ES2318459T3 - Metodo y kit para la medicion de la activacion de las celulas neutrofilas. - Google Patents
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Abstract
Un método in vitro para medir el estado de activación de células de neutrófilos en una muestra biológica obtenida a partir de un mamífero, conteniendo dicha muestra a dichas células de neutrófilos y/o a una mieloperoxidasa liberada por dichas células, cuyo método mide específicamente sólo el contenido de mieloperoxidasa activa, estando correlacionado dicho contenido con dicho estado de activación de las células, comprendiendo dicho método las operaciones de: - capturar (inmunológicamente) una mieloperoxidasa (1) presente en la muestra biológica mediante un anticuerpo policlonal o monoclonal (2) que es específico para la mieloperoxidasa, - detectar y/o medir la mieloperoxidasa activa que está presente en dicha muestra biológica, - posiblemente comparar los valores medidos de la mieloperoxidasa activa con los niveles normales de mieloperoxidasa activa, obtenidos a partir de un número significativo de mamíferos sanos, - opcionalmente cuantificar los niveles de mieloperoxidasa activa usando una curva patrón de mieloperoxidasa activa, y - posiblemente relacionar los niveles de mieloperoxidasa activa, que se han medido, con un estado de actividad de dichas células, que es indicativo de la presencia, la ausencia o la condición de una enfermedad o de un estado inmunológico.
Description
Método y kit para la medición de la activación
de las células neutrófilas.
El presente invento se refiere a métodos y
estuches (o dispositivos) para la medición de una mieloperoxidasa
equina (MPO), que es una enzima específica de neutrófilos equinos,
ya sea en su totalidad (primer método], o específicamente en su
forma activa [segundo método]. Dichos métodos y estuches (o
dispositivos), usados independientemente o en combinación,
encuentran aplicaciones mejoradas en el sector veterinario y se
pueden adaptar para su aplicación en el cuidado de la salud humana.
El concepto del segundo método es aplicable a cualquier otra
enzima.
Una mieloperoxidasa (MPO) es una enzima
específica de leucocitos polimorfonucleares (también conocidos como
neutrófilos), que son células sanguíneas blancas especializadas en
la lucha contra microorganismos por fagocitosis.
Los agentes patógenos son destruidos en el
interior de los neutrófilos por unas proteinasas y una
mieloperoxidasa, siendo esta última enzima específicamente
responsable de la producción de un potente agente oxidante, el ácido
hipocloroso (HOCl). Este HOCl (blanqueador) permite la destrucción
de las cápsulas polisacarídicas bacterianas que resisten a las
proteinasas. Por lo tanto una MPO desempeña un cometido clave en la
defensa de los anfitriones contra una infección.
Durante su lucha contra microorganismos, los
neutrófilos moribundos liberan una mieloperoxidasa en los líquidos
y tejidos circundantes. Cuando la activación de los neutrófilos es
excesiva y se vuelve incontrolada (como en patologías de
inflamaciones agudas), la liberación de una mieloperoxidasa es
importante y se alcanzan altas concentraciones de esta enzima en
medios o muestras biológicos/as (plasma, tejidos, fluidos ascíticos,
fluidos bronquio-alveolares, un fluido pleural,
linfa, orina, saliva, líquidos de irrigación uterina....),
conduciendo a un riesgo acrecentado de citotoxicidad (por captura
de la mieloperoxidasa dentro de células o por su fijación sobre una
superficie celular, con una producción in situ de
oxidantes).
Hasta ahora, en la medicina equina, una
mieloperoxidasa se medía por medio de la detección de una actividad
de peroxidasa. Sin embargo, dicha detección, de acuerdo con las
técnicas hasta ahora desarrolladas, no es específica para una
mieloperoxidasa equina (se detecta una actividad general de
peroxidasa), es tediosa y no es aplicable a medios y muestras
biológicos/as complejos/as (tales como un plasma) debido a la
presencia de proteínas (albúmina, lipoproteínas,...) y reduciendo a
los agentes que interfieren con la medición enzimática.
Hasta ahora no se ha desarrollado ninguna
técnica eficiente para la medición de la concentración total de una
mieloperoxidasa equina en fluidos biológicos complejos (tanto
celulares como acelulares) y en tejidos.
La presencia de una mieloperoxidasa en alvéolos
y tejidos se estima actualmente por medio de la medición de una
actividad de peroxidasa no específica después de una extracción.
Hay una demanda siempre creciente de ensayos
diagnósticos fáciles y mejorados para medir una actividad y unas
concentraciones de una MPO, especialmente en caballos. El diseño de
un ensayo rápido y sano para la medición de una mieloperoxidasa
equina es necesitado en alto grado para el diagnóstico de
enfermedades y/o patologías equinas (tales como por ejemplo cólicos
con una alta mortalidad en Equidae (équidos), sepsis, lesión
pulmonar aguda, inflamación aguda,...). La elección entre un
tratamiento clínico, una intervención quirúrgica (que es costosa
para el cirujano veterinario y para el criador) o, en el peor de los
casos, una eutanasia del animal será más fácil de hacer y la
decisión tomada se encontrará mejor consolidada cuando existan
ensayos buenos, rápidos y confiables para diagnosticar una excesiva
activación y/o invasión de neutrófilos.
Se conoce que una mieloperoxidasa es un marcador
específico para una activación y/o una invasión excesivas de
neutrófilos en seres humanos así como también en otros mamíferos
tales como caballos. En caballos, las calificaciones de tejidos
intestinales se correlacionan por ejemplo positivamente con una
actividad de MPO tisular en muestras adyacentes (Mc Connino y
colaboradores, 1999, Am J Vet Res 60: 807-813). Se
ha comprobado que los valores fisiológicos de una mieloperoxidasa
en plasma en caballos sanos se exceden significativamente en varias
patologías abdominales agudas en caballos con estrangulación del
intestino grueso y en caballos que no sobrevivirán
(Deby-Dupont y colaboradores, Vet Immunol
Immunopathol. 86: 257-271; Grülke y colaboradores,
1999, Can J. Vet Res. 63: 142-7; Grülke, 2002, tesis
doctoral, ISBN
2-930212-57-8). En
seres humanos, la concentración en plasma de una mieloperoxidasa es
considerada actualmente como marcadora de una activación de
neutrófilos tal como en enfermedades cardiovasculares (Zhang y
colaboradores, 2001, JAMA 282: 3126-2142).
La publicación de Deby-Dupont y
colaboradores (1998, Vet Immunol Immunopathol. 66:
257-271) describe la preparación de un ensayo
radioinmunológico (RIA) que requiere el uso de moléculas marcadas
radiactivamente, un equipo especializado y una autorización
específica para el uso de dichas marcas con isótopos
radiactivos.
Dicho ensayo radioinmunológico (RIA) es
apropiado para la detección de una mieloperoxidasa equina en su
totalidad (sin ninguna distinción entre las formas activas o no
activas de la enzima, reconociendo por ejemplo también a
hemi-enzimas y a las subunidades pesadas de una
MPO). El método de RIA disponible no es apropiado, sin embargo,
para la detección dirigida de una mieloperoxidasa activa
enzimáticamente. El método de RIA se puede usar para la detección
de una mieloperoxidasa en plasma, pero no es apropiado para una
detección adecuada y confiable de una MPO en muestras de tejidos y
en medios o muestras biológicos/as complejos/as (tales como un
plasma seminal, fluidos de lavado
bronquio-alveolares, un esputo, líquidos purulentos,
abscesos, fluidos pleurales, orina, saliva, líquidos de irrigación
uterina,....). Una medición adecuada y confiable de una MPO en
medios y muestras complejos/as no es posible, debido a
interferencias del medio, que conducen a una alteración proteolítica
de la molécula de referencia marcada (mieloperoxidasa marcada con
^{125}I) y que, debido a los contenidos excesivos de lípidos de
alta viscosidad y a los bajos contenidos de proteínas del medio
alteran la formación y la precipitación de complejos de anticuerpos
dobles ("efectos de matriz").
El documento de solicitud de patente
internacional WO 99/61907 describe un método para medir el estado de
activación de células de leucocitos, que no puede distinguir entre
linfocitos (linfocitos T, linfocitos NK (asesinos) o B),
eosinófilos, neutrófilos, basófilos, monocitos y macrófagos. Dicho
método requiere además la presencia de dichas células (en este caso
(in casu) las células de leucocitos) en la muestra biológica
que se ha de analizar. El estado de activación de dicha
sub-población de leucocitos se obtiene por medio de
la medición del tamaño de los leucocitos y/o por medio de la
medición de la actividad de peroxidasa de dichas células de
leucocitos. Entre las actividades de peroxidasas totales que se
detectan, se encuentran, por lo menos, las actividades de
peroxidasas de eosinófilos debidas a la peroxidasa del eosinófilo:
EPO) y las de neutrófilos (debidas a una mieloperoxidasa: MPO).
El método descrito en el documento WO 99/61907
detecta, por lo tanto, todas las clases de actividades de
peroxidasas, no está limitado a una actividad de mieloperoxidasa
por sí sola, y mide una actividad de peroxidasa en general en
neutrófilos, eosinófilos y otros tipos de células sanguíneas. El
método está meramente confinado a la medición de una actividad de
peroxidasa en una muestra de células aisladas, en que una actividad
de peroxidasa es de todos modos alta debido a la liberación in
situ de enzimas por las células.
