ES2837858T3 - Ensayos para determinar biomarcadores del sistema calicreína plasmática - Google Patents

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Abstract

Un método de activación ex vivo, que comprende: incubar una muestra de plasma obtenida de un sujeto con un activador del sistema de calicreína plasmática (pKal), en el que el activador es el Factor XIIa (FXIIa); medir los niveles de cininógeno de alto peso molecular intacto (HMWK), de HMWK escindido, o de ambos, en la muestra de plasma antes y después de la incubación; y determinar la reducción de HMWK intacto en la muestra después de la activación, opcionalmente, en el que los niveles de HMWK intacto y HMWK escindido se miden mediante análisis de transferencia Western, que es preferiblemente análisis de transferencia Western de tipo Protein Simple.

Description

DESCRIPCIÓN
Ensayos para determinar biomarcadores del sistema calicreína plasmática
ANTECEDENTES
La calicreína plasmática (pKal) es la principal enzima generadora de bradicinina en la circulación. La activación de pKal ocurre a través del sistema de contacto que se ha relacionado con patología de la enfermedad asociada con angioedema hereditario (HAE). La bradicinina es un mediador clave del dolor, la inflamación, el edema y la angiogénesis.
SUMARIO DE LA PRESENTE DESCRIPCIÓN
La calicreína plasmática (PKal) es un componente de serina proteasa del sistema de contacto, y es la principal enzima generadora de bradicinina en la circulación. El sistema de contacto es activado por el factor XIIa tras la exposición a superficies extrañas o cargadas negativamente o en las superficies de las células endoteliales por las prolilcarboxipeptidasas (Sainz I.M. et al., Thromb Haemost 98, 77-83, 2007). La activación de la calicreína plasmática amplifica la coagulación intrínseca a través de su activación por retroalimentación del factor XII, y aumenta la inflamación a través de la producción del nonapéptido proinflamatorio bradicinina. Como la quininogenasa primaria en la circulación, la calicreína plasmática es en gran parte responsable de la generación de bradicinina en la vasculatura. Una deficiencia genética en la proteína inhibidor C1 (C1 -INH), el principal inhibidor natural de la calicreína plasmática, conduce al angioedema hereditario (HAE). Los pacientes con HAE sufren ataques agudos de edema doloroso, a menudo precipitados por desencadenantes desconocidos (Zuraw B.L. et al., N Engl J Med 359, 1027-1036, 2008). Mediante el uso de agentes farmacológicos o estudios genéticos en modelos animales, el sistema plasmático calicreína-cinina (KKS plasmático) se ha implicado en diversas enfermedades.
Los documentos WO2012/l70945; US6913900; US6242210; Reddigari et al., J Immunol Methods, 119:19-25; US 2011/154517; US4985354; Reddigari et al., Blood, 74:695-702; Page et al., Br J Haematol, 87:81-86; EP0210029; Defendi et al., PLOS ONE, 8:e70140; Cugno et al., Blood, 89:3213-3218; Berrettini et al., Blood, 68:455-462; y Joseph et al., 101:279-286, se refieren a ensayos ex vivo que implican pKal.
La presente descripción se basa en el desarrollo de una serie de ensayos de biomarcadores, incluyendo el ensayo de activación ex vivo de HMWK, el ensayo de HMWK escindido endógeno, y el ensayo de activación ex vivo de pKal como se describe aquí. Dichos ensayos pueden usarse para medir el nivel de activación del sistema de calicreína plasmática (pKal) en el plasma de un sujeto. También se pueden usar para evaluar un compuesto candidato para su actividad en la modulación (inhibición o activación) del sistema pKal.
La invención proporciona un método de activación ex vivo, que comprende: incubar una muestra de plasma obtenida de un sujeto con un activador del sistema de calicreína plasmática (pKal), en el que el activador es el Factor XIIa (FXIIa); medir los niveles de cininógeno de alto peso molecular intacto (HMWK), HMWK escindido, o ambos, en la muestra de plasma antes y después de la incubación; y determinar la reducción de HMWK intacto en la muestra después de la activación, en el que opcionalmente los niveles de HMWK intacto y HMWK escindido se miden mediante análisis de transferencia Western que es preferiblemente análisis de transferencia Western de tipo Protein Simple.
En un aspecto, la presente descripción presenta un método de activación ex vivo, que comprende: (i) incubar una muestra de plasma obtenida de un sujeto con un activador del sistema de calicreína plasmática (pKal) (por ejemplo, FXIIa); (ii) medir los niveles de cininógeno de alto peso molecular intacto (HMWK), e1HMWK escindido, o ambos, en la muestra de plasma antes y después de la incubación; y (iii) determinar la reducción de HMWK intacto en la muestra después de la activación. Opcionalmente, la muestra de plasma y el activador se incuban en presencia de un candidato modulador de pKal (por ejemplo, un candidato inhibidor tal como DX2930 o un candidato activador). El método puede comprender además evaluar la actividad del candidato modulador de pKal. En algunas realizaciones, los niveles de HMWK intacto y HMWK escindido se miden mediante análisis de transferencia Western, tal como análisis de transferencia Western de tipo Protein Simple.
En otro aspecto, la presente descripción presenta un método para evaluar la activación del plasma en un sujeto, que comprende: proporcionar una muestra de plasma de un sujeto; y medir el nivel de HMWK escindido en la muestra de plasma. El nivel de HMWK escindido se puede medir mediante, por ejemplo, transferencia Western, tal como análisis de transferencia Western de tipo Protein Simple. En algunas realizaciones, el sujeto tiene o se sospecha que tiene una enfermedad asociada con el sistema pKal. Alternativamente o además, el sujeto se trata con un inhibidor de pKal. Cualquiera de los métodos descritos aquí puede comprender además evaluar la eficacia del inhibidor de pKal, en los que un nivel reducido de HMWK escindido después del tratamiento en comparación con el anterior al tratamiento indica que el inhibidor de pKal es eficaz.
En aún otro aspecto, la presente descripción proporciona un ensayo ex vivo para determinar la actividad de pKal en una muestra (por ejemplo, una muestra de plasma de un sujeto), que comprende: (i) incubar la muestra con un activador del sistema pKal (por ejemplo, Factor XIIa o FXIIa) en presencia de un sustrato de pKal, y (ii) medir la actividad de pKal en base a la tasa de escisión del sustrato. En algunos ejemplos, el sustrato unido a un marcador que es capaz de liberar una señal detectable después de ser escindido por pKal, y la tasa de escisión del sustrato, se determina basándose en la magnitud de la señal detectable. En algunos ejemplos, la muestra de plasma se incuba con el activador, el sustrato de pKal, y un candidato modulador de pKal (por ejemplo, un modulador inhibidor o un modulador activador). El método puede comprender además evaluar la actividad del candidato modulador de pKal (por ejemplo, DX-2930), en el que un cambio del nivel de actividad de pKal en presencia del candidato modulador de pKal en comparación con el nivel de actividad de pKal en ausencia del candidato inhibidor de pKal indica que el candidato inhibidor es eficaz. Por ejemplo, un nivel reducido de actividad de pKal indica que el candidato modulador de pKal es un inhibidor de pKal; mientras que un nivel elevado de actividad de pKal indica que el candidato modulador de pKal es un activador de pKal. Cualquiera de los métodos de ensayo descritos aquí se puede realizar en una microplaca.
En cualquiera de los métodos de ensayo descritos aquí, el método puede comprender además evaluar si el sujeto tiene o está en riesgo de padecer una enfermedad asociada con pKal (por ejemplo, HAE); en el que un nivel elevado del HMWK escindido en comparación con un valor predeterminado indica que el sujeto tiene o está en riesgo de padecer la enfermedad. En algunas realizaciones, el sujeto puede ser un paciente humano que tiene una enfermedad asociada con pKal (por ejemplo, HAE) y se somete a un tratamiento de la enfermedad (por ejemplo, un inhibidor de pKal tal como DX2930). La muestra de plasma se puede obtener después o durante el curso del tratamiento. En algunas realizaciones, el método comprende además evaluar la eficacia del tratamiento; en el que un nivel reducido de HMWK escindido en comparación con aquel antes del tratamiento (por ejemplo, un inhibidor de pKal tal como DX2930) o un nivel reducido de HMWK escindido durante el transcurso del tratamiento (por ejemplo, un inhibidor de pKal tal como DX2930) indica que el tratamiento es eficaz.
Además, la presente descripción proporciona métodos para evaluar un sujeto, por ejemplo un sujeto en riesgo o que padece un trastorno mediado por pKal o mediado por bradicinina, que puede implicar cualquiera de los métodos de ensayo descritos aquí. Los métodos proporcionados permiten el análisis de pacientes con angioedema mediado por calicreína plasmática (KMA), u otras enfermedades mediadas por pKal útiles en la evaluación y el tratamiento.
Las realizaciones de la presente descripción proporcionan un biomarcador y su uso en la identificación y el tratamiento de pacientes, por ejemplo pacientes que padecen edema causado por bradicinina que es generada por calicreína plasmática. Los métodos, composiciones y dispositivos descritos aquí son útiles de varias formas. Por ejemplo, los niveles de un marcador de pKal pueden usarse para identificar trastornos asociados con la activación elevada del sistema de contacto. El cribado inicial se puede seguir con ensayos in vitro o in vivo con inhibidores de calicreína plasmática (por ejemplo, DX-88, EPIKAL2, o DX-2930), por ejemplo en modelos preclínicos de enfermedad. Un marcador descrito aquí también puede usarse como un biomarcador farmacodinámico o para monitorizar de otro modo la respuesta de un sujeto a un inhibidor de calicreína. Un marcador descrito aquí puede usarse en un diagnóstico complementario para permitir el tratamiento de enfermedades mediadas por calicreína plasmática, administrar la dosificación durante la terapia profiláctica de un trastorno mediado por pKal o mediado por bradicinina, por ejemplo HAE, angioedema idiopático no dependiente de histamina, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, lupus, enfermedad de Alzheimer, choque séptico, lesión por quemadura, lesión por isquemia/reperfusión cerebral, edema cerebral, retinopatía diabética, nefropatía diabética, edema macular, vasculitis, trombosis arterial o venosa, trombosis asociada con dispositivos de asistencia ventricular o endoprótesis vasculares, trombocitopenia con trombosis inducida por heparina, enfermedad tromboembólica, y cardiopatía coronaria con angina de pecho inestable, edema, enfermedad ocular, gota, enfermedad inflamatoria del intestino, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, estenosis espinal-enfermedad de la columna vertebral degenerativa, íleo postoperatorio, aneurisma aórtico, osteoartritis, angioedema hereditario, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), restenosis (por ejemplo, después de una angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad neurológica, una enfermedad asociada con el plegamiento incorrecto de proteínas, una enfermedad asociada con angiogénesis, nefropatía hipertensiva y nefropatía diabética, enfermedades alérgicas y respiratorias (por ejemplo anafilaxia, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, síndrome disneico agudo, fibrosis quística, rinitis persistente) y lesiones tisulares (por ejemplo, lesión por quemaduras o químicas).
En un aspecto, la presente descripción proporciona un método para evaluar o tratar a un sujeto, por ejemplo distinguir un trastorno mediado por pKal, tal como un angioedema mediado por bradicinina, de un trastorno mediado por histamina, o predecir un ataque futuro de un trastorno mediado por pKal, que comprende adquirir, por ejemplo determinar, el nivel de uno o más marcadores correlacionados con la activación de pKal (un marcador de pKal), descrito aquí, por ejemplo precalicreína, pKal activa, alfa 2M-pKal, C1-INH-pKal, cininógeno intacto, y cininógeno escindido, evaluando o tratando de ese modo dicho sujeto. En algunas realizaciones, el método comprende adquirir, por ejemplo detectar, el nivel de uno o más marcadores correlacionados con una respuesta inflamatoria mediada por histamina (un marcador H), por ejemplo triptasa.
En algunas realizaciones, dicho trastorno mediado por pKal es HAE, IAE, IBD o IBS. En algunas realizaciones, dicho trastorno mediado por pKal se selecciona de angioedema idiopático no dependiente de histamina, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, lupus, enfermedad de Alzheimer, choque séptico, lesión por quemadura, lesión por isquemia/reperfusión cerebral, edema cerebral, retinopatía diabética, nefropatía diabética, edema macular, vasculitis, trombosis arterial o venosa, trombosis asociada con dispositivos de asistencia ventricular o endoprótesis vasculares, trombocitopenia con trombosis inducida por heparina, enfermedad tromboembólica, y cardiopatía coronaria con angina de pecho inestable, edema, enfermedad ocular, gota, enfermedad inflamatoria del intestino, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, estenosis espinal-enfermedad de la columna degenerativa, íleo postoperatorio, aneurisma aórtico, osteoartritis, angioedema hereditario, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), restenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad neurológica, una enfermedad asociada con un plegamiento incorrecto de proteínas, una enfermedad asociada con angiogénesis, nefropatía hipertensiva y nefropatía diabética, enfermedades alérgicas y respiratorias (por ejemplo, anafilaxia, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, síndrome disneico agudo, fibrosis quística, rinitis persistente) y lesiones tisulares (por ejemplo, lesión por quemaduras o química).
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para evaluar o tratar a un sujeto, teniendo dicho sujeto un síntoma compatible con un trastorno mediado por pKal, por ejemplo angioedema mediado por bradicinina, y un trastorno relacionado con histamina, que comprende a) opcionalmente, determinar que dicho sujeto tiene un síntoma, por ejemplo edema o malestar abdominal, compatible con uno o ambos trastornos mediados por pKal y un trastorno relacionado con histamina; b) si dicho sujeto no ha sido tratado con una terapia antihistamínica para dicho síntoma, entonces tratar a dicho sujeto con una terapia antihistamínica; c) adquirir, por ejemplo detectar, el nivel de uno o más marcadores correlacionados con la activación de pKal (un marcador de pKal), por ejemplo de precalicreína, pKal activa, alfa 2M-pKal, C1 -INH-pKal, cininógeno intacto, y cininógeno escindido; d) si dicho nivel cumple con un criterio predeterminado, por ejemplo si está en o por encima de un nivel de referencia: seleccionar el sujeto para la terapia con inhibidor de calicreína; o administrar un inhibidor de calicreína a dicho sujeto, evaluando o tratando de ese modo dicho sujeto. En algunas realizaciones, el método comprende seleccionar el sujeto para la terapia con inhibidor de calicreína. En ciertas realizaciones, el método comprende administrar un inhibidor de calicreína a dicho sujeto. En realizaciones particulares, la selección del sujeto para la terapia con inhibidor de calicreína, o la administración de un inhibidor de calicreína a dicho sujeto, ocurre antes de una determinación de que el sujeto ha mostrado una respuesta aceptable a dicha terapia antihistamínica, por ejemplo ocurre dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 horas de dicho tratamiento con una terapia antihistamínica. En algunas realizaciones, una determinación de que dicho sujeto tiene un síntoma compatible tanto con un trastorno mediado por pKal como con un trastorno relacionado con histamina y la adquisición de una muestra de dicho paciente para determinar el nivel de un marcador de pKal se producen: en 30 minutos, 1,2 o 3 horas una de la otra; o en la misma visita a un proveedor de atención médica.
En algunas realizaciones, dicho inhibidor de pKal se selecciona de DX-88, DX-2930 o EpiKal-2.
En algunas realizaciones, el método comprende adquirir, por ejemplo determinar, el nivel de uno o más marcadores correlacionados con una respuesta inflamatoria mediada por histamina (un marcador H). En ciertas realizaciones, se evalúa la susceptibilidad de dicho sujeto a un trastorno mediado por pKal. En ciertas realizaciones, dicho sujeto tiene un síntoma de, por ejemplo consistente con, un trastorno mediado por pKal, por ejemplo edema, por ejemplo HAE. En ciertas realizaciones, dicho sujeto tiene un síntoma de un trastorno caracterizado por la activación de pKal no deseada, y a dicho sujeto se le ha administrado una terapia antihistamínica. En realizaciones particulares, dicha terapia antihistamínica se administra dentro de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 horas antes o después de una etapa determinante como se describe aquí. En realizaciones particulares, el método comprende además administrar una terapia antihistamínica a dicho sujeto, por ejemplo antes, después o durante la evaluación o determinaciones como se describe aquí.
En algunas realizaciones, en respuesta a dicha determinación o evaluación, administrar un inhibidor de calicreína a dicho sujeto. En ciertas realizaciones, dicho sujeto tiene uno o más o todos los siguientes síntomas o propiedades: ataques recurrentes de hinchazón; hinchazón, en la que dicha hinchazón es completa o predominantemente periférica, por ejemplo el sujeto no tiene hinchazón abdominal o de las vías respiratorias significativa; urticaria; enrojecimiento, dolor e hinchazón en ausencia de evidencia de infección; no responde a la terapia con antihistamínicos o corticosteroides; o tiene edema no mediado por histamina. En ciertas realizaciones, dicho sujeto tiene edema persistente o recurrente, y no responde a una o ambas de la terapia con antihistamínicos y esteroides. En ciertas realizaciones, el sujeto no tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo HAE, IAE, IBD o IBS; el sujeto tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo HAE, IAE, IBD o IBS, el sujeto no tiene antecedentes de HAE; el sujeto tiene antecedentes de HAE; el sujeto no tiene antecedentes de IAE; el sujeto tiene antecedentes de IAE; el sujeto no tiene antecedentes de IBD o IBS; el sujeto tiene antecedentes de IBD o IBS; el sujeto no tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo una alergia alimentaria; el sujeto tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo una alergia alimentaria; el sujeto no tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo HAE, IAE, IBD o IBS, y no tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo una alergia alimentaria; o el sujeto no tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo HAE, iA e , IBD o IBS, y tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo una alergia alimentaria; el sujeto tiene antecedentes de un trastorno mediado pKal, por ejemplo HAE, IAE, IBD o IBS, y no tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo una alergia alimentaria; o el sujeto tiene un historial de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo HAE, IAE, IBD o IBS, y tiene un historial de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo una alergia alimentaria.
En algunas realizaciones, el sujeto ha sido tratado con un inhibidor de calicreína, por ejemplo en terapia profiláctica, por ejemplo para HAE, y la respuesta de los sujetos al inhibidor de calicreína se evalúa o monitoriza, y opcionalmente, en respuesta a dicha monitorización, se selecciona o administra una terapia, por ejemplo en respuesta a la determinación, se ajusta la dosis del inhibidor de calicreína. En algunas realizaciones, se realiza una determinación de un marcador de pKal en el contexto de un diagnóstico complementario, y opcionalmente, se administra o se detiene la administración de un agente terapéutico sobre la base de la determinación. En ciertas realizaciones, en respuesta a dicha adquisición, identificar un ataque agudo inminente, por ejemplo un ataque de HAE o IEA. En realizaciones particulares, se evalúa la susceptibilidad de dicho sujeto al angioedema idiopático. En realizaciones particulares, dicha evaluación comprende determinar si dicho sujeto padece un trastorno mediado por pKal, por ejemplo un trastorno mediado por bradicinina, por ejemplo un angioedema mediado por pKal, o un trastorno mediado por histamina, por ejemplo una reacción alérgica a los alimentos.
