2-carboxi-pirrolidin-1-il]-2-oxo-etoxi]-naftalen-1-iloxi]-acetil]-pirrolidin-2-carboxilico.

Ro-63-8593: (R)-1-[[2-[2-[(R)-2-carboxi-pirrolidin-1-il]-2-oxo-etoxi]-fenoxil]-acetil]-pirrolidin-2-carboxilico.

Ro-63-7777: (R)-1-[[4-[2-[(R)-2-carboxi-pirrolidin-1-il]-2-oxo-etil]-fenil]-acetil]-pirrolidin-2-carboxilico.

Resultados

La capacidad de los compuestos sometidos a ensayo para inhibir la uni6n de SAP a meningococos se expresa como el porcentaje de reducci6n de la uni6n de SAP en comparaci6n con la uni6n en ausencia de cualquier inhibidor (Tabla 1). Se inhibi6 toda la uni6n por parte de EDTA, confirmando la naturaleza de interacci6n especifica y dependiente de calcio. Fosfoetanolamina, una ligando bien conocido de SAP (25, 32) produjo inhibici6n a concentraci6n elevada, pero unicamente efectos modestos cuando se diluy6. Fosfocolina, el ligando especifico de la proteina reactiva C, la otra proteina de pentraxina de plasma humano estrechamente relacionada con SAP, no present6 efecto virtual, como se esperaba ya que no hubo evidencia de que SAP reconociera y se uniera a fosfocolina en condiciones fisiol6gicas. La familia de moleculas Ro-63-8695 fue un potente inhibidor con valores de IC50 en el intervalo sub-micromolar en varios casos. Por tanto, estos compuestos son candidatos para el ensayo posterior de acuerdo con la presente invenci6n.

Tabla 1 Porcentaje de inhibici6n por parte de varios compuestos de la uni6n de SAP radiomarcado a Neisseria meningitidis

inmovilizada

Compuesto: Molaridad

2 mM: 200 lM 20 IM 2 IM 200 nM

Ninguno: 0 0 0 0 0

EDTA 10 mM: 100 nd nd nd nd

Fosfoetanolamina: 95 41 32 18 7

Fosfocolina: 24 3 4 5 0

Ro-63-8695: 100 79 74 61 5

Ro-64-4383: 100 100 95 76 1

Ro-64-2856: 100 65 74 65 0

Ro-63-3300: 100 69 73 68 28

Ro-15-3479: 77 54 50 42 3

Ro-64-2848: 100 100 93 64 1

Ro-64-2868: 100 100 92 64 28

Ro-64-2845: 100 93 92 74 19

Ro-64-2600: 100 100 93 73 31

Ro-64-5607: 100 100 89 69 13

Ro-64-5445: 100 100 81 72 30

Ro-63-8593: 100 100 87 77 18

Ro-63-7777: 100 100 73 64 7

Ejemplo C

Detecci6n de inhibidores de la uni6n de SAP radiomarcado con 125I a cromatina inmovilizada en placas de microvaloraci6n

