ES2692408T3 - Evaluación y tratamiento de trastornos mediados por bradiquinina - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para identificar a un sujeto en riesgo de padecer o que padece un trastorno mediado por calicreína plasmática (pKal), comprendiendo el procedimiento: medir un nivel de quininógeno de alto peso molecular (HMWK) escindido, y opcionalmente un nivel de HMWK intacto en una muestra de un sujeto; determinar un valor del HMWK escindido; y establecer que el sujeto está en riesgo de padecer o padece un trastorno mediado por pKal si el valor del HMWK escindido es superior a un valor de referencia, en el que el valor de referencia se refiere al valor de HMWK escindido en un sujeto sano; y en el que el trastorno mediado por pKal es angioedema hereditario (HAE), artritis reumatoide, colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.

Description

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DESCRIPCION
Evaluacion y tratamiento de trastornos mediados por bradiquinina REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES DE PATENTE RELACIONADAS ANTECEDENTES
La calicreina plasmatica (pKal) es la principal enzima generadora de bradiquinina en la circulacion. La activacion de pKal se produce por medio del sistema de contacto que se ha vinculado a la patologia de la enfermedad asociada con angioedema hereditario (HAE). La bradiquinina es un mediador clave del dolor, de la inflamacion, del edema y de la angiogenesis.
Los quininogenos son precursores de quinina, tales como la bradiquinina y la calicreina. Existen dos tipos de quininogenos humanos, quininogeno de alto peso molecular (HMWK) y quininogeno de bajo peso molecular (LMWK), que son variantes de corte y empalme. El HMWK actua principalmente como cofactor en la coagulacion y la inflamacion y es el sustrato preferido para la generacion de bradiquinina mediada por pKal. Tanto los HMWK como los LMWK son inhibidores de la cisteina proteasa.
Phipps et al. (Hypertension. 2009 Feb; 53(2):175-81) afirman que la calicreina plasmatica media la permeabilidad vascular retinal estimulada por el receptor de angiotensina II de tipo 1. Zhang et al. (FASEB J. 2000 Dec; 14(15):2589-600) explican que la porcion de cadena pesada de HMWK escindido esta tambien presente en LMWK.
SUMARIO DE LA INVENCION
La invencion proporciona un procedimiento para identificar a un sujeto en riesgo de padecer o que padece un trastorno mediado por calicreina plasmatica (pKal), comprendiendo el procedimiento:
medir un nivel de un quininogeno de alto peso molecular (HMWK) escindido y, opcionalmente, un nivel de un HMWK intacto en una muestra de un sujeto;
determinar un valor del HMWK escindido; y
establecer que el sujeto esta en riesgo de padecer o que padece un trastorno mediado por pKal si el valor del HMWK escindido es superior a un valor de referencia,
en el que el valor de referencia se refiere al valor de HMWK escindido en un sujeto sano;
y en el que el trastorno mediado por pKal es angioedema hereditario (HAE), artritis reumatoide, colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
La invencion tambien proporciona un procedimiento para evaluar un tratamiento de un trastorno mediado por pKal en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:
medir niveles de un HMWK escindido y opcionalmente niveles de un HMWK intacto en muestras recogidas de un sujeto antes y despues del tratamiento o durante el transcurso del tratamiento;
determinar un valor de HMWK escindido en cada muestra basandose en los niveles de HMWK escindido y, opcionalmente, intacto en la misma muestra y
evaluar la eficacia del tratamiento basandose en los cambios en los valores de HMWK escindido en las muestras antes y despues del tratamiento o a lo largo del transcurso del tratamiento,
en el que el trastorno mediado por pKal es angioedema hereditario (HAE), artritis reumatoide, colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
La invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica para su utilizacion en el tratamiento de una enfermedad mediada por pKal en un sujeto, comprendiendo la composicion un inhibidor de pKal y un vehiculo farmaceuticamente aceptable, en la que el sujeto tiene un valor de quininogeno de alto peso molecular (HMWK) escindido que es superior a un valor de referencia, que se refiere al valor de HMWK escindido en un sujeto sano; y en la que la enfermedad mediada por pKal es angioedema hereditario (HAE), artritis reumatoide, colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
La calicreina plasmatica (pKal) es un componente de tipo serina proteasa del sistema de contacto y es la principal enzima generadora de bradiquinina en la circulacion. El sistema de contacto se activa o bien mediante el factor XI la despues de exposicion a superficies extranas o cargadas negativamente o bien en superficies celulares endoteliales
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mediante prolilcarboxipeptidasas (Sainz I.M. et al., Thromb Haemost 98, 77-83, 2007). La activacion de la calicreina plasmatica amplifica la coagulacion intrinseca por medio de su activacion por retroalimentacion del factor XII y fomenta la inflamacion por medio de la produccion del nonapeptido proinflamatorio bradiquinina. Como la principal quininogenasa en circulacion, la pKal es ampliamente responsable de la generacion de bradiquinina en la vasculatura. Una deficiencia genetica en la proteina inhibidora C1 (C1-INH), el principal inhibidor natural de la calicreina plasmatica, desemboca en un angioedema hereditario (HAE). Los pacientes con HAE padecen ataques agudos de edema doloroso frecuentemente precipitados por desencadenantes desconocidos (Zuraw B.L. et al., N Engl J Med 359, 1027-1036, 2008). Mediante el uso de agentes farmacologicos o de estudios geneticos en modelos animales, el sistema calicreina-quinina plasmatico (KKS plasmatico) ha sido involucrado en diversas enfermedades.
Como se describe en el presente documento, se desarrollo un ensayo de inmunotransferencia Western para la deteccion de quininogeno de alto peso molecular (HMWK) intacto (monocatenario) y escindido (bicatenario), utilizando un reactivo de deteccion (por ejemplo, un anticuerpo) que se une especificamente (por ejemplo, preferentemente) o bien al quininogeno intacto o bien al quininogeno escindido, y opcionalmente, no se une a LMWK. Dicho reactivo de deteccion puede utilizarse para supervisar cantidades relativas de HMWK monocatenario y bicatenario en el plasma de pacientes. Aplicando este procedimiento se encontro que el nivel (por ejemplo, el porcentaje) de quininogeno escindido en una muestra del paciente se incrementa en estados de enfermedad que se sabe que estan mediados por un exceso de activacion de pKal, tales como ataques de HAE edematosos. El porcentaje de quininogeno escindido en el plasma de pacientes con otras enfermedades puede analizarse subsiguientemente para determinar si el pKal activo esta asociado con la enfermedad. Otras enfermedades que se han estudiado y que se ha mostrado que presentan aumentos de quininogeno, con respecto al plasma sano, incluyen artritis reumatoide (RA), colitis ulcerosa (UC) y enfermedad de Crohn.
En consecuencia, un aspecto de la presente divulgacion se refiere a un procedimiento para identificar a un sujeto en riesgo de padecer o que padece un trastorno mediado por pKal, comprendiendo el procedimiento: (a) medir un nivel de un quininogeno (por ejemplo, HMWK) escindido y un nivel de un quininogeno (por ejemplo, HMWK) intacto en una muestra de un sujeto (por ejemplo, una muestra de sangre o una muestra de plasma) mediante, por ejemplo, un ensayo de inmunotransferencia Western; (b) determinar un valor (por ejemplo, un porcentaje) del quininogeno escindido, un valor del quininogeno intacto (por ejemplo, un porcentaje), o ambos, en la muestra y (c) establecer que el sujeto esta en riesgo de padecer o padece un trastorno mediado por pKal si el valor del quininogeno escindido, el valor del quininogeno intacto, o ambos, se desvian de un valor de referencia. En algunos ejemplos, se determina el porcentaje de quininogeno escindido y se establece que el sujeto esta en riesgo de padecer o padece la enfermedad diana si el porcentaje de quininogeno escindido en la muestra es igual o superior a un valor de referencia.
En algunas formas de realizacion, los niveles del quininogeno escindido y del quininogeno intacto se miden mediante un agente de deteccion (por ejemplo, un anticuerpo) que se une especificamente (por ejemplo, preferentemente) o bien al quininogeno escindido o bien al intacto. Dicho agente de deteccion (por ejemplo, un anticuerpo) puede unirse tanto al quininogeno intacto como al escindido, pero no se une a LMWK. En otras formas de realizacion, los niveles del quininogeno escindido y del quininogeno intacto se miden mediante un agente de deteccion (por ejemplo, un anticuerpo) que se une especificamente a quininogeno escindido en comparacion con quininogeno intacto, o se une especificamente a quininogeno intacto en comparacion con quininogeno escindido. En un ejemplo, el reactivo de deteccion es un anticuerpo que se une especificamente a quininogeno escindido en comparacion con quininogeno intacto. En otro ejemplo, el agente de deteccion es un anticuerpo que se une al extremo C-terminal de la cadena ligera del quininogeno escindido, que no esta presente en LMWK.
El trastorno mediado por pKal puede ser angioedema hereditario (HAE), artritis reumatoide, colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn. Si se establece que el sujeto esta en riesgo de padecer o padece un trastorno mediado por pKal, el procedimiento tal como se describe en el presente documento puede comprender adicionalmente administrar una cantidad eficaz de un inhibidor de pKal al sujeto. En algunos ejemplos, el inhibidor de pKal es DX- 88, EPIKAL-2 o DX-2930.
En algunas formas de realizacion, la muestra es de un sujeto que presenta un sintoma de un trastorno mediado por pKal, incluidos, pero sin limitacion, edema, ataques recurrentes de inflamacion, inflamacion, siendo dicha inflamacion completamente o predominantemente periferica, urticaria, enrojecimiento, dolor e inflamacion en ausencia de evidencias de infeccion; o edema no mediado por histamina. En otras formas de realizacion, la muestra es de un sujeto que no presenta sintomas de un trastorno mediado por pKal en el momento de recoger la muestra, no tiene antecedentes de un sintoma de un trastorno mediado por pKal o no tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal. Como alternativa o adicionalmente, el sujeto es resistente a un tratamiento antihistaminico, un tratamiento con corticosteroides, o a ambos.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un procedimiento para determinar si un trastorno es susceptible de tratamiento con un inhibidor de pKal, comprendiendo el procedimiento: (a) medir un nivel de un quininogeno (por ejemplo, HMWK) escindido y un nivel de un quininogeno (por ejemplo, HMWK) intacto en una muestra de un sujeto (por ejemplo, una muestra de sangre o una muestra de plasma) que padece el trastorno; (b) determinar un valor (por ejemplo, un porcentaje) del quininogeno escindido, un valor (por ejemplo, un porcentaje) del quininogeno intacto, o ambos, en la muestra y (c) establecer que el trastorno es susceptible de tratamiento con un inhibidor de pKal si el
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En algunas formas de realizacion, los niveles del quininogeno escindido y del quininogeno intacto se miden mediante un agente de deteccion (por ejemplo, un anticuerpo) que se une especificamente a quininogeno escindido en comparacion con quininogeno intacto, o se une especificamente a quininogeno intacto en comparacion con quininogeno escindido. En algunos ejemplos, el reactivo de deteccion es un anticuerpo que se une especificamente a quininogeno escindido en comparacion con quininogeno intacto. En otros ejemplos, el reactivo de deteccion es un anticuerpo que se une al extremo C-terminal de la cadena ligera de quininogeno escindido. En cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, los niveles del quininogeno intacto y del quininogeno escindido pueden medirse mediante ensayo de inmunotransferencia Western.
Si se constata que el trastorno es susceptible de tratamiento con un inhibidor de pKal, el procedimiento puede comprender adicionalmente administrar al sujeto una cantidad eficaz de un inhibidor de pKal, que incluye, pero sin limitacion, DX-88, EPIKAL-2 o DX-2930.
En otro aspecto mas, la presente invencion tambien proporciona un procedimiento para evaluar un tratamiento de un trastorno mediado por pKal en un sujeto, comprendiendo el procedimiento: (a) medir niveles de un quininogeno (por ejemplo, HMWK) escindido y niveles de un quininogeno (por ejemplo, HMWK) intacto en muestras (por ejemplo, muestras de sangre o muestras de plasma) recogidas del sujeto antes y despues del tratamiento o durante el transcurso del tratamiento; (b) determinar un valor (por ejemplo, un porcentaje) de quininogeno escindido, un valor (por ejemplo, un porcentaje) de quininogeno intacto, o ambos, en cada muestra basandose en los niveles de quininogeno escindido e intacto en la misma muestra y (c) evaluar la eficacia del tratamiento basandose en los cambios en el valor de quininogeno escindido y/o intacto antes y despues del tratamiento o a lo largo del transcurso del tratamiento. Por ejemplo, una reduccion del porcentaje de quininogeno escindido despues del tratamiento o a lo largo del transcurso del tratamiento indica que el tratamiento es eficaz sobre el sujeto. En algunas formas de realizacion, el tratamiento comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un inhibidor de pKal, por ejemplo DX-88, EPIKAL-2 o DX-2930.
En cualquiera de los procedimientos de evaluacion descritos en el presente documento, los niveles del quininogeno escindido y del quininogeno intacto pueden medirse por medio de un agente de deteccion (por ejemplo, un anticuerpo) que se une especificamente a quininogeno escindido en comparacion con quininogeno intacto, o se une especificamente a quininogeno intacto en comparacion con quininogeno escindido. En algunos ejemplos, el reactivo de deteccion es un anticuerpo que se une especificamente a quininogeno escindido en comparacion con quininogeno intacto. En otros ejemplos, el agente de deteccion es un anticuerpo que se une al extremo C-terminal de la cadena ligera de quininogeno escindido. En cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, los niveles del quininogeno intacto y del quininogeno escindido pueden medirse mediante ensayo de inmunotransferencia Western.
En algunas formas de realizacion, el trastorno mediado por pKal es angioedema hereditario (HAE), artritis reumatoide, colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
Ademas, la presente divulgacion proporciona un procedimiento para determinar un valor de quininogeno escindido, un valor de quininogeno intacto, o ambos, en una muestra, que comprende (a) poner en contacto una muestra (por ejemplo, una muestra de sangre o una muestra de plasma) que contiene quininogeno intacto y escindido con un reactivo de deteccion en condiciones que permitan la interaccion entre el agente de deteccion y el quininogeno intacto y escindido, en el que el agente de deteccion se une especificamente a quininogeno escindido en comparacion con quininogeno intacto, o se une especificamente a quininogeno intacto en comparacion con quininogeno escindido; (b) medir el nivel de quininogeno escindido y/o quininogeno intacto en la muestra basandose en su interaccion con el reactivo de deteccion y (c) determinar un valor (por ejemplo, un porcentaje) del quininogeno escindido, un valor (por ejemplo, un porcentaje) del quininogeno intacto, o ambos, en la muestra basandose en los niveles del quininogeno escindido y del quininogeno intacto. En algunas formas de realizacion, el reactivo de deteccion es un anticuerpo, tal como un anticuerpo que se une especificamente a quininogeno escindido en comparacion con quininogeno intacto, o un anticuerpo que se une al extremo C-terminal de la cadena ligera de quininogeno escindido. En algunas formas de realizacion, las cantidades del quininogeno intacto y del quininogeno escindido se miden mediante ensayo de inmunotransferencia Western.
Tambien dentro del alcance de la presente divulgacion se encuentran (i) un procedimiento para tratar una enfermedad mediada por pKal, que comprende administrar a un sujeto con necesidad de ello una cantidad eficaz de un inhibidor de pKal tal como se describe en el presente documento, en el que el sujeto tiene un valor (por ejemplo, un porcentaje) de quininogeno escindido, un valor (por ejemplo, un porcentaje) de quininogeno intacto, o ambos, que se desvia del valor de referencia, (ii) una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por pKal en un sujeto, comprendiendo la composicion un inhibidor de pKal y un vehiculo farmaceuticamente aceptable y en la que el sujeto presenta un valor desviado de quininogeno escindido y/o quininogeno intacto, en comparacion con un valor de referencia, y (iii) el uso de la composicion farmaceutica para la
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Las formas de realizacion siguientes tambien se encuentran dentro del alcance de la presente divulgacion:
En el presente documento se proporcionan procedimientos para evaluar un sujeto, por ejemplo un sujeto en riesgo de padecer o que padece un trastorno mediado por pKal o mediado por bradiquinina. Los procedimientos proporcionados permiten el analisis de pacientes con angioedema mediado por calicreina plasmatica (KMA), u otras enfermedades mediadas por pKal utiles en la evaluacion y el tratamiento.
Las formas de realizacion de la presente divulgacion proporcionan un biomarcador y el uso del mismo en la identificacion y el tratamiento de pacientes, por ejemplo de pacientes que padecen un edema provocado por bradiquinina que se ha generado por medio de calicreina plasmatica. Los procedimientos, las composiciones y los dispositivos divulgados por el presente documento son utiles de una serie de maneras. Por ejemplo, los niveles de un marcador pKal pueden usarse para identificar trastornos asociados con una activacion del sistema de contacto elevada. El cribado inicial puede venir seguido de un analisis in vitro o in vivo con inhibidores de calicreina plasmatica (por ejemplo DX-88, EPIKAL2 o DX-2930), por ejemplo en modelos preclinicos de enfermedad. Tambien puede usarse un marcador divulgado en el presente documento como biomarcador farmacodinamico o para supervisar de otra forma la respuesta de un sujeto a un inhibidor de calicreina. Un marcador divulgado en el presente documento puede utilizarse en un diagnostico complementario para permitir el tratamiento de enfermedades mediadas por calicreina plasmatica, controlar la dosificacion durante el tratamiento preventivo de un trastorno mediado por pKal o mediado por bradiquinina, por ejemplo, HAE, angioedema idiopatico no dependiente de histamina, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, lupus, enfermedad de Alzheimer, choque septico, lesion por quemadura, lesion por isquemia/reperfusion cerebral, edema cerebral, retinopatia diabetica, nefropatia diabetica, edema macular, vasculitis, trombosis arterial o venosa, trombosis asociada con dispositivos de asistencia ventricular o endoprotesis vasculares, trombocitopenia inducida por heparina con trombosis, enfermedad tromboembolica y enfermedad cardiaca coronaria con angina de pecho inestable, edema, enfermedad ocular, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropatico, dolor inflamatorio, estenosis espinal-enfermedad espinal degenerativa, ileo postoperatorio, aneurisma aortico, osteoartritis, angioedema hereditario, embolismo pulmonar, apoplejia, traumatismo craneal o edema cerebral peritumoral, sepsis, evento isquemico de la arteria cerebral media (MCA) agudo (apoplejia), reestenosis (por ejemplo, despues de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistemico, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad neurologica, una enfermedad asociada con un plegamiento proteico incorrecto, una enfermedad asociada con angiogenesis, nefropatia hipertensiva y nefropatia diabetica, enfermedades alergicas y respiratorias (por ejemplo, anafilaxia, asma, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, sindrome de dificultad respiratoria aguda, fibrosis quistica, rinitis persistente) y lesiones histicas (por ejemplo, lesion por quemadura o por producto quimico).
La presente divulgacion proporciona un procedimiento de evaluacion o de tratamiento de un sujeto, en el que, por ejemplo, se distingue un trastorno mediado por pKal, por ejemplo angioedema mediado por bradiquinina, a partir de un trastorno mediado por histamina, o se predice un ataque futuro de un trastorno mediado por pKal, que comprende adquirir, por ejemplo determinar, el nivel de uno o mas marcadores correlacionados con la activacion de pKal (un marcador pKal), divulgado en el presente documento, por ejemplo, quininogeno intacto, y quininogeno escindido, evaluando o tratando, de esta forma, a dicho sujeto. En algunas formas de realizacion, el procedimiento comprende adquirir, por ejemplo detectar, el nivel de uno o mas marcadores correlacionados con una respuesta inflamatoria mediada por histamina (un marcador H), por ejemplo, triptasa.
En algunas formas de realizacion, dicho trastorno mediado por pKal es HAE (angioedema hereditario), IAE (encefalopatia asociada a la gripe), IBD (enfermedad inflamatoria intestinal) o IBS (sindrome del intestino irritable). En algunas formas de realizacion, dicho trastorno mediado por pKal se selecciona de entre angioedema idiopatico no dependiente de histamina, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, lupus, enfermedad de Alzheimer, choque septico, lesion por quemadura, lesion por isquemia/reperfusion cerebral, edema cerebral, retinopatia diabetica, nefropatia diabetica, edema macular, vasculitis, trombosis arterial o venosa, trombosis asociada con dispositivos de asistencia ventricular o endoprotesis vasculares, trombocitopenia inducida por heparina con trombosis, enfermedad tromboembolica y enfermedad cardiaca coronaria con angina de pecho inestable, edema, enfermedad ocular, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropatico, dolor inflamatorio, estenosis espinal-enfermedad espinal degenerativa, ileo postoperatorio, aneurisma aortico, osteoartritis, angioedema hereditario, embolismo pulmonar, apoplejia, traumatismo craneal o edema cerebral peritumoral, sepsis, evento isquemico de la arteria cerebral media (MCA) agudo (apoplejia), reestenosis (por ejemplo, despues de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistemico, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad neurologica, una enfermedad asociada con un plegamiento proteico incorrecto, una enfermedad asociada con angiogenesis, nefropatia hipertensiva y nefropatia diabetica, enfermedades alergicas y respiratorias (por ejemplo, anafilaxia, asma, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, sindrome de dificultad respiratoria aguda, fibrosis quistica, rinitis persistente) y lesiones histicas (por ejemplo, lesion por quemadura o por producto quimico).
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La presente divulgacion tambien proporciona un procedimiento de evaluacion o de tratamiento de un sujeto, presentando dicho sujeto un sintoma consecuente con un trastorno mediado por pKal, por ejemplo, angioedema mediado por bradiquinina, y un trastorno relacionado con histamina, que comprende a) opcionalmente, determinar que dicho sujeto tiene un sintoma, por ejemplo edema o malestar abdominal, consecuente con uno de entre un trastorno mediado por pKal o un trastorno relacionado con histamina, o con ambos; b) si dicho sujeto no se ha tratado con un tratamiento antihistaminico para dicho sintoma, tratar entonces dicho sujeto con un tratamiento antihistaminico; c) adquirir, por ejemplo detectar, el nivel de uno o mas marcadores correlacionados con la activacion de pKal (un marcador pKal), por ejemplo, quininogeno intacto y quininogeno escindido; d) si dicho nivel cumple un determinado criterio, por ejemplo, si es igual o superior a un nivel de referencia: seleccionar al sujeto para el tratamiento inhibidor de la calicreina; o administrar un inhibidor de calicreina a dicho sujeto, evaluando o tratando, de esta forma, a dicho sujeto. En algunas formas de realizacion, el procedimiento comprende seleccionar al sujeto para el tratamiento inhibidor de calicreina. En determinadas formas de realizacion, el procedimiento comprende administrar un inhibidor de calicreina a dicho sujeto. En formas de realizacion particulares, la seleccion de sujetos para el tratamiento inhibidor de calicreina; o la administracion de un inhibidor de calicreina a dicho sujeto, tiene lugar antes de determinar que el sujeto no responde a dicho tratamiento antihistaminico, por ejemplo tiene lugar dentro de un periodo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 horas de dicho tratamiento con un tratamiento antihistaminico. En algunas formas de realizacion, la determinacion de que dicho sujeto tiene un sintoma consecuente con un trastorno mediado por pKal y un trastorno relacionado con histamina y la adquisicion de una muestra de dicho paciente para determinar el nivel de un marcador pKal tiene lugar: dentro de un periodo de 30 minutos, 1, 2 o 3 horas una de otra, o en la misma visita a un centro de salud.
En algunas formas de realizacion, dicho inhibidor de pKal se selecciona de entre DX-88, DX-2930 o EpiKal-2.
En algunas formas de realizacion, el procedimiento comprende adquirir, por ejemplo, determinar, el nivel de uno o mas marcadores correlacionados con una respuesta inflamatoria mediada por histamina (un marcador H). En determinadas formas de realizacion, dicho sujeto se evalua para determinar su susceptibilidad a un trastorno mediado por pKal. En determinadas formas de realizacion, dicho sujeto presenta un sintoma de, por ejemplo consecuente con, un trastorno mediado por pKal, por ejemplo edema, por ejemplo HAE. En determinadas formas de realizacion, dicho sujeto presenta un sintoma de un trastorno caracterizado por la activacion no deseada de pKal y a dicho sujeto se le ha administrado un tratamiento antihistaminico. En formas de realizacion particulares, dicho tratamiento antihistaminico se administra dentro de un periodo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 8 o 10 horas antes o despues de una etapa de determinacion tal como se divulga en el presente documento. En formas de realizacion particulares, el procedimiento comprende ademas administrar un tratamiento antihistaminico a dicho sujeto, por ejemplo antes, despues o durante la evaluacion o las determinaciones tal como se divulgan en el presente documento.
En algunas formas de realizacion, en respuesta a dicha determinacion o evaluacion, se administra un inhibidor de calicreina a dicho sujeto. En determinadas formas de realizacion, dicho sujeto tiene uno o mas o todos los sintomas o propiedades siguientes: ataques recurrentes de inflamacion; inflamacion, siendo dicha inflamacion completamente o predominantemente periferica, por ejemplo, el sujeto no padece inflamacion abdominal o de las vias respiratorias significativa; urticaria; enrojecimiento, dolor e inflamacion en ausencia de evidencias de infeccion; no responde al tratamiento antihistaminico o con corticosteroides, o padece un edema no mediado por histamina. En determinadas formas de realizacion, dicho sujeto padece edema persistente o recurrente y no responde a uno de entre tratamiento antihistaminico y tratamiento con esteroides, o ambos. En determinadas formas de realizacion, el sujeto no tiene antecedentes de trastorno mediado por pKal, por ejemplo, HAE, IAE, IBD o IBS; el sujeto tiene antecedentes de trastorno mediado por pKal, por ejemplo, HAE, IAE, IBD o IBS, el sujeto no tiene antecedentes de HAE; el sujeto tiene antecedentes de HAE; el sujeto no tiene antecedentes de IAE; el sujeto tiene antecedentes de IAE; el sujeto no tiene antecedentes de IBD o IBS; el sujeto tiene antecedentes de IBD o IBS; el sujeto no tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo, una alergia alimentaria; el sujeto tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo, una alergia alimentaria; el sujeto no tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo, HAE, IAE, IBD o IBS y no tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo, una alergia alimentaria; o el sujeto no tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo, HAE, IAE, IBD o IBS y tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo, una alergia alimentaria: el sujeto tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo, HAE, iAe, IBD o IBS y no tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo, una alergia alimentaria; o el sujeto tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo, hAe, IAE, IBD o IBS y tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo, una alergia alimentaria.
