JP2018522940A - 鎌状赤血球症の処置のためのペントサンポリ硫酸ナトリウム - Google Patents

Abstract

本発明は、とりわけ、ペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）構成成分で構成される組成物およびそのような組成物を作製し、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）の治療のためにそれを使用する方法に関する。開示される組成物は、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）の治療のために、優れた生物学的利用能ならびにＰ−セレクチン遮断活性を有する。それを使用する方法が、本明細書でさらに提供される。溶液中または動物もしくは個体から得られる生物学的中のＰＰＳまたはＰＰＳ分画を検出または定量する方法も、本明細書で提供される。

Description

（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１５年５月２７日に出願された米国仮特許出願番号第６２／１６６，８６３号および２０１５年１０月２３日に出願された米国仮特許出願番号第６２／２４５，７６６号に基づく優先権を主張しており、これら仮出願の各々の開示はそれらの全体が本明細書中に参考として援用される。

（政府の権益）
本発明は、米国国立衛生研究所のＴｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって授与されたＲ４３ ＨＬ１２３０５９の下で政府の援助によって達成された。政府は、本発明に一定の権利を有する。

（発明の背景）
本発明は、とりわけ、ペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）構成成分で構成される組成物およびそのような組成物を作製し、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）の治療のためにそれを使用する方法に関する。

（背景）
鎌状赤血球貧血症（ＳＣＡ、ＨｂＳＳホモ接合性のＳＣＤを引き起こす最も一般的な遺伝子型を識別するためにより正確に使用される）としても知られる鎌状赤血球症（ＳＣＤ）およびドレパノサイトーシス（この疾患のギリシア名）は、ヘモグロビンのβ−グロビン鎖での点突然変異によって引き起こされる常染色体劣性遺伝子の血液障害である。ＳＣＤは、低酸素条件下で、「鎌状赤血球化」と呼ばれる異常で剛直な鎌形を採択する赤血球によって特徴付けられる。鎌状になる可能性を有する異常な細胞は、鎌状赤血球（ＳＲＢＣ）と呼ばれる。鎌状赤血球化の反復発症は、血液細胞の膜に損傷を与え、その変形性を減少し得る。正常な酸素圧が回復するときにも、鎌状細胞の一部は正常な形状に戻ることができない。これらの不可逆的に鎌状になったＳＲＢＣおよび可逆的に鎌状になったＳＲＢＣは剛直であり、細い毛細管を通過するときに変形することができず、血管閉塞および虚血につながる。この病気の実際の貧血は、ＳＲＢＣの早発の破壊である溶血によって主に引き起こされる。

Ｐ−セレクチンは、血小板および内皮細胞によって一般的に発現される１４０ｋＤａタンパク質である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ１６１０９（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ４０００８（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）を参照）。Ｐ−セレクチンは、炎症の間の損傷部位への白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）（白血球細胞（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ））の初期の動員で必須の役割を演ずる。ＳＣＤの病態生理に対するＰ−セレクチンの重要性は、血管内皮へのＳＲＢＣの接着、および結果として生じる血流障害に及ぼすその影響を通して理解される。Ｐ−セレクチンはＳＣＤでの異常な血流において中心的な因子であり、異常な血流はこの障害の病的状態および死亡率にとって最も重要である。

ペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）は、平均して８〜１０個のキシロースごとの鎖の横の位置に結び付けられた４−ＯメチルＤグルクロン酸（Ｃ２およびＣ３に硫酸基を有する）とＣ２およびＣ３に硫酸基を有するβ−Ｄ−キシロースの鎖で構成される、経口吸収性の半合成硫酸化多糖である（Maffrandら、（１９９１年）Semin Thromb Hemost、１７巻、増補２、１８６〜１９８頁）。それは、ヘパリンとの構造的および機能的類似性を、しかしヘパリンよりかなり低い抗凝固活性およびＰ−セレクチンへのＳＲＢＣ接着に対する強い遮断活性を有する（Kutlarら、（２０１２年）Am J Hematol、８７巻、５３６〜５３９頁とオンライン補助資料）。しかし、市販されているＰＰＳは、そのわずかな経口生物学的利用能、不均一性および限定的作用持続時間のために、ＳＣＤの理想的な療法でない。したがって、必要なものは、より均一であり、強いＰ−セレクチン遮断活性ならびにＳＣＤ治療のための優れた経口吸収／生物学的利用能の両特性を有するＰＰＳ含有組成物である。本明細書に記載される本発明は、これらの必要性に対処するだけでなく、追加の利点も提供する。