Materiales y metodos

Se reparti6 una disoluci6n que contenia 100 Ig/ml de cromatina larga procedente de eritrocito de pollo (27), en PBS con un pH ajustado a 9, sobre placas de microvaloraci6n que contenian superficies activadas con N-oxisuccinimida, en volumenes de 50 Il por pocillo y se dej6 a temperatura ambiente durante 1 h. Posteriormente se lavaron todos los pocillos tres veces con volumenes de 200 Il de PBS, pH 7,4, que contenian 0,05 % v/v de Tween 20 (PBST) y se bloquearon los sitios activos sin reaccionar mediante la adici6n de 50 Il de BSA 2 % v/v en PBS, pH 7,4, sobre cada pocillo, durante 30 min a temperatura ambiente. A continuaci6n, se lavaron los pocillos tres veces con volumenes de 200 Il de PBST antes del equilibrio durante 2 minutos con NaCl 0,14 M/CaCl2 0,002 M tamponado con Tris 0,01 M a pH 8,0 (tamp6n TC), que contenia BSA 4 % p/v y Tween 20 0,05 % v/v (tamp6n TCBT). Posteriormente, se vaciaron los pocillos antes de anadir a cada uno de ellos los siguientes reactivos. Para el control de la uni6n maxima inhibida: 35 Il de tamp6n TCBT (que contenia 2,3 mM de CaCl2, BSA 5,72 % p/v, Tween 20 0,072 % v/v), 10 Il de TC y 5 Il de SAP radiomarcado con 125I en NaCl 0,14 M tamponado con Tris 0,01 M a pH 8,0 (tamp6n TN), para proporcionar concentraciones finales de BSA, 4 %; Ca2+, 2 mM; Tween 20, 0,05 %. Para la uni6n de fondo, no especifica, no dependiente de calcio, en presencia de EDTA; 5 Il de SAP radiomarcado en TN y 45 Il de NaCl 0,14 M tamponado con Tris 0,01 M a pH 8,0 que contenia 11,1 mM de EDTA, 4,4 % p/v de BSA y Tween 20 0,06 % p/v (tamp6n TEBT) para proporcionar concentraciones finales de EDTA, 10 mM; BSA, 4 %; Tween 20, 0,05 %. Para los ensayos de inhibidores; 35 Il de TCBT (que contenia 2,3 mM de Ca2+, 5,72 % de BSA y 0,072 % de Tween 20), 10 Il de compuestos de ensayo que contenian TC a 10 mM, 1 mM, 100 IM, 10 IM 6 1 IM y 5 Il de SAP radiomarcado en TN. A continuaci6n se incubaron todos los pocillos a temperatura ambiente durante 2 h antes de ser lavados tres veces con volumenes de 200 Il de TCBT, se dejaron secar durante 1 h a temperatura ambiente, se unieron a SAP radiomarcado y posteriormente se contaron. Los compuestos sometidos a ensayo del experimento mostrados en el

presente documento fueron los mismos que los especificados en el Ejemplo B anterior.

Resultados

La capacidad de los compuestos sometidos a ensayo para inhibir la uni6n de SAP a cromatina se expresa como el porcentaje de reducci6n de la uni6n de SAP en comparaci6n con la uni6n en ausencia de cualquier inhibidor (Tabla 2). Se inhibi6 toda la uni6n por parte de EDTA, confirmando la naturaleza de la interacci6n especifica y dependiente de calcio. La uni6n a los pocillos de control sin cromatina y el bloqueo con BSA se encontraron al mismo nivel de fondo como se observa con la inhibici6n completa por parte de EDTA o los otros inhibidores especificos. Fosfoetanolamina, un conocido ligando de SAP (25, 32) produjo inhibici6n a concentraci6n elevada, pero unicamente efectos modestos cuando se diluy6. Fosfocolina, el ligando especifico de la proteina reactiva C, la otra proteina de pentraxina de plasma humano estrechamente relacionada con SAP, no present6 efecto virtual, como se esperaba ya que no hubo evidencia de que SAP reconociera y se uniera a fosfocolina en condiciones fisiol6gicas. La familia de moleculas Ro-63-8695 fue un potente inhibidor con valores de IC50 en el intervalo micromolar en varios casos. Por tanto, estos compuestos son candidatos para el ensayo posterior de acuerdo con la presente invenci6n, aunque de manera interesante este ensayo fue menos sensible que el que usa meningococos como ligando inmovilizado.