En algunas formas de realizacion, el sujeto se ha tratado con un inhibidor de calicreina, por ejemplo, en tratamiento preventivo, por ejemplo, contra HAE, y la respuesta del sujeto al inhibidor de calicreina se evalua o se supervisa, y opcionalmente, en respuesta a dicha supervision, se selecciona o se administra un tratamiento, por ejemplo en respuesta a la determinacion se ajusta la dosificacion del inhibidor de calicreina. En algunas formas de realizacion, se realiza la determinacion de un marcador pKal en el contexto de un diagnostico complementario, y opcionalmente, se proporciona o se deniega la administracion de un producto terapeutico basandose en la determinacion. En determinadas formas de realizacion, la respuesta a dicho tratamiento consiste en identificar un ataque agudo inminente, por ejemplo, un ataque de HAE o de IEA. En formas de realizacion particulares, dicho sujeto se evalua para determinar su susceptibilidad a angioedema idiopatico. En formas de realizacion particulares, dicha evaluacion
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En algunas formas de realizacion, el sujeto no tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo HAE o IAE. En algunas formas de realizacion, el sujeto tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo HAE o IAE. En algunas formas de realizacion, el sujeto no tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo, HAE, IAE, IBD o IBS; el sujeto tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo, HAE, IAE, IBD o IBS, el sujeto no tiene antecedentes de HAE; el sujeto tiene antecedentes de HAE; el sujeto no tiene antecedentes de IAE; el sujeto tiene antecedentes de IAE; el sujeto no tiene antecedentes de IBD o IBS; el sujeto tiene antecedentes de IBD o IBS; el sujeto no tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo, una alergia alimentaria; el sujeto tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo, una alergia alimentaria; el sujeto no tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo, HAE, IAE, IBD o IBS y no tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo, una alergia alimentaria; o el sujeto no tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo, HAE, IAE, IBD o IBS y tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo, una alergia alimentaria: el sujeto tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo, hAe, IAE, IBD o IBS y no tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo, una alergia alimentaria; o el sujeto tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo, HAE, IAE, IBD o IBS y tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo, una alergia alimentaria.
En algunas formas de realizacion, se detecta un marcador pka, por ejemplo un marcador pKal divulgado en el presente documento, con un reactivo basado en anticuerpos. En determinadas formas de realizacion, un marcador pKal se detecta con un inmunoensayo de tipo sandwich. En determinadas formas de realizacion, el procedimiento comprende adquirir, por ejemplo detectar, el nivel de quininogeno, por ejemplo un quininogeno intacto o un quininogeno escindido, o ambos, por ejemplo mediante un ensayo de separacion electroforetica, por ejemplo, un analisis de inmunotransferencia Western. En algunas formas de realizacion, se detecta un marcador pKal, por ejemplo, un quininogeno, en un ensayo que consiste en la separacion, por ejemplo la separacion electroforetica, por ejemplo por inmunotransferencia Western, del analito de otros productos.
En algunas formas de realizacion, un marcador pKal se detecta con un inmunoensayo de tipo sandwich y un segundo marcador pKal, por ejemplo, un quininogeno, se detecta en un ensayo que consiste en la separacion, por ejemplo la separacion electroforetica, por ejemplo por inmunotransferencia Western, del analito de otros productos. En determinadas formas de realizacion, la deteccion de un marcador pKal es cualitativa. En determinadas formas de realizacion, la deteccion de un marcador pKal es cuantitativa. En formas de realizacion particulares, se detecta cada uno de un nivel de quininogeno intacto y de quininogeno escindido.
En algunas formas de realizacion, el procedimiento comprende comparar el nivel de un marcador pKal, por ejemplo quininogeno intacto o quininogeno escindido, con un valor de referencia. En determinadas formas de realizacion, dicho valor de referencia es una funcion del nivel de dicho marcador pKal en un sujeto con HAE, por ejemplo en uno o mas sujetos con HAE. En determinadas formas de realizacion, dicho valor de referencia es una funcion del nivel de dicho marcador pKal en un sujeto con HAE durante un ataque, por ejemplo, en uno o mas sujetos con HAE durante un ataque. En determinadas formas de realizacion, dicho valor de referencia es una funcion del nivel de un marcador pKal en un sujeto con IAE, por ejemplo, en uno o mas sujetos con IAE. En determinadas formas de realizacion, dicho valor de referencia es una funcion del nivel de dicho marcador pKal en un sujeto con IAE durante un ataque agudo, por ejemplo, en uno o mas sujetos con IAE durante un ataque agudo. En determinadas formas de realizacion, dicho valor de referencia es una funcion del nivel de un marcador pKal en ausencia de HAE o IAE, por ejemplo, en uno o mas sujetos que no tienen antecedentes de HAE o IAE.
En formas de realizacion particulares, el procedimiento comprende, por ejemplo, en respuesta a una comparacion, clasificar el sujeto, por ejemplo clasificar el sujeto por riesgo de padecer un trastorno mediado por pKal, o administrar o denegar un tratamiento a dicho sujeto. En determinadas formas de realizacion, el procedimiento comprende, por ejemplo, en respuesta a una comparacion, seleccionar un tratamiento para dicho sujeto. En algunas formas de realizacion, el procedimiento comprende, por ejemplo, en respuesta a una comparacion, administracion o denegar un tratamiento a dicho sujeto, por ejemplo con un agente de union a calicreina; un antagonista del receptor de bradiquinina B2 o un agente de reemplazo de C1-INH. En formas de realizacion particulares, dicho tratamiento es la administracion de un inhibidor de pKal, por ejemplo un inhibidor de pKal seleccionado de entre DX-88; EpiKal-2 y DX-2930.
En algunas formas de realizacion, una muestra de dicho sujeto se pone en contacto con un sustrato que comprende un agente de captura para dos o mas marcadores, por ejemplo de: un marcador pKal o un marcador H, por ejemplo un anticuerpo anti-marcador H; opcionalmente, en el que por lo menos un agente de captura es un agente de captura para un marcador pKal.
En algunas formas de realizacion, el procedimiento comprende adquirir una muestra, por ejemplo una muestra de sangre o de plasma de dicho sujeto.
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En algunas formas de realizacion, un primer agente de captura (para un primer marcador) y un segundo agente de captura (para un segundo marcador) se disponen sobre un sustrato de forma que puede distinguirse una senal para la presencia del primer marcador de una senal para la presencia del segundo marcador. En determinadas formas de realizacion, dicho primer agente de captura (para un primer marcador) se ubica en la primera ubicacion o localizacion y dicho segundo agente de captura (para un segundo marcador) se ubica en una segunda ubicacion o localizacion. En formas de realizacion particulares, dicha primera ubicacion o localizacion y dicha segunda ubicacion o localizacion no se solapan en dicho sustrato. En determinadas formas de realizacion, dicho primer agente de captura es para un primer marcador pKal. En determinadas formas de realizacion, dicho primer agente de captura es para un primer marcador pKal y dicho segundo agente de captura es para un segundo marcador pKal. En determinadas formas de realizacion, dicho primer agente de captura es para un marcador pKal y dicho segundo agente de captura es para un marcador H.
En determinadas formas de realizacion, el procedimiento comprende poner en contacto un sustrato con, por ejemplo, un anticuerpo detectable, para determinar la presencia o la cantidad de un marcador pKal. En determinadas formas de realizacion, dichos anticuerpos se marcan con un resto que produce un producto coloreado, emite un foton, absorbe un foton, altera un sustrato o altera la conductividad del sustrato. En determinadas formas de realizacion, dichos anticuerpos se marcan con un resto que utiliza electroquimioluminiscencia. En determinadas formas de realizacion, dichos anticuerpos se marcan con resinium. En formas de realizacion particulares, dicho sustrato se proporciona en un dispositivo de Meso Scale Discovery. En formas de realizacion particulares, dicho sustrato se proporciona como un dispositivo de varilla de inmersion, adecuado para su uso con sangre o plasma o con ambos. En formas de realizacion particulares, dicho primer agente de captura y dicho segundo agente de captura se disponen en una camara comun o conectada mediante fluido, por ejemplo una camara, por ejemplo un pocillo o una depresion, en un dispositivo de varias camaras, por ejemplo una placa de multiples pocillos. En formas de realizacion particulares, dicho primer agente de captura y dicho segundo agente de captura estan impresos sobre un sustrato.
En algunas formas de realizacion, dicho agente de captura para un primer marcador pKal se encuentra en una primera ubicacion sobre dicho sustrato y dicho agente de captura para un segundo marcador pKal se encuentra en una segunda ubicacion sobre dicho sustrato, y dichas primera y segunda ubicaciones se disponen sobre dicho sustrato de forma que una senal para la presencia del primer marcador pKal puede distinguirse de una senal para un segundo marcador pKal. En determinadas formas de realizacion, dicho sustrato comprende un agente de captura para un tercer marcador en una tercera ubicacion, y la tercera ubicacion se dispone sobre dicho sustrato de forma que una senal para la presencia del tercer marcador puede distinguirse de una senal para dichos primer y segundo marcadores.
En algunas formas de realizacion, puede realizarse la determinacion del nivel de un marcador pKal en una muestra dentro de un periodo de 1, 2, 3, 4 o 5 horas de contacto del sustrato con dicha muestra. En algunas formas de realizacion, la determinacion del nivel de dos marcadores pKal en una muestra puede realizarse dentro de un periodo de 1, 2, 3, 4 o 5 horas de contacto del sustrato con dicha muestra. En algunas formas de realizacion, la determinacion del nivel de dos marcadores pKal se realiza en ensayos realizados simultaneamente, por ejemplo la incubacion u otros intervalos para los ensayos se solapan uno o con otro.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un sustrato que comprende agentes de captura para una pluralidad de marcadores pKal, por ejemplo tal como se describen en el presente documento.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un procedimiento para determinar si un trastorno es susceptible de tratamiento con un inhibidor de pKal que comprende: evaluar los niveles de uno o de una pluralidad de marcadores pKal, por ejemplo tal como se describen en el presente documento, en, por ejemplo, un sujeto que padece dicho trastorno, o un modelo animal para dicho trastorno, en comparacion con el nivel determinado con una referencia, en el que un nivel que cumple un criterio predeterminado, por ejemplo, si es igual o superior a un nivel de referencia, es indicativo de un trastorno susceptible de tratamiento con un inhibidor de pKal. En algunas formas de realizacion, el procedimiento comprende evaluar el efecto de un inhibidor de calicreina, in vitro o in vivo, o en un modelo animal de dicho trastorno.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un procedimiento para tratar un sujeto que padece un trastorno mediado por pKal, por ejemplo un trastorno mediado por bradiquinina, que comprende evaluar el nivel de un marcador pKal descrito en el presente documento, por ejemplo, mediante un procedimiento descrito en el presente documento, determinar, y en respuesta a dicha evaluacion, seleccionar un tratamiento, por ejemplo, seleccionar una de entre la cantidad de dosificacion o la frecuencia de dosificacion, o ambas, de un inhibidor de calicreina. En algunas formas de realizacion, el procedimiento comprende administrar un inhibidor de calicreina a dicho sujeto. En algunas formas de realizacion, se ha administrado a dicho paciente un inhibidor de calicreina antes de dicha evaluacion. En determinadas formas de realizacion, el procedimiento comprende administrar un inhibidor de calicreina en dicha dosificacion o frecuencia seleccionada.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un procedimiento para determinar si un trastorno es susceptible
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de tratamiento con un inhibidor de pKal que comprende: evaluar los niveles de uno o de una pluralidad de marcadores pKal, por ejemplo, tal como se describen en el presente documento, en, por ejemplo, un sujeto que padece dicho trastorno, o un modelo animal para dicho trastorno, en comparacion con el nivel determinado con una referencia, en el que un nivel que cumple un criterio predeterminado, por ejemplo, si es igual o superior a un nivel de referencia, es indicativo de un trastorno susceptible de tratamiento con un inhibidor de pKal. En algunas formas de realizacion, el procedimiento comprende evaluar el efecto de un inhibidor de calicreina, in vitro o in vivo, o en un modelo animal de dicho trastorno.
En otro aspecto la divulgacion presenta procedimientos y dispositivos para la recogida de una muestra, por ejemplo sangre, con una activacion de contacto minima. En una forma de realizacion, la divulgacion presenta un recipiente, que tiene dispuesto en el mismo un reactivo de captura descrito en el presente documento, por ejemplo un inhibidor de calicreina, por ejemplo un polipeptido que es similar en secuencia a DX-88, por ejemplo uno que difiere de DX-88 en no mas de 1,2 o 5 residuos de aminoacidos, EPIKAL-2. El recipiente se configura, por ejemplo, con una apertura, una abertura, un tabique, etc., de forma que permita la recogida de una muestra, por ejemplo sangre, de un sujeto y la union de un marcador relacionado con pKal en la muestra, por ejemplo pKal, con el reactivo de captura, en el mismo recipiente. Puede llevarse a cabo una medicion de las especies unidas, por ejemplo pKal, en el mismo recipiente o en formas de realizacion, el sustrato se retira del recipiente anterior para su medicion, por ejemplo, la medicion puede realizarse en otro o sobre otro dispositivo. En formas de realizacion, el volumen del recipiente es de 0,5-100, 0,5-50, 0,5-10, 1-100, 1-50, 1-25 ml. En una forma de realizacion, el reactivo de captura, por ejemplo, un reactivo de captura de pKal, se dispone en la superficie interior del recipiente. El reactivo de captura puede acoplarse a la superficie con un primer asociado de union especifico unido a la superficie y un segundo asociado de union especifico acoplado al reactivo de captura. Los ejemplos de asociados de union especifico son biotina y avidina. En una forma de realizacion, el reactivo de captura biotinilado, por ejemplo, un reactivo de captura de pKal, por ejemplo, un inhibidor de calicreina, por ejemplo, un polipeptido que es similar en secuencia a DX-88, por ejemplo uno que difiere de DX-88 en no mas de 1, 2 o 5 residuos de aminoacidos, por ejemplo, Epikal-2, se dispone sobre una superficie del recipiente que esta recubierta con avidina.
La presente divulgacion proporciona biomarcadores capaces de identificar pacientes con angioedema mediado por calicreina plasmatica (KMA), u otras enfermedades mediadas por pKal utiles en la evaluacion y el tratamiento.
Los pacientes que se mostro que presentaban activacion de pKal por medio de un biomarcador son candidatos para el tratamiento con un inhibidor de pKal, tal como DX-88, un inhibidor de proteina pequena de pKal aprobado para el tratamiento de ataques edematosos agudos asociados a HAE. Otros inhibidores de pKal incluyen DX-2930, que es un inhibidor de anticuerpo totalmente humano. En algunas formas de realizacion, los pacientes que se mostro que presentaban la activacion de pKal a traves de un biomarcador son candidatos para el tratamiento con un antagonista del receptor de bradiquinina B2, por ejemplo, incatibant (Firazyr®). En algunas formas de realizacion, los pacientes que se mostro que presentaban activacion de pKal a traves de un biomarcador son candidatos para el tratamiento con un agente de reemplazo de C1-INH, por ejemplo un concentrado de C1-INH nanofiltrado pasteurizado humano purificado (Berinert®).
Algunas formas de realizacion de la divulgacion proporcionan un biomarcador y el uso del mismo en la identificacion y el tratamiento de pacientes, por ejemplo de pacientes que padecen un edema provocado por bradiquinina que se ha generado mediante calicreina plasmatica. Los procedimientos, las composiciones y los dispositivos divulgados por el presente documento son utiles en una serie de maneras. Por ejemplo, los niveles de un marcador pKal pueden usarse para identificar trastornos asociados con una activacion del sistema de contacto elevada. El cribado inicial puede venir seguido de un analisis in vitro o in vivo con inhibidores de calicreina plasmatica (por ejemplo, DX- 88, EPIKAL-2 o DX-2930), por ejemplo en modelos preclinicos de enfermedad. Tambien puede usarse un marcador divulgado en el presente documento como biomarcador farmacodinamico o para supervisar de otra forma la respuesta de un sujeto a un inhibidor de calicreina. Un marcador divulgado en el presente documento puede usarse en un diagnostico complementario para permitir el tratamiento de enfermedades mediadas por calicreina plasmatica, gestionar la dosificacion durante el tratamiento preventivo de HAE o identificar un ataque de HAE agudo inminente.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
La figura 1 es una descripcion de elementos implicados en la activacion del sistema de contacto de calicreina plasmatica.
La figura 2 muestra la deteccion de quininogeno escindido mediante analisis por inmunotransferencia Western. Las muestras se analizaron usando SDS-PAGE (tris-acetato al 3-8 %) en condiciones reductoras, operacion seguida de transferencia a membrana PVDF e inmunotransferencia. Carril 1: quininogeno intacto 50 nM; Carril 2: quininogeno escindido 50 nM; Carril 3: quininogeno de bajo peso molecular 50 nM; Carril 4: 1:20 Plasma humano con citrato de sodio (tubo de recogida de vidrio); Carril 5: 1:20 Plasma humano con citrato de sodio (plastico) tratado con calicreina; Carril 6: 1:20 Plasma humano con citrato de sodio (plastico); Carril 7: 1:20 Plasma humano con citrato de sodio (plastico) al que se ha anadido quininogeno bicatenario 20 nM.
La figura 3 muestra la deteccion de quininogeno intacto (es decir, monocatenario) en una muestra de paciente
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obtenida durante un ataque. La muestra de plasma de paciente se recogio en tubos de plasma con citrato que contenian un coctel de antiproteasas.
La figura 4 muestra un esquema de la estructura del dominio de HMWK monocatenario y HMWK bicatenario tras la escision por pKal y una inmunotransferencia Western para detectar HMWK monocatenario y bicatenario utilizando un anticuerpo que se une a la cadena ligera de quininogeno escindido. C1 = HMWK monocatenario, C2 = HMWK bicatenario, G = vidrio, P= plastico.
La figura 5 muestra la deteccion LI-COR de HMWK purificado como un ensayo semicuantitativo. Se valoraron HMWK humano purificado y HMWK escindido desde 9 0 pg/ml a 5,6 pg/ml en plasma humano deficiente en HMWK. Las muestras se diluyeron 1:20 en TBS y tampon de carga de muestra (con DTT). Las muestras diluidas se procesaron sobre un gel de bis-tris al 4-12 % y, despues de la electroforesis, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Despues del bloqueo, la mancha se visualizo utilizando un anticuerpo anti-HMWK humano de raton (clon N° 11H05), que es especifico de la cadena ligera de HMWK, y un IRDye 680 antirraton de cabra. Se realizo un barrido sobre los geles utilizando el detector IR de LI-COR Odyssey, que es capaz de detectar la senal de excitacion de IRDye 680.
La figura 6 muestra una inmunotransferencia Western y un analisis LI-COR de una muestra de paciente con HAE y demuestra que las muestras de paciente con HAE muestran niveles endogenos mas elevados de HMWK escindido. El plasma de paciente con HAE tanto basal como de ataque tenia porcentajes mas elevados de HMWK escindido en comparacion con plasma de un estado no de enfermedad mediante analisis Li-cor. Las muestras de plasma analizadas se recogieron en una solucion de antiproteasa que, en comparacion con muestras de plasma con citrato de sodio de los mismos pacientes en el mismo momento de la recogida, protegio el plasma del paciente con HAE de una activacion de contacto adicional. Las barras de error en el grafico representan la desviacion tipica.
La figura 7 muestra una inmunotransferencia Western y un grafico que representa la evaluacion de condiciones de activacion por FXIIa. Figura 7A: inmunotransferencia Western y deteccion por Li-cor de plasma humano normal activado con diferentes concentraciones de FXIIa a diferentes temperaturas (hielo frente a 37 °C) y tiempos de incubacion (10 frente a 30 minutos). Carril 1: marcadores de peso molecular; Carril 2: HMWK monocatenario y bicatenario purificado; Carril 3: plasma humano normal; Carril 4: plasma humano normal + FXIIa 2,5 nM durante 10 minutos a 37°C; Carril 5: plasma humano normal + FXIIa 2,5 nM durante 30 minutos a 37°C; Carril 6: plasma
humano normal + FXIIa 2,5 nM durante 10 minutos en hielo; Carril 7: plasma humano normal + FXIIa 2,5 nM durante
30 minutos en hielo; Carril 8: plasma humano normal + FXIIa 5 nM durante 10 minutos a 37°C; Carril 9: plasma humano normal + FXIIa 5 nM durante 30 minutos a 37°C; Carril 10: plasma humano normal + FXIIa 5 nM durante 10 minutos en hielo; Carril 11: plasma humano normal + FXIIa 5 nM durante 30 minutos en hielo; Carril 12: plasma
humano normal + FXIIa 7,5 nM durante 10 minutos a 37°C; Carril 13: plasma humano normal + FXIIa 7,5 nM durante
30 minutos a 37°C; Carril 14: plasma humano normal + FXIIa 7,5 nM durante 10 minutos en hielo; Carril 15: plasma humano normal + FXIIa 7,5 nM durante 30 minutos en hielo. Figura 7B: Porcentaje de HMWK bicatenario en cada carril determinado usando intensidades de senal Li-cor [% de HMWK bicatenario = (senal de 46 kDa + senal de 56 kDa)/(senal de 46 kDa + senal de 56 kDa + senal de 110 kDa)].
La figura 8 muestra una inmunotransferencia Western y un grafico que representa los efectos inhibidores de DX-88 y DX-2930 sobre la activacion por FXIIa de la actividad de pKal. Figura 8A: Analisis por inmunotransferencia Western que representa que la ecalantida y DX-2930 inhiben la escision de HMWK por pKAL cuando se anaden a plasma humano ex vivo. Figura 8B: un diagrama que muestra los efectos de DX-88 y DX-2930 sobre la produccion de HMWK escindido en presencia de FXIIa. El plasma humano con citrato de sodio reunido se pretrato con DX-2930 o ecalantida a concentraciones que varian de 1370 a 34,3 nM. Todas las muestras (incluida una muestra no tratada) se activaron mediante la adicion de FXIIa 2,5 nM. Las enzimas se inhibieron despues mediante la adicion de un coctel inhibidor de proteasas. Concentraciones molares iguales de ecalantida y DX-2930 reducen la cantidad de HMWK escindido de forma equivalente en plasma humano reunido en comparacion con la muestra de plasma no tratada. C = HMWK monocatenario y bicatenario 25 nM; N = plasma normal; + = plasma humano activado (sin farmaco).
La figura 9 muestra un analisis de inmunotransferencia Western de activacion del sistema de contacto en pacientes con colitis ulcerosa (UC) y artritis reumatoide (RA). Carril 1: marcadores de peso molecular; Carril 2: HMWK monocatenario y bicatenario purificado; Carriles 3 a 5: plasma humano normal; Carriles 6 a 10: plasma de pacientes con UC; Carriles 11 a 15: plasma de pacientes con RA. En la tabla 3 se proporcionan detalles adicionales con respecto a las muestras de cada carril.
La figura 10 muestra un analisis por inmunotransferencia Western de la activacion del sistema de contacto en pacientes con enfermedad de Crohn (CD). Carril 1: marcadores de peso molecular; Carril 2: HMWK monocatenario y bicatenario purificado; Carriles 3 a 5: plasma humano normal; Carriles 6 a 10: plasma de pacientes con CD. En la tabla 4 se proporcionan detalles adicionales con respecto a las muestras de cada carril.
DESCRIPCION DETALLADA
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Definiciones
Por conveniencia, antes de la descripcion adicional de la presente invencion, se definen a continuacion determinados terminos empleados en la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas. Otros terminos se definen cuando aparezcan en la memoria descriptiva.
Las formas del singular “un”, “uno/a” y “el/la” incluyen referencias al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Tal como se usa en el presente documento, "adquiere" o "adquirir" se refiere a obtener la posesion de una entidad fisica, o un valor, por ejemplo un valor numerico, "adquiriendo directamente" o "adquiriendo indirectamente" la entidad fisica o el valor. "Adquirir directamente" significa realizar un proceso (por ejemplo realizar un ensayo o prueba sobre una muestra o "analizar una muestra" tal como se define la expresion en el presente documento) para obtener la entidad fisica o el valor. "Adquirir indirectamente" se refiere a recibir la entidad fisica o el valor de otra parte o fuente (por ejemplo, un laboratorio de una tercera parte que adquiere directamente la entidad fisica o el valor). Adquirir directamente una entidad fisica incluye realizar un proceso, por ejemplo analizar una muestra, que incluye un cambio fisico en una sustancia fisica, por ejemplo un material de partida. Los cambios ejemplares incluyen producir una entidad fisica a partir de dos o mas materiales de partida, someter a cizallamiento o fragmentar una sustancia, separar o purificar la sustancia, combinar dos o mas entidades separadas en una muestra, realizar una reaccion quimica que incluye romper o formar un enlace covalente o no covalente. Adquirir directamente un valor incluye realizar un proceso que incluye un cambio fisico en una muestra u otra sustancia, por ejemplo realizar un proceso analitico que incluye un cambio fisico en una sustancia, por ejemplo una muestra, un analito o un reactivo (a veces denominado en el presente documento "analisis fisico"), realizar un procedimiento analitico, por ejemplo un procedimiento que incluye uno o varios de los siguientes: separar o purificar una sustancia, por ejemplo un analito, o un fragmento u otro derivado de la misma, de otra sustancia; combinar un analito, o un fragmento u otro derivado del mismo, con otra sustancia, por ejemplo un tampon, un disolvente o un reactante; o cambiar la estructura de un analito, o un fragmento u otro derivado del mismo, por ejemplo, rompiendo o formando un enlace covalente o no covalente entre un primer y un segundo atomo del analito; o cambiar la estructura de un reactivo, o un fragmento u otro derivado del mismo, por ejemplo rompiendo o formando un enlace covalente o no covalente, entre un primer y un segundo atomo del reactivo.
Tal como se usa en el presente documento, "analizar" una muestra incluye realizar un proceso que implica un cambio fisico en una muestra u otra sustancia, por ejemplo un material de partida. Los cambios ejemplares incluyen producir una entidad fisica a partir de dos o mas materiales de partida, someter a cizallamiento o fragmentar una sustancia, separar o purificar la sustancia, combinar dos o mas entidades separadas en una muestra, realizar una reaccion quimica que incluye romper o formar un enlace covalente o no covalente. Analizar una muestra puede incluir realizar un proceso analitico que incluye un cambio fisico en una sustancia, por ejemplo una muestra, un analito o un reactivo (a veces denominado en el presente documento "analisis fisico"), realizar un procedimiento analitico, por ejemplo un procedimiento que incluya uno o mas de lo siguiente: separar o purificar una sustancia, por ejemplo un analito, o un fragmento u otro derivado de la misma, de otra sustancia; combinar un analito, o un fragmento u otro derivado del mismo, con otra sustancia, por ejemplo un tampon, un disolvente o un reactante; o cambiar la estructura de un analito, o un fragmento u otro derivado del mismo, por ejemplo, rompiendo o formando un enlace covalente o no covalente, entre un primer y un segundo atomo del analito; o cambiar la estructura de un reactivo, o un fragmento u otro derivado del mismo, por ejemplo rompiendo o formando un enlace covalente o no covalente, entre un primer y un segundo atomo del reactivo.
El termino "agonista", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un agente que imita o regula al alza (por ejemplo potencia o complementa) la bioactividad de una proteina. Un agonista puede ser una proteina de tipo silvestre o un derivado de la misma que tenga por lo menos una bioactividad de la proteina de tipo silvestre. Un agonista tambien puede ser un compuesto que aumenta por lo menos una bioactividad de una proteina. Un agonista tambien puede ser un compuesto que aumenta la interaccion de un polipeptido con otra molecula, por ejemplo un peptido diana o un acido nucleico.
El termino "antagonista", tal como se usa en el presente documento, se pretende que se refiera a un agente que regula a la baja (por ejemplo suprime o inhibe) por lo menos una bioactividad de una proteina. Un antagonista puede ser un compuesto que inhibe o reduce la interaccion entre una proteina y otra molecula, por ejemplo un peptido diana o un sustrato enzimatico. Un antagonista puede ser tambien un compuesto que reduce o inhibe la cantidad de proteina expresada presente. Normalmente, inhibir una proteina o un gen se refiere a reducir la expresion o una actividad relevante de la proteina o el gen en por lo menos el 10 % o mas, por ejemplo el 20 %, 30 %, 40 %, o el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o mas, o producir una reduccion en la expresion o la actividad relevante superior a 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces, 100 veces o mas medida mediante uno o varios procedimientos descritos en el presente documento o reconocidos en la tecnica.