ヘパリン類似物質（ｈｅｐａｒｉｎｏｉｄ）のＰ−セレクチン遮断活性は、同時にＬ−セレクチン遮断を伴い（４〜６）、パンセレクチン（ｐａｎｓｅｌｅｃｔｉｎｅ）阻害剤として開発中のセレクチン遮断剤は主にＥ−セレクチンを遮断するが、Ｐ−セレクチンおよびＬ−セレクチンの遮断では概ねその１００分の１の低い活性を有する（７）。対照的に、Ｐ−セレクチンを遮断する正確な特異性を有するモノクローナル抗体（１、２）および核酸アプタマー（３）などの異なるクラスの薬剤が、操作されて存在している。他にも利点がある中で、本明細書において本発明は、これらのポリマー炭水化物剤に特有である、Ｐ−セレクチンへの特異性について対処する。
この明細書全体において、様々な特許、特許出願および他のタイプの刊行物（例えば、雑誌論文、電子データベース登録事項など）が参照される。本明細書で引用される全ての特許、特許出願および他の刊行物の開示は、全ての目的のためにここに参照によりその全体が組み込まれる。

Maffrandら、（１９９１年）Semin Thromb Hemost、１７巻、増補２、１８６〜１９８頁 Kutlarら、（２０１２年）Am J Hematol、８７巻、５３６〜５３９頁とオンライン補助資料

（要旨）
本明細書では、とりわけ、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）の治療のために優れた経口生物学的利用能およびＰ−セレクチン遮断活性を有する、ペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）構成成分で構成される組成物、ならびにそれを使用する方法が提供される。

したがって、一部の態様では、本明細書で、単離されたペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）分画を含む組成物であって、未分画ＰＰＳと比較して、（ａ）改善されたまたは同等のＰ−セレクチン遮断活性、（ｂ）改善された生物学的利用能、および（ｃ）それ以下の抗凝固活性を有する組成物が提供される。一部の実施形態では、未分画ＰＰＳは１，２２１〜７，６８１Ｄａの平均分子量範囲を有する。

他の態様では、本明細書で、単離されたペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）分画を含む組成物であって、
（ａ）水を含むがそれに限定されない水溶液にＰＰＳを可溶化するステップ；
（ｂ）有機溶媒の全体の濃度が少なくとも約５０容量％になるまで可溶化ＰＰＳに前記有機溶媒を段階的方式で添加するステップ、および
（ｃ）沈殿したＰＰＳ分画を単離するステップ
によって生成される組成物と同じ特性を有する組成物が提供される。一部の実施形態では、前記有機溶媒の全体の濃度が少なくとも約３８容量％になるまで前記可溶化ＰＰＳに前記有機溶媒が段階的方式で添加される。一部の実施形態では、少なくとも約４３容量％、４６容量％、４８容量％および／または５０容量％を含む次第に増加する濃度の有機溶媒を使用して、請求項３のステップ（ｂ）および（ｃ）が繰り返される。本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部の実施形態では、前記段階的方式が、上清を取り除き、沈殿したＰＰＳ分画を再可溶化することを含む。本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部の実施形態では、前記特性が、未分画ＰＰＳと比較して、（ａ）改善されたｐ−セレクチン遮断活性、（ｂ）改善された生物学的利用能および（ｃ）それ以下の抗凝固活性である。一部の実施形態では、未分画ＰＰＳが１，２２１〜７，６８１Ｄａの平均分子量範囲を有する。一部の実施形態では、（１）水を含むがそれに限定されない水溶液にＰＰＳを可溶化するステップ；（２）有機溶媒の全体の濃度が少なくとも約５０容量％になるまで前記可溶化ＰＰＳに前記有機溶媒を段階的方式で添加するステップ、および（３）沈殿したＰＰＳ分画を単離するステップによって生成される。前記水溶液は、塩（例えば、塩化ナトリウム）、共溶媒（co-solvent）、界面活性剤、または他の添加剤を含み得る。一部の実施形態では、前記有機溶媒の全体の濃度が少なくとも約３８容量％になるまで前記可溶化ＰＰＳに前記有機溶媒が段階的方式で添加される。一部の実施形態では、少なくとも約４３容量％、４６容量％、４８容量％および／または５０容量％を含む次第に増加する濃度の有機溶媒を使用して、ステップ（２）および（３）が繰り返される。本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部の実施形態では、前記段階的方式が、上清を取り除き、前記沈殿したＰＰＳ分画を再可溶化することを含む。本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部の実施形態では、前記有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノールからなる群から選択される。本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部の実施形態では、前記有機溶媒がメタノールである。本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部の実施形態では、単離された前記ＰＰＳ分画が約３７６１〜４８３２Ｄａの間の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する。一部の実施形態では、単離された前記ＰＰＳ分画が約４２７４Ｄａの重量平均分子量（Ｍｗ）を有する。本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部の実施形態では、単離された前記ＰＰＳ分画が約１．２３７〜１．１４２Ｍｗ／Ｍｎの間の多分散指数を有する。一部の実施形態では、単離された前記ＰＰＳ分画が約１．１６７Ｍｗ／Ｍｎの多分散指数を有する。本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部の実施形態では、前記組成物は、Ｐ−セレクチン遮断活性と比較して低減されたＥ−セレクチンおよびＬ−セレクチン遮断活性を示す。一部の実施形態では、前記組成物は、５％未満のＥ−セレクチン遮断活性を示す。一部の実施形態では、前記組成物は、２％未満のＬ−セレクチン遮断活性を示す。