En algunas realizaciones, el sujeto no tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo HAE o IAE. En algunas realizaciones, el sujeto tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo HAE o IAE. En algunas realizaciones, el sujeto no tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo HAE, IAE, IBD o IBS; el sujeto tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo HAE, IAE, IBD o IBS, el sujeto no tiene antecedentes de HAE; el sujeto tiene antecedentes de HAE; el sujeto no tiene antecedentes de IAE; el sujeto tiene antecedentes de IAE; el sujeto no tiene antecedentes de IBD o IBS; el sujeto tiene antecedentes de IBD o IBS; el sujeto no tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo una alergia alimentaria; el sujeto tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo una alergia alimentaria; el sujeto no tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo HAE, IAE, IBD o IBS, y no tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo una alergia alimentaria; o el sujeto no tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo HAE, iA e , IBD o IBS, y tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo una alergia alimentaria; el sujeto tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo HAE, IAE, IBD o IBS, y no tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo una alergia alimentaria; o el sujeto tiene antecedentes de un trastorno mediado por pKal, por ejemplo HAE, IAE, IBD o IBS, y tiene antecedentes de un trastorno mediado por histamina, por ejemplo una alergia alimentaria.
En algunas realizaciones, un marcador de pkal, por ejemplo un marcador de pKal descrito aquí, se detecta con un reactivo basado en anticuerpos. En ciertas realizaciones, un marcador de pKal se detecta con un inmunoensayo de tipo sándwich. En ciertas realizaciones, el método comprende adquirir, por ejemplo detectar, el nivel de alfa 2M-pKal y C1-INH-pKal, por ejemplo mediante inmunoensayos de tipo sándwich. En ciertas realizaciones, el método comprende adquirir, por ejemplo detectar, el nivel de cininógeno, por ejemplo uno o ambos de cininógeno intacto o escindido, por ejemplo mediante un ensayo de separación electroforética, por ejemplo una transferencia Western. En algunas realizaciones, un marcador de pKal, por ejemplo cininógeno, se detecta en un ensayo que se basa en la separación, por ejemplo, separación electroforética, por ejemplo mediante transferencia Western, del analito de otros productos. En algunas realizaciones, un marcador de pKal se detecta con un ensayo Simple Western™. Los ensayos Simple Western™ son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Rustandi et al. Qualitative and quantitative evaluation of Simon™, a new CE-based automated Western blot system as applied to vaccine development. Electrophoresis. 2012 Sep; 33(17):2790-7). Los productos Simple Western™ también están disponibles comercialmente (véase, por ejemplo, ProteinSimple, Santa Clara, CA).
En algunas realizaciones, un primer marcador de pKal, por ejemplo de precalicreína, preKal activa, alfa 2M-pKal, o C1INH-pKal, se detecta con un inmunoensayo de tipo sándwich, y un segundo marcador de pKal, por ejemplo cininógeno, se detecta en un ensayo que se basa en la separación, por ejemplo la separación electroforética, por ejemplo mediante transferencia Western o Simple Western™, del analito de otros productos. En determinadas realizaciones, la detección de un marcador de pKal es cualitativa. En ciertas realizaciones, la detección de un marcador de pKal es cuantitativa. En realizaciones particulares, el método comprende determinar los niveles de C1-INH-pKal y a2M-pKal. En realizaciones particulares, el método comprende determinar los niveles de pKal activa. En realizaciones particulares, se detectan los niveles de cada uno de precalicreína, pKal activa, alfa 2M-pKal, C1-INH-pKal, cininógeno intacto, y cininógeno escindido.
En algunas realizaciones, el método comprende comparar el nivel de un marcador de pKal, por ejemplo de precalicreína, pKal activa, alfa 2M-pKal, C1-INH-pKal, cininógeno intacto, o cininógeno escindido, con un valor de referencia. En ciertas realizaciones, dicho valor de referencia es una función del nivel de dicho marcador de pKal en un HAE, por ejemplo en uno o más sujetos con HAE. En ciertas realizaciones, dicho valor de referencia es una función del nivel de dicho marcador de pKal en un HAE durante un ataque, por ejemplo en uno o más sujetos con HAE durante un ataque agudo. En ciertas realizaciones, dicho valor de referencia es una función del nivel de un marcador de pKal en un IAe , por ejemplo en uno o más sujetos con IAE. En ciertas realizaciones, dicho valor de referencia es una función del nivel de un marcador de pKal en un IAE durante un ataque agudo, por ejemplo en uno o más sujetos con IAE durante un ataque agudo. En ciertas realizaciones, dicho valor de referencia es función del nivel de un marcador de pKal en ausencia de HAE o IAE, por ejemplo en uno o más sujetos que no tienen antecedentes de HAE o IAE.
En realizaciones particulares, el método comprende, por ejemplo en respuesta a una comparación, clasificar al sujeto, por ejemplo clasificar al sujeto por riesgo de un trastorno mediado por pKal, o administrar o detener una terapia de dicho sujeto. En ciertas realizaciones, el método comprende, por ejemplo en respuesta a una comparación, seleccionar un tratamiento para dicho sujeto. En alguna realización, el método comprende, por ejemplo en respuesta a una comparación, administrar o detener una terapia de dicho sujeto, por ejemplo un agente de unión a calicreína; un antagonista del receptor de bradicinina B2; o un agente de sustitución de C1 -INH. En realizaciones particulares, dicho tratamiento es la administración de un inhibidor de pKal, por ejemplo un inhibidor de pKal seleccionado de DX-88; EpiKal-2 y DX-2930.
En algunas realizaciones, una muestra de dicho sujeto se pone en contacto con un sustrato que comprende un agente de captura para dos o más de los siguientes marcadores descritos aquí, por ejemplo de: precalicreína, por ejemplo un anticuerpo anti-precalicreína; pKal activa, por ejemplo un anticuerpo anti-pKal activa; alfa 2M-pKal, por ejemplo un anticuerpo anti-alfa 2M-pKal; C1INH-pKal, por ejemplo un anticuerpo antiC1INH-pKal; o un marcador H, por ejemplo un anticuerpo anti-marcador H; opcionalmente, en el que al menos un agente de captura es un agente de captura para un marcador de pKal.
En algunas realizaciones, el método comprende adquirir una muestra, por ejemplo una muestra de sangre o plasma de dicho sujeto.
En algunas realizaciones, dicho sustrato comprende: un agente de captura para C1-INH-pKal; y un agente de captura para alfa2M-pKal. En ciertas realizaciones, dicho sustrato comprende además uno o ambos de: un agente de captura para precalicreína, por ejemplo un anticuerpo anti-precalicreína; un agente de captura para pKal activa, por ejemplo un anticuerpo anti-pKal activa.
En algunas realizaciones, un primer agente de captura (para un primer marcador) y un segundo agente de captura (para un segundo marcador) se disponen sobre un sustrato de manera que una señal para la presencia del primer marcador se pueda distinguir de una señal para la presencia del segundo marcador. En ciertas realizaciones, dicho primer agente de captura (para un primer marcador) está ubicado en una primera ubicación o dirección, y dicho segundo agente de captura (para un segundo marcador) está ubicado en una segunda ubicación o dirección. En realizaciones particulares, dicha primera ubicación o dirección y dicha segunda ubicación o dirección no se superponen sobre dicho sustrato. En ciertas realizaciones, dicho primer agente de captura es para un primer marcador de pKal. En ciertas realizaciones, dicho primer agente de captura es para un primer marcador de pKal, y dicho segundo agente de captura es para un segundo marcador de pKal. En ciertas realizaciones, dicho primer agente de captura es para un marcador de pKal, y dicho segundo agente de captura es para un marcador H. En ciertas realizaciones, dicho primer marcador es 2M-pKal, y dicho segundo marcador es C1 INH-pKal. En ciertas realizaciones, el agente de captura para 2M-pKal es un anticuerpo anti-2M-pKal, y el agente de captura para C1 INH-pKal es un anticuerpo anti-C1 INH-pKal.
En ciertas realizaciones, el método comprende poner en contacto un sustrato con un anticuerpo anti-2M-pKal detectable, por ejemplo marcado, y un anticuerpo anti-C1 INH-pKal detectable, por ejemplo marcado, para determinar la presencia o cantidad de un marcador de pKal. En ciertas realizaciones, dichos anticuerpos se marcan con un resto que produce un producto coloreado, emite un fotón, absorbe un fotón, altera un sustrato, o altera la conductividad del sustrato. En ciertas realizaciones, dichos anticuerpos se marcan con un resto que utiliza electroquimioluminiscencia. En ciertas realizaciones, dichos anticuerpos se marcan con resinium. En realizaciones particulares, dicho sustrato se proporciona en un dispositivo de descubrimiento a mesoescala. En realizaciones particulares, dicho sustrato se proporciona como un dispositivo de varilla, adecuado para uso con uno o ambos de sangre y plasma. En realizaciones particulares, dicho primer agente de captura y dicho segundo agente de captura están dispuestos en una cámara común o conectada de forma fluida, por ejemplo una cámara, por ejemplo un pocillo o depresión, en un dispositivo de múltiples cámaras, por ejemplo una placa de múltiples pocillos. En realizaciones particulares, dicho primer agente de captura y dicho segundo agente de captura se imprimen sobre un sustrato.
En algunas realizaciones, dicho agente de captura para un primer marcador de pKal está en una primera ubicación en dicho sustrato, y dicho agente de captura para un segundo marcador de pKal está en una segunda ubicación en dicho sustrato, y dichas ubicaciones primera y segunda están dispuestas en dicho sustrato de tal manera que una señal para la presencia del primer marcador de pKal puede distinguirse de una señal de un segundo marcador de pKal. En ciertas realizaciones, dicho sustrato comprende un agente de captura para un tercer marcador en una tercera ubicación, y la tercera ubicación está dispuesta en dicho sustrato de manera que una señal para la presencia del tercer marcador se pueda distinguir de una señal de dicho primer y segundo marcador. En realizaciones particulares, dicho primer agente de captura es específico para alfa 2M-pKal o C1 INH-pKal. En realizaciones particulares, dicho primer agente de captura es específico para alfa 2M-pKal, y dicho segundo agente de captura es específico para C1INH-pKal.
En algunas realizaciones, se puede realizar una determinación del nivel de un marcador de pKal en una muestra dentro de 1, 2, 3, 4 o 5 horas de contacto del sustrato con dicha muestra. En algunas realizaciones, se puede realizar una determinación del nivel de dos marcadores de pKal en una muestra dentro de 1,2, 3, 4 o 5 horas de contacto del sustrato con dicha muestra. En algunas realizaciones, se puede realizar una determinación del nivel de dos marcadores de pKal en ensayos realizados simultáneamente, por ejemplo la incubación u otros intervalos para los ensayos se solapan entre sí.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un sustrato que comprende agentes de captura para una pluralidad de marcadores de pKal, por ejemplo como se describe aquí.
En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un método para determinar si un trastorno es susceptible de tratamiento con un inhibidor de pKal que comprende: evaluar los niveles de uno o más marcadores de pKal, por ejemplo como se describe aquí, por ejemplo en un sujeto que padece de dicho trastorno, o un modelo animal para dicho trastorno; comparar el nivel determinado con una referencia, en el que un nivel que cumple un criterio predeterminado, por ejemplo si está en o por encima de un nivel de referencia, es indicativo de un trastorno susceptible de tratamiento con un inhibidor de pKal. En algunas realizaciones, el método comprende evaluar el efecto de un inhibidor de calicreína, in vitro o in vivo, o en un modelo animal de dicho trastorno.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene un trastorno mediado por pKal, por ejemplo un trastorno mediado por bradicinina, que comprende evaluar el nivel de un marcador de pKal descrito aquí, por ejemplo mediante un método descrito aquí, determinar, y en respuesta a dicha evaluación, seleccionar un tratamiento, por ejemplo seleccionar una o ambas de una cantidad de dosificación o frecuencia de dosificación, de un inhibidor de calicreína. En algunas realizaciones, el método comprende administrar un inhibidor de calicreína a dicho sujeto. En algunas realizaciones, a dicho paciente se le ha administrado un inhibidor de calicreína antes de dicha evaluación. En ciertas realizaciones, el método comprende administrar un inhibidor de calicreína a dicha dosis o frecuencia seleccionada.
En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un método para determinar si un trastorno es susceptible de tratamiento con un inhibidor de pKal, que comprende: evaluar los niveles de uno o una pluralidad de marcadores pKal, por ejemplo como se describe aquí, por ejemplo en un sujeto que padece de dicho trastorno, o un modelo animal para dicho trastorno; comparar el nivel determinado con una referencia, en el que un nivel que cumple un criterio predeterminado, por ejemplo si está en o por encima de un nivel de referencia, es indicativo de un trastorno susceptible de tratamiento con un inhibidor de pKal. En algunas realizaciones, el método comprende evaluar el efecto de un inhibidor de calicreína, in vitro o in vivo, o en un modelo animal de dicho trastorno.
En otro aspecto, la presente descripción presenta métodos y dispositivos para la recogida de una muestra, por ejemplo sangre, con mínima activación por contacto. En una realización, la presente descripción presenta un recipiente, que tiene dispuesto en él un reactivo de captura descrito aquí, por ejemplo un inhibidor de calicreína, por ejemplo un polipéptido que es similar en secuencia a DX-88, por ejemplo uno que difiere de DX-88 en no más de 1,2 o 5 restos de aminoácidos, por ejemplo EPIKAL-2. El recipiente está configurado, por ejemplo, con una abertura, apertura, tabique, etc., para permitir la recogida de una muestra, por ejemplo sangre, de un sujeto, y la unión de un marcador relacionado con pKal en la muestra, por ejemplo pKal, con el reactivo de captura, en el mismo recipiente. La medida de especies unidas, por ejemplo pKal, se puede llevar a cabo en el mismo recipiente, o en realizaciones, el sustrato se retira del recipiente anterior a la medida, por ejemplo la medida puede realizarse en o sobre otro dispositivo. En las realizaciones, el volumen del recipiente es 0,5-100, 0,5-50, 0,5-10, 1-100, 1 -50, 1-25 ml. En una realización, el reactivo de captura, por ejemplo un reactivo de captura de pKal, está dispuesto en la superficie interior del recipiente. El reactivo de captura se puede acoplar a la superficie con una primera pareja de unión específica unida a la superficie y una segunda pareja de unión específica acoplada al reactivo de captura. Ejemplos de parejas de unión específica son biotina y avidina. En una realización, el reactivo de captura biotinilado, por ejemplo un reactivo de captura de pKal, por ejemplo un inhibidor de calicreína, por ejemplo un polipéptido que es similar en secuencia a DX-88, por ejemplo uno que difiere de DX-88 en no más de 1, 2, o 5 restos de aminoácidos, por ejemplo Epikal-2, se dispone sobre una superficie del recipiente que está recubierta con avidina.
La presente descripción proporciona biomarcadores capaces de identificar pacientes con angioedema mediado por calicreína plasmática (KMA), u otras enfermedades mediadas por pKal útiles en la evaluación y el tratamiento.
Los pacientes que muestran una activación de pKal a través de un biomarcador son candidatos para el tratamiento con un inhibidor de pKal, tal como DX-88, un inhibidor de pKal de tipo pequeña proteína aprobado para el tratamiento de los HAE asociados a ataques edematosos agudos. Otros inhibidores de pKal incluyen DX-2930, que es un inhibidor de anticuerpos completamente humanos. En algunas realizaciones, los pacientes que muestran la activación de pKal a través de un biomarcador son candidatos para el tratamiento con un antagonista del receptor de bradicinina B2, por ejemplo Incatibant (Firazyr®). En algunas realizaciones, los pacientes que muestran una activación de pKal a través de un biomarcador son candidatos para el tratamiento con un agente de sustitución de C1-INH, por ejemplo un concentrado de C1-INH nanofiltrado pasteurizado humano purificado (Berinert®).
Las realizaciones de la presente descripción proporcionan un biomarcador y su uso en la identificación y el tratamiento de pacientes, por ejemplo pacientes que padecen edema causado por bradicinina que es generada por calicreína plasmática. Los métodos, composiciones y dispositivos descritos aquí son útiles de varias formas. Por ejemplo, los niveles de un marcador de pKal pueden usarse para identificar trastornos asociados con la activación elevada del sistema de contacto. El cribado inicial se puede seguir con ensayos in vitro o in vivo con inhibidores de calicreína plasmática (por ejemplo, DX-88, EPIKAL-2 o DX-2930), por ejemplo en modelos preclínicos de enfermedad. Un marcador descrito aquí también puede usarse como un biomarcador farmacodinámico o para monitorizar de otro modo la respuesta de un sujeto a un inhibidor de calicreína. Un marcador descrito aquí se puede utilizar en un diagnóstico complementario para permitir el tratamiento de enfermedades mediadas por calicreína plasmática, gestionar la dosificación durante la terapia profiláctica de HAE, o identificar un ataque agudo de HAE inminente.
Otras realizaciones ejemplares incluyen:
Un ensayo de actividad de pKal basado en microplacas, que comprende: (a) proporcionar una muestra de plasma de un sujeto; (b) incubar la muestra de plasma con un activador del sistema pKal en presencia de un sustrato de pKal, en el que el sustrato está unido a un marcador que es capaz de liberar una señal detectable después de ser escindido por pKal; y (c) medir la actividad de pKal basándose en la densidad de la señal detectable. El activador puede ser Factor FXIIa. En algunos ejemplos, la muestra de plasma se puede incubar con el activador, el sustrato de pKal, y un candidato inhibidor de pKal. En algunos ejemplos, el método puede comprender además evaluar la actividad del candidato inhibidor de pKal, en el que un nivel reducido de actividad de pKal en presencia del candidato inhibidor de pKal con respecto al nivel de actividad de pKal en ausencia del candidato inhibidor de pKal indica que el candidato inhibidor es eficaz.
Los detalles de una o más realizaciones de la presente descripción se exponen en la descripción siguiente. Otras características o ventajas de la presente descripción serán evidentes a partir de los siguientes dibujos y la descripción detallada de varias realizaciones, y también de las reivindicaciones adjuntas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIGURA 1 es una descripción de los elementos implicados en la activación del sistema de contacto de la calicreína plasmática. El HMWK escindido se puede determinar mediante transferencia Western. a2M-pKal y C1INH-pKal se pueden determinar mediante inmunoensayo (plataforma MSD).
La FIGURA 2 muestra la detección de cininógeno escindido mediante análisis de transferencia Western. Las muestras se analizaron usando SDS-PAGE (3-8% de Tris-Acetato) en condiciones reductoras, seguido de transferencia a una membrana de PVDF e inmunotransferencia. Línea 1 - cininógeno intacto 50 nM; Línea 2 - cininógeno escindido 50 nM; Línea 3 - cininógeno de bajo peso molecular 50 nM; Línea 4 - plasma humano con citrato de sodio 1:20 (tubo de recogida de vidrio); Línea 5 - plasma humano con citrato de sodio 1:20 (plástico) tratado con calicreína; Línea 6 -plasma humano con citrato de sodio 1:20 (plástico); Línea 7 - plasma humano con citrato de sodio 1:20 (plástico) al que se le añade cininógeno de 2 cadenas 20 nM.