Tal como se usa en el presente documento, "afinidad de union" se refiere a la constante de asociacion aparente o Ka. La Ka es la inversa de la constante de disociacion (Kd). Una proteina de union puede tener, por ejemplo, una afinidad de union de por lo menos 105, 106, 107, 108, 109, 1010 y 1011 M'1 para una molecula diana particular. La
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mayor afinidad de union de una proteina de union a una primera diana con respecto a una segunda diana puede venir indicada por una Ka superior (o un valor numerico mas pequeno de Kd) para la union a la primera diana que la Ka (o el valor numerico de Kd) para la union a la segunda diana. En dichos casos, la proteina de union tiene especificidad por la primera diana (por ejemplo una proteina en una primera conformacion o imitadora de la misma) con respecto a la segunda diana (por ejemplo la misma proteina en una segunda conformacion o imitadora de la misma; o una segunda proteina). Las diferencias en la afinidad de union (por ejemplo, para la especificidad u otras comparaciones) pueden ser por lo menos de 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37.5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000 o 105 veces.
La afinidad de union puede determinarse mediante una diversidad de procedimientos que incluyen dialisis en equilibrio, union en equilibrio, filtracion en gel, ELISA, resonancia de plasmon superficial o espectroscopia (por ejemplo usando un ensayo de fluorescencia). Las condiciones ejemplares para la evaluacion de la afinidad de union son en tampon TRIS (TRIS 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, a un pH de 7,5). Estas tecnicas pueden usarse para medir la concentracion de proteina de union unida y libre en funcion de la concentracion de la proteina de union (o diana). La concentracion de la proteina de union unida ([Unida]) se refiere a la concentracion de la proteina de union libre ([Libre]) y la concentracion de sitios de union para la proteina de union en la diana en la que (N) es el numero de sitios de union por molecula diana mediante la ecuacion siguiente:
[Unida] = N [Libre]/((1/Ka) + [Libre]).
No siempre es necesario realizar una determinacion exacta de Ka, aunque, dado que a veces es suficiente obtener una medicion cuantitativa de la afinidad, por ejemplo determinada usando un procedimiento tal como ELISA o analisis FACS, que es proporcional a Ka, y por lo tanto puede usarse para comparaciones, tal como la determinacion de si una afinidad superior es, por ejemplo, 2 veces superior, para obtener una medida cualitativa de la afinidad, u obtener una inferencia de afinidad, por ejemplo, mediante la actividad en un ensayo funcional, por ejemplo un ensayo in vitro o in vivo.
La expresion "proteina de union" se refiere a una proteina que puede interactuar con una molecula diana. Esta expresion se usa de forma indistintamente con el termino "ligando". Una "proteina de union a calicreina plasmatica" se refiere a una proteina que puede interactuar con (por ejemplo, unirse a) calicreina plasmatica, e incluye, en particular, proteinas que preferentemente o especificamente interactuan con y/o inhiben calicreina plasmatica. Una proteina inhibe la calicreina plasmatica si provoca una reduccion de la actividad de la calicreina plasmatica en comparacion con la actividad de la calicreina plasmatica en ausencia de la proteina y en las mismas condiciones. En algunas formas de realizacion, la proteina de union a calicreina plasmatica es un anticuerpo.
La expresion "reactivo de captura" se refiere a un resto que se une especificamente a su ligando.
Tal como se usan en el presente documento, el termino "complejo" o la expresion "formacion de complejo" se refieren a un complejo entre asociados que tienen una afinidad especifica uno por otro.
Una "sustitucion de aminoacidos conservativa" es una en la que el residuo de aminoacido esta reemplazado por un residuo de aminoacido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoacidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la tecnica. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
Las secuencias de motivos para biopolimeros pueden incluir posiciones que pueden ser aminoacidos variados. Por ejemplo, el simbolo "X" en dicho contexto se refiere generalmente a cualquier aminoacido (por ejemplo, cualquiera de los veinte aminoacidos naturales) a menos que se indique lo contrario, por ejemplo, se refiere a cualquier aminoacido que no sea cisteina. Otros aminoacidos permitidos tambien pueden indicarse, por ejemplo, usando parentesis y barras oblicuas. Por ejemplo, "(A/W/F/N/Q)" significa que la alanina, el triptofano, la fenilalanina, la asparagina y la glutamina estan permitidos en esa posicion particular.
Tal como se usa en el presente documento, un "reactivo de deteccion" se refiere a un resto que se une al resto que se va a detectar. Normalmente genera una senal, por ejemplo, fluorescencia, o produce un compuesto que puede medirse.
Un "epitope" se refiere al sitio en un compuesto diana la que se une una proteina de union (por ejemplo un anticuerpo tal como un Fab o un anticuerpo de longitud completa). En el caso en el que el compuesto diana sea una proteina, el sitio puede estar compuesto totalmente por componentes aminoacidicos, estar compuesto totalmente por modificaciones quimicas de aminoacidos de la proteina (por ejemplo, restos glicosilo) o estar compuesto por combinaciones de los mismos. Los epitopes que se solapan incluyen por lo menos un residuo de aminoacido comun, un grupo glicosilo, un grupo fosfato, un grupo sulfato u otra caracteristica molecular.
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Una primera proteina de union (por ejemplo, un anticuerpo) "se une al mismo epitope" que una segunda proteina de union (por ejemplo, un anticuerpo) si la primera proteina de union se une al mismo sitio de un compuesto diana al que se une la segunda proteina de union, o se une a un sitio que se solapa (por ejemplo se solapa el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %, por ejemplo, en terminos de secuencia de aminoacidos u otra caracteristica molecular (por ejemplo grupo glicosilo, grupos fosfato o grupo sulfato)), con el sitio al que se une la segunda proteina de union.
Una primera proteina de union (por ejemplo, un anticuerpo) "compite por la union" con una segunda proteina de union (por ejemplo un anticuerpo) si la union de la primera proteina de union reduce (por ejemplo un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o mas) la cantidad de la segunda proteina de union que se une a su epitope. La competencia puede ser directa (por ejemplo, la primera proteina de union se une a un epitope que es el mismo que, o que se solapa con, el epitope unido a la segunda proteina de union), o indirectamente (por ejemplo, la union de la primera proteina de union a su epitope causa un cambio esterico en el compuesto diana que reduce la capacidad de la segunda proteina de union para unirse a su epitope).
Tal como se usa en el presente documento, una molecula biologica "funcional" es una molecula biologica en una forma que muestra una propiedad y/o una actividad por la que se caracteriza.
Los calculos de "homologia" o de "identidad de secuencia” entre dos secuencias (los terminos se usan en el presente documento indistintamente) se llevan a cabo como sigue. Las secuencias se alinean con fines de una comparacion optima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoacidos o de acidos nucleicos para un alineamiento optimo y secuencias no homologas pueden no tomarse en cuenta para propositos de comparacion). El alineamiento optimo se determina como la mejor puntuacion usando el programa GAP en el paquete informatico GCG con una matriz de puntuacion Blossum 62 con una penalizacion de hueco de 12, una penalizacion de hueco extendido de 4 y una penalizacion de hueco de desplazamiento de marco de 5. A continuacion, los residuos de aminoacidos o los nucleotidos en posiciones de aminoacidos o posiciones de nucleotidos correspondientes se comparan. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo resto de aminoacido o por el mismo nucleotido segun la posicion correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moleculas son identicas en esa posicion (tal como se usa en el presente documento “identidad” de aminoacidos o de acidos nucleicos es equivalente a “homologia” de aminoacidos o de acidos nucleicos). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias.
En una forma de realizacion preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada con propositos de comparacion es por lo menos el 30 %, preferentemente por lo menos el 40 %, de forma mas preferida por lo menos el 50 %, de forma incluso mas preferida por lo menos el 60 % y de forma incluso mas preferida por lo menos el 70 %, 80 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 % o 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia de referencia puede ser la longitud de la secuencia de dominio variable de inmunoglobulina.
Tal como se usa en el presente documento "se hibrida en condiciones de bajo rigor, de rigor medio, de alto rigor o de muy alto rigor" describe condiciones para la hibridacion y el lavado. Pueden encontrarse directrices para la realizacion de reacciones de hibridacion en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Se describen procedimientos acuosos y no acuosos en dicha referencia y pueden usarse cualquiera de los mismos. Las condiciones de hibridacion especificas a las que se hace referencia en el presente documento son las siguientes: (1) condiciones de hibridacion de bajo rigor en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de dos lavados con 0,2X SSC, 0,1 % de SDS por lo menos a 50 °C (la temperatura de los lavados puede aumentarse a 55 °C para condiciones de bajo rigor); (2) condiciones de hibridacion de rigor medio en 6X sSc a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o mas lavados con 0,2X SSC, 0,1 % de SDS a 60 °C; (3) condiciones de hibridacion de alto rigor en 6X SSC a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o mas lavados con 0,2X SSC, 0,1 % de SDS a 65 °C; y (4) condiciones de hibridacion de muy alto rigor en fosfato de sodio 0,5 M, 7 % de SDS a 65 °C, seguido de uno o mas lavados en 0,2X SSC, 1 % de SDS a 65 °C. Las condiciones de muy alto rigor (4) son las condiciones preferidas y las que deberian usarse a menos que se indique lo contrario. La divulgacion incluye acidos nucleicos que se hibridan con bajo, medio, alto o muy alto rigor a un acido nucleico descrito en el presente documento o a un complemento del mismo, por ejemplo acidos nucleicos que codifican una proteina de union descritos en el presente documento. Los acidos nucleicos pueden tener la misma longitud o una longitud dentro del 30, 20 o 10 % de la longitud del acido nucleico de referencia. El acido nucleico puede corresponder a una region que codifica una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina descrita en el presente documento.
Una "composicion aislada" se refiere a una composicion en la que se ha eliminado por lo menos el 90 % de por lo menos un componente de una muestra natural a partir de la que se puede obtener la composicion aislada. Las composiciones producidas artificialmente o de forma natural pueden ser "composiciones de por lo menos" un determinado grado de pureza si la especie o la poblacion de especies de interes es por lo menos el 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98 o 99 % pura sobre la base de peso-peso.
Tal como se usa en el presente documento, "in vitro" se refiere a eventos que tienen lugar en un entorno artificial,
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por ejemplo en un tubo de ensayo o un recipiente de reaccion, en cultivo celular, etc., mas que dentro de un organismo multicelular.
Tal como se usa en el presente documento, la expresion "in vivo”se refiere a eventos que tienen lugar dentro de un organismo multicelular tales como un animal humano o no humano.
Una "composicion aislada" se refiere a una composicion a la que se ha eliminado por lo menos el 90 % de por lo menos un componente de una muestra natural a partir de la que se puede obtener la composicion aislada. Las composiciones producidas artificialmente o de forma natural pueden ser "composiciones de por lo menos" un determinado grado de pureza si la especie o la poblacion de especies de interes es por lo menos el 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98 o 99 % pura sobre la base de peso-peso.
Una proteina "aislada" se refiere a una proteina a la que se ha eliminado por lo menos el 90 % de por lo menos un componente de una muestra natural a partir de la que se puede obtener la proteina aislada. Las proteinas pueden ser "de por lo menos" un determinado grado de pureza si la especie o la poblacion de especies de interes es por lo menos el 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98 o 99 % pura sobre la base de peso-peso.
El termino "calicreina" (por ejemplo, calicreina plasmatica) se refiere a peptidasas (enzimas que escinden enlaces peptidicos en proteinas), un subgrupo de la familia de la serina proteasa. La calicreina plasmatica escinde quininogeno para generar quininas, peptidos proinflamatorios potentes.
La expresion "inhibidor de calicreina" se refiere a cualquier agente o molecula que inhiba la calicreina. Por ejemplo, el DX-88 (tambien denominado en el presente documento "PEP-1") es un inhibidor especifico potente (Ki < 1 nM) de calicreina plasmatica (NP_000883). (Veanse tambien, por ejemplo, los documentos WO 95/21601 o WO 2003/103475).
Tal como se usa en el presente documento el termino "DX-2922" se usa indistintamente que el termino "X101-A01". A continuacion se describen otras variantes de este anticuerpo.
Identificacion del anticuerpo
Descripcion
X63-G06
Fab de linea no germinal descubierto usando ROLIC, misma HC pero diferente LC que M160-G12
X81-B01
IgG de linea germinal producido en celulas HEK 293T
X101-A01
IgG de linea germinal producido en celulas CHO, misma secuencia de HC y de LC que X81-B01
DX-2922
Nomenclatura alternativa para X101-A01
Tal como se usa en el presente documento el termino "DX-2930" se usa indistintamente que el termino "X124-G01". A continuacion se describen otras variantes de este anticuerpo.
Identificacion del anticuerpo
Descripcion
M162-A04
Fab de linea no germinal descubierto usando presentacion en fagos
M199-A08
Fab con CDR3 de cadena pesada variada derivado por maduracion de afinidad de M162-A04
X115-F02
Fab de linea germinal producido en celulas 293T, misma cadena pesada variable que X124-G01
X124-G01 o DX-2930
IgG de linea germinal producida en celulas CHO, secuencia de LC y HC igual que X115-F02 excepto que la Lys C-terminal de la HC esta eliminada en X124-G01 (tambien conocido como DX-2930).
El termino "modulador" se refiere a un polipeptido, acido nucleico, macromolecula, complejo, molecula, molecula pequena, compuesto, especie o similar (de origen natural o no natural), o un extracto realizado a partir de materiales biologicos tales como bacterias, plantas, hongos, o celulas o tejidos animales, que pueden ser capaces de causar una modulacion. Los moduladores pueden evaluarse para determinar su actividad potencial como inhibidores o activadores (directamente o indirectamente) de una propiedad funcional, actividad o proceso biologico, o combinacion de las mismas (por ejemplo, agonista, antagonista parcial, agonista parcial, agonista inverso, antagonista, agentes antimicrobianos, inhibidores de la infeccion o la proliferacion microbiana y similares) mediante su inclusion en ensayos. En dichos ensayos, muchos moduladores pueden cribarse a la vez. La actividad de un modular puede ser conocida, desconocida o parcialmente conocida.
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Un residuo de aminoacido "no esencial" es un residuo que puede alterarse a partir de la secuencia de tipo silvestre del agente de union, por ejemplo, el anticuerpo, sin abolir o, de forma mas preferida, sin alterar sustancialmente una actividad biologica, mientras que el cambio de un residuo de aminoacido "esencial" da como resultado una perdida sustancial de actividad.
Un "paciente", "sujeto" o "huesped" (estos terminos se usan indistintamente) que se va a tratar mediante el procedimiento objeto puede significar un animal humano o no humano. En algunas formas de realizacion, un sujeto es sospechoso de padecer, o esta en riesgo de padecer, o padece un trastorno mediado por calicreina, por ejemplo un trastorno mediado por bradiquinina, por ejemplo angioedema hereditario (HAE). En algunas formas de realizacion, un sujeto esta en riesgo de padecer o padece angioedema idiopatico no dependiente de histamina, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, lupus, enfermedad de Alzheimer, choque septico, lesion por quemadura, lesion por isquemia/reperfusion cerebral, edema cerebral, retinopatia diabetica, nefropatia diabetica, edema macular, vasculitis, trombosis arterial o venosa, trombosis asociada con dispositivos de asistencia ventricular o endoprotesis vasculares, trombocitopenia inducida por heparina con trombosis, enfermedad tromboembolica y enfermedad cardiaca coronaria con angina de pecho inestable, edema, enfermedad ocular, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropatico, dolor inflamatorio, estenosis espinal-enfermedad espinal degenerativa, ileo postoperatorio, aneurisma aortico, osteoartritis, angioedema hereditario, embolismo pulmonar, apoplejia, traumatismo craneal o edema cerebral peritumoral, sepsis, evento isquemico de la arteria cerebral media (MCA) agudo (apoplejia), reestenosis (por ejemplo, despues de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistemico, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad neurologica, una enfermedad asociada con un plegamiento proteico incorrecto, una enfermedad asociada con angiogenesis, nefropatia hipertensiva y nefropatia diabetica, enfermedades alergicas y respiratorias (por ejemplo, anafilaxia, asma, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, sindrome de dificultad respiratoria aguda, fibrosis quistica, rinitis persistente) y lesiones histicas (por ejemplo, lesion por quemadura o por producto quimico).
El termino "precalicreina" y la expresion "precalicreina plasmatica" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a la forma zimogena de calicreina plasmatica activa, que tambien es conocida como precalicreina.
El termino "prevenir" o "previene" una enfermedad en un sujeto se refiere a someter al sujeto a un tratamiento farmaceutico, por ejemplo a la administracion de un farmaco, de forma que se prevenga por lo menos un sintoma de la enfermedad, es decir, se administra antes de la manifestacion clinica de la afeccion no deseada (por ejemplo, una enfermedad u otro estado no deseado del animal huesped) de forma que proteja al huesped frente al desarrollo de la afeccion no deseada. "Prevencion" de una enfermedad tambien puede denominarse "profilaxis" o "tratamiento preventivo".
Tal como se usa en el presente documento, la expresion "sustancialmente identica" (o "sustancialmente homologa") se usa en el presente documento para referirse a una primera secuencia de aminoacido o de acido nucleico que contiene un numero suficiente de residuos de aminoacidos o nucleotidos identicos o equivalentes (por ejemplo, con una cadena lateral similar, por ejemplo, sustituciones de aminoacidos conservadas) a una segunda secuencia de aminoacidos o acidos nucleicos de forma que la primera y la segunda secuencia de aminoacidos o de acidos nucleicos presentan (o codifican proteinas que presentan) actividades similares, por ejemplo, una actividad de union, una preferencia de union o una actividad biologica. En el caso de anticuerpos, el segundo anticuerpo presenta la misma especificidad y presenta por lo menos el 50 %, por lo menos el 25 % o por lo menos el 10 % de la afinidad con respecto al mismo antigeno.
Las secuencias similares u homologas (por ejemplo, por lo menos aproximadamente el 85 % de identidad de secuencia) a las secuencias divulgadas en el presente documento son tambien parte de la presente solicitud. En algunas realizaciones, la identidad de secuencia puede ser de aproximadamente el 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o superior.
Ademas, existe identidad sustancial cuando los segmentos de acidos nucleicos se hibridan en condiciones de hibridacion selectivas (por ejemplo, condiciones de hibridacion muy rigurosas) al complemento de la cadena. Los acidos nucleicos pueden estar presentes en celulas completas, en un lisado celular o en un una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura.
Las secuencias de motivos para biopolimeros pueden incluir posiciones que pueden ser aminoacidos variados. Por ejemplo, el simbolo "X" en dicho contexto se refiere generalmente a cualquier aminoacido (por ejemplo, cualquiera de los veinte aminoacidos naturales) a menos que se indique lo contrario, por ejemplo, se refiere a cualquier aminoacido que no sea cisteina. Otros aminoacidos permitidos tambien pueden indicarse, por ejemplo, usando parentesis y barras oblicuas. Por ejemplo, "(A/W/F/N/Q)" significa que la alanina, el triptofano, la fenilalanina, la asparagina y la glutamina estan permitidos en esa posicion particular.
La significancia estadistica puede determinarse mediante cualquier procedimiento conocido en la tecnica. Los ensayos estadisticos ejemplares incluyen: el ensayo en T de Students, el ensayo no parametrico en U de Mann
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Whitney y el ensayo estadistico no parametrico de Wilcoxon. Algunas relaciones estadisticamente significativas tienen un valor de P inferior a 0,05 o 0,02. Los terminos "induce", "inhibe", "potencia", "eleva", "aumenta", "reduce" o similares, por ejemplo que denotan diferencias cualitativas o cuantitativas distinguibles entre dos estados, pueden referirse a una diferencia, por ejemplo, una diferencia estadisticamente significativa, entre dos estados.
Tal como se use en el presente documento, una "muestra" se refiere a una composicion que comprende tejido, por ejemplo sangre, plasma o proteina, de un sujeto. Una muestra incluye tanto una muestra sin procesar inicial tomada de un sujeto, asi como formas procesadas subsiguientemente, por ejemplo parcialmente purificadas o conservadas. Las muestras ejemplares incluyen sangre, plasma, lagrimas o mucosidad. En algunas formas de realizacion, la muestra es una muestra de sangre o de plasma.
Una "dosificacion terapeuticamente eficaz" preferentemente modula un parametro que puede medirse, por ejemplo, la actividad de calicreina plasmatica, en un grado estadisticamente significativo o en por lo menos aproximadamente el 20 %, de forma mas preferida en por lo menos aproximadamente el 40 %, de forma incluso mas preferida en por lo menos aproximadamente el 60 % y de forma aun mas preferida en por lo menos aproximadamente el 80 % con respecto a sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para modular un parametro que puede medirse, por ejemplo un parametro asociado a una enfermedad, puede evaluarse en un sistema de modelo animal predictivo de eficacia en afecciones y trastornos humanos. Como alternativa, esta propiedad de una composicion puede evaluarse examinando la capacidad del compuesto para modular un parametro in vitro.
"Tratar" una enfermedad (o afeccion) en un sujeto o "tratar" un sujeto que padece una enfermedad se refiere a someter al sujeto a un tratamiento farmaceutico, por ejemplo, la administracion de un farmaco, de forma que por lo menos un sintoma de la enfermedad se cure, se alivie o se reduzca.
El termino "prevenir" una enfermedad en un sujeto se refiere a someter al sujeto a un tratamiento farmaceutico, por ejemplo la administracion de un farmaco, de forma que se prevenga por lo menos un sintoma de la enfermedad, es decir, se administra antes de la manifestacion clinica de la afeccion no deseada (por ejemplo, una enfermedad u otro estado no deseado del animal huesped) de forma que proteja al huesped frente al desarrollo de la afeccion no deseada. "Prevencion" de una enfermedad tambien puede denominarse "profilaxis" o "tratamiento preventivo".
Una "cantidad profilacticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante periodos necesarios, para lograr el resultado de prevencion deseado. Normalmente, debido a que se usa una dosis de prevencion en los sujetos antes, o en un estado temprano, de la enfermedad, la cantidad profilacticamente eficaz sera menor que la cantidad terapeuticamente eficaz.
Los encabezados, incluidos encabezados alfabeticos y numericos, son meramente para facilitar el entendimiento y la lectura y, en ausencia de indicacion expresa de lo contrario, no impone orden temporal o una jerarquia de preferencias.
Deteccion de HMWK escindido e intacto
La calicreina plasmatica circula como un zimogeno inactivo denominado precalicreina que esta en su mayor parte unido a su sustrato, quininogeno de alto peso molecular (HMWK). En respuesta a un estimulo, el FXII se activa dando FXIIa. El FXIIa escinde la precalicreina para formar calicreina plasmatica activa (figura 1). Aproximadamente el 75-90 % de la precalicreina en circulacion esta unida a HMWK a traves de una interaccion de sitio no activo con el dominio 6 de HMWK. La pKal activa libre y unida a HMWK genera HMWK escindido y bradiquinina. Los biomarcadores de la activacion de calicreina plasmatica se muestran en la tabla 2. La adecuabilidad de un biomarcador puede demostrarse siguiendo sus niveles en presencia y en ausencia de un ataque agudo de HAE. Los niveles de estos biomarcadores podrian tambien alterarse durante un ataque de edema mediado por bradiquinina u otras enfermedades mediadas por la actividad de pKal. Vease la tabla 2.
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Tabla 2. Biomarcadores asociados con KMA
La tabla 2 proporciona marcadores que pueden evaluarse mediante los procedimientos descritos en la tabla 2 y en cualquier otro sitio del presente documento para evaluar sujetos para determinar trastornos mediados por pKal o bradiquinina. La tabla 2 indica la direccion en el cambio del nivel del marcador asociado con trastornos mediados por pKal o bradiquinina.
Biomarcador
Ensayo Nivel basal en pacientes con HAE con respecto al normal A debida a activacion de contacto Comentarios
HMWK intacto
ELISA, inmuno- transferencia Western Sin cambios Se reduce El ensayo esta disponible para medir quininogeno intacto usando APTT con plasma deficiente en quininogeno o inmunoensayos:
www.diapharma.com/downloads/68201025811 .pdf
HMWK escindido
ELISA, inmuno- transferencia Western Aumento Aumento El quininogeno escindido puede aumentar a ~47 % del quininogeno total durante un ataque de HAE. -El quininogeno escindido tambien se eleva durante sepsis, cirrosis. Los ensayos pueden usar o bien a) un anticuerpo que es especifico para quininogeno escindido frente a quininogeno intacto o bien b) un formato de ensayo capaz de separar y cuantificar quininogeno escindido e intacto (por ejemplo, inmunotransferencia Western). Este ensayo no seria sensible a anticuerpo anti-pKal en circulacion y no depende de si la pKal activa unida a la superficie celular es la principal responsable del angioedema mediado por bradiquinina localizado.
La presente divulgacion se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento de que un valor de una forma especifica de NMWK (por ejemplo, el porcentaje de HMWK escindido) en una muestra de un paciente se correlaciona con determinadas enfermedades mediadas por pKal (por ejemplo, HAE) y enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo, RA, UC y la enfermedad de Crohn). Asi, un valor (por ejemplo, un porcentaje) de HMWK escindido, HMWK intacto, o ambos, puede usarse como biomarcador para identificar sujetos que padecen o estan en riesgo de padecer dichas enfermedades, para identificar un trastorno que es probable que sea susceptible de tratamiento con un inhibidor de pKal y para evaluar la eficacia del tratamiento de una enfermedad que implica uno o mas inhibidores de pKal.
Reactivo de detection
En algunas formas de realizacion, un reactivo de deteccion (por ejemplo, un anticuerpo) que se une especificamente (preferentemente) a una forma de HMWK en comparacion con la otra forma de HMWK puede usarse en los procedimientos de ensayo descritos en el presente documento para determinar el nivel de HMWK escindido en una muestra, que puede ser una muestra biologica (por ejemplo, una muestra de sangre o una muestra de plasma) de un paciente candidato. En un ejemplo, el reactivo de deteccion es un anticuerpo que se une especificamente a HMWK escindido en comparacion con HMWK intacto. En otro ejemplo, el reactivo de deteccion es un anticuerpo que se une especificamente a HMWK intacto en comparacion con HMWK escindido. Como alternativa o adicionalmente, el anticuerpo se une especificamente al extremo C-terminal de la cadena ligera de HMWK escindido. Dicho anticuerpo puede usarse para distinguir HMWK de LMWK debido a que el LMWK no contiene el fragmento C- terminal de la cadena ligera de HMWK escindido debido a un corte y empalme alternativo.
Un reactivo de deteccion que "se une especificamente" a un antigeno o a un epitope es una expresion bien conocida en la tecnica, y los procedimientos para determinar dicha union especifica son tambien bien conocidos en la tecnica. Se dice que un reactivo de deteccion tal como un anticuerpo muestra "union especifica" si reacciona o se asocia mas frecuentemente, mas rapidamente, con una mayor duracion y/o con una mayor afinidad con un antigeno diana particular que lo que lo hace con dianas alternativas. Un reactivo de deteccion "se une especificamente" a un antigeno diana (por ejemplo, HMWK escindido) o un epitope del mismo con una mayor afinidad, avidez, mas
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facilmente y/o con una mayor duracion que lo que se une a otras sustancias (por ejemplo, HMWK intacto). Por ejemplo, un anticuerpo que se une especificamente (o preferentemente) a un antigeno (por ejemplo HMWK escindido o al extremo C-terminal de la cadena ligera de HMWK escindido) o un epitope antigenico del mismo es un anticuerpo que se une a su antigeno diana con una mayor afinidad, avidez, mas facilmente y/o con una mayor duracion que lo que se une a otros antigenos (por ejemplo, HMWK intacto) u otros epitopes del mismo antigeno. Se entendera tambien al leer esta definicion que, por ejemplo, un anticuerpo que se une especificamente a un primer antigeno diana puede o no puede unirse especificamente o preferentemente a un segundo antigeno diana. Como tal, "union especifica" o "union preferencial" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) una union exclusiva. En general, pero no necesariamente, la referencia a la union significa union preferencial. En algunos ejemplos, un anticuerpo que "se une especificamente" a un antigeno diana o a un epitope del mismo puede no unirse a otros antigenos o a otros epitopes del mismo antigeno.
