BR112016008970B1 - Método de ativação ex vivo, método para avaliar ativação plasmática e ensaio ex vivo - Google Patents

Método de ativação ex vivo, método para avaliar ativação plasmática e ensaio ex vivo Download PDF

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Abstract

ensaios para a determinação de biomarcadores de sistema calicreína plasmática. métodos e ensaios para determinar o nível de ativação do sistema de calicreína plasmática (pkal) e usos destes para avaliar a atividade dos moduladores de pkal no sistema pkal.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício da data de depósito do Pedido Provisório US N° 61/893.505, depositado em 21 de outubro de 2013, cujo conteúdo total é incorporado neste documento por referência.
FUNDAMENTOS
[0002] Calicreína plasmática (pKal) é a enzima primária geradora de bradicinina na circulação. A ativação de pKal ocorre através do sistema de contato que foi ligado à patologia de doença associada com angioedema hereditário (HAE). Bradicinina é um mediador chave de dor, inflamação, edema e angiogênese.
RESUMO DA PRESENTE DIVULGAÇÃO
[0003] Calicreína plasmática (PKal) é um componente de serina protease do sistema de contato e é a enzima geradora de bradicinina primária na circulação. O sistema de contato é ativado por qualquer fator XIIa mediante exposição a superfícies externas ou carregadas negativamente ou em superfícies de células endoteliais por prolilcarboxipeptidases (Sainz I.M. et al., Thromb Haemost 98, 77-83, 2007). Ativação da calicreína plasmática amplifica coagulação intrínseca através de sua ativação de retorno do fator XII e acentua a inflamação através da produção do nonapeptídeo pró-inflamatório bradicinina. Como a cininogenase primária na circulação, calicreína plasmática é, em grande parte, responsável pela geração de bradicinina na vasculatura. Uma deficiência genética da proteína inibidora de C1 (C1-INH), o principal inibidor natural de calicreína plasmática, leva a angioedema hereditário (HAE). Pacientes com HAE sofrem de ataques agudos de edema doloroso, muitas vezes precipitado por acionadores desconhecidos (Zuraw BL et al, N Engl J Med 359, 1027-1036, 2008). Através do uso de agentes farmacológicos ou estudos genéticos em modelos animais, o sistema cinina-calicreína plasmática (plasma KKS) foi implicado em diversas doenças.
[0004] A presente divulgação baseia-se no desenvolvimento de uma série de ensaios de biomarcador, incluindo o ensaio de ativação ex vivo HMWK, o ensaio HMWK clivado endógeno e o ensaio da ativação ex vivo pKal conforme descrito neste documento. Tais ensaios podem ser usados para medir o nível de ativação do sistema de calicreína plasmática (pKal) no plasma de um sujeito. Eles também podem ser usados para avaliar um candidato composto para a sua atividade na modulação (inibindo ou ativando) o sistema de pKal.
[0005] Em um aspecto, a presente divulgação apresenta um método de ativação ex vivo compreendendo: (i) incubar uma amostra plasmática obtida de um sujeito com um ativador do sistema de calicreína plasmática (pKal) (por exemplo, FXIIa); (ii) medir os níveis de cininogênio intacto de alto peso molecular (HMWK), o HMWK clivado, ou ambos, na amostra plasmática antes e após a incubação; e (iii) determinar a redução de HMWK intacta na amostra após a ativação. Opcionalmente, a amostra plasmática e o ativador são incubados na presença de um candidato modulador de um pKal (por exemplo, um candidato inibidor, como DX2930, ou um candidato ativador). O método pode compreender, de modo adicional, avaliar a atividade do candidato modulador pKal. Em algumas modalidades, medem-se os níveis de HMWK intacto e HMWK clivado pela análise Western blot, tais como análise Protein Simple Western blot.
[0006] Em outro aspecto, a presente divulgação apresenta um método para avaliar a ativação plasmática em um sujeito, compreendendo: prover uma amostra plasmática a partir de um sujeito; e medir o nível de HMWK clivado da amostra plasmática. O nível de HMWK clivado pode ser medido por, por exemplo, Western blot, como Protein Simple Western blot. Em algumas modalidades, o sujeito tem, ou é suspeito de ter uma doença associada com o sistema pKal. Como alternativa, ou de modo adicional, o sujeito é tratado com um inibidor de pKal. Qualquer um dos métodos descritos neste documento pode, adicionalmente, compreender a avaliação da eficácia do inibidor de pKal, em que um nível reduzido de HMWK clivado após o tratamento, quando comparado com aquele de antes do tratamento, indica que o inibidor de pKal é eficaz.
[0007] Em ainda outro aspecto, a presente divulgação fornece um ensaio ex vivo para determinar a atividade de pKal em uma amostra (por exemplo, uma amostra plasmática de um sujeito), compreendendo: (i) incubar a amostra com um ativador de sistema pKal (por exemplo, Fator XIIa ou FXIIa) na presença de um substrato de pKal e (ii) medir a atividade de pKal com base na taxa de clivagem do substrato. Em alguns exemplos, o substrato é anexado a um rótulo, o qual é capaz de liberar um sinal detectável após ser clivado por pKal, e a taxa de clivagem do substrato é determinada com base na magnitude do sinal detectável. Em alguns exemplos, a amostra plasmática é incubada com o ativador, o substrato de pKal e um candidato modulador pKal (por exemplo, um modulador inibidor ou um modulador ativador). O método pode compreender, ainda, a avaliação da atividade do candidato modulador pKal (por exemplo, DX2930), em que uma alteração do nível de atividade de pKal na presença do candidato modulador pKal, conforme relacionado ao nível de atividade de pKal na ausência do candidato inibidor de pKal, indica que o candidato inibidor é eficaz. Por exemplo, um nível reduzido de atividade de pKal indica que o candidato modulador pKal é um inibidor de pKal; enquanto um elevado nível de atividade de pKal indica que o candidato modulador pKal é um ativador de pKal. Qualquer método de ensaio descrito neste documento pode ser executado em uma microplaca.
[0008] Em qualquer dos métodos de ensaio descritos neste documento os métodos podem compreender, adicionalmente, avaliar se o sujeito tem ou está com risco de ter uma doença associada ao pKal (por exemplo, HAE); em que um elevado nível do HMWK clivado, se comparado com um valor pré-determinado, indica que o sujeito tem ou corre o risco de ter a doença. Em algumas modalidades, o sujeito pode ser um paciente humano tendo uma doença associada com pKal (por exemplo, HAE) e é submetido a um tratamento da doença (por exemplo, um inibidor de pKal como DX2930). A amostra plasmática pode ser obtida após ou ao longo do tratamento. Em algumas modalidades, o método compreende, ainda, avaliar a eficácia do tratamento; em que um nível reduzido de HMWK clivado, se comparado à antes do tratamento (por exemplo, um inibidor de pKal como DX2930) ou um nível reduzido de HMWK clivado ao longo do tratamento (por exemplo, um inibidor de pKal como DX2930) indica que o tratamento é eficaz.
[0009] De modo adicional, a presente divulgação prove métodos de avaliação de um sujeito, por exemplo, um sujeito em risco de ou sofrendo de um distúrbio mediado por pKal ou mediado por bradicinina, que pode envolver qualquer um dos métodos de ensaio descritos neste documento. Métodos providos admitem análise de pacientes com angioedema mediada por calicreína plasmática (KMA) ou outras doenças mediadas por pKal úteis na avaliação e tratamento.
[00010] Modalidades da presente divulgação proveem um biomarcador e respectivo uso na identificação e o tratamento de pacientes, por exemplo, pacientes sofrendo de edema causado por bradicinina que é gerada por calicreína plasmática. Métodos, composições e dispositivos divulgados neste documento são úteis de diversas formas. Por exemplo, níveis de um marcador de pKal podem ser usados para identificar distúrbios associados com a ativação do sistema de contato elevado. Triagem inicial pode ser seguida de teste in vitro ou in vivo, com inibidores de calicreína plasmática (por exemplo, DX-88, EPIKAL2 ou DX-2930), por exemplo, em modelos pré-clínicos de doenças. Um marcador divulgado neste documento também pode ser usado como um biomarcador farmacodinâmico ou, de outra forma, monitorar a resposta de um sujeito a um inibidor da calicreína. Um marcador divulgado neste documento pode ser usado em um diagnóstico integrante para possibilitar o tratamento de doenças mediadas por calicreína plasmática, gerenciar a dosagem durante terapia profilática de um distúrbio mediado por pKal ou mediado por bradicinina, por exemplo, HAE, angioedema idiopático não dependente de histamina, artrite reumatoide, doença de Crohn, colite ulcerativa, lúpus, doença de Alzheimer, choque séptico, lesão por queimadura, lesão por isquemia/reperfusão cerebral, edema cerebral, retinopatia diabética, nefropatia diabética, edema macular, vasculite, trombose arterial ou venosa, trombose associada com dispositivos de assistência ventricular ou stents, trombocitopenia induzida por heparina com trombose, doença tromboembólica e doença coronariana com angina de peito instável, edema, doença ocular, gota, doença inflamatória intestinal, mucosite oral, dor neuropática, dor inflamatória, doença vertebral degenerativa-estenose da coluna vertebral, íleo pós operatório, aneurisma da aorta, osteoartrite, angioedema hereditário, embolia pulmonar, acidente vascular cerebral, traumatismo craniano ou edema cerebral peritumoral, sepse, evento isquêmico (AVC) de artéria cerebral média aguda (MCA), reestenose (por exemplo, após a angioplastia), nefrite de lúpus eritematoso sistêmico, uma doença autoimune, uma doença inflamatória, uma doença cardiovascular, uma doença neurológica, uma doença associada com desenovelamento de proteínas, uma doença associada com a angiogênese, nefropatia hipertensiva e nefropatia diabética, doenças alérgicas e respiratórias (por exemplo, anafilaxia, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, síndrome do desconforto respiratório agudo, fibrose cística persistente, rinite) e lesões de tecidos (por exemplo, lesão por queimadura ou química).
[00011] Em um aspecto, a presente divulgação provê um método para avaliar ou tratar um sujeito, por exemplo, distinguir um distúrbio mediado por pKal, por exemplo, angioedema mediado por bradicinina, de um distúrbio mediado por histamina, ou prever um futuro ataque de um distúrbio mediado por pKal, compreendendo a aquisição e, por exemplo, a determinação, do nível de um ou mais marcadores correlacionados com ativação por pKal (um marcador de pKal), divulgado neste documento, por exemplo, cininogênio intacto e cininogênio clivado, desse modo avaliando ou tratando dito sujeito. Em algumas modalidades, o método compreende a aquisição, por exemplo, detecção, do nível de um ou mais marcadores correlacionados com uma resposta inflamatória mediada por histamina (um marcador H), por exemplo, triptase.
[00012] Em algumas modalidades, dito distúrbio mediado por pKal é HAE, IAE, IBD ou IBS. Em algumas modalidades, dito distúrbio mediado por pKal é selecionado a partir de angioedema idiopático não dependente de histamina, artrite reumatoide, doença de Crohn, lúpus, doença de Alzheimer, choque séptico, lesão por queimadura, lesão por isquemia/reperfusão cerebral, edema cerebral, retinopatia diabética, nefropatia diabética, edema macular, vasculite, trombose arterial ou venosa, trombose associada com dispositivos de assistência ventricular ou stents, trombocitopenia induzida por heparina com trombose, doença tromboembólica e doença coronariana com angina de peito instável, edema, doença ocular, gota, doença inflamatória intestinal, mucosite oral, dor neuropática, dor inflamatória, doença de estenose espinhal- degenerativa, íleo pós operatório, aneurisma da aorta, osteoartrite, angioedema hereditário, embolia pulmonar, acidente vascular cerebral, traumatismo craniano ou edema cerebral peritumoral, sepse, evento isquêmico (derrame) de artéria cerebral média aguda (MCA), reestenose (por exemplo, após a angioplastia), nefrite de lúpus eritematoso sistêmico, uma doença autoimune, uma doença inflamatória, uma doença cardiovascular, uma doença neurológica, uma doença associada com desenovelamento de proteínas, uma doença associada com a angiogênese, nefropatia hipertensiva e nefropatia diabética, doenças alérgicas e respiratórias (por exemplo, anafilaxia, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, síndrome do desconforto respiratório agudo, fibrose cística persistente, rinite) e lesões de tecidos (por exemplo, lesão por queimadura ou química).
[00013] Em outro aspecto, a presente divulgação também provê um método de avaliação ou tratamento de um sujeito, dito sujeito tendo um sintoma consistente com ambos os distúrbios mediados por pKal, por exemplo, angioedema mediado por bradicinina e um distúrbio relacionado a histamina, compreendendo a) opcionalmente, determina que dito sujeito tem um sintoma, por exemplo, edema ou desconforto abdominal, consistente com um ou ambos os distúrbios mediados por pKal e um distúrbio relacionado a histamina; b) se dito sujeito não foi tratado com uma terapia anti-histamínica para dito sintoma, e então, tratar dito sujeito com uma terapia anti-histamínica; c) adquirir e, por exemplo, detectar, o nível de um ou mais marcadores correlacionados com ativação de pKal (um marcador de pKal), por exemplo, precalicreína, pKal ativo, alfa 2M-pKal, C1-INH-pKal, cininogênio intacto e cininogênio clivado; d) se dito nível atende a um critério predeterminado, por exemplo, se for igual ou acima de um nível de referência: selecionar o sujeito para a terapia inibidora de calicreína; ou administrar um inibidor de calicreína para dito sujeito, desse modo, avaliando ou tratando dito sujeito. Em algumas modalidades, o método compreende selecionar o sujeito para a terapia inibidora de calicreína. Em determinadas modalidades, o método compreende administrar um inibidor de calicreína ao dito sujeito. Em modalidades particulares, a seleção de sujeitos para a terapia inibidora de calicreína; ou administração de um inibidor de calicreína para o dito sujeito, ocorre antes de uma determinação de que o sujeito mostre uma resposta aceitável à dita terapia anti-histamínica, por exemplo, ocorre dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 horas de dito tratamento com uma terapia anti-histamínica. Em algumas modalidades, ocorre uma determinação de que dito sujeito tem um sintoma consistente com ambos um distúrbio mediado por pKal e um distúrbio relacionado com histamina e aquisição de uma amostra do dito paciente para determinar o nível de um marcador de pKal: dentro de 30 minutos, 1, 2 ou 3 horas um do outro; ou na mesma visita a um profissional de saúde.
[00014] Em algumas modalidades, dito inibidor de pKal é selecionado de DX-88, DX-2930 ou EpiKal-2.
[00015] Em algumas modalidades, o método compreende a aquisição, por exemplo, determinação, do nível de um ou mais marcadores correlacionados com uma resposta inflamatória mediada por histamina (um marcador H). Em determinadas modalidades, dito sujeito é avaliado para suscetibilidade a um distúrbio mediado por pKal. Em determinadas modalidades, dito sujeito tem um sintoma de, por exemplo, consistente com um distúrbio mediado por pKal, por exemplo, edema, por exemplo, HAE. Em determinadas modalidades, dito sujeito tem um sintoma de um distúrbio caracterizado por ativação de pKal indesejada e foi administrada uma terapia anti-histamínica ao dito sujeito. Em modalidades particulares, a dita terapia anti-histamínica é administrada dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 horas antes ou após uma etapa determinante, conforme divulgado neste documento. Em modalidades particulares, o método compreende, adicionalmente, administrar uma terapia anti-histamínica para dito sujeito, por exemplo, antes, após ou durante a avaliação ou determinação, conforme divulgado neste documento.
[00016] Em algumas modalidades, responsivas à dita determinação ou avaliação, administrar um inibidor de calicreína ao dito sujeito. Em determinadas modalidades, dito sujeito tem um ou mais ou todos os seguintes sintomas ou propriedades: ataques recorrentes de inchaço; inchaço no qual dito inchaço é completamente ou predominantemente periférico, por exemplo, o sujeito não tem inchaço abdominal ou das vias respiratórias significativo; urticária; vermelhidão, dor e inchaço na ausência de evidência de infecção; não responde à terapia anti-histamínica ou corticosteroide; ou tem edema não mediado por histamina. Em determinadas modalidades, dito sujeito tem edema persistente ou recorrente e não responde a uma ou ambas a terapia anti- histamínica e com esteroide. Em determinadas modalidades, o sujeito não tem histórico de um distúrbio mediado por pKal, por exemplo, HAE, IAE, IBD ou IBS; o sujeito tem um histórico de um distúrbio mediado por pKal, por exemplo, HAE, IAE, IBD ou IBS, o sujeito não tem histórico de HAE; o sujeito tem um histórico de HAE; o sujeito não tem histórico de IAE; o sujeito tem um histórico de IAE; o sujeito não tem histórico de IBD ou IBS; o sujeito tem um histórico de IBD ou IBS; o sujeito não tem histórico de um distúrbio mediado por histamina, por exemplo, uma alergia alimentar; o sujeito tem uma história de um distúrbio de histamina mediada, por exemplo, alergia alimentar; o sujeito não tem um histórico de um distúrbio mediado por pKal, por exemplo, HAE, IAE, IBD ou IBS e não tem histórico de um distúrbio mediado por histamina, por exemplo, uma alergia alimentar; ou o sujeito não tem histórico de um distúrbio mediado por pKal, por exemplo, HAE, IAE, IBD ou IBS e tem um histórico de um distúrbio mediado por histamina, por exemplo, uma alergia alimentar: o sujeito tem um histórico de um distúrbio mediado por pKal, por exemplo, HAE, IAE, IBD ou IBS e não tem histórico de um distúrbio mediado por histamina, alergia alimentar; ou o sujeito tem uma história de uma doença mediada por pKal, por exemplo, HAE, IAE, IBD ou IBS e tem um histórico de um distúrbio mediado por histamina, por exemplo, uma alergia alimentar.
[00017] Em algumas modalidades, o sujeito foi tratado com um inibidor de calicreína, por exemplo, na terapia profilática, por exemplo, para HAE, e a resposta do sujeito ao inibidor de calicreína é avaliada ou monitorada, e opcionalmente, responsiva ao dito monitoramento, uma terapia é selecionada ou administrada, por exemplo, responsiva à determinação, a dosagem do inibidor de calicreína sendo, assim, ajustada. Em algumas modalidades, uma determinação de um marcador de pKal é executada no contexto de um diagnóstico integrante, e opcionalmente, a administração de uma terapêutica é dada ou retida com base na determinação. Em determinadas modalidades, ser responsivo ao dito tratamento depende da identificação de um ataque agudo iminente, por exemplo, um ataque de HAE ou IEA. Em modalidades particulares, dito sujeito é avaliado para susceptibilidade a angioedema idiopático. Em modalidades particulares, a dita avaliação compreende a determinação se dito sujeito está sofrendo de um distúrbio mediado por pKal, por exemplo, um distúrbio mediado por bradicinina, por exemplo, um angioedema mediado por pKal, ou de um distúrbio mediado por histamina, por exemplo, uma reação de alergia alimentar.
[00018] Em algumas modalidades, o sujeito não tem histórico de um distúrbio mediado por pKal, por exemplo, HAE ou IAE. Em algumas modalidades, o sujeito tem um histórico de um distúrbio mediado por pKal, por exemplo, HAE ou IAE. Em algumas modalidades, o sujeito não tem histórico de um distúrbio mediado por pKal, por exemplo, HAE, IAE, IBD ou IBS; o sujeito tem um histórico de um distúrbio mediado por pKal, por exemplo, HAE, IAE, IBD ou IBS, o sujeito não tem histórico de HAE; o sujeito tem um histórico de HAE; o sujeito não tem histórico de IAE; o sujeito tem um histórico de IAE; o sujeito não tem histórico de IBD ou IBS; o sujeito tem um histórico de IBD ou IBS; o sujeito não tem histórico de um distúrbio mediado por histamina, por exemplo, uma alergia alimentar; o sujeito tem um histórico de um distúrbio mediado por histamina, por exemplo, uma alergia alimentar; o sujeito não tem um histórico de um distúrbio mediado por pKal, por exemplo, HAE, IAE, IBD ou IBS e não tem histórico de um distúrbio mediado por histamina, por exemplo, uma alergia alimentar; ou o sujeito não tem histórico de um distúrbio mediado por pKal, por exemplo, HAE, IAE, IBD ou IBS e tem um histórico de um distúrbio mediado por histamina, por exemplo, uma alergia alimentar: o sujeito tem um histórico de um distúrbio mediado por pKal, por exemplo, HAE, IAE, IBD ou IBS e não tem histórico de um distúrbio mediado por histamina, uma alergia alimentar; ou o sujeito tem um histórico de um distúrbio mediado por pKal, por exemplo, HAE, IAE, IBD ou IBS e tem um histórico de um distúrbio mediado por histamina, por exemplo, uma alergia alimentar.