Sólo una actividad de enzima intracelular activa
se mide en el método de acuerdo con el documento WO 99/61907, por
ejemplo mediante un citómetro de flujo o un analizador hematológico
automático, que requiere la disponibilidad de un personal altamente
experto.
El método del documento WO 99/61907 no se aplica
específica a la medición de una mieloperoxidasa procedente de
neutrófilos y no se aplica a medios acelulares complejos, tales como
un plasma, ni a tejidos. Por lo tanto, el método no es
suficientemente específico para una mieloperoxidasa y no permitirá
al practicante identificar con claridad la presencia o ausencia de
una enfermedad dada, o la condición de una enfermedad específica,
que está caracterizada por un estado de activación, que es
específico para células de neutrófilos.
Finalmente, dependiendo del estado de
óxido-reducción del medio de una muestra, podrían
surgir aberraciones de gran tamaño y afectar a la precisión de una
detección cuando la persona experta en la especialidad aplique el
método descrito en el documento WO 99/61907.
El documento WO 02/50550 describe el uso de una
mieloperoxidasa humana recombinante para obtener una lipoproteína
oxidada, y describe correspondientes anticuerpos monoclonales
dirigidos contra ella. Dichos anticuerpos son apropiados para usos
de diagnóstico, preventivos y terapéuticos, especialmente para
diagnosticar y determinar riesgos cardiovasculares vinculados con
la presencia de lipoproteínas oxidadas de baja densidad.
El presente invento tiene como meta proporcionar
nuevos métodos y estuches (o dispositivos) para una medición
específica de la activación de células de neutrófilos en una muestra
biológica obtenida de un mamífero, preferiblemente de un
caballo.
Una meta principal del presente invento es la de
proporcionar los métodos y los estuches (o los dispositivos) que
sean específicos para la medición de una mieloperoxidasa obtenida a
partir de neutrófilos de un mamífero, preferiblemente neutrófilos
equinos, en medios biológicos celulares o acelulares complejos.
Una meta adicional del presente invento es la de
proporcionar métodos y estuches (o dispositivos) que puedan
caracterizar a una mieloperoxidasa total (activa y no activa)
[primer método], y proporcionar métodos y estuches (o dispositivos)
que puedan caracterizar exclusivamente a una mieloperoxidasa activa
obtenida a partir de dichas células de neutrófilos [segundo
método]. Otra meta del invento es la de proporcionar métodos y
estuches (o dispositivos) para estudiar los efectos de ligandos
(fármacos) de una mieloperoxidasa o para escrutar nuevos compuestos
que interactúen con una mieloperoxidasa.
Una última meta del presente invento es la de
proporcionar métodos y estuches (o dispositivos) mejorados para
aplicaciones veterinarias y médicas.
El presente invento se relaciona con un método
(preferiblemente con un método in vitro) para medir el estado
de activación (activación y desgranulación) de células de
neutrófilos que están presentes en una muestra biológica obtenida a
partir de un mamífero, preferiblemente de un caballo, cuyo método
mide específicamente el contenido de mieloperoxidasa (MPO)
(solamente), estando correlacionado dicho contenido con dicho estado
de activación de los neutrófilos, comprendiendo dicho método las
operaciones de:
- -
- obtener una muestra biológica, preferiblemente un fluido biológico, a partir de dicho mamífero, conteniendo dicha muestra preferiblemente dichas células o conteniendo la MPO liberada por dichas células,
- -
- capturar (inmunológicamente) la MPO que está presente en dicha muestra biológica, mediante anticuerpos específicos,
- -
- detectar y/o medir o bien una MPO total (activa e inactiva) o exclusivamente una MPO activa que está presente en dicha muestra biológca,
- -
- posiblemente comparar los valores medidos de MPO con unos niveles normales de MPO (es decir patrones de referencia o niveles patrones de MPO preestablecidos, usados como referencia) obtenidos a partir de un número importante (de más que 10, preferiblemente de más que 50, más preferiblemente de más que 200 o 1.000 individuos) de mamíferos "sanos" (es decir mamíferos que presentan unos niveles de MPO de mamífero y que no padecen de las enfermedades o de los síntomas, que se describen seguidamente) o cuantificar opcionalmente los niveles de MPO usando una curva de MPO patrón, y
- -
- relacionar los niveles de MPO medidos con un estado de actividad de dichos neutrófilos, que es indicativo de la presencia, la ausencia, o la condición de una enfermedad o de un estado inmunológico del paciente mamífero;
representando dicha detección y/o
dichas mediciones de una manera específica y exacta los niveles de
MPO totales o los niveles de MPO activa en cualquier tipo de muestra
biológica.
\vskip1.000000\baselineskip
Para medir el contenido de MPO total, se
desarrolló un método adicionalmente citado como de
MYELO-ELISA. Para medir los niveles de una enzima
MPO activa, se desarrolló un método citado adicionalmente como de
MYELO SIEFED.
En una realización preferida, dicho mamífero es
un caballo y dicha mieloperoxidasa (MPO) es una mieloperoxidasa
equina.
Preferiblemente, las curvas patrón y las
diluciones específicas de MPO se establecen para el método
específico de detección que se usa y, si fuese posible, para el tipo
de muestra analizada.
Ventajosamente, los valores de MPO medidos son
"normalizados" a la vista de los niveles medios de MPO
obtenidos a partir de un número importante de individuos o
mamíferos, preferiblemente caballos, sanos. Esto puede tener una
importancia particular, puesto que se observó que la respuesta de
neutrófilos puede ser altamente variable de un individuo a otro,
pero también de un día a otro para un solo y mismo individuo.
Ventajosamente, los niveles de MPO normalizados
pueden ser vinculados de manera vigilada a la ausencia o presencia
de una enfermedad y/o patología y pueden ser vinculados con una
condición o estado específica/o en ésta, comparando los niveles
medidos con unos valores de corte derivados a partir de mediciones
realizadas en un número importante de individuos con dicha
enfermedad y/o patología y/o en una condición y/o un estado
específica/o. Como tales, los métodos de acuerdo con el presente
invento se pueden usar también para hacer predicciones acerca de la
susceptibilidad de individuos y/o grupos para ciertas enfermedades
y/o patologías. Una predicción de este tipo podría ser muy útil en
sectores de la veterinaria, tales como la cría de caballos.
Ventajosamente, siguiendo los métodos de acuerdo
con el invento, el estado de activación de neutrófilos es detectado
y/o medido por medio de una reacción inmunológica en la que una MPO
es capturada (inmunológicamente) de manera específica (solamente
una MPO es capturada por un primer anticuerpo o por lo menos por la
porción hipervariable del mismo) preferiblemente en primer lugar a
través de anticuerpos que reconocen a una MPO, y/o luego se puede
detectar ya sea directamente a través de la reacción enzimática de
una MPO o a través de una reacción con un compuesto marcado
específicamente tal como un cromógeno, un fluorígeno o cualquier
otro tipo de marca, ya sea directamente (detección de una actividad
de MPO; MYELO-SIEFED) o indirectamente
("emparedado (sándwich) inmunológico" con un segundo
anticuerpo de MPO o por lo menos con una porción hipervariable del
mismo y posiblemente con un anticuerpo adicional portador de una
enzima, que puede reconocer al segundo anticuerpo, seguido por la
detección de esta actividad de enzima;
MYELO-ELISA).
Dicho primer anticuerpo que reconoce a una MPO o
que es específico para una MPO puede ser un anticuerpo policlonal o
monoclonal o su porción hipervariable o fragmento del mismo, un
anticuerpo tratado por ingeniería genética tal como un anticuerpo
humanizado (todos ellos obtenibles por técnicas bien conocidas en la
especialidad) siempre que éste sea específico en su reconocimiento
de una MPO en un medio complejo que posiblemente contenga otros
tipos de peroxidasas.
Un aspecto del invento se refiere al primer
anticuerpo monoclonal o a su porción hipervariable, incitado/a
contra una MPO equina, que no estaba disponible hasta ahora.
Los métodos de acuerdo con el invento, en
particular el MYELO-ELISA y la
MYELO-SIEFED, son particularmente útiles para la
medición de una mieloperoxidasa equina y encuentran un uso ventajoso
en la medicina veterinaria, siendo usados los métodos en el
diagnóstico y/o la predicción de una susceptibilidad a enfermedades
que estén correlacionadas con una activación o desactivación de
neutrófilos, o siendo usados para evaluar el estado inmunológico de
un caballo. Los métodos SIEFED del invento son útiles también para
estudiar los efectos de ligandos (fármacos) que interactúan con una
mieloperoxidasa o para escrutar nuevos compuestos que interactúan
con una mieloperoxidasa.
Los métodos de acuerdo con el invento, que hacen
uso de anticuerpos específicos, no están restringidos a la medición
de una MPO equina que se origine a partir de neutrófilos. Ellos se
pueden prolongar con facilidad a la medición de una MPO de
mamíferos distintos de los caballos, incluyendo a los seres humanos.