En algunas realizaciones, un anticuerpo para su uso en los procedimientos de ensayo descritos en el presente documento tiene una afinidad de union adecuada por un antigeno o un epitope antigenico diana (por ejemplo, quininogeno escindido, HMWK intacto o el extremo C-terminal de la cadena ligera de quininogeno escindido). Tal como se usa en el presente documento, "afinidad de union" se refiere a la constante de asociacion aparente o Ka. La Ka es la inversa de la constante de disociacion (Kd). El anticuerpo descrito en el presente documento puede tener una afinidad de union (Kd) de por lo menos 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 M o inferior. Una afinidad de union aumentada corresponde a una Kd reducida. La mayor afinidad de union de un anticuerpo por un primer antigeno con respecto a un segundo antigeno puede indicarse mediante una Ka superior (o un valor numerico mas pequeno de Kd) para la union al primer antigeno que la Ka (o el valor numerico de Kd) para la union al segundo antigeno. En dichos casos, el anticuerpo tiene especificidad por el primer antigeno con respecto al segundo antigeno. Las diferencias en la afinidad de union (por ejemplo, para la especificidad u otras comparaciones) pueden ser por lo menos de 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37.5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, 10000 o 105 veces.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "anticuerpo" se refiere a una proteina que incluye por lo menos un dominio variable de inmunoglobulina o una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir una region variable de cadena pesada (H) (abreviada en el presente documento como VH), y una region variable de cadena ligera (L) (abreviada en el presente documento como VL). En otro ejemplo, un anticuerpo incluye dos regiones variables de cadena pesada (H) y dos regiones variables de cadena ligera (L). El termino "anticuerpo" abarca fragmentos de union a antigeno de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab y sFab, F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, scFv y fragmentos de anticuerpos de dominio (dAb) (de Wildt et al., Eur J Immunol. 1996; 26(3):629-39.)) asi como anticuerpos completos. Un anticuerpo puede tener las caracteristicas estructurales de IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (asi como de subtipos de las mismas). Los anticuerpos pueden ser de cualquier fuente, pero se prefieren los de primate (primate humano y no humano) y los primatizados.
Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" ("CDR"), intercaladas con regiones que estan mas conservadas, denominadas "regiones estructurales" ("FR"). La extension de la region estructural y de las CDR se ha definido con precision (vease, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edicion, U.S. Department of Health and Human Services, NiH Publicacion N° 91-3242, y Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; vease tambien
www.hgmp.mrc.ac.uk). En el presente documento se usan las definiciones de Kabat. Cada VH y cada VL esta constituida normalmente por tres CDR y cuatro FR, dispuestas partiendo del extremo amino-terminal hacia el extremo carboxi-terminal en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
La cadena VH o VL del anticuerpo puede incluir adicionalmente la totalidad o parte de una region constante de cadena pesada o ligera, para formar, por lo tanto, una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina, respectivamente. En una forma de realizacion, el anticuerpo es un tetramero de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina, estando interconectadas las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina por, por ejemplo, enlaces disulfuro. En las IgG, la region constante de cadena pesada incluye tres dominios de inmunoglobulina, CH1, CH2 y CH3. La region constante de cadena ligera incluye un dominio CL. La region variable de las cadenas pesada y ligera contiene un dominio de union que interactua con un antigeno. Las regiones constantes de los anticuerpos normalmente median la union del anticuerpo a tejidos o factores del huesped, incluidas diversas celulas del sistema inmunitario (por ejemplo, celulas efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clasico. Las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de tipos kappa o lambda. En una forma de realizacion, el anticuerpo esta glicosilado. Un anticuerpo puede ser funcional para citotoxicidad dependiente de anticuerpo y/o citotoxicidad mediada por complemento.
Una o mas regiones de un anticuerpo pueden ser humanas o eficazmente humanas. Por ejemplo, una o mas de las regiones variables pueden ser humanas o eficazmente humanas. Por ejemplo, una o mas de las CDR pueden ser humanas, por ejemplo, CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de lC, CDR2 de LC y CDR3 de LC. Cada una de las CDR de cadena ligera puede ser humana. La CDR3 de HC puede ser humana. Una o mas de las regiones estructurales pueden ser humanas, por ejemplo, FR1, FR2, FR3 y FR4 de la HC o la LC. Por ejemplo, la region Fc puede ser humana. En una forma de realizacion, todas las regiones estructurales son humanas, por ejemplo, tienen una secuencia de un marco estructural de un anticuerpo producido por una celula somatica humana,
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por ejemplo una celula hematopoyetica que produce inmunoglobulinas o una celula no hematopoyetica. En una forma de realizacion, las secuencias humanas son secuencias de linea germinal, por ejemplo, codificadas por un acido nucleico de linea germinal. En una forma de realizacion, los residuos del marco estructural (FR) de un Fab seleccionado pueden convertirse en el tipo de aminoacido del residuo correspondiente en el gen de linea germinal de primate mas similar, especialmente el gen de linea germinal humana. Una o mas de las regiones constantes pueden ser humanas o eficazmente humanas. Por ejemplo, por lo menos el 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 98 o 100 % de un dominio variable de inmunoglobulina, la region constante, los dominios constantes (CH1, CH2, CH3, CL1), o la totalidad del anticuerpo pueden ser humanos o eficazmente humanos.
La totalidad o parte de un anticuerpo puede estar codificado por un gen de inmunoglobulina o un segmento del mismo. Los genes de inmunoglobulina humanos ejemplares incluyen los genes de region constante kappa, lambda, alfa (IgA1 y IgA2), gamma (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta, epsilon y mu, asi como los muchos genes de region variable de inmunoglobulina. Las "cadenas ligeras" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 25 kDa o aproximadamente 214 aminoacidos) estan codificadas por un gen de region variable en el extremo NH2- terminal (aproximadamente 110 aminoacidos) y un gen de region constante kappa o lambda en el extremo COOH- terminal. Las "cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 50 KDa o aproximadamente 446 aminoacidos), estan codificadas de forma similar por un gen de region variable (aproximadamente 116 aminoacidos) y uno de los otros genes de region constante mencionados anteriormente, por ejemplo gamma (que codifica aproximadamente 330 aminoacidos). La longitud de HC humana varia considerablemente debido a que la CDR3 de HC varia de aproximadamente 3 residuos de aminoacidos a mas de 35 residuos de aminoacidos.
La expresion "fragmento de union a antigeno" de un anticuerpo de longitud completa se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo de longitud completa que conservan la capacidad de unirse especificamente a una diana de interes. Los ejemplos de fragmentos de union abarcados dentro de la expresion "fragmento de union a antigeno" de un anticuerpo de longitud completa incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos mediante un puente bisulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un unico brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH y (vi) una region determinante de la complementariedad (CDR) aislada que conserva funcionalidad. Ademas, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, estan codificados por genes separados, pueden unirse usando procedimientos recombinantes, por medio de un enlazador sintetico que permite producirlos como una unica cadena de proteina en la que el par de regiones VL y VH forma moleculas monovalentes conocidas como Fv monocatenario (scFv). Veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 5.260.203, 4.946.778 y 4.881.175; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883.
Pueden obtenerse fragmentos de anticuerpos utilizando cualquier tecnica apropiada, incluidas tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la tecnica. La expresion "anticuerpo monoespecifico" se refiere a un anticuerpo que muestra una especificidad y una afinidad de union unicas por una diana, por ejemplo, un epitope, particular. Esta expresion incluye un "anticuerpo monoclonal" o una "composicion de anticuerpos monoclonales", que se usa en el presente documento para referirse a una preparacion de anticuerpos o fragmentos de los mismos de composicion molecular unica, independientemente de como se ha generado el anticuerpo.
Tal como se usa en el presente documento, una region variable de inmunoglobulina "humanizada" se refiere a una region variable de inmunoglobulina que esta modificada de forma que incluya un numero suficiente de posiciones de aminoacidos de marco estructural humano de forma que la region variable de inmunoglobulina no provoque una respuesta inmunogenica en un ser humano normal. Las descripciones de inmunoglobulinas "humanizadas" incluyen, por ejemplo, los documentos U.S. 6.407.213 y U.S. 5.693.762.
La constante de inhibicion (Ki) proporciona una medida de la potencia del inhibidor; es la concentracion de inhibidor requerida para reducir la actividad enzimatica a la mitad y no depende de las concentraciones de la enzima o el sustrato. La Ki aparente (Ki,ap) se obtiene a diferentes concentraciones de sustrato mediante la medicion del efecto inhibidor de diferentes concentraciones de inhibidor (por ejemplo, proteina de union inhibidora) a lo largo de la extension de la reaccion (por ejemplo, actividad enzimatica); el ajuste del cambio en la constante de velocidad de seudoprimer orden como funcion de la concentracion de inhibidor en la ecuacion de Morrison (ecuacion 1) proporciona un valor estimado de la Ki aparente. La Ki se obtiene a partir del intercepto y extraido de un analisis de regresion lineal de una grafica de Ki,ap frente a la concentracion de sustrato.
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En la que v = velocidad medida; V0 = velocidad en ausencia de inhibidor; Ki,ap = constante de inhibition aparente; I = concentration de inhibidor total y E = concentration de enzima total.
En algunas formas de realization, el reactivo de detection tal como se describe en el presente documento puede conjugarse a una marca detectable y la union del reactivo de deteccion al antigeno de interes (por ejemplo HMWK escindido y HMWK intacto) puede determinarse basandose en la intensidad de la senal liberada de la marca detectable. Como alternativa, puede usarse un anticuerpo secundario especifico con respecto al reactivo de deteccion. Pueden acoplarse uno o mas anticuerpos a la marca detectable. Puede usarse cualquier marca adecuada conocida en la tecnica en los procedimientos de ensayo descritos en el presente documento. En algunas formas de realizacion, una marca detectable comprende un fluoroforo. Tal como se usa en el presente documento, el termino "fluoroforo" (tambien denominado "marca fluorescente" o "colorante fluorescente") se refiere a restos que absorben energia luminica a una longitud de onda de excitation definida y emiten energia luminica a una longitud de onda diferente. En algunas realizaciones, un resto de deteccion es o comprende una enzima. En algunas realizaciones, una enzima es una (por ejemplo, p-galactosidasa) que produce un producto coloreado a partir de un sustrato incoloro.
Quininogeno de alto peso molecular
El quininogeno de alto peso molecular (HMWK) esta presente en el plasma como una proteina de un unico polipeptido (monocatenaria) de multiples dominios (dominios 1-6) con un peso molecular de aproximadamente 110 kDa (figura 4). El HMWK es escindido por la pKal dentro del dominio 4 para liberar los 9 aminoacidos, bradiquinina peptidica proinflamatoria y una forma bicatenaria de HMWK (quininogeno escindido). Las 2 cadenas de HMWK son la cadena pesada, que contienen los dominios 1-3 de HMWK, y la cadena ligera, que contiene los dominios 5 y 6 de HMWK. Las cadenas pesada y ligera tienen un peso molecular de aproximadamente 56 y 46 kilodaltons, respectivamente. Figura 4.
HMWK intacto
El quininogeno de alto peso molecular (HMWK) intacto, tambien denominado en el presente documento "quininogeno intacto", puede analizarse, por ejemplo, usando procedimientos coagulantes o inmunologicos, por ejemplo, radioinmunoensayo (vease, por ejemplo, Kerbiriou-Nabias, D.M., Br J Haematol, 1984, 56(2):2734-86). Un anticuerpo monoclonal para la cadena ligera de HMWK humano es conocido. Vease, por ejemplo, Reddigari, S.R. y Kaplan, A.P., Blood, 1999, 74:695-702. Tambien puede usarse un ensayo para HMWK que se basa en un sustrato cromogenico. Veanse, por ejemplo, Scott, C.F. et al. Thromb Res, 1987, 48(6):685-700; Gallimore, M.J. et al. Thromb Res, 2004, 114(2):91 -96.
El gen humano que codifica HMWK es quininogeno 1 (KNG1). El KNG1 se transcribe y alternativamente se corta y empalma para formar diversos ARNm que codifican o bien HMWK o bien quininogeno de bajo peso molecular (LMWK). Una secuencia de proteina ejemplar de HMWK se proporciona a continuation:
>gi | 156231037 | ref | NP_001095886.1 | precursor de la isoforma 1 de quininogeno-1 [Homo sapiens]
MKLITILFLCSRLLLSLTQESQSEEIDCNDKDLFKAVDAALKKYNSQNQSNNQFVLYRITEATKTVGSDT FYSFKYEIKEGDCPVQSGKTWQDCEYKDAAKAATGECTATVGKRSSTKFSVATQTCQITPAEGPWTAQY DCLGCVHPISTQSPDLEPILRHGIQYFNNNTQHSSLFMLNEVKRAQRQWAGLNFRITYSIVQTNCSKEN FLFLTPDCKSLWNGDTGECTDNAYIDIQLRIASFSQNCDIYPGKDFVQPPTKICVGCPRDIPTNSPELEE TLTHTITKLNAENNATFYFKIDNVKKARVQWAGKKYFIDFVARETTCSKESNEELTESCETKKLGQSLD CNAEVYWPWEKKIYPTVNCQPLGMISLMKRPPGFSPFRSSRIGEIKEETTVSPPHTSMAPAQDEERDSG KEQGHTRRHDWGHEKQRKHNLGHGHKHERDQGHGHQRGHGLGHGHEQQHGLGHGHKFKLDDDLEHQGGHV LDHGHKHKHGHGHGKHKNKGKKNGKHNGWKTEHLASSSEDSTTPSAQTQEKTEGPTPIPSLAKPGVTVTF SDFQDSDLIATMMPPISPAPIQSDDDWIPDIQIDPNGLSFNPISDFPDTTSPKCPGRPWKSVSEINPTTQ MKESYYFDLTDGLS (SEQ ID NO: 1)
HMWK escindido
El quininogeno de alto peso molecular (HMWK) escindido, tambien denominado en el presente documento
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"quininogeno escindido", puede evaluarse, por ejemplo, usando procedimientos descritos en los ejemplos 1, y 3 a 7, por ejemplo inmunotransferencia Western. En algunas formas de realization, puede evaluarse la cadena ligera de HMWK escindido. Pueden usarse anticuerpos que se unen a HMWK escindido, tales como anticuerpos que se unen a la cadena ligera de HMWK escindido (por ejemplo, un epitope que comprende residuos C-terminales). Un ejemplo es el mAb (anticuerpo monoclonal) de raton clon 11H05. Adicionalmente, puede evaluarse HMWK usando espectrometria de masas. Las tecnicas de inmunotransferencia para evaluar niveles de HMWK son conocidas en la tecnica. Vease, por ejemplo, Buhler R. et al. Blood Coagul Fibrinolysis, 1995, 6(3):223-232.
Las secuencias ejemplares de las cadenas pesada y ligera de quininogeno escindido se proporcionan a continuacion.
> cadena pesada de quininogeno 1 escindido
QESQSEEIDCNDKDLFKAVDAALKKYNSQNQSNNQFVLYRITEATKTVGSDTFYSFKYEI KEGDCPVQSGKTWQDCEYKDAAKAATGECTATVGKRSSTKFSVATQTCQITPAEGPWTA QYDCLGCVHPISTQSPDLEPILRHGIQYFNNNTQHSSLFMLNEVKRAQRQWAGLNFRIT YSIVQTNCSKENFLFLTPDCKSLWNGDTGECTDNAYIDIQLRIASFSQNCDIYPGKDFVQ PPTKICVGCPRDIPTNSPELEETLTHTITKLNAENNATFYFKIDNVKKARVQWAGKKYF IDFVARETTCSKESNEELTESCETKKLGQSLDCNAEVYWPWEKKIYPTVNCQPLGMISL MK (SEQ ID NO: 2)
> cadena ligera de quininogeno 1 escindido
SSRIGEIKEETTVSPPHTSMAPAQDEERDSGKEQGHTRRHDWGHEKQRKHNLGHGHKHER DQGHGHQRGHGLGHGHEQQHGLGHGHKFKLDDDLEHQGGHVLDHGHKHKHGHGHGKHKNK GKKNGKHNGWKTEHLASSSEDSTTPSAQTQEKTEGPTPIPSLAKPGVTVTFSDFQDSDLI ATMMPPISPAPIQSDDDWIPDIQIDPNGLSFNPISDFPDTTSPKCPGRPWKSVSEINPTT QMKESYYFDLTDGLS (SEQ ID NO: 3)
Formato de ensayo
Los valores (por ejemplo, las cantidades o los niveles absolutos o las cantidades o los niveles relativos tales como porcentajes) de biomarcadores divulgados en el presente documento, o los cambios en valores de biomarcadores divulgados en el presente documento, pueden evaluarse usando ensayos descritos en el presente documento y/o ensayos conocidos en la tecnica. En algunas realizaciones, el porcentaje de quininogeno escindido en una muestra de un sujeto se usa en cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento.
Los ensayos que pueden usarse para evaluar niveles de biomarcadores incluyen, por ejemplo, inmunoensayos, por ejemplo, inmunotransferencias Western, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA) (por ejemplo, ELISA en sandwich), radioinmunoensayos, ensayos de detection basados en electroquimioluminiscencia y tecnicas relacionadas. Tambien pueden usarse enfoques basados en espectrometria de masas. Tambien pueden usarse ensayos que se basan en un sustrato cromogenico. Los ensayos, por ejemplo, los ensayos de inmunotransferencia Western, pueden implicar ademas el uso de un sistema de imagenologia cuantitativo, por ejemplo, tecnologia de imagenologia LI-COR, que esta comercialmente disponible (vease, por ejemplo, el sistema de imaginologia por infrarrojos Odyssey® CLx de LI-COR Biosciences). En algunas formas de realizacion, se usa un ensayo de deteccion por electroquimioluminiscencia o un ensayo basado en una combinacion de electroquimioluminiscencia y tecnologia de matriz con patron (por ejemplo, un ECL o un ensayo de tecnologia MULTI-ARRAY de Meso Scale Discovery (MSD)).
Tal como se usan en el presente documento, los terminos "medir" o "medicion", o alternativamente "detectar" o "deteccion", significan evaluar la presencia, la ausencia, la cantidad (que puede ser una cantidad eficaz) de una sustancia dentro de una muestra, incluida la derivation de niveles de concentration cualitativos o cuantitativos de dichas sustancias, o evaluar de otra forma los valores o la categorization de un sujeto.
En algunas formas de realizacion, los ensayos proporcionados pueden llevarse a cabo en plataformas de alto rendimiento. En algunas formas de realizacion, pueden usarse placas de multiples pocillos, por ejemplo, placas de 24, 48, 96, 384 o mas pocillos, para ensayos de alto rendimiento. Pueden llevarse a cabo ensayos individuales en cada pocillo en paralelo. Por lo tanto, generalmente es deseable usar un lector de placas para medir multiples pocillos en paralelo para aumentar el rendimiento del ensayo. En algunas formas de realizacion, pueden usarse para esta plataforma lectores de placas que son capaces de tomar imagenes de multiples pocillos (por ejemplo 4, 16, 24, 48, 96, 384 o mas pocillos) en paralelo. Por ejemplo, puede usarse un lector de placas comercialmente disponible (por ejemplo el sistema de placa::vision disponible de Perkin Elmer, Waltham, MA). Este lector de placas es capaz de realizar analisis de fluorescencia basados en cinetica. El sistema de placa::vision tiene opticas de alta eficacia de captation y tiene opticas especiales disenadas para el analisis de 96 pocillos en paralelo. Algunos lectores de placas en paralelo adecuados adicionales incluyen, pero sin limitation, el SAFIRE (Tecan, San Jose, CA), el
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Kits
La presente divulgacion tambien proporciona kits para su uso en la evaluacion de quininogeno escindido y/o intacto en muestras que contienen los mismos, por ejemplo muestras biologicas de pacientes humanos. Dichos kits pueden comprender un reactivo de deteccion que se une especificamente o bien al quininogeno escindido o bien al quininogeno intacto en comparacion con otras formas, y opcionalmente, quininogeno escindido y/o quininogeno intacto como controles. En algunas formas de realizacion, los kits comprenden ademas reactivos y/o anticuerpos secundarios para detectar la union del reactivo de deteccion al quininogeno escindido y/o intacto.
En algunas formas de realizacion, el kit puede comprender instrucciones para su uso segun cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. Las instrucciones incluidas pueden comprender una descripcion de como usar los componentes contenidos en el kit para medir el nivel de quininogeno escindido y/o intacto en una muestra, que puede ser una muestra biologica recogida de un paciente humano.
Las instrucciones con respecto al uso del kit incluyen generalmente informacion sobre la cantidad de cada componente y condiciones adecuadas para la realizacion de los procedimientos de ensayo descritos en el presente documento. Los componentes del kit puede ser dosis unitarias, envases con productos a granel (por ejemplo, envases de multiples dosis) o dosis subunitarias. Los componentes del kit de la divulgacion son normalmente instrucciones escritas en una etiqueta o un prospecto del envase (por ejemplo, una hoja de papel incluida en el kit), pero tambien son aceptables instrucciones legibles por maquina (por ejemplo, instrucciones proporcionadas en un disco de almacenamiento magnetico u optico).
La etiqueta o el prospecto del envase indica que el kit se usa para evaluar el nivel de quininogeno escindido y/o intacto. Las instrucciones pueden proporcionarse para poner en practica cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento.
Los kits de la presente divulgacion se encuentran en un envase adecuado. Los envases adecuados incluyen, pero sin limitacion, viales, frascos, jarras, envases flexibles (por ejemplo bolsas de Mylar o de plastico selladas) y similares. Tambien se contemplan envases para su uso en combinacion con un dispositivo especifico, tal como un inhalador, dispositivo de administracion nasal (por ejemplo, un atomizador) o un dispositivo de infusion tal como una minibomba. Un kit puede tener un puerto de acceso esteril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa para solucion de administracion intravenosa o un vial que tiene un tapon que puede atravesarse con la aguja de una inyeccion hipodermica). El recipiente puede tener tambien un puerto de acceso esteril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa para solucion de administracion intravenosa o un vial que tiene un tapon que puede atravesarse con la aguja de una inyeccion hipodermica).
Los kits pueden proporcionar opcionalmente componentes adicionales tales como tampones e informacion interpretativa. Normalmente, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto(s) del envase en el recipiente o asociados con el mismo. En algunas formas de realizacion, la presente divulgacion proporciona articulos de fabricacion que comprenden contenidos de los kits descritos anteriormente.
Aplicacion de procedimientos de ensayo en diagnostico y pronostico de enfermedades
Los procedimientos de ensayo y los kits descritos en el presente documento pueden aplicarse para la evaluacion de enfermedades, por ejemplo para el diagnostico o el pronostico de una enfermedad. La evaluacion puede incluir identificar a un sujeto que esta en riesgo de padecer o que padece una enfermedad tal como se describe en el presente documento, por ejemplo un trastorno mediado por pKal tal como HAE y una enfermedad autoinmunitaria tal como RA, UC y la enfermedad de Crohn. La evaluacion tambien puede incluir supervisar el tratamiento de una enfermedad, tal como evaluar la eficacia de un tratamiento para un trastorno mediado por pKal tal como HAE. Ademas, la evaluacion puede incluir identificar una enfermedad que puede tratarse mediante un inhibidor de pKal.
A. Diagnostico
En algunas formas de realizacion, los procedimientos de ensayo y los kits se realizan para determinar el nivel de quininogeno escindido y/o quininogeno intacto en una muestra biologica (por ejemplo, una muestra de sangre o una muestra de plasma) recogida de un sujeto candidato (por ejemplo un paciente humano sospechoso de padecer un trastorno mediado por pKal tal como HAE o una enfermedad autoinmunitaria tal como RA, UC y la enfermedad de Crohn). El nivel de quininogeno escindido puede compararse despues con o bien el quininogeno intacto o bien la cantidad total de quininogeno en la muestra para determinar un valor (por ejemplo un porcentaje) de quininogeno escindido, un valor de quininogeno intacto, o ambos, en la muestra. El valor de quininogeno escindido y/o quininogeno intacto puede compararse con un valor de referencia para determinar si el sujeto padece o esta en riesgo de padecer un trastorno mediado por pKal, por ejemplo, HAE o una enfermedad autoinmunitaria, tal como RA,
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UC y enfermedad de Crohn. Por ejemplo, si el porcentaje de quininogeno escindido es igual o superior a un numero de referencia, puede establecerse que el sujeto padece o esta en riesgo de padecer un trastorno mediado por pKal tal como HAE, RA, UC y la enfermedad de Crohn. Como alternativa, si el porcentaje de quininogeno intacto es igual o inferior a un numero de referencia, puede establecerse que el sujeto padece o esta en riesgo de padecer un trastorno mediado por pKal tal como HAE, RA, UC y la enfermedad de Crohn.
El valor de referencia puede ser un nivel de control de porcentaje de quininogeno escindido. En algunas formas de realizacion, el nivel de control es el porcentaje de quininogeno escindido en una muestra de control, tal como una muestra (por ejemplo, una muestra de sangre o plasma) obtenida de un sujeto sano o una poblacion de sujetos sanos, que preferentemente son de la misma especie que el sujeto candidato. Tal como se usa en el presente documento, un sujeto sano es un sujeto que aparentemente no presenta la enfermedad diana (por ejemplo, un trastorno mediado por pKal tal como HAE o enfermedades autoinmunitarias tales como RA, US y la enfermedad de Crohn) en el momento de medir el nivel de quininogeno escindido y/o intacto o no tiene antecedentes de la enfermedad.
El nivel de control tambien puede ser un nivel predeterminado. Dicho nivel predeterminado puede representar un porcentaje de quininogeno escindido en una poblacion de sujetos que no padecen o no estan en riesgo de padecer la enfermedad diana. Tambien pueden representar un porcentaje de quininogeno escindido en una poblacion de sujetos que padecen la enfermedad diana.
El nivel predeterminado puede tomar una diversidad de formas. Por ejemplo, puede ser un valor de corte individual, tal como una mediana o una media. En algunas formas de realizacion, dicho nivel predeterminado puede establecerse basandose en grupos comparativos, tales como cuando se sabe que un grupo definido padece una enfermedad diana y que otro grupo definido no padece la enfermedad diana. Como alternativa, el nivel predeterminado puede variarse, por ejemplo, un intervalo que representa los porcentajes de quininogeno escindido en una poblacion de control dentro de un percentil predeterminado.
El nivel de control tal como se describe en el presente documento puede determinarse mediante tecnologia rutinaria. En algunos ejemplos, en nivel de control puede obtenerse realizando un procedimiento convencional (por ejemplo, el mismo ensayo para obtener el nivel de quininogeno escindido y/o intacto en una muestra de ensayo tal como se describe en el presente documento) en una muestra de control tal como se describe en el presente documento. En otros ejemplos, los niveles de quininogeno escindido y/o intacto pueden obtenerse de miembros de una poblacion de control y los resultados pueden analizarse con, por ejemplo, un programa informatico, para obtener el nivel de control (un nivel predeterminado) que represente el nivel de quininogeno escindido y/o intacto en la poblacion de control.