Tabla 2

Porcentaje de inhibici6n por parte de varios compuestos de la uni6n de SAP radiomarcado a cromatina larga nativa

inmovilizada

Compuesto: Molaridad

2 mM: 200 lM 20 IM 2 IM 200 nM

Ninguno: 0 0 0 0 0

Fosfoetanolamina: 94 59 36 9 3

Fosfocolina: 19 3 0 0 2

Ro-63-8695: 93 87 69 29 1

Ro-64-4383: 97 88 78 45 0

Ro-64-2856: 91 75 56 36 1

Ro-63-3300: 99 88 69 34 3

Ro-15-3479: 81 46 72 14 0

Ro-64-2848: 98 95 65 22 0

Ro-64-2868: 98 94 56 18 0

Ro-64-2845: 100 96 75 nd 11

Ro-64-2600: 100 94 67 35 1

Ro-64-5607: 100 96 77 35 15

Ro-64-5445: 96 82 74 51 12

Ro-63-8593: 96 89 77 34 7

Ro-63-7777: 92 66 39 19 4

Ejemplo D. Detecci6n de inhibidores de la uni6n de SAP radiomarcado con 125I a virus de gripe inmovilizado sobre placas de microvaloraci6n

Materiales y metodos

Se diluy6 una suspensi6n concentrada de virus de gripe purificado A/Shanghai/24/90 a 10 mg de proteina por ml en PBS 1:50 en PBS y posteriormente de reparti6 sobre placas de microvaloraci6n de poliestireno en volumenes de 50 Il por pocillo, y se dej6 durante la noche a 4 oC. Se vaciaron todos los pocillos antes del bloqueo mediante adici6n a cada pocillo de 200 Il de BSA 2 % p/v en PBS e incubaci6n a temperatura ambiente durante 1 h. Posteriormente se lavaron todos los pocillos tres veces con volumenes de 200 Il de PBS que contenia 0,05 % v/v de Tween 20, antes del equilibrio durante 2 minutos con NaCl 0,14 M/CaCl2 0,002 M tamponado con Tris 0,01 M a pH 8,0 (tamp6n TC),

que contenia BSA 4 % p/v y Tween 20 0,05 % v/v (tamp6n TCBT). Posteriormente, se vaciaron los pocillos antes de anadir a cada uno de ellos los siguientes reactivos. Para el control de la uni6n maxima inhibida: 35 Il de tamp6n TCBT (que contenia 2,3 mM de CaCl2, BSA 5,72 % p/v, Tween 20 0,072 % v/v), 10 Il de TC y 5 Il de SAP radiomarcado con 125I (32) en NaCl 0,14 M tamponado con Tris 0,01 M a pH 8,0 (tamp6n TN), para proporcionar concentraciones finales de BSA, 4 %; Ca2+, 2 mM; Tween 20, 0,05 %. Para la uni6n de fondo, no especifica, no dependiente de calcio, en presencia de EDTA; 5 Il de SAP radiomarcado en TN y 45 Il de NaCl 0,14 M tamponado con Tris 0,01 M a pH 8,0 que contenia 11,1 mM de EDTA, 4,4 % p/v de BSA y Tween 20 0,06 % p/v (tamp6n TEBT) para proporcionar concentraciones finales de EDTA, 10 mM; BSA, 4 %; Tween 20, 0,05 %. Para los ensayos de inhibidores; 35 Il de TCBT (que contenia 2,3 mM de Ca2+, 5,72 % de BSA y 0,072 % de Tween 20), 10 Il de compuestos de ensayo que contenian TC a 10 mM, 1 mM, 100 IM, 10 IM 6 1 IM y 5 Il de SAP radiomarcado en TN. A continuaci6n se incubaron todos los pocillos a temperatura ambiente durante 2 h antes de ser lavados tres veces con volumenes de 200 Il de TCBT, se dejaron secar durante 1 h a temperatura ambiente, se unieron a SAP radiomarcado y posteriormente se contaron. Los compuestos sometidos a ensayo del experimento mostrados en el presente documento fueron los mismos que los especificados en el Ejemplo B anterior.