Se deberá decir que el primer anticuerpo (o su porción
hipervariable) que reconoce específicamente a una MPO equina, no
reconoce a la de otras especies (Serteyn y colaboradores, 2003, Ann.
Méd. Vét. 147: 79-93). Anticuerpos específicos para
una especie se pueden incitar usando técnicas clásicas, si es que ya
no están disponibles (comercialmente). Los métodos del invento, en
particular el método SIEFED descrito, no se definen por lo tanto
para una MPO por si misma, sino que se pueden prolongar fácilmente a
otras enzimas, incluyendo, pero sin limitarse a,.una elastasa, una
tripsina,.... .
La muestra o el medio biológica/o es
preferiblemente un fluido biológico que se puede obtener a partir de
dicho mamífero, preferiblemente de un caballo. Dicho fluido
biológico podría ser un fluido biológico celular o un fluido
biológico acelular. Dicho fluido biológico podría ser un suero o
plasma de sangre venosa y capilar, un fluido seminal, un fluido
bronquio-alveolar, un fluido pleural, un esputo, un
fluido nasal, fluidos ascíticos, un fluido sinovial, muestras
gástricas derivadas del vientre y de materiales fecales, o un fluido
cerebroespinal.
La muestra o el medio biológica/o podría ser
también un extracto obtenido a partir de diferentes tejidos de un
mamífero u otras/os muestras o medios biológicas/os complejas/os,
que pueden comprender también otras moléculas tales como proteínas
(albúmina, una lipoproteína) y agentes reductores que pueden
interferir con una adecuada medición de una MPO, tal como se observa
mediante ensayos conocidos en la especialidad.
Por lo tanto, contrariamente a los métodos del
estado de la técnica, tal como se describen por ejemplo en el
documento WO 99/61907, la detección inmunológica con métodos de
acuerdo con el invento permite averiguar la capacidad natural de
defensa o la aptitud de un mamífero para hacer frente a una
infección midiendo específicamente el contenido de mieloperoxidasa
que se origina a partir de células de neutrófilos, y las células de
neutrófilos
solamente.
solamente.
Los métodos de acuerdo con el invento se aplican
también a algunos ensayos específicos de diagnóstico ya propuestos
para el caballo, tales como la detección de enfermedades de origen
inflamatorio, que pueden afectar a dicho mamífero, especialmente al
caballo.
Seguidamente, se da alguna información más
detallada sobre los ensayos de MYELO-ELISA y de
MYELO-SIEFED (estuches o dispositivos) que se
desarrollaron (véanse las Fig. 1 y 2 para un esquema general). El
acrónimo ELISA representa a Enzyme - Linked Immuno Sorbent Assay
[ensayo de inmuno sorbente vinculado con enzimas] y el acrónico
SIEFED representa a Specific Immunological Extraction Followed by
Enzymatic Detection [extracción inmunológica específica seguida por
una detección enzimática].
El ensayo o método inmunológico de
MYELO-ELISA comprende las siguientes operaciones.
Primeramente, se captura inmunológicamente una peroxidasa a partir
de una muestra biológica tomada de un mamífero, preferiblemente un
caballo, sano o sospechoso de estar enfermo. La captura inmunológica
se realiza específicamente por unos primeros anticuerpos
inmovilizados sobre un soporte sólido tal como una superficie de
material plástico de una placa de múltiples pocillos). La operación
de capturar es seguida por la fijación de la mieloperoxidasa
inmovilizada de otro anticuerpo (el segundo anticuerpo), que es
acoplada con un marcador enzimático, usado para revelar la reacción
entre los primeros anticuerpos y la mieloperoxidasa. Dichos
anticuerpos específicos para una MPO se obtienen con una molécula
de mieloperoxidasa altamente purificada, que puede ser una
mieloperoxidasa natural o recombinante. De manera preferida, se usa
una mieloperoxidasa recombinante.
El ensayo inmunológico (estuches o dispositivos)
o el método de (MYELO)SIEFED es un método nuevo e inventivo
que comprende las siguientes operaciones. Primeramente se realiza la
captura de una enzima, por ejemplo de una mieloperoxidasa, obtenida
a partir de una muestra de un mamífero, preferiblemente de una
muestra de un caballo. La muestra puede ser tomada a partir de un
individuo sano o de uno sospechoso de estar enfermo. La enzima que
se ha de medir y/o detectar es capturada por un primer anticuerpo
específico inmovilizado (inmovilizado sobre un soporte sólido
insoluble, tal como una superficie de material plástico). La captura
(inmunológica) de la enzima, por ejemplo una MPO, es seguida luego
por una operación de lavado, en la que son eliminados por lavado
los componentes que puedan interferir con la medición. La actividad
enzimática de dicha enzima, por ejemplo una mieloperoxidasa, fijada
sobre su primer anticuerpo específico, se determina luego mediante
técnicas específicas que se describen aquí a continuación. Esta
técnica no requiere ninguna operación de purificación extensa y
laboriosa, que podría ser requerida por lo demás, cuando se trabaja
con muestras complejas.
Otro aspecto del presente invento concierne a
estuches (o estuches de partes o dispositivos) para ensayos
inmunológicos que comprenden los elementos para realizar por lo
menos la operación de estos dos ensayos inmunológicos (ensayos
inmunológicos de MYELO-ELISA y de (MYELO-)SIEFED).
Dichos elementos pueden incluir los anticuerpos que reconocen a una
MPO, marcados posiblemente y fijados preferiblemente sobre soportes
sólidos (tales como placas de pocillos múltiples (de cualquier
formato) o perlas), cromógenos y otros substratos, tampones,
diluyentes o soluciones de lavado, agentes de bloqueo, ... .
En una realización de acuerdo con el presente
invento, los estuches (o dispositivos) son estuches de partes (que
comprenden preferiblemente diferentes partes de los elementos para
realizar las operaciones del método).
Otro aspecto del invento se refiere a unos
dispositivos para detectar el estado de activación de células de
neutrófilos, que comprenden uno de los estuches de ELISA y/o de
SIEFED antes descritos.
Una realización particular del invento concierne
a un estuche o método de ELISA en emparedado, con el que el segundo
anticuerpo es reconocido por un anticuerpo de "revelación"
marcado con una enzima, tal como una fosfatasa alcalina, que
permite la detección del complejo inmunológico [el primer anticuerpo
inmovilizado que reconoce a una MPO - una MPO - el segundo
anticuerpo que reconoce a una MPO]. Virando a un substrato para dar
un producto de reacción coloreado, fosforescente o fluorescente, la
enzima que está unida con dicho segundo anticuerpo permite la
detección y/o cuantificación de la molécula de MPO fijada que está
presente en la muestra. En una forma de realización particular del
invento, el anticuerpo de "revelación" estaba marcado con una
fosfatasa alcalina y el substrato era fosfato de
N-nitro-fenilo. Muchas/os otras/os
marcas y substratos apropiadas/os son conocidas/os sin embargo para
la persona experta en la especialidad.
Otra forma de realización del invento se
relaciona con un método, un estuche y un dispositivo de
MPO-SIEFED, en los que la MPO presente en la
muestra es capturada por anticuerpos específicos inmovilizados. En
este caso particular, su actividad enzimática se detectaba mediante
un producto de reacción fluorimétrica de un substrato, tal como
Rojo Amplex®
(10-acetil-3,7-dihidroxi-fenoxazina,
que es un "fluorógeno") cuando dicho substrato es añadido a la
MPO fijada en la presencia de H_{2}O_{2}. Muchas/os otras/os
técnicas y medios de detección están disponibles para la persona
experta en la especialidad.
Se encontró sorprendentemente que la
sensibilidad de detección del método de MPO-SIEFED
podría ser aumentada de una manera importante por la adición de
unos nitritos que tienen una fluorescencia significativamente
intensificada. La cantidad preferida de un nitrito
(NO_{2}^{-}), que se ha de añadir a la mezcla de reacción, está
comprendida entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 0,7 mg/ml
y preferiblemente es de alrededor de 0,2 mg/ml. Un nitrito se añade
preferiblemente en la forma de una sal tal como una sal de Na o
cualquier otra sal de un metal alcalino o
alcalino-térreo (tal como las sales de Li, K, Rb,
Cs, Be, Mg, Ca, Sr) excepto las sales tóxicas (tales como
presumiblemente las sales de Ba, Ra o Fr). Una amplificación de la
señal de detección hace posible medir y detectar con exactitud la
actividad enzimática de una enzima, por ejemplo la de una MPO que se
origina a partir de neutrófilos, en los medios, los tejidos o las
muestras (biológicos/as) más complejos/as.
En una forma de realización particular y
preferida del invento, la sensibilidad de la detección enzimática
se aumentó en al menos 2 veces, preferiblemente en al menos 5 veces,
lo más preferiblemente en al menos 10 veces o 20 veces, usando un
nitrito como agente intensificador de la fluorescencia.
Esta técnica de intensificación de la
fluorescencia es aplicable igualmente bien a la detección de otras
actividades de peroxidasas, y es aplicable no solamente a los
métodos, los estuches y los dispositivos que se han descrito, sino
también a cualquier método o estuche de detección que pueda requerir
el uso de una enzima peroxidasa.