Comparando el porcentaje de quininogeno escindido en una muestra obtenida de un sujeto candidato con el valor de referencia tal como se describe en el presente documento, puede determinarse si el sujeto candidato padece o esta en riesgo de padecer una enfermedad mediada por pKal (por ejemplo, HAE o una enfermedad autoinmunitaria tal como RA, UC y la enfermedad de Crohn). Por ejemplo, si el porcentaje de quininogeno escindido en una muestra del sujeto candidato se desvia del valor de referencia (por ejemplo, presenta un valor aumentado en comparacion con el valor de referencia), puede establecerse que el sujeto candidato padece o esta en riesgo de padecer la enfermedad. Cuando el valor de referencia representa el intervalo de porcentaje de quininogeno escindido en una poblacion de sujetos que padecen la enfermedad diana, el porcentaje de quininogeno escindido en una muestra de un candidato que se encuentra dentro del intervalo indica que el sujeto candidato padece o esta en riesgo de padecer la enfermedad diana.
Tal como se usa en el presente documento, "un nivel elevado o un nivel superior a un valor de referencia" significa que el nivel/porcentaje de quininogeno escindido es superior a un valor de referencia, tal como un valor umbral predeterminado de un nivel/porcentaje de quininogeno escindido en una muestra de control. Los niveles de control se describen en detalle en el presente documento. Un porcentaje elevado de quininogeno escindido incluye un quininogeno escindido es un porcentaje que es, por ejemplo, el 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o mas superior a un valor de referencia. Un porcentaje elevado de quininogeno escindido tambien incluye el aumento de un fenomeno a partir de un estado cero (por ejemplo, no hay nada de quininogeno escindido y/o de quininogeno intacto que se unan a un reactivo de captura en una muestra o estos son indetectables) a un estado no cero (por ejemplo, hay algo de quininogeno escindido y/o quininogeno intacto o estos pueden detectarse).
Tal como se usa en el presente documento, "un porcentaje/nivel reducido o un porcentaje/nivel inferior a un valor de referencia" significa que el porcentaje/nivel de quininogeno escindido es inferior a un valor de referencia, tal como un valor umbral predeterminado de quininogeno escindido en una muestra de control. Los niveles de control se describen en detalle en el presente documento. Un nivel reducido de quininogeno escindido incluye un quininogeno escindido que es, por ejemplo, el 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o mas inferior a un valor de referencia. Un nivel reducido de quininogeno escindido que se une a un reactivo de captura tambien incluye la reduccion de un fenomeno a partir de un estado no cero (por ejemplo, hay algo de quininogeno escindido o este es detectable en una muestra) a un estado de cero (por ejemplo,
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no hay nada de quininogeno escindido o este es indetectable en una muestra).
En algunas formas de realizacion, el sujeto candidato es un paciente humano que padece un smtoma de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo, tal como HAE o una enfermedad autoinmunitaria tal como RA, UC y la enfermedad de Crohn. Por ejemplo, el sujeto padece edema; inflamacion, siendo dicha inflamacion completamente o predominantemente periferica; urticaria; enrojecimiento, dolor e inflamacion en ausencia de evidencias de infeccion; edema mediado por histamina, ataques recurrentes de inflamacion, o una combinacion de los mismos. En otras formas de realizacion, el sujeto es de un sujeto que no presenta sfntomas de un trastorno mediado por pKal en el momento de recoger la muestra, no tiene antecedentes de un sfntoma de un trastorno mediado por pKal o no tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, tal como HAE. En otras formas de realizacion mas, el sujeto es resistente a un tratamiento antihistammico, un tratamiento con corticosteroides, o a ambos.
(i) HAE
En algunas formas de realizacion, la enfermedad o la afeccion que implica actividad de calicrefna plasmatica es angioedema hereditaria (HAE). El angioedema hereditario (HAE) es tambien conocido como "edema de Quincke", deficiencia de inhibidor de esterasa C1, deficiencia de inhibidor C1 y edema angioneurotico hereditario (HANE). El HAE se caracteriza por episodios recurrentes de inflamacion grave (angioedema) que pueden afectar, por ejemplo, a extremidades, cara, genitales, aparato gastrointestinal y vfas respiratorias. Los sfntomas de HAE incluyen, por ejemplo, inflamacion en brazos, piernas, labios, ojos, lengua y/o garganta; bloqueo de vfas respiratorias que pueden implicar inflamacion de garganta y ronquera subita; episodios repetidos de calambres abdominales sin causa obvia; y/o inflamacion de los intestinos, que puede ser grave y puede desembocar en calambres abdominales, vomitos, deshidratacion, diarrea, dolor y/o conmocion. Aproximadamente un tercio de los individuos con este HAE desarrollan una erupcion sin picor denominada eritema marginado durante un ataque.
La inflamacion de las vfas respiratorias puede ser potencialmente mortal y causar la muerte en algunos pacientes. Las tasas de mortalidad se estiman en el 15-33 %. El HAE es la causa de aproximadamente 15.000-30.000 visitas al servicio de urgencias por ano.
El traumatismo o el estres, por ejemplo, procedimientos dentales, enfermedad (por ejemplo enfermedad vfrica tal como resfriados y gripe), menstruacion y cirugfa pueden desencadenar un ataque de angioedema. Para prevenir ataques agudos de HAE, los pacientes pueden intentar evitar estfmulos especfficos que han provocado anteriormente ataques. No obstante, en muchos casos, tiene lugar un ataque sin un desencadenante conocido. Normalmente, los sfntomas de HAE aparecen en primer lugar en la infancia, y empeoran durante la pubertad. En promedio, los individuos tratados tienen un ataque cada 1 a 2 semanas, y la mayor parte de los episodios durante aproximadamente de 3 a 4 dfas (ghr.nlm.nih.gov/condition/hereditary-angioedema). La frecuencia y la duracion de los ataques varfan ampliamente entre personas con angioedema hereditario, incluso entre personas de la misma familia.
Existen tres tipos de HAE, conocidos como tipos I, II y III. Se estima que el HAE afecta a 1 de cada 50.000 personas, el tipo I abarca el 85 por ciento de los casos, el tipo II abarca aproximadamente el 15 por ciento de los casos y el tipo III es muy raro. El tipo III es la forma descrita mas recientemente y originalmente se pensaba que se producfa solo en mujeres, pero se han identificado familias con varones afectados.
El HAE se hereda en un patron autosomico dominante, de forma que una persona afectada puede heredar la mutacion de un pariente afectado. Tambien pueden tener lugar nuevas mutaciones en el gen, y asf, tambien puede producirse HAE en gente sin antecedentes del trastorno en su familia. Se estima que el 20-25 % de los casos son consecuencia de una mutacion nueva espontanea.
Las mutaciones en el gen SERPING1 causan angioedema hereditaria de tipo I y tipo II. El gen SERPING1 proporciona instrucciones para producir la protefna inhibidora C1, que es importante para controlar la inflamacion. El inhibidor C1 bloquea la actividad de determinadas protefnas que promueven la inflamacion. Las mutaciones que causan angioedema hereditario de tipo I conducen a niveles reducidos de inhibidor C1 en la sangre. Por el contrario, las mutaciones que causan el tipo II dan como resultado la produccion de un inhibidor C1 que funciona de forma anormal. Sin los niveles adecuados de inhibidor C1 funcional se generan cantidades excesivas de bradiquinina. La bradiquinina promueve la inflamacion aumentando el escape de fluido a traves de las paredes de los vasos sangufneos a tejidos corporales. La acumulacion excesiva de fluidos en tejidos corporales causa los episodios de inflamacion observados en individuos con angioedema hereditario de tipo I y tipo II.
Las mutaciones en el gen F12 estan asociadas con algunos casos de angioedema hereditario de tipo III. El gen F12 proporciona instrucciones para producir el factor de coagulacion XII. Ademas de desempenar un papel crftico en la coagulacion de la sangre, el factor XII es tambien un estimulante importante de la inflamacion y esta implicado en la produccion de bradiquinina. Determinadas mutaciones en el gen F12 tienen como consecuencia la produccion de factor XII con actividad aumentada. Como consecuencia, se genera mas bradiquinina y las paredes de los vasos sangufneos se vuelven mas permeables, lo que conduce a episodios de inflamacion. La causa de otros casos de angioedema hereditario de tipo III continua siendo desconocida. Las mutaciones en uno o mas de los genes aun no
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identificados pueden ser responsables del trastorno en algunos casos.
El HAE puede presentarse de forma similar a otras formas de angioedema que tienen como consecuencia alergias u otras afecciones medicas, pero difiere significativamente en causa y tratamiento. Cuando el angioedema hereditario se diagnostica erroneamente como una alergia, se trata de la forma mas comun con antihistaminicos, esteroides y/o epinefrina, que son normalmente ineficaces contra el HAE, aunque puede utilizarse la epinefrina para reacciones potencialmente mortales. Un diagnostico erroneo tambien tiene como consecuencia una cirugia exploratoria innecesaria para pacientes con inflamacion abdominal, y en algunos pacientes con HAE se ha diagnosticado incorrectamente el dolor abdominal como psicosomatico.
Los sintomas de HAE pueden evaluarse, por ejemplo, utilizando cuestionarios, por ejemplo cuestionarios que son completados por pacientes, personal clinico o miembros de la familia. Dichos cuestionarios se conocen en la tecnica e incluyen, por ejemplo, escalas analogicas visuales. Vease, por ejemplo, McMillan, C.V. et al. Patient. 2012 ;5(2) :113-26.
(ii) Artritis reumatoide
La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad autoinmunitaria inflamatoria cronica que causa inflamacion y dolor de las articulaciones y desemboca normalmente en la destruccion de las articulaciones. La RA sigue generalmente un curso de recaida/remision, con brotes de actividad de la enfermedad intercaladas con remisiones de los sintomas de enfermedad. La RA se asocia con una serie de trastornos inflamatorios adicionales, incluidos el sindrome de Sjogren (ojos y boca secos provocados por la inflamacion de glandulas lacrimales y salivares), pleuritis (inflamacion de la pleura que provoca dolor al respirar profundamente y al toser), nodulos reumatoides (sitios nodulares de inflamacion que se desarrollan dentro de los pulmones), pericarditis (inflamacion del pericardio que causa dolor al tumbarse o al inclinarse hacia delante), sindrome de Felty (esplenomegalia y leucopenia observadas junto con RA, que hacen que el sujeto sea propenso a la infeccion) y vasculitis (una inflamacion de los vasos sanguineos que puede bloquear el flujo sanguineo). La calicreina plasmatica se ha implicado en artritis reumatoide.
Los sintomas de RA activa incluyen fatiga, falta de apetito, fiebre de grado reducido, dolor de musculos y articulaciones y rigidez. La rigidez de musculos y articulaciones son mas notables generalmente por la manana y despues de periodos de inactividad. Durante los brotes, las articulaciones se vuelven frecuentemente rojas, inflamadas, dolorosas y blandas, generalmente como consecuencia de sinovitis.
El tratamiento contra la artritis reumatoide implica una combinacion de medicaciones, descanso, ejercicio fortalecedor de las articulaciones y proteccion de las articulaciones. Se utilizan dos clases de medicamentos en el tratamiento de la artritis reumatoide: "farmacos de primera linea" antiinflamatorios y "farmacos antirreumaticos modificadores de la enfermedad" (DMARD). Los farmacos de primera linea incluyen NSAID (farmacos antiinflamatorios no esteroideos) (por ejemplo, aspirina, naproxeno, ibuprofeno y etodolac) y cortisona (corticosteroides). Los DMARD, tales como el oro (por ejemplo, sales de oro, oro-tioglucosa, tiomalato de oro, oro para administracion oral), metotrexato, sulfasalazina, D-penicilamina, azatioprina, ciclofosfamida, clorambucilo y ciclosporina, leflunomida, etanercept, infliximab, anakinra y adalimumab, e hidroxicloroquina, promueven la remision de la enfermedad y previenen la destruccion progresiva de articulaciones, pero no son agentes antiinflamatorios.
Las escalas utiles para evaluar RA y sintomas de RA incluyen, por ejemplo, la escala de gravedad de artritis reumatoide (RASS; Bardwell et al., (2002) Rheumatology 41(1 ):38-45), indice de salud especifico de artritis SF-36 (ASHI; Ware et al., (1999) Med. Care. 37(5 Supl):MS40-50), escalas de medicion del impacto de la artritis o escalas de medicion del impacto de la artritis 2 (AlMS o AIMS2; Meenan et al. (1992) Arthritis Rheum. 35(1 ):1-10); el cuestionario de evaluacion de salud de Stanford (HAQ), HAQII, o HAQ modificado (vease, por ejemplo, Pincus et al. (1983) Arthritis Rheum. 26(11):1346-53).
(iii) Enfermedad intestinal (IBP) - enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa
La enfermedad intestinal inflamatoria (IBD) es un grupo de afecciones inflamatorias del intestino grueso y, en algunos casos, del intestino delgado. Las formas principales de IBD son la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa (UC). Contando con muchos menos casos estan otras formas de IBD: colitis colagenosa, colitis linfocitica, colitis isquemica, colitis por diversion, sindrome de Behget, colitis infecciosa y colitis indeterminada. La mayor diferencia entre la enfermedad de Crohn y la UC es la ubicacion y la naturaleza de los cambios inflamatorios. La enfermedad de Crohn puede afectar cualquier parte del aparato gastrointestinal, desde la boca hasta el ano (salto de lesiones), aunque una mayor parte de los casos comienza en el ileon terminal. La colitis ulcerosa, por el contrario, se restringe al colon y al recto. Microscopicamente, la colitis ulcerosa se restringe a la mucosa (revestimiento epitelial del intestino), mientras que la enfermedad de Crohn afecta a la totalidad de la pared intestinal. Finalmente, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa se presentan con manifestaciones extraintestinales (tales como problemas hepaticos, artritis, manifestaciones en la piel y problemas oculares) en diferentes proporciones.
Los sintomas de la IBD incluyen dolor abdominal, vomitos, diarrea, hematoquecia, perdida de peso, ganancia de peso y diversas dolencias o enfermedades asociadas (artritis, pioderma gangrenosa, colangitis esclerotica primaria).
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El diagnostico se realiza generalmente mediante colonoscopia con biopsia de lesiones patologicas.
El tratamiento para la IBD, en funcion del nivel de gravedad, puede requerir inmunosupresion para controlar los sintomas. Pueden utilizarse inmunosupresores tales como azatioprina, metotrexato o 6-mercaptopurina. Mas comunmente, el tratamiento de IBD requiere una forma de mesalamina. A menudo, se utilizan esteroides para controlar brotes de enfermedad y fueron una vez aceptables como farmaco de mantenimiento. Se han utilizado productos biologicos, tales como infliximab, para tratar pacientes con enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa. Los casos graves pueden requerir cirugia, tal como reseccion de intestino, estricturoplastia o una colostomia o ileostomia temporal o permanente. Existen tratamientos medicinales alternativos para IBD en diversas formas, no obstante dichos procedimientos se concentran en controlar la patologia subyacente a fin de evitar una exposicion a esteroides prolongada o una escision quirurgica. Habitualmente, el tratamiento comienza por la administracion de farmacos, tales como prednisona, con efectos antiinflamatorios elevados. Una vez la inflamacion se ha controlado exitosamente, el paciente se cambia habitualmente a un farmaco mas suave, tal como asacol (una mesalamina) para mantener la enfermedad en remision. Si no tiene exito, puede o no puede administrarse, dependiendo del paciente, una combinacion de los farmacos inmunosupresores mencionados anteriormente con una mesalamina (que tambien puede tener un efecto antinflamatorio).
(iv) Otros trastornos mediados por pKal o mediados por bradiquinina
Otras enfermedades o afecciones ejemplares asociadas con la actividad de calicreina plasmatica incluyen angioedema idiopatico no dependiente de histamina, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, lupus, enfermedad de Alzheimer, choque septico, lesion por quemadura, lesion por isquemia/reperfusion cerebral, edema cerebral, retinopatia diabetica, nefropatia diabetica, edema macular, vasculitis, trombosis arterial o venosa, trombosis asociada con dispositivos de asistencia ventricular o endoprotesis vasculares, trombocitopenia inducida por heparina con trombosis, enfermedad tromboembolica y enfermedad cardiaca coronaria con angina de pecho inestable, edema, enfermedad ocular, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropatico, dolor inflamatorio, estenosis espinal-enfermedad espinal degenerativa, ileo postoperatorio, aneurisma aortico, osteoartritis, angioedema hereditario, embolismo pulmonar, apoplejia, traumatismo craneal o edema cerebral peritumoral, sepsis, evento isquemico de la arteria cerebral media (MCA) agudo (apoplejia), reestenosis (por ejemplo, despues de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistemico, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad neurologica, una enfermedad asociada con un plegamiento proteico incorrecto, una enfermedad asociada con angiogenesis, nefropatia hipertensiva y nefropatia diabetica, enfermedades alergicas y respiratorias (por ejemplo, anafilaxia, asma, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, sindrome de dificultad respiratoria aguda, fibrosis quistica, rinitis persistente) y lesiones histicas (por ejemplo, lesion por quemadura o por producto quimico).
Un sujeto que se ha establecido que padece o que esta en riesgo de padecer un trastorno mediado por pKal tal como se describe en el presente documento puede someterse a un tratamiento adecuado tal como los descritos en el presente documento.
B. Evaluacion de la eficacia del tratamiento
Los procedimientos de ensayo descritos en el presente documento tambien pueden aplicarse para evaluar la eficacia de un tratamiento contra un trastorno mediado por pKal (por ejemplo, HAE). Por ejemplo, pueden recogerse multiples muestras biologicas (por ejemplo, muestras de sangre o de plasma) de un sujeto al que se realiza un tratamiento o bien antes y despues del tratamiento o bien durante el transcurso del tratamiento. Los niveles de quininogeno escindido y/o intacto pueden medirse mediante cualquiera de los procedimientos de ensayo descritos en el presente documento y pueden determinarse valores (por ejemplo, porcentajes) de quininogeno escindido y/o intacto en consecuencia. Si el porcentaje del quininogeno escindido se reduce despues del tratamiento o a lo largo del transcurso del tratamiento (el porcentaje de quininogeno escindido en una muestra recogida mas tarde en comparacion con el de una muestra recogida antes) o el porcentaje de quininogeno intacto aumenta despues del tratamiento o a lo largo del transcurso del tratamiento, indica que el tratamiento es eficaz. En algunos ejemplos, el tratamiento implica un agente terapeutico, tal como un agente de union a calicreina tal como se describe en el presente documento, un antagonista del receptor de bradiquinina B2 tal como se describe en el presente documento o un agente de reemplazo de C1-INH tal como se describe en el presente documento. Los ejemplos de los agentes terapeuticos incluyen, pero sin limitacion, DX-2930 o DX88.
Si se constata que el sujeto no responde al tratamiento, se administra al sujeto en cuestion el agente terapeutico con una dosis superior y/o con una frecuencia de dosificacion superior. En algunas formas de realizacion, la dosificacion o la frecuencia de dosificacion del agente terapeutico se mantienen, se reducen o se suspenden en un sujeto que se ha constatado que responde al tratamiento o no tiene necesidad de un tratamiento adicional. Como alternativa, puede aplicarse un tratamiento diferente al sujeto que se ha encontrado que no responde al primer tratamiento.
Identificacion de trastornos susceptibles de tratamiento con inhibidores de pKal
Los valores de quininogeno escindido y/o quininogeno intacto pueden basarse tambien en la identificacion de un
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trastorno que puede tratarse mediante un inhibidor de pKal. Para poner en practica este procedimiento, el nivel de quininogeno escindido y/o el nivel de quininogeno intacto en una muestra recogida de un sujeto (por ejemplo, una muestra de sangre o una muestra de plasma) que tiene una enfermedad diana puede medirse mediante un ensayo adecuado, por ejemplo, los descritos en el presente documento tal como un ensayo de inmunotransferencia Western. Los valores tales como porcentajes del quininogeno escindido y/o intacto pueden determinarse tal como se describe en el presente documento. Los valores de quininogeno escindido y/o quininogeno intacto pueden compararse con un valor de referencia tal como se describe en el presente documento. Si el valor de quininogeno escindido/quininogeno intacto se desvia del valor de referencia (por ejemplo, se eleva o se reduce), esto indica que un inhibidor de pKal puede ser eficaz en el tratamiento de la enfermedad. Por ejemplo, si los porcentajes de quininogeno escindido se reducen despues del tratamiento o a lo largo del transcurso del tratamiento, puede constatarse que el tratamiento es eficaz. Como alternativa, si los porcentajes de quininogeno intacto aumentan despues del tratamiento o a lo largo del transcurso del tratamiento, se constata que el tratamiento es eficaz.
En algunas formas de realizacion, el nivel de quininogeno escindido y/o intacto puede medirse utilizando un reactivo de deteccion (por ejemplo un anticuerpo) que se une especificamente o bien a quininogeno escindido o bien a quininogeno intacto en comparacion con la otra forma de quininogeno. En algunos ejemplos, el anticuerpo se une especificamente a quininogeno escindido en comparacion con quininogeno intacto. En otros ejemplos, el anticuerpo se une especificamente al extremo C-terminal de la cadena ligera de quininogeno escindido.
Si se constata que la enfermedad es susceptible (puede tratarse mediante) a un inhibidor de pKal, el procedimiento puede comprender adicionalmente administrar al sujeto que padece la enfermedad una cantidad eficaz de un inhibidor de pKal, DX-88, EPIKAL-2 o DX-2930.
Tratamiento
Un sujeto en riesgo de padecer o que padece (por ejemplo, que tiene), un trastorno mediado por pKal o mediado por bradiquinina, identificado mediante cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, puede tratarse con cualquier agente terapeutico apropiado. En algunas formas de realizacion, los procedimientos proporcionados incluyen seleccionar un tratamiento para un sujeto basado en el resultado del ensayo proporcionado, por ejemplo la deteccion de un biomarcador.
En algunas formas de realizacion, el procedimiento comprende uno de entre seleccionar o administrar, o ambos, un agente terapeutico, por ejemplo, un agente de union a calicreina tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, un antagonista del receptor de bradiquinina B2 tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, un agente de reemplazo de C1-INH tal como se describe en el presente documento, para su administracion al sujeto basandose en el resultado del ensayo, por ejemplo, la deteccion de un biomarcador.
En algunas formas de realizacion, se administra a un sujeto una proteina o un polipeptido de union de calicreina plasmatica. En algunas formas de realizacion, el agente de union a calicreina es un inhibidor de calicreina, por ejemplo, un peptido, un inhibidor de molecula pequena, un anticuerpo de calicreina o un fragmento de los mismos. En algunas formas de realizacion, se administra a un sujeto un antagonista del receptor de bradiquinina B2. En algunas formas de realizacion, se administra a un sujeto un agente terapeutico de reemplazo de C1-INH.
El agente terapeutico, por ejemplo un inhibidor de calicreina, por ejemplo un antagonista del receptor de bradiquinina B2, por ejemplo un agente de reemplazo de C1-INH, puede administrarse junto con otro tratamiento como parte de una politerapia para el tratamiento de la enfermedad o la afeccion que implica actividad de calicreina plasmatica y/o de bradiquinina. La politerapia, por ejemplo con uno o mas de entre un inhibidor de calicreina, antagonista del receptor de bradiquinina B2 o agente de reemplazo de C1 -INH, por ejemplo con uno o mas de entre un inhibidor de calicreina, antagonista del receptor de bradiquinina B2 o agente de reemplazo de C1-INH y otro tratamiento, puede proporcionarse en multiples configuraciones diferentes. El primer agente puede administrarse antes o despues de la administracion del otro tratamiento. En algunas situaciones, el primer agente y otro tratamiento (por ejemplo, un agente terapeutico) se administran concurrentemente, o en una proximidad temporal cercana (por ejemplo un intervalo de tiempo corto entre las inyecciones, tal como durante la misma sesion de tratamiento). El primer agente y el otro tratamiento tambien pueden administrarse a intervalos temporales mas amplios.
Agentes de union a calicreina plasmatica
Los agentes de union a calicreina plasmatica (por ejemplo, proteinas de union, por ejemplo polipeptidos, por ejemplo polipeptidos inhibidores, por ejemplo anticuerpos, por ejemplo anticuerpos inhibidores, u otros agentes de union, por ejemplo moleculas pequenas) son agentes terapeuticos utiles para una diversidad de enfermedades y afecciones, por ejemplo, enfermedades y afecciones que implican actividad de calicreina plasmatica. Por ejemplo, en algunas formas de realizacion, la enfermedad o la afeccion que implica actividad de calicreina plasmatica es angioedema hereditaria (HAE). En algunas formas de realizacion, se administra una proteina o un polipeptido de union a calicreina plasmatica a un sujeto en riesgo de padecer o que padece un trastorno mediado por pKal o mediado por bradiquinina.
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Una serie de inhibidores proteicos utiles de calicrefna, calicrefna tisular y/o plasmatica, incluye un dominio de Kunitz. Tal como se utiliza en el presente documento, un "dominio de Kunitz" es un dominio polipeptfdico que tiene por lo menos 51 aminoacidos y que contiene por lo menos dos, y preferentemente tres, disulfuros. El dominio se pliega de forma que la primera y la sexta cistefnas, la segunda y la cuarta, y la tercera y la quinta cistefnas formen puentes disulfuro (por ejemplo, en un dominio de Kunitz que tiene 58 aminoacidos, las cistefnas pueden estar presentes en posiciones correspondientes a los aminoacidos 5, 14, 30, 38, 51 y 55, segun el numero de las secuencias homologas de BPTI proporcionadas mas adelante, y los disulfuros pueden formarse entre las cistefnas de la posicion 5 y 55, 14 y 38, y 30 y 51), o, si hay presencia de dos disulfuros, pueden formarse entre un subconjunto correspondiente de cistefnas del mismo. El espaciado entre cistefnas respectivas puede ser de entre 7, 5, 4, 3, 2, 1 o 0 aminoacidos del espaciado siguiente entre posiciones correspondientes a: 5 a 55, 14 a 38, y 30 a 51, segun la numeracion de la secuencia BPTI que se proporciona mas adelante. La secuencia BPTI puede usarse como referencia para referirse a posiciones especfficas en cualquier dominio de Kunitz generico. La comparacion de un dominio de Kunitz de interes con BPTI puede realizarse identificando el mejor ajuste de alineamiento en el que el numero de cistefnas alineadas este maximizado.
La estructura 3D (a alta resolucion) del dominio de Kunitz de BPTI es conocida. Una de las estructuras de rayos X se deposita en el Brookhaven Protein Data Bank como "6PTI". La estructura 3D de algunos homologos de BPTI (Eigenbrot et al., (1990) Protein Engineering, 3(7):591 -598; Hynes et al., (1990) Biochemistry, 29:10018-10022) es conocida. Se conocen por lo menos ochenta y una secuencias de dominios de Kunitz. Los homologos humanos conocidos incluyen tres dominios de Kunitz de LACI tambien conocido como inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) (Wun et al., (1988) J. Biol. Chem. 263(13):6001-6004; Girard et al., (1989) Nature, 338:518-20; Novotny et al, (1989) J. Biol. Chem., 264(31):18832-18837), dos dominios de Kunitz de inhibidor de inter-a-tripsina, APP-I (Kido et al., (1988) J. Biol. Chem., 263(34):18104-18107), un dominio de Kunitz de colageno, tres dominios de Kunitz de TFPI-2 (Sprecher et al., (1994) PNAS USA, 91:3353-3357), los dominios de Kunitz de inhibidor del activador del factor de crecimiento de hepatocitos de tipo 1, los dominios de Kunitz de inhibidor del activador del factor de crecimiento de hepatocitos de tipo 2, los dominios de Kunitz descritos en la publicacion de patente de Estados Unidos N° 2004-0152633. LACI es una fosfoglicoprotefna serica humana con un peso molecular de 39 kDa (secuencia de aminoacidos en la tabla 1) que contiene tres dominios de Kunitz.