La FIGURA 3 muestra la purificación del complejo C1 INH-pKal. El cromatograma de intercambio catiónico (panel A) demuestra la separación del C1INH, pKal y el complejo. Las fracciones del intercambio catiónico se recogieron y analizaron mediante SDS-PAGE (panel B).
La FIGURA 4 muestra una curva estándar de ELISA de tipo sándwich para la detección de C1 INH-pKal en plasma humano. Se colocó en placa anti-pKal de ratón (clon 13G11), y se usó el inhibidor anti-Cl de cabra para la detección.
La FIGURA 5 muestra una curva estándar de ELISA de tipo sándwich para la detección de C1 INH-pKal en plasma humano. Se colocó en placa Anti-C1 -INH de cabra, y se usó anti-pKal de ratón (clon 13G11) para la detección.
La FIGURA 6 muestra la purificación del complejo a2M-pKal. El complejo se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (panel A), y las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE (panel B).
La FIGURA 7 muestra la cuantificación del complejo a2M-pKal. Se demostró que la actividad de calicreína en plasma disminuyó hasta un nivel de meseta tras la adición de un exceso de a2M (panel A). Usando un exceso de 10 veces de a2M con respecto a pKal, se construyó una curva estándar, a partir de la cual se pudo determinar la concentración molar de nuestro complejo a2M-pKal purificado de acuerdo con la concentración de pKal en el complejo.
La FIGURA 8 muestra una curva estándar de ELISA de tipo sándwich para la detección de a2M-pKal en plasma humano. Se colocó en placa anti-a2M, y se usó anti-pKal de ratón (clon 13G11) para la detección.
La FIGURA 9 muestra una curva estándar de ELISA de tipo sándwich para la detección de a2M-pKal en plasma humano. Se colocó en placa anti-pKal (clon 13G11), y se usó anti-a2M para la detección.
La FIGURA 10 muestra la detección de complejos C1 INH-pKal y a2M-pKal en plasma humano normal después de la activación con sulfato de dextrano.
La FIGURA 11 muestra la detección de cininógeno intacto (es decir, 1 cadena) en una muestra de paciente obtenida durante un ataque. La muestra de plasma del paciente se recogió en tubos de plasma citrado que contenían un cóctel anti-proteasas.
La FIGURA 12 es una ilustración esquemática de un ensayo de actividad de pKal basado en microplacas, con un experimento adjunto que muestra la actividad inhibidora de DX-2930 sobre la actividad de pKal en monos tratados.
La FIGURA 13 muestra experimentos en plasma de monos tratados con placebo/vehículo, así como un control DX-2930 añadido a este mismo plasma.
La FIGURA 14 muestra HMWK en muestras de plasma de pacientes con HAE (CM, DG, BB y GR). Las muestras se recogieron en un cóctel de inhibidores anti-proteasas. MW: marcador; C: 1 cadena (6,44 mg/ml) 2 cadenas (1,54 mg/ml); 1: basal CM; 2: ataque CM; 3: basal DG; 4: ataque DG; 5: basal BB; 6: ataque BB; 7: basal GR; 8: ataque GR; y 9: plasma normal reunido.
La FIGURA 15 muestra el nivel de HMWK de una cadena en muestras de pacientes con HAE según se determina mediante un ensayo de transferencia Western.
La FIGURA 16 muestra la actividad inhibidora de DX-2930 sobre la activación de pKal en monos macacos. Se usó DX-2930 multidosis en el análisis de transferencia Western de cininógeno de monos macacos de muestras de plasma APTT del día 4 (con o sin activación del plasma por caolín o 15 mg/ml de sulfato de dextrano).
La FIGURA 17 ilustra un ensayo ejemplar de activación de HMWK ex vivo para examinar la actividad inhibidora de un inhibidor de pKal de ejemplo Dx-2930, usando tanto el análisis Western de tipo Protein Simple como el análisis de transferencia Western tradicional. El ensayo de activación de HMWK ex vivo descrito aquí mostró que los niveles mínimos de DX-2930 inhibieron la activación de pKal, que superó al inhibidor C1 endógeno solo en plasma humano normal.
La FIGURA 18 representa un ensayo de activación de HMWK ex vivo que muestra datos brutos de Protein Simple para plasma activado con Factor XIIa con titulación de DX2930.
La FIGURA 19 muestra la detección de cininógeno HMW humano en plasma después de 30 minutos de activación según se determina mediante análisis de transferencia Western.
La FIGURA 20 muestra la comparación entre el ensayo Western de tipo Protein Simple y el ensayo de transferencia Western tradicional en la detección de la activación del plasma.
La FIGURA 21 muestra la comparación entre el ensayo Western de tipo Protein Simple y el ensayo de transferencia Western tradicional en la detección de la activación del plasma.
La FIGURA 22 muestra el porcentaje de reducción de HMWK de una cadena después de 30 minutos de activación con FXIIa en la muestra de plasma puro BRH745047.
La FIGURA 23 muestra el porcentaje de reducción de HMWK de una cadena después de 30 minutos de activación con FXIIa en la muestra de plasma puro BRH745048.
La FIGURA 24 muestra el porcentaje de reducción de HMWK de una cadena después de 30 minutos de activación con FXIIa en la muestra de plasma puro BRH745064.
La FIGURA 25 muestra el porcentaje de reducción de HMWK de una cadena después de 30 minutos de activación con FXIIa en la muestra de plasma puro BRH745062.
La FIGURA 26 muestra el porcentaje de reducción de HMWK de una cadena después de 30 minutos de activación con FXIIa en la muestra de plasma puro BRH745049, BRH745062 y BRH745063.
La FIGURA 27 es una gráfica que muestra la reducción de HMWK de una cadena en plasma con FXIIa a diversas concentraciones.
La FIGURA 28 muestra los niveles de HMWK de dos cadenas en pacientes normales, basales, y con ataque de HAE, según se determina mediante el ensayo de cininógeno escindido endógeno descrito aquí.
La FIGURA 29 es una gráfica que muestra el cininógeno escindido endógeno en muestras de HAE según lo determinado por transferencia Western de tipo Protein Simple y transferencia Western tradicional.
La FIGURA 30 muestra los niveles de cininógeno escindido endógeno en muestras de pacientes con HAE. Línea 1: HMWK purificado de una cadena y de 2 cadenas. Línea 2: muestras de plasma humano normal recogidas con citrato.
La FIGURA 31 es una gráfica que muestra el porcentaje de inhibición de la actividad de pKal en muestras de plasma de monos tratados con DX-2930, y la inhibición de la actividad de pKal en muestras de plasma enriquecidas in vitro con DX-88 (ecallantida), C1-INH o DX-2930. El porcentaje de inhibición se midió usando ensayo de activación de pKal ex vivo ejemplar. Las barras de error representan el error estándar de la media.
La FIGURA 32 es una gráfica que muestra el porcentaje de inhibición ex vivo de la actividad de pKal en plasma de humanos y monos tratados con diferentes dosis de DX-2930. El porcentaje de inhibición se midió usando un ensayo de activación de pKal ex vivo ejemplar. La línea discontinua muestra el porcentaje de inhibición observado con DX-293080 nM, que es una concentración que coincide con la Cmax de un nivel terapéuticamente eficaz de ecallantida.
La FIGURA 33 es una serie de gráficas que muestran el “% de inhibición de la actividad de pKal” en muestras de plasma del estudio de Fase 1 de DX-2930, que compara la inhibición promedio de cada día posterior a la dosis para cada grupo de dosis en comparación con las muestras correspondientes en el grupo de control de vehículo. Las barras de error son el error estándar.
La FIGURA 34 es una gráfica que muestra datos de transferencia Western de sujetos en Fase 1a con DX-2930 después del tratamiento con FXIIa. Las barras de error se calcularon usando la desviación estándar entre sujetos. Los sujetos del Grupo 1 recibieron una dosis de 0,1 mg/kg, los sujetos del Grupo 2 recibieron una dosis de 0,3 mg/kg, los sujetos del Grupo 3 recibieron una dosis de 1 mg/kg, y los sujetos del Grupo 4 recibieron una dosis de 3 mg/kg.
La FIGURA 35 muestra una gráfica de datos de transferencia Western de sujetos de Fase 1 a con DX-2930 en ausencia de tratamiento con FXIIa. Las barras de error se calcularon usando la desviación estándar entre sujetos. Los sujetos del Grupo 1 recibieron una dosis de 0,1 mg/kg, los sujetos del Grupo 2 recibieron una dosis de 0,3 mg/kg, los sujetos del Grupo 3 recibieron una dosis de 1 mg/kg, y los sujetos del Grupo 4 recibieron una dosis de 3 mg/kg.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Se describen aquí ensayos para medir niveles, en una muestra de un sujeto, de biomarcadores asociados con el sistema de calicreína plasmática (pKal), tales como cininógeno intacto de alto peso molecular (HMWK), HMWK escindido, y/o actividad de pKal. En algunas realizaciones, los ensayos comprenden incubar una muestra obtenida del sujeto con un activador del sistema pKal, y medir los niveles de cininógeno intacto de alto peso molecular (HMWK), HMWK escindido, y/o actividad de pKal. Dichos ensayos son útiles, por ejemplo, para evaluar si el sujeto tiene o está en riesgo de padecer una enfermedad asociada con pKal, para evaluar el tratamiento de una enfermedad asociada con pKal, y para identificar candidatos farmacéuticos, por ejemplo moduladores de pKal tales como inhibidores de pKal. Dichos ensayos también son útiles, por ejemplo, para seleccionar sujetos para tratamiento, tal como para el tratamiento de una enfermedad asociada con pKal.
Definiciones
Por conveniencia, antes de la descripción adicional de la presente descripción, se definen aquí ciertos términos empleados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas. Los demás términos se definen como aparecen en la memoria descriptiva.
Las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Como se usa aquí, “adquirir” o “adquiriendo” se refiere a obtener la posesión de una entidad física, o un valor, por ejemplo un valor numérico, “adquiriendo directamente” o “adquiriendo indirectamente” la entidad física o el valor. “Adquirir directamente” significa realizar un procedimiento (por ejemplo, realizar un ensayo o prueba en una muestra o “analizar una muestra” como se define ese término aquí) para obtener la entidad física o el valor. “Adquiriendo indirectamente” se refiere a recibir la entidad física o el valor de otra parte o fuente (por ejemplo, un laboratorio de terceros que adquirió directamente la entidad física o el valor). Adquirir directamente una entidad física incluye realizar un procedimiento, por ejemplo analizar una muestra, que incluye un cambio físico en una sustancia física, por ejemplo un material de partida. Los cambios ejemplares incluyen obtener una entidad física a partir de dos o más materiales de partida, cortar o fragmentar una sustancia, separar o purificar una sustancia, combinar dos o más entidades separadas en una mezcla, realizar una reacción química que incluye romper o formar un enlace covalente o no covalente. Adquirir directamente un valor incluye realizar un procedimiento que incluye un cambio físico en una muestra u otra sustancia, por ejemplo realizar un procedimiento analítico que incluye un cambio físico en una sustancia, por ejemplo una muestra, analito o reactivo (a veces denominado aquí como “análisis físico”), realizar un método analítico, por ejemplo un método que incluye uno o más de los siguientes: separar o purificar una sustancia, por ejemplo un analito, o un fragmento u otro derivado del mismo, de otra sustancia; combinar un analito, o fragmento u otro derivado del mismo, con otra sustancia, por ejemplo un amortiguador, disolvente o agente reaccionante; o cambiar la estructura de un analito, o un fragmento u otro derivado del mismo, por ejemplo rompiendo o formando un enlace covalente o no covalente, entre un primer y un segundo átomo del analito; o cambiando la estructura de un reactivo, o un fragmento u otro derivado del mismo, por ejemplo rompiendo o formando un enlace covalente o no covalente, entre un primer y un segundo átomo del reactivo.
Como se usa aquí, “analizar” una muestra incluye realizar un procedimiento que implica un cambio físico en una muestra u otra sustancia, por ejemplo un material de partida. Los cambios ejemplares incluyen obtener una entidad física a partir de dos o más materiales de partida, cortar o fragmentar una sustancia, separar o purificar una sustancia, combinar dos o más entidades separadas en una mezcla, realizar una reacción química que incluye romper o formar un enlace covalente o no covalente. Analizar una muestra puede incluir realizar un procedimiento analítico que incluye un cambio físico en una sustancia, por ejemplo una muestra, analito o reactivo (a veces denominado aquí como “análisis físico”), realizar un método analítico, por ejemplo un método que incluye uno o más de los siguientes: separar o purificar una sustancia, por ejemplo un analito, o un fragmento u otro derivado del mismo, de otra sustancia; combinar un analito, o fragmento u otro derivado del mismo, con otra sustancia, por ejemplo un amortiguador, disolvente o agente reaccionante; o cambiar la estructura de un analito, o un fragmento u otro derivado del mismo, por ejemplo rompiendo o formando un enlace covalente o no covalente, entre un primer y un segundo átomo del analito; o cambiar la estructura de un reactivo, o un fragmento u otro derivado del mismo, por ejemplo rompiendo o formando un enlace covalente o no covalente, entre un primer y un segundo átomo del reactivo.
El término “agonista”, como se usa aquí, se refiere a un agente que imita o regula positivamente (por ejemplo, potencia o suplementa) la bioactividad de una proteína. Un agonista puede ser una proteína de tipo salvaje o un derivado de la misma que tiene al menos una bioactividad de la proteína de tipo salvaje. Un agonista también puede ser un compuesto que aumenta al menos una bioactividad de una proteína. Un agonista también puede ser un compuesto que aumenta la interacción de un polipéptido con otra molécula, por ejemplo un péptido o ácido nucleico diana.
El término “antagonista”, como se usa aquí, se refiere a un agente que regula negativamente (por ejemplo, suprime o inhibe) al menos una bioactividad de una proteína. Un antagonista puede ser un compuesto que inhibe o reduce la interacción entre una proteína y otra molécula, por ejemplo un péptido diana o un sustrato enzimático. Un antagonista también puede ser un compuesto que reduce o inhibe la cantidad de proteína expresada presente. Normalmente, inhibir una proteína o un gen se refiere a reducir la expresión o una actividad relevante de la proteína o gen en al menos 10% o más, por ejemplo, 20%, 30%, 40% o 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más, o una disminución en la expresión o la actividad relevante de más de 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces, 100 veces o más, según se mide mediante uno o más métodos descritos aquí o reconocidos en la técnica.
Como se usa aquí, “afinidad de unión” se refiere a la constante de asociación aparente o Ka . La Ka es el recíproco de la constante de disociación (Kd). Una proteína de unión puede tener, por ejemplo, una afinidad de unión de al menos 105, 106, 107, 108, 109, 1010 y 1011 M-1 para una molécula diana particular. La unión de mayor afinidad de una proteína de unión a una primera diana con respecto a una segunda diana puede indicarse por una mayor Ka (o un valor numérico Kd menor) para la unión a la primera diana que la Ka (o valor numérico Kd) para la unión a la segunda diana. En tales casos, la proteína de unión tiene especificidad para la primera diana (por ejemplo, una proteína en una primera conformación o imitación de la misma) con respecto a la segunda diana (por ejemplo, La misma proteína en una segunda conformación o imitación de la misma; o una segunda proteína). Las diferencias en la afinidad de unión (por ejemplo, para la especificidad u otras comparaciones) pueden ser de al menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37,5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000 o 105 veces.
La afinidad de unión se puede determinar mediante una variedad de métodos que incluyen diálisis en equilibrio, unión en equilibrio, filtración en gel, ELISA, resonancia de plasmones superficiales, o espectroscopía (por ejemplo, usando un ensayo de fluorescencia). Las condiciones ejemplares para evaluar la afinidad de unión están en amortiguador TRIS (TRIS 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl25 mM a pH 7,5). Estas técnicas pueden usarse para medir la concentración de proteína de unión unida y libre como una función de la concentración de proteína de unión (o diana). La concentración de proteína de unión unida ([Unida]) está relacionada con la concentración de proteína de unión libre ([Libre]) y la concentración de sitios de unión para la proteína de unión en la diana, en la que (N) es el número de sitios de unión por molécula diana, mediante la siguiente ecuación:
[Unida] = N ■ [Libre]/((1/Ka) [Libre]).
No siempre es necesario realizar una determinación exacta de Ka, aunque, dado que a veces es suficiente obtener una medida cuantitativa de afinidad, por ejemplo determinada mediante un método tal como ELISA o análisis FACS, es proporcional a Ka, y de este modo se puede usar para comparaciones, tales como determinar si una mayor afinidad es, por ejemplo, 2 veces mayor, para obtener una medida cualitativa de afinidad, o para obtener una inferencia de afinidad, por ejemplo por actividad en un ensayo funcional, por ejemplo un ensayo in vitro o in vivo.
La expresión “proteína de unión” se refiere a una proteína que puede interactuar con una molécula diana. Esta expresión se usa indistintamente con “ligando”. Una “proteína de unión a calicreína plasmática” se refiere a una proteína que puede interactuar con (por ejemplo, unirse a) calicreína plasmática, e incluye, en particular, proteínas que interactúan preferente o específicamente con y/o inhiben la calicreína plasmática. Una proteína inhibe la calicreína plasmática si provoca una disminución en la actividad de la calicreína plasmática en comparación con la actividad de la calicreína plasmática en ausencia de la proteína y en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática es un anticuerpo.
La expresión “reactivo de captura” se refiere a un resto que se une específicamente a su ligando.
Como se usa aquí, los términos “complejo” o “formación de complejo” se refieren a un complejo entre miembros que tienen una afinidad específica entre sí.
Una “sustitución conservativa de aminoácidos” es aquella en la que el resto de aminoácido se reemplaza por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales de ramificación beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).
Las secuencias de motivos para biopolímeros pueden incluir posiciones que pueden ser aminoácidos variados. Por ejemplo, el símbolo “X” en tal contexto generalmente se refiere a cualquier aminoácido (por ejemplo, cualquiera de los veinte aminoácidos naturales) a menos que se especifique lo contrario, por ejemplo para referirse a cualquier aminoácido que no sea cisteína. También se pueden indicar otros aminoácidos permitidos, por ejemplo usando paréntesis y barras. Por ejemplo, “(A/W/F/N/Q)” significa que la alanina, triptófano, fenilalanina, asparagina y glutamina están permitidos en esa posición particular.
Como se usa aquí, un “reactivo de detección” se refiere a un resto que se une al resto a detectar. Normalmente genera una señal, por ejemplo fluorescencia, o produce un compuesto medible.
Un “epítopo” se refiere al sitio en un compuesto diana que está unido por una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo tal como un Fab o un anticuerpo de longitud completa). En el caso de que el compuesto diana sea una proteína, el sitio puede estar compuesto completamente de componentes de aminoácidos, compuesto completamente de modificaciones químicas de aminoácidos de la proteína (por ejemplo, restos de glicosilo), o compuesto de combinaciones de los mismos. Los epítopos superpuestos incluyen al menos un resto de aminoácido común, grupo glicosilo, grupo fosfato, grupo sulfato, u otra característica molecular.