Resultados

La capacidad de los compuestos sometidos a ensayo para inhibir la uni6n de SAP a virus de gripe se expresa como el porcentaje de reducci6n de la uni6n de SAP en comparaci6n con la uni6n en ausencia de cualquier inhibidor (Tabla 3). Se inhibi6 toda la uni6n por parte de EDTA, confirmando la naturaleza de la interacci6n especifica y dependiente de calcio. La uni6n a los pocillos de control sin cromatina y bloqueados con BSA tuvieron lugar al mismo nivel de fondo como se observa con la inhibici6n completa por parte de EDTA o los inhibidores especificos. Fosfoetanolamina, un conocido ligando de SAP (25, 32) produjo inhibici6n a concentraci6n elevada, pero unicamente efectos modestos cuando se diluy6. Fosfocolina, el ligando especifico de la proteina reactiva C, la otra proteina de pentraxina de plasma humano estrechamente relacionada con SAP, no present6 efecto virtual, como se esperaba ya que no hubo evidencia de que SAP reconociera y se uniera a fosfocolina en condiciones fisiol6gicas. La familia de moleculas Ro-63-8695 fue un potente inhibidor con valores de IC50 en el intervalo sub-micromolar, nanomolar elevado, en varios casos. Por tanto, estos compuestos son candidatos para el ensayo posterior de acuerdo con la presente invenci6n, aunque de manera interesante este ensayo fue mas sensible que el que usa meningococos enteros o cromatina larga nativa como ligando inmovilizado.

Tabla 3

Porcentaje de inhibici6n por parte de varios compuestos de la uni6n de SAP radiomarcado a virus de gripe

inmovilizado

Compuesto: Molaridad

2 mM: 200 lM 20 IM 2 IM 200 nM

Ninguno: 0 0 0 0 0

Fosfoetanolamina: 69 51 42 8 1

Fosfocolina: 3 5 5 2 0

Ro-63-8695: 98 96 90 81 36

Ro-64-4383: 89 89 80 57 24

Ro-64-2856: 87 84 82 77 3

Ro-63-3300: 91 91 90 78 47

Ro-15-3479: 68 51 40 30 12

Ro-64-2848: 85 81 81 65 24

Ro-64-2868: 82 77 73 68 25

Ro-64-2845: 89 77 62 52 16

Ro-64-2600: 92 89 83 76 0

Ro-64-5607: 98 94 95 64 4

Ro-64-5445: 80 76 64 51 23

Ro-63-8593: 94 93 88 68 44

Ro-63-7777: 89 89 85 65 37

Ejemplo E

Acumulaci6n de SAP radiomarcado en articulaciones de pacientes que padecen artritis

Se encontr6 que SAP radiomarcado en articulaciones de pacientes sin amiloidosis de dialisis que padecian otras formas de artritis: 5 personas con osteoartritis (Fig. 4), 12 con artritis reumatoide y un sujeto con derrame traumatico. En cada uno de estos pacientes, se detect6 SAP marcado en todas las articulaciones con un derrama importante, independiente de la etiologia. Esto no resulta sorprendente en si mismo ya que se sabe que las proteinas del plasma penetran en los derrames de las articulaciones. No obstante, en 20 de 30 pacientes con diferentes artropatias, los inventores tambien observaron la captaci6n de SAP marcado en el interior de las articulaciones que no presentaban derrames clinicamente detectables.

La Figura 4 muestra una imagen gammagrafica de las manos de un paciente con osteoartritis 24 h despues de la inyecci6n intravenosa de SAP marcado con 125I. La captaci6n y la retenci6n de SAP vienen indicadas tanto en zonas carpianas, en las articulaciones de la segunda falange del metacarpiano y en algunas articulaciones de las intrafalanges.