[00019] Em algumas modalidades, um marcador de pKal, por exemplo, um marcador de pKal divulgado neste documento, é detectado com um reagente à base de anticorpos. Em determinadas modalidades, um marcador de pKal é detectado com imunoensaio do tipo sanduíche. Em determinadas modalidades, o método compreende adquirir, por exemplo, detectar, o nível de alfa 2M-pKal e C1-INH-pKal, por exemplo, por imunoensaio do tipo sanduíche. Em determinadas modalidades, o método compreende adquirir, por exemplo, a detectar, o nível de cininogênio, por exemplo, um ou ambos os cininogênio intacto ou clivado, por exemplo, por um ensaio de separação por eletroforese, por exemplo, um Western blot. Em algumas modalidades, um marcador de pKal, por exemplo, cininogênio, é detectado em um ensaio que depende da separação, por exemplo, a separação por eletroforese, por exemplo, por Western blot, do analito a partir de outros produtos. Em algumas modalidades, um marcador de pKal é detectado com um ensaio de Simple Western™. Ensaios Simple Western™ são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Rustandi et al. Qualitative and quantitative evaluation of Simon™, a new CE-based automated Western blot system as applied to vaccine development. Electrophoresis. 2012 Sep;33(17):2790-7). Produtos Simple Western™ também estão disponíveis comercialmente (ver, por exemplo, ProteinSimple®, Santa Clara, CA).
[00020] Em algumas modalidades, um primeiro marcador de pKal, por exemplo, de precalicreína, preKal ativa, alfa 2M-pKal, ou C1INH- pKal, é detectado com imunoensaio do tipo sanduíche, e um segundo marcador de pKal, por exemplo, cininogênio, é detectado em um ensaio que depende da separação, por exemplo, separação por eletroforese, por exemplo, por Western bolt ou Simple Western™, do analito a partir de outros produtos. Em determinadas modalidades, a detecção de um marcador de pKal é qualitativa. Em determinadas modalidades, a detecção de um marcador de pKal é quantitativa. Em modalidades particulares, o método compreende determinar os níveis de C1-INH-pKal e α2M-pKal. Em modalidades particulares, o método compreende a determinação dos níveis de pKal ativo. Em modalidades particulares, são detectados níveis de precalicreína, pKal ativo, alfa 2M-pKal, pKal-C1-INH, cininogênio intacto e cininogênio clivado.
[00021] Em algumas modalidades, o método compreende comparar o nível de um marcador de pKal, por exemplo, precalicreína, pKal ativo, alfa 2M-pKal, pKal-C1-INH, cininogênio intacto ou cininogênio clivado, com um valor de referência. Em determinadas modalidades, dito valor de referência é uma função do nível do dito marcador de pKal em um HAE, por exemplo, em um ou mais sujeitos HAE. Em determinadas modalidades, dito valor de referência é uma função do nível do dito marcador de pKal em um HAE durante um ataque, por exemplo, em um ou mais sujeitos HAE durante um ataque agudo. Em determinadas modalidades, dito valor de referência é uma função do nível de um marcador de pKal em um IAE, por exemplo, em um ou mais sujeitos IAE. Em determinadas modalidades, dito valor de referência é uma função do nível de um marcador de pKal em um IAE durante um ataque agudo, por exemplo, em um ou mais sujeitos IAE durante um ataque agudo. Em determinadas modalidades, dito valor de referência é uma função do nível de um marcador de pKal na ausência de HAE ou IAE, por exemplo, em um ou mais sujeitos sem histórico de HAE ou IAE.
[00022] Em modalidades particulares, o método compreende, por exemplo, responder a uma comparação, classificar o sujeito, por exemplo, classificar o sujeito em risco para um distúrbio mediado por pKal, ou administrar ou reter uma terapia do dito sujeito. Em determinadas modalidades, o método compreende, por exemplo, responder a uma comparação, selecionar um tratamento para dito sujeito. Em alguma modalidade, o método compreende, por exemplo, responder a uma comparação, administrar ou reter uma terapia do dito sujeito, por exemplo, um agente de ligação de calicreína; um antagonista do receptor de bradicinina B2; ou um agente de substituição de C1-INH. Em modalidades particulares, dito tratamento é a administração de um inibidor de pKal, por exemplo, um inibidor de pKal selecionado a partir de DX-88; EpiKal-2 e DX2930.
[00023] Em algumas modalidades, uma amostra do referido sujeito é posta em contato com um substrato que compreende um agente de captura para dois ou mais dos seguintes marcadores divulgados neste documento, por exemplo, de: precalicreína, por exemplo, um anticorpo anti- precalicreína; pKal ativo, por exemplo, um anticorpo anti pKal ativo; alfa 2M- pKal, por exemplo, um anti-alfa 2m-pKal anticorpo; C1INH-pKal, por exemplo, um anticorpo anti-C1INH-pKal; ou um marcador H, por exemplo, um anticorpo anti-marcador H; opcionalmente, no qual pelo menos um agente é, opcionalmente, um agente de captura para um marcador pKal.
[00024] Em algumas modalidades, o método compreende a aquisição de uma amostra, por exemplo, uma amostra de sangue ou plasma do dito sujeito.
[00025] Em algumas modalidades, dito substrato compreende: um agente de captura para C1-INH-pKal; e um agente de captura para alpha2M-pKal. Em determinadas modalidades, dito substrato compreende, ainda, um ou ambos: um agente de captura para precalicreína, por exemplo, um anticorpo anti-precalicreína; um agente de captura para pKal ativo, por exemplo, um anticorpo anti-pKal ativo.
[00026] Em algumas modalidades, um primeiro agente de captura (para um primeiro marcador) e um segundo agente de captura (para um segundo marcador) são dispostos em um substrato, tal que um sinal para a presença do primeiro marcador pode ser distinto de um sinal para a presença do segundo marcador. Em determinadas modalidades, dito primeiro agente de captura (para um primeiro marcador) está localizado em um primeiro local ou endereço e dito segundo agente de captura (para um segundo marcador) está localizado em um segundo local ou endereço. Em modalidades particulares, dito primeiro local ou endereço e dito segundo local ou endereço não se sobrepõem no dito substrato. Em determinadas modalidades, dito primeiro agente de captura é para um primeiro marcador de pKal. Em determinadas modalidades, dito primeiro agente de captura é para um primeiro marcador de pKal e dito segundo agente de captura para um segundo marcador de pKal. Em determinadas modalidades, dito primeiro agente de captura é para um marcador de pKal e dito segundo agente de captura é para um marcador de H. Em determinadas modalidades, dito primeiro marcador é 2m-pKal e dito segundo marcador é C1INH-pKal. Em determinadas modalidades, o agente de captura para 2m- pKal é um anticorpo anti-2M-pKal e o agente de captura para C1INH-pKal é um anticorpo anti-C1INH-pKal.
[00027] Em determinadas modalidades, o método compreende, por exemplo, colocar um substrato em contato com um anticorpo anti-2M- pKal detectável e classificado, e um anticorpo anti-C1INH-pKal detectável e classificado para determinar a presença ou a quantidade de um marcador de pKal. Em determinadas modalidades, os ditos anticorpos são rotulados com uma fração que produz um produto colorido, emite um fóton, absorve um fóton, altera um substrato ou altera a condutividade do substrato. Em determinadas modalidades, os ditos anticorpos são rotulados com uma fração que utiliza eletroquimioluminescência. Em determinadas modalidades, os ditos anticorpos são rotulados com resinium. Em modalidades particulares, dito substrato provido em um dispositivo de detecção de mesoescala. Em modalidades particulares, dito substrato provido como um dispositivo de tira de medida, adequado para uso com um ou ambos de sangue e plasma. Em modalidades particulares, dito primeiro agente de captura e dito segundo agente de captura estão dispostos em uma câmara conectada fluidicamente ou de forma comum, por exemplo, uma câmara, por exemplo, um poço ou depressão, em um dispositivo multicâmara, por exemplo, uma placa multipoços. Em modalidades particulares, dito primeiro agente de captura e dito segundo agente de captura são impressos em um substrato.
[00028] Em algumas modalidades, dito agente de captura para um primeiro marcador de pKal está em um primeiro local no dito substrato e dito agente de captura para um segundo marcador de pKal está em um segundo local no dito substrato e dito primeiro e segundo locais são dispostos no dito substrato tal que um sinal para a presença do primeiro marcador de pKal pode ser distinto de um sinal de um segundo marcador de pKal. Em determinadas modalidades, dito substrato compreende um agente de captura para um terceiro marcador em um terceiro local, e o terceiro local é disposto no dito substrato tal que um sinal para a presença do terceiro marcador pode ser distinto de um sinal do dito primeiro e o segundo marcador. Em modalidades particulares, dito primeiro agente de captura é específico para alfa 2M-pKal ou C1INH-pKal. Em modalidades particulares, dito primeiro agente de captura é específico para alfa 2M-pKal e dito segundo agente de captura é específico para C1INH-pKal.
[00029] Em algumas modalidades, uma determinação do nível de um marcador de pKal em uma amostra pode ser feita dentro de 1, 2, 3, 4 ou 5 horas de contato do substrato com a dita amostra. Em algumas modalidades, uma determinação do nível de dois marcadores de pKal em uma amostra pode ser feita dentro de 1, 2, 3, 4 ou 5 horas de contato do substrato com a dita amostra. Em algumas modalidades, uma determinação do nível de dois marcadores de pKal pode ser feita em ensaios realizados simultaneamente, por exemplo, a incubação ou outros intervalos para os testes se sobrepõem um ao outro.
[00030] Em outro aspecto, a presente invenção provê um substrato compreendendo agentes de captura para uma pluralidade de marcadores de pKal, por exemplo, como descrito neste documento.
[00031] Em um aspecto adicional, a presente divulgação provê um método para determinar se um distúrbio é suscetível ao tratamento com um inibidor de pKal compreendendo: avaliar os níveis de um, ou uma pluralidade de, marcadores de pKal, por exemplo, como descrito neste documento, em, por exemplo, um sujeito sofrendo de dito distúrbio, ou um modelo animal para dito distúrbio; comparar o nível determinado com uma referência, em que um nível que atenda um critério predeterminado, por exemplo, se for igual ou acima de um nível de referência, seja indicativo de um distúrbio suscetível ao tratamento com um inibidor de pKal. Em algumas modalidades, o método compreende avaliar o efeito de um inibidor da calicreína, in vitro ou in vivo, ou em um modelo animal de dito distúrbio.
[00032] Em outro aspecto, a presente divulgação provê um método de tratar o sujeito tendo um distúrbio mediado por pKal, por exemplo, um distúrbio mediado por bradicinina, compreendendo a avaliação do nível de um marcador de pKal descrito neste documento, por exemplo, por um método descrito neste documento, determinante, e responsivo à dita avaliação, seleção de um tratamento, por exemplo, seleção de um ou ambos de uma quantidade de dosagem ou frequência de dosagem, de um inibidor de calicreína. Em algumas modalidades, o método compreende administrar um inibidor de calicreína ao dito sujeito. Em algumas modalidades, dito paciente foi administrado um inibidor de calicreína antes da dita avaliação. Em determinadas modalidades, o método compreende administrar um inibidor de calicreína na dita dosagem ou frequência selecionada.
[00033] Em um aspecto adicional, a presente divulgação provê um método para determinar se um distúrbio é suscetível ao tratamento com um inibidor de pKal compreendendo: avaliar os níveis de um ou uma pluralidade de marcadores de pKal, por exemplo, como descrito neste documento, em, por exemplo, um sujeito sofrendo do dito distúrbio, ou um modelo animal para dito distúrbio; comparar o nível determinado com uma referência, em que um nível que atenda um critério predeterminado, por exemplo, se for igual ou acima de um nível de referência, é indicativo de um distúrbio suscetível ao tratamento com um inibidor de pKal. Em algumas modalidades, o método compreende avaliar o efeito de um inibidor da calicreína, in vitro ou in vivo, ou em um modelo animal de dito distúrbio.
[00034] Em outro aspecto, a presente divulgação apresenta métodos e dispositivos da invenção para coleta de uma amostra, por exemplo, de sangue, com ativação de contato mínima. Em uma modalidade, a presente divulgação apresenta um recipiente, no qual está disposto um reagente de captura descrito neste documento, por exemplo, um inibidor da calicreína, por exemplo, um polipeptídio com sequência semelhante à DX-88, por exemplo, um que difere do DX-88 por não mais de 1, 2 ou 5 resíduos de aminoácidos, por exemplo, EPIKAL-2. O recipiente é configurado, por exemplo, com uma abertura, passagem, septo, etc., de modo a permitir a coleta de uma amostra, por exemplo, de sangue, de um sujeito e a ligação de um marcador relacionado a pKal na amostra, por exemplo, pKal, com o reagente de captura, no mesmo recipiente. Medição da espécie ligada, por exemplo, pKal, pode ser efetuada no mesmo recipiente ou em modalidades, o substrato é removido do recipiente anterior para medição, por exemplo, a medição pode ser em ou sobre outro dispositivo. Em modalidades, o volume do recipiente é de 0,5-100, 0,5-50, 0,5-10, 1-100, 1-50, é 1-25 mls. Em uma modalidade, o reagente de captura, por exemplo, um reagente de captura de pKal, é disposto sobre a superfície interna do recipiente. O reagente de captura pode ser acoplado à superfície com um primeiro par ligante específico ligado à superfície e um segundo par ligante específico acoplado ao reagente de captura. Exemplos de pares ligantes específicos são biotina e avidina. Em uma modalidade, um reagente de captura biotinilado, por exemplo, um reagente de captura pKal, por exemplo, um inibidor da calicreína, por exemplo, um polipeptídio com sequência semelhante à DX-88, por exemplo, um que difira de DX-88 por não mais de 1, 2 ou 5 resíduos de aminoácidos, por exemplo, Epikal-2 é disposto sobre uma superfície do recipiente que é revestido com avidina.
[00035] A presente divulgação provê biomarcadores capazes de identificar pacientes com angioedema mediado por calicreína plasmática (KMA) ou outras doenças mediadas por pKal úteis na avaliação e tratamento.
[00036] Paciente mostrados como exibindo ativação de pKal através de um biomarcador são candidatos para tratamento com um inibidor de pKal, tal como DX-88, um inibidor de proteína pequena de pKal aprovado para o tratamento de HAE associado a ataques edematosos agudos. Outros inibidores de pKal incluem DX-2930, o qual é um inibidor de anticorpo totalmente humano. Em algumas modalidades, pacientes que exibiram ativação de pKal através de um biomarcador são candidatos a tratamento com um antagonista do receptor de bradicinina B2, por exemplo, Incatibant (Firazyr). Em algumas modalidades, pacientes que exibiram ativação de pKal através de um biomarcador são candidatos para o tratamento com um agente de substituição de C1-INH, por exemplo, um concentrado de C1-INH nanofiltrado pasteurizado humano purificado (Berinert).
[00037] Modalidades da presente divulgação proveem um biomarcador e respectivo uso na identificação e o tratamento de pacientes, por exemplo, pacientes sofrendo de edema causado por bradicinina que é gerada por calicreína plasmática. Métodos, composições e dispositivos divulgados neste documento são úteis de diversas formas. Por exemplo, níveis de um marcador de pKal podem ser usados para identificar distúrbios associados com a ativação do sistema de contato elevado. Triagem inicial pode ser seguida de teste in vitro ou in vivo, com inibidores de calicreína plasmática (por exemplo, DX-88, EPIKAL-2 ou DX-2930), por exemplo, em modelos pré-clínicos de doenças. Um marcador divulgado neste documento também pode ser usado como um biomarcador farmacodinâmico ou, de outra forma, monitorar a resposta de um sujeito a um inibidor da calicreína. Um marcador divulgado neste documento pode ser usado em um diagnóstico integrante para possibilitar o tratamento de doenças mediadas por calicreína plasmática, gerenciar a dosagem durante terapia profilática de HAE ou identificar um iminente ataque agudo de HAE. Outras modalidades exemplares incluem: a. Um ensaio da atividade de pKal baseada em microplacas compreendendo: (a) prover uma amostra plasmática a partir de um sujeito; (b) incubando a amostra plasmática com um ativador de sistema pKal na presença de um substrato de pKal, em que o substrato é anexado a um rótulo que é capaz de lançar um sinal detectável após ser clivado por pKal; e (c) medir a atividade de pKal com base na densidade do sinal detectável. O ativador pode ser Fator FXIIa. Em alguns exemplos, a amostra plasmática pode ser incubada com o ativador, o substrato de pKal e um candidato inibidor de pKal. Em alguns exemplos, o método pode compreender, adicionalmente, avaliar a atividade do candidato inibidor de pKal, em que um nível reduzido de atividade de pKal na presença do candidato inibidor de pKal, quando relacionado ao nível da atividade de pKal na ausência do candidato inibidor de pKal, indica que o candidato inibidor é eficaz.
[00038] Os detalhes de uma ou mais modalidades da presente divulgação estão estabelecidos na descrição abaixo. Outros recursos ou vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição, dos desenhos, e também a partir das reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[00039] Figura 1 é uma representação de elementos envolvidos na ativação do sistema de contato de calicreína plasmática. HMWK clivado pode ser determinado por Western blot. 2m-pKal e C1INH-pKal podem ser determinados por imunoensaio (plataforma MSD).
[00040] Figura 2 mostra a detecção de cininogênio clivado pela análise de Western blot. Amostras foram analisadas utilizando SDS-PAGE (3-8% Tris-Acetato) sob condições redutoras seguidas por transferência para membrana de PVDF e immunoblotting. Faixa 1 - 50 nM de Cininogênio Intacto; Faixa 2 - 50 nM de Cininogênio Clivado; Faixa 3 - 50 nM de Cininogênio de Baixo Peso Molecular; Faixa 4 - 1:20 plasmática Humano Citratado de Sódio (Tubo de Coleta de Vidro); Faixa 5 - 1:20 plasmática Humano Citratado de Sódio Tratado por Calicreína (Plástico); Faixa 6 - 1:20 plasmática Humano Citratado de Sódio (Plástico); Faixa 7 - 1:20 plasmática Humano Citratado de Sódio (Plástico) 20nM de Cininogênio de Duas Cadeias Adicionado.
[00041] Figura 3 mostra a purificação de complexo de C1INH- pKal. O cromatograma de permuta catiônica (painel A) demonstra a separação entre a C1INH, pKal e o complexo. As frações das trocas catiônicas foram coletadas e analisadas por SDS-PAGE (painel B).
[00042] Figura 4 mostra uma curva padrão ELISA de tipo sanduíche para a detecção de C1INH-pKal no plasma humano. Anti-pKal mouse (clone 13G11) foi chapeado, e inibidor Anti-C1 de cabra foi usado para a detecção.
[00043] Figura 5 mostra uma curva padrão ELISA de tipo sanduíche para a detecção de C1INH-pKal no plasma humano. Anti-C1-INH de cabra foi chapeado, e anti-pKal mouse (clone 13G11) foi usado para a detecção.
[00044] Figura 6 mostra a purificação de complexo de α2M-pKal. O complexo foi purificado por cromatografia de exclusão de tamanho (painel A) e frações foram analisadas por SDS-PAGE (painel B).
[00045] Figura 7 mostra a quantificação do complexo de α2M- pKal. Atividade de calicreína plasmática foi diminuída para um nível de platô sobre adição de excesso de α2M (painel A). Usando um excesso de α2M de 10 vezes sobre pKal como curva padrão, foi construída, a partir da qual a concentração molar do complexo de α2M-pKal purificado poderia ser determinada de acordo com a concentração de pKal no complexo.
[00046] Figura 8 mostra uma curva padrão ELISA de tipo sanduíche para a detecção de α2M-pKal no plasma humano. Anti-α2M foi chapeado e anti-pKal mouse (clone 13G11) foi usado para a detecção.
[00047] Figura 9 mostra uma curva padrão ELISA de tipo sanduíche para a detecção de α2M-pKal no plasma humano. Anti-pKal (clone 13G 11) foi chapeado e anti-α2M foi usado para a detecção.
[00048] Figura 10 mostra a detecção de complexos C1INH-pKal e α2M-pKal em plasma humano normal após ativação com sulfato de dextrano.
[00049] Figura 11 mostra a detecção de cininogênio intacto (ou seja, cadeia 1) em uma amostra do paciente obtida durante um ataque. Amostra plasmática do paciente foi coletada em tubos plasmática citratados contendo um coquetel anti-protease.
[00050] Figura 12 é uma ilustração esquemática de um ensaio da atividade de pKal baseada em microplacas, com acompanhamento do experimento mostrando a atividade inibitória de DX-2930 na atividade de pKal em macacos tratados.
[00051] Figura 13 mostra experimentos em plasma de macacos tratados por placebo/veículo, bem como um controle preciso de DX-2930 neste mesmo plasma.
[00052] Figura 14 mostra HMWK em amostras plasmática de pacientes HAE (CM, DG, BB e GR). As amostras foram coletadas em coquetel de inibidor de anti protease. MW: marcador; C: 1 cadeia (6,44 μ g/mL) + 2 corrente (1,54 μ g/mL); 1: Basal CM; 2: Ataque CM; 3: Basal DG; 2: Ataque DG; 5: Basal BB; 6: Ataque BB; 7: Basal GR; 8: Ataque GR; e 9: Plasma normal coletivo.