Una primera proteína de unión (por ejemplo, anticuerpo) “se une al mismo epítopo” como una segunda proteína de unión (por ejemplo, anticuerpo) si la primera proteína de unión se une al mismo sitio en un compuesto diana al que se une la segunda proteína de unión, o se une a un sitio que se superpone (por ejemplo, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de superposición, por ejemplo en términos de secuencia de aminoácidos u otra característica molecular (por ejemplo, grupo glicosilo, grupo fosfato o grupo sulfato)) con el sitio al que se une la segunda proteína de unión.
Una primera proteína de unión (por ejemplo, anticuerpo) “compite por la unión” con una segunda proteína de unión (por ejemplo, anticuerpo) si la unión de la primera proteína de unión a su epítopo disminuye (por ejemplo, en 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% o más) la cantidad de la segunda proteína de unión que se une a su epítopo. La competencia puede ser directa (por ejemplo, la primera proteína de unión se une a un epítopo que es el mismo que, o se superpone con, el epítopo unido por la segunda proteína de unión), o indirecta (por ejemplo, la unión de la primera proteína de unión a su epítopo provoca un cambio estérico en el compuesto diana que disminuye la capacidad de la segunda proteína de unión para unirse a su epítopo).
Como se usa aquí, una molécula biológica “funcional” es una molécula biológica en una forma en la que exhibe una propiedad y/o actividad por la que se caracteriza.
Los cálculos de “homología” o “identidad de secuencia” entre dos secuencias (los términos se usan indistintamente aquí) se realizan como sigue. Las secuencias se alinean con fines de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir espacios en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para una alineación óptima, y las secuencias no homólogas se pueden descartar para fines de comparación). La alineación óptima se determina como la mejor puntuación usando el programa GAP en el paquete de software GCG con una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización de espacio de 12, una penalización de extensión de espacio de 4, y una penalización de espacio de cambio de marco de 5. Los restos de aminoácidos o nucleótidos se comparan entonces en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa aquí, la “identidad” de aminoácidos o ácidos nucleicos es equivalente a “homología” de aminoácidos o de ácidos nucleicos). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias.
En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada con fines de comparación es al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, más preferiblemente al menos 50%, incluso más preferiblemente al menos 60%, e incluso más preferiblemente al menos 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% o 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia de referencia puede ser la longitud de la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina.
Como se usa aquí, la expresión “se hibrida en condiciones de restricción baja, restricción media, restricción alta, o restricción muy alta” describe las condiciones para la hibridación y el lavado. En Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, se puede encontrar una guía para realizar reacciones de hibridación. Los métodos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia, y se pueden utilizar. Las condiciones de hibridación específicas a las que se hace referencia aquí son las siguientes: (1) condiciones de hibridación de baja restricción en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a alrededor de 45°C, seguido de dos lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% al menos a 50°C (la temperatura de los lavados se puede aumentar hasta 55°C para condiciones de baja restricción); (2) condiciones de hibridación de restricción media en 6X SSC a alrededor de 45°C, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 60°C; (3) condiciones de hibridación de restricción alta en 6X SSC a alrededor de 45°C, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 65°C; y (4) las condiciones de hibridación de restricción muy alta son fosfato sódico 0,5 M, SDS al 7% a 65°C, seguido de uno o más lavados a 0,2X SSC, SDS al 1% a 65°C. Las condiciones de restricción muy alta (4) son las condiciones preferidas y las que deben usarse a menos que se especifique lo contrario. La descripción incluye ácidos nucleicos que se hibridan con restricción baja, media, alta o muy alta con un ácido nucleico descrito aquí o con un complemento del mismo, por ejemplo ácidos nucleicos que codifican una proteína de unión descrita aquí. Los ácidos nucleicos pueden tener la misma longitud o estar dentro del 30, 20 o 10% de la longitud del ácido nucleico de referencia. El ácido nucleico puede corresponder a una región que codifica una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina descrita aquí.
Una “composición aislada” se refiere a una composición que se elimina de al menos el 90% de al menos un componente de una muestra natural de la que se puede obtener la composición aislada. Las composiciones producidas artificial o naturalmente pueden ser “composiciones de al menos” un cierto grado de pureza si la especie o población de especies de interés es al menos 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98, o 99% pura en una base de pesopeso.
Como se usa aquí, la expresión “in vitro" se refiere a eventos que ocurren en un ambiente artificial, por ejemplo en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en cultivo celular, etc., en lugar de dentro de un organismo multicelular.
Como se usa aquí, la expresión “in vivo" se refiere a eventos que ocurren dentro de un organismo multicelular, tal como un ser humano o animal no humano.
Una “composición aislada” se refiere a una composición que se elimina de al menos el 90% de al menos un componente de una muestra natural de la que se puede obtener la composición aislada. Las composiciones producidas artificial o naturalmente pueden ser “composiciones de al menos” un cierto grado de pureza si la especie o población de especies de interés es al menos 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98, o 99% pura en una base de pesopeso.
Una proteína “aislada” se refiere a una proteína que se elimina de al menos el 90% de al menos un componente de una muestra natural de la que se puede obtener la proteína aislada. Las proteínas pueden tener “al menos” un cierto grado de pureza si la especie o población de especies de interés es al menos 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98, o 99% pura en una base de peso-peso.
El término “calicreína” (por ejemplo, calicreína plasmática) se refiere a peptidasas (enzimas que rompen enlaces peptídicos en proteínas), un subgrupo de la familia de las serina proteasas. La calicreína plasmática escinde el cininógeno para generar cininas, potentes péptidos proinflamatorios.
La expresión “inhibidor de calicreína” se refiere a cualquier agente o molécula que inhibe la calicreína. Por ejemplo, DX-88 (también denominado aquí “PEP-1 ”) es un inhibidor potente (Ki <1 nM) y específico de la calicreína plasmática (NP_000883). (Véanse también, por ejemplo, los documentos WO 95/21601 o WO 2003/103475).
Como se usa aquí, el término “DX-2922” se usa indistintamente con el término “X101-A01”. A continuación se describen otras variantes de este anticuerpo.
Figure imgf000013_0001
Como se usa aquí, el término “DX-2930” se usa indistintamente con el término “X124-G01”. A continuación se describen otras variantes de este anticuerpo.
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El término “modulador” se refiere a un polipéptido, ácido nucleico, macromolécula, complejo, molécula, molécula pequeña, compuesto, especie, o similar (de origen natural o no natural), o un extracto elaborado a partir de materiales biológicos tales como bacterias, plantas, hongos, o células o tejidos de animales, que pueden ser capaces de provocar modulación. Los moduladores pueden evaluarse para determinar la actividad potencial como inhibidores o activadores (directa o indirectamente) de una propiedad funcional, actividad biológica o proceso, o una combinación de ellos (por ejemplo, agonista, antagonista parcial, agonista parcial, agonista inverso, antagonista, agentes antimicrobianos, inhibidores de la proliferación o infección microbiana, y similares) por inclusión en ensayos. En tales ensayos, se pueden cribar muchos moduladores al mismo tiempo. La actividad de un modulador puede ser conocida, desconocida, o parcialmente conocida.
Un resto de aminoácido “no esencial” es un resto que se puede alterar de la secuencia de tipo salvaje del agente de unión, por ejemplo el anticuerpo, sin abolir, o más preferiblemente, sin alterar sustancialmente una actividad biológica, mientras que cambiar un resto de aminoácido “esencial” da como resultado una pérdida sustancial de actividad.
Un “paciente”, “sujeto” u “hospedante” (estos términos se usan indistintamente) a tratar mediante el método en cuestión puede significar un ser humano o animal no humano. En algunas realizaciones, un sujeto tiene riesgo de sufrir un trastorno mediado por calicreína o lo padece, por ejemplo un trastorno mediado por bradicinina, por ejemplo angioedema hereditario (HAE). En algunas realizaciones, un sujeto tiene riesgo de o sufre de angioedema idiopático no dependiente de histamina, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, lupus, enfermedad de Alzheimer, choque séptico, lesión por quemadura, lesión por isquemia/reperfusión cerebral, edema cerebral, retinopatía diabética, nefropatía diabética, edema macular, vasculitis, trombosis arterial o venosa, trombosis asociada con dispositivos de asistencia ventricular o endoprótesis vasculares, trombocitopenia inducida por heparina con trombosis, enfermedad tromboembólica, y cardiopatía coronaria con angina de pecho inestable, edema, enfermedad ocular, gota, enfermedad inflamatoria del intestino, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, estenosis espinal-enfermedad degenerativa de la columna vertebral, íleo postoperatorio, aneurisma aórtico, osteoartritis, angioedema hereditario, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peri-tumoral, septicemia, evento isquémico agudo de arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), restenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad neurológica, una enfermedad asociada con plegamiento incorrecto de proteínas, una enfermedad asociada con angiogénesis, nefropatía hipertensiva y nefropatía diabética, enfermedades alérgicas y respiratorias (por ejemplo anafilaxia, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, síndrome disneico agudo, fibrosis quística, rinitis persistente) y lesiones tisulares (por ejemplo, lesión por quemadura o química).
Los términos “precalicreína” y “calicreína preplasmática” se usan indistintamente aquí, y se refieren a la forma zimógena de calicreína plasmática activa, que también se conoce como precalicreína.
El término “que previene” o “prevenir” una enfermedad en un sujeto se refiere a someter al sujeto a un tratamiento farmacéutico, por ejemplo la administración de un fármaco, de modo que se prevenga al menos un síntoma de la enfermedad, es decir, se administre antes de la manifestación clínica de la afección no deseada (por ejemplo, enfermedad u otro estado no deseado del animal hospedante) de modo que proteja al hospedante contra el desarrollo de la afección no deseada. “Prevenir” una enfermedad también puede denominarse “profilaxis” o “tratamiento profiláctico”.
Como se usa aquí, la expresión “sustancialmente idéntica” (o “sustancialmente homóloga”) se usa aquí para referirse a una primera secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos que contiene un número suficiente de restos de aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con una cadena lateral similar, por ejemplo sustituciones de aminoácidos conservadas) a una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico, de modo que la primera y la segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos tengan (o codifiquen proteínas que tienen) actividades similares, por ejemplo una actividad de unión, una preferencia de unión, o una actividad biológica. En el caso de los anticuerpos, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad, y tiene al menos 50%, al menos 25%, o al menos 10% de afinidad con respecto al mismo antígeno.
Las secuencias similares u homólogas (por ejemplo, al menos alrededor de 85% de identidad de secuencia) a las secuencias descritas aquí también forman parte de esta solicitud. En algunas realizaciones, la identidad de secuencia puede ser alrededor de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor.
Además, la identidad sustancial existe cuando los segmentos de ácido nucleico se hibridan en condiciones de hibridación selectivas (por ejemplo, condiciones de hibridación muy restrictivas) con el complemento de la hebra. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura.
Las secuencias de motivos para biopolímeros pueden incluir posiciones que pueden ser aminoácidos variados. Por ejemplo, el símbolo “X” en tal contexto generalmente se refiere a cualquier aminoácido (por ejemplo, cualquiera de los veinte aminoácidos naturales) a menos que se especifique lo contrario, por ejemplo para referirse a cualquier aminoácido que no sea cisteína. También se pueden indicar otros aminoácidos permitidos, por ejemplo usando paréntesis y barras. Por ejemplo, “(A/W/F/N/Q)” significa que la alanina, triptófano, fenilalanina, asparagina y glutamina están permitidos en esa posición particular.
La significancia estadística se puede determinar mediante cualquier método conocido en la técnica. Las pruebas estadísticas ejemplares incluyen: la prueba de la T de Student, la prueba no paramétrica U de Mann Whitney, y la prueba estadística no paramétrica de Wilcoxon. Algunas relaciones estadísticamente significativas tienen un valor de P de menos de 0,05 o 0,02. Los términos “inducir”, “inhibir”, “potenciar”, “elevar”, “aumentar”, “disminuir”, o similares, por ejemplo que denotan diferencias cualitativas o cuantitativas distinguibles entre dos estados, pueden referirse a una diferencia, por ejemplo una diferencia estadísticamente significativa, entre los dos estados.
Como se usa aquí, una “muestra” se refiere a una composición que comprende tejido, por ejemplo sangre, plasma o proteína, de un sujeto. Una muestra incluye tanto una muestra inicial no procesada tomada de un sujeto así como procesada posteriormente, por ejemplo formas parcialmente purificadas o conservadas. Las muestras ejemplares incluyen sangre, plasma, lágrimas, o moco.
Una “dosis terapéuticamente eficaz” modula preferiblemente un parámetro medible, por ejemplo la actividad de calicreína plasmática, en un grado estadísticamente significativo o al menos alrededor de 20%, más preferiblemente al menos alrededor de 40%, incluso más preferiblemente al menos alrededor de 60%, y aún más preferiblemente en al menos alrededor de 80% con respecto a los sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para modular un parámetro medible, por ejemplo un parámetro asociado a una enfermedad, puede evaluarse en un sistema de modelo animal predictivo de la eficacia en trastornos y afecciones humanas. Alternativamente, esta propiedad de una composición puede evaluarse examinando la capacidad del compuesto para modular un parámetro in vitro.
“Tratar” una enfermedad (o afección) en un sujeto, o “tratar” a un sujeto que tiene una enfermedad, se refiere a someter al sujeto a un tratamiento farmacéutico, por ejemplo la administración de un fármaco, de modo que al menos un síntoma de la enfermedad se cure, se alivie o disminuya.
El término “prevenir” una enfermedad en un sujeto se refiere a someter al sujeto a un tratamiento farmacéutico, por ejemplo la administración de un fármaco, de manera que se prevenga al menos un síntoma de la enfermedad, es decir, se administre antes de la manifestación clínica de la afección no deseada (por ejemplo, enfermedad u otro estado no deseado del animal hospedante) de modo que protege al hospedante contra el desarrollo de la afección no deseada. “Prevenir” una enfermedad también puede denominarse “profilaxis” o “tratamiento profiláctico”.
Una “cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Normalmente, debido a que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
Los títulos, incluyendo los alfabéticos o numéricos, son simplemente para facilitar la comprensión y la lectura, y, en ausencia de una indicación expresa de lo contrario, no imponen un orden temporal ni una jerarquía de preferencias.
Biomarcadores del sistema de contacto
La calicreína plasmática circula como un zimógeno inactivo, denominado precalicreína, que está unido principalmente a su sustrato, el cininógeno de alto peso molecular (HMWK). En respuesta a un estímulo, FXII se activa a FXIIa. FXIIa escinde la precalicreína para formar calicreína plasmática activa (Figura 1). Aproximadamente el 75-90% de precalicreína circulante se une a HMWK a través de una interacción de sitio no activo con el dominio 6 de HMWK. La pKal activa libre y unida a HMWK genera HMWK escindida y bradicinina. Los biomarcadores de la activación de calicreína plasmática se muestran en la Tabla 2. La idoneidad de un biomarcador puede demostrarse siguiendo sus niveles en presencia y ausencia de un ataque agudo de HAE. Los niveles de estos biomarcadores también podrían alterarse durante un ataque de edema mediado por bradicinina, u otra enfermedad mediada por la actividad de pKal.
La Tabla 2 a continuación proporciona marcadores que pueden evaluarse mediante los métodos descritos en la Tabla 2 y en otras partes de este documento para evaluar a los sujetos en busca de trastornos mediados por pKal o bradicinina. La Tabla 2 indica la dirección del cambio en el nivel del marcador asociado con un trastorno mediado por pKal o bradicinina.
Ensayos para biomarcadores
Los niveles (por ejemplo, la cantidad) de biomarcadores descritos aquí, o los cambios en los niveles de biomarcadores descritos aquí, se pueden evaluar usando ensayos descritos aquí y/o ensayos conocidos en la técnica. Los ensayos que pueden usarse para evaluar los niveles de biomarcadores incluyen, por ejemplo, inmunoensayos, por ejemplo transferencias Western, ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) (por ejemplo, ELISA de tipo sándwich), radioinmunoensayos, ensayos de detección basados en electroquimioluminiscencia, y técnicas relacionadas. También se pueden utilizar enfoques basados en espectrometría de masas. También se pueden emplear ensayos que se basan en un sustrato cromogénico.
En algunas realizaciones, se usa un ensayo de detección de electroquimioluminiscencia o un ensayo que se basa en una combinación de tecnología de matriz de patrón y electroquimioluminiscencia (por ejemplo, un ensayo de tecnología ECL o MULTI-ARRAY de Meso Scale Discovery (MSD)).
(i) Precalicreína
Los niveles de precalicreína se pueden evaluar usando ensayos existentes para precalicreína, por ejemplo inmunoensayos, por ejemplo un ELISA de precalicreína. Por ejemplo, un kit de ELISA de precalicreína está disponible comercialmente en antibodiesonline.com (número de catálogo: ABIN858073). Los anticuerpos que se unen a precalicreína son conocidos en la técnica, y pueden usarse, por ejemplo en inmunoensayos, para la detección de precalicreína. Por ejemplo, se han producido anticuerpos monoclonales murinos anti-precalicreína humana. Véase, por ejemplo, Veloso, D. et al. Blood, 1987, 70(4):1053-62. Un anticuerpo de oveja anti-precalicreína humana está disponible comercialmente de GenWay Biotech, Inc. (GenWay ID: GWB-58AC79).
En una realización, se determina el nivel de pKal en una alícuota de muestra. Después, toda la precalicreína en una alícuota de muestra se convierte en pKal y se mide el nivel de pKal. Restar el primero del segundo da la cantidad de precalicreína. Las determinaciones del nivel se pueden realizar mediante la actividad enzimática.
(ii) Calicreína plasmática activa
La calicreína plasmática activa (pKal activa) puede detectarse, por ejemplo, mediante un inmunoensayo. El inmunoensayo puede usar un anticuerpo que solo se une a la calicreína plasmática activa, tal como, por ejemplo, DX-2930 o DX-2922. En una realización, el ensayo se basa en la unión de pKal activa a un reactivo de captura, por ejemplo un inhibidor de calicreína, por ejemplo un polipéptido que es similar en secuencia a DX-88, por ejemplo uno que difiere de DX-88 en no más de 1, 2 o 5 restos de aminoácidos, por ejemplo EPIKAL-2.
En una realización, el reactivo de captura se proporciona sobre un sustrato, se pone en contacto con la muestra, y se determina la cantidad unida al reactivo de captura, por ejemplo con un anticuerpo anti-pKal. En una realización, la manipulación de la muestra, por ejemplo la transferencia de un recipiente a otro, se minimiza, para reducir los niveles de activación por contacto. En realizaciones, el reactivo de captura se dispone en el mismo dispositivo, por ejemplo un recipiente de recolección, por ejemplo un tubo de recolección de sangre, que se usa para recolectar una muestra, por ejemplo sangre, del sujeto.
También dentro de la presente descripción hay un ensayo de activación ex vivo para determinar la actividad de pKal (por ejemplo, un ensayo de actividad de pKal basado en microplacas), que puede comprender (i) proporcionar una muestra de plasma de un sujeto; (ii) incubar la muestra de plasma con un activador del sistema pKal en presencia de un sustrato de pKal, en el que el sustrato está unido a un marcador que es capaz de liberar una señal detectable después de ser escindido por pKal; y (iii) medir la actividad de pKal basándose en la magnitud de la señal detectable. En algunos ejemplos, el activador es el Factor FXIIa. En algunos ejemplos, la muestra de plasma se incuba con el activador, el sustrato de pKal, y un candidato inhibidor de pKal. El método puede comprender además evaluar la actividad del
Tabla 2. Biomarcadores asociados con KMA
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candidato inhibidor de pKal, en el que un nivel reducido de actividad de pKal en presencia del candidato inhibidor de pKal con respecto al nivel de actividad de pKal en ausencia del candidato inhibidor de pKal indica que el candidato inhibidor es eficaz.