Tabla 1: Dominios de Kunitz naturales ejemplares
LACI: (SEQ ID NO. 4)
1 MIYTMKKVHA LWASVCLLLN LAPAPLNAds eedeehtiit dtelpplklM 51 HSFCAFKADD GPCKAIMKRF FFNIFTRQCE EFIYGGCEGN QNRFESLEEC 101 KKMCTRDnan riikttlqqe kpdfCfleed pqiCrgyitr yfynnqtkqC
151 erfkyggClg nmnnfetlee CkniCedgpn gfqvdnygtq lnavnnsltp 201 qstkvpslfe fhgpswCltp adrglCrane nrfyynsvig kCrpfkysgC 251 ggnennftsk qeClraCkkg fiqriskggl iktkrkrkkq rvkiayeeif 301 vknm
La secuencia de senal (1-28) esta en mayusculas y subrayada LACI-K1 (50-107) esta en mayusculas LACI-K2 (121-178) esta subrayada LACI-K3 (211-270) esta en negrita
BPTI (SEQ ID NO: 5)
1 2 3 4 5 1234567890123456789012345678901234567890123456789012345678 RPDFCLEPPYTGPCKARIIRYFYNAKAGLCQTFVYGGCRAKRNNFKSAEDCMRTCGGA
Los dominios de Kunitz anteriores se refieren a LACI-K1 (residuos 50 a 107), LACI-K2 (residuos 121 a 178) y LACI- K3 (213 a 270). La secuencia de ADNc de LACI se indica en Wun et al. (J. Biol. Chem., 1988, 263(13):6001-6004). Girard et al. (Nature, 1989, 338:518-20) informan sobre estudios mutacionales en los que los residuos de PI de cada uno de los tres dominios de Kunitz estaban alterados. LACI-K1 inhibe el Factor VIIa (F.VIIa) cuando F.VIIa esta complejado al factor tisular y LACI-K2 inhibe el Factor Xa.
Las protefnas que contienen dominios de Kunitz ejemplares incluyen las siguientes, con los numeros de acceso de SWISS-PROT en parentesis:
A4_HUMAN (P05067), A4_MACFA (P53601), A4_MACMU (P29216),
A4_MOUSE (P12023), A4_RAT (P08592), A4_SAISC (Q95241),
AMBP_PLEPL (P36992), APP2_HUMAN (Q06481), APP2_RAT (P15943),
AXP1_ANTAF (P81547), AXP2_ANTAF (P81548), BPT1_BOVIN (P00974),
BPT2_BOVIN (P04815), CA17_HUMAN (Q02388), CA36_CHICK (P15989),
CA36_HUMAN (P12111), CRPT_BOOMI (P81162), ELAC_MACEU (062845),
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ELAC_TRIVU (Q29143), EPPI_HUMAN (095925), EPPI_MOUSE (Q9DA01),
HTIB_MANSE (P26227), IBP_CARCR (P00993), IBPC_BOVIN (P00976),
IBPI_TACTR (P16044), IBPS_BOVIN (P00975), ICS3_BOMMO (P07481),
IMAP_DROFU (P11424), IP52_ANESU (P10280), ISC1_BOMMO (P10831),
ISC2_BOMMO (P10832), ISH1_STOHE (P31713), ISH2_STOHE (P81129),
ISIK_HELPO (P00994), ISP2_GALME (P81906), IVB1_BUNFA (P25660),
IVB1_BUNMU (P00987), IVB1_VIPAA (P00991), IVB2_BUNMU (P00989),
IVB2_DABRU (P00990), IVB2_HEMHA (P00985), IVB2_NAJNI (P00986),
IVB3_VIPAA (P00992), IVBB_DENPO (P00983), IVBC_NAJNA (P19859),
IVBC_OPHHA (P82966), IVBE_DENPO (P00984), IVBI_DENAN (P00980),
IVBI_DENPO (P00979), IVBK_DENAN (P00982), IVBK_DENPO (P00981),
IVBT_ERIMA (P24541), IVBT_NAJNA (P20229), MCPI_MELCP (P82968),
SBPI_SARBU (P26228), SPT3_HUMAN (P49223), TKD1_BOVIN (Q28201),
TKD1_SHEEP (Q29428), TXCA_DENAN (P81658), UPTI_PIG (Q29100),
AMBP_BOVIN (P00978), AMBP_HUMAN (P02760), AMBP_MERUN (Q62577),
AMBP_MESAU (Q60559), AMBP_MOUSE (Q07456), AMBP_PIG (P04366),
AMBP_RAT (Q64240), IATR_HORSE (P04365), IATR_SHEEP (P13371),
SPT1_HUMAN (043278), SPT1_MOUSE (Q9R097), SPT2_HUMAN (043291),
SPT2_MOUSE (Q9WU03), TFP2_HUMAN (P48307), TFP2_MOUSE (035536),
FPI_HUMAN (P10646), TFPI_MACMU (Q28864), TFPI_MOUSE (054819),
FPI_RABIT (P19761), TFPI_RAT (Q02445), YN81_CAEEL (Q03610)
Puede usarse una diversidad de procedimientos para identificar un dominio de Kunitz a partir de una base de datos de secuencias. Por ejemplo, una secuencia de aminoacidos conocida de un dominio de Kunitz, una secuencia de consenso, o un motivo (por ejemplo el motivo ProSite Motif) pueden contrastarse con las bases de datos de secuencias de GenBank (National Center for Biotechnology Information, National Institutes of Health, Bethesda, MD), por ejemplo, usando BLAST; con la base de datos Pfam de HMM (Modelos Ocultos de Markov) (por ejemplo, usando parametros por defecto para la busqueda en Pfam; con la base de datos SMART o con la base de datos ProDom. Por ejemplo, el numero de acceso Pfam PF00014 de la Publicacion 9 de Pfam proporciona numerosos dominios de Kunitz y un HMM para identificar dominios de Kunitz. Una descripcion de la base de datos Pfam puede encontrarse en Sonhammer et al. (1997) Proteins 28(3):405-420 y una descripcion detallada de los HMM puede encontrarse, por ejemplo, en Gribskov et al. (1990) Meth. Enzymol. 183:146-159; Gribskov et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4355-4358; Krogh et al. (1994) J. Mol. Biol. 235:1501-1531; y Stultz et al. (1993) Protein Sci. 2:305-314. La base de datos SMART (Simple Modular Architecture Research Tool, EMBL, Heidelberg, DE) de HMM tal como se describe por Schultz et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857 y Schultz et al. (2000) Nucl. Acids Res 28:231. La base de datos de SMART contiene dominios identificados mediante perfilado con los modelos de ocultos de Markov del programa de busqueda HMMer2 (R. Durbin et al. (1998) Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press). La base de datos tambien esta anotada y supervisada. La base de datos de dominios proteicos ProDom consiste en una compilacion automatica de dominios homologos (Corpet et al. (1999) Nucl. Acids Res. 27:263-267). Las versiones actuales de ProDom se construyen usando busquedas en PSI-BLAST recurrentes (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:33893402; Gouzy et al. (1999) Computers and Chemistry 23:333-340.) de las bases de datos de proteinas SWISS-PROT 38 y TREMBL. La base de datos genera automaticamente una secuencia de consenso para cada dominio. Prosite enumera el dominio de Kunitz como un motivo e identifica proteinas que incluyen un dominio de Kunitz. Vease, por ejemplo, Falquet et al. Nucleic Acids Res. 30:235-238(2002).
Los dominios de Kunitz interactuan con proteasa diana usando, principalmente, aminoacidos de dos regiones bucle ("bucles de union"). La primera region bucle se encuentra aproximadamente entre los residuos correspondientes a los aminoacidos 13-20 de BPTI. La segunda region bucle se encuentra aproximadamente entre los residuos correspondientes a los aminoacidos 31-39 de BPTI. Una biblioteca ejemplar de dominios de Kunitz varia una o mas posiciones de aminoacidos en la primera y/o la segunda regiones bucle. Las posiciones particularmente utiles para variar, cuando se criba para obtener dominios de Kunitz que interactuan con calicreina o cuando se seleccionan para determinar variantes de afinidad mejorada incluyen: posiciones 13, 15, 16, 17, 18, 19, 31, 32, 34 y 39 con respecto a la secuencia de BPTI. Se espera que por lo menos algunas de estas posiciones esten en contacto estrecho con la proteasa diana. Tambien es util variar otras posiciones, por ejemplo, posiciones que son adyacentes a las posiciones mencionadas anteriormente en la estructura tridimensional.
La "region estructural" de un dominio de Kunitz se define como aquellos residuos que son una parte del dominio de Kunitz, pero excluyendo especificamente residuos de las primera y segunda regiones bucles de union, es decir, aproximadamente los residuos correspondientes a los aminoacidos 13-20 de BPTI y 31-39 de BPTI. Inversamente, los residuos que no se encuentran en el bucle de union pueden tolerar un intervalo mas amplio de sustituciones de aminoacidos (por ejemplo, sustituciones conservativas y/o no conservativas).
En una forma de realizacion, estos dominios de Kunitz son formas variantes de la estructura en bucle incluido el dominio de Kunitz 1 de la proteina inhibidora de la coagulacion asociada a lipoproteina (LACI) humana. La LACI contiene tres estructuras de bucle peptidicas internas bien definidas que son paradigma de dominios de Kunitz
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(Girard, T. et al., 1989. Nature, 338:518-520). Las variantes del dominio de Kunitz 1 de LACI descritas en el presente documento se han cribado, aislado y unido a calicrefna con una afinidad y especificidad potenciadas (veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 5.795.865 y 6.057.287). Estos procedimientos tambien pueden aplicarse a otros marcos estructurales de dominios de Kunitz para obtener otros dominios de Kunitz que interactuan con calicrefna, por ejemplo, calicrefna plasmatica. Los moduladores utiles de calicrefna actuan normalmente uniendose a y/o inhibiendo la calicrefna, tal como se determina usando ensayos de union e inhibicion de calicrefna.
En algunos aspectos, un agente de union a calicrefna (por ejemplo una protefna de union, por ejemplo un polipeptido, por ejemplo polipeptidos inhibidores, por ejemplo un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo inhibidor, u otro agente de union, por ejemplo una molecula pequena) se une a la forma activa de calicrefna plasmatica. En algunas formas de realizacion, el agente de union a calicrefna, se une a, e inhibe, la calicrefna plasmatica, por ejemplo, calicrefna plasmatica humana y/o calicrefna murina.
Las protefnas de union a calicrefna plasmatica pueden ser de longitud completa (por ejemplo, una IgG (por ejemplo una IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (por ejemplo, IgA1, IgA2), IgD e IgE) o pueden incluir solo un fragmento de union a antfgeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv). La protefna de union puede incluir dos inmunoglobulinas de cadena pesada y dos inmunoglobulinas de cadena ligera, o puede ser un anticuerpo monocatenario. Las protefnas de union a calicrefna plasmatica pueden ser protefnas recombinantes tales como anticuerpos humanizados, injertados a CDR, quimericos, desinmunizados o generados in vitro y pueden incluir opcionalmente regiones constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de lfnea germinal. En una forma de realizacion, la protefna de union a calicrefna plasmatica es un anticuerpo monoclonal.
En algunas formas de realizacion, la protefna de union a calicrefna se une a, e inhibe, la calicrefna plasmatica, por ejemplo, calicrefna plasmatica humana y/o calicrefna murina. En la publication de Estados Unidos N° 20120201756 se divulgan protefnas de union a calicrefna plasmatica ejemplares. En algunas formas de realizacion, la protefna de union a calicrefna plasmatica es un anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligera y/o pesada de anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101 - A01 (tambien denominado en el presente documento DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (tambien denominado en el presente documento DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04. En algunas formas de realizacion, la protefna de union a calicrefna plasmatica compite con o se une al mismo epitope que M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (tambien denominado en el presente documento DX- 2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (tambien denominado en el presente documento DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04. En algunas formas de realizacion, la protefna de union a calicrefna plasmatica es DX-2930.
A continuation se proporcionan las secuencias de la region variable de cadena pesada y de cadena ligera de DX- 2930.
Region variable de cadena pesada de DX-2930:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYIMMWVRQAPGKGLEWVSGIYSSGGITVYADSVKGRF
TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAYRRIGVPRRDEFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:
6)
Region variable de cadena ligera de DX-2930:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSG
TEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEI (SEQ ID NO: 7)
En algunos aspectos, un polipeptido de union a calicrefna (por ejemplo, polipeptido inhibidor) se une a la forma activa de calicrefna plasmatica. En la patente de Estados Unidos N° 5.795.865, la patente de Estados Unidos N° 5.994.125, la patente de Estados Unidos N° 6.057.287, la patente de Estados Unidos N° 6.333.402, la patente de Estados Unidos N° 7.628.983 y la patente de Estados Unidos N° 8.283.321, la patente de Estados Unidos N° 7.064.107, la patente de Estados Unidos N° 7.276.480, la patente de Estados Unidos N° 7.851.442, la patente de Estados Unidos N° 8.124.586, la patente de Estados Unidos N° 7.811.991 y la publicacion de Estados Unidos N° 20110086801 se divulgan agentes de calicrefna plasmatica polipeptfdicos ejemplares. El algunas formas de realizacion, el polipeptido de union a calicrefna es DX-88 (un inhibidor de calicrefna de origen no natural, tambien conocido como KALBITOR® (ecalantida), SEQ ID NO: 8). El algunas formas de realizacion, el inhibidor de calicrefna comprende o consiste en una secuencia de aproximadamente 58 aminoacidos de los aminoacidos 3-60 de la SEQ ID NO: 8 o el polipeptido DX-88 que tiene la secuencia de 60 aminoacidos de la SEQ ID NO: 8.
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Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn lie Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe lie Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO:8)
En algunas formas de realizacion, la protefna de union a calicrefna plasmatica es EPIKAL-2 (SEQ ID NO: 9), que es un inhibidor de calicrefna de origen no natural que tiene una secuencia de 58 residuos de aminoacidos (correspondiente a los residuos 3-60 de SEQ ID NO: 8) y que tiene sustituciones de aminoacidos de Ile a Ser en el residuo 34 y Glu a Gly en el residuo 39. La secuencia de EPIKAL-2 se muestra a continuacion:
EpiKal2: Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO:9)
En algunas formas de realizacion, una protefna de union de calicrefna plasmatica puede tener aproximadamente el 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas de identidad de secuencia con respecto a la protefna de union descrita en el presente documento. En algunas formas de realizacion, una protefna de union a calicrefna plasmatica puede tener aproximadamente el 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas de identidad de secuencia en las regiones estructurales de HC y/o LC (por ejemplo, FR 1,2, 3 y/o 4 de HC y/o LC) con respecto a una protefna de union descrita en el presente documento. En algunas formas de realizacion, una protefna de union a calicrefna plasmatica puede tener aproximadamente el 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas de identidad de secuencia en las CDR de HC y/o LC (por ejemplo, CDR 1,2 y/o 3 de HC y/o LC) con respecto a una protefna de union descrita en el presente documento. En algunas formas de realizacion, una protefna de union de calicrefna plasmatica puede tener aproximadamente el 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas de identidad de secuencia en la region constante (por ejemplo, CH1, CH2, CH3 y/o CL1) con respecto a la protefna de union descrita en el presente documento.
En algunos aspectos, una molecula pequena se une a la forma activa de calicrefna plasmatica.
Antagonistas del receptor de bradiquinina B2
En algunas formas de realizacion, se administra a un sujeto un antagonista del receptor de bradiquinina B2. Los antagonistas del receptor de bradiquinina B2 ejemplares incluyen incatibant (Firazyr®), que es un farmaco peptidomimetico que contiene 10 aminoacidos que bloquean la union de bradiquinina nativa al receptor de bradiquinina B2.
Agentes de reemplazo de C1-INH
En algunas formas de realizacion, se administra a un sujeto un agente de reemplazo de C1-INH. Los agentes de reemplazo de C1-INH estan disponibles publicamente e incluyen, por ejemplo, Berinert®, que es un concentrado de C1-INH nanofiltrado, pasteurizado, humano purificado.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Quininogeno escindido
Sobre la base del analisis del sistema de contacto, el quininogeno escindido es un biomarcador adecuado para medir la activacion del sistema de contacto. Se ha demostrado previamente que el quininogeno escindido aumenta durante ataques de HAE, en cirrosis), y como consecuencia de la activacion del sistema de contacto durante la sepsis. Se cribaron bibliotecas de presentacion en fagos de anticuerpos frente al quininogeno escindido en combinacion con deplecion sobre quininogeno intacto. Paralelamente se inmunizaron ratones con quininogeno escindido y anticuerpos monoclonales obtenidos de lfneas celulares de hibridoma. Ambas actividades proporcionaron una serie de anticuerpos monoclonales diferentes que se unieron a quininogeno escindido y quininogeno intacto, pero ningun anticuerpo que se unio solo a quininogeno escindido.
Se cribaron una serie de anticuerpos para determinar su adecuabilidad en un analisis por inmunotransferencia Western y se identificaron algunos que operaban bien, que incluyen el mAb de raton (clon 11H05) mostrado en la figura 2. Es evidente que este ensayo es capaz de detectar quininogeno escindido en muestras de plasma humano. Ademas, los datos de la figura 2 confirman que la recogida de plasma en vidrio es suficiente para prevenir la
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activacion de contacto y la escision del quininogeno.
Tambien puede usarse un enfoque basado en espectrometria de masas para detectar quininogeno escindido en plasma de pacientes. En este enfoque, un producto inmunitario adsorbe quininogeno de la muestra del paciente, digiere proteoliticamente el quininogeno eluido y analiza fragmentos peptidicos por LC-MC.
Ejemplo 2: Quininogeno intacto y escindido
Se uso un analisis por inmunotransferencia Western para demostrar que el plasma de un paciente obtenido durante un ataque y recogido en tubos para plasma con citrato que contenian un coctel de antiproteasas muestra una reduccion en la cantidad de quininogeno intacto (es decir, monocatenario) (figura 3). Se observo un aumento en quininogeno escindido (es decir, bicatenario).
Ejemplo 3: Ensayo para medir niveles de quininogeno escindido
Se optimizo adicionalmente un ensayo por inmunotransferencia Western para la deteccion de quininogeno de alto peso molecular (HMWK) intacto (monocatenario) y escindido (bicatenario) usando deteccion Li-cor. Este ensayo descrito en el presente documento usa un anticuerpo monoclonal de raton (clon 11H05) que se genero mediante tecnologia de hibridoma inmunizando animales con HMWK bicatenario y cribando fusiones de hibridoma frente a HMWK monocatenario y bicatenario por ELISA. El mAb 11H05 se selecciono basandose en su rendimiento en un ensayo de inmunotransferencia Western y su capacidad para unirse especificamente a la cadena ligera y no unirse a la cadena pesada de HMWK. Se prefieren los que se unen a la cadena ligera debido a que la cadena ligera no esta presente en el otro quininogeno plasmatico (quininogeno de bajo peso molecular, LMWK), que no es un sustrato de pKal. El ensayo se uso tambien para demostrar la importancia de la recogida de plasma en tubos de plastico dado que la recogida en tubos de vidrio dio como resultado la activacion del sistema de contacto (figura 4).
En algunos ejemplos, se usaron los materiales y las condiciones siguientes en el ensayo de inmunotransferencia Western en el presente documento:
Materiales
• Minicelda XCell SureLock® Mini-Cell, Life Technologies (Invitrogen), N° de cat. EI0001
• Caja de gel (gel box)/fuente de alimentacion
• Dispositivo de inmunotransferencia Western iBlot®, Life Technologies (Invitrogen), N° de cat. IB1001
• Pila de transferencia iBlot®, nitrocelulosa, mini, Life Technologies (Invitrogen), N° de cat. IB301001
• Pipeta de multiples canales de Matrix Laboratories Impact-2, o equivalente
• Rainin Pipetman, intervalos de volumen variados, Rainin, N° de cat.: P-10, P-20, P-100, P-200 y P-1000, o equivalente
• Congelador a -80 °C con registrador grafico
• Congelador a -20 °C con registrador grafico
• Refrigerador a 2-8 °C con registrador grafico
• Sistemas de filtro de polietersulfona (PES) de 0,22 gm, Corning, N° de cat. 431096 o equivalente
• Agua desionizada y purificada (agua DI), Ricca Chemical, N° de cat. 9150-5, o equivalente
• Geles NuPAGE de tris-acetato al 7 %, 15 pocillos, Life Technologies (Invitrogen), N° de cat. EA03555Box
• Tampon de procesamiento SDS tris-acetato (20X), Life Technologies (Invitrogen), N° de cat. LA0041
• Agente reductor de muestra NuPAGE (10X), Life Technologies (Invitrogen), N° de cat. NP0009
• Tampon de muestra NuPAGE (4X), Life Technologies (Invitrogen), N° de cat. NP0007
• Geles NuPAGE de Bis-Tris al 4-12 %, 15 pocillos, Life Technologies (Invitrogen), N° de cat. NP0336BOX
• Tampon de procesamiento MES SDS (20X), Life Technologies (Invitrogen), N° de cat. NP0002
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• Tampon de bloqueo Odyssey, LI-COR, N° de cat. 927-40000
• Tween20, Sigma, N° de cat. P1379
• Solucion salina tamponada con fosfato, pH 7,4, Sigma, N° de cat. P-3813 o equivalente
• Tris, Fisher Scientific, N° de cat. T393-5000
• Cloruro de sodio, JT Baker, N° de cat. 3624-19
• Acido clorhidrico 6 N, EMD, N° de cat. HX0603M-6
• Tampon de acetato de sodio 3 M, pH 5,2, Teknova, N° de cat. S0296
• Albumina serica bovina (BSA), exenta de IgG y proteasa, Jackson ImmunoResearch, N° de cat. 001 -000-162
• Clon de anticuerpo anti-LC de HMWK monoclonal de raton, Clon 11H05 (N° 16), 1,4 mg/ml, Dyax
• IRDye 680RD antirraton de cabra, LI-COR, N° de cat. 926-68070
• Marcadores de peso molecular de un color Odyssey, LI-COR, N° de cat. 928-40000
• Coctel inhibidor de antiproteasas (10X), proporcionado por Dyax
• Factor XIIa, 1,47 mg/ml (21,6 pM), Enzyme Research Labs, proporcionado por Dyax
• Plasma deficiente en quininogeno, Hyphen-Biomed, proporcionado por Dyax
• HMWK monocatenario, 1,61 mg/ml, Enzyme Research Labs, N° de cat. HK 2700
• HMWK bicatenario, 2,01 mg/ml, Enzyme Research Labs, N° de cat. HK 2362
• Muestras de plasma humano normal, muestras de pacientes con HAE y muestras de Bioreclamation proporcionadas por Dyax
• DX2930, Dyax, N2 de lote: PURDX1-L01,32,1 mg/ml
• DX88, Dyax, N2 de lote: B2007-029, 10,1 mg/ml Esquema del protocolo:
Preparacion de muestra de ensayo no reducida
Se prepararon muestras de ensayo no reducidas anadiendo 5 pl de 4X tampon de muestra a 15 pl de muestras de ensayo a ~5 %. Las muestras se calentaron a 95 °C durante 5 minutos. Las muestras se centrifugaron brevemente para eliminar cualquier tipo de condensacion de la tapa del tubo de microcentrifugacion de la muestra de ensayo.
Carga y procesamiento de gel
Se procesaron muestras reducidas usando geles Bis-Tris al 4-12 % y se procesaron muestras no reducidas usando geles de Tris-acetato al 7 %. Se carga un marcador proteico de un color en el carril 1 de cada gel. Se carga una muestra QC en el carril 2 de cada gel. Se cargan muestras de ensayo reducidas y no reducidas en los carriles 315 del tipo de gel apropiado. Los geles se procesan a 125 V durante ~75 minutos.
Transferencia de gel
Cada gel se transfiere a una membrana de microcelulosa usando las pilas de transferencia iBlot, mini y el iBlot. Despues de anadir el gel y la pila de transferencia al iBlot, se selecciona el programa P0 y se procesa durante ~7 minutos. Despues de completar la transferencia, la membrana se transfiere a una bandeja de plastico que contiene 20 ml de tampon de bloqueo Odyssey.
Bloqueo de membrana
Las membranas se bloquean con 20 ml de tampon de bloqueo Odyssey. Las membranas se incuban con tampon de bloqueo sobre un agitador de placa durante 1 hora.
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Preparacion y adicion de mAb anti-LC de HMWK de raton
Se diluye mAb anti-LC de HMWK de raton a 1 pg/ml en tampon de bloqueo Odyssey que contiene el 0,2 % de Tween-20. El tampon de bloqueo se descarta de cada membrana. Se anade un volumen de 20 ml de la solucion de anticuerpo primario a 1 pg/ml a cada membrana y las membranas se incuban sobre un agitador de placa durante 1 hora a temperatura ambiente.
Preparacion y adicion de IRDye 680 antirraton de cabra
Se prepara IRDye 680 antirraton de cabra a una dilucion de 1:15.000. El IRDye 680 antirraton de cabra se prepara inicialmente a una dilucion de 1:10 seguida de 1:1.500 para una dilucion final de 1:15.000. El IRDye 680 antirraton de cabra se prepara en tampon de bloqueo Odyssey que contiene el 0,2 % de Tween-20. La solucion de anticuerpo secundario se anade a cada membrana y las membranas se incuban sobre un agitador de placa durante 1 hora a temperatura ambiente.
Lectura de la membrana
Despues de enjuagar con PBS, las membranas se disponen sobre el Li-Cor Odyssey y las membranas se leen.
Lavado de la membrana
Las membranas se lavan con PBS que contiene el 0,1 % de Tween-20 durante 5 minutos por lavado durante un total de cuatro lavados despues de la incubacion de anticuerpo primario y la incubacion de anticuerpo secundario.
Para evaluar la capacidad de mAb 11H05 para detectar HMWK monocatenario y bicatenario, las proteinas purificadas se anadieron a plasma deficiente en HMWK en concentraciones que incluyen niveles observados en plasma normal (figura 5). Fue evidente que en condiciones reductoras, 11H05 detecta HMWK monocatenario con una sensibilidad superior al bicatenario. Contando con la sensibilidad diferencial del mAb para las dos formas de HMWK, este ensayo pudo usarse para cuantificar con exactitud la concentracion de HMWK monocatenario y bicatenario en plasma del paciente. Como alternativa, el porcentaje de la senal del bicatenario puede determinarse en muestras de plasma sospechosas de implicar activacion de contacto y se compara con el del plasma de individuos sanos normales. Usando este ultimo enfoque, el ensayo pudo usarse para cribar muestras de diferentes enfermedades e identificar enfermedades asociadas con la activacion del sistema de contacto.
Tambien se realizaron ensayos de precision y exactitud inter e intra-ensayo. Tanto en condiciones no reductoras como en condiciones reductoras, el ensayo se realizo de forma aceptable produciendo porcentajes de valores CV < 25 % a lo largo de todos los parametros analizados.