さらなる態様では、本明細書で、本明細書に開示される組成物を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態では、前記医薬組成物は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤（zwitterionic surfactant）、有機酸および／または抗酸化剤のうちの１つまたは複数をさらに含む。

他の態様では、本明細書で、それを必要とする対象で鎌状赤血球症（ＳＣＤ）を治療するための方法であって、本明細書に開示される分画されたペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）組成物のいずれか、または本明細書に開示される医薬組成物のいずれかの臨床有効量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、組成物または医薬組成物は経口投与される。他の実施形態では、組成物または医薬組成物は、皮下、静脈内、筋肉内、吸入により、経皮的、局所的、または任意の他の許容される医薬投与経路により投与することができる。

さらに他の態様では、本明細書で、（ａ）本明細書に開示される単離したペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）分画のいずれか、および（ｂ）１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、担体、アジュバントまたはビヒクルを含むキットが提供される。

なお他の態様では、本明細書で、生物学的中のペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）またはＰＰＳ分画を検出するための方法であって、（ａ）試料をプロテアーゼと接触させるステップ；（ｂ）試料中のＰＰＳまたはＰＰＳ分画を抽出して沈殿させるステップ；（ｃ）ＰＰＳまたはＰＰＳ分画に結合する抗体と試料を接触させるステップであって、前記抗体は検出が直接的または間接的に可能であるステップ；および（ｄ）前記抗体を検出し、それによって生物学的中のＰＰＳまたはＰＰＳ分画の存在を検出するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、生物学的は血液である。一部の実施形態では、生物学的は血清または血漿である。本明細書に開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態では、本方法は、約０．５ｎｇ／ｍＬから約１０ｎｇ／ｍＬの間の検出下限（ＬＬＯＤ）（２×シグナル／バックグラウンド）を有する。本明細書に開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態では、ＰＰＳまたはＰＰＳ分画に結合する抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイで使用される。本明細書に開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態では、ＰＰＳはクロロホルムおよび酢酸アンモニウムで抽出、沈殿させる。本明細書に開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）はステップ（ａ）の前に実施される。本明細書に開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態では、ＰＰＳ分画は本明細書に開示されるＰＰＳ分画のいずれか１つである。

実施形態または態様の文脈から明示的にまたは明らかに排除されない限り、本明細書に記載される態様および実施形態の各々は、一緒に使用することが可能である。

図１は、ＰＰＳおよびＰＰＳ分画３〜９のＰ−セレクチン遮断比活性を表す。Ｙ軸は、Ｐ−セレクチン遮断活性（ｎｍｏｌ／ｍＬ）のＩＣ５０である。ＰＰＳのＩＣ５０は、水平線で示す。ＰＰＳ分画は、Ｘ軸上に示す。

図２は、９６時間にわたるＰＰＳ、分画５および分画７の平均の不揮発性累積尿中排泄放射能を表す。データポイントは、トリチウム水の揮発性放射能が取り除かれた各試験アイテムの３反復測定からの平均尿中放射能である。図示の通り、分画は、９６時間を通して未分画ＰＰＳと比較して大きな尿中排泄を有する。

図３は、血漿試料中のＰＰＳ、分画５および分画７の平均不揮発性放射能濃度を表す。データポイントは、トリチウム水の揮発性放射能が取り除かれた各試験アイテムの３反復測定からの平均血漿中放射能である。図示の通り、分画は、ＰＰＳより大きな経口ＢＡを有し、未分画ＰＰＳと比較して４８時間後でさえ生物的に利用可能のままである。

図４は、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチンに関する未分画ＰＰＳならびに分画５および７の遮断特異性を表す。図示の通り、未分画ＰＰＳ、分画５および分画７は、ある範囲の濃度にわたってＥ−セレクチンまたはＬ−セレクチンを遮断する能力と比較してＰ−セレクチンの遮断に関して高度に特異的である。

図５は、ヒトまたはラットからの血清または血漿中のＰＰＳの存在および量を検出するために使用された改変ＥＬＩＳＡアッセイのシグナル／ノイズを表す。

図６は、プロテアーゼで前処置されたヒト、サルまたはラットの血清中のＰＰＳまたは分画５を検出するための改変ＥＬＩＳＡアッセイのシグナル／ノイズを表す。

図７は、コンドロイチナーゼで前処置されたヒトまたはラットの血清中のＰＰＳを検出するための改変ＥＬＩＳＡアッセイのシグナル／ノイズを表す。

図８は、ヒトまたはラットの血清中のＰＰＳを検出するための改変ＥＬＩＳＡアッセイのシグナル／ノイズを表す。アッセイを行う前に、クロロホルムを使用してＰＰＳを抽出し、次に酢酸アンモニウムおよびエタノールで沈殿させた。