Un aspecto particular del presente invento se
refiere al uso de un nitrito para intensificar la detección
enzimática de peroxidasas. Se encontró que un nitrito en particular
aumenta una señal fluorescente inducida por la
10-acetil-3,7-dihidroxi-fenoxazina.
El interés de las técnicas de detección arriba
descritas (métodos, estuches y dispositivos de ELISA y SIEFED) es
que ellas permiten conocer por separado, si se necesitase, la
concentración de una MPO total (formas activas e inactivas de una
enzima; mediante un MYELO ELISA) y la concentración de la forma
activa solamente (mediante una MYELO-SIEFED) que se
ha puesto en libertad y/o está presente en muestras biológicas, que
pueden ser unas muestras complejas.
Durante unos procesos inflamatorios
incontrolados, una liberación de una mieloperoxidasa activa en
fluidos biológicos (p. ej. en sangre) podría ser perjudicial para
las células o los tejidos circundantes. Unos bioensayos (estuches o
dispositivos) de SIEFED permiten una determinación de la parte
activa de la enzima (potencialmente tóxica) mientras que unos
bioensayos (estuches o dispositivos) de ELISA darán información
acerca de la concentración de la enzima. Ambos ensayos son, por lo
tanto, complementarios.
Las aplicaciones potenciales de los ELISA y
SIEFED para una mieloperoxidasa (equina) en particular son:
- -
- la evaluación de la intensidad de una activación de neutrófilos y de una reacción inflamatoria sistémica o local en patologías de inflamación aguda o crónica (sepsis, choque séptico, patologías de inflamación pulmonar, patologías intestinales, laminitis),
- -
- el seguimiento de la activación de neutrófilos durante una terapia (estudio de los efectos de fármacos administrados al paciente, preferiblemente a un caballo), tomando muestras del mismo individuo o mamífero enfermo (preferiblemente de un caballo) en diferentes intervalos de tiempo, con lo que el estado de activación de neutrófilos puede ser seguido y vigilado en el tiempo,
- -
- el diagnóstico precoz o la predicción de algunas patologías,
- -
- la evaluación de la capacidad de los neutrófilos para destruir a microorganismos (evaluación en neutrófilos aislados), un ensayo que se ha aplicar en patologías de inmunosupresión,
- -
- la evaluación de la capacidad de defensa natural o la aptitud de un individuo o de un grupo de individuos para luchar contra infecciones,
- -
- la medición de la captura de una mieloperoxidasa por otras células (en relación con su aptitud para luchar contra microorganismos y/o para destruirlos),
- -
- el escrutinio y la selección de unos compuestos que posiblemente se inducen con la MPO y que posiblemente afectan a la actividad de esta MPO.
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto, el estuche o dispositivo de
acuerdo con el invento es preferiblemente un estuche o dispositivo
de escrutinio con alto caudal de realización, que comprende unos
elementos para medir, escrutar, seleccionar y posiblemente
recuperar compuestos activos. Dichos "compuestos activos" son
unos elementos seleccionados entre el conjunto que se compone de
moléculas sintetizadas química o biológicamente (incluyendo a los
anticuerpos), nuevas moléculas naturales purificadas,
microorganismos o extractos de plantas o animales, o una mezcla de
los/as mismos/as. Estos compuestos son preferiblemente agentes
inhibidores de MPO (agentes inhibidores reversibles o
irreversibles). El término de "un agente inhibidor de enzimas"
se refiere a un compuesto o agente que se combina con una enzima de
una manera tal que se impide la combinación normal entre un
substrato y una enzima y la reacción catalítica. Preferiblemente,
dicho estuche o dispositivo está basado en un método que comprende
las operaciones de
- -
- capturar una MPO activa (preferiblemente por medio de un anticuerpo específico para la MPO, o de una porción hipervariable del mismo) fijada a un soporte sólido, preferiblemente el soporte sólido del estuche o dispositivo de SIEFED de acuerdo con el invento,
- -
- posiblemente medir una actividad de MPO, preferiblemente por el método de SIEFED antes descrito,
- -
- añadir uno o más compuestos a la MPO activa (fijada al anticuerpo o a una porción hipervariable del mismo),
- -
- medir una actividad de MPO después de una adición del(de los) compuesto(s) y preferiblemente después de una operación de lavado del(de los) compuesto(s) no fijado(s),
- -
- posiblemente comparar una actividad de MPO antes o después de una adición del(de los) compuesto(s), y
- -
- posiblemente recuperar el (los) compuesto(s) que interactúa(n) con la MPO.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se examina la aptitud de células
distintas de neutrófilos para luchar contra microorganismos y/o para
destruirlos, los bioensayos que se han descrito anteriormente se
aplican entonces a unas muestras que contienen dicho otro tipo de
células. Comparando los niveles de MPO obtenidos para dichas células
con los niveles de MPO de neutrófilos de los individuos sanos, se
puede hacer una estimación de la capacidad o aptitud de dichas
células para luchar contra infecciones causadas por
microorganismos.
Las técnicas de detección anteriores (métodos,
estuches o dispositivos) pueden encontrar además un uso ventajoso
en el estudio de la eficiencia de ciertos medicamentos tales como
agentes inmunomoduladores. Luego los niveles de MPO de neutrófilos,
que han estado en contacto por ejemplo con dichos agentes
inmunomoduladores, se comparan entonces con unos niveles de MPO de
células de neutrófilos no tratadas, siendo dichos niveles de MPO una
indicación del estado de activación de neutrófilos y/o de su aptitud
para luchar contra, y/o destruir, a los microorganismos.
Los métodos de detección de acuerdo con el
invento son en particular útiles en la predicción, el diagnóstico,
posiblemente en una etapa muy temprana y precoz, y/o en el
seguimiento de una de las siguientes patologías o enfermedades:
enfermedades inflamatorias, patologías digestivas, patologías
intestinales estranguladas, sepsis, choque séptico, patologías
pulmonares crónicas y agudas (con invasión de los alvéolos por
neutrófilos), patologías de reperfusión de isquemias, patologías
articulares (con una presencia de neutrófilos en las juntas o
articulaciones), cólicos, alergias, infecciones, enfermedades
cardiovasculares, .... .
El método, el estuche o el dispositivo de
detección de SIEFED de acuerdo con el invento son además
particularmente útiles para la evaluación in vitro de la
capacidad inhibidora sobre la actividad de mieloperoxidasa de
fármacos (ya sea productos naturales obtenidos a partir de
extractos de plantas o de un origen animal, o moléculas
sintetizadas de nuevas), permitiendo distinguir entre un efecto
neutralizador de dichos fármacos sobre los productos de una
actividad de mieloperoxidasa (actividad antioxidante
estequiométrica) o una actividad inhibidora directa sobre la
función de la enzima propiamente dicha (actividad
anti-catalítica).
Un último aspecto se relaciona con el compuesto
que interactúa con una actividad de MPO, y que es recuperado por el
método de acuerdo con el invento, preferiblemente un compuesto
terapéutico o profiláctico, que se podría usar en el tratamiento de
uno/a o más de los síntomas o de las enfermedades que antes se han
descrito.
De una manera más general, comparando los
niveles de una MPO medidos mediante técnicas de ELISA (se miden las
MPO activas e inactivas) y técnicas de SIEFED (solamente se mide la
MPO activa) se puede ensayar la eficiencia de técnicas de
purificación.
La Fig. 1 representa un esquema general de un
MYELO-ELISA
La Fig. 2 representa un esquema general de una
MYELO-SIEFED con amplificación o intensificación de
la fluorescencia.
La Fig. 3 representa las operaciones principales
de purificación de una MPO: como se visualiza con una electroforesis
de una MPO equina pura en condiciones no reductoras [A], en
condiciones reductoras [A(R)], y en condiciones no reductoras
con detección de la actividad enzimática sobre el gel [A
(O-dianisidina)]. Las operaciones de purificación
comprendían el aislamiento de leucocitos polimorfonucleares (PMN) a
partir de sangre, extracción de los PMN, diálisis, cromatografía
(intercambio de cationes, filtración a través de gel) y
electroforesis.
La Fig. 4 representa los resultados de un ensayo
de inmunodifusión para una IgG de conejo (1) y para una IgG de
cobaya (2), obtenidas contra una MPO equina. Los anticuerpos usados
en este ensayo eran unos anticuerpos (IgG) policlonales, purificados
por una cromatografía de afinidad sobre proteína A Sepharose.
La Fig. 5 representa curvas patrones de una MPO
para un MYELO-ELISA realizado con anticuerpos
policlonales: antes (A) y después (B) de una transformación
logarítmica (n = 10). Los valores medios de DO (densidad óptica),
las desviaciones típicas (DT) y los coeficientes de variación (CV)
se dan en las correspondientes tablas.
La Fig. 6 representa curvas patrones de una MPO
para un MYELO-ELISA realizado con anticuerpos
monoclonales; antes (A) y después (B) de una transformación
logarítmica (n = 10). Los valores medios de DO, las desviaciones
típicas (DT) y los coeficientes de variación CV se dan en la
correspondiente tabla. Se encontró que las curvas son lineales para
unas concentraciones de la MPO que fluctúan entre 3,125 y 50
ng/ml.