El método también puede comprender además evaluar si el sujeto tiene o está en riesgo de padecer una enfermedad asociada con pKal; en el que un nivel elevado de actividad de pKal en comparación con un valor predeterminado (por ejemplo, un nivel de actividad de pKal en muestra o muestras de un sujeto sano o población de sujetos sanos) indica que el sujeto tiene o está en riesgo de padecer la enfermedad.
El método también puede comprender además evaluar la eficacia del tratamiento, tal como un tratamiento para una enfermedad asociada con pKal. Múltiples biomuestras (por ejemplo, muestras de plasma) pueden obtenerse de un paciente que tiene una enfermedad relacionada con pKal, tal como HAE, y que está siendo tratado por un agente terapéutico tal como un inhibidor de pKal, antes, durante el transcurso del tratamiento, y/o después del tratamiento. Los niveles de actividad de pKal o un biomarcador indicativo de la actividad de pKal en esas biomuestras se pueden medir usando cualquiera de los métodos de ensayo descritos aquí. Un nivel reducido de actividad de pKal, o un nivel reducido de uno o más biomarcadores indicativos de actividad de pKal en comparación con aquel anterior al tratamiento, o un nivel reducido de actividad de pKal/biomarcador durante el transcurso del tratamiento, indica que el tratamiento es eficaz.
(iii) Complejo a2M-pKal
El complejo de calicreína plasmática con alfa 2 macroglobulina (complejo a2M-pKal) puede detectarse, por ejemplo, usando un inmunoensayo. Por ejemplo, se ha desarrollado un ensayo ELISA basado en sándwich como se describe en el Ejemplo 2. También se dio a conocer un ELISA de tipo sándwich cuantitativo en Kaufman, N. et al. Blood, 1991, 77(12):2660-2667 y en Wachtfogel, Y.T. et al., 1989, Blood, 73:468-471. Se dio a conocer un ensayo enzimático de inmunoinmovilización en Harpel, P.C. et al., J Biol Chem, 1985, 260(7):4257-63). También se puede utilizar un ensayo de sustrato cromogénico, por ejemplo usando el sustrato cromogénico S-2302 disponible en chromogenicsubstrates.com, y el protocolo proporcionado en chromogenicsubstrates.com/methods/chromogenic_substrates_methods_kallikrein-like.htm.
(iv) Complejo C1INH-pKal
El complejo C1INH-pKal se puede detectar, por ejemplo, usando inmunoensayos, por ejemplo métodos ELISA, por ejemplo métodos descritos en el Ejemplo 3. Por ejemplo, se puede usar un ELISA de tipo sándwich en el que un anticuerpo anti-pKal (por ejemplo, mAb 13G11 de ratón) es el anticuerpo de captura y se usa un anticuerpo contra C1INH como el anticuerpo detector, o un ELISA de tipo sándwich en el que se usa un anticuerpo contra C1INH como el anticuerpo de captura y un anticuerpo anti-pKal (por ejemplo, mAb 13 G11 de ratón) es el anticuerpo detector. En la técnica se conocen anticuerpos contra C1 INH. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de ratón contra el inhibidor C1 humano está disponible de ABBIOTEC (número de catálogo 250122). Otro anticuerpo monoclonal de ratón contra el inhibidor C1 humano (4G12) está disponible en pierce-antibodies.com (n° de producto LF-MA0136). El anticuerpo de cabra anti-inhibidor C1 humano está disponible de Quidel (número de catálogo A300). En Wachtfogel, Y.T. et al., 1989, Blood, 73:468-471 se utilizó otro ensayo ELISA de tipo sándwich para la detección de complejos C1 INH-pKal.
(v) HMWK intacto
El cininógeno intacto de alto peso molecular (HMWK) puede ensayarse, por ejemplo, usando métodos coagulantes o inmunológicos, por ejemplo radioinmunoensayo (véase, por ejemplo, Kerbiriou-Nabias, D.M., Br J Haematol, 1984, 56(2):2734-86). Se conoce un anticuerpo monoclonal contra la cadena ligera de HMWK humano. Véase, por ejemplo, Reddigari, S.R. y Kaplan, A.P., Blood, 1999, 74:695-702. También se puede usar un ensayo para HMWK que se basa en un sustrato cromogénico. Véanse, por ejemplo, Scott, C.F. et al. Thromb Res, 1987, 48(6):685-700; Gallimore, M.J. et al. Thromb Res, 2004, 114(2):91 -96.
El gen humano que codifica HMWK es el cininógeno 1 (KNG1). KNG1 se transcribe y se empalma alternativamente para formar ARNm que codifican HMWK o cininógeno de bajo peso molecular (LMWK). A continuación se proporciona una secuencia de proteína ejemplar de HMWK:
>gi|156231037|ref|NP_001095886.1| precursor de la isoforma 1 del cininógeno-1 [Homo sapiens]
MKLITILFLCSRLLLSLTQESQSEEIDCNDKDLFKAVDAALKKYNSQNQSNNQFVLYRITEATKTVGSDT FYSFKYEIKEGDCPVQSGKTWQDCEYKDAAKAATGECTATVGKRSSTKFSVATQTCQITPAEGPVVTAQY DCLGCVHPISTQSPDLEPILRHGIQYFNNNTQHSSLFMLNEVKRAQRQVVAGLNFRITYSIVQTNCSKEN FLFLTPDCKSLWNGDTGECTDNAYIDIQLRIASFSQNCDIYPGKDFVQPPTKICVGCPRDIPTNSPELEE TLTHTITKLNAENNATFYFKIDNVKKARVQVVAGKKYFIDFVARETTCSKESNEELTESCETKKLGQSLD
CNAEVYVVPWEKKIYPTVNCQPLGMISLMKRPPGFSPFRSSRIGEIKEETTVSPPHTSMAPAQDEERDSG KEQGHTRRHDWGHEKQRKHNLGHGHKHERDQGHGHQRGHGLGHGHEQQHGLGHGHKFKLDDDLEHQGGHV LDHGHKHKHGHGHGKHKNKGKKNGKHNGWKTEHLASSSEDSTTPSAQTQEKTEGPTPIPSLAKPGVTVTF SDFQDSDLIATMMPPISPAPIQSDDDWIPDIQIDPNGLSFNPISDFPDTTSPKCPGRPWKSVSEINPTTQ MKESYYFDLTDGLS (SEQ IDNO: 5)
(vi) HMWK escindido
El cininógeno escindido de alto peso molecular (HMWK), también denominado aquí como “cininógeno escindido”, puede evaluarse, por ejemplo, usando métodos descritos en el Ejemplo 1, por ejemplo transferencia Western. Se pueden usar anticuerpos que se unen a HMWK escindido, tales como, por ejemplo, el clon de mAb de ratón 11H05. Además, el HMWK escindido se puede evaluar usando espectrometría de masas. En la técnica se conocen técnicas de inmunotransferencia para evaluar los niveles de HmW k escindido. Véase, por ejemplo, Buhler R. et al. Blood Coagul Fibrinolysis, 1995, 6(3):223-232.
A continuación se proporcionan ejemplos de secuencias de las cadenas pesada y ligera de cininógeno escindido. > cadena pesada de cininógeno-1 escindido QESQSEEIDCNDKDLFKAVDAALKKYNSQNQSNNQFVLYRITEATKTVGSDTFYSFKYEI KEGDCPVQSGKTWQDCEYKDAAKAATGECTATVGKRSSTKFSVATQTCQITPAEGPVVTA QYDCLGCVHPISTQSPDLEPILRHGIQYFNNNTQHSSLFMLNEVKRAQRQVVAGLNFRIT YSIVQTNCSKENFLFLTPDCKSLWNGDTGECTDNAYIDIQLRIASFSQNCDIYPGKDFVQ PPTKICVGCPRDIPTNSPELEETLTHTITKLNAENNATFYFKIDNVKKARVQVVAGKKYF IDFVARETTCSKESNEELTESCETKKLGQSLDCNAEVYVVPWEKKIYPTVNCQPLGMISL MK (SEQ IDNO: 6)
> cadena ligera de cininógeno-1 escindido SSRIGEIKEETTVSPPHTSMAPAQDEERDSGKEQGHTRRHDWGHEKQRKHNLGHGHKHER DQGHGHQRGHGLGHGHEQQHGLGHGHKFKLDDDLEHQGGHVLDHGHKHKHGHGHGKHKNK GKKNGKHNGWKTEHLASSSEDSTTPSAQTQEKTEGPTPIPSLAKPGVTVTFSDFQDSDLI ATMMPPISPAPIQSDDDWIPDIQIDPNGLSFNPISDFPDTTSPKCPGRPWKSVSEINPTT QMKESYYFDLTDGLS (SEQ IDNO: 7)
En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona un método de activación ex vivo. Dicho método puede comprender (i) incubar una muestra de plasma obtenida de un sujeto con un activador del sistema de calicreína plasmática (pKal) (por ejemplo, Factor FXIIa); (ii) medir los niveles de cininógeno de alto peso molecular intacto (HMWK), de HMWK escindido, o de ambos, en la muestra de plasma antes y después de la incubación; y (iii) determinar la reducción de HMWK intacto en la muestra después de la activación. En algunos ejemplos, los niveles de HMWK intacto y HMWK escindido se miden mediante un análisis de transferencia Western, por ejemplo un análisis de transferencia Western Simple Western™ Protein Simple®. Los ensayos Simple Western™ son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Rustandi et al. Electrophoresis. 2012 Sep; 33(17):2790-7). Los productos Simple Western™ también están disponibles comercialmente (véase, por ejemplo, ProteinSimple®, Santa Clara, CA). El método de activación ex vivo como se describe aquí puede usarse para evaluar la actividad de un candidato inhibidor de pKal en la inhibición de la activación del plasma. Más específicamente, la muestra de plasma se puede incubar con el activador en presencia del candidato inhibidor de pKal. Si el nivel de activación se reduce en presencia del candidato inhibidor, indica que el candidato es eficaz para inhibir la activación del plasma.
En otras realizaciones, la presente descripción proporciona métodos para medir HMWK escindido endógeno. Tal método puede comprender (i) proporcionar una muestra de plasma de un sujeto; y (ii) medir el nivel de HMWK escindido en la muestra de plasma. En algunos ejemplos, el nivel de HMWK escindido se mide mediante análisis de transferencia Western de tipo Protein Simple.
El ensayo de HMWK escindido endógeno se puede aplicar para identificar sujetos que tienen o se sospecha que tienen una enfermedad asociada con el sistema pKal, por ejemplo las descritas aquí. En algunos ejemplos, la muestra de plasma se obtiene de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad asociada con el sistema pKal. Si el HMWK escindido endógeno en el sujeto es elevado en comparación con el de un sujeto sano, indica que el sujeto tiene o se sospecha que tiene la enfermedad.
Alternativamente o además, el ensayo de HMWK escindido endógeno puede usarse para evaluar la eficacia de un tratamiento para una enfermedad asociada con el sistema pkal. En ese caso, la muestra de plasma se obtiene de un sujeto que padece la enfermedad y se trata con un inhibidor de pKal. Si se observa un nivel reducido de HMWK escindido después del tratamiento en comparación con el anterior al tratamiento, indica que el inhibidor de pKal es eficaz.
Como otra alternativa o además, el ensayo también puede usarse para evaluar si un sujeto tiene o está en riesgo de padecer una enfermedad asociada con pKal; en el que un nivel elevado de HMWK escindido en comparación con un valor predeterminado (por ejemplo, un nivel de HMWK escindido en muestra o muestras de un sujeto sano o población de sujetos sanos) indica que el sujeto tiene o está en riesgo de padecer la enfermedad.
El método también puede comprender además evaluar la eficacia del tratamiento, tal como un tratamiento para una enfermedad asociada con pKal. Múltiples biomuestras (por ejemplo, muestras de plasma) pueden obtenerse de un paciente que tiene una enfermedad relacionada con pKal, tal como HAE, y que está siendo tratado por un agente terapéutico tal como un inhibidor de pKal, antes, durante el transcurso del tratamiento, y/o después del tratamiento. Los niveles de HMWK intacto y/o HMWK escindido en esas biomuestras se pueden medir usando cualquiera de los métodos de ensayo descritos aquí. Un nivel reducido de HMWK escindido en comparación con aquel antes del tratamiento, o un nivel reducido de HMWK escindido durante el transcurso del tratamiento, indica que el tratamiento es eficaz.
Anticuerpos
En los métodos proporcionados se pueden usar anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno. En algunas realizaciones, un agente de captura es o comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno. En algunas realizaciones, un agente de detección es o comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno. En algunas realizaciones, una composición terapéutica para el tratamiento de un trastorno mediado por pKal o mediado por bradicinina es o comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno.
Como se usa aquí, el término “anticuerpo” se refiere a una proteína que incluye al menos un dominio variable de inmunoglobulina o una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir una región variable de cadena pesada (H) (abreviada aquí como VH), y una región variable de cadena ligera (L) (abreviada aquí como VL). En otro ejemplo, un anticuerpo incluye dos regiones variables de cadena pesada (H) y dos regiones variables de cadena ligera (L). El término “anticuerpo” abarca fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab y sFab, F(ab’)2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, scFv, y fragmentos de anticuerpos de dominio (dAb) (de Wildt et al., Eur J Immunol. 1996; 26(3):629-39.)), así como anticuerpos completos. Un anticuerpo puede tener las características estructurales de IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (así como sus subtipos). Los anticuerpos pueden ser de cualquier fuente, pero se prefieren los primates (primates humanos y no humanos) y primatizados.
Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas “regiones determinantes de la complementariedad” (“CDR”), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas “regiones estructurales” (“FR”). La extensión de la región estructural y las CDR se han definido con precisión (véanse, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, N iH Publication No. 91-3242, y Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol.
196:901-917, véase también www.hgmp.mrc.ac.uk). Las definiciones de Kabat se utilizan aquí. Cada VH y VL está compuesta típicamente por tres CDR y cuatro FR, ordenadas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, c Dr 1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
La cadena VH o VL del anticuerpo puede incluir además toda o parte de una región constante de cadena pesada o ligera, para formar de ese modo una cadena de inmunoglobulina pesada o ligera, respectivamente. En una realización, el anticuerpo es un tetrámero de dos cadenas de inmunoglobulinas pesadas y dos cadenas de inmunoglobulinas ligeras, en el que las cadenas de inmunoglobulinas pesadas y ligeras están interconectadas, por ejemplo, mediante enlaces de disulfuro. En las IgG, la región constante de la cadena pesada incluye tres dominios de inmunoglobulina, CH1, CH2 y CH3. La región constante de la cadena ligera incluye un dominio CL. La región variable de las cadenas pesada y ligera contiene un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos median típicamente la unión del anticuerpo a los tejidos o factores del hospedante, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico. Las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de tipo kappa o lambda. En una realización, el anticuerpo está glicosilado. Un anticuerpo puede ser funcional para la citotoxicidad dependiente de anticuerpos y/o la citotoxicidad mediada por el complemento.
Una o más regiones de un anticuerpo pueden ser humanas o efectivamente humanas. Por ejemplo, una o más de las regiones variables pueden ser humanas o efectivamente humanas. Por ejemplo, una o más de las CDR pueden ser humanas, por ejemplo HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC c Dr 2, y LC CDR3. Cada una de las CDR de cadena ligera puede ser humana. HC CDR3 puede ser humana. Una o más de las regiones estructurales pueden ser humanas, por ejemplo FR1, FR2, FR3 y FR4 de HC o LC. Por ejemplo, la región Fc puede ser humana. En una realización, todas las regiones estructurales son humanas, por ejemplo tienen una secuencia de una estructura de un anticuerpo producido por una célula somática humana, por ejemplo una célula hematopoyética que produce inmunoglobulinas o una célula no hematopoyética. En una realización, las secuencias humanas son secuencias de la línea germinal, por ejemplo codificadas por un ácido nucleico de la línea germinal. En una realización, los restos estructurales (FR) de un Fab seleccionado se pueden convertir en el tipo de aminoácido del resto correspondiente en el gen de la línea germinal de primates más similar, especialmente el gen de la línea germinal humana. Una o más de las regiones constantes pueden ser humanas o efectivamente humanas. Por ejemplo, al menos el 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 98, o 100% de un dominio variable de inmunoglobulina, la región constante, los dominios constantes (CH1, CH2, CH3, CL1), o todo el anticuerpo pueden ser humanos o efectivamente humanos.
Todo o parte de un anticuerpo puede estar codificado por un gen de inmunoglobulina o un segmento del mismo. Los genes de inmunoglobulina humana ejemplares incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa (IgA1 e IgA2), gamma (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta, épsilon y mu, así como los muchos genes de región variable de inmunoglobulina. Las “cadenas ligeras” de inmunoglobulina de longitud completa (alrededor de 25 Kda, o alrededor de 214 aminoácidos) están codificadas por un gen de región variable en el extremo NH2 (alrededor de 110 aminoácidos), y un gen de región constante kappa o lambda en el extremo COOH. Las “cadenas pesadas” de inmunoglobulina de longitud completa (alrededor de 50 Kda, o alrededor de 446 aminoácidos) están codificadas de manera similar por un gen de región variable (alrededor de 116 aminoácidos) y uno de los otros genes de región constante mencionados anteriormente, por ejemplo gamma (que codifica alrededor de 330 aminoácidos). La longitud de la HC humana varía considerablemente debido a que la HC CDR3 varía de alrededor de 3 restos de aminoácidos a más de 35 restos de aminoácidos.
La expresión “fragmento de unión a antígeno” de un anticuerpo de longitud completa se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo de longitud completa que retienen la capacidad de unirse específicamente a una diana de interés. Los ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro de la expresión “fragmento de unión a antígeno” de un anticuerpo de longitud completa incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab’)2 , un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos por un puente de disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada que conserva la funcionalidad. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes distintos, se pueden unir, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permita fabricarse como una única cadena de proteína en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes conocidas como Fv de cadena única (scFv). Véanse, por ejemplo, las patentes US 5.260.203, 4.946.778, y 4.881.175; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883.
Los fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse usando cualquier técnica apropiada, incluyendo las técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica. La expresión “anticuerpo monoespecífico” se refiere a un anticuerpo que muestra una única especificidad de unión y afinidad por una diana particular, por ejemplo un epítopo. Esta expresión incluye un “anticuerpo monoclonal” o “composición de anticuerpo monoclonal”, que, como se usa aquí, se refiere a una preparación de anticuerpos o fragmentos de los mismos de composición molecular única, independientemente de cómo se generó el anticuerpo.
Como se usa aquí, una región variable de inmunoglobulina “humanizada” se refiere a una región variable de inmunoglobulina que está modificada para incluir un número suficiente de posiciones de aminoácidos de estructura humana de modo que la región variable de inmunoglobulina no provoque una respuesta inmunogénica en un ser humano normal. Las descripciones de inmunoglobulinas “humanizadas” incluyen, por ejemplo, los documentos U.S.