（詳細な説明）
本明細書に記載される本発明は、とりわけ、未分画ＰＰＳと比較して、改善されたＰ−セレクチン遮断活性、改善された生物学的利用能、より少ない不均一性、およびそれ以下の抗凝固活性を有するペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）の単離および／または精製された分画を提供する。販売業者によるとわずか３％〜６％の経口生物学的利用能（ＢＡ）を有する未分画ＰＰＳと対照的に、本明細書で提供されるある特定のＰＰＳ分画は、実質的に改善された経口ＢＡを示す。このように、ＰＰＳはＰ−セレクチンの遮断を通して、ＳＣＤを有する患者で微小血管血流を改善することが示されているので、本明細書に記載される組成物は、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）の治療のために有益である。

Ｉ．定義
ポリマーの「多分散指数」（ＰＤＩ）は、ポリマーの重量平均分子量のポリマーの数平均分子量に対する比（Ｍｗ／Ｍｎ）と規定される。１．２またはそれ未満のＰＤＩは、その分布が単分散であることを表す。

ＰＰＳ分画を指すとき、「精製された」および「単離された」は、その分画が１．２５またはそれ未満のＰＤＩを有することを意味する。

一部の実施形態では、「１，２２１〜７，６８１Ｄａの平均分子量範囲を有するＰＰＳ」というフレーズは、未分画のおよび／または市販されているＰＰＳを指すが、未分画ＰＰＳの実際のＭＷ範囲はそれよりかなり広い。

ＰＰＳ分画を指すとき、「改善されたＰ−セレクチン遮断活性」は、特異的単離分画が、比較ＰＰＳ調製物と比較してｉｎ ｖｉｔｒｏで固定化シアリルルイスＡ（「ｓＬｅＡ」）へのＰ−セレクチン分子の接着を遮断する能力を増加させることを意味する。本明細書に記されるように、一部の実施形態では、本発明のＰＰＳ分画は、未分画のＰＰＳまたは約１，２２１〜７，６８１Ｄａの間の平均分子量範囲を有するＰＰＳ調製物と比較して改善されたＰ−セレクチン遮断活性を示すことができる。一部の実施形態では、特異的分子量範囲は、比較ＰＰＳ調製物と比較して固定化Ｐ−セレクチンへのＵ９３７細胞、ＨＬ−６０細胞、鎌赤血球および／または白血球の接着を遮断する能力も増加させる。

「それ以下の抗凝固活性」は、ＰＰＳ分画を指すとき、この特異的分画が未分画ＰＰＳ調製物と比較して有意により大きな抗凝固活性を示さないことを意味する。一部の実施形態では、本発明のＰＰＳ分画は、約１，２２１〜７，６８１Ｄａの間の平均分子量範囲を有する未分画のＰＰＳと比較してそれ以下の抗凝固活性を示す。

「改善された生物学的利用能」は、ＰＰＳ分画を指すとき、経口的に送達したときに、未分画ＰＰＳ調製物と比較して、特異的分画がＰＰＳのＡＵＣ、Ｃ_ｍａｘ、血漿中濃度および／または全累積尿中排泄を改善することを意味する。単回投与の場合、Ｃ_ｍａｘは最大血漿中濃度であり、ＡＵＣは血漿中濃度−時間曲線の下の数学的に積分した面積であり、累積尿中排泄は、試料（例えば、限定されずに、尿または血漿）の中に経時的に出現する非標識または標識（例えば、放射性標識）ＰＰＳの量である。本明細書に記されるように、一部の実施形態では、本発明のＰＰＳ分画は、未分画のＰＰＳ調製物または約１，２２１〜７，６８１Ｄａの間の平均分子量範囲を有するＰＰＳ調製物と比較して改善された生物学的利用能を示す。

「作用持続時間を改善する」は、特異的ＰＰＳ分画がＴ_１／２または所望の薬理効果の持続時間を増加させることを意味する。本明細書で使用される場合、「Ｔ_１／２」は、半減期または複数の半減期である。

「数平均分子量」（Ｍｎ）は、その試料中の分子数で割った試料の全重量を指し、平均についての第１のモーメントである。それは、ゲル浸透クロマトグラフィーおよび屈折率によって測定することができ、試料の最も低いｍｗ部分を強調する。

「重量平均分子量」（Ｍｗ）は、平均に関する第２のモーメントの第１のモーメントに対する比であり、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィーおよび光散乱によって判定することができ、所与のクロマトグラフピークの中心に最も近い平均分子量である。