La Fig. 7 representa una variación dentro de un
ensayo (intra) para unos ensayos de MYELO-ELISA
realizados con anticuerpos monoclonales. Unos plasmas con EDTA,
tomados a partir de caballos con patologías (Patho) o sin ellas (N),
se diluyeron en 40 veces. Los valores medios de DO, las desviaciones
típicas (DT) y los coeficientes de variación (CV) se dan en la
correspondiente tabla.
La Fig. 8 representa una variación entre ensayos
(inter) para unos ensayos de MYELO-ELISA realizados
con anticuerpos policlonales. Los plasmas con EDTA tomados a partir
de caballos con patologías (Patho) o sin (N) se diluyeron en 40
veces. Los valores medios de DO, las desviaciones típicas (DT) y los
coeficientes de variación (CV) se dan en la correspondiente
tabla.
La Fig. 9 representa los efectos de una dilución
de muestras sobre los valores de MPO medidos por medio de un ELISA
en un suero y un plasma (A) y sobre los valores de MPO medidos por
medio de un ELISA en el material sobrenadante de neutrófilos equinos
estimulados (PMN A) o no estimulados (PMN NA) (n = 3).
La Fig. 10 representa los resultados de una
MYELO-SIEFED realizada con anticuerpos monoclonales:
antes (A) y después (B) de una transformación lineal (n = 3). Los
valores medios de DO, las desviaciones típicas (DT) y los
coeficientes de variación (CV) se dan en la correspondiente tabla.
Período de tiempo de incubación de una MPO con anticuerpos
inmovilizados: 2 h a 37ºC. La actividad enzimática se detectó con
Rojo Amplex® como substrato.
La Fig. 11 representa una curva patrón de MPO
para una MYELO-SIEFED realizada con anticuerpos
monoclonales: antes (A) y después (B) de una transformación lineal
(n = 3). Los valores medios de DO, las desviaciones típicas (DT) y
los coeficientes de variación (CV) se dan en la correspondiente
tabla.
La Fig. 12 representa una curva patrón de una
MPO para una MYELO-SIEFED y muestra el efecto
positivo de añadir nitritos como agente intensificador de la
reacción enzimática cuando se usa Rojo Amplex® como substrato
(MYELO-SIEFED+).
La Fig. 13 demuestra que una
MYELO-SIEFED realizada con anticuerpos policlonales
se puede usar de una manera eficiente para la detección y la
medición de una actividad enzimática de MPO en muestras biológicas.
Se debería hacer una distinción entre los niveles de MPO de
neutrófilos no estimulados (PMN) y de neutrófilos que fueron
estimulados por acetato miristato de forbol (PMN + PMA). Se usaron
números crecientes de PMN.
La Fig. 14 demuestra que una
MYELO-SIEFED se puede usar eficientemente para
detectar y medir una actividad enzimática de una MPO en diferentes
muestras biológicas, tales como un plasma y un líquido seminal, y
que se puede hacer una distinción entre muestras normales (sanas) y
patológicas. DT: desviación típica; CV: coeficiente de variación; N:
muestras normales; P: muestras patológicas.
La Fig. 15 representa recuentos absolutos de
neutrófilos (expresado en número de células 10^{4}/ml) (Abs N); el
número relativo de neutrófilos (en %) (Rel N) y BAL MPO (ng/ml)
(MPO) procedentes de 7 caballos henchidos ya sea en crisis o después
de 2 meses consumiendo pasto, y de caballos sanos testigos
(significativamente diferentes de los caballos sanos y caballos
henchidos en remisión; + significativamente diferentes de los
caballos sanos).
La Fig. 16 representa el efecto inhibitorio de
la curcumina sobre la liberación de MPO por neutrófilos incubados en
un tampón PBS con o sin estimulación con acetato miristato de forbol
(PMA) (la curcumina (Curcu) se había disuelto en etanol. Una MPO se
midió por un ELISA en el material sobrenadante de neutrófilos
activados).
La Fig. 17 representa el efecto inhibidor de la
curcumina sobre la actividad de una MPO. La concentración de la MPO
usada era de: 9 ng/ml. El período de tiempo de incubación de la
curcumina con la MPO antes de un ensayo por SIEFED era de 30 min.
(La solución de curcumina más concentrada se preparó en etanol (175
mM) y se realizaron diluciones de esta solución concentrada con un
tampón PBS).
El presente invento se describirá ahora con
detalle en la siguiente descripción de realizaciones preferidas del
presente invento, haciendo referencia a las figuras adjuntas.
Los Ejemplos dados a continuación se ofrecen por
vía de ilustración, no por vía de limitación.
Una MPO se extrajo a partir de leucocitos
polimorfonucleares (PMN) equinos aislados a partir de una sangre
entera, por sedimentación en un gradiente de densidades
Ficoll-Paque. La purificación se realizó, con
algunas modificaciones, siguiendo una técnica anteriormente
descrita (por Mathy-Hartert y colaboradores 1998,
Can J Vet Res. 62:127-32). Dicho brevemente, unos
neutrófilos empaquetados fueron homogeneizados en un tampón de
acetato de sodio (0,2 M de acetato de Na; 1 M de NaCl; pH 4,7) que
contenía bromuro de
cetil-trimetil-amonio (CETAB) al
1%. El material sobrenadante se recogió por centrifugación y se
dializó. La diálisis permitió una precipitación de una elastasa y
de catepsina G, mientras que la MPO fue recuperada en el material
sobrenadante. La MPO se purificó adicionalmente por medio de dos
operaciones de cromatografía: un intercambio de iones (Hiload SP
Sepharose) con un gradiente de NaCl, seguido por una cromatografía
con filtración a través de gel en Hiload Superdex 200 (elución con
un tampón de NaCl y acetato). La pureza de la MPO fue comprobada
mediante ensayos enzimáticos (con la técnica de
orto-dianisidina) y por electroforesis sobre geles
de poli(acrilamida) (ExcelGel de SDS, gradiente
8-18) (Fig. 3).
Para la producción de anticuerpos policlonales,
se incitaron unos antisueros en conejos y cobayas mediante una
inyección intradérmica de 100 \mug de una MPO equina pura. Se
administraron inyecciones de refuerzo a intervalos de 15 días con
50 \mug de la MPO. Se recogieron muestras de sangre a los 10 días
después de cada inyección de refuerzo. Después del último refuerzo,
se sacó sangre de los dos animales. La purificación de los
anticuerpos policlonales (inmunoglobulina, o IgG) procedentes de
antisueros se realizó mediante una cromatografía de afinidad sobre
una columna de proteína A Sepharose. La reactividad de los dos
anticuerpos contra una MPO equina se ensayó cualitativamente por
inmunodifusión (técnica de Ouchterlony) (Figura 4).
Los anticuerpos monoclonales y los
correspondientes hibridomas se han obtenido y ensayado en cuanto a
su reactividad contra una MPO equina. Entre varios hibridomas
convenientes, se seleccionaron dos de ellos para a la producción de
anticuerpos monoclonales que se han de usar en las técnicas ELISA y
SIEFED.
Para la medición del estado de activación de
neutrófilos por medición de las MPO tanto activas como inactivas
(1) se diseñó un clásico método ELISA "en emparedado" (Figura
1). El ELISA desarrollado para la medición de una MPO (1) es citado
adicionalmente como un MYELO-ELISA. Una IgG de
conejo, el anticuerpo primario (2), se inmoviliza (aplica como
revestimiento) en un exceso (de 3 \mug/ml) sobre pocillos de
microtitulación (3) (Cliniplate EB, Labsystem). Un antígeno patrón
o de ensayo (de MPO equina (1)) se incuba durante una noche con el
anticuerpo primario (2) a 4ºC. Después de haber lavado (con una
solución de NaCl al 0,9% que contiene 0,1% de Tween 20), el
complejo inmovilizado de un anticuerpo y un antígeno se incuba
(durante 2 h, a 37ºC) con un exceso (5 \mug/ml) de IgG de cobaya,
el anticuerpo secundario (4). Después de haber lavado, se añade un
tercer anticuerpo (5) producido contra IgG de cobaya. Esta tercera
IgG (5) (IgG de cabra) se marca con una fosfatasa alcalina (6) y
reconoce al complejo "en emparedado" de "un anticuerpo
primario - una MPO - un anticuerpo secundario". Después de haber
lavado, la actividad de fosfatasa se detecta por incubación (durante
30 min, a 37ºC en la oscuridad) con una solución de fosfato de
para-nitro-fenilo (substrato para
fosfatasa, de Sigma). La reacción es detenida con NaOH y la
absorbencia (a 405 nm) se mide con un aparato Multiscan Ascent (de
Labsystems) (7). Todos los volúmenes añadidos dentro de los pocillos
comprenden 100 \mul, excepto los de lavado (300 \mul) y los de
la solución de substrato (200 \mul). Los testigos (en blanco) y
las diluciones de una MPO patrón y de las muestras se establecieron
con un tampón de dilución [PBS (20 mM de un fosfato, 137 mM de NaCl
y 2,7 mM de KCl, de pH 7,4) al que se añadieron 5 g/l de albúmina de
suero bovino y 0,1% de Tween 20].
La misma técnica de ELISA se desarrolló también para anticuerpos monoclonales como anticuerpo primario.