Un posible mecanismo para la localizaci6n de SAP a partir de sangre en una articulaci6n danada puede ser la presencia en el interior de la articulaci6n de dep6sitos amiloides en las estructuras articular y peri-articular. De hecho, esto supone una amplia evidencia de la presencia dispersa de dep6sitos amiloides microsc6picos en el sinovio, cartilago articular y/o las capsulas de la articulaci6n de los individuos mayores (33-44). No obstante, la impresi6n global de estos estudios observacionales de autopsia y/o muestras de retenci6n es que los dep6sitos amiloides se encuentran asociados principalmente a una mayor edad de los sujetos y no particularmente al alcance

o gravedad de las manifestaciones clinicas o patol6gicas de la osteoartritis. De manera alternativa, o ademas de, SAP puede unirse a ligandos sobre estructuras diferentes de las fibrillas amiloides que se encuentran presentes en las articulaciones inflamadas o danadas. Se ha documento la uni6n dependiente de calcio de SAP a los glucosaminoglucanos in vitro (45), pero resulto especifica para los sulfatos de heparano y dermatano, en lugar de sulfato de condroitina y acido hialur6nico que son mas abundantes en el cartilago y en el liquido sinovial, respectivamente. No obstante, los glucosaminoglucanos son ubicuos en el tejido conectivo y pueden encontrarse expuestos de manera anormal y por tanto proporcionar ligandos para SAP en el interior y alrededor de las articulaciones danadas. Otro ligando al que se une SAP de forma rapida, in vivo asi como in vitro, es ADN (26, 27), tanto libre como el interior de cromatina cuando se encuentra expuesto por muerte celular (46), y SAP tambien se une a celulas apr6ticas in vivo (47). Un mayor muerte celular en las articulaciones danadas, bien por apoptosis o bien por necrosis, con exposici6n a cromatina, puede provocar una actividad anormal de los ligandos y de este modo un foco para la deposici6n de SAP.

Ejemplo F

Uni6n de SAP a ligandos en articulaciones danadas

Con el fin de someter a ensayo si SAP puede unirse a ligandos en articulaciones danadas, los inventores compararon en primer lugar la distribuci6n de albumina de suero humano radiomarcada con la de SAP en dos pacientes. En el que presentaba dialisis asociada a amiloide, la captaci6n de SAP por parte de la articulaci6n fue muy superior a la de albumina, mostrando que la localizaci6n de SAP fue especifica para amiloide. Por el contrario, en el paciente con artritis reumatoide activa y articulaciones multiples danadas con derrames, de manera general la localizaci6n de albumina y SAP resultaron comparables, lo que sugiere un proceso similar no especifico de derrame en el interior del espacio sinovial para ambas proteinas, aunque articulaciones esporadicas mostraron mayor retenci6n de SAP que de albumina. Ademas, en un paciente en el que se succionaron los derrames de articulaci6n de la rodilla hasta sequedad 24 h despues de la inyecci6n de SAP radiomarcado, se apreci6 todavia una localizaci6n intensa de SAP en las articulaciones. En segundo lugar, se midieron las concentraciones de SAP en el liquido sinovial y en el suero y de otras proteinas del plasma en muestras emparejadas en 15 pacientes con derrames articulares de diferente etiologia, y se calcularon las proporciones de liquido sinovial:suero. Existe una relaci6n lineal inversa bien conocida entre esta proporci6n y la masa molecular relativa de las proteinas, reflejando su facilidad relativa de acceso mediante la difusi6n desde la circulaci6n hasta el interior del espacio de la articulaci6n. No obstante, la proporci6n fue notablemente y considerablemente menor para SAP que la esperada para la proteina de su masa molecular (Fig. 5). Esto indica que SAP, que evidentemente puede conseguir acceso al liquido sinovial, como queda mostrado por medio de los estudios de los inventores con SAP radiomarcado, se encuentra probablemente formando uni6n con la estructura(s) de la articulaci6n y por tanto no se encuentran disponible para la detecci6n y en el analisis del propio liquido sinovial.

La Figura 5 muestra la proporci6n de la concentraci6n de varias proteinas de plasma en el liquido sinovial y en el suero para pacientes con varias formas de artritis que producen derrames. Existe una relaci6n lineal, r = 0,62, entre la masa molecular relativa y la proporci6n de concentraci6n de liquido sinovial/suero para todos los pacientes mostrados en el presente documento excepto SAP, para el cual la concentraci6n en el liquido de sinovial es notablemente menor que la predicha a partir de su masa molecular y concentraci6n en suero. (Clave: a1AG, glucoproteina de acido-a1; Alb, albumina; Trf, tranferrina; Cer, ceruloplasmina; a2M, macroglobulina a2).