Se realizaron tambien ensayos de estabilidad de congelacion-descongelacion en plasma humano normal. Se determino que el HMWK no parece degradarse entre 0 y 3 ciclos de congelacion-descongelacion.
El ensayo de inmunotransferencia Western se valido usando muestras de plasma de pacientes con angioedema hereditario (HAE), una enfermedad que se sabe que esta provocada por un exceso de activacion del sistema de contacto y de actividad de pKal. Tal como se muestra en la figura 6, el porcentaje de HMWK escindido en plasma con HAE es aproximadamente el 20 %, que es significativamente superior al de plasma normal. Durante un ataque de HAE, el porcentaje de HMWK escindido detectado usando este ensayo esta mas elevado. Estos datos demuestran claramente el aumento de HMWK escindido en plasma de HAE durante el estado de enfermedad quiescente (basal). Por lo tanto, el ensayo pudo usarse para supervisar la eficacia de inhibidores de pKal terapeuticos mediante una evaluacion del grado al que restauran niveles normales de quininogeno escindido.
Se sabe que las superficies o particulas cargadas negativamente tales como fosfolipidos o polifosfatos son activadores eficaces del sistema de contacto, que conduce a la formacion de pKal activo y la generacion de la bradiquinina a partir de la proteolisis de HMWK monocatenario. La identidad de la superficie fisiologica que conduce a la activacion del sistema de contacto en ataques de HAE no se conoce. No obstante, los ataques de HAE estan asociados con la generacion de FXIIa. El uso de FXIIa como iniciador del sistema de contacto, mas que de sustancias cargadas tales como sulfato de dextrano o caolin, posibilita una activacion del sistema de contacto mas reproducible y un rendimiento del ensayo optimizado. La concentracion de FXIIa y las condiciones de reaccion se determinaron para aproximar el porcentaje de quininogeno escindido que se observa en pacientes con HAE (~20- 50 %) (figura 7, tabla 1).
Tabla 1 - Intensidades de senal Li-cor de muestras de plasma humano tratado con FXIIa*
Comparacion reducida de condiciones de activacion de factor Xlla
Conc. de FXIIa (nM)
Temp. de incubacion Tiempo de incubacion (min) Mono- catenario Bicatenario (56 kDa) Bicatenario (46 kDa) Senal total % de bicatenario en el carril % de bicatenario a partir de la senal sin tratar
0
N/A N/A 29500 202 300 30002 1,7 % N/A
2,5
37 °C 10 21900 4010 2370 28280 22,6 % 25,8 %
2,5
37 °C 30 19500 4240 2370 26110 25,3 % 33,9 %
2,5
Hielo 10 20900 447 1220 22567 7,4 % 29,2 %
2,5
Hielo 30 8160 3380 3950 15490 47,3 % 72,3 %
5
37 °C 10 9020 4070 2950 16040 43,8 % 69,4 %
5
37 °C 30 8480 4070 3770 16320 48,0 % 71,3 %
5
Hielo 10 13300 3270 2780 19350 31,3 % 54,9 %
5
Hielo 30 2220 5220 9420 16860 86,8 % 92,5 %
7,5
37 °C 10 4200 5610 6920 16730 74,9 % 85,8 %
7,5
37 °C 30 4530 6310 7560 18400 75,4 % 84,6 %
7,5
Hielo 10 12100 2510 2520 17130 29,4 % 59,0 %
7,5
Hielo 30 260 4340 12300 16900 98,5 % 99,1 %
% de bicatenario en el carril: suma de senal de bicatenario/suma de senal del carril total % de bicatenario a partir de la senal sin tratar:
1 - (senal de monocatenario tratada/senal de monocatenario sin tratar)
*Analisis de senal de muestras a partir de inmunotransferencia Western en la figura 5.
Usando una concentracion de FXIIa 2,5 nM y condiciones de reaccion optimizadas, se examino plasma humano 5 normal de 15 varones y 15 mujeres en presencia o ausencia de 10 pg/ml de DX-2930 (un anticuerpo inhibidor potente de la actividad de pKal) y se determino el porcentaje de HMWK bicatenario (tabla 2). Es evidente que el ensayo es capaz de detectar la inhibicion de la calicreina plasmatica de proteolisis de HMWK en plasma. Se mostro que DX-2930 presenta una potencia aproximadamente equivalente en este ensayo a la ecalantida, un inhibidor de pKal aprobado para el tratamiento de ataques de HAE (figura 8). Una potencia igual a la de ecalantida en este 10 ensayo in vitro sugiere que niveles de farmaco equivalentes pueden ser igualmente eficaces en HAE.
Tabla 2. Porcentaje promedio de bicatenario en el carril, valores reducidos y no reducidos*
Po Muestra
rcentaje prom Xlla (nM) edio de bicatenario en DX2930 (pg/ml) el carril Reducidos No reducidos
Promedio varones
0 0 16,1 % 32,0 %
2,5
0 42,0 % 61,2 %
2,5
10 29,5 % 43,6 %
Promedio mujeres
0 0 9,6 % 21,5 %
2,5
0 43,8 % 50,2 %
2,5
10 26,4 % 30,3 %
15 *Promedio de plasma a partir de 15 varones y 15 mujeres.
Tambien se analizaron muestras de pacientes con colitis ulcerosa (UC) y artritis reumatoide (RA) usando el ensayo de inmunotransferencia de Western. Las muestras de plasma de pacientes se obtuvieron de Bioreclamation y se recogieron en tubos de plastico en anticoagulante. Se encontro que el porcentaje de quininogeno escindido era 20 elevado tanto en pacientes con UC como con RA en comparacion con pacientes de control normales (figura 9, tabla
Tabla 3. Resumen del analisis por inmunotransferencia Western de muestras con colitis ulcerosa y artritis reumatoide
Carril
Muestras en estado de enfermedad reducido en K2EDTA y citrato de sodio, colitis ulcerosa y artritis reumatoide
Muestra
Anticoagulante Enfermedad Senal de HMWK % de bicatenario en el carril
Monocatenario (110 kDa)
Bicatenario (56 kDa) Bicatenario (46 kDa) Senal total
1
Patrones de peso molecular n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a
2
Patrones de monocatenario y bicatenario n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a
3
A3005, N17 Antiproteasa Normal 20500 775 366 21641 5,3 %
4
BRH745075 Citrato de sodio Normal 18700 1340 802 20842 10,3 %
5
BRH745056 Citrato de sodio Normal 24200 893 782 25875 6,5 %
6
BRH715036 K2EDTA Colitis ulcerosa 17400 3030 1340 21770 20,1 %
7
BRH715037 Citrato de sodio Colitis ulcerosa 17400 1220 694 19314 9,9 %
8
BRH715038 Citrato de sodio Colitis ulcerosa N/A 2140 10300 12440 100,0 %
9
BRH715039 Citrato de sodio Colitis ulcerosa 14100 1700 596 16396 14,0 %
10
BRH715040 Citrato de sodio Colitis ulcerosa 13300 1170 2070 16540 19,6 %
11
BRH715041 K2EDTA Artritis reumatoide N/A N/A 4950 4950 100,0 %
12
BRH715042 K2EDTA Artritis reumatoide 88 N/A 9250 9338 99,1 %
13
BRH715043 K2EDTA Artritis reumatoide N/A N/A 6900 6900 100,0 %
14
BRH715044 Citrato de sodio Artritis reumatoide N/A N/A 2850 2850 100,0 %
15
BRH715045 Citrato de sodio Artritis reumatoide 6600 1860 1520 9980 33,9 %
Tambien se analizaron muestras de pacientes con enfermedad de Crohn (CD) usando el ensayo de inmunotransferencia Western. Las muestras de plasma de pacientes se obtuvieron de Bioreclamation y se recogieron en tubos de plastico en anticoagulante. Se encontro que el porcentaje de quininogeno escindido era 10 elevado en pacientes con CD en comparacion con pacientes de control normales (figura 10, tabla 4).
5
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35
Tabla 4. Resumen del analisis por inmunotransferencia Western de muestras con enfermedad de Crohn
Carril
Muestras en estado de enfermedad reducido en K2EDTA y citrato de sodio, colitis ulcerosa y artritis reumatoide
Muestra
Anticoagulante Enfermedad Senal de HMWK % de bicatenario en el carril
Monocatenario (150 kDa)
Monoca- tenario (110 kDa) Bicate- nario (56 kDa) Bicate- nario (46 kDa) Senal total
1
Patrones de peso molecular n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a
2
Patrones de monocatenario y bicatenario n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a
3
A2992, N14 Citrato de sodio Normal 704 12900 384 576 14564 6,6 %
4
BRH745047 Citrato de sodio Normal 1560 5820 192 7572 2,5 %
5
BRH745076 Citrato de sodio Normal 5720 12300 382 480 18882 4,6 %
6
BRH715026 K2EDTA Enfermedad de Crohn N/A 12100 1230 1950 15280 20,8 %
7
BRH715027 K2EDTA Enfermedad de Crohn N/A 16300 668 1550 18518 12,0 %
8
BRH715028 K2EDTA Enfermedad de Crohn N/A 6650 504 2250 9404 29,3 %
9
BRH715029 K2EDTA Enfermedad de Crohn 1900 14100 N/A 680 16680 4,1 %
10
BRH715030 K2EDTA Enfermedad de Crohn N/A 1320 3230 6020 10570 87,5 %
Ejemplo 4: Efectos de FXIIa y DX2930 sobre muestras de plasma humano normal (NHP)
Proposito:
El proposito de este experimento era determinar los efectos de DX-2930 sobre la activacion del sistema de contacto por FXIIa. El DX2930 puede inhibir la calicreina plasmatica, reduciendo la relacion bicatenario a monocatenario medida en respuesta al tratamiento con FXIIa. Las muestras de NHP en citrato de sodio de cinco varones y cinco mujeres se analizaron sin tratar, despues de activacion con FXIIa y despues de activacion con FXIIa cuando las muestras se habian pretratado con 10 pg/ml de DX-2930. Cada serie de muestras se analizo en condiciones no reducidas y reducidas.
Procedimiento:
Preparacion de la muestra
1. Se retiraron muestras de NHP del almacenamiento en congelacion y se dejaron estabilizar a temperatura ambiente. Se analizaron las muestras de NHP siguientes: BRH745050, BRH745051, BRH745052, BRH745053 y BRH745054. Se analizaron las muestras de mujeres siguientes: BRH745065, BRH745066, BRH745067, BRH745068 y BRH745069.
2. Se preparo DX2930 a 215 pg/ml anadiendo 3,35 pl de la solucion madre de DX2930 (N° de lote: PURDX1-L01, 32,1 mg/ml) a 496,65 pl de 1X TBS.
3. Se preparo un intermedio 1:10 de la solucion de FXIIa anadiendo 5 pl de la solucion madre de FXIIa (25.300 nM) a 45 pl de TBS. Se preparo una solucion de FXIIa 56,25 nM anadiendo 4,45 pl del intermedio 1:10 a 195,55 pl de TBS.
4. Cada una de las muestras de NHP se preparo con 10 pg/ml de DX2930 anadiendo 2 pl de la solucion de DX2930 de 215 pg/ml a 41 pl de NHP.
5. Cada una de las muestras de NHP se preparo con 2,5 nM de FXIIa anadiendo 2 pl de la solucion 56,25 nM de FXIIa a 43 pl de cada una de las muestras de NHP, con o sin DX2930.
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6. Las muestras se incubaron con FXIIa a 37 °C durante 10 minutos. La reaccion se detuvo anadiendo 5 pl de 10X inhibidores de antiproteasa.
7. Cada una de las muestras de NHP, con FXIIa, con DX2930 y FXIIa, y la muestra no tratada se diluyeron en plasma al 5 % anadiendo 5 pl de la muestra a 95 pl de TBS.
8. Se prepararon las muestras de ensayo no reducidas anadiendo 5 pl de 4X tampon de muestra a 15 pl de muestra.
9. Las muestras reducidas se prepararon anadiendo 5 pl del 4X tampon de muestra y 2 pl de 10X agente reductor a 13 pl de muestra.
10. Todas las muestras se calentaron a 95 °C durante 5 minutos usando un bloque calentador.
Carga, procesamiento y transferencia de gel
1. Se preparo un volumen de 1 l de tampon de procesamiento 1X Tris-Acetato SDS anadiendo 50 ml de tampon de procesamiento 20X Tris-Acetato SDS a 950 ml de agua DI.
2. Se preparo un volumen de 1 l de tampon de procesamiento 1X MES anadiendo 50 ml de tampon de procesamiento 20X MES SDS a 950 ml de agua DI.
3. Se preparo tampon de ensayo (tampon de bloqueo Odyssey con el 0,2 % de Tween) anadiendo 1 ml de Tween- 20 a 499 ml de tampon de bloqueo Odyssey.
4. Se preparo tampon de lavado (PBS con el 0,1 % de Tween) anadiendo 1 paquete de PBS y 1 ml de Tween-20 a 900 ml de agua DI. La solucion se mezclo bien y se llevo a 1 l usando agua DI. La solucion final se filtro a traves de un sistema de filtracion PES 0,22 pM.
5. Un volumen de 4 pl de un marcador proteico de un color se anadio al carril 1 de dos geles.
6. Se anadieron volumenes de 13 pl de muestras no reducidas a los carriles apropiados de un gel de Tris-Acetato al 7 %.
7. Se anadieron volumenes de 13 pl de muestras reducidas a los carriles apropiados de un gel de Bis-Tris al 412 %.
8. Los geles se procesaron a 125 voltios durante ~75 minutos.
9. Cada gel se transfirio individualmente a una membrana usando las minipilas de transferencia de iBlot y el programa P0 del sistema de transferencia iBlot.
10. Cada membrana se transfirio a una bandeja de plastico que contenia 20 ml de tampon de bloqueo Odyssey. Las membranas se incubaron en tampon de bloqueo Odyssey sobre un agitador de placa a temperatura ambiente durante 1 hora.
11. Se preparo una solucion de anticuerpo primario de 1 pg/ml anadiendo 28,58 pl de mAb anti-HMWK de raton, clon N° 11H05, 1,4 mg/ml a 29.971,42 pl de tampon de ensayo.
12. El tampon de bloqueo se retiro de las bandejas de plastico. Se anadio un volumen de 20 ml de la solucion de anticuerpo primario a cada bandeja y las membranas se incubaron sobre un agitador de placa a temperatura ambiente durante 1 hora.
13. Un intermedio 1:10 de IRDye 680 anti-IgG de raton de cabra se preparo anadiendo 5 pl de IRDye 680 de IgG antirraton de cabra a 45 pl de tampon de ensayo. La solucion de anticuerpo secundario se preparo a una dilucion de 1:15.000 anadiendo 26,66 pl del intermedio 1:10 de IRDye 680 de anti-IgG de raton de cabra a 39.973,34 pl de tampon de ensayo.
14. La solucion de anticuerpo primario se retiro de las bandejas.
15. Cada membrana se lavo durante cinco minutos con 20 ml de tampon de lavado y despues la solucion de lavado se descarto. El lavado se repitio durante un total de 4 lavados.
16. Se anadio un volumen de 20 ml de la solucion de anticuerpo secundario a cada bandeja y las membranas se incubaron sobre un agitador de placa a temperatura ambiente durante 1 hora.
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17. La solucion de anticuerpo secundario se retiro de las bandejas.
18. Cada membrana se lavo durante cinco minutos con 20 ml de tampon de lavado y despues la solucion de lavado se descarto. El lavado se repitio durante un total de 4 lavados.
19. Cada membrana se enjuago con PBS durante 5 minutos.
20. Las membranas se escanearon usando Li-cor Odyssey CLx.
Resultados:
Las tablas 5 y 6 contienen los datos de muestras no reducidas. Las tablas 7 y 8 contienen los datos de muestras reducidas. El porcentaje de HMWK escindido se calculo usando dos procedimientos. El porcentaje de bicatenario en el carril se determino usando la ecuacion siguiente: suma de senal de bicatenario/suma de senal del carril total. El porcentaje de bicatenario de la senal no tratada se determino usando la formula siguiente: 1 - (senal de monocatenario tratada/senal de monocatenario no tratada). Las muestras tratadas y no tratadas se prepararon de forma ligeramente diferente, dado que las muestras no tratadas tenian un porcentaje ligeramente superior de plasma en la preparacion de muestra. Por lo tanto, las muestras no tratadas produjeron senales en general ligeramente superiores que las muestras tratadas. El porcentaje de valor de bicatenario en el carril se uso para determinar el porcentaje de HWMK escindido debido a la preparacion de muestra ligeramente diferente entre muestras tratadas y no tratadas.
La tabla 16 contiene un resumen de los resultados de activacion y de inhibicion. En condiciones reducidas, las muestras no tratadas de NHP de varones y mujeres contenian un promedio del 16,1 % y del 9,6 % de HMWK escindido respectivamente. Las muestras de NHP de varones y mujeres tratadas con FXIIa contenian un promedio del 42,0 % y el 43,8 % de HMWK escindido, respectivamente. Las muestras de NHP de varones y mujeres pretratadas con DX-2930 y tratadas despues con FXIIa contenian un promedio del 29,5 % y el 26,4 % de HMWK escindido, respectivamente.
En condiciones no reducidas, las muestras no tratadas de NHP de varones y mujeres contenian un promedio del 32,0 % y del 21,5 % de HMWK escindido respectivamente. Las muestras de NHP de varones y mujeres tratadas con FXIIa contenian un promedio del 61,2 % y el 50,2 % de HMWK escindido, respectivamente. Las muestras de NHP de varones y mujeres pretratadas con DX-2930 y tratadas despues con FXIIa contenian un promedio del 43,6 % y el 30,3 % de HMWK escindido, respectivamente.
Conclusion:
El tratamiento de muestras de NHP con FXIIa aumento el porcentaje de HMWK escindido en comparacion con muestras no tratadas. Las muestras de NHP que se pretrataron con DX-2930, operacion seguida de la activacion con FXIIa, produjeron menos HMWK escindido que las muestras tratadas con solo FXIIa, pero un porcentaje ligeramente superior de HMWK escindido en comparacion con muestras no tratadas. Las muestras de NHP no tratadas reducidas contenian menos HMWK escindido que las muestras de NHP no tratadas no reducidas. Se encontro tambien que las muestras de NHP no tratadas, tratadas con FXIIa y pretratadas con DX2930 y tratadas despues con FXIIa produjeron resultados reproducibles.
Activa
cion no re ducida de NHP de varones con factor XIIa, inhibicion Senal de HMWK de factor XIIa con DX2 930 % de bicatenario a partir de la senal sin tratar
Muestra de NHP de varones
FXIIa (nM) DX2930 (pg/ml) Monocatenario (120kDa) Bicatenario (100 kDa) Bicatenario (90 kDa) Senal total % de bicatenario en el carril
BRH745050
0 0 17900 4670 0 22570 20,7 % N/A
BRH745050
2,5 0 8160 7750 1770 17680 53,8 % 54,4 %
BRH745050
2,5 10 12600 6620 812 20032 37,1 % 29,6 %
BRH745051
0 0 19600 3450 0 23050 15,0 % N/A
BRH745051
2,5 0 10000 9430 2140 21570 53,6 % 49,0 %
BRH745051
2,5 10 15300 6480 915 22695 32,6 % 21,9 %
BRH745052
0 0 22500 8570 1100 32170 30,1 % N/A
BRH745052
2,5 0 11000 10700 3050 24750 55,6 % 51,1 %
BRH745052
2,5 10 16500 8500 1500 26500 37,7 % 26,7 %
BRH745053
0 0 6370 13100 7390 26860 76,3 % N/A
BRH745053
2,5 0 1710 8310 10500 20520 91,7 % 73,2 %
BRH745053
2,5 10 4360 9310 6490 20160 78,4 % 31,6 %
BRH745054
0 0 27100 5900 0 33000 17,9 % N/A
BRH745054
2,5 0 11500 9880 2270 23650 51,4 % 57,6 %
BRH745054
2,5 10 15100 6280 814 22194 32,0 % 44,3 %
% de bicatenario en el carril: suma de senal de bicatenario/suma de senal del carril total % de bicatenario a partir de la senal sin tratar:
1 - (senal de monocatenario tratada/senal de monocatenario no tratada)
Activa
cion no re ducida de NHP de mujeres con factor XIIa, inhibicion Senal de HMWK de factor XIIa con DX2 930 % de bicatenario a partir de la senal sin tratar
Muestra de NHP de mujeres
FXIIa (nM) DX2930 (pg/ml) Monocatenario (120kDa) Bicatenario (100 kDa) Bicatenario (90 kDa) Senal total % de bicatenario en el carril
BRH745065
0 0 14700 2500 161 17361 15,3 % N/A
BRH745065
2,5 0 4750 5550 3160 13460 64,7 % 67,7 %
BRH745065
2,5 10 10500 3270 453 14223 26,2 % 28,6 %
BRH745066
0 0 23200 4460 17,4 27677 16,2 % N/A
BRH745066
2,5 0 14200 10600 1780 26580 46,6 % 38,8 %
BRH745066
2,5 10 15100 5920 205 21225 28,9 % 34,9 %
BRH745067
0 0 26000 8610 300 34910 25,5 % N/A
BRH745067
2,5 0 13700 9470 1410 24580 44,3 % 47,3 %
BRH745067
2,5 10 19800 8880 795 29475 32,8 % 23,8 %
BRH745068
0 0 25400 9180 211 34791 27,0 % N/A
BRH745068
2,5 0 14200 12500 2610 29310 51,6 % 44,1 %
BRH745068
2,5 10 15800 7350 708 23858 33,8 % 37,8 %
BRH745069
0 0 20900 6470 0 27370 23,6 % N/A
BRH745069
2,5 0 17000 11500 1820 30320 43,9 % 18,7 %
BRH745069
2,5 10 21600 8960 198 30758 29,8 % -3,3 %
% de bicatenario en el carril: suma de senal de bicatenario/suma de senal del carril total % de bicatenario a partir de la senal sin tratar:
1 - (senal de monocatenario tratada/senal de monocatenario no tratada)
Activ
acion rec ucida de >JHP de varones con factor XIIa, inhibicion d Senal de HMWK e factor X IIa con DX293 0 % de bicatenario a partir de la senal sin tratar
Muestra de NHP de varones
FXIIa (nM) DX2930 (pg/ml) Monocatenario Bicatenario (56 kDa) Bicatenario (46 kDa) Senal total % de bicatenario en el carril
BRH745050
0 0 28300 0 0 28300 0,0 % N/A
BRH745050
2,5 0 14400 3360 2620 20380 29,3 % 49,1 %
BRH745050
2,5 10 19200 2560 1430 23190 17,2 % 32,2 %
BRH745051
0 0 26800 0 0 26800 0,0 % N/A
BRH745051
2,5 0 12800 2950 2580 18330 30,2 % 52,2 %
BRH745051
2,5 10 13900 2100 1210 17210 19,2 % 48,1 %
BRH745052
0 0 17800 853 1500 20153 11,7 % N/A
BRH745052
2,5 0 12100 2980 3250 18330 34,0 % 32,0 %
BRH745052
2,5 10 16900 2790 2190 21880 22,8 % 5,1 %
BRH745053
0 0 7280 4340 8430 20050 63,7 % N/A
BRH745053
2,5 0 3180 5620 9240 18040 82,4 % 56,3 %
BRH745053
2,5 10 6420 5470 6660 18550 65,4 % 11,8 %
BRH745054
0 0 22100 625 586 23311 5,2 % N/A
BRH745054
2,5 0 9610 2660 2020 14290 32,8 % 56,5 %
BRH745054
2,5 10 12500 2010 1300 15810 20,9 % 43,4 %
% de bicatenario en el carril: suma de senal de bicatenario/suma de senal del carril total % de bicatenario a partir de la senal sin tratar:
1 - (senal de monocatenario tratada/senal de monocatenario no tratada)
Activ
acion rec ucida de JHP de mujeres con factor XIIa, inhibicion d Senal de HMWK e factor X IIa con DX293 0 % de bicatenario a partir de la senal sin tratar
Muestra de NHP de mujeres
FXIIa (nM) DX2930 (pg/ml) Monocatenario Bicatenario (56 kDa) Bicatenario (46 kDa) Senal total % de bicatenario en el carril
BRH745065
0 0 17300 2080 1240 20620 16,1 % N/A
BRH745065
2,5 0 4100 4880 3450 12430 67,0 % 76,3 %
BRH745065
2,5 10 9770 3740 1960 15470 36,8 % 43,5 %
BRH745066
0 0 21300 1770 753 23823 10,6 % N/A
BRH745066
2,5 0 9710 4280 2760 16750 42,0 % 54,4 %
BRH745066
2,5 10 13600 3990 1780 19370 29,8 % 36,2 %
BRH745067
0 0 21900 375 1850 24125 9,2 % N/A
BRH745067
2,5 0 11900 5120 3430 20450 41,8 % 45,7 %
BRH745067
2,5 10 19000 3610 2440 25050 24,2 % 13,2 %
BRH745068
0 0 29400 525 966 30891 4,8 % N/A
BRH745068
2,5 0 19600 5660 5130 30390 35,5 % 33,3 %
BRH745068
2,5 10 25100 4050 3260 32410 22,6 % 14,6 %
BRH745069
0 0 19900 500 688 21088 5,6 % N/A
BRH745069
2,5 0 12000 2910 2560 17470 31,3 % 39,7 %
BRH745069
2,5 10 15000 1790 1350 18140 17,3 % 24,6 %
% de bicatenario en el carril: suma de senal de bicatenario/suma de senal del carril total % de bicatenario a partir de la senal sin tratar:
1 - (senal de monocatenario tratada/senal de monocatenario no tratada)
5 Tabla 9. Porcentaje promedio de bicatenario en el carril, valores reducidos y no reducidos
Porcentaje promedio de bicatenario en el carril
Muestra
XIIa (nM) DX2930 (pg/ml) Reducidos No reducidos
Promedio varones
0 0 16,1 % 32,0 %
2,5
0 42,0 % 61,2 %
2,5
10 29,5 % 43,6 %
Promedio mujeres
0 0 9,6 % 21,5 %
2,5
0 43,8 % 50,2 %
2,5
10 26,4 % 30,3 %
Ejemplo 6. Inhibicion de la activacion de FXIIa usando DX-2930 y DX-88
10 Proposito:
El proposito de este experimento era determinar los efectos de DX-2930 y DX-88 sobre la inhibicion de la activacion con el FXIIa. Se analizo DX-2930 a 5 concentraciones: 200, 100, 30, 12 y 5 pg/ml. Se analizo DX-88 a 5 concentraciones: 9,4, 4,7, 1,4, 0,56 y 0,24 pg/ml. Las muestras pretratadas con DX-2930 y DX-88 se trataron con 15 FXIIa. Ademas de las muestras pretratadas, se analizaron una muestra no tratada y dos muestras tratadas solo con FXIIa. Las muestras se analizaron en condiciones reducidas.
Procedimiento:
20 1. Se preparo una mezcla de NHP anadiendo 250 pl de cada muestra de plasma, BRH745070, BRH745071 y
BRH745048, a un tubo de microcentrifugacion de 1,5 ml y se mezclo bien.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
2. Se preparo una solucion de 4500 pg/ml de DX2930 anadiendo 4,21 pi de la solucion madre de DX2930 (32,1
mg/ml) a 25,79 pi de TBS. Se preparo una solucion de 2250 pg/ml de DX2930 anadiendo 15 pi de la solucion de 4500 pg/ml a 15 pl de TBS. Se preparo una solucion de 675 pg/ml de DX2930 anadiendo 6 pl de la solucion de
2250 pg/ml a 14 pl de TBS. Se preparo una solucion de 270 pg/ml de DX2930 anadiendo 8 pl de la solucion de
675 pg/ml a 12 pl de TBS. Se preparo una solucion de 112,5 pg/ml de DX2930 anadiendo 10 pl de la solucion de 270 pg/ml a 14 pl de TBS.