6.407.213 y U.S. 5.693.762.
La constante de inhibición (Ki) proporciona una medida de la potencia del inhibidor; es la concentración de inhibidor requerida para reducir la actividad enzimática a la mitad, y no depende de las concentraciones de enzima o sustrato. La Ki aparente (Ki,app) se obtiene a diferentes concentraciones de sustrato midiendo el efecto inhibidor de diferentes concentraciones de inhibidor (por ejemplo, proteína de unión inhibidora) sobre la extensión de la reacción (por ejemplo, actividad enzimática); el ajuste del cambio en la constante de velocidad de pseudoprimer orden como una función de la concentración de inhibidor a la ecuación de Morrison (Ecuación 1) produce una estimación del valor de Ki aparente. La Ki se obtiene de la intersección con el eje Y extraído a partir de un análisis de regresión lineal de una gráfica de Ki,app frente a la concentración de sustrato.
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Ecuación 1
en la que v = velocidad medida; v0 = velocidad en ausencia de inhibidor; Ki,app = constante de inhibición aparente; I = concentración total de inhibidor; y E = concentración total de enzima.
Angioedema hereditario (HAE)
En algunas realizaciones, la enfermedad o afección que implica la actividad de la calicreína plasmática es el angioedema hereditario (HAE). El angioedema hereditario (HAE) también se conoce como “edema de Quincke”, deficiencia del inhibidor de la esterasa C1, deficiencia del inhibidor C1, y edema angioneurótico hereditario (HANE). El HAE se caracteriza por episodios recurrentes de inflamación grave (angioedema), que pueden afectar, por ejemplo, las extremidades, la cara, los genitales, el tubo digestivo, y las vías respiratorias. Los síntomas de1HAE incluyen, por ejemplo, hinchazón en los brazos, piernas, labios, ojos, lengua, y/o garganta; obstrucción de las vías respiratorias que puede implicar inflamación de la garganta y ronquera repentina; episodios repetidos de calambres abdominales sin una causa obvia; y/o hinchazón de los intestinos, que puede ser grave y provocar calambres abdominales, vómitos, deshidratación, diarrea, dolor, y/o choque. Alrededor de un tercio de las personas con este HAE desarrollan una erupción que no produce picazón y que se denomina eritema marginatum durante un ataque.
La inflamación de las vías respiratorias puede poner en peligro la vida y provocar la muerte en algunos pacientes. Las tasas de mortalidad se estiman entre 15%-33%. HAE conduce a alrededor de 15.000-30.000 visitas al departamento de urgencias por año.
El trauma o el estrés, por ejemplo procedimientos dentales, enfermedades (por ejemplo, enfermedades virales como resfriados y gripe), la menstruación, y la cirugía pueden desencadenar un ataque de angioedema. Para prevenir ataques agudos de HAE, los pacientes pueden intentar evitar estímulos específicos que hayan causado ataques previamente. Sin embargo, en muchos casos, se produce un ataque sin un desencadenante conocido. Por lo general, los síntomas del HAE aparecen por primera vez en la infancia y empeoran durante la pubertad. De media, las personas que no reciben tratamiento tienen un ataque cada 1 o 2 semanas, y la mayoría de los episodios duran alrededor de 3 a 4 días (ghr.nlm.nih.gov/condition/hereditary-angioedema). La frecuencia y duración de los ataques varían mucho entre las personas con angioedema hereditario, incluso entre personas de la misma familia.
Hay tres tipos de HAE, conocidos como tipos I, II y III. Se estima que el HAE afecta a 1 de cada 50.000 personas, que el tipo I representa alrededor de 85 por ciento de los casos, el tipo II representa alrededor de 15 por ciento de los casos, y el tipo III es muy raro. El tipo III es la forma descrita más recientemente, y originalmente se pensó que ocurría solo en mujeres, pero se han identificado familias con varones afectados.
El HAE se hereda con un patrón dominante autosómico, de modo que una persona afectada puede heredar la mutación de uno de los padres afectados. También pueden ocurrir nuevas mutaciones en el gen, y de este modo, e1HAE también puede aparecer en personas sin antecedentes familiares del trastorno. Se estima que el 20-25% de los casos son el resultado de una nueva mutación espontánea.
Las mutaciones en el gen SERPING1 causan angioedema hereditario tipo I y tipo II. El gen SERPING1 proporciona instrucciones para producir la proteína inhibidor C1, que es importante para controlar la inflamación. El inhibidor C1 bloquea la actividad de ciertas proteínas que promueven la inflamación. Las mutaciones que causan angioedema hereditario tipo I conducen a niveles reducidos del inhibidor C1 en la sangre. En contraste, las mutaciones que causan el tipo II dan como resultado la producción de un inhibidor C1 que funciona de manera anormal. Sin los niveles adecuados de inhibidor C1 funcional, se generan cantidades excesivas de bradicinina. La bradicinina promueve la inflamación al aumentar la fuga de líquido a través de las paredes de los vasos sanguíneos hacia los tejidos corporales. La acumulación excesiva de líquidos en los tejidos corporales provoca los episodios de hinchazón que se observan en personas con angioedema hereditario tipo I y tipo II.
Las mutaciones en el gen F12 se asocian con algunos casos de angioedema hereditario tipo III. El gen F12 proporciona instrucciones para producir el factor XII de coagulación. Además de desempeñar un papel fundamental en la coagulación de la sangre (coagulación), el factor XII también es un estimulador importante de la inflamación, y participa en la producción de bradicinina. Ciertas mutaciones en el gen F12 dan como resultado la producción de factor XII con mayor actividad. Como resultado, se genera más bradicinina, y las paredes de los vasos sanguíneos se vuelven más permeables, lo que conduce a episodios de hinchazón. Se desconoce la causa de otros casos de angioedema hereditario tipo III. Las mutaciones en uno o más genes aún no identificados pueden ser responsables del trastorno en estos casos.
El HAE puede presentarse de manera similar a otras formas de angioedema como resultado de alergias u otras afecciones médicas, pero difiere significativamente en la causa y el tratamiento. Cuando el angioedema hereditario se diagnostica erróneamente como una alergia, generalmente se trata con antihistamínicos, esteroides y/o epinefrina, que por lo general son ineficaces en el HAE, aunque la epinefrina se puede usar para las reacciones potencialmente mortales. Los diagnósticos erróneos también han dado lugar a una cirugía exploratoria innecesaria para los pacientes con hinchazón abdominal, y, en algunos pacientes con HAE, el dolor abdominal se ha diagnosticado incorrectamente como psicosomático.
Las terapias con inhibidores de C1, así como otras terapias para HAE, se describen en Kaplan, A.P., J Allergy Clin Immunol, 2010, 126(5):918-925.
El tratamiento agudo de los ataques de HAE se proporciona para detener la progresión del edema lo más rápido posible. El concentrado de inhibidor C1 de sangre de un donante, que se administra por vía intravenosa, es un tratamiento agudo; sin embargo, este tratamiento no está disponible en muchos países. En situaciones de emergencia en las que no se dispone de concentrado de inhibidor C1, se puede utilizar como alternativa plasma reciente congelado (PRC), ya que también contiene inhibidor C1.
El inhibidor C1 purificado, derivado de la sangre humana, se ha utilizado en Europa desde 1979. Actualmente, hay varios tratamientos con inhibidor C1 disponibles en los Estados Unidos de América, y ahora están disponibles dos productos de inhibidor C1 en Canadá. Berinert P (CSL Behring), que está pasteurizado, fue aprobado por la F.D.A. en 2009 para los ataques agudos. Cinryze (ViroPharma), que está nanofiltrado, fue aprobado por la F.D.A. en 2008 para la profilaxis. Rhucin (Pharming) es un inhibidor C1 recombinante en desarrollo que no conlleva el riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas debido a patógenos transmitidos por la sangre humana.
El tratamiento de un ataque agudo de HAE también puede incluir medicamentos para aliviar el dolor y/o líquidos intravenosos.
Otras modalidades de tratamiento pueden estimular la síntesis de inhibidor C1, o reducir el consumo de inhibidor C1. Los medicamentos andrógenos, tal como el danazol, pueden reducir la frecuencia y la gravedad de los ataques al estimular la producción de inhibidor C1.
Helicobacter pylori puede desencadenar ataques abdominales. Antibióticos para tratar h. pylori disminuirán los ataques abdominales.
Los tratamientos más nuevos atacan la cascada de contactos. Ecallantida (KALBITOR®, DX-88, Dyax) inhibe la calicreína plasmática, y ha sido aprobado en los Estados Unidos de América. El icatibant (FIRAZYR®, Shire) inhibe el receptor de bradicinina B2, y ha sido aprobado en Europa y en los Estados Unidos de América.
El diagnóstico de HAE puede basarse, por ejemplo, en antecedentes familiares y/o análisis de sangre. Los hallazgos de laboratorio asociados con HAE tipos I, II y III se describen, por ejemplo, en Kaplan, A.P., J Allergy Clin Immunol, 2010, 126(5):918-925. En el HAE de tipo I, el nivel de inhibidor C1 disminuye, al igual que el nivel de C4, mientras que el nivel de C1q es normal. En HAE tipo II, el nivel de inhibidor C1 es normal o está aumentado; sin embargo, la función del inhibidor C1 es anormal. El nivel de C4 está disminuido, y el nivel de C1q es normal. En el tipo III, los niveles de inhibidor C1, C4 y C1q pueden ser todos normales.
Los síntomas del HAE se pueden evaluar, por ejemplo, mediante cuestionarios, por ejemplo cuestionarios que completan los pacientes, los médicos o los familiares. Dichos cuestionarios son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, escalas analógicas visuales. Véase, por ejemplo, McMillan, C.V. et al. Patient. 2012; 5(2): 113-26.
Otros trastornos mediados por pKal o mediados por bradicinina
Otras enfermedades o afecciones ejemplares asociadas con la actividad de la calicreína plasmática incluyen angioedema idiopático no dependiente de histamina, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, lupus, enfermedad de Alzheimer, choque séptico, lesión por quemadura, lesión por isquemia/reperfusión cerebral, edema cerebral, retinopatía diabética, nefropatía diabética, edema macular, vasculitis, trombosis arterial o venosa, trombosis asociada con dispositivos de asistencia ventricular o endoprótesis vasculares, trombocitopenia inducida por heparina con trombosis, enfermedad tromboembólica, y cardiopatía coronaria con angina de pecho inestable, edema, enfermedad ocular, gota, enfermedad inflamatoria del intestino, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, estenosis espinal-enfermedad de la columna vertebral degenerativa, íleo postoperatorio, aneurisma aórtico, osteoartritis, angioedema hereditario, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), restenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad neurológica, una enfermedad asociada con plegamiento incorrecto de proteínas, una enfermedad asociada con angiogénesis, nefropatía hipertensiva y nefropatía diabética, enfermedades alérgicas y respiratorias (por ejemplo anafilaxia, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, síndrome disneico agudo, fibrosis quística, rinitis persistente) y lesiones tisulares (por ejemplo, lesión por quemadura o química).
Tratamiento
Un sujeto en riesgo de padecer o que padece un trastorno mediado por pKal o mediado por bradicinina, según se identifique usando un método de ensayo tal como los descritos aquí, puede tratarse con cualquier agente terapéutico apropiado. En algunas realizaciones, los métodos proporcionados incluyen seleccionar un tratamiento para un sujeto basándose en el resultado de un ensayo proporcionado, por ejemplo detección de biomarcadores.
En algunas realizaciones, el método comprende uno o ambos de seleccionar o administrar un agente terapéutico, por ejemplo un agente de unión a calicreína como se describe aquí, por ejemplo un antagonista del receptor de bradicinina B2 como se describe aquí, por ejemplo un agente de sustitución de C1-INH como se describe aquí, para la administración al sujeto basándose en el resultado del ensayo, por ejemplo detección de biomarcadores.
En algunas realizaciones, se administra a un sujeto una proteína o polipéptido de unión a calicreína plasmática. En algunas realizaciones, el agente de unión a calicreína es un inhibidor de calicreína, por ejemplo un péptido, un inhibidor de molécula pequeña, un anticuerpo contra calicreína, o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, se administra a un sujeto un antagonista del receptor de bradicinina B2. En algunas realizaciones, se administra a un sujeto un agente terapéutico de sustitución de C1-INH.
El agente terapéutico, por ejemplo inhibidor de calicreína, por ejemplo antagonista del receptor de bradicinina B2, por ejemplo agente de sustitución C1-INH, se puede administrar junto con otra terapia como parte de una terapia de combinación para el tratamiento de la enfermedad o afección que implica actividad de calicreína plasmática y/o de bradicinina. La terapia de combinación, por ejemplo con uno o más de un inhibidor de calicreína, un antagonista del receptor de bradicinina B2, o un agente de sustitución de C1-INH, por ejemplo con uno o más de un inhibidor de calicreína, un antagonista del receptor de bradicinina B2 o un agente de sustitución de C1-INH y otra terapia, se puede proporcionar en múltiples configuraciones diferentes. El primer agente puede administrarse antes o después de la administración de la otra terapia. En algunas situaciones, el primer agente y otra terapia (por ejemplo, un agente terapéutico) se administran al mismo tiempo o en una proximidad temporal cercana (por ejemplo, un intervalo de tiempo corto entre las inyecciones, tal como durante la misma sesión de tratamiento). El primer agente y la otra terapia también pueden administrarse a intervalos temporales mayores.
Agentes de unión a calicreína plasmática
Los agentes de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, proteínas de unión, por ejemplo polipéptidos, por ejemplo polipéptidos inhibidores, por ejemplo anticuerpos, por ejemplo anticuerpos inhibidores, u otros agentes de unión, por ejemplo moléculas pequeñas) son agentes terapéuticos útiles para una variedad de enfermedades y afecciones, por ejemplo enfermedades y afecciones que implican la actividad de la calicreína plasmática. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la enfermedad o afección que implica la actividad de la calicreína plasmática es el angioedema hereditario (HAE). En algunas realizaciones, se administra una proteína o polipéptido de unión a calicreína plasmática a un sujeto en riesgo de padecer o que padece un trastorno mediado por pKal o mediado por bradicinina.
Varios inhibidores proteicos útiles de calicreína, ya sea calicreína tisular y/o plasmática, incluyen un dominio de Kunitz. Como se usa aquí, un “dominio de Kunitz” es un dominio de polipéptido que tiene al menos 51 aminoácidos y que contiene al menos dos, y preferiblemente tres, disulfuros. El dominio se pliega de manera que la primera y sexta cisteínas, la segunda y cuarta, y la tercera y quinta cisteínas forman enlaces de disulfuro (por ejemplo, en un dominio de Kunitz que tiene 58 aminoácidos, las cisteínas pueden estar presentes en las posiciones correspondientes a los aminoácidos 5, 14, 30, 38, 51 y 55, según el número de las secuencias homólogas BPTI proporcionadas a continuación, y se pueden formar disulfuros entre las cisteínas en la posición 5 y 55, 14 y 38, y 30 y 51), o, si están presentes dos disulfuros, pueden formarse entre un subconjunto correspondiente de cisteínas de los mismos. El espaciado entre las cisteínas respectivas puede estar dentro de 7, 5, 4, 3, 2, 1 o 0 aminoácidos del siguiente espaciado entre posiciones correspondientes a: 5 a 55, 14 a 38, y 30 a 51, según la numeración de la secuencia BPTI proporcionada a continuación. La secuencia BPTI puede usarse como referencia para referirse a posiciones específicas en cualquier dominio genérico de Kunitz. La comparación de un dominio de Kunitz de interés con BPTI se puede realizar identificando la alineación de mejor ajuste en la que se maximiza el número de cisteínas alineadas.
Se conoce la estructura 3D (a alta resolución) del dominio de Kunitz de BPTI. Una de las estructuras de rayos X está depositada en el Brookhaven Protein Data Bank como “6PTI”. Se conoce la estructura 3D de algunos homólogos de BPTI Figenbrot et al., (1990) Protein Engineering, 3(7):591 -598; Hynes et al., (1990) Biochemistry, 29:10018-10022). Se conocen al menos ochenta y una secuencias de dominio de Kunitz. Los homólogos humanos conocidos incluyen tres dominios de Kunitz de La C i, también conocidos como inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) (Wun et al., (1988) J. Biol. Chem. 263(13):6001 -6004; Girard et al., (1989) Nature, 338:518-20; Novotny et al, (1989) J. Biol. Chem., 264(31):18832-18837), dos dominios de Kunitz del inhibidor de inter-a-tripsina, APP-I (Kido et al., (1988) J. Biol. Chem., 263(34):18104-18107), un dominio de Kunitz de colágeno, tres dominios de Kunitz de TFPI-2 (Sprecher et al., (1994) PNAS USA, 91:3353-3357), los dominios de Kunitz del inhibidor del activador del factor de crecimiento de hepatocitos tipo 1, los dominios de Kunitz del inhibidor del activador del factor de crecimiento de hepatocitos tipo 2, los dominios de Kunitz descritos en la Publicación de Patente U.S. n°: 2004-0152633. LACI es una fosfoglicoproteína sérica humana con un peso molecular de 39 kDa (secuencia de aminoácidos en la Tabla 1) que contiene tres dominios de Kunitz.
Tabla 1: Dominios de Kunitz naturales ejemplares
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Los dominios de Kunitz anteriores se denominan LACI-K1 (restos 50 a 107), LACI-K2 (restos 121 a 178), y LACI-K3 (213 a 270). La secuencia de ADNc de LACI se da a conocer en Wun et al. (J. Biol. Chem., 1988, 263(13):6001 -6004).
Girard et al. (Nature, 1989, 338:518-20) dan a conocer estudios mutacionales en los que se alteraron los restos P1 de cada uno de los tres dominios de Kunitz. LACI-K1 inhibe el Factor VIIa (F.VIIa) cuando F.VIIa forma un complejo con el factor tisular, y LACI-K2 inhibe el Factor Xa.