La misma técnica de ELISA se desarrolló también para anticuerpos monoclonales como anticuerpo primario.
La respuesta de absorbencia obtenida con dichos
ensayos de ELISA es directamente proporcional a la cantidad de
complejo en emparedado formado, en otras palabras, a la
concentración de MPO en la muestra.
La técnica de SIEFED ("specific
immunological extraction followed by
enzymatic detection") es una técnica de detección
inmunológica que consta de dos operaciones:
- -
- la captura de una enzima tal como una MPO (equina) (1) procedente de muestras biológicas, mediante anticuerpos específicos inmovilizados (2), seguida por
- -
- la detección enzimática de la enzima tal como una MPO (1) inmovilizada sobre los anticuerpos que están aplicados como revestimiento sobre un soporte sólido (3) (Figura 2).
Al contrario que el ensayo de ELISA antes
descrito, las técnicas de SIEFED miden solamente a una MPO activa.
De una cierta manera, ambos ensayos son por lo tanto
complementarios.
Como para el ensayo de ELISA, el anticuerpo
primario, que captura a una MPO, es IgG de conejo (33 \mug/ml).
Una MPO patrón o una muestra desconocida se incuba durante 2 h a
37ºC. Después de haber lavado, la actividad de peroxidasa de la MPO
se detecta añadiendo 100 \mul de una solución de H_{2}O_{2} 10
mM y 40 mM de Rojo Amplex®
(10-acetil-3,7-dihidroxi-fenoxazina;
de Molecular Probes) en un tampón de fosfato (50 mM, pH 7,5).
Después de una incubación en la oscuridad (durante 30 min, a 37ºC),
se lee la fluorescencia a 590 nm con un aparato Fluoroskan Ascent
(de Labsystems). Los volúmenes del anticuerpo primario y de la
muestra colocada en los pocillos, son de 200 \mul. Los testigos
(en blanco) y las diluciones de las muestras se establecen con un
tampón para dilución.
La misma técnica se desarrolló para anticuerpos
monoclonales, que reconocen a la forma activa de MPO.
Una técnica original de intensificación de la
respuesta a peroxidasas de una MPO ha sido desarrollada, conduciendo
a una respuesta de fluorescencia aumentada y a un aumento de la
sensibilidad de la MYELO-SIEFED. La intensificación
de la fluorescencia se obtuvo sorprendentemente cuando se añadió una
concentración definida de iones de nitrito (aproximadamente 10 mM)
a la solución de Rojo Amplex®. Esta técnica de intensificación de la
sensibilidad es aplicable a la detección enzimática de otras
peroxidasas, así como también en otros procesos de detección médicos
o industriales.
La electroforesis de una MPO equina purificada
muestra 3 bandas: dos con un peso molecular próximo a 120 kDa
(enzima nativa) y una con 96 kDa (precursora) (Fig. 3). Cuando una
MPO es tratada con ditiotreitol (antes de cargar sobre el gel con
el fin de romper los puentes internos de disulfuro y de poner en
libertad la estructura de subunidades de la enzima), permanece la
banda de 46 kDa, desaparecen las bandas de 120 kDa y aparecen dos
bandas de 64 kDa y 16 kDa que corresponden respectivamente a las
subunidades pesada y ligera de la enzima. Una banda débilmente
teñida aparece también con un peso molecular de 40 kDa, que puede
resultar de la rotura de un puente de disulfuro intramolecular, o
que representa a la subunidad pesada sin el grupo protésico. Otra
banda débil aparece con 76 kDa, que podría ser atribuida a la
hemi-enzima (subunidades pesada y ligera). La
actividad de peroxidasa (definida como la tinción de las bandas de
proteínas sobre el gel mediante orto-dianisidina en
la presencia de H_{2}O_{2}) mostró actividad en la bandas de 120
kDa en condiciones no reductoras.
\vskip1.000000\baselineskip
Una buena reactividad (presencia de arcos de
precipitación) se observó entre una MPO equina y una IgG de conejos
y cobayas (Fig. 4, técnica de detección de Ouchterlony). Se obtienen
unos resultados similares con varios anticuerpos monoclonales, dos
de los cuales se seleccionaron para un desarrollo adicional del
ELISA y de la SIEFED.
\vskip1.000000\baselineskip
Una curva patrón de MPO se obtuvo representando
gráficamente los valores de la absorbencia a 405 nm como una
función de concentraciones de MPO patrones medidas por medio del
ensayo ELISA desarrollado. Esta curva patrón es una de tipo
clásico, que alcanza una meseta para las más altas concentraciones
de MPO. Se obtiene una curva casi lineal cuando las concentraciones
de MPO se expresan en la forma logarítmica (Fig. 5). La tabla
mostrada en la Fig. 5 enumera los valores de la absorbencia (405
nm), de la desviación típica (DT) y del coeficiente de variación
dentro de un ensayo (CV en %) que se obtuvieron para una serie de
diluciones en 2 veces de MPO equina que fluctuaba entre 0,78 y 100
ng/ml de MPO en el tampón para dilución (para la composición: véase
el Ejemplo 3).
Las curvas patrones obtenidas con un anticuerpo
monoclonal se muestran en la Fig. 6. Los resultados son similares a
los obtenidos con los anticuerpos policlonales (Fig. 5).
Las curvas patrones de MPO permiten una
cuantificación de la cantidad de MPO detectada. Una vigilancia de
la progresión de una enfermedad se beneficia de dicha
cuantificación. Comparando los niveles medios de MPO de individuos
sanos con los de individuos enfermos, se pueden establecer unos
valores de corte que permiten una distinción entre mamíferos sanos
y enfermos. Preferiblemente, dichos valores de corte son
establecidos para las diferentes muestras biológicas ensayadas en
cuanto a los niveles de MPO de neutrófilos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los niveles de una MPO se detectaron en unas
muestras biológicas que se componían de un plasma sacado a partir
de sangre con diferentes agentes anticoagulantes (EDTA, citrato,
heparina), de un suero (Fig. 9A) o de un material sobrenadante
aislado a partir de neutrófilos (PMM) estimulados o no estimulados
(Fig. 9B).
Se encontró que la óptima técnica de muestreo
para la medición de una MPO en un plasma (como testimonio verdadero
de una desgranulación de neutrófilos in vivo) es la de
recoger sangre sobre EDTA, lo cual permite obtener un valor de MPO
en plasma, que es estable con el tiempo. El plasma sacado sobre
heparina y el suero permiten una desgranulación in vitro de
neutrófilos, conduciendo a unos valores artificiales de MPO.
Una liberación importante de MPO se observó en
el material sobrenadante de neutrófilos excitados en comparación
con unos no excitados. Unos coeficientes de variación dentro de un
ensayo [intra] (Fig. 7) y entre ensayos [inter] (Fig. 8)
(testimonio de la precisión de la técnica) se establecieron para un
plasma tomado de caballos sanos y de caballos con patologías de
inflamación.
Las concentraciones más altas de MPO se
observaron en plasmas procedentes de caballos con patologías
intestinales estranguladas.
Lo antedicho demuestra que los ensayos del
presente invento son sensibles, exactos y claramente capaces de
establecer una distinción entre animales sanos y patológicos. Ellos
demuestran además que la medición de la MPO en plasma se puede
tomar como el testimonio de una activación de neutrófilos y está
correlacionada positivamente con ciertas patologías.
El ensayo se aplicó con éxito también a fluidos
peritoneales y líquidos seminales.
\vskip1.000000\baselineskip
Para el ensayo de ELISA desarrollado para una
MPO equina (MYELO-ELISA), la sensibilidad del ensayo
es de aproximadamente 2 mg/ml. Se obtienen unas buenas precisiones
dentro de un ensayo y entre ensayos para curvas patrones (inferiores
a 8%) y para muestras biológicas (generalmente inferiores a 10%).
El valor medio de MPO, medido en caballos normales, fue de 181,8
\pm 64,7 mg/ml en un plasma anticoagulado con EDTA (n = 38).
\vskip1.000000\baselineskip
En caballos, se conoce que una obstrucción
recurrente de las vías aéreas o henchimientos induce un aumento
intra-alveolar de neutrófilos tal como se observa en
fluidos de lavado bronquio-alveolares (BAL de
bronchoalveolar lavage fluids). Una mieloperoxidasa (MPO) es una
enzima específica de gránulos de neutrófilos con una fuerte
actividad oxidante, que con la máxima probabilidad desempeña un
cierto cometido en la inflamación pulmonar observada en caballos
que padecen de henchimientos. Ésta nunca se ha medido en un BAL de
caballo.
Siete caballos que padecen de henchimientos
fueron expuestos a un heno mohoso hasta que ellos alcanzaron un
cambio máximo en la presión pleural (\DeltaPplmax) > 15
CmH_{2}O. En este punto, se realizó un BAL. La citología del BAL,
es decir el recuento total de células y de los porcentajes de
neutrófilos se realizó inmediatamente, mientras que la
concentración de la MPO en un material sobrenadante de BAL
(centrifugación durante 10 minutos a 1.000 g) se determinó
inmediatamente usando un ensayo de inmunosorbente vinculado con
enzimas (ELISA) específico, con anticuerpos policlonales incitados
contra una MPO equina (patente nº 04447027.6). Los ensayos se
repitieron con los mismos caballos después de que éstos hubieron
pasado 2 meses consumiendo pasto. Seis caballos sanos sirvieron
como testigos. Los valores medios se compararon mediante un ANOVA, y
se consideró como significativa una probabilidad de > 0,05. La
relación entre los neutrófilos absolutos y relativos se comprobó por
regresión lineal de los datos recogidos.