[00053] Figura 15 mostra o nível de uma cadeia HMWK em amostras de pacientes HAE, conforme determinado por um ensaio de Western blot.
[00054] Figura 16 mostra a atividade inibitória de DX-2930 na ativação de pKal em macacos cinomolgos. DX-2930 Multi-Dose foi usado em análise Western Blot de Amostras Plasmáticas APTT (com ou sem Ativação plasmática por Caulim ou 15μg/mL Sulfato de Dextrano) de Cininogênio de Macacos cinomolgos de Dia 4
[00055] Figura 17 ilustra um ensaio de ativação HMWK exemplar Ex Vivo para examinar a atividade inibitória de um inibidor de pKal Dx-2930 exemplar, usando análise Protein Simple Western e análise Western blot tradicional. O ensaio de ativação HMWK Ex Vivo descrito neste documento mostrou que os níveis mínimos de DX-2930 inibiram a ativação de pKal, a qual superou o inibidor de C1 endógeno sozinho no plasma humano normal.
[00056] Figura 18 retrata um ensaio de ativação HMWK Ex Vivo de dados brutos de Protein Simple para plasma ativado Fator XIIa com titulação DX2930.
[00057] Figura 19 mostra a detecção de cininogênio HMW humano no plasma após a ativação de 30 minutos, conforme determinado por análise Western blot.
[00058] Figura 20 mostra a comparação entre o ensaio Protein Simple Western e o tradicional ensaio de Western blot na detecção de ativação plasmática.
[00059] Figura 21 mostra a comparação entre o ensaio Protein Simple Western e o tradicional ensaio de Western blot na detecção de ativação plasmática.
[00060] Figura 22 mostra o percentual de redução de uma cadeia HMWK após 30 minutos de ativação FXIIa em amostra plasmática pura BRH745047.
[00061] Figura 23 mostra o percentual de redução de uma cadeia HMWK após 30 minutos de ativação FXIIa em amostra plasmática pura BRH745048.
[00062] Figura 24 mostra o percentual de redução de uma cadeia HMWK após 30 minutos de ativação FXIIa em amostra plasmática pura BRH745064.
[00063] Figura 25 mostra o percentual de redução de uma cadeia HMWK após 30 minutos de ativação FXIIa em amostra plasmática pura BRH745062.
[00064] Figura 26 mostra o percentual de redução de uma cadeia HMWK após 30 minutos de ativação FXIIa em amostra plasmática pura BRH745049, BRH745062 e BRH745063.
[00065] Figura 27 é um gráfico que mostra a redução de uma cadeia HMWK em plasma com FXIIa em várias concentrações.
[00066] Figura 28 mostra os níveis de HMWK de cadeia dupla, normalmente, basal, e pacientes que sofrem de ataque HAE, conforme determinado pelo ensaio de cininogênio clivado endógeno descritos neste documento.
[00067] Figura 29 é um gráfico mostrando o cininogênio clivado endógeno em amostras HAE, conforme determinado por Protein Simple Western blot e Western blot tradicional.
[00068] Figura 30 mostra os níveis de cininogênio clivado endógeno em amostras de pacientes HAE. Faixa 1: cadeia única e cadeia dupla HMWK purificada. Faixa 2: amostras plasmáticas de humano normal coletadas com citrato.
[00069] Figura 31 é um gráfico que mostra a porcentagem de inibição da atividade de pKal em amostras plasmáticas de macacos tratados com DX-2930 e inibição da atividade de pKal nas amostras plasmáticas cravadas in vitro com DX-88 (ecallantide), C1-INH ou DX-2930. A inibição percentual foi medida utilizando um ensaio de ativação pKal exemplar ex vivo. Barras de erro representam o erro padrão da média.
[00070] Figura 32 é um gráfico mostrando o percentual ex vivo de inibição da atividade de pKal no plasma de humanos e macacos tratados com diferentes doses de DX-2930. A inibição percentual foi medida utilizando um ensaio de ativação pKal exemplar ex vivo. A linha tracejada mostra a inibição percentual observada com 80 nM DX-2930, que é uma concentração que corresponde a Cmáxima de um nível terapeuticamente eficaz de ecallantide.
[00071] Figura 33 é uma série de tramas, mostrando a "% de inibição da atividade de pKal" em amostras plasmáticas de estudo DX-2930 Fase 1, comparando a inibição média de cada dose diária para cada grupo de dosagem a amostras correspondentes no grupo de controle-veículo. Barras de erro são erro padrão.
[00072] Figura 34 é um gráfico mostrando dados Western blot de sujeitos DX-2930 Fase 1a seguido de tratamento FXIIa. Barras de erro foram calculadas utilizando o desvio padrão entre os sujeitos. Sujeitos do grupo 1 foram dosados em 0,1 mg/Kg, sujeitos do grupo 2 foram dosados em 0,3 mg/Kg, sujeitos do grupo 3 foram dosados em 1 mg/Kg, e sujeitos do grupo 4 foram dosados em 3 mg/Kg.
[00073] Figura 35 mostra um gráfico de dados Western blot de sujeitos DX-2930 Fase 1a na ausência de tratamento FXIIa. Barras de erro foram calculadas utilizando o desvio padrão entre os sujeitos. Sujeitos do grupo 1 foram dosados em 0,1 mg/Kg, sujeitos do grupo 2 foram dosados em 0,3 mg/Kg, sujeitos do grupo 3 foram dosados em 1 mg/Kg, e sujeitos do grupo 4 foram dosados em 3 mg/Kg.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00074] Neste documento descreve-se ensaios para medição de níveis em uma amostra de um sujeito de biomarcadores associados com o sistema de calicreína (pKal) plasmática, tal como cininogênio intacto de alto peso molecular (HMWK), HMWK clivado e/ou atividade de pKal. Em algumas modalidades, os ensaios compreendem incubar uma amostra obtida do sujeito com um ativador do sistema pKal e medir os níveis de cininogênio intacto de alto peso molecular (HMWK), HMWK clivado e/ou atividade de pKal. Tais ensaios são úteis, por exemplo, para avaliar se o sujeito tem ou está em risco de uma doença associada com pKal, para avaliar o tratamento de uma doença associada com pKal, e para identificar candidatos a fármacos, por exemplo, moduladores pKal, tais como inibidores de pKal. Tais ensaios também são úteis, por exemplo, para selecionar sujeitos para tratamento, tal como para o tratamento de uma doença associada com pKal.
Definições
[00075] Por conveniência, antes da descrição adicional da presente invenção, certos termos empregados na especificação, nos exemplos e nas reivindicações anexas são definidos aqui. Outros termos são definidos conforme eles aparecem na especificação.
[00076] As formas singulares "um", "uma" e "o" incluem referências plurais, a menos que o contexto claramente dite o contrário.
[00077] Como usado neste documento, "adquirir" ou "aquisição" refere-se à obtenção de posse de uma entidade física ou um valor, por exemplo, um valor numérico, pela "aquisição direta" ou a "aquisição indireta" da entidade física ou o valor. "Aquisição direta" significa realizar um processo (por exemplo, realizar um ensaio ou teste em uma amostra, ou "analisar uma amostra" conforme esse termo é definido neste documento) para obter a entidade física ou o valor. "Aquisição indireta" refere-se a receber a entidade ou valor físico de outro grupo ou fonte (por exemplo, um laboratório de terceiros que adquiriu diretamente a entidade ou valor físico). Aquisição direta de uma entidade física inclui a realização de um processo, por exemplo, analisar uma amostra, que inclui uma mudança física em uma substância física, por exemplo, uma matéria-prima. Mudanças exemplares incluem fazer uma entidade física de duas ou mais matérias-primas, distorcer ou fragmentar uma substância, separar ou purificar uma substância, combinar duas ou mais entidades separadas em uma mistura, realizar uma reação química que inclui quebrar ou formar uma ligação covalente ou ligação não covalente. Aquisição direta de um valor inclui realizar um processo que inclui uma mudança física em uma amostra ou outra substância, por exemplo, realizar um processo analítico que inclui uma mudança física em uma substância, por exemplo, uma amostra, analito, ou reagente (por vezes referido neste documento como "análise física"), realizar um método analítico, por exemplo, um método que inclui um ou mais dos seguintes: separar ou purificar uma substância , por exemplo, um analito, ou um fragmento ou outros respectivos derivados, de outra substância; combinar um analito, ou fragmento ou outros respectivos derivados, com outra substância, por exemplo, um tampão, solvente ou reagente; ou mudar a estrutura de um analito, ou um fragmento ou outro respectivo derivado, por exemplo, ao quebrar ou formar uma ligação covalente ou não covalente, entre um primeiro e um segundo átomo do analito; ou ao mudar a estrutura de um reagente, ou um fragmento ou outro respectivo derivado, por exemplo, ao quebrar ou formar uma ligação covalente ou não covalente, entre um primeiro e um segundo átomo do reagente.
[00078] Como usado neste documento, "analisar" uma amostra inclui a realização de um processo que envolve uma mudança física em uma amostra ou outra substância, por exemplo, matéria-prima. Mudanças exemplares incluem fazer uma entidade física de duas ou mais matérias- primas, distorcer ou fragmentar uma substância, separar ou purificar uma substância, combinar duas ou mais entidades separadas em uma mistura, realizar uma reação química que inclui quebrar ou formar uma ligação covalente ou ligação não covalente. Análise de uma amostra pode incluir realizar um processo analítico que inclui uma mudança física em uma substância, por exemplo, uma amostra, analito, ou reagente (por vezes referido neste documento como "análise física"), realizar um método analítico, por exemplo, um método que inclui um ou mais dos seguintes: separar ou purificar uma substância, por exemplo, um analito, ou um fragmento ou outro respectivo derivado, de outra substância; combinar um analito, ou fragmento ou outro respectivo derivado, com outra substância, por exemplo, um tampão, solvente ou reagente; ou mudar a estrutura de um analito, ou um fragmento ou outro respectivo derivado, por exemplo, ao quebrar ou formar uma ligação covalente ou não covalente, entre um primeiro e um segundo átomo do analito; ou ao mudar a estrutura de um reagente, ou um fragmento ou outro respectivo derivado, por exemplo, ao quebrar ou formar uma ligação covalente ou não covalente, entre um primeiro e um segundo átomo do reagente.
[00079] O termo "agonista," conforme usado neste documento, deve referir-se a um agente que imita ou regula para cima (por exemplo, potencializa ou suplementa) a bioatividade de uma proteína. Um agonista pode ser uma proteína do tipo selvagem ou respectivo derivado tendo pelo menos uma bioatividade da proteína do tipo selvagem. Um agonista pode também ser um composto que aumenta pelo menos uma bioatividade de uma proteína. Um agonista também pode ser um composto que aumenta a interação de um polipeptídio com outra molécula, por exemplo, um peptídeo alvo ou ácido nucleico.
[00080] O termo "antagonista" conforme usado neste documento destina-se a se referir a um agente que regula para baixo (por exemplo, suprime ou inibe) pelo menos uma bioatividade de uma proteína. Um antagonista pode ser um composto que inibe ou diminui a interação entre uma proteína e outra molécula, por exemplo, um peptídeo alvo ou substrato de enzima. Um antagonista também pode ser um composto que reduz ou inibe a quantidade de proteína expressa presente. Normalmente, inibir uma proteína ou um gene se refere a reduzir a expressão ou uma atividade relevante da proteína ou gene por pelo menos 10% ou mais, por exemplo, 20%, 30%, 40%, ou 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais, ou uma diminuição na expressão ou na atividade relevante superior a 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou mais, como medido por um ou mais métodos descritos neste documento ou reconhecidos na técnica.
[00081] Como usado neste documento, "afinidade de ligação" refere-se à associação aparente constante ou Ka. O Ka é o recíproco da constante de dissociação (Kd). Uma proteína de ligação pode, por exemplo, ter uma afinidade de ligação de pelo menos 105, 106, 107, 108, 109, 10 10 e 1011 M-1 para uma molécula alvo específica. Maior ligação de afinidade de uma proteína de ligação a um primeiro alvo em relação a um segundo alvo pode ser indicada por um maior Ka (ou um menor valor numérico Kd) para ligar o primeiro alvo do que o Ka (ou valor numérico Kd) para ligar ao segundo alvo. Em tais casos, a proteína de ligação tem especificidade para o primeiro alvo (por exemplo, uma proteína em uma primeira conformação ou respectiva imitação) em relação ao segundo alvo (por exemplo, a mesma proteína em uma segunda conformação ou respectiva imitação; ou uma segunda proteína). Diferenças na afinidade de ligação (por exemplo, para especificidade ou outras comparações) podem ser pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37,5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, ou 105 vezes.
[00082] Afinidade de ligação pode ser determinada por uma variedade de métodos incluindo diálise de equilíbrio, ligação de equilíbrio, filtração de gel, ELISA, ressonância de plasmon de superfície ou espectroscopia (por exemplo, usando um ensaio de fluorescência). Condições exemplares para avaliar a afinidade de ligação estão no tampão de TRIS (50mM de TRIS, 150mM de NaCl, 5mM de CaCl2 em pH 7,5). Estas técnicas podem ser usadas para medir a concentração de proteína de ligação livre e delimitada como uma função de concentração de proteína de ligação (ou alvo). A concentração de proteína de ligação delimitada ([Delimitada]) está relacionada à concentração de proteína de ligação livre ([Livre]) e a concentração de sítios de ligação para a proteína de ligação no alvo onde (N) é o número de sítios de ligação por molécula alvo pela seguinte equação: [Delimitada] = N • [Livre]/((1/Ka) + [Livre]).
[00083] Não é sempre necessário efetuar uma determinação exata de Ka, embora, uma vez que às vezes é suficiente obter uma medição quantitativa de afinidade, por exemplo, determinada utilizando um método tal como ELISA ou análise de FACS, é proporcional a Kae assim pode ser usado para comparações, tais como determinar se uma maior afinidade é , por exemplo, 2 vezes superior, obter uma medição qualitativa da afinidade, ou obter uma inferência de afinidade, por exemplo, pela atividade em um ensaio funcional, por exemplo, um ensaio in vitro ou in vivo.
[00084] O termo "proteína de ligação" se refere a uma proteína que pode interagir com uma molécula alvo. Este termo é usado intercambiavelmente com "ligante". Uma "proteína de ligação de calicreína plasmática" se refere a uma proteína que pode interagir com (por exemplo, ligar) calicreína plasmática e inclui, em particular, as proteínas que preferencialmente ou especificamente interagem com e/ou inibem calicreína plasmática. Uma proteína inibe calicreína plasmática se provoca uma diminuição na atividade da calicreína plasmática em comparação com a atividade da calicreína plasmática na ausência da proteína e nas mesmas condições. Em algumas modalidades, a proteína de ligação de calicreína plasmática é um anticorpo.
[00085] O termo "reagente de captura" refere-se a uma fração que se liga especificamente ao seu ligante.
[00086] Como usado neste documento, os termos "complexo" ou "formação de complexo" referem-se a um complexo entre membros tendo uma afinidade específica entre si.
[00087] Uma "substituição de aminoácido conservadora" é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (e.g., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
[00088] Sequências de motivo para biopolímeros podem incluir posições que podem ser aminoácidos variados. Por exemplo, o símbolo "X" neste contexto geralmente se refere a qualquer aminoácido (por exemplo, qualquer um dos vinte aminoácidos naturais) a menos que especificado de outra forma, por exemplo, para se referir a qualquer aminoácido não cisteína. Outros aminoácidos permitidos também podem ser indicados, por exemplo, usando parênteses e barras. Por exemplo, "(A/W/F/N/Q)" significa que alanina, triptofano, fenilalanina, asparagina e glutamina são permitidos nessa posição particular.
[00089] Como usado neste documento, um "reagente de detecção" refere-se a uma fração que se liga à fração ativa para ser detectada. Normalmente isso gera um sinal, por exemplo, fluorescência, ou produz um composto mensurável.
[00090] Um "epítopo" refere-se ao sítio em um composto alvo que é ligado por uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo tal como um anticorpo Fab ou de comprimento total). No caso onde o composto alvo é uma proteína, o sítio pode ser inteiramente composto de componentes de aminoácidos, inteiramente compostos de modificações químicas de aminoácidos da proteína (por exemplo, frações de glicosil), ou composto de suas combinações. Sobreposição de epítopos incluem pelo menos um resíduo de aminoácido, grupo glicosil, grupo fosfato, grupo sulfato ou outra característica molecular em comum.
[00091] Uma primeira proteína de ligação (por exemplo, anticorpo) "se liga ao mesmo epítopo" como uma segunda proteína de ligação (por exemplo, anticorpo) se a primeira proteína de ligação se liga ao mesmo sítio em um composto alvo que a segunda proteína de ligação liga, ou se liga a um sítio que se sobrepõe (por exemplo, sobreposição de 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%, por exemplo, em termos de sequência de aminoácidos ou outro recurso molecular (por exemplo, grupo glicosil, grupo fosfato ou grupo sulfato)) com o sítio que a segunda proteína de ligação se liga.
[00092] Uma primeira proteína de ligação (por exemplo, anticorpo) "concorre para ligação" com uma segunda proteína de ligação (por exemplo, anticorpo) se a ligação da primeira proteína de ligação ao seu epítopo diminui (por exemplo, em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais) a quantidade da segunda proteína de ligação que se liga a seu epítopo. A concorrência pode ser direta (por exemplo, a primeira proteína de ligação se liga a um epítopo que é igual, ou se sobrepõe ao epítopo ligado pela segunda proteína de ligação), ou indireta (por exemplo, a ligação da primeira proteína de ligação ao seu epítopo provoca uma mudança estérica no composto alvo que diminui a capacidade da segunda proteína de ligação em se ligar a seu epítopo).
[00093] Como usado neste documento, uma molécula biológica "funcional" é uma molécula biológica em uma forma na qual exibe uma propriedade e/ou atividade pela qual é caracterizada.
[00094] Cálculos de "homologia" ou "sequência de identidade" entre duas sequências (os termos são usados intercambiavelmente neste documento) são realizados da seguinte maneira. As sequências são alinhadas para fins de comparação ideais (por exemplo, lacunas podem ser introduzidas em um ou ambos de uma primeira e uma segunda sequência de aminoácidos ou de ácidos nucleicos para alinhamento ideal e sequências não homólogas podem ser desconsideradas para fins de comparação). O alinhamento ideal é determinado como a melhor classificação usando o programa GAP no pacote de software do GCG com uma matriz de classificação Blossum 62 com uma penalidade de lacuna de 12, uma penalidade estendida de lacuna de 4 e uma penalidade de lacuna de mutação frameshift de 5. Os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos em posições de aminoácido ou posições de nucleotídeo correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas naquela posição (como usado neste documento "identidade" de aminoácidos ou de ácidos nucleicos é equivalente à "homologia" de aminoácidos ou ácidos nucleicos). A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhado pelas sequências.
[00095] Em uma modalidade preferencial, o comprimento de uma sequência de referência alinhada para fins de comparação é de pelo menos 30%, preferencialmente de pelo menos 40%, mais preferencialmente de pelo menos 50%, ainda mais preferencialmente de pelo menos 60% e ainda mais preferencialmente de pelo menos 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% ou 100% do comprimento da sequência de referência. Por exemplo, a sequência de referência pode ser o comprimento da sequência de domínio variável de imunoglobulina.
[00096] Como usado neste documento, o termo "hibridiza sob condições de baixa rigidez, média rigidez, alta rigidez ou de rigidez muito alta" descreve condições para hibridização e lavagem. Orientação para a realização de reações de hibridização pode ser encontrada em protocolos atuais em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Métodos aquosos e não aquosos são descritos nessa referência e qualquer um dos dois pode ser usado. Condições de hibridização específicas referidas neste documento são as seguintes: (1) condições de hibridação com baixa estringência em cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 °C, seguida por duas lavagens em 0,2X SSC, 0,1% de SDS a pelo menos 50 °C (a temperatura das lavagens pode ser elevada até 55 °C para as condições de baixa estringência); (2) condições de hibridação com média estringência em 6X SSC a cerca de 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, 0,1% de SDS a 60 °C; (3) condições de hibridação com elevada estringência em 6X SSC a cerca de 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, 0,1% de SDS a 65 °C; e (4) condições de hibridação com estringência muito elevada são de 0,5M de fosfato de sódio, 7% de SDS a 65 °C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2 SSC, 1% de SDS a 65 °C. Condições (4) com estringência muito elevada são as condições preferenciais e as que devem ser usadas, a menos que especificado ao contrário. A divulgação inclui ácidos nucleicos que hibridizam com rigidez baixa, média, alta, ou muito alta a um ácido nucleico descrito neste documento ou a um respectivo complemento, por exemplo, ácidos nucleicos codificando uma proteína de ligação descrita neste documento. Os ácidos nucleicos podem ser do mesmo comprimento ou de 30, 20, ou 10% do comprimento do ácido nucleico de referência. O ácido nucleico pode corresponder a uma região codificando uma sequência de domínio variável de imunoglobulina descrita neste documento.