Hasta el momento, no se pensaba que los dep6sitos amiloides microsc6picos muy comunes y dispersos en articulaciones de edad avanzada y que padecen osteoartritis contribuian a la patogenesis o a los sintomas de la osteoartritis. No esta claro como la uni6n de SAP bien a fibrillas amiloides o a otras estructuras en las articulaciones podria resultar patogenica en osteoartritis. Aunque el SAP agregado artificialmente puede activar el sistema de complemento (48) y podria de este modo ser pro-inflamatorio, la uni6n de SAP a cualquiera de los ligandos conocidos no solo no activa el complemento, sino que actualmente inhibe la activaci6n del complemento por parte del propio substrato (49, 50). De igual forma, no existe evidencia alguna de la activaci6n del complemento, bien de forma local o de forma sistemica, en pacientes con osteoartritis. No obstante, a la vista de las observaciones de los inventores de la localizaci6n de SAP en las articulaciones y de la concentraci6n inesperadamente reducida de SAP libre en el liquido sinovial, los inventores sometieron a ensayo si el SAP podria verse implicado en la osteoartritis.

Ejemplo G

Tratamiento de pacientes con osteoartritis

Dos ejemplos demuestran la eficacia de dicho tratamiento.

1) RJ, un medico de cabecera retirado de 64 anos de edad que vive en Nueva Zelanda, presenta un amplio historial de lesiones articulares y 6seas, comenzando desde nino en una granja y continuando durante la adolescencia y posteriormente la edad adulta practicando rugby y esqui. Desde la edad de 42 anos el paciente ha sufrido dolor e hinchamiento de articulaciones previamente danadas tras esfuerzo y en condiciones meteorol6gicas de frio. Las articulaciones de inter-falange proximal de los dedos coraz6n izquierdo y anular derecho, el codo derecho y las articulaciones intervertebrales toracicas medias han sido los mas afectados. Durante los ultimos 22 anos los sintomas han ido empeorando de forma progresiva, de manera que su capacidad de esfuerzo fisico se ha visto muy restringida y durante el invierno ha sido preciso el tratamiento frecuente y continuo con farmaco anti-inflamatorios no esteroidales. Estas con todas las manifestaciones tipicas de osteoartritis. En 2000, el descubrimiento de una disfunci6n renal condujo a una segunda diagnosis completamente separada de amiloidosis sistemica hereditaria provocada por la mutaci6n en el gen de la cadena-a de fibr6geno A. Este tipo de amiloidosis no afecta a la articulaciones y su patogenesis y manifestaciones clinicas no se encuentran relacionadas para nada con la osteoartritis.

El 9 de octubre de 2001 el paciente comenz6 el tratamiento experimental con acido (R)-1-[6-[(R)-2-carboxi-pirrolidin1-il]-6-oxo-hexanoil]-pirrolidin-2-carboxilico, 10 mg dos veces al dia mediante inyecci6n sub-cutanea. En enero de 2002, tras tres meses de este potente farmaco de eliminaci6n de SAP y con una reducci6n importante por encima de 95 % en la concentraci6n de SAP en plasma, el paciente apreci6 en primer lugar que sus sintomas de artritis fueron menos problematicos que anteriormente. Esta mejora se mantuvo y aument6 de manera que en abril de 2002, otono en Nueva Zelanda, fue admirablemente mas alla de la duda. Durante ese invierno, por primera vez en muchos anos, el paciente no precis6 tratamiento necesario con farmacos anti-inflamatorios no esteroidales, a pesar de una mayor actividad fisica. El paciente continu6 el tratamiento con acido (R)-1-[6-[(R)-2-carboxi-pirrolidin-1-il]-6-oxohexanoil]piridin-2-carboxilico hasta la actualidad (junio de 2003) y todos sus sintomas de osteoartritis han continuado, de manera notable, en remisi6n. Durante los ultimos meses, el paciente ha estado practicando ejercicio fisico de forma regular en tierra, haciendo trabajos de arquitectura paisajistica y cercado, incluyendo el levantamiento y acarreo de pesos importantes, sin padecer ningun dolor o hinchamiento de los que previamente le afectaban incluso sin el esfuerzo de la actividad fisica inusual.