Una exposición a un material mohoso indujo unos
aumentos significativos en la \DeltaPplmax (28,4 \pm 14,6
CmH_{2}O), en neutrófilos tanto absolutos como relativos así como
en el nivel de MPO (Figura 1). Después de 2 meses consumiendo
pasto, los caballos recuperaron un valor fisiológico de
\DeltaPplmax (8,1 \pm 0,7 CmH_{2}O), mientras que los números
absolutos y relativos de neutrófilos y la concentración de MPO
disminuyeron significativamente (Figura 15). No había diferencias
significativas entre los recuentos de neutrófilos de caballos
testigos y caballos henchidos en remisión, pero sus respectivas
concentraciones de MPO en BAL eran diferentes, siendo
significativamente más alto el nivel de MPO procedente de caballos
henchidos. Una correlación entre los niveles de MPO y los recuentos
de neutrófilos era significativa, con unos valores de R2 de 0,671 y
0,825 para neutrófilos relativos y absolutos, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los neutrófilos aislados a partir de la sangre
citratada de caballos sanos se recontaron, se suspendieron en una
solución salina de tampón de fosfato (PBS de phosphate buffer
saline) a un pH de 7,4 y se incubaron durante 10 min a 37ºC con
curcumina o con THC en la concentración final de 10^{-4},
10^{-5} o 10^{-6} M. Después de una incubación y de una
centrifugación (a 1000 x g, durante 10 min), los neutrófilos fueron
suspendidos de nuevo en una PBS y o bien activados durante 30 min
con 8x10^{-7} M de acetato miristato de forbol (PMA = phorbol
myristate acetate), con una vigilancia simultánea de la respuesta
quimioluminiscente en presencia de lucigenina (5x10^{-8} M), o
activados en las mismas condiciones, seguidas por una centrifugación
y una medición de la MPO en el material sobrenadante. La MPO,
marcadora de la desgranulación de neutrófilos, se midió mediante un
ensayo ELISA específico incitado contra una MPO equina. El efecto de
los polifenoles sobre una actividad de MPO se ensayó mediante un
método de SIEFED ("Specific Immunological Extraction Followed by
Enzymatic Detection") que permite el estudio de la interacción de
un fármaco con la enzima sin interferencias con el medio de
reacción.
La curcumina y la THC tenían ambas unos efectos
inhibidores dependientes de la dosis, sobre la respuesta de
quimioluminiscencia de neutrófilos activados y la liberación de MPO
por neutrófilos activados, y sobre la actividad de MPO. Los
porcentajes de inhibición fueron de 70%, 44% y 60% para la curcumina
(10^{-5} M) y de 12%, 18% y 22% para la THC (10^{-5} M), sobre
la quimioluminiscencia, la liberación de MPO y la actividad de MPO,
respectivamente. La más alta eficacia de la curcumina puede ser
explicada por lo menos parcialmente por su estructura química. Los
dobles enlaces conjugados y la estructura plana de la curcumina
parece que hacen que sea más fácil la neutralización de las
especies de radicales generados por neutrófilos activados y la
interacción del fármaco con el sitio activo de la MPO. Estos efectos
inhibidores de la curcumina sobre neutrófilos equinos y sobre la
actividad de MPO hacen surgir perspectivas terapéuticas en
patologías equinas con excesivas reacciones inflamatorias.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad enzimática de una MPO produce HOCl
(ácido hipocloroso) o NaOCl (hipoclorito de sodio) y otras especies
oxidantes potencialmente tóxicas, si la enzima actúa directamente en
contacto con tejidos o dentro de las células, por consiguiente en
sitios distintos que en el fagolisosoma. La MPO puede estar presente
en fluidos biológicos en una forma inactiva (inhibición por
oxidación o mediante agentes inhibidores específicos). Es
interesante distinguir a la MPO activa con respecto de su forma
inactiva en muestras biológicas.
Una medición enzimática directa de una MPO en
fluidos biológicos es imposible por la presencia de proteínas,
principalmente de albúmina. Antes de una medición en un medio
biológico complejo, la enzima hubiera tenido que haber sido
extraída por unos largos procesos de purificación, que implicaban
una separación por cromatografía. La originalidad de la técnica de
SIEFED se encuentra en el hecho de que una MPO activa puede ser
detectada realizando solamente dos fáciles operaciones, que son la
captura de una MPO equina a partir de la muestra biológica mediante
anticuerpos inmovilizados específicos, seguida, después de un lavado
(eliminación de albúmina y de otras proteínas), por una detección
directa de la actividad enzimática con un substrato apropiado
(principalmente con alta sensibilidad).
Indirectamente, la técnica de SIEFED indicará
cualesquiera anomalías que puedan haber surgido durante un
aislamiento y una purificación de MPO.
\vskip1.000000\baselineskip
Una curva patrón de una MPO se obtuvo
representando gráficamente los valores de la fluorescencia
(correspondientes a una actividad de MPO), leídos a 590 nm, como una
función de las concentraciones de MPO patrones medidas con el ensayo
de SIEFED desarrollado.
Una curva patrón obtenida con unas
concentraciones crecientes de una MPO se muestra en la Fig. 10A. Se
obtiene una curva casi lineal con la transformación matemática de
los valores de la fluorescencia (Fig. 10B). La correspondiente
tabla de la Fig. 10 enumera los valores medios de la absorbencia, la
desviación típica y el coeficiente de variación dentro de un ensayo
(CV (%)) como una indicación de la precisión del ensayo) que se
obtuvieron para las concentraciones medidas de la MPO (serie de
diluciones en 2 veces). El período de tiempo de reacción con Rojo
Amplex fue de 30 min. El período de tiempo de incubación de la MPO
con un anticuerpo policlonal inmovilizado fue de 2 h a 37ºC.
Una curva patrón similar se obtuvo cuando se
usaron anticuerpos monoclonales (Fig. 11).
La adición de iones de nitrito (aproximadamente
10 mM) en la forma de una sal (la sal de sodio) al medio de reacción
podría intensificar hasta en diez veces la sensibilidad del ensayo
de SIEFED (Fig. 12).
\vskip1.000000\baselineskip
Los niveles de MPO se midieron a través del
ensayo de SIEFED desarrollado en muestras biológicas que se
componían de un plasma, un suero, un líquido seminal (Fig. 12) y un
material sobrenadante aislado a partir de neutrófilos (PMN)
excitados o no excitados (Fig. 13).
Los niveles de MPO se pueden medir a través de
una SIEFED en muestras biológicas, diluidas o sin diluir. Las
muestras concentradas tienen con frecuencia que ser diluidas para
evitar una interferencia de proteínas presentes (abundantemente) en
el medio biológico, especialmente de albúmina. La adición de un
agente intensificador (nitritos) de la actividad enzimática de una
peroxidasa permite usar una dilución de las muestras en cinco
veces.
\vskip1.000000\baselineskip
La sensibilidad del ensayo de SIEFED para una
MPO equina activa, desarrollado con anticuerpos policlonales o
monoclonales, y la adición del agente intensificador nitrito era de
aproximadamente 0,2 mg/ml. Se obtuvo una buena precisión dentro de
un ensayo para curvas patrones y para muestras biológicas (inferior
a 10%).
\vskip1.000000\baselineskip
La SIEFED se aplicó al estudio de los efectos de
dos polifenoles naturales (curcumina y resveratrol) sobre una
actividad de MPO. La incubación del polifenol con una MPO, seguida
por la captura de la MPO, un lavado y una detección enzimática,
mostraron un efecto directo inhibidor, dependiente de la dosis, de
curcumina o de resveratrol sobre una actividad de MPO. Estos
resultados (Figuras 16 y 17) sugieren una interacción directa entre
el fármaco y la enzima o una modificación de la estructura
enzimática por el fármaco.
La Tabla 1 representa los efectos inhibidores de
curcumina y de tetrahidro-curcumina sobre una
mieloperoxidasa liberada por neutrófilos equinos activados. Las
enzimas totales se midieron por un ELISA y las enzimas activas se
midieron por una SIEFED (la inhibición medida resulta de una
interacción directa entre la enzima y su agente inhibidor).