[00097] Uma "composição isolada" refere-se a uma composição que é removida de pelo menos 90% de pelo menos um componente de uma amostra natural da qual a composição isolada pode ser obtida. Composições produzidas artificialmente ou naturalmente podem ser "composições de pelo menos" um certo grau de pureza se a espécie ou população de espécies de interesse é pelo menos 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98 ou 99% pura em uma relação peso-peso.
[00098] Como usado neste documento, o termo "in vitro" refere- se aos eventos que ocorrem em um ambiente artificial, por exemplo, em um tubo de ensaio ou recipiente de reação, em cultura de células, etc., em vez de dentro de um organismo multicelular.
[00099] Como usado neste documento, o termo "in vivo" se refere aos eventos que ocorrem dentro de um organismo multicelular tal como um animal humano ou não humano.
[000100] Uma "composição isolada" refere-se a uma composição que é removida de pelo menos 90% de pelo menos um componente de uma amostra natural da qual a composição isolada pode ser obtida. Composições produzidas artificialmente ou naturalmente podem ser "composições de pelo menos" certo grau de pureza se a espécie ou população de espécies de interesse é pelo menos 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98 ou 99% pura em uma relação peso-peso.
[000101] Uma proteína "isolada" refere-se a uma proteína que é removida de pelo menos 90% de pelo menos um componente de uma amostra natural da qual a proteína isolada pode ser obtida. Proteínas podem ser "de pelo menos" certo grau de pureza se a espécie ou população de espécies de interesse é pelo menos 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98 ou 99% pura em uma relação peso-peso.
[000102] O termo "calicreína" (por exemplo, calicreína plasmática) refere-se a peptidases (enzimas que clivam ligações peptídicas em proteínas), um subgrupo da família de serina protease. Calicreína plasmática cliva cininogênio para gerar as cininas, potentes peptídeos pró- inflamatórios.
[000103] O termo "inibidor de calicreína" refere-se a qualquer agente ou molécula que inibe a calicreína. Por exemplo, DX-88 (também referido neste documento como "PEP-1") é um potente (Ki < 1 nM) e um inibidor específico da calicreína plasmática (NP_000883). (Vide também, por exemplo, WO 95/21601 ou WO 2003/103475).
[000104] Como usado neste documento, o termo "DX-2922" como usado intercambiavelmente com o termo "X101-A01". Outras variantes deste anticorpo são descritas abaixo.
[000105] Como usado neste documento, o termo "DX-2930" como usado intercambiavelmente com o termo "X124-G01". Outras variantes deste anticorpo são descritas abaixo.
[000106] O termo "modulador" refere-se a um polipeptídio, ácido nucleico, macromolécula, complexo, molécula, molécula pequena, composto, espécie ou semelhantes (de ocorrência natural ou não natural), ou um extrato feito de materiais biológicos tais como bactérias, plantas, fungos, ou células ou tecidos animais, que podem ser capazes de causar modulação. Moduladores podem ser avaliados para atividade potencial como inibidores ou ativadores (direta ou indiretamente) de uma propriedade funcional, atividade ou processo biológico ou combinação deles, (por exemplo, agonista, antagonista parcial, agonista parcial, agonista inverso, antagonista, agentes antimicrobianos, inibidores da infecção ou proliferação microbiana e semelhantes) por inclusão em ensaios. Em tais ensaios, muitos moduladores podem ser triados ao mesmo tempo. A atividade de um modulador pode ser conhecida, desconhecida ou parcialmente conhecida.
[000107] Um resíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência de tipo selvagem do agente de ligação, por exemplo, o anticorpo, sem abolir ou mais preferencialmente, sem alterar substancialmente uma atividade biológica, enquanto mudar um resíduo de aminoácido "essencial" resulta em uma perda substancial da atividade.
[000108] Um "paciente", "sujeito" ou "hospedeiro" (estes termos são usados intercambiavelmente) a ser tratado pelo método de sujeito pode significar um animal humano ou não humano. Em algumas modalidades, um sujeito está em risco de ou sofre de um distúrbio mediado por calicreína, por exemplo, um distúrbio mediado por bradicinina, por exemplo, angioedema hereditário (HAE). Em algumas modalidades, um sujeito está em risco de ou sofre de angioedema idiopático não dependente de histamina, artrite reumatoide, doença de Crohn, lúpus, doença de Alzheimer, choque séptico, lesão por queimadura, lesão por isquemia/reperfusão cerebral, edema cerebral, retinopatia diabética, nefropatia diabética, edema macular, vasculite, trombose arterial ou venosa, trombose associada com dispositivos de assistência ventricular ou stents, trombocitopenia induzida por heparina com trombose, doença tromboembólica e doença coronariana com angina de peito instável, edema, doença ocular, gota, doença inflamatória intestinal, mucosite oral, dor neuropática, dor inflamatória, tipo, doenças de estenose espinhal- degenerativas, íleo pós operatório, aneurisma da aorta, osteoartrite, angioedema hereditário, embolia pulmonar, acidente vascular cerebral, traumatismo craniano ou edema cerebral peritumoral, sepse, evento isquêmico (AVC) de artéria cerebral média aguda (MCA), reestenose (por exemplo, após a angioplastia), nefrite de lúpus eritematoso sistêmico, uma doença autoimune, uma doença inflamatória, uma doença cardiovascular, uma doença neurológica, uma doença associada com desenovelamento de proteínas, uma doença associada com a angiogênese, nefropatia hipertensiva e nefropatia diabética, doenças alérgicas e respiratórias (por exemplo, anafilaxia, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, síndrome do desconforto respiratório agudo, fibrose cística persistente, rinite) e lesões de tecidos (por exemplo, lesão por queimadura ou química).
[000109] Os termos "pré-calicreína" e "calicreína pré-plasma" são usados intercambiavelmente neste documento e referem-se à forma de zimogênio da calicreína plasmática ativa, que é também conhecida como pré-calicreína.
[000110] O termo "prevenção" ou "prevenir" uma doença em um sujeito refere-se a submeter o sujeito a um tratamento farmacêutico, por exemplo, à administração de uma droga, tal que pelo menos um sintoma da doença seja prevenido, ou seja, administrada antes da manifestação clínica da condição indesejada (por exemplo, doença ou outro estado indesejado do animal hospedeiro) de modo que proteja o hospedeiro contra o desenvolvimento da condição indesejada. "Prevenção" de uma doença também pode ser referida como "profilaxia" ou "tratamento profilático”.
[000111] Como usado neste documento, o termo "substancialmente idêntico" (ou "substancialmente homólogo") é usado neste documento para se referir a uma primeira sequência de aminoácidos ou de ácidos nucleicos que contém um número suficiente de resíduos aminoácidos ou nucleotídeos idêntico ou equivalente (por exemplo, com uma cadeia lateral semelhante, por exemplo, substituições de aminoácidos conservados) a uma segunda sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos, tal que a primeira e segunda sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos tem (ou codificam proteínas tendo) atividades semelhantes, por exemplo, uma atividade de ligação, uma preferência de ligação ou uma atividade biológica. No caso de anticorpos, o segundo anticorpo tem a mesma especificidade e tem pelo menos 50%, pelo menos 25% ou pelo menos 10% da afinidade em relação ao mesmo antígeno.
[000112] Sequências semelhantes ou homólogas (por exemplo, pelo menos cerca de 85% de identidade sequencial) para as sequências divulgadas neste documento também fazem parte deste pedido. Em algumas modalidades, a identidade sequencial pode ser cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou acima.
[000113] Adicionalmente, identidade substancial existe quando os segmentos de ácido nucleico hibridizam sob condições de hibridação seletiva (por exemplo, condições de hibridização altamente rigorosas), para o complemento do filamento. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, em um lisato celular ou de forma parcialmente purificada ou substancialmente pura.
[000114] Sequências de motivo para biopolímeros podem incluir posições que podem ser aminoácidos variados. Por exemplo, o símbolo "X" neste contexto geralmente se refere a qualquer aminoácido (por exemplo, qualquer um dos vinte aminoácidos naturais) a menos que especificado de outra forma, por exemplo, para se referir a qualquer aminoácido não cisteína. Outros aminoácidos permitidos também podem ser indicados, por exemplo, usando parênteses e barras. Por exemplo, "(A/W/F/N/Q)" significa que alanina, triptofano, fenilalanina, asparagina e glutamina são permitidas nessa posição particular.
[000115] Significância estatística pode ser determinada por qualquer método conhecido da técnica. Testes estatísticos exemplares incluem: o teste T de estudo não paramétrico de Mann Whitney U e teste estatístico não paramétrico de Wilcoxon. Algumas relações estatisticamente significativas têm um valor de P inferior a 0,05 ou 0,02. Os termos "induzir", "inibir", "potencializar", "elevar", "aumentar", "diminuir" ou semelhante, por exemplo, que denotam diferenças distinguíveis qualitativas ou quantitativas entre dois estados, podem se referir a uma diferença, por exemplo, uma diferença estatisticamente significativa, entre os dois estados.
[000116] Como usado neste documento, uma "amostra", refere-se a uma composição que compreende o tecido, por exemplo, sangue, plasma ou proteína, de um sujeito. Uma amostra inclui uma amostra não processada inicial tomada de um sujeito, bem como subsequentemente processada, por exemplo, formas parcialmente purificada ou conservada. Amostras exemplares incluem sangue, plasma, lágrimas ou muco.
[000117] Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" modula preferencialmente um parâmetro mensurável, por exemplo, atividade de calicreína plasmática, por um grau estatisticamente significativo ou pelo menos cerca de 20%, mais preferencialmente por pelo menos cerca de 40%, ainda mais preferencialmente por pelo menos cerca de 60% e ainda mais preferencialmente por pelo menos cerca de 80% em relação a sujeitos não tratados. A capacidade de um composto de modular um parâmetro mensurável, por exemplo, um parâmetro associado a doença, pode ser avaliada em um sistema de modelo animal preditivo de eficácia em distúrbios e condições humanas. Alternativamente, essa propriedade de uma composição pode ser avaliada examinando-se a capacidade do composto de modular um parâmetro in vitro.
[000118] "Tratamento" de uma doença (ou condição) em um sujeito ou "tratamento" de um sujeito tendo uma doença refere-se à submissão do sujeito a um tratamento farmacêutico, por exemplo, a administração de uma droga, tal que pelo menos um sintoma da doença é curado, atenuado ou diminuído.
[000119] O termo "prevenção" de uma doença em um sujeito refere-se à submissão do sujeito a um tratamento farmacêutico, por exemplo, a administração de uma droga, tal que pelo menos um sintoma da doença seja prevenido, ou seja, administrada antes da manifestação clínica da condição indesejada (por exemplo, doença ou outro estado indesejado do animal hospedeiro) de modo que proteja o hospedeiro contra o desenvolvimento da condição indesejada. "Prevenção" de uma doença também pode ser referida como "profilaxia" ou "tratamento profilático."
[000120] Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em doses e por períodos de tempo necessário, para alcançar o resultado profilático desejado. Normalmente, porque uma dose profilática é usada em sujeitos antes ou em um estágio inicial da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.
[000121] Títulos, incluindo títulos em ordem alfabética ou numéricos, são apenas para facilitar a leitura e compreensão e, sem indicação expressa em contrário, não impor ordem temporal ou uma hierarquia de preferências.
Sistema de Contato de Biomarcadores
[000122] Calicreína plasmática circula como um zimógeno inativo chamado pré-calicreína que é ligada principalmente a seu substrato, cininogênio de alto peso molecular (HMWK). Em resposta a um estímulo, FXII é ativado para o FXIIa. FXIIa cliva pré-calicreína para formar calicreína plasmática ativa (Figura 1). Aproximadamente 75-90% de pré-calicreína em circulação é ligado ao HMWK através de uma interação de sítio não ativo com domínio 6 de HMWK. PKal ativo livre e limitado por HMWK gera HMWK clivado e bradicinina. Biomarcadores de ativação por calicreína plasmática são mostrados na Tabela 2. A adequação de um biomarcador pode ser demonstrada seguindo seus níveis na presença e na ausência de um ataque agudo de HAE. Níveis desses biomarcadores também poderiam ser alterados durante um ataque de edema mediado por bradicinina ou outras doenças mediadas pela atividade de pKal.
[000123] A tabela 2 abaixo provê marcadores que podem ser avaliados pelos métodos descritos na Tabela 2, e em outro lugar neste documento, para avaliar sujeitos para distúrbios mediados por pKal ou bradicinina. A Tabela 2 indica a direção na mudança do nível de marcador associado com distúrbios mediados por pKal ou bradicinina.
Ensaios para Biomarcadores
[000124] Níveis de biomarcadores (por exemplo, a quantidade) divulgados neste documento, ou mudanças nos níveis de biomarcadores divulgados neste documento, podem ser avaliados usando ensaios descritos neste documento e/ou ensaios conhecidos na técnica. Ensaios que podem ser usados para avaliar os níveis de biomarcadores incluem, por exemplo, os imunoensaios, por exemplo, Western blots, ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISAs) (por exemplo, ELISAs de tipo sanduíche), radioimunoensaios, ensaios de detecção à base de eletroquimioluminescência e técnicas relacionadas. Abordagens com base em espectrometria de massa também podem ser usadas. Ensaios que dependem de um substrato cromogênico também podem ser empregados.
[000125] Em algumas modalidades, um ensaio de detecção de eletroquimioluminescência ou um ensaio que depende de uma combinação de eletroquimioluminescência e tecnologia de matriz padronizada é usada (por exemplo, um ensaio de tecnologia ECL ou MULTI-MATRIZ de Descoberta de Meso Escala (MSD)).
i. Precalicreína
[000126] Níveis de precalicreína podem ser avaliados usando ensaios existentes para precalicreína, por exemplo, os imunoensaios, por exemplo, uma pré-calicreína ELISA. Por exemplo, um conjunto precalicreína ELISA é comercialmente disponível em antibodiesonline.com (catálogo n°.: ABIN858073). Anticorpos que se ligam a precalicreína são conhecidos na técnica, e podem ser usados, por exemplo, em imunoensaios, para a detecção de precalicreína. Por exemplo, anticorpos precalicreína anti-humano monoclonal murino têm sido produzidos. Ver, por exemplo, Veloso, D. et al. Blood, 1987, 70(4):1053-62. Um anticorpo de ovelha precalicreína anti-humano é comercialmente disponível em GenWay Biotech, Inc. (GenWay ID: GWB-58AC79).
[000127] Em uma modalidade, do nível de pKal em uma alíquota de amostra é determinado. Então, toda precalicreína em uma alíquota da amostra é convertido em pKal, e então é medido o nível de pKal. Subtrair o primeiro do segundo resulta na quantidade de precalicreína. Determinações de nível podem ser feitas pela atividade da enzima.
ii. Calicreína Plasmática Ativa
[000128] Calicreína plasmática ativa (pKal ativo) pode ser detectado, por exemplo, usando um imunoensaio. O imunoensaio pode usar um anticorpo que liga apenas calicreína plasmática ativa, como, por exemplo, DX-2930 ou DX-2922. Em uma modalidade, a invenção depende de um recipiente de pKal ativo para um reagente de captura, por exemplo, um inibidor da calicreína, por exemplo, um polipeptídio semelhante na sequência à DX-88, por exemplo, um que difere de DX-88 por não mais de 1, 2 ou 5 resíduos de aminoácidos, por exemplo, EPIKAL-2.
[000129] Em uma modalidade, o reagente de captura é provido em um substrato, em contato com a amostra, e a quantidade ligada ao reagente de captura é determinada, por exemplo, com um anticorpo anti- pKal. Em uma modalidade, o manuseio simples da amostra, por exemplo, ao transferir de um recipiente para outro, é minimizado a fim de reduzir os níveis de ativação de contato. Em modalidades, o reagente de captura é descartado no mesmo dispositivo, por exemplo, um recipiente de coleta, por exemplo, um tubo coleta de sangue, que é usado para coletar uma amostra, por exemplo, de sangue, do sujeito.
[000130] Ainda dentro da presente divulgação, está um ensaio de ativação ex vivo para determinar a atividade de pKal (por exemplo, um ensaio de atividade baseado em microplacas pKal), que pode incluir (i) fornecer uma amostra plasmática a partir de um sujeito; (ii) incubar a amostra plasmática com um ativador de sistema pKal na presença de um substrato de pKal, onde o substrato é anexado a um rótulo que é capaz de liberar um sinal detectável após ser clivado por pKal; e (iii) medir a atividade de pKal baseada na magnitude do sinal detectável. Em alguns exemplos, o ativador é Fator FXIIa. Em alguns exemplos, a amostra plasmática pode ser incubada com o ativador, o substrato de pKal e um candidato inibidor de pKal. O método pode adicionalmente compreender a avaliação da atividade da Tabela 2. Biomarcadores associados com KMA
[000131] O candidato inibidor de pKal, em que um nível reduzido de atividade de pKal na presença do candidato inibidor de pKal, quando relacionado ao nível da atividade de pKal na ausência do candidato inibidor de pKal, indica que o candidato inibidor é eficaz.
[000132] O método pode também incluir a avaliação de se o sujeito tem ou está em risco de uma doença associada com pKal; em que um nível elevado de atividade de pKal em comparação com um valor predeterminado (por exemplo, um nível de atividade de pKal em amostra de um sujeito saudável ou população de indivíduos saudáveis) indica que o sujeito tem ou está em risco de doença.
[000133] O método pode, também, compreender a avaliação da eficácia do tratamento, tal como um tratamento para uma doença associada com pKal. Várias bioamostras (por exemplo, amostras plasmáticas) podem ser obtidas de um paciente com uma doença relacionada a pKal, tais como HAE, e sendo tratados por um agente terapêutico como um inibidor de pKal antes e ao longo do tratamento, e/ou após o tratamento. Os níveis de atividade de pKal ou biomarcador indicativo de atividade de pKal nas bioamostras podem ser medidas usando qualquer um dos métodos de ensaio divulgados neste documento. Um nível reduzido de atividade de pKal ou um nível reduzido de biomarcadores de um ou mais indicativos de atividade de pKal quando comparado a antes do tratamento ou a um nível reduzido de atividade/biomarcador de pKal no decorrer do tratamento indica que o tratamento é eficaz.
iii. Complexo de α2M-pKal
[000134] A calicreína plasmática de complexo alfa 2 macroglobulina (complexo de α2M-pKal) pode ser detectada, por exemplo, usando um imunoensaio. Por exemplo, um ensaio ELISA de tipo sanduíche foi desenvolvido conforme descrito no exemplo 2. Uma ELISA quantitativa de tipo sanduíche também foi relatado em Kaufman, N. et al. Blood, 1991, 77(12): 2660-2667 e em Wachtfogel, Y.T. et al., 1989, Blood, 73:468-471. Um ensaio de enzima de imobilização imunológica foi relatado em Harpel, P.C. et al, J Biol Chem, 1985, 260(7):4257-63). Um ensaio de substrato cromogênico também pode ser usado, por exemplo, utilizando o substrato cromogênico S-2302 disponível em chromogenicsubstrates.com e o protocolo fornecido no chromogenicsubstrates.com/methods/chromogenic_substrates_methods_ka llikrein-like.htm.
iv. Complexo de C1INH-pKal
[000135] O complexo de C1INH-pKal pode ser detectado, por exemplo, usando os imunoensaios, por exemplo, métodos ELISA, por exemplo, métodos descritos no exemplo 3. Por exemplo, uma ELISA de tipo sanduíche em que um anticorpo anti-pKal (por exemplo, mouse mAb 13G11) é o anticorpo de captura, e um anticorpo contra C1INH é usado como o anticorpo do detector, ou uma ELISA de tipo sanduíche, na qual um anticorpo contra C1INH é usado como o anticorpo de captura e um anticorpo anti-pKal (por exemplo, mouse mAb 13G11) é o anticorpo de detector que pode ser usado. Anticorpos contra C1INH são conhecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo monoclonal de rato contra inibidor de C1 humano está disponível em ABBIOTEC (Catálogo n° 250122). Outro anticorpo monoclonal de rato contra inibidor C1 humano (4G12) está disponível em pierce-antibodies.com (Product # LF-MA0136). Anticorpo de cabra inibidor C1 anti-humano está disponível em Quidel (Catálogo n° A300). Outro ensaio ELISA de tipo sanduíche para detecção de complexos de C1INH-pKal foi usada em Wachtfogel, Y.T. et al., 1989, Blood, 73:468-471.
v. HMWK intacto
[000136] Cininogênio de alto peso molecular intacto (HMWK) pode ser analisado, por exemplo, usando-se métodos coagulantes ou imunológicos, por exemplo, radioimunoensaio (vide, por exemplo, Kerbiriou- Nabias, D.M., Br J Haematol, 1984, 56(2):2734-86). Um anticorpo monoclonal para a cadeia leve de HMWK humano é conhecido. Vide, por exemplo, Reddigari, S.R. & Kaplan, A.P., Blood, 1999, 74:695-702. Um ensaio para HMWK que depende de um substrato cromogênico também pode ser usado. Vide, por exemplo, Scott, C.F. et al. Thromb Res, 1987, 48(6):685-700; Gallimore, M.J. et al. Thromb Res, 2004, 114(2):91-96.