Las proteínas que contienen dominios de Kunitz ejemplares incluyen las siguientes, con los números de acceso de SWISS-PROT entre paréntesis:
A4_HUMAN (P05067), A4_MACFA (P53601), A4_MACMU (P29216),
A4_MOUSE (P12023), A4_RAT (P08592), A4_SAISC (Q95241),
AMBP_PLEPL (P36992), APP2_HUMAN (Q06481), APP2_RAT (P15943),
AXP1_ANTAF (P81547), AXP2_ANTAF (P81548), BPT1_BOVIN (P00974),
BPT2_BOVIN (P04815), CA17_HUMAN (Q02388), CA36_CHICK (P15989),
CA36_HUMAN (P12111), CRPT_BOOMI (P81162), ELAC_MACEU (O62845),
ELAC_TRIVU (Q29143), EPPI_HUMAN (O95925), EPPI_MOUSE (Q9DA01),
HTIB_MANSE (P26227), IBP_CARCR (P00993), IBPC_BOVIN (P00976),
IBPI_TACTR (P16044), IBPS_BOVIN (P00975), ICS3_BOMMO (P07481),
IMAP_DROFU (P11424), IP52_ANESU (P10280), ISC1_BOMMO (P10831),
ISC2_BOMMO (P10832), ISH1_STOHE (P31713), ISH2_STOHE (P81129),
ISIK_HELPO (P00994), ISP2_GALME (P81906), IVB1_BUNFA (P25660),
IVB1_BUNMU (P00987), IVB1_VIPAA (P00991), IVB2_BUNMU (P00989),
IVB2_DABRU (P00990), IVB2_HEMHA (P00985), IVB2_NAJNI (P00986),
IVB3_VIPAA (P00992), IVBB_DENPO (P00983), IVBC_NAJNA (P19859),
IVBC_OPHHA (P82966), IVBE_DENPO (P00984), IVBI_DENAN (P00980),
IVBI_DENPO (P00979), IVBK_DENAN (P00982), IVBK_DENPO (P00981),
IVBT_ERIMA (P24541), IVBT_NAJNA (P20229), MCPI_MELCP (P82968),
SBPI_SARBU (P26228), SPT3_HUMAN (P49223), IKD1_BOVIN (Q28201),
TKD1_SHEEP (Q29428), TXCA_DENAN (P81658), UPTI_PIG (Q29100),
AMBP_BOVIN (P00978), AMBP_HUMAN (P02760), AMBP_MERUN (Q62577),
AMBP_MESAU (Q60559), AMBP_MOUSE (Q07456), AMBP_PIG (P04366),
AMBP_RAT (Q64240), IATR_HORSE (P04365), IATR_SHEEP (P13371),
SPT1_HUMAN (O43278), SPT1_MOUSE (Q9R097), SPT2_HUMAN (043291),
SPT2_MOUSE (Q9WU03), TFP2_HUMAN (P48307), IFP2_MOUSE (O35536),
TFPI_HUMAN (P10646), TFPI_MACMU (Q28864), IFPI_MOUSE (054819),
TFPI_RABIT (P19761), TFPI_RAT (Q02445), YN81_CAEEL (Q03610)
Se puede usar una variedad de métodos para identificar un dominio de Kunitz a partir de una base de datos de secuencias. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos conocida de un dominio de Kunitz, una secuencia de consenso, o un motivo (por ejemplo, el motivo ProSite) se puede buscar en las bases de datos de secuencias de GenBank (National Center for Biotechnology Information, National Institutes of Health, Bethesda MD), por ejemplo usando BLAST; en la base de datos Pfam de HMMs (Modelos Ocultos de Markov) (por ejemplo, usando parámetros por defecto para la búsqueda Pfam; en la base de datos SMART; o en la base de datos ProDom. Por ejemplo, el número de acceso de Pfam PF00014 de la versión 9 de Pfam proporciona numerosos dominios de Kunitz y un HMM para identificar los dominios de Kunitz. En Sonhammer et al. (1997) Proteins 28(3):405-420 se puede encontrar una descripción de la base de datos Pfam, y en Gribskov et al. (1990) Meth. Enzymol. 183:146-159; Gribskov et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4355-4358; Krogh et al. (1994) J. Mol. Biol. 235:1501 -1531; y Stultz et al. (1993) Protein Sci. 2:305-314, por ejemplo, se puede encontrar una descripción detallada de los HMMs. La base de datos SMART (Simple Modular Architecture Research Tool, EMBL, Heidelberg, DE) de los HMMs como se describe en Schultz et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857 y Schultz et al. (2000) Nucl. Acids Res 28:231. La base de datos SMART contiene dominios identificados mediante la creación de perfiles con los modelos ocultos de Markov del programa de búsqueda HMMer2 (R. Durbin et al. (1998) Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press). La base de datos también tiene comentarios y está monitorizada. La base de datos de dominios de proteínas ProDom consiste en una compilación automática de dominios homólogos (Corpet et al. (1999), Nucl. Acids Res. 27:263-267). Las versiones actuales de ProDom se crean usando búsquedas pSI-BLAST recursivas (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Gouzy et al. (1999) Computers and Chemistry 23:333-340.) de las bases de datos de proteínas SWISS-PROT 38 y TREMBL. La base de datos genera automáticamente una secuencia de consenso para cada dominio. Prosite enumera el dominio de Kunitz como un motivo, e identifica proteínas que incluyen un dominio de Kunitz. Véase, por ejemplo, Falquet et al. Nucleic Acids Res.
30:235-238(2002).
Los dominios de Kunitz interactúan con la proteasa diana usando, principalmente, aminoácidos en dos regiones de bucle (“bucles de unión”). La primera región de bucle se encuentra entre alrededor de los restos correspondientes a los aminoácidos 13-20 de BPTI. La segunda región de bucle está entre alrededor de los restos correspondientes a los aminoácidos 31-39 de BPTI. Una biblioteca ejemplar de dominios de Kunitz varía una o más posiciones de aminoácidos en las regiones de bucle primera y/o segunda. Las posiciones particularmente útiles para variar, cuando se seleccionan los dominios de Kunitz que interactúan con la calicreína, o cuando se seleccionan variantes de afinidad mejoradas, incluyen: posiciones 13, 15, 16, 17, 18, 19, 31,32, 34 y 39 con respecto a la secuencia de BPTI. Se espera que al menos algunas de estas posiciones estén en estrecho contacto con la proteasa diana. También es útil variar otras posiciones, por ejemplo posiciones adyacentes a las posiciones antes mencionadas en la estructura tridimensional.
La “región estructural” de un dominio de Kunitz se define como aquellos restos que forman parte del dominio de Kunitz, pero excluyen específicamente los restos en las regiones de bucle de unión primera y segunda, es decir, alrededor de los restos correspondientes a los aminoácidos 13-20 de BPTI y 31-39 de BPTI. A la inversa, los restos que no están en el bucle de unión pueden tolerar un intervalo más amplio de sustitución de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones conservativas y/o no conservativas).
En una realización, estos dominios de Kunitz son formas variantes de la estructura en bucle que incluye el dominio 1 de Kunitz de la proteína inhibidora de la coagulación asociada a lipoproteínas humanas (LACI). LACI contiene tres estructuras de bucle peptídico internas bien definidas que son dominios paradigmáticos de Kunitz (Girard, T. et al., 1989. Nature, 338:518-520). Las variantes del dominio 1 de Kunitz de LACI descritas aquí se han seleccionado, aislado, y se unen a calicreína con mayor afinidad y especificidad (véanse, por ejemplo, las patentes U.S. nos 5.795.865 y 6.057.287). Estos métodos también se pueden aplicar a otras estructuras de dominio de Kunitz para obtener otros dominios de Kunitz que interactúan con la calicreína, por ejemplo calicreína plasmática. Los moduladores útiles de la función de la calicreína típicamente se unen y/o inhiben la calicreína, según se determina usando ensayos de inhibición de y unión a calicreína.
En algunos aspectos, un agente de unión a calicreína (por ejemplo, proteína de unión, por ejemplo polipéptido, por ejemplo polipéptidos inhibidores, por ejemplo anticuerpo, por ejemplo anticuerpo inhibidor, u otro agente de unión, por ejemplo molécula pequeña) se une a la forma activa de calicreína plasmática. En algunas realizaciones, el agente de unión a calicreína se une a e inhibe la calicreína plasmática, por ejemplo calicreína plasmática humana y/o calicreína murina.
Las proteínas de unión a calicreína plasmática pueden ser de longitud completa (por ejemplo, una IgG (por ejemplo, una IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (por ejemplo, IgA1, IgA2), IgD, y IgE), o pueden incluir solo un fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab’)2, o scFv). La proteína de unión puede incluir dos inmunoglobulinas de cadena pesada y dos inmunoglobulinas de cadena ligera, o puede ser un anticuerpo monocatenario. Las proteínas de unión a calicreína plasmática pueden ser proteínas recombinantes, tales como anticuerpos humanizados, con CDR injertadas, quiméricos, desinmunizados, o generados in vitro, y pueden incluir opcionalmente regiones constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática es un anticuerpo monoclonal.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína se une a e inhibe la calicreína plasmática, por ejemplo calicreína plasmática humana y/o calicreína murina. Las proteínas de unión a calicreína plasmática ejemplares se describen en la Publicación U.S. n° 20120201756. En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligeras y/o pesadas de anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (también denominado aquí como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (también denominado aquí como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04. En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática compite con o se une al mismo epítopo que M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (también denominado aquí como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (también denominado aquí como DX2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04. En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática es DX-2930. Véanse los documentos US 20110200611 y US 20120201756.
En algunos aspectos, un polipéptido de unión a calicreína (por ejemplo, polipéptido inhibidor) se une a la forma activa de calicreína plasmática. Los agentes polipeptídicos ejemplares que se unen a calicreína plasmática se describen en Patente U.S. n° 5.795.865, Patente U.S. n° 5.994.125, Patente U.S, n° 6.057.287, Patente U.S, n° 6.333.402, Patente U.S, n° 7.628.983, y Patente U.S, n° 8.283.321, Patente U.S, n° 7.064.107, Patente U.S, n° 7.276.480, Patente U.S, n° 7.851.442, Patente U.S, n° 8.124.586, Patente U.S, n° 7.811.991, y Publicación U.S. n° 20110086801. En algunas realizaciones, el polipéptido de unión a calicreína es DX-88 (un inhibidor de calicreína de origen no natural, también conocido como KALBITOR® (ecallantida), SEQ ID NO: 3). En algunas realizaciones, el inhibidor de calicreína comprende o consiste en una secuencia de alrededor de 58 aminoácidos de los aminoácidos 3-60 de la SEC ID NO: 3, o el polipéptido DX-88 que tiene la secuencia de 60 aminoácidos de la SEC ID NO: 3.
Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala
His Pro Arg Trp Phe Phe Asn lie Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe lie Tyr Gly Gly Cys
Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp
(SEQ ID NO:3)
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática es EPIKAL-2 (SEQ ID NO: 4), que es un inhibidor de calicreína de origen no natural que tiene una secuencia de aminoácidos de 58 restos (correspondientes a los restos 3-60 de SEQ ID NO: 3) y que tiene sustituciones de aminoácidos de Ile por Ser en el resto 34 y Glu por Gly en el resto 39. La secuencia de EPIKAL-2 se muestra a continuación:
EpiKal2: Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO:4) En algunas realizaciones, una proteína de unión a calicreína plasmática puede tener una identidad de secuencia alrededor de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor, con una proteína de unión descrita aquí. En algunas realizaciones, una proteína de unión a calicreína plasmática puede tener una identidad de secuencia alrededor de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor en las regiones estructurales de HC y/o LC (por ejemplo, HC y/o LC FR 1,2, 3 y/o 4) con una proteína de unión descrita aquí. En algunas realizaciones, una proteína de unión a calicreína plasmática puede tener una identidad de secuencia alrededor de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor en las HC y/o LC CDRs (por ejemplo, HC y/o LC CDR1,2 y/o 3) con una proteína de unión descrita aquí. En algunas realizaciones, una proteína de unión a calicreína plasmática puede tener una identidad de secuencia alrededor de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor en la región constante (por ejemplo, CH1, CH2, CH3 y/o CL1) con una proteína de unión descrita aquí.
En algunos aspectos, una pequeña molécula se une a la forma activa de calicreína plasmática.
Antagonistas del receptor de bradicinina B2
En algunas realizaciones, se administra a un sujeto un antagonista del receptor de bradicinina B2. Ejemplos de antagonistas del receptor de bradicinina B2 incluyen Incatibant (Firazyr®), que es un fármaco peptidomimético que contiene 10 aminoácidos que bloquean la unión de la bradicinina nativa al receptor de bradicinina B2.
Agentes de sustitución de C1-INH
En alguna realización, se administra a un sujeto un agente C1-INH de sustitución. Los agentes de sustitución de C1-INH ejemplares están disponibles públicamente, e incluyen, por ejemplo, Berinert®, que es un concentrado de C1 -INH nanofiltrado pasteurizado humano purificado.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Cininógeno escindido
Según el análisis del sistema de contacto, el cininógeno escindido es un biomarcador adecuado para medir la activación del sistema de contacto. Se ha demostrado previamente que el cininógeno escindido está elevado durante los ataques de HAE, en la cirrosis) y como consecuencia de la activación del sistema de contacto durante la septicemia. Las bibliotecas de presentación de fagos de anticuerpos se seleccionaron contra el cininógeno escindido en combinación con el agotamiento del cininógeno intacto. En paralelo, se inmunizaron ratones con cininógeno escindido y anticuerpos monoclonales obtenidos de líneas celulares de hibridoma. Ambos esfuerzos proporcionaron varios anticuerpos monoclonales diferentes que se unían tanto al cininógeno escindido como al intacto, pero ningún anticuerpo que solo se uniera al cininógeno escindido.
Se seleccionaron varios anticuerpos para determinar su idoneidad en un ensayo de transferencia Western, y se identificaron varios que funcionan bien, incluyendo el mAb de ratón (clon 11H05) que se muestra en la Figura 2. Es evidente que este ensayo es capaz de detectar cininógeno escindido en muestras de plasma humano. Además, los datos en la Figura 2 confirman que la recolección de plasma en vidrio es suficiente para evitar la activación por contacto y la escisión del cininógeno.
El enfoque basado en espectrometría de masas también puede usarse para detectar cininógeno escindido en el plasma del paciente. En este enfoque, un sistema inmune adsorbe el cininógeno de la muestra del paciente, digiere proteolíticamente el cininógeno eluido, y analiza los fragmentos peptídicos mediante LC-MC.
Ejemplo 2: Inmunoensayos para C1INH-pKal y a2M-pKal
Se han desarrollado inmunoensayos basados en ELISA para la detección de estos complejos. Los ensayos ELISA basados en sándwich son similares a los descritos anteriormente; véanse, por ejemplo, Kaufman, et al., Blood 77, 2660-2667, y Wachtfogel, Blood 73, 468-471.
Ejemplo 3: Ensayo de C1INH-pKal
Se ha desarrollado un ELISA para la detección del complejo C1 INH-pKal. Este ensayo de sándwich utiliza anticuerpos contra pKal y C1INH como reactivo de captura o detección. Una primera etapa en el desarrollo de este ensayo es la preparación del complejo C1 INH-pKal. Este complejo covalente se preparó incubando un exceso molar de 2-4 veces de pKal con respecto a C1INH. Después, el complejo se purificó usando cromatografía de intercambio catiónico (resina Capto S) como se muestra en la Figura 3. El complejo se cuantificó usando un coeficiente de extinción molar calculado a 280 nm (121, 740 M-1cm-1). Los informes anteriores que utilizaron ensayos similares para medir C1INH-pKal no dieron a conocer un coeficiente de extinción. La determinación precisa de la concentración es fundamental debido a que en un ensayo se determina cuánto pKal se activa durante la enfermedad, lo que da a conocer la dosificación del fármaco.
Se investigaron dos formatos de ensayo para la detección de C1 INH-pKal por ELISA. El primer formato usa un anticuerpo anti-pKal (mAb 13G11 de ratón) como reactivo de captura y un anticuerpo contra C1 INH como anticuerpo de detección, seguido de la producción de una señal con un anticuerpo secundario marcado con HRP (Figura 4). Este ensayo tiene un límite inferior de cuantificación en el intervalo nanomolar de un solo dígito o por debajo. También se investigó el formato de ensayo opuesto, en el que anti-C1 INH es el anticuerpo de captura y anti-pKal (13G11) es el anticuerpo de detección (Figura 5). Este formato de ensayo tiene un límite inferior de cuantificación similar. Tener dos formatos de ensayo proporciona opciones adicionales para ensayos múltiples para C1 INH-pKal y a2M-pKal.
Ejemplo 4: Ensayo del complejo a2M-pKal
Se desarrolló un ELISA para la detección del complejo a2M-pKal. Este ensayo de sándwich utiliza anticuerpos contra pKal y a2M como reactivo de captura o de detección. Una primera etapa en el desarrollo de este ensayo es la preparación del complejo a2M-pKal. Este complejo covalente se preparó incubando un exceso molar de 2-4 veces de pKal con respecto a a2M. A continuación, el complejo se purificó usando cromatografía de exclusión por tamaño como se muestra en la Figura 6. a2M está compuesto por subunidades de ~180 kDa que existen como una distribución de oligómeros hasta tetrámeros. Tras la interacción con pKal, cada monómero de a2M tiene una propensión a formar un enlace amídico covalente mediante la hidrólisis de enlaces tioéster en a2M mediante aminas de lisina en pKal. En consecuencia, se puede esperar una distribución de especies reticuladas, lo que complica la cuantificación. Se derivó un método para cuantificar el complejo a2M-pKal midiendo la actividad del complejo y convirtiéndolo en una concentración usando una curva estándar (Figura 7). Este método de cuantificación es posible debido a que es bien conocido en la bibliografía que los complejos covalentes de a2M con proteasas diana no bloquean el sitio activo con respecto a sustratos de péptidos sintéticos pequeños.
Al igual que con el ensayo de C1 INH-pKal, se investigaron dos formatos de ensayo para la detección de a2M-pKal mediante ELISA. El primer formato usa un anticuerpo anti-pKal (mAb 13G11 de ratón) como reactivo de captura y un anticuerpo contra a2M como anticuerpo de detección, seguido de la producción de una señal con un anticuerpo secundario marcado con HRP (Figura 8). Este formato de ensayo tiene un límite inferior de cuantificación en el intervalo nanomolar de un solo dígito o por debajo. También se investigó el formato de ensayo opuesto, en el que anti-a2M es el anticuerpo de captura y anti-pKal (13G11) es el anticuerpo de detección (Figura 9). Este formato de ensayo tiene un límite inferior de cuantificación similar. Tener dos formatos de ensayo proporciona opciones adicionales a medida que buscamos ensayos múltiples para C1 INH-pKal y a2M-pKal.
Ejemplo 5: Detección de a2M-pKal y C1INH-pKal en plasma activado.
Se utilizó ELISA para detectar la activación de pKal en plasma humano normal tratado con reactivos, tales como caolín o sulfato de dextrano, que se sabe que inducen la activación por contacto. Como se muestra en la Figura 10, los ensayos pueden detectar los complejos que se forman en el plasma tras la activación in vitro con sulfato de dextrano.
Ejemplo 6: Cininógeno intacto y escindido
Se usó transferencia Western para mostrar que el plasma de un paciente obtenido durante un ataque y recogido en tubos de plasma citrados que contenían un cóctel anti-proteasas exhibe una disminución en la cantidad de cininógeno intacto (es decir, 1 cadena) (Figura 11). Se observó un aumento en el cininógeno escindido (es decir, 2 cadenas) (datos no mostrados).
Ejemplo 7: Ensayos ejemplares y datos de ensayos
(i) Activación ex vivo de HMWK
El ensayo de activación ex vivo de HMWK puede usarse para evaluar la actividad inhibidora de un inhibidor de pKal candidato en la activación por contacto. Brevemente, FXIIa (por ejemplo, 5 nM) se usó para estimular la activación del sistema de contacto en plasma humano normal o simular muestras de ataque de HAE para reducir el nivel de HMWK de 1 cadena en alrededor de 10-50%, que se puede detectar mediante Simple Western (SBHD) o transferencia Western (TGA). Se observó una activación por contacto reducida en las muestras tratadas con DX-2930.