Claims (26)
1. Un método in vitro para medir el
estado de activación de células de neutrófilos en una muestra
biológica obtenida a partir de un mamífero, conteniendo dicha
muestra a dichas células de neutrófilos y/o a una mieloperoxidasa
liberada por dichas células, cuyo método mide específicamente sólo
el contenido de mieloperoxidasa activa, estando correlacionado dicho
contenido con dicho estado de activación de las células,
comprendiendo dicho método las operaciones de:
- -
- capturar (inmunológicamente) una mieloperoxidasa (1) presente en la muestra biológica mediante un anticuerpo policlonal o monoclonal (2) que es específico para la mieloperoxidasa,
- -
- detectar y/o medir la mieloperoxidasa activa que está presente en dicha muestra biológica,
- -
- posiblemente comparar los valores medidos de la mieloperoxidasa activa con los niveles normales de mieloperoxidasa activa, obtenidos a partir de un número significativo de mamíferos sanos,
- -
- opcionalmente cuantificar los niveles de mieloperoxidasa activa usando una curva patrón de mieloperoxidasa activa, y
- -
- posiblemente relacionar los niveles de mieloperoxidasa activa, que se han medido, con un estado de actividad de dichas células, que es indicativo de la presencia, la ausencia o la condición de una enfermedad o de un estado inmunológico.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método de acuerdo con la reivindicación
1, que es un método de detección de SIEFED, en el que la operación
de capturar inmunológicamente una mieloperoxidasa es seguida por una
operación de lavado con el fin de eliminar cualesquiera componentes
que puedan interferir con la medición de la actividad enzimática de
una mieloperoxidasa, luego se detecta la actividad enzimática de
dicha mieloperoxidasa (1) fijada sobre su anticuerpo específico
añadiendo un substrato específico que se ha de transformar por una
mieloperoxidasa activa (1) a un producto de reacción visible.
3. El método de acuerdo con la reivindicación
2, en que se añaden H_{2}O_{2} y un substrato apropiado de un
producto de reacción fluorimétrica al medio de reacción.
4. El método de acuerdo con la reivindicación
3, en el que el substrato es
10-acetil-3,7-dihidroxi-fenoxazina.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 3
ó 4, en el que se añade al medio de reacción una cantidad suficiente
de un nitrito para intensificar la señal fluorescente generada.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha muestra biológica es una
muestra celular o acelular, seleccionada entre el conjunto que
consiste en sangre arterial, venosa y capilar, un suero, un plasma,
un fluido seminal, un fluido bronquio-alveolar, una
orina, una saliva, un fluido endotraqueal, un fluido peritoneal,
líquidos de irrigación uterina, un esputo, un fluido sinovial, un
fluido bronquio-alveolar, un fluido nasal, muestras
gástricas derivadas del vientre y de materiales fecales, un fluido
cerebroespinal y extractos de tejidos.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6 en el que se mide un estado de activación
de células de neutrófilos y posiblemente se correlaciona con una
enfermedad y/o una patología.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que el mamífero es un
caballo.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, que comprende además las
operaciones de detectar y/o medir una mieloperoxidasa activa, y de
medir por separado y de manera complementaria la mieloperoxidasa
total (activa e inactiva) en la muestra mediante un método de
detección por ELISA.
10. El método de acuerdo con la reivindicación
9, en el que la operación de detectar y/o medir la mieloperoxidasa
total (activa e inactiva) presente en la muestra biológica, se
obtiene mediante el uso de un segundo anticuerpo policlonal o
monoclonal (4) que reconoce a una mieloperoxidasa, marcado
enzimáticamente, para la detección de una mieloperoxidasa capturada
inmunológicamente (1).
11. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10, en el que el anticuerpo policlonal o
monoclonal específico para una mieloperoxidasa (2) está fijado sobre
un soporte sólido (3).
12. Un estuche o dispositivo de SIEFED para
medir el estado de activación de células de neutrófilos en una
muestra biológica obtenida de un mamífero, cuyo estuche o
dispositivo de SIEFED mide específicamente sólo el contenido de
mieloperoxidasa activa, estando correlacionado dicho contenido con
dicho estado de activación, comprendiendo dicho estuche o
dispositivo de SIEFED:
- -
- un anticuerpo específico para una mieloperoxidasa, o una porción hipervariable del mismo, que es capaz de fijar a una mieloperoxidasa mientras que se mantienen unas condiciones que permiten una detección y una medición de la actividad de mieloperoxidasa fijada, para
- -
- capturar inmunológicamente la mieloperoxidasa (1) presente en la muestra biológica de un mamífero, conteniendo la muestra dichas células de neutrófilos o dicha mieloperoxidasa liberada por dichas células, y los elementos necesarios para:
- -
- lavar cualquier compuesto no fijado de la muestra, que pudiera interferir con la medición adicional de una mieloperoxidasa activa,
- -
- detectar y/o medir la mieloperoxidasa activa presente en dicha muestra biológica, con lo cual se puede añadir un nitrito al medio de reacción con el fin de amplificar una reacción enzimática de mieloperoxidasa,
- -
- posiblemente comparar los valores medidos de mieloperoxidasa activa con unos niveles normales de mieloperoxidasa activa, obtenidos a partir de un número significativo de mamíferos sanos,
- -
- opcionalmente cuantificar los niveles de mieloperoxidasa activa usando una curva patrón de mieloperoxidasa activa, y
- -
- posiblemente relacionar los niveles de mieloperoxidasa activa que se han medido con un estado de actividad de dichas células, que es indicativo de la presencia, la ausencia o la condición de un estado de enfermedad o inmunológico, representando dicha detección y/o dichas mediciones, de una manera específica y exacta, los niveles de mieloperoxidasa activa en cualquier tipo de muestra biológica.
\vskip1.000000\baselineskip
13. El estuche o dispositivo de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que el mamífero es un caballo.
14. El estuche o dispositivo de acuerdo con la
reivindicación 12 ó 13, en el que los elementos son unos anticuerpos
(2) que reconocen a una MPO, fijados sobre un soporte sólido (3) y
un substrato que se ha ser transformado por una mieloperoxidasa
activa en un producto de reacción visible.
15. El estuche o dispositivo de acuerdo con la
reivindicación 12 ó 13, en el que los elementos son H_{2}O_{2} y
un substrato de un producto de reacción fluorimétrica.
16. El estuche o dispositivo de acuerdo con la
reivindicación 15, en el que el substrato es
10-acetil-3,7-dihidroxi-fenoxazina.
17. El estuche o dispositivo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, que comprende además una
cantidad suficiente de nitritos, en la forma de una sal.
18. El estuche o dispositivo de acuerdo con la
reivindicación 17, en el que los nitritos están presentes en una
cantidad comprendida entre 0,05 mg/ml y 0,7 mg/ml.
19. El estuche o dispositivo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, que comprende además un
segundo anticuerpo policlonal o monoclonal (4) marcado
enzimáticamente, que reconoce a una mieloperoxidasa, para la
detección de la mieloperoxidasa capturada inmunológicamente total
(1).
20. Un uso del método de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 precedentes o del estuche
o dispositivo de acuerdo con las reivindicaciones 12 a 19,
- -
- para la detección y/o predicción de una enfermedad o patología,
- -
- para seguir y vigilar la activación de células de neutrófilos durante una terapia de un mamífero enfermo,
- -
- para evaluar la capacidad (natural) de células de neutrófilos para luchar contra microorganismos y/o para destruirlos,
- -
- para evaluar la eficiencia de agentes moduladores inmunológicos sobre la capacidad inhibidora in vitro de fármacos, por comparación del estado de activación de neutrófilos tratados y no tratados,
- -
- evaluar la capacidad o aptitud de defensa natural de un mamífero, para luchar contra microorganismos,
- -
- escrutar o seleccionar compuestos que interactúan con una mieloperoxidasa y posiblemente inhibir una actividad de mieloperoxidasa.
\newpage
21. El uso de acuerdo con la reivindicación 20,
en el que la enfermedad o patología se selecciona entre el conjunto
que consiste en enfermedades inflamatorias crónicas o agudas,
patologías digestivas, patologías intestinales estranguladas,
sepsis, choque séptico, patologías pulmonares crónicas y agudas (con
invasión de los alvéolos por neutrófilos), patologías de reperfusión
de isquemias, patologías articulares (con la presencia de
neutrófilos en las juntas y articulaciones), cólicos, laminitis,
alergias, infecciones y enfermedades cardiovasculares.
22. El uso tanto de un método de ELISA como de
un método de SIEFED para distinguir entre un contenido de
mieloperoxidasa total y un contenido de mieloperoxidasa activa.
23. Un método de escrutinio y selección de uno
o varios compuestos que interactúan con una mieloperoxidasa, que
inhiben preferiblemente una actividad de mieloperoxidasa, que
comprende la operación de
- -
- capturar una mieloperoxidasa activa en un soporte sólido (3)
- -
- posiblemente medir una actividad de mieloperoxidasa,
- -
- añadir uno o más compuesto(s) a la mieloperoxidasa activa,
- -
- medir una actividad de mieloperoxidasa después de haber lavado el (los) compuesto(s),
- -
- posiblemente comparar las actividades de mieloperoxidasa antes o después de una adición de los compuestos, y
- -
- posiblemente recuperar el (los) compuesto(s) que interactúa(n) con una mieloperoxidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
24. El método de acuerdo con la reivindicación
23 en el que al referirse al compuesto que interactúa con una
mieloperoxidasa se trata de compuestos que inhiben una actividad de
mieloperoxidasa.
25. El método de acuerdo con la reivindicación
23 o 24, en el que la operación de capturar una mieloperoxidasa
activa se hace por un anticuerpo.
26. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 23 a 25, que comprende, después de la operación
de añadir uno o más compuesto(s) a la mieloperoxidasa activa,
una operación de lavar el(los) compuesto(s) que no
está(n) fijado(s) a la mieloperoxidasa activa.
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