[000137] O gene humano codificando HMWK é cininogênio 1 (KNG1). KNG1 é transcrito e alternativamente emendado para formar mRNAs que codificam HMWK ou cininogênio de baixo peso molecular (LMWK). Uma sequência de proteína exemplar de HMWK é provida abaixo: >gi|156231037|ref|NP_001095886.1| cininogênio-1 isoforma 1 precursor [Homo sapiens] MKLITILFLCSRLLLSLTQESQSEEIDCNDKDLFKAVDAALKKYNSQN QSNNQFVLYRITEATKTVGSDTFYSFKYEIKEGDCPVQSGKTWQDCEYKD AAKAATGECTATVGKRSSTKFSVATQTCQITPAEGPVVTAQYDCLGCVHPI STQSPDLEPILRHGIQYFNNNTQHSSLFMLNEVKRAQRQVVAGLNFRITYS IVQTNCSKENFLFLTPDCKSLWNGDTGECTDNAYIDIQLRIASFSQNCDIYP GKDFVQPPTKICVGCPRDIPTNSPELEETLTHTITKLNAENNATFYFKIDNV KKARVQVVAGKKYFIDFVARETTCSKESNEELTESCETKKLGQSLDCNAE VYVVPWEKKIYPTVNCQPLGMISLMKRPPGFSPFRSSRIGEIKEETTVSPP HTSMAPAQDEERDSGKEQGHTRRHDWGHEKQRKHNLGHGHKHERDQG HGHQRGHGLGHGHEQQHGLGHGHKFKLDDDLEHQGGHVLDHGHKHKH GHGHGKHKNKGKKNGKHNGWKTEHLASSSEDSTTPSAQTQEKTEGPTPI PSLAKPGVTVTFSDFQDSDLIATMMPPISPAPIQSDDDWIPDIQIDPNGLSF NPISDFPDTTSPKCPGRPWKSVSEINPTTQMKESYYFDLTDGLS (SEQ ID No: 5)
vi. HMWK clivado
[000138] Cininogênio de alto peso molecular clivado (HMWK), também referido neste documento como "cininogênio clivado", pode ser avaliado, por exemplo, usando os métodos descritos nos Exemplos 1, por exemplo, Western blot. Os anticorpos que ligam HMWK clivado, tal como, por exemplo, o clone mouse mAb 11H05 pode ser utilizado. Adicionalmente, HMWK clivado pode ser avaliado utilizando espectrometria de massa. Técnicas de immunoblotting para avaliar os níveis de HMWK clivado são conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Buhler R. et al. Blood Coagul Fibrinolysis, 1995, 6(3):223-232.
[000139] Sequências exemplares das cadeias pesadas e leves de cininogênio clivado são providas abaixo. > 1 cadeia pesada de cininogênio clivado QESQSEEIDCNDKDLFKAVDAALKKYNSQNQSNNQFVLYRITEATK TVGSDTFYSFKYEIKEGDCPVQSGKTWQDCEYKDAAKAATGECTATVGK RSSTKFSVATQTCQITPAEGPVVTAQYDCLGCVHPISTQSPDLEPILRHGIQ YFNNNTQHSSLFMLNEVKRAQRQVVAGLNFRITYSIVQTNCSKENFLFLTP DCKSLWNGDTGECTDNAYIDIQLRIASFSQNCDIYPGKDFVQPPTKICVGC PRDIPTNSPELEETLTHTITKLNAENNATFYFKIDNVKKARVQVVAGKKYFID FVARETTCSKESNEELTESCETKKLGQSLDCNAEVYVVPWEKKIYPTVNC QPLGMISLMK (SEQ ID No: 6) > 1 cadeia leve de cininogênio clivado SSRIGEIKEETTVSPPHTSMAPAQDEERDSGKEQGHTRRHDWGHE KQRKHNLGHGHKHERDQGHGHQRGHGLGHGHEQQHGLGHGHKFKLDD DLEHQGGHVLDHGHKHKHGHGHGKHKNKGKKNGKHNGWKTEHLASSS EDSTTPSAQTQEKTEGPTPIPSLAKPGVTVTFSDFQDSDLIATMMPPISPA PIQSDDDWIPDIQIDPNGLSFNPISDFPDTTSPKCPGRPWKSVSEINPTTQ MKESYYFDLTDGLS (SEQ ID No: 7)
[000140] Em algumas modalidades, a divulgação presente provê um método de ativação ex vivo. Tal método pode compreender: (i) incubar uma amostra plasmática obtida de um sujeito com um ativador do sistema de calicreína plasmática (pKal) (por exemplo, Fator FXIIa); (ii) medir os níveis de cininogênio intacto de alto peso molecular (HMWK), o HMWK clivado, ou ambos, na amostra plasmática antes e após a incubação; e (iii) determinar a redução de HMWK intacta na amostra após a ativação. Em algumas modalidades, medem-se os níveis de HMWK intacto e HMWK clivado por uma análise Western blot, por exemplo, uma análise Western blot Simple Western™ Protein Simple®. Ensaios Simple Western™ são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Rustandi et al. Electrophoresis. 2012 Sep;33(17):2790-7). Produtos Simple Western™ também estão disponíveis comercialmente (ver, por exemplo, ProteinSimple®, Santa Clara, CA).
[000141] O método de ativação ex vivo, conforme descrito neste documento, pode ser usado para avaliar a atividade de um candidato inibidor de pKal na inibição da ativação do plasma. Mais especificamente, a amostra plasmática pode ser incubada com o ativador na presença do candidato inibidor de pKal. Se o nível de ativação é reduzido no presente do candidato inibidor, ele indica que o candidato é eficaz na inibição da ativação plasmática.
[000142] Em outras modalidades, a divulgação presente provê métodos para medir HMWK clivado endógeno. Tal método pode incluir (i) prover uma amostra plasmática a partir de um sujeito; e (ii) medir o nível de HMWK clivado da amostra plasmática. Em alguns exemplos, o nível de HMWK clivado é medido pela análise Protein Simple Western blot.
[000143] O ensaio HMWK clivado endógeno pode ser aplicado para identificar sujeitos tendo ou suspeitos de terem uma doença associada com o sistema de pKal, por exemplo, aqueles descritos neste documento. Em alguns exemplos, a amostra plasmática é obtida a partir de um sujeito tendo, ou em risco de desenvolver, uma doença autoimune associada ao sistema de pKal. Se o HMWK clivado endógeno no sujeito for elevado se comparado àquele de um sujeito saudável, indica que o sujeito tem ou é suspeito de ter a doença.
[000144] Alternativamente, ou de modo adicional, o ensaio HMWK clivado endógeno pode ser usado para avaliar a eficácia de um tratamento para uma doença associada com o sistema de pKal. Nesse caso, a amostra plasmática é obtida a partir de um sujeito que tenha a doença e seja tratado por um inibidor de pKal. Se um nível reduzido de HMWK clivado é observado após o tratamento em comparação à antes do tratamento, ele indica que o inibidor de pKal é eficaz.
[000145] Como uma alternativa, ou de modo adicional, o ensaio pode também ser usado avaliar se o sujeito tem ou está em risco de ter uma doença associada com pKal; em que um nível elevado de HMWK clivado em comparação com um valor predeterminado (por exemplo, um nível de HMWK clivado em amostra de um sujeito saudável ou população de sujeitos saudáveis) indica que o sujeito tem ou está em risco de doença.
[000146] O método pode, também, compreender a avaliação da eficácia do tratamento, tal como um tratamento para uma doença associada com pKal. Várias bioamostras (por exemplo, amostras plasmáticas) podem ser obtidas de um paciente com uma doença relacionada a pKal, tais como HAE, e sendo tratados por um agente terapêutico como um inibidor de pKal antes e ao longo do tratamento, e/ou após o tratamento. Os níveis de HMWK intacto e/ou HMWK clivado nessas bioamostras podem ser medidos usando qualquer um dos métodos de ensaio divulgados neste documento. Um nível reduzido de HMWK clivado, quando comparado àquele de antes do tratamento, ou um reduzido nível de HMWK clivado ao longo do tratamento, indica que o tratamento é eficaz.
Anticorpos
[000147] Anticorpos e fragmentos ligados por antígeno podem ser usados nos métodos providos. Em algumas modalidades, um agente de captura é ou compreende um anticorpo ou fragmento ligado por antígeno. Em algumas modalidades, um agente de detecção é ou compreende um anticorpo ou fragmento ligado por antígeno. Em algumas modalidades, uma composição terapêutica para o tratamento de um distúrbio mediado por pKal ou mediado por bradicinina é ou é compreende um anticorpo ou um fragmento ligado por antígeno.
[000148] Como usado neste documento, o termo "anticorpo" refere-se a uma proteína que inclui pelo menos um domínio variável de imunoglobulina ou sequência de domínio variável de imunoglobulina. Por exemplo, um anticorpo pode incluir uma região variável de cadeia pesada (H) (abreviada neste documento como VH) e uma região variável de cadeia leve (L) (abreviada neste documento como VL). Em outro exemplo, um anticorpo inclui duas regiões variáveis de cadeia pesada (H) e duas regiões variáveis de cadeia leve (L). O termo "anticorpo" engloba fragmentos de ligação de antígeno de anticorpos (por exemplo, anticorpos de cadeia única, fragmentos de Fab e sFab, fragmentos de F(ab')2, fragmentos de Fd, fragmentos de Fv, scFv e fragmentos de anticorpos de domínio (dAb) (de Wildt et al. Eur J Immunol. 1996; 26(3):629-39.))), bem como anticorpos completos. Um anticorpo pode ter os recursos estruturais de IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (bem como respectivos subtipos). Os anticorpos podem ser de qualquer fonte, mas primata (primatas humanos e não humanos) e primatizada são preferenciais.
[000149] As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas "regiões determinantes de complementariedade" ("CDR"), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas "regiões framework" ("FR"). A extensão da região framework e CDRs foi precisamente definida (vide Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publicação N° 91-3242 e Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, vide também www.hgmp.mrc.ac.uk). Definições de Kabat são usadas neste documento. Cada VH e VL é tipicamente composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas desde o terminal amino até o terminal carboxilo, na seguinte ordem: FR1 CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
[000150] A cadeia VH ou VL do anticorpo pode incluir, adicionalmente, toda ou parte de uma região constante de cadeia leve ou pesada, para, desse modo, formar uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina, respectivamente. Em uma modalidade, o anticorpo é um tetrâmero de duas cadeias pesadas de imunoglobulina e duas cadeias leves de imunoglobulina, em que as cadeias pesadas e leves de imunoglobulina são interligadas por, por exemplo, ligações de dissulfeto. Em IgGs, a região constante da cadeia pesada inclui três domínios de imunoglobulina, CH1, CH2 e CH3. A região constante de cadeia leve inclui um domínio de CL. A região variável das cadeias pesadas e leves contém um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos normalmente mediam a ligação do anticorpo a tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo diversas células do sistema imunológico (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico. As cadeias leves da imunoglobulina podem ser de tipos kappa ou lambda. Em uma modalidade, o anticorpo é glicosilado. Um anticorpo pode ser funcional para citotoxicidade dependente de anticorpo e/ou citotoxicidade mediada por complemento.
[000151] Uma ou mais regiões de um anticorpo pode ser humana ou efetivamente humana. Por exemplo, uma ou mais das regiões variáveis pode ser humana ou efetivamente humana. Por exemplo, uma ou mais das CDRs pode ser humana, por exemplo, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2 e LC CDR3. Cada uma das CDRs de cadeia leve pode ser humana. HC CDR3 pode ser humana. Uma ou mais das regiões framework pode ser humana, por exemplo, FR1, FR2, FR3 e FR4 da HC ou LC. Por exemplo, a região de Fc pode ser humana. Em uma modalidade, todas as regiões framework são humanas, por exemplo, têm uma sequência de um quadro de um anticorpo produzido por uma célula somática humana, por exemplo, uma célula hematopoiética que produz imunoglobulinas ou uma célula não hematopoiética. Em uma modalidade, as sequências humanas são sequências germinais, por exemplo, codificadas por um ácido nucleico germinal. Em uma modalidade, os resíduos de quadro (FR) de um Fab selecionado podem ser convertidos para o tipo de aminoácido do resíduo correspondente no gene germinal primata mais similar, especialmente o gene germinal humano. Uma ou mais das regiões constantes pode ser humana ou efetivamente humana. Por exemplo, pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 98 ou 100% de um domínio variável de imunoglobulina, a região constante, os domínios constantes (CH1, CH2, CH3, CL1) ou o anticorpo inteiro podem ser humanos ou efetivamente humanos.
[000152] Todo ou parte de um anticorpo pode ser codificado por um gene de imunoglobulina ou um respectivo segmento. Genes de imunoglobulina humana exemplar incluem os genes de região constante kappa, lambda, alfa (IgA1 e IgA2), gama (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta, épsilon e mu, bem como os muitos genes de região variável de imunoglobulina. "Cadeias leves" de imunoglobulina de comprimento total (cerca de 25 KDa ou cerca de 214 aminoácidos) são codificadas por um gene de região variável no terminal NH2 (cerca de 110 aminoácidos) e um gene de região constante kappa ou lambda no terminal COOH. "Cadeias pesadas" de Imunoglobulina de comprimento total (cerca de 50 KDa ou 446 aminoácidos), são codificados de forma semelhante por um gene de região variável (cerca de 116 aminoácidos) e um dos outros genes de região constante mencionados acima, por exemplo, gama (codificação de cerca de 330 aminoácidos). O comprimento da HC humana varia consideravelmente, porque HC CDR3 varia desde cerca de 3 resíduos de aminoácido a mais de 35 resíduos de aminoácido.
[000153] O termo "fragmento de ligação de antígeno" de um anticorpo de comprimento total refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo de comprimento total que mantêm a capacidade de se ligar especificamente a um alvo de interesse. Exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo "fragmento de ligação de antígeno" de um anticorpo de comprimento total incluem (i) um fragmento de Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios de VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento de F(ab')2, um fragmento bivalente incluindo dois fragmentos de Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento de Fd consistindo nos domínios de VH e CH1; (iv) um fragmento de Fv consistindo nos domínios de VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento de dAb (Ward et al, (1989) Nature 341:544- 546), o qual consiste em um domínio de VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada que retém a funcionalidade. Além disso, embora os dois domínios do fragmento de Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando-se métodos de recombinação, por um ligante sintético que lhes possibilita ser feitos como uma cadeia de proteína única em que as regiões VL e VH emparelham para formar moléculas monovalentes conhecidas como cadeia única de Fv (scFv). Vide, por exemplo, patentes US 5.260.203, 4.946.778 e 4.881.175; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883.
[000154] Fragmentos de anticorpos podem ser obtidos usando qualquer técnica apropriada incluindo técnicas convencionais conhecidas daqueles com habilidade na técnica. O termo "anticorpo monoespecífico" refere-se a um anticorpo que revela uma única especificidade e afinidade de ligação para um alvo específico, por exemplo, epítopo. Este termo inclui um "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal," que neste documento se refere a uma preparação de respectivos anticorpos ou fragmentos de composição molecular única, independentemente de como o anticorpo foi gerado.
[000155] Como usado neste documento, uma região variável de imunoglobulina "humanizada" se refere a uma região variável de imunoglobulina que é modificada para incluir um número suficiente de posições de aminoácidos de quadro humano, tal que a região variável da imunoglobulina não recebe uma resposta imunogênica em um humano normal. Descrições de imunoglobulinas "humanizadas" incluem, por exemplo, US 6.407.213 e US 5.693.762.
[000156] A constante de inibição (Ki) provê uma medida de potência do inibidor; é a concentração de inibidor necessária para reduzir a atividade da enzima pela metade e não é dependente das concentrações de enzima ou substrato. O Ki (Ki,app) aparente é obtido a concentrações diferentes de substrato, ao medir o efeito inibitório de diferentes concentrações do inibidor (por exemplo, a proteína de ligação inibitória) na extensão da reação (por exemplo, atividade enzimática); encaixar a mudança na pseudo-primeira constante de taxa de ordem em função da concentração de inibidor à equação de Morrison (Equação 1) produz uma estimativa do valor de Ki aparente. O Ki é obtido a partir do ponto de intersecção com o eixo y extraído de uma análise de regressão linear de um gráfico de Ki,app versus concentração de substrato.
Equação 1
[000157] Onde v=velocidade medida; v0=velocidade na ausência de inibidor; Ki,app=constante de inibição aparente; I=concentração de inibidor total; e E=concentração total da enzima.
Angioedema hereditário (HAE)
[000158] Em algumas modalidades, a doença ou condição que envolve atividade de calicreína plasmática é angioedema hereditário (HAE). Angioedema hereditário (HAE) também é conhecido como "Edema de Quincke," deficiência de inibidor de C1 esterase, deficiência de inibidor de C1 e edema angioneurótico hereditário (HANE). HAE é caracterizado por episódios recorrentes de inchaço grave (angioedema), o qual pode afetar, por exemplo, os membros, face, genitais, trato gastrointestinal e vias respiratórias. Sintomas de HAE incluem, por exemplo, inchaço nos braços, pernas, lábios, olhos, língua e/ou garganta; obstrução das vias aéreas que pode envolver inchaço de garganta e rouquidão súbita; episódios repetidos de cólicas abdominais sem causa aparente; e/ou inchaço dos intestinos, que pode ser grave e pode levar a cólicas abdominais, vômitos, desidratação, diarreia, dor e/ou choque. Cerca de um terço dos indivíduos com este HAE desenvolvem uma brotoeja que não coça chamada eritema marginatum durante um ataque.
[000159] Inchaço das vias aéreas pode ser fatal e provoca morte em alguns pacientes. Taxas de mortalidade são estimadas em 15 a 33%. HAE conduz a cerca de 15.000 a 30.000 visitas ao departamento de emergência por ano.
[000160] Trauma ou stress, por exemplo, procedimentos odontológicos, enfermidade (por exemplo, doenças virais tais como resfriados e gripe), menstruação e cirurgia podem desencadear um ataque de angioedema. Para prevenir ataques agudos de HAE, pacientes podem tentar evitar estímulos específicos que causaram ataques anteriormente. No entanto, em muitos casos, um ataque ocorre sem um gatilho conhecido. Tipicamente, os sintomas de HAE aparecem primeiro na infância e agravam-se durante a puberdade. Em média, indivíduos não tratados têm um ataque a cada 1 a 2 semanas, e a maioria dos episódios dura cerca de 3 a 4 dias (ghr.nlm.nih.gov/condition/hereditary-angioedema). A frequência e a duração dos ataques variam muito entre as pessoas com angioedema hereditário, mesmo entre pessoas da mesma família.
[000161] Há três tipos de HAE, conhecidos como tipos I, II e III. Estima-se que HAE afeta 1 em cada 50.000 pessoas, que tipo I é responsável por cerca de 85% dos casos, tipo II é responsável por cerca de 15% dos casos e tipo III é muito raro. Tipo III é a forma mais recentemente descrita e originalmente pensou-se ocorrer somente em mulheres, mas famílias com machos afetados foram identificadas.
[000162] HAE é herdado em um padrão autossômico dominante, tal que uma pessoa afetada pode herdar a mutação de um pai ou mãe afetado. Novas mutações no gene também podem ocorrer, e, assim, HAE também pode ocorrer em pessoas sem histórico do distúrbio em sua família. Estima-se que 20-25% dos casos resultam de uma nova mutação espontânea.
[000163] Mutações no gene SERPING1 provocam angioedema hereditário tipo I e tipo II. O gene SERPING1 provê instruções para fazer a proteína inibidora de C1, que é importante para controlar a inflamação. Inibidor de C1 bloqueia a atividade de certas proteínas que promovem a inflamação. Mutações que provocam angioedema hereditário tipo I levam a níveis reduzidos de inibidor de C1 no sangue. Em contraste, as mutações que provocam tipo II resultam na produção de um inibidor de C1 que funciona de forma anormal. Sem os níveis apropriados de inibidor de C1 funcional, quantidades excessivas de bradicinina são geradas. Bradicinina promove inflamação, ao aumentar o vazamento de fluido através das paredes dos vasos sanguíneos nos tecidos do corpo. Acúmulo excessivo de fluidos nos tecidos do corpo provoca os episódios de inchaço visto em indivíduos com angioedema hereditário tipo I e tipo II.
[000164] Mutações no gene F12 estão associados a alguns casos de angioedema hereditário tipo III. O gene F12 provê instruções para fazer o fator de coagulação XII. Além de assumir um papel crítico na coagulação do sangue (coagulação), o fator XII também é um importante estimulador da inflamação e está envolvido na produção de bradicinina. Certas mutações no gene F12 resultam na produção de fator XII com aumento da atividade. Como resultado, mais bradicinina é gerada e paredes dos vasos sanguíneos apresentam mais vazamento, o que leva a episódios de inchaço. A causa de outros casos de angioedema hereditário tipo III permanece desconhecida. Mutações em um ou mais genes ainda não identificados podem ser responsáveis pelo distúrbio nestes casos.