2) CD, trabajadora de servicio de Gales de 49 anos de edad, presentaba un historial de 6-8 anos de dolor y disfunci6n en varias articulaciones. Presentaba dolor en los hombros, en particular en la zona superior o detras de la cabeza, haciendo que el secado de pelo o determinadas tarea domesticas resultara dolorosas y complicadas. La mayoria de los dias se veia afectada por dolor de espalda en la zona toracica media y dolores de tobillo bilaterales, normalmente provocados por estancias prolongadas de pie. Tambien presentaba dolor en la muneca derecha al realizar determinados movimientos, en particular la apertura de tarros, una maniobra que le resultaba muy complicada. Estos sintomas tambien son compatibles con la osteoartritis.

CD presentaba amiloidosis sistemica hereditaria provocada por la mutaci6n en el gen de la apolipoproteina AI, diagnosticada en octubre de 2001 durante la investigaci6n de una disfunci6n renal. Esto tipo de amiloidosis no afecta a las articulaciones o provoca sintomas artriticos. Ella comenz6 el tratamiento contra la amiloidosis el 22 de octubre de 2001 con acido (R)-1-[6-[(R)-2-carboxi-pirrolidin-1-il]-6-oxo-hexanoil]-pirrolidin-2-carboxilico, 15 mg dos veces al dia mediante inyecci6n sub-cutanea. En diciembre de 2001, tras dos meses con este potente farmaco de eliminaci6n de SAP y con una reducci6n importante por encima de 95 % en la concentraci6n de SAP en plasma, ella apreci6 que los sintomas de articulaciones fueron menos problematicos que anteriormente. Esta mejora se mantuvo y aument6 de manera que en enero de 2002 la paciente se encontraba libre de dolor y presentaba una funci6n normal en sus articulaciones. El tratamiento con acido (R)-1-[6-[(R)-2-carboxi-pirrolidin-1-il]-6-oxo-hexanoil]-pirrolidin-2-carboxilico concluy6 el 22 de octubre y su remisi6n notable ha continuado hasta la actualidad (junio de 2003).

Referencias

Claims

REIVINDICACIONES

1.-El uso de D-prolina de f6rmula:

en la que R es

o

y el grupo

R1 es hidr6geno o hal6geno;

X-Y-X' es un enlazador que tiene al menos 4, de manera ventajosa al menos 5, de manera ventajosa al menos 6, hasta 20 atomos de carbono de cadena lineal o sencilla, en la que

10 X es -(CH2)n-; -CH(R2)(CH2)n-; CH2O(CH2)n-; CH2NH-; bencilo; -C(R2)=CH-; -CH2-CH(OH)- o tiazol-2,5diilo;

Y es -S-S-;-(CH2)n-; -O-; -NH-; -N(R2)-;-CH=CH-; -NHC(O)NH-;-N(R2)C(O)N(R2)-; -N[CH2C6H3(OCH3)2]; -N(CH2C6H5)-; N(CH2C6H5)C(O)N(CH2C6H5)-; -N(alcoxialquilo)-; N(cicloalquil-metilo)-; 2,6-piridilo; 2,5furanilo; 2,5-tienilo; 1,2-ciclohexilo; 1,3-ciclohexilo; 1,4-ciclohexilo;1,2-naftilo; 1,4-naftilo; 1,5-naftilo; 1,6