Como se muestra en la Figura 17, la actividad inhibidora de niveles mínimos de DX-2930 (por ejemplo, 9-27 nM) se detectó en el ensayo de activación ex vivo de HMWK descrito aquí, usando análisis Western de tipo Protein Simple o el análisis de transferencia Western tradicional. Las condiciones de ensayo utilizadas en este estudio pueden detectar la actividad de DX-29309-27 nM en plasma al 5%. Véase también la Tabla 2 a continuación:
Tabla 2: Reducción de la activación del plasma por DX-2930
Figure imgf000029_0001
Los datos brutos para el plasma activado con Factor XIIa con titulación de DX-2930 se proporcionaron en la Figura 18. Véase también la Tabla 3 a continuación:
Tabla 3: Reducción de la activación del plasma por DX-2930 a diversas concentraciones
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La reducción de HMWK de una cadena se examinó en diversas muestras de plasma puro humano después de la activación por FXIIa durante 30 minutos. Los resultados se muestran en las Figuras 22-26. Véanse también las Tablas 4-8 a continuación:
Tabla 4: % de reducción de HMWK de una cadena después de 30 minutos de acción en una muestra de plasma puro BRH745047
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Tabla 5: % de reducción de HMWK de una cadena después de 30 minutos de acción en una muestra de plasma puro BRH745048.
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Tabla 6: % de reducción de HMWK de una cadena después de 30 minutos de acción en una muestra de plasma puro BRH745064
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Tabla 7: % de reducción de HMWK de una cadena después de 30 minutos de acción en una muestra de plasma puro BRH745062
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Tabla 8: % de reducción de HMWK de una cadena después de 30 minutos de acción en muestras de plasma puro BRH745049, BRH745062 y BRH745063
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Como se muestra en la Figura 27, la activación por el Factor XIIa dio como resultado la reducción de HMWK de una cadena en muestras de plasma de una manera dependiente de la dosis.
(ii) Cininógeno escindido endógeno
En este ensayo, el plasma en tubo SCAT se analizó mediante Simple Western (SBHD) y transferencia Western (TGA) para determinar el nivel de cininógeno escindido en la muestra de plasma. Se encontró que e1HMWK escindido estaba elevado en muestras de HAE basal y de ataque en comparación con el plasma humano normal. Se espera que el HMWK escindido se reduzca en pacientes con HAE tratados con DX-2930, así como en voluntarios sanos tratados con DX-2930.
Como se muestra en la Figura 28, se encontró que los niveles de HMWK de dos cadenas (HMWK escindido) en muestras de pacientes con HAE basal eran menores que aquellos de pacientes con ataque de HAE. Se espera que el nivel de HMWK escindido en pacientes tratados con DX-2930 sea similar al de los pacientes normales.
La Figura 29 muestra los niveles de HMWK escindido en pacientes basales y con ataque HAE según lo determinado por análisis de transferencia Western de tipo Protein Simple y análisis de transferencia Western tradicional.
El HMWK escindido endógeno se examinó en cuatro individuos. Los resultados se muestran en la Figura 30. Se encontró una cantidad baja de HMWK escindido en muestras de plasma humano normal recogidas con citrato.
(iii) Ensayo ex vivo para medir la actividad de pKal
Este ensayo basado en enzimas se desarrolló para evaluar la activación del sistema de contacto en muestras de plasma humano normal o muestras con ataque de HAE simulado (tiene como objetivo una reducción del 10-50% en HMWK de 1 cadena), y para evaluar la actividad inhibidora del inhibidor de pKal sobre la activación del sistema de contacto. Se observó una activación por contacto reducida en sujetos tratados con DX-2930. Este ensayo es útil para evaluar inhibidores de pKal, tal como la bioactividad de DX-2930, en sujetos tratados (por ejemplo, monos o pacientes humanos).
Un ejemplo de este ensayo se ilustra en la Figura 12. Brevemente, se colocó una muestra de plasma en una microplaca de 96 pocillos. Dx-2930, un inhibidor de pKal ejemplar, FXIIa, un activador del sistema de contacto ejemplar, se añadieron a la muestra de plasma. La mezcla se incubó en hielo en presencia de un sustrato peptídico marcado de pKal durante un período de tiempo adecuado (por ejemplo, 2 minutos), y se añadió inhibidor de tripsina de maíz (CTI) a la mezcla para detener la reacción de activación. La mezcla se diluyó si era necesario, y la actividad proteolítica se determinó midiendo el nivel de sustrato peptídico fluorescente.
Como se muestra en la Figura 12, los monos tratados con DX-2930 mostraron niveles reducidos de activación por contacto (actividad de pKal reducida).
(iv) Ensayo de transferencia Western para determinar el HMWK escindido
El nivel de HMWK escindido se midió mediante un ensayo de transferencia Western, que puede implicar la detección de LiCor. Véase también el Ejemplo 8 a continuación. Cuando fue necesario, se utilizó citrato o cóctel de anti-proteasas como anticoagulante en este ensayo. Se observó un HMWK escindido elevado en las muestras de HAE en comparación con el plasma normal. Este ensayo es útil para evaluar inhibidores de pKal tales como la bioactividad de DX-2930 en sujetos tratados (por ejemplo, monos o pacientes humanos).
Las muestras de plasma recolectadas de pacientes con HAE en un cóctel inhibidores anti-proteasas se examinaron usando el ensayo de transferencia Western con detección de LiCor, y los resultados se muestran en la Figura 14. Como se muestra en la Figura 15, el cininógeno intacto disminuyó de 10% (ensayo de transferencia Western con detección de LiCor) hasta 50% como se dio a conocer previamente. Los macacos tratados con DX-2930 mostraron niveles reducidos de activación de pKal (por caolín o sulfato de dextrano) de una manera dependiente de la dosis. Figura 16. Véase también la Tabla 9 a continuación:
Tabla 9: Reducción de HMWK escindido por DX-2930
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El HMWK humano en diversas muestras de plasma después de 30 minutos de activación como se muestra en la Figura 19 se determinó mediante el ensayo de transferencia Western descrito aquí. Las muestras reducidas se hirvieron durante 5 minutos antes de la adición al gel. Las muestras se diluyeron 20 veces y se procesaron en un gel Bis-Tris al 4-12% a 150V durante 90 minutos. Las proteínas del gel se transfirieron a una membrana usando iBlot durante 7 minutos. Se utilizó cininógeno antihumano de ratón (dilución 1:1.000). El tiempo de exposición de la transferencia fue 5 segundos.
El ensayo Western de tipo Protein Simple se comparó con el ensayo de transferencia Western tradicional para detectar la activación del plasma. Como se muestra en las Figuras 20 y 21, el primero (panel derecho) es más sensible que el segundo (panel izquierdo).
Ejemplo 8. Activación ex vivo de pKal como biomarcador
La activación ex vivo de precalicreína a calicreína plasmática (pKal) en el plasma se puede utilizar, por ejemplo, tanto como biomarcador farmacodinámico (PD) para proporcionar evidencia de la bioactividad de inhibidores terapéuticos de pKal, tal como DX-2930, como para la detección de pKal activada en muestras de enfermedades.
En un primer experimento, se obtuvo plasma de un macaco al que se le administró una sola inyección SC de DX-2930 (5 mg/kg), y se activó con FXIIa 10 nM para generar pKal activa que se monitorizó usando un sustrato sintético (Pro-Phe-Arg-AMC). Se añadió inhibidor de tripsina de maíz para detener la activación por FXIIa antes de la adición del sustrato. El porcentaje de inhibición observado en el plasma de muestras de macacos dosificadas coincidió con el de las muestras de plasma preparadas enriquecidas con un equivalente molar de DX-2930 o ecallantida (Figura 31). Es evidente que la concentración plasmática de DX-2930 alcanzó un nivel de fármaco (~265 nM) que inhibió aproximadamente el 80% de la actividad de pKal que se generó por la adición ex vivo de FXIIa. La Figura 31 también muestra que se observaron cantidades iguales de inhibición de pKal con una concentración equivalente de ecallantida. Por el contrario, las concentraciones equivalentes de C1 -INH añadidas al plasma no inhibieron pKal que fue activada por FXIIa en este ensayo de activación ex vivo.
En un segundo experimento, se obtuvo plasma de macacos dosificados con cinco inyecciones SC semanales de diferentes dosis de DX-2930, y se obtuvo plasma citrado de seres humanos (n = 6) en un estudio clínico de fase 1a que recibieron una única inyección SC de DX-2930 a diferentes dosis. Las muestras de plasma se activaron con FXIIa, y se midió la actividad de pKal resultante usando un sustrato sintético (Pro-Phe-Arg-AMC). Se añadió inhibidor de tripsina de maíz para detener la activación por FXIIa antes de la adición del sustrato. El porcentaje de inhibición se determinó usando la actividad de pKal presente en la muestra de plasma antes de la dosis procedente de cada individuo como línea de base. La Figura 32 muestra que el porcentaje de inhibición aumentó tanto en muestras de plasma humano como de mono con dosis crecientes de DX-2930.
Los resultados de estos dos experimentos muestran que el ensayo de activación ex vivo es útil como un biomarcador de PD para la bioactividad de inhibidores terapéuticos de pKal.
Ejemplo 9. Inhibición ex vivo de la actividad de pKal en muestras de plasma del estudio de Fase 1A de DX-2930
En este estudio, se investigó la actividad inhibidora ex vivo (bioactividad) de DX-2930 en plasma derivado de sujetos humanos a los que se les administró subcutáneamente DX-2930.
MATERIALES
DX-2930 (106,7 mg/ml = 732 pM)
FXIIa humano - ERL HFXIIa 2790P (1,72 mg/ml = 25,3 pM)
Inhibidor de tripsina de maíz (CTI) - ERL CTI 360 (1,54 mg/ml = 123 pM)
Sustrato peptídico = PFR-AMC, n° de Cat Sigma 99273, Lote 037K1207.
Amortiguador de ensayo = Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 al 0,1%, PEG-8000 al 0,1%
Microplacas de poliestireno blancas de 96 pocillos de Corning, n° de Cat 3789
Lector de placas Spectramax M2
Plasma citrado recolectado en el estudio de Fase 1A de DX-2930
MÉTODOS
El plasma diluido 1:40 se activó mediante la adición de FXIIa 10 nM durante 2 minutos a temperatura ambiente. A continuación, FXIIa se inactivó mediante adición de CTI 100 nM, y entonces se evaluó la actividad proteolítica de la calicreína plasmática (pKal) mediante una dilución adicional 1:10 de plasma de muestra y la adición de sustrato peptídico fluorescente PFR-AMC 10 pM. Cada muestra de plasma se dio a conocer como tasa de actividad de pKal, que se convirtió en “% de inhibición” en base a los controles de predosis para cada individuo.
RESULTADOS
Se obtuvieron muestras de plasma citrado de sujetos sanos en el estudio de fase 1a de DX-2930, y se analizaron usando un ensayo de bioactividad ex vivo en plasma. Se observó una inhibición significativa de la actividad de pKal en los grupos de dosis 3 (1,0 mg/kg de DX-2930) y 4 (3,0 mg/kg de DX-2930), logrando aproximadamente 19% y 36% de inhibición máxima de la actividad de pKal, respectivamente (Figura 33). La inhibición que se logró en los grupos 3 y 4 se mantuvo, y fue consistente con una vida media aparente de aproximadamente 20 días. La inhibición de la actividad de pKal en los grupos de dosis 1 (0,1 mg/kg de DX-2930) y 2 (0,3 mg/kg de DX-2930) no fue significativa.
Estos resultados demuestran además que el ensayo de activación ex vivo es útil como un biomarcador de PD para la bioactividad de inhibidores terapéuticos de pKal.
Ejemplo 10. Análisis de la bioactividad de DX-2930 en muestras de estudio de fase 1a del ensayo de transferencia Western
Se investigó la bioactividad de DX-2930 en el plasma de sujetos humanos tratados con DX-2930 usando el ensayo de transferencia Western descrito aquí.
El ensayo de transferencia Western se realizó usando muestras de plasma citrado obtenidas de sujetos el Día 1 (antes de la dosis de DX-2930 o del placebo), el Día 5, o el Día 28 después de la dosis de DX-2930 o del placebo. Las muestras se analizaron mediante transferencia Western usando un anticuerpo que detecta el cininógeno de alto peso molecular (HMWK), el sustrato para calicreína plasmática activa, que es la enzima diana que es inhibida por DX-2930. La calicreína plasmática actúa sobre HMWK para generar el péptido proinflamatorio bradicinina y un HMWK de 2 cadenas, que se conoce como la forma escindida de HMWK que se detectó mediante análisis de transferencia Western. Se analizaron muestras de plasma no tratadas y tratadas con Factor XIIa de coagulación activado (FXIIa). FXIIa convierte la precalicreína inactiva en el plasma en calicreína plasmática activada.
Los resultados obtenidos de este estudio muestran que las muestras tratadas con FXIIa de sujetos a los que se les administró 3 mg/kg de DX-2930 (Grupo 4) mostraron un porcentaje estadísticamente menor de HMWK de 2 cadenas (HMWK escindido) en el Día 5 (p = 0,0011) y el Día 28 (p = 0,0028) que las muestras antes de la dosis procedentes de estos sujetos. Esto es signo de la bioactividad de DX-2930 contra la proteólisis mediada por calicreína plasmática de su sustrato endógeno (HMWK) (Figura 34). La reducción en el porcentaje de HMWK de 2 cadenas observada en el Grupo 4 tuvo una tendencia más baja que la observada en otros grupos de dosis o en el grupo tratado con placebo.
Además, las muestras de sujetos a los que se les administró DX-2930 a 0,3, 1 o 3 mg/kg que no fueron tratados con FXIIa mostraron un porcentaje menor de HMWK de 2 cadenas que el observado en las dosis de placebo o de 0,1 mg/kg (Figura 35).
Tomados en conjunto, estos resultados demuestran además que el ensayo de transferencia Western es útil como un biomarcador de PD para la bioactividad de inhibidores terapéuticos de pKal.
EQUIVALENTES Y ALCANCE
Aquellos expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando únicamente experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la presente descripción descrita aquí. No se pretende que el alcance de la presente descripción se limite a la descripción anterior, sino que es como se establece en las reivindicaciones adjuntas.
En las reivindicaciones, artículos tales como “un”, “una” y “el/la” pueden significar uno o más de uno a menos que se indique lo contrario o sea de otro modo evidente por el contexto. Las afirmaciones o descripciones que incluyen “o” entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes, se emplean, o de otro modo son relevantes para un producto o procedimiento determinado, a menos que se indique lo contrario o de otra manera sea evidente por el contexto. La presente descripción incluye realizaciones en las que exactamente un miembro del grupo está presente, se emplea, o de otra manera es relevante para un producto o procedimiento dado. La presente descripción incluye realizaciones en las que más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes, se emplean, o de otra manera son relevantes para un producto o procedimiento dado.
Además, la presente descripción abarca todas las variaciones, combinaciones y permutaciones en las que una o más limitaciones, elementos, cláusulas y términos descriptivos de una o más de las reivindicaciones enumeradas se introducen en otra reivindicación. Por ejemplo, cualquier reivindicación que dependa de otra reivindicación puede modificarse para incluir una o más limitaciones encontradas en cualquier otra reivindicación que dependa de la misma reivindicación base. Cuando los elementos se presentan como listas, por ejemplo en formato de grupo de Markush, también se describe cada subgrupo de los elementos, y cualquier elemento o elementos se pueden eliminar del grupo.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método de activación ex vivo, que comprende:
incubar una muestra de plasma obtenida de un sujeto con un activador del sistema de calicreína plasmática (pKal), en el que el activador es el Factor XIIa (FXIIa);
medir los niveles de cininógeno de alto peso molecular intacto (HMWK), de HMWK escindido, o de ambos, en la muestra de plasma antes y después de la incubación; y
determinar la reducción de HMWK intacto en la muestra después de la activación,
opcionalmente, en el que los niveles de HMWK intacto y HMWK escindido se miden mediante análisis de transferencia Western, que es preferiblemente análisis de transferencia Western de tipo Protein Simple.
2. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra de plasma y el activador se incuban en presencia de un candidato modulador de pKal,
que comprende además opcionalmente evaluar la actividad del candidato modulador de pKal en la calicreína plasmática.
3. El método de la reivindicación 1, que comprende además evaluar si el sujeto tiene o está en riesgo de padecer una enfermedad asociada con pKal; en el que un nivel elevado del HMWK escindido en comparación con un valor predeterminado indica que el sujeto tiene o está en riesgo de padecer la enfermedad,
en el que la enfermedad es HAE.
4. El método de la reivindicación 1, en el que el sujeto es un paciente humano que tiene una enfermedad asociada con pKal y ha sido sometido a un tratamiento de la enfermedad; y en el que la muestra de plasma se ha obtenido después o durante el transcurso del tratamiento,
que comprende además opcionalmente evaluar la eficacia del tratamiento; en el que un nivel reducido de HMWK escindido en comparación con aquel antes del tratamiento o un nivel reducido de HMWK escindido durante el transcurso del tratamiento indica que el tratamiento es eficaz.
5. El método de la reivindicación 4, en el que el paciente tiene HAE y ha sido tratado con un inhibidor de pKal, opcionalmente en el que el inhibidor de pKal es DX2930.
6. Un ensayo ex vivo para determinar la actividad de la calicreína plasmática (pKal) en una muestra de plasma de un sujeto, que comprende:
incubar la muestra de plasma con un activador del sistema pKal en presencia de un sustrato de pKal, en el que el activador del sistema pKal es el Factor XIIa, y medir la actividad de pKal en función de la tasa de escisión del sustrato, y
opcionalmente en el que el ensayo se realiza en una microplaca.
7. El ensayo de la reivindicación 6, en el que la muestra de plasma se incuba con el activador, el sustrato de pKal, y un candidato modulador de pKal,
opcionalmente en el que el candidato modulador de pKal es un candidato inhibidor de pKal.
8. El ensayo de la reivindicación 7, en el que el candidato modulador de pKal es un candidato inhibidor de pKal, que es un anticuerpo que se une a pKal;
comprendiendo además opcionalmente el ensayo evaluar la actividad inhibidora del candidato inhibidor de pKal sobre pKal, en el que un nivel reducido de actividad de pKal en presencia del candidato inhibidor de pKal con respecto al nivel de actividad de pKal en ausencia del candidato inhibidor de pKal indica que el candidato inhibidor es eficaz.
9. El ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 6-7, que comprende además evaluar si el sujeto tiene o está en riesgo de padecer una enfermedad asociada con pKal; en el que un nivel elevado de actividad de pKal en comparación con un valor predeterminado indica que el sujeto tiene o está en riesgo de padecer la enfermedad, en el que la enfermedad es HAE.
10. El ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en el que el sujeto es un paciente humano que tiene una enfermedad asociada con pKal y ha sido sometido a un tratamiento de la enfermedad; y en el que la muestra se ha obtenido después o durante el transcurso del tratamiento,
que comprende además opcionalmente evaluar la eficacia del tratamiento; en el que un nivel reducido de actividad de pKal en comparación con aquel antes del tratamiento o un nivel reducido de actividad de pKal durante el transcurso del tratamiento indica que el tratamiento es eficaz,
opcionalmente en el que el paciente tiene HAE y ha sido tratado con un inhibidor de pKal que es preferiblemente DX2930.
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