[000165] HAE pode apresentar de forma semelhante a outras formas de angioedema resultantes de alergias ou outras condições médicas, mas difere significativamente em causa e tratamento. Quando o angioedema hereditário é diagnosticado erroneamente como uma alergia, é mais comumente tratado com anti-histamínicos, esteroides e/ou epinefrina, que são normalmente ineficazes no HAE, embora a epinefrina possa ser usada para reações fatais. Diagnósticos errados resultaram também na cirurgia exploratória desnecessária para pacientes com inchaço abdominal, e em alguns pacientes de HAE, dor abdominal foi incorretamente diagnosticada como psicossomática.
[000166] Terapias de inibidor de C1, bem como outras terapias para HAE, são descritas em Kaplan, A.P., J Allergy Clin Immunol, 2010, 126(5):918-925.
[000167] Tratamento agudo de ataques de HAE é provido para deter a progressão do edema tão rapidamente quanto possível. Concentrado de inibidor de C1 do doador de sangue, o qual é administrado por via intravenosa, é um tratamento agudo; no entanto, este tratamento não está disponível em muitos países. Em situações de emergência, onde o concentrado de inibidor de C1 não estiver disponível, plasma congelado fresco (FFP) pode ser usado como uma alternativa, uma vez que também contém inibidor de C1.
[000168] Inibidor de C1 purificado, derivado de sangue humano, tem sido usado na Europa desde 1979. Vários tratamentos de inibidor de C1 estão disponíveis nos EUA e dois produtos de inibidor de C1 estão agora disponíveis no Canadá. Berinert P (CSL Behring), que é pasteurizado, foi aprovado pela FDA em 2009 para ataques agudos. Cinryze (ViroPharma), que é nanofiltrado, foi aprovado pela FDA em 2008 para profilaxia. Rhucin (Pharming) é um recombinante de inibidor de C1 em desenvolvimento que não carrega o risco de transmissão de doenças infecciosas devido a patógenos transmitidos pelo sangue humano.
[000169] Tratamento de um ataque agudo de HAE também pode incluir medicamentos para alívio da dor e/ou fluido IV.
[000170] Outras modalidades de tratamento podem estimular a síntese do inibidor de C1, ou reduzir o consumo de inibidor de C1. Medicamentos andrógenos, tais como danazol, podem reduzir a frequência e gravidade de ataques ao estimular a produção de inibidor de C1.
[000171] Helicobacter pylori pode desencadear ataques abdominais. Antibióticos para tratar H. Pylori diminuirão ataques abdominais.
[000172] Tratamentos mais recentes atacam a cascata em contato. Ecallantide (KALBITOR®, DX-88, Dyax) inibe a calicreína plasmática e foi aprovado nos Estados Unidos. Icatibanto (FIRAZYR®, Shire) inibe o receptor B2 de bradicinina e foi aprovado na Europa e nos Estados Unidos.
[000173] Diagnóstico de HAE pode depender, por exemplo, de histórico familiar e/ou exames de sangue. Resultados laboratoriais associados a HAE tipos I, II e III são descritos, por exemplo, em Kaplan, A.P., J Allergy Clin Immunol, 2010, 126(5):918-925. Em HAE tipo I, o nível de inibidor de C1 é diminuído, como é o nível de C4, enquanto o nível de C1q é normal. No HAE tipo II, o nível de inibidor de C1 é normal ou aumentado; no entanto, a função de inibidor de C1 é anormal. Nível de C4 é diminuído e nível de C1q é normal. No tipo III, os níveis do inibidor C1, C4 e C1q podem ser normais.
[000174] Sintomas de HAE podem ser avaliados, por exemplo, utilizando questionários, por exemplo, questionários que são concluídos por pacientes, médicos ou membros da família. Esses questionários são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, escalas analógicas visuais. Vide, por exemplo, McMillan, C.V. et al. Patient. 2012;5(2):113-26.
Outros distúrbios mediados por pKal ou mediados por bradicinina
[000175] Outras doenças ou condições exemplares associadas à atividade de calicreína plasmática incluem angioedema idiopático não dependente de histamina, artrite reumatóide, doença de Crohn, lúpus, doença de Alzheimer, choque séptico, lesão por queimadura, lesão de isquemia/reperfusão cerebral, edema cerebral, retinopatia diabética, nefropatia diabética, edema macular, vasculite, trombose arterial ou venosa, trombose associada com dispositivos de assistência ventricular ou stents, trombocitopenia induzida por heparina com trombose, doença tromboembólica e doença coronariana com angina de peito instável , edema, doença ocular, gota, doença intestinal, mucosite oral, dor neuropática, dor inflamatória, doença vertebral degenerativa-estenose da coluna vertebral, pós operatório íleo, aneurisma da aorta, osteoartrite, angioedema hereditário, embolia pulmonar, acidente vascular cerebral, edema cabeça trauma ou peri-tumor de cérebro, sepse, evento isquêmico de artéria cerebral média aguda (MCA) (AVC), reestenose (por exemplo, após a angioplastia), nefrite de lúpus eritematoso sistêmico, uma doença auto-imune, doença inflamatória, uma doença cardiovascular, uma doença neurológica, uma doença associada com enrolamento de proteínas, uma doença associada com a angiogênese, a nefropatia hipertensiva e a nefropatia diabética, alergia e doenças respiratórias (por exemplo, anafilaxia, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, síndrome respiratória aguda, fibrose cística, persistente, rinite) e lesões de tecidos (por exemplo, lesão por queimadura ou química).
Tratamento
[000176] Um sujeito em risco de ou sofrendo de um distúrbio mediado por pKal ou mediado por bradicinina, conforme identificado por um método de ensaio tal qual os descritos neste documento, pode ser tratado com qualquer agente terapêutico apropriado. Em algumas modalidades, métodos providos incluem a seleção de um tratamento para um sujeito baseado na emissão de um ensaio provido, por exemplo, detecção de biomarcador.
[000177] Em algumas modalidades, o método compreende um ou ambas a seleção ou administração de um agente terapêutico, por exemplo, um agente de ligação de calicreína, como descrito neste documento, por exemplo, um antagonista do receptor B2 de bradicinina como descrito neste documento, por exemplo, um agente de substituição de C1-INH como descrito neste documento, para a administração ao sujeito com base na emissão do ensaio, por exemplo, detecção de biomarcador.
[000178] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação ou polipeptídio de calicreína plasmática é administrado a um sujeito. Em algumas modalidades, o agente de ligação de calicreína é um inibidor da calicreína, por exemplo, peptídeo, um inibidor de pequena molécula, um anticorpo de calicreína ou um respectivo fragmento. Em algumas modalidades, um antagonista de receptor B2 da bradicinina é administrado a um sujeito. Em algumas modalidades, um agente terapêutico de substituição de C1-INH é administrado a um sujeito.
[000179] O agente terapêutico, por exemplo, o inibidor da calicreína, por exemplo, o antagonista do receptor B2 de bradicinina, por exemplo, agente de substituição de C1-INH, pode ser administrado junto com outra terapia como parte de uma terapia de combinação para o tratamento da doença ou condição que envolve atividade de calicreína plasmática e/ou bradicinina. Terapia de combinação, por exemplo, com um ou mais de um inibidor da calicreína, antagonista do receptor B2 de bradicinina ou agente de substituição de C1-INH, por exemplo, com um ou mais de um inibidor da calicreína, antagonista do receptor B2 de bradicinina ou agente de substituição de C1-INH e outra terapia, podem ser providos em múltiplas configurações diferentes. O primeiro agente pode ser administrado antes ou após a administração da outra terapia. Em algumas situações, o primeiro agente e outra terapia (por exemplo, um agente terapêutico) são administrados simultaneamente, ou em estreita proximidade temporal (por exemplo, um curto intervalo de tempo entre as injeções, tal como durante a mesma sessão de tratamento). O primeiro agente e a outra terapia também podem ser administrados em intervalos temporais maiores.
Agentes de ligação de calicreína plasmática
[000180] Agentes de ligação de calicreína plasmática (por exemplo, proteínas de ligação, por exemplo, polipeptídeos, por exemplo, polipeptídeos inibitórios, por exemplo, anticorpos, por exemplo, anticorpos inibitórios ou outros agentes de ligação, por exemplo, pequenas moléculas) são agentes terapêuticos úteis para uma variedade de doenças e condições, por exemplo, doenças e condições que envolvem a atividade de calicreína plasmática. Por exemplo, em algumas modalidades, a doença ou condição que envolve atividade de calicreína plasmática é angioedema hereditário (HAE). Em algumas modalidades, uma proteína ou polipeptídio de ligação de calicreína plasmática é administrada a um sujeito em risco de ou sofrendo de um distúrbio mediado por pKal ou mediado por bradicinina.
[000181] Um número de inibidores de proteína calicreína úteis, tecido e/ou calicreína plasmática, incluem um domínio Kunitz. Como usado neste documento, um "domínio Kunitz" é um domínio de polipeptídio tendo pelo menos 51 aminoácidos e contendo pelo menos dois e preferencialmente três, dissulfetos. O domínio é dobrado tal que a primeira e sexta cisteínas, a segunda e quarta, e a terceira e quinta cisteínas formam ligações de bissulfeto (por exemplo, em um domínio de Kunitz tendo 58 aminoácidos, cisteínas podem estar presentes nas posições correspondentes aos aminoácidos 5, 14, 30, 38, 51 e 55, de acordo com o número das sequências homólogas de BPTI providas abaixo e dissulfetos podem se formar entre as cisteínas na posição 5 e 55, 14 e 38 e 30 e 51), ou, se dois dissulfetos estão presentes, eles podem se formar entre um subconjunto correspondente de cisteínas respectivas. O espaçamento entre cisteínas respectivas pode ser dentro de 7, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0 aminoácidos do seguinte afastamento entre as posições correspondentes a: 5 a 55, 14 a 38 e 30 a 51, de acordo com a numeração da sequência de BPTI provida abaixo. A sequência de BPTI pode ser usada como uma referência para se referir a posições específicas em qualquer domínio Kunitz genérico. Comparação de um domínio Kunitz de interesse para BPTI pode ser realizada, identificando o melhor alinhamento de ajuste no qual o número de cisteínas alinhadas é maximizado.
[000182] A estrutura 3D (em alta resolução) do domínio Kunitz de BPTI é conhecida. Uma das estruturas de raio X é depositada no Banco de Dados de Proteínas de Brookhaven como "6PTI". A estrutura 3D de alguns homólogos de BPTI (Eigenbrot et al., (1990) Protein Engineering, 3(7):591- 598; Hynes et al., (1990) Biochemistry, 29:10018-10022) são conhecidas. Pelo menos oitenta e uma sequências de domínio Kunitz são conhecidas. Homólogos humanos conhecidos incluem três domínios Kunitz de LACI, também conhecido como inibidor do caminho do fator de tecido (TFPI) (Wun et al., (1988) J. Biol. Chem. 263(13):6001-6004; Girard et al., (1989) Nature, 338:518-20; Novotny et al, (1989) J. Biol. Chem., 264(31):18832- 18837) dois domínios Kunitz de Inibidor de Inter-D-Tripsina, APP-I (Kido et al., (1988) J. Biol. Chem., 263(34):18104-18107), um domínio Kunitz a partir de colágeno, três domínios Kunitz de TFPI-2 (Sprecher et al., (1994) PNAS USA, 91:3353-3357), os domínios Kunitz do inibidor do ativador do fator de crescimento de hepatócito tipo 1, os domínios Kunitz do inibidor do ativador do fator de crescimento de hepatócito tipo 2, os domínios Kunitz descritos em Publicação de Patente US No: 2004-0152633. LACI é um fosfoglicoproteína de soro humano com um peso molecular de 39 kDa (sequência de aminoácidos na Tabela 1) contendo três domínios Kunitz. Tabela 1: Domínios Kunitz Naturais Exemplares
[000183] Os domínios Kunitz acima são referidos como LACI-K1 (resíduos 50 a 107), LACI-K2 (resíduos 121 a 178) e LACI-K3 (213 a 270). A sequência de cDNA de LACI é relatada em Wun et al. (J. Biol. Chem., 1988, 263(13):6001-6004). Girard et al. (Nature, 1989, 338:518-20) relata estudos mutacionais em que os resíduos de P1 de cada um dos três domínios Kunitz foram alterados. LACI-K1 inibe o fator VIIa (F.VIIa) quando F.VIIa é complexado a fator de tecido e LACI-K2 inibe o fator Xa.
[000184] Proteínas contendo domínios Kunitz exemplares incluem o seguinte, com Números de Acesso SWISS-PROT entre parênteses: A4_HUMAN (P05067), A4_MACFA (P53601), A4_MACMU (P29216), A4_MOUSE (P12023), A4_RAT (P08592), A4_SAISC (Q95241), AMBP_PLEPL (P36992), APP2_HUMAN (Q06481), APP2_RAT (P15943), AXP1_ANTAF (P81547), AXP2_ANTAF (P81548), BPT1_BOVIN (P00974), BPT2_BOVIN (P04815), CA17_HUMAN (Q02388), CA36_CHICK (P15989), CA36_HUMAN (P12111), CRPT_BOOMI (P81162), ELAC_MACEU (O62845), ELAC_TRIVU (Q29143), EPPI_HUMAN (O95925), EPPI_MOUSE (Q9DA01), HTIB_MANSE (P26227), IBP_CARCR (P00993), IBPC_BOVIN (P00976), IBPI_TACTR (P16044), IBPS_BOVIN (P00975), ICS3_BOMMO (P07481), IMAP_DROFU (P11424), IP52_ANESU (P10280), ISC1_BOMMO (P10831), ISC2_BOMMO (P10832), ISH1_STOHE (P31713), ISH2_STOHE (P81129), ISIK_HELPO (P00994), ISP2_GALME (P81906), IVB1_BUNFA (P25660), IVB1_BUNMU (P00987), IVB1_VIPAA (P00991), IVB2_BUNMU (P00989), IVB2_DABRU (P00990), IVB2_HEMHA (P00985), IVB2_NAJNI (P00986), IVB3_VIPAA (P00992), IVBB_DENPO (P00983), IVBC_NAJNA (P19859), IVBC_OPHHA (P82966), IVBE_DENPO (P00984), IVBI_DENAN (P00980), IVBI_DENPO (P00979), IVBK_DENAN (P00982), IVBK_DENPO (P00981), IVBT_ERIMA (P24541), IVBT_NAJNA (P20229), MCPI_MELCP (P82968), SBPI_SARBU (P26228), SPT3_HUMAN (P49223), TKD1_BOVIN (Q28201), TKD1_SHEEP (Q29428), TXCA_DENAN (P81658), UPTI_PIG (Q29100), AMBP_BOVIN (P00978), AMBP_HUMAN (P02760), AMBP_MERUN (Q62577), AMBP_MESAU (Q60559), AMBP_MOUSE (Q07456), AMBP_PIG (P04366), AMBP_RAT (Q64240), IATR_HORSE (P04365), IATR_SHEEP (P13371), SPT1_HUMAN (O43278), SPT1_MOUSE (Q9R097), SPT2_HUMAN (O43291), SPT2_MOUSE (Q9WU03), TFP2_HUMAN (P48307), TFP2_MOUSE (O35536), TFPI_HUMAN (P10646), TFPI_MACMU (Q28864), TFPI_MOUSE (O54819), TFPI_RABIT (P19761), TFPI_RAT (Q02445), YN81_CAEEL (Q03610)
[000185] Uma variedade de métodos pode ser usada para identificar um domínio Kunitz de um banco de dados de sequência. Por exemplo, uma sequência de aminoácidos conhecida de um domínio Kunitz, uma sequência de consenso ou um motivo (por exemplo, o motivo ProSite) podem ser pesquisados contra os bancos de dados de sequência de GenBank (National Center for Biotechnology Information, National Institutes of Health, Bethesda MD), por exemplo, usando BLAST; contra o banco de dados de Pfam de HMMs (modelos ocultos de Markov) (por exemplo, usando os parâmetros padrão para a busca de Pfam; contra o banco de dados SMART; ou contra o banco de dados ProDom. Por exemplo, o Número de Acesso de Pfam PF00014 de Lançamento de Pfam 9 provê inúmeros domínios Kunitz e um HMM para identificar domínios Kunitz. Uma descrição do banco de dados de Pfam pode ser encontrada em Sonhammer et al. (1997) Proteínas 28(3):405-420 e uma descrição detalhada de HMMs podem ser encontradas, por exemplo, em Gribskov et al. (1990) Meth. Enzymol. 183:146-159; Gribskov et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4355-4358; Krogh et al. (1994) J. Mol. Biol. 235:15011531; e Stultz et al. (1993) Protein Sci. 2:305-314. O banco de dados SMART (Ferramenta de Pesquisa de Arquitetura Modular Simples, EMBL, Heidelberg, DE) de HMMs como descrito em Schultz et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857 e Schultz et al. (2000) Nucl. Acids Res 28:231. O banco de dados SMART contém domínios identificados por perfis com os modelos ocultos de Markov do programa de pesquisa de HMMer2 (R. Durbin et al. (1998) Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press). O banco de dados também é anotado e monitorado. O banco de dados do domínio da proteína de ProDom consiste em uma compilação automática de domínios homólogos (Corpet et al. (1999), Nucl. Acids Res. 27:263-267). As versões atuais de ProDom são construídas usando pesquisas PSI-BLAST recursivas (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Gouzy et al. (1999) Computers and Chemistry 23:333-340.) dos bancos de dados de proteína SWISS-PROT 38 e TREMBL. O banco de dados gera automaticamente uma sequência de consenso para cada domínio. Prosite lista o domínio Kunitz como um motivo e identifica proteínas que incluem um domínio Kunitz. Vide, por exemplo, Falquet et al. Nucleic Acids Res. 30:235-238(2002).
[000186] Domínios Kunitz interagem com protease alvo utilizando, principalmente, aminoácidos nas duas regiões de loop ("loops de ligação"). A primeira região de loop é entre sobre resíduos correspondentes aos aminoácidos 13-20 de BPTI. A segunda região de loop é entre sobre resíduos correspondentes aos aminoácidos 31-39 de BPTI. Uma biblioteca exemplar de domínios Kunitz varia de uma ou mais posições de aminoácidos na primeira e/ou segunda regiões de loop. Posições particularmente úteis para variar, ao fazer a triagem de domínios Kunitz que interagem com calicreína ou ao selecionar melhores variantes de afinidade, incluem: posições 13, 15, 16, 17, 18, 19, 31, 32, 34 e 39 no que diz respeito à sequência de BPTI. Pelo menos algumas destas posições deverão estar em contato estreito com a protease alvo. Também é útil variar outras posições, por exemplo, posições que são adjacentes às posições mencionadas acima na estrutura tridimensional.
[000187] A "região framework" de um domínio Kunitz é definida como aqueles resíduos que fazem parte do domínio Kunitz, mas especificamente excluindo os resíduos na primeira e segunda regiões de loops de ligação, ou seja, sobre resíduos correspondentes a aminoácidos 13-20 de BPTI e 31-39 de BPTI. Por outro lado, resíduos que não estão no loop de ligação podem tolerar um intervalo maior de substituição de aminoácidos (por exemplo, substituições conservadoras e/ou não conservadoras).
[000188] Em uma modalidade, estes domínios Kunitz são formas variantes da estrutura em loop incluindo domínio Kunitz 1 de proteínas inibidoras de coagulação associada a lipoproteína humana (LACI). LACI contém três estruturas em loop internas e bem definidas de peptídeo, que são domínios Kunitz de paradigma (Girard, T. et al., 1989. Nature, 338:518520). Variantes de domínio Kunitz 1 de LACI descritas neste documento foram triadas, isoladas e ligadas a calicreína com maior afinidade e especificidade (vide, por exemplo, Pat. US Nos. 5.795.865 e 6.057.287). Esses métodos também podem ser aplicados a outros frameworks de domínio Kunitz para obter outros domínios Kunitz que interagem com calicreína, por exemplo, calicreína plasmática. Moduladores úteis da função de calicreína normalmente ligam e/ou inibem calicreína, como determinado usando-se ensaios de ligação e inibição de calicreína.
[000189] Em alguns aspectos, um agente de ligação de calicreína (por exemplo, proteína de ligação, por exemplo, polipeptídio, por exemplo, polipeptídeos inibitórios, por exemplo, anticorpo, por exemplo, anticorpo inibitório ou outro agente de ligação, por exemplo, pequena molécula) se liga à forma ativa da calicreína plasmática. Em algumas modalidades, o agente de ligação da calicreína, liga e inibe a calicreína plasmática, por exemplo, calicreína plasmática humano e/ou calicreína murino.