粘度によって判定される「Ｚ平均分子量」（Ｍｚ）は、試料の最も高い分子量部分に最も近い平均分子量を反映する。一部の実施形態では、それは、平均に関する第３のモーメントの第２のモーメントに対する比を指し、歪み分布にとって重要であり、粘度から判定される。

「改善された微小血管血流」は、ＰＰＳ分画を指すとき、経口的に送達されるときに、例えば比較ＰＰＳ調製物または未処置の鎌形赤血球マウスキメラ系での血流と比較して、特異的分画が、鎌形赤血球マウスキメラモデル系で微小血管血流を増加させることを意味する。本明細書に記されるように、一部の実施形態では、本発明のＰＰＳ分画は、未分画のＰＰＳ調製物または約１，２２１〜７，６８１Ｄａの間の平均分子量範囲を有するＰＰＳ調製物と比較して、誘導された微小血管血流閉塞からの保護を示す。微小血管血流は、レーザードップラー速度測定、または、コンピュータを利用した生体内鏡検（ＣＡＩＭ）、レーザースペックルコントラスト画像化、ＥｎｄｏＰＡＴ、造影剤増強超音波マイクロバブルフロー画像化、指先温度リバウンドおよび直交偏光スペクトル画像化を含むいくつかの他の非侵襲的方法のいずれかによって測定することもできる。

「試料」または「生物学的」は、ヒト、動物、プラセボまたは研究試料、例えば、細胞、組織、器官、流体、気体、エアゾール、スラリー、コロイドまたは凝固材料からの試料を指す。「試料」は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えばヒトまたは動物から取り除かずに、ｅｘ ｖｉｖｏで、例えばヒトまたは動物から取り除いた後に、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば非生物環境で、試験することができる。試料は、プロセシングの後に、例えば組織学的方法によって試験することができる。「試料」は、例えば、流体もしくは組織試料を含む細胞、または流体もしくは組織試料から分離される細胞も指す。「試料」は、ヒトもしくは動物から新たにとられる細胞、組織、器官もしくは流体、またはプロセシングもしくは保存される細胞、組織、器官もしくは流体を指すこともできる。

「対象」は、脊椎動物、哺乳動物またはヒトであってよい。哺乳動物には、限定されずに、家畜、競技用動物、ペット、霊長類、マウスおよびラットが含まれる。一態様では、対象はヒトである。

本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、この発明が属する分野の当業技術者が一般に理解するのと同じ意味を有する。

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別に指図しない限り、複数形への言及を含む。

ＩＩ．発明の組成物
Ａ．ペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）
ペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）は、ヘパリンと構造的および機能的類似性を有する高分子量硫酸化多糖である。未分画ＰＰＳは、ブナノキＦａｇｕｓ ｓｙｌｖａｔｉｃａのパルプから一般的に抽出される、ポリマーキシロース分子の硫酸化によって調製される不均一な混合物である。一実施形態では、未分画ＰＰＳは、約１，２２１〜７，６８１Ｄａの間の平均分子量範囲を有し、経口剤として３％〜６％の生物学的利用能（ＢＡ）および４．８時間の半減期を有する。有効成分として１００ｍｇのＰＰＳを含有する白色不透明な硬質ゼラチンカプセルで供給され、間質性膀胱炎の治療での経口的使用のために医薬賦形剤として微結晶性セルロースおよびステアリン酸マグネシウムと混和されるＥｌｍｉｒｏｎ（登録商標）（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）。１８年を超える期間の使用で、ヒトでの経口ＰＰＳの非常に大きな安全性データベースが確立されている。さらに、欧州諸国では、様々な疾患のためにＰＰＳの他の形態が、局所的に、経口的に、および注射によって使用されている。

一部の実施形態では、未分画ＰＰＳは、約５００〜１０，０００Ｄａの間、例えば、約６００〜９０００Ｄａ、７００〜８５００Ｄａ、８００〜８０００Ｄａ、９００〜９６００Ｄａ、１０００〜９０００Ｄａ、５００〜９５００Ｄａ、５００〜９０００Ｄａ、５００〜８９００Ｄａ、５００〜８８００Ｄａ、５００〜８７００Ｄａ、５００〜８６００Ｄａ、５００〜８５００Ｄａ、５００〜８４００Ｄａ、５００〜８３００Ｄａ、５００〜８２００Ｄａ、５００〜８１００Ｄａ、５００〜８０００Ｄａ、５００〜７９００Ｄａ、５００〜７８００Ｄａ、５００〜７７００Ｄａ、５００〜７６００Ｄａ、６００〜７５００Ｄａ、７００〜７４００Ｄａ、８００〜７３００Ｄａ、９００〜７２００Ｄａ、１０００〜７１００Ｄａ、１１００〜７０００Ｄａ、１２００〜６９００Ｄａまたは１５００〜６５００Ｄａのいずれかの間の平均分子量範囲を有する。他の実施形態では、未分画ＰＰＳは、１，２２１〜７，６８１Ｄａの平均分子量範囲を有する。別の実施形態では、未分画ＰＰＳは、それぞれ１，２２１〜７，６８１の範囲の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％または２５％下または上のいずれかの間の平均分子量範囲を有する。