3. Se prepararon cinco muestras de plasma pretratadas con DX-2930 anadiendo 2 pl de cada solucion de DX2930 a 41 pl de la mezcla de NHP.
4. Se preparo una solucion de 211,5 pg/ml de DX88 anadiendo 6,28 pl de la solucion madre de DX88 (10,1 mg/ml)
a 293,72 pl de TBS. Se preparo una solucion de 105,75 pg/ml de DX88 anadiendo 15 pl de la solucion de 211,5 pg/ml a 15 pl de TBS. Se preparo una solucion de 31,5 pg/ml de DX88 anadiendo 8,94 pl de la solucion de 105,75 pg/ml a 21,06 pl de TBS. Se preparo una solucion de 12,6 pg/ml de DX88 anadiendo 12 pl de la solucion de 31,5
pg/ml a 18 pl de TBS. Se preparo una solucion de 5,4 pg/ml de DX88 anadiendo 12,86 pl de la solucion de 12,6
pg/ml a 17,14 pl de TBS.
5. Se prepararon cinco muestras de plasma pretratadas con DX-88 anadiendo 2 pl de cada solucion de DX-88 a 41 pl de la mezcla de NHP.
6. Se preparo un intermedio 1:10 de FXIIa anadiendo 5 pl de la solucion madre (25.300 nM) a 45 pl de TBS. Se preparo una solucion de FXIIa 56,25 nM anadiendo 4,45 pl del intermedio 1:10 a 195,55 pl de TBS.
7. Cada una de las muestras de plasma pretratadas con DX2930 y DX88 se trato con 2,5 nM de FXIIa anadiendo 2 pl de la solucion de FXIIa 56,25 nM a cada una de las muestras.
8. Se prepararon dos muestras que contenian FXIIa anadiendo 2 pl de TBS y 2 pl de la solucion de FXIIa 56,25 nM a 41 pl del conjunto de NHP.
9. Se preparo una muestra no tratada anadiendo 4 pl de TBS a 41 pl del conjunto de NHP.
10. Se incubaron todas las muestras que contenian FXIIa a 37 °C durante 10 minutos.
11. Se anadio un volumen de 5 pl de inhibidores de antiproteasa a cada muestra incluida la muestra no tratada. El volumen de muestra total para cada replicado fue de 50 pl.
12. Cada muestras se diluyo a ~5 % de plasma anadiendo 5 pl de la muestra a 95 pl de TBS.
13. Las muestras se prepararon anadiendo 5 pl del 4X tampon de muestra y 2 pl de 10X agente reductor a 13 pl de muestra.
14. Todas las muestras se calentaron a 95 °C durante 5 minutos usando un bloque calentador.
15. Un volumen de 1 l de tampon de procesamiento 1X MES se preparo anadiendo 50 ml de tampon de procesamiento 20X MES SDS a 950 ml de agua DI.
16. Se preparo tampon de ensayo (tampon de bloqueo Odyssey con el 0,2 % de Tween) anadiendo 1 ml de Tween-20 a 499 ml de tampon de bloqueo Odyssey.
17. Se preparo tampon de lavado (PBS con el 0,1 % de Tween) anadiendo 1 paquete de PBS y 1 ml de Tween-20 a 900 ml de agua DI. La solucion se mezclo bien y se llevo a 1 l usando agua DI. La solucion final se filtro a traves de un sistema de filtracion PES 0,22 pM.
18. Un volumen de 4 pl de un marcador proteico de un color se anadio al carril 1 de dos geles.
19. Se anadieron volumenes de 13 pl de muestras reducidas a los carriles apropiados de un gel de Bis-Tris al 4-
12 %.
20. El gel se proceso a 125 voltios durante ~75 minutos.
21. Cada gel se transfirio a una membrana usando la minipila de transferencia de iBlot y el programa P0 del sistema de transferencia de iBlot.
22. La membrana se transfirio a una bandeja de plastico que contenia 20 ml de tampon de bloqueo Odyssey. La membrana se incubo en tampon de bloqueo Odyssey sobre un agitador de placa a temperatura ambiente durante
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1 hora.
23. Se preparo una solucion de anticuerpo primario de 1 pg/ml anadiendo 14,29 pi de mAb anti-HMWK de raton, clon N° 11H05, 1,4 mg/ml a 19.985,7 pi de tampon de ensayo.
24. El tampon de bloqueo se retiro de la bandeja de plastico. Se anadio un volumen de 20 ml de la solucion de anticuerpo primario a la membrana y se incubo sobre un agitador de placa a temperatura ambiente durante 1 hora.
25. Un intermedio 1:10 de IRDye 680 de anti-IgG de raton de cabra se preparo anadiendo 5 pl de IRDye 680 anti- IgG de raton de cabra a 45 pl de tampon de ensayo. La solucion de anticuerpo secundario se preparo a una dilucion de 1:15.000 anadiendo 13,33 pl del intermedio 1:10 de IRDye 680 anti-IgG de raton de cabra a 19.986,7 pl de tampon de ensayo.
26. La solucion de anticuerpo primario se retiro de la bandeja.
27. La membrana se lavo durante cinco minutos con 20 ml de tampon de lavado y despues la solucion de lavado se descarto. El lavado se repitio durante un total de 4 lavados.
28. Se anadio un volumen de 20 ml de la solucion de anticuerpo secundario a la membrana y se incubo sobre un agitador de placa a temperatura ambiente durante 1 hora.
29. La solucion de anticuerpo secundario se retiro de la bandeja.
30. La membrana se lavo durante cinco minutos con 20 ml de tampon de lavado y despues la solucion de lavado se descarto. El lavado se repitio durante un total de 4 lavados.
31. La membrana se enjuago con PBS durante 5 minutos.
32. La membrana se analizo usando Li-cor Odyssey CLx.
Resultados:
La tabla 10 contiene los resultados para el experimento de inhibicion con DX-2930 y DX-88. El porcentaje de bicatenario se calculo dentro de cada carril y se calculo mediante comparacion de la senal sin tratar con la senal tratada. Para esta comparacion, se uso el porcentaje de bicatenario en el carril. El conjunto de NHP no tratado produjo un porcentaje de valor de bicatenario del 3,8 %. Cuando el conjunto de NHP se trato solo con FXIIa, las dos muestras replicadas produjeron porcentajes de valores de bicatenario del 24,4 %. Las muestras pretradas con DX- 2930 produjeron porcentajes de valores de bicatenario ligeramente inferiores en comparacion con las muestras preparadas con DX-88. Las muestras pretratadas con 5 pg/ml de DX-2930 y 0,24 pg/ml de DX-88 produjeron porcentajes de valores de bicatenario del 22,3 % y del 23,9 % respectivamente. Estos valores son muy proximos al porcentaje de valor de bicatenario en la muestra tratada solo con FXIIa.
Conclusion:
Las muestras pretratadas con DX-2930 produjeron un porcentaje ligeramente inferior de valores de bicatenario que las muestras pretratadas con DX-88.
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Inh ibicion d e la activacion de contacto de FXIIa usando DX-88 y [ Senal de HMWK X-2930
FXIIa (nM)
DX2930 (gg/ml) DX88 (gg/ml) Monocatenario (110 kDa) Bicatenario (56 kDa) Bicatenario (46 kDa) Senal total % de bicatenario en el carril % de bicatenario a partir de la senal sin tratar
0,00
0,00
000 26600 413 643 27656 3,8 % N/A
2,50
0,00 0,00 20500 3920 2690 27110 24,4 % 22,9 %
2,50
0,00 0,00 21200 4470 2390 28060 24,4 % 20,3 %
2,50
200,00 0,00 27200 376 576 28152 3,4 % -2,3 %
2,50
100,00 0,00 25300 206 212 25718 1,6 % 4,9 %
2,50
30,00 0,00 24700 784 1470 26954 8,4 % 7,1 %
2,50
12,00 0,00 23200 3170 1560 27930 16,9 % 12,8 %
2,50
5,00 0,00 20100 3630 2140 25870 22,3 % 24,4 %
2,50
0,00 9,40 22600 615 663 23878 5,4 % 15,0 %
2,50
0,00 4,70 22500 349 592 23441 4,0 % 15,4 %
2,50
0,00 1,40 21500 2210 1270 24980 13,9 % 19,2 %
2,50
0,00 0,56 20600 3340 1990 25930 20,6 % 22,6 %
2,50
0,00 0,24 19500 3910 2200 25610 23,9 % 26,7 %
% de bicatenario en el carril: suma de senal de bicatenario/suma de senal del carril total % de bicatenario a partir de la senal sin tratar:
1 - (senal de monocatenario tratada/senal de monocatenario no tratada)
Ejemplo 7. Determinacion de niveles de quininogeno escindido en muestras de pacientes con HAE, RA, UC y CD
Proposito:
El proposito de este experimento era evaluar muestras de plasma tratado con antiproteasa de pacientes con angioedema hereditario (HAE). Se analizaron dos muestras con HAE de cada paciente, una muestra basal y una muestra de ataque. Las muestras se analizaron en condiciones reducidas y en condiciones no reducidas. Ademas, se analizaron muestras de pacientes a los que se diagnostico enfermedad de Crohn, artritis reumatoide y colitis ulcerosa. Tambien se analizaron muestras de plasma humano normal. Las muestras adicionales se analizaron solo en condiciones reducidas.
Procedimiento:
1. Se analizaron seis conjuntos de muestras de pacientes con HAE. Cada muestra de plasma se preparo anadiendo 5 gl de muestra a 95 gl de TBS.
2. Se analizaron cinco muestras de plasma con enfermedad de Crohn, cinco muestras de plasma con artritis reumatoide y cinco muestras con colitis ulcerosa. Cada muestra de plasma se preparo anadiendo 5 gl de muestra a 95 gl de TBS.
3. Se prepararon siete muestras de plasma humano normal para su uso como controles anadiendo 5 gl de muestra a 95 gl de TBS.
4. Se prepararon muestras de ensayo no reducidas anadiendo 5 gl de 4X tampon de muestra a 15 gl de muestra.
5. Se prepararon muestras reducidas anadiendo 5 gl del 4X tampon de muestra y 2 gl de 10X agente reductor a 13 gl de muestra.
6. Todas las muestras se calentaron a 95 °C durante 5 minutos usando un bloque calentador.
7. Un volumen de 1 l de tampon de procesamiento 1X Tris-Acetato SDS se preparo anadiendo 50 ml de tampon
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de procesamiento 20X Tris-Acetato SDS a 950 ml de agua DI.
8. Un volumen de 2 l de tampon de procesamiento 1X MES se preparo anadiendo 100 ml de tampon de procesamiento 20X MES SDS a 1900 ml de agua DI.
9. Se preparo tampon de ensayo (tampon de bloqueo Odyssey con el 0,2 % de Tween) anadiendo 2 ml de Tween- 20 a 998 ml de tampon de bloqueo Odyssey.
10. Se preparo tampon de lavado (PBS con el 0,1 % de Tween) anadiendo 1 paquete de PBS y 1 ml de Tween-20 a 900 mL de agua DI. La solucion se mezclo bien y se llevo a 1 l usando agua DI. La solucion final se filtro a traves de un sistema de filtracion PES 0,22 pM.
11. Un volumen de 4 pl de un marcador proteico de un color se anadio al carril 1 de cuatro geles.
12. Se anadieron volumenes de 13 pl de muestras no reducidas a los carriles apropiados de un gel de Tris-Acetato al 7 %.
13. Se anadieron volumenes de 13 pl de muestras reducidas a los carriles apropiados de geles de Bis-Tris al 412 %.
14. Los geles se procesaron a 125 voltios durante ~75 minutos.
15. Cada gel se transfirio individualmente a una membrana usando las minipilas de transferencia de iBlot y el programa P0 del sistema de transferencia de iBlot.
16. Cada membrana se transfirio a una bandeja de plastico que contenia 20 ml de tampon de bloqueo Odyssey. Las membranas se incubaron en tampon de bloqueo Odyssey sobre un agitador de placa a temperatura ambiente durante 1 hora.
17. Se preparo una solucion de anticuerpo primario de 1 pg/ml anadiendo 57,14 pl de mAb anti-HMWK de raton, clon N° 11H05, 1,4 mg/ml a 79.942,86 pl de tampon de ensayo.
18. El tampon de bloqueo se retiro de las bandejas de plastico. Se anadio un volumen de 20 ml de la solucion de anticuerpo primario a cada bandeja y las membranas se incubaron sobre un agitador de placa a temperatura ambiente durante 1 hora.
19. Un intermedio 1:10 de IRDye 680 anti-IgG de raton de cabra se preparo anadiendo 10 pl de IRDye 680 anti- IgG de raton de cabra a 90 pl de tampon de ensayo. La solucion de anticuerpo secundario se preparo a una dilucion de 1:15.000 anadiendo 53,33 pl del intermedio 1:10 de IRDye 680 anti-IgG de raton de cabra a 79.946,67 pl de tampon de ensayo.
20. La solucion de anticuerpo primario se retiro de las bandejas.
21. Cada membrana se lavo durante cinco minutos con 20 ml de tampon de lavado y despues la solucion de lavado se descarto. El lavado se repitio durante un total de 4 lavados.
22. Se anadio un volumen de 20 ml de la solucion de anticuerpo secundario a cada bandeja y las membranas se incubaron sobre un agitador de placa a temperatura ambiente durante 1 hora.
23. La solucion de anticuerpo secundario se retiro de las bandejas.
24. Cada membrana se lavo durante cinco minutos con 20 ml de tampon de lavado y despues la solucion de lavado se descarto. El lavado se repitio durante un total de 4 lavados.
25. Cada membrana se enjuago con PBS durante 5 minutos.
26. Las membranas se escanearon usando Li-cor Odyssey CLx.
Resultados:
Como se esperaba, la mayor parte de las muestras de pacientes mostraron un nivel elevado de HMWK bicatenario en las muestras de ataques a diferencia de en las muestras basales. Las tablas 11 y 12 contienen los datos de HAE para este experimento. La tabla 13 contiene el conjunto de datos para muestras de pacientes con colitis ulcerosa y artritis reumatoide. La tabla 14 contiene los datos para las muestras de pacientes con enfermedad de Crohn.
Tabla 11. Muestras de pacientes con HAE no reducidas, senales de HMWK, basales y de ataque, porcentaje de bicatenario en el carril
Muest Paciente ID
ras de pacie Pacientes iniciales tes con HAE no r HAE ducidas 120 kDa con anti Senal d 100 kDa proteas e HMWI 90 kDa a, basales K Senal total f de ataque % de bicatenario en el carril
A3009
N18 Normal 15500 3750 N/A 19250 19,5 %
A4970
AC Basal 13000 4300 240 17540 25,9 %
A4908
AC De ataque 9450 5910 1740 17100 44,7 %
A5564
BB Basal 15900 5650 585 22135 28,2 %
A5353
BB De ataque 11600 10500 2340 24440 52,5 %
A4607
FF Basal 11400 4850 N/A 16250 29,8 %
A4619
FF De ataque 6770 6750 2090 15610 56,6 %
A5346
DG Basal 10800 3850 102 14752 26,8 %
A5422
DG De ataque 5650 2080 133 7863 28,1 %
A4183
PC Basal 9530 1190 N/A 10720 11,1 %
A4671
PC De ataque 8840 1570 N/A 10410 15,1 %
A5248
GR Basal 14300 4270 44,1 18614,1 23,2 %
A2315
GR De ataque 11600 4610 490 16700 30,5 %
% de bicatenario en el carril: suma de senal de bicatenario/suma de senal del carril total
5 Tabla 12. Muestras de pacientes con HAE reducidas, senales de HMWK, basales y de ataque, porcentaje de bicatenario en el carril
Mues Paciente ID
tras de paci Pacientes iniciales entes con HAE red HAE ucidas c 110 kDa on antipr Senal d 56 kDa oteasa, e HMWI 46 kDa basales y K Senal total de ataque % de bicatenario en el carril
A3009
N18 Normal 18700 802 926 20428 8,5 %
A4970
AC Basal 14500 2980 1480 18960 23,5 %
A4908
AC De ataque 8500 3540 2670 14710 42,2 %
A5564
BB Basal 12400 3160 1380 16940 26,8 %
A5353
BB De ataque 8980 3980 2620 15580 42,4 %
A4607
FF Basal 10900 2490 1620 15010 27,4 %
A4619
FF De ataque 6130 3930 2520 12580 51,3 %
A5346
DG Basal 11200 2400 709 14309 21,7 %
A5422
DG De ataque 7900 2640 749 11289 30,0 %
A4183
PC Basal 13900 1850 572 16322 14,8 %
A4671
PC De ataque 13500 2120 572 16192 16,6 %
A5248
GR Basal 19000 2120 1160 22280 14,7 %
A2315
GR De ataque 16400 3660 1580 21640 4,2 %
% de bicatenario en el carril: suma de senal de bicatenario/suma de senal del carril total
Tabla 13. Muestras de plasma de individuos con colitis ulcerosa y artritis reumatoide, senales HMWK, porcentaje de bicatenario en el carril
Muestras en estado de enfermedad reducido en K2EDTA y citrato de sodio, colitis ulcerosa y artritis reumatoide
Senal de HMWK
Muestra
Anticoagulante Enfermedad Monocatenario (110 kDa) Bicatenario (56 kDa) Bicatenario (46 kDa) Senal total % de bicatenario en el carril
A3005, N17
Antiproteasa Normal 20500 775 366 21641 5,3 %
BRH745075
Citrato de sodio Normal 18700 1340 802 20842 10,3 %
BRH745056
Citrato de sodio Normal 24200 893 782 25875 6,5 %
BRH715036
K2EDTA Colitis ulcerosa 17400 3030 1340 21770 20,1 %
BRH715037
Citrato de sodio Colitis ulcerosa 17400 1220 694 19314 9,9 %
BRH715038
Citrato de sodio Colitis ulcerosa N/A 2140 10300 12440 100,0 %
BRH715039
Citrato de sodio Colitis ulcerosa 14100 1700 596 16396 14,0 %
BRH715040
Citrato de sodio Colitis ulcerosa 13300 1170 2070 16540 19,6 %
BRH715041
K2EDTA Artritis reumatoide N/A N/A 4950 4950 100,0 %
BRH715042
K2EDTA Artritis reumatoide 88 N/A 9250 9338 99,1 %
BRH715043
K2EDTA Artritis reumatoide N/A N/A 6900 6900 100,0 %
BRH715044
Citrato de sodio Artritis reumatoide N/A N/A 2850 2850 100,0 %
BRH715045
Citrato de sodio Artritis reumatoide 6600 1860 1520 9980 33,9 %
% de bicatenario en el carril: suma de senal de bicatenario/suma de senal del carril total
5 Tabla 14. Muestras de plasma de individuos con enfermedad de Crohn, senales HMWK, porcentaje de bicatenario en el carril
Muestras en estado de enfermedad reducido en K2EDTA y citrato de sodio, enfermedad de Crohn y psoriasis
Senal de HMWK
Muestra
Anticua- gulante Enfermedad Monoca- tenario (150 kDa) Monoca- tenario (110 kDa) Bicate- nario (56 kDa) Bicate- nario (46 kDa) Senal total % de bicatenario en el carril
A2992, N14
Citrato de sodio Normal 704 12900 384 576 14564 6,6 %
BRH745047
Citrato de sodio Normal 1560 5820 N/A 192 7572 2,5 %
BRH745076
Citrato de sodio Normal 5720 12300 382 480 18882 4,6 %
BRH715026
K2EDTA Enfermedad de Crohn N/A 12100 1230 1950 15280 20,8 %
BRH715027
K2EDTA Enfermedad de Crohn N/A 16300 668 1550 18518 12,0 %
BRH715028
K2EDTA Enfermedad de Crohn N/A 6650 504 2250 9404 29,3 %
BRH715029
K2EDTA Enfermedad de Crohn 1900 14100 N/A 680 16680 4,1 %
BRH715030
K2EDTA Enfermedad de Crohn N/A 1320 3230 6020 10570 87,5 %
% de bicatenario en el carril: suma de senal de bicatenario/suma de senal del carril total OTRAS FORMAS DE REALIZACION
Todas las caracteristicas divulgadas en la presente memoria descriptiva pueden combinarse en cualquier combinacion. Cada caracteristica divulgada en la presente memoria descriptiva puede reemplazarse por una caracteristica alternativa que sirva para el mismo fin, un fin equivalente o similar. Asi, a menos que se indique
5
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25
30
35
expresamente lo contrario, cada caracterfstica divulgada es solo un ejemplo de una serie generica de caracterfsticas equivalentes o similares.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Dyax Corp.
Sexton, Daniel J.
Faucette, Ryan Kenniston, Jon A.
Conley, Greg Nixon, Andrew TenHoor, Christopher Adelman, Burt Chyung, Yung
<120> EVALUACION Y TRATAMIENTO DE TRASTORNOS MEDIADOS POR BRADIQUININA
<130> D0617.70063WO00
<140> TBD <141 > 17/01/2004
<150> US 61/754.607 <151 > 20/01/2013
<160>9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 644
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1

Met Lys Leu lie Thr lie Leu Phe Leu Cys Ser Arg Leu Leu Leu Ser 15 10 15

Leu Thr Gin Glu Ser Gin Ser Glu Glu lie Asp Cys Asn Asp Lys Asp 20 25 30

Leu Phe Lys Ala Val Asp Ala Ala Leu Lys Lys Tyr Asn Ser Gin Asn 35 40 45

Gin Ser Asn Asn Gin Phe Val Leu Tyr Arg lie Thr Glu Ala Thr Lys 50 55 60

Thr Val Gly Ser Asp Thr Phe Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu lie Lys Glu 65 70 75 80

Gly Asp Cys Pro Val Gin Ser Gly Lys Thr Trp Gin Asp Cys Glu Tyr 85 90 95

Lys Asp Ala Ala Lys Ala Ala Thr Gly Glu Cys Thr Ala Thr Val Gly 100 105 110

Lys Arg Ser Ser Thr Lys Phe Ser Val Ala Thr Gin Thr Cys Gin lie 115 120 125

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
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    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para identificar a un sujeto en riesgo de padecer o que padece un trastorno mediado por calicreina plasmatica (pKal), comprendiendo el procedimiento:
    medir un nivel de quininogeno de alto peso molecular (HMWK) escindido, y opcionalmente un nivel de HMWK intacto en una muestra de un sujeto;
    determinar un valor del HMWK escindido; y
    establecer que el sujeto esta en riesgo de padecer o padece un trastorno mediado por pKal si el valor del HMWK escindido es superior a un valor de referencia,
    en el que el valor de referencia se refiere al valor de HMWK escindido en un sujeto sano;
    y en el que el trastorno mediado por pKal es angioedema hereditario (HAE), artritis reumatoide, colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
  2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el valor del HMWK escindido es el porcentaje del HMWK escindido en la muestra.
  3. 3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que los niveles del HMWK escindido y opcionalmente del HMWK intacto se miden mediante un agente de deteccion, que se une especificamente a HMWK escindido en comparacion con HMWK intacto, o que se une especificamente a HMWK intacto en comparacion con HMWK escindido, en el que opcionalmente el agente de deteccion no se une a quininogeno de bajo peso molecular (LMWK).
  4. 4. El procedimiento de la reivindicacion 3, en el que el agente de deteccion es un anticuerpo; preferentemente en el que el anticuerpo se une especificamente a HMWK escindido en comparacion con HMWK intacto y opcionalmente no se une a LMWK, de forma mas preferida en el que el agente de deteccion es un anticuerpo que se une al extremo C-terminal de la cadena ligera de HMWK escindido.
  5. 5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que los niveles del HMWK intacto y del HMWK escindido se miden mediante ensayo de inmunotransferencia Western.
  6. 6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la muestra es una muestra de sangre o una muestra de plasma.
  7. 7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el sujeto presenta un sintoma del trastorno mediado por pKal, o en el que el sujeto es resistente a un tratamiento antihistaminico, a un tratamiento con corticosteroides, o a ambos.
  8. 8. El procedimiento de la reivindicacion 7, en el que el sintoma es un edema.
  9. 9. El procedimiento de la reivindicacion 7, en el que el sintoma es: ataques recurrentes de inflamacion;
    inflamacion, siendo dicha inflamacion completamente o predominantemente periferica; urticaria;
    enrojecimiento, dolor e inflamacion en ausencia de evidencias de infeccion; o edema no mediado por histamina.
  10. 10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el sujeto no tiene sintomas de un trastorno mediado por pKal en el momento de la recogida de la muestra, no tiene antecedentes de sintomas del trastorno mediado por pKal, o no tiene antecedentes del trastorno mediado por pKal.
  11. 11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que ademas comprende determinar si el trastorno es susceptible de tratamiento con un inhibidor de pKal, siendo el trastorno susceptible de tratamiento con un inhibidor de pKal si el valor de HMWK escindido es superior al valor de referencia.
  12. 12. Un procedimiento para evaluar un tratamiento de un trastorno mediado por pKal en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:
    medir niveles de un HMWK escindido y opcionalmente niveles de un HMWK intacto en muestras recogidas de un sujeto antes y despues del tratamiento o durante el transcurso del tratamiento;
    5 determinar un valor de HMWK escindido en cada muestra basandose en los niveles de HMWK escindido y opcionalmente intacto en la misma muestra y
    evaluar la eficacia del tratamiento basandose en los cambios en los valores de HMWK escindido en las muestras antes y despues del tratamiento o a lo largo del transcurso del tratamiento,
    10
    en el que el trastorno mediado por pKal es angioedema hereditario (HAE), artritis reumatoide, colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
  13. 13. Una composicion farmaceutica para su utilizacion en el tratamiento de una enfermedad mediada por pKal en un 15 sujeto, comprendiendo la composicion un inhibidor de pKal y un vehiculo farmaceuticamente aceptable, en la que el sujeto tiene un valor de quininogeno de alto peso molecular (HMWK) escindido que es superior a un valor de referencia, que se refiere al valor de HMWK escindido en un sujeto sano; y en la que la enfermedad mediada por pKal es angioedema hereditario (HAE), artritis reumatoide, colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
    imagen1
    + bradiquinina
    FXIIa
    || pKal
    1| activa
    HMWK!
    FIG. 1
    210
    111
    FIG. 2
    [Quininogeno monocatenario] (|jg/ml)
    Cuantificacion de quininogeno monocatenario intacto mediante inmunotransferencia Western en plasma " con ANTIPROTEASA de pacientes con HAE
    imagen2
    FIG. 3
    imagen3
    imagen4
    HMWK escmdido en plasma humano
    con HAE y normal
    Muestras de plasma emparejadas de
    pacientes con HAE basal/de ataque
    FIG. 6
    imagen5
    HMWK monocatenario (110 KDa)
    HMWK bicatenario (46 y 56 KDa)
    FIG. 7A
    imagen6
    FIG. 7B
    Porcentaje de HMVUK escindido
    imagen7
    FIG. 8A
    HMWK escindido con activacion con FXIIa en plasma humano
    'io.m
    imagen8
    0 500 1000 1500
    Concentration de farmaco (nM)
    FIG. 8B
    imagen9
    Normal Colitis ulcerosa Artritis reumatoide
    FIG
    imagen10
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