[000190] Proteínas de ligação de calicreína plasmática podem ser de comprimento total (por exemplo, um IgG (por exemplo, um IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (por exemplo, IgA1, IgA2), IgD e IgE) ou pode incluir apenas um fragmento de ligação do antígeno (por exemplo, um fragmento de Fab, F(ab‘)2 ou de scFv). A proteína de ligação pode incluir duas imunoglobulinas de cadeia pesada e duas imunoglobulinas de cadeia leve, ou pode ser um anticorpo de cadeia única. Proteínas de ligação de calicreína plasmática podem ser proteínas recombinantes tais como anticorpos humanizados, enxertados por CDR, quiméricos, desimunizados, ou geradosin vitroe podem, opcionalmente, incluir regiões constantes derivadas de sequências de imunoglobulina germinais humanas. Em uma modalidade, a proteína de ligação de calicreína plasmática é um anticorpo monoclonal.
[000191] Em algumas modalidades, o agente de ligação da calicreína plasmática se liga a e inibe a calicreína plasmática, por exemplo, calicreína plasmática humano e/ou calicreína murino. Proteínas de ligação de calicreína plasmática exemplares são divulgadas na Publicação US No. 20120201756, todo o conteúdo do qual é incorporado neste documento por referência. Em algumas modalidades, a proteína de ligação de calicreína é um anticorpo (por exemplo, um anticorpo humano), tendo as cadeias leves e/ou pesadas de anticorpos selecionados a partir do grupo consistindo em M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (também referido neste documento como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115- A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (também referido neste documento como DX-2930), X115-G04 , M29-D09, M145-D11, M06-D09 e M35-G04. Em algumas modalidades, a proteína de ligação de calicreína plasmática concorre com ou se liga ao mesmo epítopo que M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (também referido neste documento como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115- F02, X124-G01 (também referido neste documento como DX-2930), X115- G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 e M35-G04. Em algumas modalidades, a proteína de ligação de calicreína plasmática é DX-2930. Ver U.S. 20110200611 e U.S. 20120201756, que são incorporados por referência neste documento.
[000192] Em alguns aspectos, um polipeptídio de ligação de calicreína (por exemplo, polipeptídio inibitório) que liga a forma ativa do calicreína plasmática. Agentes de calicreína plasmática do polipeptídio exemplares são divulgados na Patente US No. 5.795.865, Patente US No. 5.994.125, Patente US No. 6.057.287, Patente US No. 6.333.402, Patente US No. 7.628.983 e Patente US No. 8.283.321, Patente US No. 7.064.107, Patente US No. 7.276.480, Patente US No. 7.851.442, Patente US No. 8.124.586, Patente US No. 7.811.991 e Publicação US No. 20110086801, todo o conteúdo de cada uma das quais é incorporado neste documento por referência. Em algumas modalidades, o polipeptídio de ligação de calicreína é DX-88 (um inibidor da calicreína de ocorrência não natural, também conhecido como KALBITOR® (ecallantide), SEQ ID No.: 3). Em algumas modalidades, o inibidor de calicreína compreende ou consiste em uma sequência de cerca de 58 aminoácidos de 3 a 60 aminoácidos da SEQ ID N°:3 ou o polipeptídio de DX-88 tendo a sequência de 60 aminoácidos da SEQ ID N°:3.
[000193] Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe AsnIle Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu GluCys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO:3)
[000194] Em algumas modalidades, a proteína de ligação de calicreína plasmática é EPIKAL-2 (SEQ ID N°.: 4), a qual é inibidora de calicreína de ocorrência não natural tendo uma sequência de aminoácidos de 58 resíduos (correspondente a resíduos de 3 a 60 da SEQ ID N°.: 3), e tendo substituições de aminoácidos de Ile para Ser no resíduo 34 e Glu para Gly no resíduo 39. A sequência de EPIKAL-2 é mostrada abaixo:
[000195] EpiKal2: Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg TrpPhe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn GlnAsn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO:4)
[000196] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação de calicreína plasmática pode ter cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maior identidade de sequência a uma proteína de ligação descrita neste documento. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação de calicreína plasmática pode ter cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maior identidade de sequência nas regiões framework de HC e/ou LC (por exemplo, HC e/ou LC FR 1, 2, 3 e/ou 4) a uma proteína de ligação descrita neste documento. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação de calicreína plasmática pode ter cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maior identidade de sequência nas CDRS de HC e/ou LC (por exemplo, CDR1, 2 e/ou 3 de HC e/ou LC) a uma proteína de ligação descrita neste documento. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação de calicreína plasmática pode ter cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maior identidade de sequência na região constante (por exemplo, CH1, CH2, CH3 e/ou CL1) a uma proteína de ligação descrita neste documento.
[000197] Em alguns aspectos, uma pequena molécula se liga à forma ativa da calicreína plasmática.
Antagonistas do Receptor B2 de Bradicinina
[000198] Em algumas modalidades, um antagonista de receptor B2 da bradicinina é administrado a um sujeito. Antagonistas do receptor B2 de bradicinina exemplares incluem Incatibant (Firazyr®), o qual é uma droga peptidomimética contendo 10 aminoácidos que bloqueiam a ligação da bradicinina nativa ao receptor B2 de bradicinina.
Agentes de substituição de C1-INH
[000199] Em algumas modalidades, um agente de substituição de C1-INH é administrado a um sujeito. Agentes de substituição de C1-INH exemplares estão publicamente disponíveis e incluem, por exemplo, Berinert®, que é um concentrado de C1-INH nanofiltrado pasteurizado humano purificado.
EXEMPLOS Exemplo 1: Cininogênio clivado
[000200] Com base na análise do sistema de contato, cininogênio clivado é um biomarcador adequado para medir a ativação do sistema de contato. Cininogênio clivado mostrou-se anteriormente sendo elevado durante ataques de HAE, na cirrose), e como consequência da ativação do sistema de contato durante a sepse. Bibliotecas de exibição do fago do anticorpo foram deslocadas contra cininogênio clivado em combinação com depleção no cininogênio intacto. Em camundongos paralelos foram imunizados com cininogênio clivado e anticorpos monoclonais obtidos de linhas celulares de hibridoma. Ambos os esforços proveram um número de diferentes anticorpos monoclonais que ligaram cininogênio clivado e intacto, mas nenhum anticorpo que apenas ligou cininogênio clivado.
[000201] Um número dos anticorpos passou por triagem para adequação em um ensaio de Western blot e vários identificaram que funciona bem, incluindo o mouse mAb (clone 11H05) mostrado na Figura 2. É evidente que este ensaio é capaz de detectar cininogênio clivado em amostras plasmáticas humano. Além disso, os dados na Figura 2 confirmam que a coleta plasmática em vidro é suficiente para prevenir ativação de contato e clivagem de cininogênio.
[000202] Abordagem baseada em espectrometria de massa também pode ser usada para detectar cininogênio clivado no plasma do paciente. Nesta abordagem, um imunológico adsorve cininogênio da amostra do paciente, proteoliticamente digere o cininogênio eluído e analisa fragmentos de peptídeo por LC-MC.
Exemplo 2: Imunoensaios para C1INH-pKal α2M-pKal
[000203] Imunoensaios baseados em ELISA foram desenvolvidos para a detecção destes complexos. Os ensaios baseados em ELISA de tipo sanduíche são semelhantes aos anteriormente descritos, ver, e.g., Kaufman, et al. Blood 77, 2660 a 2667 e Wachtfogel, Blood 73, 468 a 471.
Exemplo 3: Ensaio C1INH-pKal
[000204] Um ELISA foi desenvolvido para a detecção do complexo C1INH-pKal. Este ensaio de tipo sanduíche usa anticorpos contra pKal e C1INH como reagente de captura ou de detecção. Uma primeira etapa no desenvolvimento deste ensaio é a preparação do complexo C1INH-pKal. Este complexo covalente foi preparado pela incubação de um excesso molar de pKal sobre C1INH de 2 a 4 vezes. O complexo foi então purificado usando cromatografia de permuta catiônica (resina Capto S), conforme mostrado na Figura 3. O complexo foi quantificado utilizando um coeficiente de extinção molar calculado em 280 nm (121, 740 M-1cm-1). Relatórios anteriores que usaram ensaios semelhantes para medir C1INH-pKal não relataram um coeficiente de extinção. Determinação precisa da concentração é crítica para um ensaio determinar quanto pKal é ativado durante a doença, o que informa a dosagem da droga.
[000205] Dois formatos de ensaio para a detecção de C1INH-pKal por ELISA foram investigados. O primeiro formato usa um anticorpo anti- pKal (mouse mAb 13G 11) como o reagente de captura e um anticorpo contra C1INH como o anticorpo da detecção após a produção de sinal com um anticorpo secundário HRP-rotulado (Figura 4). Este ensaio tem um limite inferior de quantificação na faixa nanomolar de dígito único ou abaixo. O formato de ensaio oposto também foi investigado, em que o anti-C1INH é o anticorpo de captura e anti-pKal (13G 11) é o anticorpo de detecção (Figura 5). Este formato de ensaio tem um limite inferior similar de quantificação. Ter dois formatos de ensaio fornece opções adicionais para multiplexar os ensaios para C1INH-pKal e α2M-pKal.
Exemplo 4: Ensaio de Complexo de α2M-pKal
[000206] Um ELISA foi desenvolvido para a detecção do complexo α2M-pKal. Este ensaio de tipo sanduíche usa anticorpos contra pKal e α2M como reagente de captura ou de detecção. Uma primeira etapa no desenvolvimento deste ensaio é a preparação do complexo α2M-pKal. Este complexo covalente foi preparado pela incubação de um excesso molar de pKal sobre α2M de 2 a 4 vezes. O complexo, então, foi purificado usando cromatografia de exclusão, conforme mostrado na Figura 6. α2M é composto de subunidades 180 kDa que existem como uma distribuição de oligômeros até tetrâmeros. Mediante interação com pKal, cada monômero de α2M tem uma propensão para formar ligação de amida covalente através de hidrólise das ligações de tioéster em α2M por aminas de lisina em pKal. Consequentemente, uma distribuição de espécies reticuladas pode ser esperada, o que dificulta a quantificação. Derivou-se um método para quantificar o complexo de α2M-pKal ao medir a atividade do complexo e convertendo-a para uma concentração usando uma curva padrão (Figura 7). Este método de quantificação é possível pelo fato de ser bem conhecido na literatura que complexos covalentes de α2M com proteases alvo não bloqueia o sítio ativo para substratos de peptídeos sintéticos pequenos.
[000207] Como com o ensaio C1INH-pKal, dois formatos de ensaio para a detecção de α2M-pKal por ELISA foram investigados. O primeiro formato usa um anticorpo anti-pKal (mouse mAb 13G 11) como o reagente de captura e um anticorpo contra α2M como o anticorpo da detecção após a produção de sinal com um anticorpo secundário HRP- rotulado (Figura 8). Este formato de ensaio tem um limite inferior de quantificação na faixa nanomolar de dígito único ou abaixo. O formato de ensaio oposto também foi investigado, em que o anti-α2M é o anticorpo de captura e anti-pKal (13G11) é o anticorpo de detecção (Figura 9). Este formato de ensaio tem um limite inferior similar de quantificação. Ter dois formatos de ensaio provê opções adicionais quando observamos ensaios multiplex para C1INH-pKal e α2M-pKal.
Exemplo 5: Detecção de α2M-pKal e C1INH-pKal no plasma ativado.
[000208] ELISAs foram usados para detectar a ativação de pKal no plasma humano normal tratado com reagentes, tais como sulfato de caulim ou dextrano, que são conhecidos por induzir ativação de contato. Como mostrado na Figura 10, os ensaios podem detectar os complexos que são formados no plasma após ativação in vitro com sulfato de dextrano.
Exemplo 6. Cininogênio Intacto e Clivado
[000209] Western blot foi usado para mostrar que plasma de um paciente obtido durante um ataque e coletado em tubos plasmática citratados contendo um coquetel anti-protease apresenta uma diminuição na quantidade de cininogênio intacto (por exemplo, cadeia única) (Figura 11). Aumento do cininogênio clivado (por exemplo, cadeia dupla) foi observado (dados não mostrados).
Exemplo 7: Ensaios Exemplares e Dados de Ensaio (i) Ativação de HMWK Ex Vivo
[000210] Ensaio de ativação HMWK Ex Vivo pode ser usado para avaliar a atividade inibitória de um candidato inibidor de pKal na ativação de contato. Brevemente, FXIIa (por exemplo, 5 nM) foi usado para estimular a ativação do sistema de contato no plasma humano normal ou simular amostras de ataque HAE para reduzir o nível de HMWK de cadeia única por cerca de 10 a 50%, o que pode ser detectado por Simple Western (SBHD) ou Western blot (TGA). Ativação de contato reduzida foi observada em amostras tratadas por DX-2930.
[000211] Conforme mostrado na Figura 17, a atividade inibitória de níveis mínimos de DX-2930 (por exemplo, 9 a 27 nM) foi detectada no ensaio de ativação HMWK Ex Vivo descrito neste documento, usando análise Protein Simple Western ou Western blot. A condição de ensaio utilizada neste estudo pode detectar a atividade de 9 a 27 nM DX-2930 em 5% de plasma. Ver também a tabela 2 abaixo: Tabela 2: Redução de Ativação Plasmática por DX-29
[000212] Os dados brutos para plasma ativado Fator XIIa com titulação DX-2930 foram providos na Figura 18. Ver também a tabela 3 abaixo: Tabela 3: Redução de Ativação Plasmática por DX-2930 a Várias Concentrações
[000213] A redução de HMWK de cadeia única foi examinado em várias amostras plasmática humano puro após ativação por FXIIa durante 30 minutos. Os resultados são mostrados nas figuras 22 a 26. Ver também as tabelas de 4 a8 abaixo: Tabela 4: % de Redução de HMWK de Cadeia Única Após 30 Minutos de Ativação em Amostra Plasmática Pura BRH745047. Tabela 5: % de Redução de HMWK de Cadeia Única Após 30 Minutos de Ativação em Amostra Plasmática Pura BRH745048. Tabela 6: % de Redução de HMWK de Cadeia Única Após 30 Minutos de Ativação em Amostra Plasmática Pura BRH745064. Tabela 7: % de Redução de HMWK de Cadeia Única Após 30 Minutos de Ativação em Amostra Plasmática Pura BRH745062. Tabela 8. % de Redução de HMWK de Cadeia Única Após 30 Minutos de Ativação em Amostras Plasmáticas Puras BRH745049, BRH745062, e BRH745063.
[000214] Conforme mostrado na Figura 27, ativação do fator XIIa resultou na redução de HMWK de cadeia única em amostras plasmática de modo dependente de dosagem.
(ii) Cininogênio clivado endógeno
[000215] Neste ensaio, plasma de tubo SCAT foi analisado por Simple Western (SBHD) e Western blot (TGA) para determinar o nível de cininogênio clivado da amostra plasmática. HMWK clivado mostrou-se elevado em amostras basais e de ataque HAE quando em comparação com o plasma humano normal. É esperado que HMWK clivado seja reduzido em pacientes HAE tratados por DX-2930, bem como em voluntários saudáveis tratados por DX-2930.
[000216] Conforme mostrado na Figura 28, níveis de HMWK de cadeia dupla (HMWK clivado) em amostras de pacientes de HAE basal foram menores do que aqueles em pacientes tendo ataque de HAE. Nível de HMWK clivado em pacientes tratados por DX-2930 deverá ser semelhante ao de pacientes normais.
[000217] A figura 29 mostra os níveis de HMWK clivado em basal, e pacientes com ataque HAE, conforme determinado por análise Protein Simple Western blot e análise tradicional Western blot.
[000218] HMWK clivado endógeno foi examinado em quatro indivíduos. Os resultados são mostrados na figura 30. Baixas quantidades de HMWK clivados foram encontradas em amostras plasmáticas humanas normais coletadas com citrato.
(iii) Ensaio ex vivo para medir a atividade de pKal
[000219] Este ensaio baseado em enzimas foi desenvolvido para avaliar a ativação do sistema de contato no plasma humano normal, ou simular amostras de ataque HAE (objetivo para 10 a 50% de redução em HMWK de cadeia única) e avaliar a atividade inibitória de inibidor de pKal sobre a ativação do sistema de contato. Ativação de contato reduzida foi observada em sujeitos tratados por DX-2930. Este teste é útil na avaliação de inibidor de pKal, tal como bioatividade DX-2930 em sujeitos tratados (por exemplo, macacos ou pacientes humanos).
[000220] Um exemplo deste teste é ilustrado na Figura 12. Brevemente, uma amostra plasmática foi colocada em uma microplaca de 96 poços. Foram adicionados DX-2930, um inibidor pKal exemplar e FXIIa, um ativador do sistema de contato exemplar, à amostra plasmática. A mistura foi incubada no gelo na presença de um substrato de peptídeo rotulado pKal durante um período apropriado de tempo (por exemplo, 2 minutos), e inibidor de tripsina de milho (CTI) foi adicionado à mistura para parar a reação de ativação. A mistura pode ter sido diluída, se necessário, e a atividade proteolítica foi determinada pela medição do nível de substrato fluorescente do peptídeo.
[000221] Como mostrado na Figura 12, macacos tratados por DX2930 mostraram redução dos níveis de ativação de contato (atividade de pKal reduzida).
(iv) Ensaio Western blot para determinar HMWK clivado
[000222] O nível de HMWK clivado foi medido através de um ensaio de Western Blot, que pode envolver a detecção de LiCor. Ver também exemplo 8 abaixo. Quando necessário, citrato ou coquetel antiprotease foi usado como um anti-coagulante neste ensaio. HMWK clivado elevado foi observado em amostras HAE em comparação com plasma normal. Este teste é útil na avaliação de inibidor de pKal, tal como bioatividade DX-2930 em sujeitos tratados (por exemplo, macacos ou pacientes humanos).
[000223] Amostras plasmáticas de pacientes HAE em coquetel inibidor de anti-protease foram examinadas usando o ensaio de Western blot com detecção de LiCor, e os resultados foram mostrados na Figura 14. Como mostrado na Figura 15, cininogênio intacto foi reduzido de 10% (ensaio de Western blot com deteção de LiCor) para 50%, conforme relatado anteriormente. Macacos cinomolgos tratados por DX-2930 mostraram redução dos níveis de ativação pKal (por sulfato de caulim ou dextrano) em forma dependente de dosagem. Figura 16. Ver também a tabela 9 abaixo: Tabela 9: Redução de HMWK clivado por DX-2930
[000224] HMWK humano em várias amostras plasmática depois de ativação por 30 minutos foi mostrado na Figura 19, e determinado pelo ensaio de Western blot aqui descrito. Amostras reduzidas foram fervidas durante 5 minutos antes da adição de gel. As amostras foram diluídas por 20 vezes, e correram em um 4 a 12% Bis-Tris Gel a 150v durante 90 minutos. As proteínas no gel foram transferidas para uma membrana usando iBlot por 7 minutos. Utilizou-se o mouse cininogênio anti-humano (diluição 1:1,000). O tempo de exposição de blot foi 5 segundos.
[000225] Protein Simple Western foi comparado com o tradicional ensaio de Western blot na detecção de ativação plasmática. Conforme mostrado nas figuras 20 e 21, o anterior (painel direito) é mais sensível do que o último (painel esquerdo).
Exemplo 8: Ativação ex vivo de pKal como um biomarcador
[000226] A ativação ex vivo de precalicreína para calicreína plasmática (pKal) no plasma pode ser usada, por exemplo, como biomarcador farmacodinâmicos (PD) para fornecer evidência da bioatividade dos inibidores terapêuticos de pKal, tais como DX-2930 e para a detecção de pKal registrado em amostras de doença.
[000227] Em uma primeira experiência, plasma dosado de um macaco cinomolgos com uma única injeção de SC de DX-2930 (5 mg/kg) foi obtido e ativado com 10 nM FXIIa para gerar pKal ativo que foi monitorado usando um substrato sintético (Pro-Phe-Arg-AMC). Inibidor de tripsina de milho foi adicionado para parar a ativação FXIIa antes da adição do substrato. A inibição porcentual observada no plasma das amostras de macaco cinomolgos dosadas igualou-se às amostras plasmática preparadas precisamente com um equivalente molar de DX-2930 ou ecallantide (figura 31). É evidente que a concentração plasmática de DX-2930 atingiu um nível de fármaco (~ 265 nM) que inibiu aproximadamente 80% da atividade de pKal que foi gerada pela adição FXIIa ex vivo. Figura 31 mostra, também, que quantidades iguais de inibição de pKal foram observadas com uma concentração equivalente de ecallantide. Em contraste, as concentrações equivalentes de C1-INH adicionado ao plasma não inibem o pKal que foi ativado pelo FXIIa neste ensaio de ativação ex vivo.
[000228] Em um segundo experimento, plasma foi obtido de macacos cinomolgos dosados com cinco injeções semanais de SC de diferentes doses de DX-2930, e plasma citratado foi obtido a partir de seres humanos (n=6) em um estudo clínico na fase 1a, os quais receberam uma única injeção de SC de DX-2930 em doses diferentes. As amostras plasmática foram ativadas com FXIIa e a atividade de pKal resultante foi medida utilizando um substrato sintético (Pro-Phe-Arg-AMC). Inibidor de tripsina de milho foi adicionado para parar a ativação FXIIa antes da adição do substrato. A inibição percentual foi determinada utilizando a atividade de pKal presente na amostra plasmática de pré-dose de cada indivíduo como uma linha de base. A Figura 32 mostra que a inibição porcentual aumentou em ambas as amostras plasmáticas humano e de macaco, com o aumento de doses de DX-2930.