ＰＰＳは本来抗血栓薬として開発されたが、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）試験によって測定したときに、重量測定に基づき、それは未分画ヘパリンのわずか１／１０の抗凝固効果を有することがｉｎ ｖｉｔｒｏで見出された。しかし、ＰＰＳのｉｎ ｖｉｖｏ抗凝固活性は十分により大きく、ＡＰＴＴ試験をＰＰＳ活性の臨床上の尺度として使用することができた。アンチトロンビン（ＡＴ；別名抗トロンビン−ＩＩＩまたはＡＴ−ＩＩＩ）およびヘパリン補因子ＩＩ（ＨＣ−ＩＩ）の活性を増強することに由来するヘパリンの抗凝固効果と違って、ＰＰＳのある特定の抗凝固活性は、一部トロンビンおよび第ＶＩＩＩａ因子へのその直接的結合の結果として、これらのヘパリン補因子とは独立である。未分画ＰＰＳと凝固系とのこれらの相互作用は、その出血リスクの認識ならびに様々なＰＰＳ構成成分の抗凝固活性を評価するのに有益な凝固試験のための基礎を提供する。

第一世代の（未分画）ＰＰＳの安全性および活性のフェーズＩ研究で、Ｅｌｍｉｒｏｎ（登録商標）が少なくとも１週の間隔で単一の１００ｍｇ、２００ｍｇおよび３００ｍｇ経口用量として５人の鎌状赤血球症を有する患者に投与され、単一の３００ｍｇ用量として２人の健康な対照対象に投与された。重大な薬物関連の薬物作用、臓器特異的毒性、臨床上の出血をモニタリングする臨床検査の異常、または凝固臨床検査の異常もなかった。信頼できるアッセイの欠如ために、薬物動態学的（ＰＫ）結果は得られなかった。微小血管系で血流を非侵襲的にモニタリングするために、レーザードップラー速度計（ＬＤＶ）を使用して有益な薬力学的（ＰＤ）効果を測定した。ＬＤＶにより、皮膚に付着させたプローブの送信ファイバーからのレーザーシグナルを皮下組織に導き、皮下毛細管中の移動する赤血球に反射してプローブの受信ファイバーに戻るシグナルの強度によって血流を判定する。微小血管中の血流が十分かどうかは、血流の摂動に対するシグナル強度の応答によって最も正確に判定される。１つの十分に確立された摂動系は、血流閉塞期間の後の充血流（閉塞後反応性充血；ＰＯＲＨ）の特徴付けである。このＰＯＲＨ評価では、流動が一時的に剥奪されていた組織への充血血流が、正常な微小血管流を有する対象では、障害のある微小血管流を有する患者と比較してより高い流量を達成し、より短いペイバック期間を必要とする。障害のある微小血管流を有する患者では、ペイバック流はより少ない流量を達成し、より長い期間を要するＬＤＶで使用された異なる流動摂動は、プローブが熱変換器を含有し、熱刺激の期間中に達成されるピーク流動によって微小血管血流が十分かどうか判定される、血流の熱誘導である。この摂動は、血管拡張薬またはヒドロキシ尿素による治療に応答して改善された鎌形赤血球血流を実証するために使用された。

５人の鎌形赤血球症患者に単一の３００ｍｇ経口用量として投与されたＥｌｍｉｒｏｎ（登録商標）の研究では、治療前の値と比較して、ハーフピーク流量までの時間の短縮によって反映されるように、投与の１時間、３時間、６時間および８時間後に微小血管血流が増加した。単一の最良の応答体が結果に大きな分散をもたらした結果、これらの変化は有意でなかったが実質的な傾向があった。その最良の応答体を分析から排除したとき、ピーク流量へのハーフタイムの改善は統計的に有意であった。これらの患者のＰＰＳ治療後に記録された時間は、３００ｍｇのＰＰＳによる治療の前後の２人の健康な対照対象の時間と同じ範囲内であった。患者のこの小さいサンプリングでは、１００ｍｇもしくは２００ｍｇの用量で、または３つの用量のいずれのピーク流量測定においても、検出可能な改善は明らかにならなかった。