15 naftilo; bifenileno 6 1,2-fenileno, 1,3-fenileno y 1,4-fenileno, en el que los grupos fenileno se encuentran sustituidos de manera opcional por 1-4 sustituyentes, escogidos entre hal6geno, alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxilo, carboxi, -COO-alquilo inferior, nitrilo, 5-tetrazol (acido 2-carboxilico pirrolidin-1-il)-2oxo-etoxi, N-hidroxicarbamimiodilo, 5-oxo[1,2-oxadiazolilo, 2-oxo[1,2,3,5]oxotiadiazolilo, 5tioxo[1,2,4]oxadiazolilo y 5-terc-butilsulfanil-[1,2,4]oxadiazolilo;

20 X' es -(CH2)n-; -(CH2)n-CH(R2)-; -(CH2)nOCH2-, -NHCH2-; bencilo; -CH=C(R2)-; CH(OH)CH2; o tiazol-2,5-diilo;

R2 es alquilo inferior, alcoxi inferior o bencilo y

n es 0-3.

o una de sus sales aceptables farmaceuticamente o de sus mono-o o diesteres que son capaces de inhibir la uni6n

del ligando SAP o la disminuci6n de SAP en el plasma de una persona, para la preparaci6n de un medicamento para 25 el tratamiento o la prevenci6n de osteoartritis en la persona.
2. Una D-prolina de f6rmula:

en la que R es

y el grupo

5 R1 es hidr6geno o hal6geno;

X-Y-X' es un enlazador que tiene al menos 4, de manera ventajosa al menos 5, de manera ventajosa al menos 6, hasta 20 atomos de carbono de cadena lineal o sencilla,en la que

X es -(CH2)n-; -CH(R2)(CH2)n-; CH2O(CH2)n-; CH2NH-; bencilo; -C(R2)=CH-; -CH2-CH(OH)- o tiazol-2,5diilo;

10 Y es -S-S-;-(CH2)n-; -O-; -NH-; -N(R2)-;-CH=CH-; -NHC(O)NH-;-N(R2)C(O)N(R2)-; -N[CH2C6H3(OCH3)2]; -N(CH2C6H5)-; N(CH2C6H5)C(O)N(CH2C6H5)-; -N(alcoxialquilo)-; N(cicloalquil-metilo)-; 2,6-piridilo; 2,5furanilo; 2,5-tienilo; 1,2-ciclohexilo; 1,3-ciclohexilo; 1,4-ciclohexilo;1,2-naftilo; 1,4-naftilo; 1,5-naftilo; 1,6naftilo; bifenileno 6 1,2-fenileno, 1,3-fenileno y 1,4-fenileno, en el que los grupos fenileno se encuentran sustituidos de manera opcional por 1-4 sustituyentes, escogidos entre hal6geno, alquilo inferior, alcoxi

15 inferior, hidroxilo, carboxi, -COO-alquilo inferior, nitrilo, 5-tetrazol (acido 2-carboxilico pirrolidin-1-il)-2oxo-etoxi, N-hidroxicarbamimiodilo, 5-oxo[1,2-oxadiazolilo, 2-oxo[1,2,3,5]oxotiadiazolilo, 5tioxo[1,2,4]oxadiazolilo y 5-terc-butilsulfanil-[1,2,4]oxadiazolilo;

X' es -(CH2)n-; -(CH2)n-CH(R2)-; -(CH2)nOCH2-, -NHCH2-; bencilo; -CH=C(R2)-; CH(OH)CH2; o tiazol-2,5-diilo;

R2 es alquilo inferior, alcoxi inferior o bencilo y

20 n es 0-3.

o una de sus sales aceptables farmaceuticamente o uno de sus mono-o diesteres que son capaces de inhibir la uni6n del ligando SAP o la disminuci6n de SAP en el plasma de una persona, para su uso en el tratamiento o la prevenci6n de osteoartritis en la persona.
3. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, o una D-prolina de acuerdo con la reivindicaci6n 2, en el que la D25 prolina es acido (R)-1-[6-[(R)-2-carboxi-pirrolidin-1-il]-6-oxo-hexanoil]pirrolidin-2-carboxilico.

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