[000229] Os resultados destes dois experimentos mostram que o ensaio de ativação ex vivo é útil como um biomarcador de PD para a bioatividade de inibidores terapêuticos de pKal.
Exemplo 9: Inibição da atividade de pKal ex vivo em DX-2930 Fase 1 de amostras plasmáticas de estudo
[000230] A atividade inibitória (bioatividade) ex vivo de DX-2930 no plasma derivado de sujeitos humanos administradas por via subcutânea com DX-2930 foi investigada neste estudo. Materiais • DX-2930 (106,7 mg / ml = 732 μM) • FXIIa Humana - ERL HFXIIa 2790P (1,72 mg/ml = 25,3 μM) • Inibidor de tripsina de milho (CTI) - ERL CTI 360 (1,54 mg/ml = 123 μM) • Substrato de Peptídeo = PFR-AMC, Sigma Cat # 99273, lote 037K1207. • Buffer de Ensaio = 20 mM Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% PEG-8000 • Microplacas de poliestireno branco com 96 poços, com borda CAT# 3789 • Leitor de placa Spectramax M2 • Plasma citratado coletado em DX-2930 Fase 1A estudado
Métodos
[000231] Plasma diluído 01:40 foi ativado pela adição de 10 nM FXIIa por 2 minutos à temperatura ambiente. FXIIa foi, então, extinto pela adição de 100 nM CTI, e a atividade proteolítica de calicreína plasmática (pKal) foi, então, avaliada por uma diluição 01:10 adicional da amostra plasmática, e adição de 10 μM substrato de peptídeo fluorescente PFR- AMC. Cada amostra plasmática foi relatada como taxa de atividade de pKal, a qual foi convertida para "% inibição" com base em controles de pré- dose para cada indivíduo.
Resultados
[000232] Amostras plasmáticas citratadas de indivíduos saudáveis foram obtidas em DX-2930 fase 1a, estudadas e analisadas usando um Ensaio de Bioatividade Ex Vivo em Plasma. Inibição significativa da atividade de pKal foi observada em grupos de dosagem 3 (1,0 mg/kg DX2930) e 4 (3,0 mg/kg DX-2930), atingindo aproximadamente 19% e 36% de inibição de atividade de pKal máxima, respectivamente (figura 33). A inibição que foi conseguida nos grupos 3 e 4 foi sustentada e foi consistente com uma meia-vida aparente de aproximadamente 20 dias. Inibição de atividade de pKal em grupos de dosagem 1 (0,1 mg/kg DX2930) e 2 (0,3 mg/kg DX-2930) não foi significativa.
[000233] Estes resultados demonstram, adicionalmente, que o ensaio de ativação ex vivo é útil como um biomarcador de PD para a bioatividade de inibidores de pKal terapêuticos.
Exemplo 10. Análise de Bioatividade DX-2930 na Fase 1a Amostras de Estudo de Ensaio Western Blot
[000234] A bioatividade de DX-2930 no plasma de seres humanos tratados com DX-2930 foi investigada usando o ensaio de Western blot descrito neste documento.
[000235] Ensaio Western blot foi realizado com amostras plasmática citratado obtido de sujeitos em Dia 1 (antes de DX-2930 ou dosagem por placebo), em Dia 5 ou Dia 28, seguindo a dosagem com DX2930 ou placebo. As amostras foram analisadas por Western blot, utilizando um anticorpo que detecta cininogênio de alto peso molecular (HMWK), o substrato para calicreína plasmática ativa, a qual é o alvo da enzima que é inibida por DX-2930. Calicreína plasmática atua em HMWK para gerar a bradicinina peptídeo pró-inflamatória e uma corrente dupla, a qual é conhecida como a forma clivada de HMWK que foi detectado pela análise Western blot. Amostras plasmáticas não tratadas e tratadas com coagulação ativada Fator XIIa (FXIIa) foram analisadas. FXIIa converte a precalicreína inativa no plasma pra calicreína plasmática ativada.
[000236] Os resultados obtidos neste estudo mostram que amostras tratadas por FXIIa de sujeitos dosados em 3 mg/Kg DX-2930 (grupo 4) exibiram uma percentagem estatisticamente menor de HMWK (HMWK clivado) de cadeia dupla no Dia 5 (p=0,0011) e dia 28 (p=0,0028) do que as amostras pré-dosadas destes sujeitos. Esta é a evidência de bioatividade de DX-2930 contra proteólise mediada por calicreína plasmática de seu substrato endógeno (HMWK) (Figura 34). A redução da percentagem de HMWK de cadeia dupla observada no grupo 4 tendia mais abaixo do que o observado em outros grupos de dosagem ou o grupo de tratado por placebo.
[000237] Além disso, amostras de indivíduos dosados com DX2930 em 0,3, 1 ou 3 mg/Kg que não foram tratados com FXIIa exibido uma menor percentagem de HMWK de cadeia dupla do que o observado nas doses de placebo ou 0,1 mg/Kg (Figura 35).
[000238] Tomados em conjunto, estes resultados demonstram, adicionalmente, que o ensaio de Western blot é útil como um biomarcador de PD para a bioatividade de inibidores de pKal terapêuticos.
EQUIVALENTES E ESCOPO
[000239] Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar, usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas descritas neste documento. O escopo da presente divulgação descrita neste documento não se destinada a limitar a descrição acima, mas sim conforme estabelecido nas reivindicações anexas.
[000240] Nas reivindicações, artigos como "um", "uma", e "a" podem significar um ou mais do que um, a menos que indicado ao contrário, ou que seja de outro modo evidente no contexto. Reivindicações ou descrições que incluem "ou" entre um ou mais membros de um grupo são considerados satisfeitos, se um, mais do que um ou todos os membros do grupo estão presentes em, empregues em, ou são, de outra forma, relevante(s) para um determinado produto ou processo, a menos que indicado ao contrário ou evidente de outra maneira a partir do contexto. A presente divulgação inclui modalidades em que exatamente um membro do grupo está presente em, empregado em, ou de outro modo é relevante para um determinado produto ou processo. A presente divulgação inclui modalidades em que mais do que um, ou todos os membros do grupo, se encontram presentes em, empregados em, ou são, de outra forma, relevantes para um determinado produto ou processo.
[000241] Ademais, a presente divulgação abrange todas as variações, combinações e permutações, em que uma ou mais limitações, elementos, cláusulas e termos descritivos de uma ou mais reivindicações listadas são introduzidas em uma outra reivindicação. Por exemplo, qualquer reivindicação que depende de outra reivindicação pode ser modificada para incluir um ou mais limitações encontradas em qualquer outra reivindicação, a qual é dependente da mesma reivindicação base. Em que os elementos são apresentados como listas, por exemplo, no formato do grupo Markush, cada subgrupo dos elementos é também descrito, e qualquer elemento(s) pode(m) ser removido(s) do grupo. Deve ser entendido que, em geral, quando a presente divulgação, ou aspectos da presente divulgação, é/são referida(s) como compreendendo elementos particulares e/ou características, certas modalidades da presente divulgação ou aspectos da presente divulgação consistem, ou consistem essencialmente, em tais elementos e/ou características. Para fins de simplicidade, estas modalidades não foram especificamente definidas aqui in haec verba. É também de se notar que os termos "compreendendo" e "contendo" destinam-se a ser aberto e permitir a inclusão de elementos ou etapas adicionais. Onde são dados intervalos, os desfechos estão incluídos. Além disso, a menos que indicado de outra forma, ou evidente de outra maneira a partir do contexto e da compreensão de um versado na técnica, valores que são expressos em intervalos podem assumir qualquer valor específico ou subintervalos dentro dos intervalos indicados nas diferentes modalidades da presente invenção, ao décimo da unidade do limite inferior do intervalo, a menos que o contexto dite claramente o contrário.
[000242] Este pedido se refere a várias patentes concedidas, pedidos de patentes publicados, artigos de revistas e outras publicações, todos os quais são aqui incorporados por referência. Se houver um conflito entre qualquer uma das referências incorporadas e a especificação imediata, a especificação deve prevalecer. Adicionalmente, qualquer modalidade particular da presente invenção que se encontre dentro do estado da técnica pode ser explicitamente excluída de qualquer uma das reivindicações. Uma vez que tais modalidades são consideradas como conhecidas por um versado na técnica, elas podem ser excluídas, mesmo que a exclusão não seja apresentada explicitamente neste documento. Qualquer modalidade particular da presente invenção pode ser excluída de qualquer reivindicação, por qualquer motivo, se não relacionada com a existência do estado da técnica.
[000243] Os versados na técnica reconhecerão ou serão capazes de determinar, usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas descritas neste documento. O escopo das presentes modalidades descritas neste documento não se destinada a limitar a descrição acima, mas sim conforme estabelecido nas reivindicações anexas. Os versados na técnica apreciarão que várias alterações e modificações podem ser feitas nesta descrição sem se afastar do espírito ou do escopo da presente divulgação, tal como definido nas reivindicações seguintes.

Claims (16)

1. Método de ativação ex vivo, caracterizado pelo fato de que compreende: incubar uma amostra plasmática obtida a partir de um sujeito com um ativador do sistema calicreína plasmática (pKal), em que o ativador é Fator XIIa (FXIIa); medir os níveis de cininogênio intacto de alto peso molecular (HMWK), HMWK clivado, ou ambos, na amostra plasmática antes e depois da incubação; e determinar a redução de HMWK intacto na amostra após a ativação.
2. Método para avaliar ativação plasmática em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende: prover uma amostra plasmática a partir de um sujeito; e medir o nível de HMWK clivado na amostra plasmática com base na ativação com Fator XIIa (FXIIa).
3. Ensaio ex vivo para determinar atividade de calicreína plasmática (pKal) em uma amostra de um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende: incubar a amostra com um ativador de sistema pKal na presença de um substrato pKal, em que o ativador de sistema pKal é Fator XIIa (FXIIa), e medir a atividade de pKal com base na taxa de clivagem do substrato.
4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que os níveis de HMWK intacto e HMWK clivado são medidos por meio de análise de Western blot.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a análise de Western blot é a análise Protein Simple Western blot.
6. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que a amostra plasmática e o ativador são incubados na presença de um candidato inibidor de pKal, e em que o método compreende, adicionalmente, a avaliação da atividade do candidato inibidor de pKal na calicreína plasmática.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, avaliar se o sujeito tem ou está em risco de ter uma doença associada a pKal; em que um nível elevado de HMWK clivado ou nível elevado de atividade de pKal, quando comparado a um valor predeterminado, indica que o sujeito tem ou corre o risco de ter a doença.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a doença é angioedema hereditária (HAE).
9. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem ou é suspeito de ter uma doença associada ao sistema calicreína plasmática (pKal).
10. Ensaio de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra plasmática do sujeito.
11. Ensaio de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o substrato é anexado a um marcador, o qual é capaz de liberar um sinal detectável após ser clivado por pKal e a taxa de clivagem do substrato é determinada com base na magnitude do sinal detectável.
12. Ensaio de acordo com qualquer uma das reivindicações 3, 10 e 11, caracterizado pelo fato de que a amostra plasmática é incubada com o ativador, o substrato de pKal e um candidato inibidor de pKal.
13. Ensaio de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, avaliar a atividade inibidora do candidato inibidor de pKal no pKal, em que um nível reduzido de atividade de pKal na presença do candidato inibidor de pKal, quando comparado ao nível da atividade de pKal na ausência do candidato inibidor de pKal, indica que o candidato inibidor é eficaz.
14. Ensaio de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o candidato inibidor pKal é um anticorpo que se liga à pKal.
15. Ensaio de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é DX-2930.
16. Ensaio de acordo com qualquer uma das reivindicações 3, 11 e 12, caracterizado pelo fato de ser realizado em uma microplaca.
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2948479T (pt) 2013-01-20 2018-11-14 Dyax Corp Avaliação e tratamento de distúrbios mediados por bradicinina
IL289514B2 (en) 2013-10-21 2024-01-01 Takeda Pharmaceuticals Co Tests to determine system biomarkers for plasma kallikrein
KR102665705B1 (ko) 2013-10-21 2024-05-14 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드 자가면역 질환의 진단 및 치료
KR20230164767A (ko) * 2015-03-30 2023-12-04 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드 혈장 칼리크레인 저해제 및 유전성 혈관부종 발작을 예방하기 위한 이의 용도
AU2016306653B2 (en) * 2015-08-13 2021-05-13 Takeda Pharmaceutical Company Limited Evacuated blood collection tubes containing protease inhibitors for the assessment of contact system activation
CN113655228A (zh) * 2015-10-19 2021-11-16 武田药品工业株式会社 检测裂解的高分子量激肽原的免疫测定方法
AU2016372159B2 (en) 2015-12-15 2022-03-24 Takeda Pharmaceutical Company Limited Peptide quantitation assay for differentiating full-length high molecular weight kininogen (HMWK) and cleaved HMWK
KR20230044024A (ko) * 2016-09-16 2023-03-31 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드 접촉 활성화 시스템과 연관된 질환을 위한 단백질 바이오마커
AU2017325999C1 (en) 2016-09-16 2024-03-07 Takeda Pharmaceutical Company Limited RNA biomarkers for hereditary angioedema
NZ751481A (en) * 2016-09-16 2024-02-23 Takeda Pharmaceuticals Co Metabolite biomarkers for diseases associated with the contact activation system
EP3521828A1 (en) * 2018-01-31 2019-08-07 Centogene AG Method for the diagnosis of hereditary angioedema
US20200407771A1 (en) * 2018-02-22 2020-12-31 The Regents Of The University Of California Threshold-stimulated plasma kallikrein activity as a biomarker for diagnosis of bradykinin-mediated angioedema
CN111057745B (zh) * 2019-12-30 2022-08-12 中国科学院生态环境研究中心 一种物质的血液毒性效应的高通量筛选方法
CN114166924A (zh) * 2021-12-03 2022-03-11 中国医学科学院北京协和医院 尿液蛋白标志物在诊断遗传性血管水肿中的用途
WO2024003617A2 (en) * 2022-06-30 2024-01-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Protein biomarkers for lanadelumab treatment

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1312564C (en) 1985-07-12 1993-01-12 Robert W. Colman Monoclonal antibodies to human plasma prekallikrein and methods of preparing and using same
US5047323A (en) 1986-01-22 1991-09-10 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Method for detecting human kininogen using monoclonal antibodies thereto
US4908431A (en) 1986-01-22 1990-03-13 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Monoclonal antibodies to human kininogen and methods of preparing same
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
JPS63185398A (ja) * 1986-09-10 1988-07-30 Nippon Zoki Pharmaceut Co Ltd 生理活性物質測定法
US4882272A (en) 1986-10-01 1989-11-21 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education High molecular weight kininogen assay
US5025796A (en) 1988-12-01 1991-06-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Apparatus and methods for determining in vivo response to thermal stimulation in in an unrestrained subject
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
AU2548992A (en) 1991-08-13 1993-03-16 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Modulation of blood pressure and inhibition of platelet activation with kininogen fragment
US6057287A (en) 1994-01-11 2000-05-02 Dyax Corp. Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof
JP3805785B2 (ja) 1994-01-11 2006-08-09 ダイアックス コープ． カリクレイン阻害クニッツドメイン蛋白質およびその相同体
JPH1084995A (ja) 1996-09-12 1998-04-07 Nippon Zoki Pharmaceut Co Ltd 血液凝固第ｘｉｉ因子活性化法
US5789261A (en) 1996-10-30 1998-08-04 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Solid phase immunoassay
US6242210B1 (en) * 1997-05-20 2001-06-05 Actinova Limited Treatment of bacterial infections
JP4346798B2 (ja) 1999-08-19 2009-10-21 協和メデックス株式会社 Ｈｃｖコア抗原の検出または定量方法およびそれに用いる検出または定量試薬。
US6994852B1 (en) 1999-11-12 2006-02-07 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Inhibition of angiogenesis by antibodies against high molecular weight kininogen domain 5
US7067713B2 (en) 2000-01-31 2006-06-27 Pharming Intellectual Property B.V. C1 Inhibitor produced in the milk of transgenic non-human mammals
US7678541B2 (en) * 2000-11-21 2010-03-16 Hologic, Inc. Methods and compositions for the detection of a nucleic acid using a non-invasive cleavage reaction
JP2002221519A (ja) 2001-01-29 2002-08-09 Sysmex Corp 抗凝固剤およびそれを用いた抗凝固剤処理方法
US20040152633A1 (en) 2001-05-31 2004-08-05 Jorgensen Marianne Ulrich Kunitz-type sequences and polypeptides
US6913900B2 (en) * 2001-08-29 2005-07-05 Nippon Zoki Pharmaceutical Co., Ltd. Plasma prekallikrein activation and kallikrein production assay
ES2559927T3 (es) 2002-06-07 2016-02-16 Dyax Corp. Prevención y reducción de pérdida de sangre y respuesta inflamatoria
US20070003552A1 (en) * 2002-07-09 2007-01-04 Gebbink Martijn F B Cross-beta structure comprising amyloid binding proteins and methods for detection of the cross-beta structure, for modulating cross-beta structures fibril formation and for modulating cross-beta structure-mediated toxicity and method for interfering with blood coagulation
EP1598428A1 (en) * 2004-05-18 2005-11-23 Georg Dewald Methods and kits to detect Hereditary angioedema type III
US7235530B2 (en) 2004-09-27 2007-06-26 Dyax Corporation Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof
DK1981519T3 (en) 2005-12-29 2018-02-19 Dyax Corp protease inhibition
US7276480B1 (en) 2005-12-30 2007-10-02 Dyax Corp. Prevention and reduction of blood loss
JP5322935B2 (ja) 2006-07-31 2013-10-23 アクティベサイト ファーマシューティカルズ インコーポレイティッド 血漿カリクレインの阻害薬
CA2696208A1 (en) 2007-08-21 2009-02-26 Genzyme Corporation Treatment with kallikrein inhibitors
EP2215256A1 (en) 2007-10-22 2010-08-11 Georg Dewald Disorders of vasoregulation and methods of diagnosing them
US20110160434A1 (en) 2008-07-07 2011-06-30 Nippon Zoki Pharmaceutical Co., Ltd. Fibromyalgia test method
US20110212104A1 (en) 2008-11-03 2011-09-01 Schering Corporation Inflammatory bowel disease biomarkers and related methods of treatment
EP2369930A4 (en) * 2008-12-02 2012-10-03 Joslin Diabetes Ct METHOD OF REDUCING BLOOD PRESSURE FROM PLASMA CALLICINE INHIBITORS
AU2010203712A1 (en) 2009-01-06 2010-07-15 Dyax Corp. Treatment of mucositis with kallikrein inhibitors
FR2942233B1 (fr) 2009-02-19 2015-03-13 Lfb Biotechnologies Moyens pour la purification d'une proteine du plasma sanguin, et procedes pour sa mise en oeuvre
KR101077275B1 (ko) 2009-05-07 2011-10-27 한국기초과학지원연구원 당단백질의 당쇄화를 이용한 암 진단 방법
WO2011075684A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Activesite Pharmaceuticals, Inc. Prodrugs of inhibitors of plasma kallikrein
US9206123B2 (en) 2009-12-18 2015-12-08 Activesite Pharmaceuticals, Inc. Prodrugs of inhibitors of plasma kallikrein
SI2521568T1 (sl) 2010-01-06 2019-01-31 Dyax Corp. Proteini, ki vežejo plazemski kalikrein
WO2012009447A2 (en) 2010-07-13 2012-01-19 University Of Rochester THE cAMP/PKA/HDAC5 PATHWAY AND USES THEREOF
WO2012075407A2 (en) 2010-12-02 2012-06-07 Becton, Dickinson And Company Blood collection devices containing blood stabilization agent
CN103635489B (zh) 2011-01-06 2016-04-13 戴埃克斯有限公司 血浆前激肽释放酶结合蛋白
EP3320922A1 (en) 2011-06-10 2018-05-16 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating kallikrein (klkb1) expression
WO2012170947A2 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating factor 12 expression
PT2948479T (pt) 2013-01-20 2018-11-14 Dyax Corp Avaliação e tratamento de distúrbios mediados por bradicinina
CA2899594A1 (en) 2013-02-01 2014-08-07 Keith A. Moskowitz Blood collection devices containing contact pathway inhibition additives
KR102665705B1 (ko) 2013-10-21 2024-05-14 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드 자가면역 질환의 진단 및 치료
IL289514B2 (en) 2013-10-21 2024-01-01 Takeda Pharmaceuticals Co Tests to determine system biomarkers for plasma kallikrein
KR102424183B1 (ko) 2014-01-21 2022-07-26 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드 혈장 칼리크레인 결합 단백질 및 유전성 혈관부종을 치료하는 데 있어서의 이의 용도
CN113655228A (zh) 2015-10-19 2021-11-16 武田药品工业株式会社 检测裂解的高分子量激肽原的免疫测定方法

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