３００ｍｇ日用量として経口投与された第一世代ＰＰＳ（Ｅｌｍｉｒｏｎ（登録商標））の予備的フェーズＩＩ研究は、患者８０人の研究における、ＬＤＶによって測定した微小血管流の改善、血管内皮損傷の１つまたは複数のマーカーの改善、または、毎日の疼痛日記もしくは疼痛危機の頻度（α＝０．１０）によって測定した疼痛の低減の傾向をエンドポイントとして使用して、鎌状赤血球症におけるＰＰＳの活性を実証することを意図したものである。この多施設プラセボ対照無作為化二重盲検研究は、ベースラインデータ収集のための３週のリードイン期間、薬物またはプラセボ投与の１２週間、および投与完了後の４週のランダウン期間を含んだ。この研究は、疼痛の有意な低減（α＝０．０５）を実証するように設計されたわけでも、そのための検出力を備えていたわけでもなかった。収集したデータのプロトコールごとによる分析は、少なくとも８週間活性薬物を確実にとった７人の患者では、血管損傷のマーカー、可溶性ＶＣＡＭ−１の高度に有意な（ｐ＝０．０１）低減があったことを明らかにした。さらに、ＬＤＶによって測定されたＰＯＲＨの変化は、ハーフピーク流量までの時間の短縮（ｐ＝ＮＳ）に反映されるように、微小血管血流の改善への傾向を明らかにした。

これらの結果は、鎌状赤血球症を有する患者で第一世代ＰＰＳのＰＤ効果を実証するが、経口的に与えられるときのそのわずかな生物学的利用能および概ね４．８時間の限定された半減期のために、この製品はこの障害の長期治療に最適でない。報告によると、医薬品の９４％超は、いかなる有益効果を提供することなしに糞便中にインタクトのまま排泄される。薬物の経口吸収における一般的な相違は、相当数の患者が全く吸収しない低い生物学的利用能を有する薬物にとって、容認できない結果をもたらす。

Ｂ．単離されたＰＰＳ分画
本明細書で単離されたペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）分画を含む組成物が提供され、ここで、組成物は、未分画ＰＰＳと比較して改善されたＰ−セレクチン遮断活性、改善された生物学的利用能および／またはそれ以下の抗凝固活性を有する。ＰＰＳの市販されているおよび未分画の供給源は、４〜６ｋＤａの範囲内の分子量を報告しているが、実際にはもっと広い。ＰＰＳ分画は、限定されずに、有機溶媒による選択的沈殿（例えば、メタノールまたはエタノール沈殿）、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを含む、当該技術分野で公知の任意の適する手段を使用して単離、精製することができる。

一部の態様では、本明細書で提供される単離されたＰＰＳ分画を含む組成物は、以下のプロセスによって生成される組成物と類似の特性を有する。ＰＰＳは、限定されずに、水を含む水溶液に、それらの値の範囲内にある任意の百分率を含む、約５％、１０％、１５％、２０％、または２５％のいずれかまたはそれを超える濃度に可溶化することができる。一部の実施形態では、分子量によってＰＰＳを沈殿させるために、有機溶媒が可溶化ＰＰＳ溶液に添加される。分子量がより高い化学種またはより高度に荷電した化学種が最初に沈殿するが、ＰＰＳ溶液中の有機溶媒の濃度が増加するにしたがって、次第に分子量がより低いまたはより低く荷電した化学種も溶液から沈殿する。

プロセスで使用される溶媒は、限定されずに、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノールまたはイソプロピルアルコールなどの有機アルコールを含む、任意の有機溶媒であってよい。プロセスは、特異的ＰＰＳ分画の沈殿を引き起こすために、複数濃度の有機溶媒の段階的添加をさらに包含する。例えば、一実施形態では、有機溶媒の濃度が約２５容量％、２６容量％、２７容量％、２８容量％、２９容量％、３０容量％、３１容量％、３２容量％、３３容量％、３４容量％、３５容量％、３６容量％、３７容量％または３８容量％のいずれかに到達するまで、有機溶媒（メタノールなど）は可溶化ＰＰＳ溶液に滴下方式で添加される。この時点で、溶液を遠心分離し、上清を取り除くことができる。遠心分離および上清の除去の後に残された沈殿物は、次に再可溶化し、当技術分野で公知であるまたは下の実施例で記載される方法を使用して、分子量、Ｐ−セレクチン遮断活性、生物学的利用能および／または抗凝固活性などの特性について評価することができる。

さらに、次第に増加する濃度の有機溶媒（メタノールなど）の添加と、続く遠心分離、上清の除去、および沈殿物の再可溶化によって、上記の初期の分画／沈殿からの上清をさらに分画することができる。有機溶媒の任意の濃度を使用して、このプロセスを任意の回数反復することができる。例えば、ＰＰＳ沈殿およびＰＰＳ分画の以降の単離を引き起こすのに十分な有機溶媒の濃度は、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％のいずれかまたはそれを超えてもよい。一実施形態では、沈殿したＰＰＳ分画を前記のように単離して収集し、上清は、３８容量％、４３容量％、４６容量％、４８容量％、５０容量％、５３容量％および５６容量％の濃度の有機溶媒（メタノールなど）のさらなる添加を受ける。一部の実施形態では、単離したＰＰＳ分画を含む組成物であって、未分画ＰＰＳと比較して改善されたＰ−セレクチン遮断活性、改善された生物学的利用能、および／または低減された抗凝固活性を有する組成物は、５０容量％の有機溶媒（メタノールなど）を使用して単離された分画である。

硫酸化ポリマーの分画に関するさらなる情報は、その開示は参照により本明細書にその全体が組み込まれる、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１０００００１３に見出すことができる。

本明細書に記載される単離されたＰＰＳ分画は、約２０００〜７０００Ｄａの間（例えば、約２１００〜６９００Ｄａ、２２００〜６８００Ｄａ、２３００〜６７００Ｄａ、２４００〜６６００Ｄａ、２５００〜６５００Ｄａ、２６００〜６４００Ｄａ、２７００〜６３００Ｄａ、２８００〜６２００Ｄａ、２９００〜６１００Ｄａ、３０００〜６０００Ｄａ、３１００〜５９００Ｄａ、３２００〜５８００Ｄａ、３３００〜５７００Ｄａ、３４００〜５６００Ｄａ、３５００〜５５００Ｄａ、３６００〜５４００Ｄａ、３７００〜５３００Ｄａ、３８００〜５０００Ｄａ、３８５０〜４７５０Ｄａ、３９００〜４７００Ｄａ、３９５０〜４６５０Ｄａ、４０００〜４６００Ｄａ、４０５０〜４５５０Ｄａ、４１００〜４５００Ｄａ、４１５０〜４４５０Ｄａ、４２００〜４４００Ｄａ、または４２５０〜４３５０Ｄａのいずれかの間）の重量平均分子量（Ｍｗ）を有することができる。別の実施形態では、本明細書中に記載のＰＰＳ分画は、約４２６０Ｄａ、４２６１Ｄａ、４２６２Ｄａ、４２６３Ｄａ、４２６４Ｄａ、４２６５Ｄａ、４２６６Ｄａ、４２６７Ｄａ、４２６８Ｄａ、４２６９Ｄａ、４２７０Ｄａ、４２７１Ｄａ、４２７２Ｄａ、４２７３Ｄａ、４２７４Ｄａ、４２７５Ｄａ、４２７６Ｄａ、４２７７Ｄａ、４２７８Ｄａ、４２７９Ｄａ、４２８０Ｄａ、４２８１Ｄａ、４２８２Ｄａ、４２８３Ｄａ、４２８４Ｄａ、４２８５Ｄａ、４２８６Ｄａ、４２８７Ｄａ、４２８８Ｄａ、または４２８９ＤａのＭｗを有することができる。別の実施形態では、本明細書に記載される単離されたＰＰＳ分画は、約３７６１〜４８３２Ｄａの間のＭｗを有することができる。

本明細書に記載される単離されたＰＰＳ分画は、約０．５〜１．５Ｍｗ／Ｍｎの間、例えば、約０．６〜１．４Ｍｗ／Ｍｎ、０．７〜１．３Ｍｗ／Ｍｎ、０．７５〜１．２５Ｍｗ／Ｍｎ、０．８〜１．２４Ｍｗ／Ｍｎ、１．１４５〜１．２３５Ｍｗ／Ｍｎ、１．１５〜１．２３Ｍｗ／Ｍｎ、１．１５５〜１．２２５Ｍｗ／Ｍｎ、１．１６〜１．２２Ｍｗ／Ｍｎ、１．１６５〜１．２１５Ｍｗ／Ｍｎ、１．１７〜１．２１Ｍｗ／Ｍｎ、１．１７５〜１．２０５Ｍｗ／Ｍｎ、１．１８〜１．２Ｍｗ／Ｍｎまたは１．１８５〜１．１９５Ｍｗ／Ｍｎのいずれかの多分散指数（ＰＤＩ）を有することができる。別の実施形態では、本明細書に記載されるＰＰＳ分画は、約１．１６Ｍｗ／Ｍｎ、１．１６１Ｍｗ／Ｍｎ、１．１６２Ｍｗ／Ｍｎ、１．１６３Ｍｗ／Ｍｎ、１．１６４Ｍｗ／Ｍｎ、１．１６５Ｍｗ／Ｍｎ、１．１６６Ｍｗ／Ｍｎ、１．１６７Ｍｗ／Ｍｎ、１．１６８Ｍｗ／Ｍｎ、１．１６９Ｍｗ／Ｍｎ、１．１７０Ｍｗ／Ｍｎ、１．１７１Ｍｗ／Ｍｎ、１．１７２Ｍｗ／Ｍｎ、１．１７３Ｍｗ／Ｍｎ、１．１７４Ｍｗ／Ｍｎ、１．１７５Ｍｗ／Ｍｎ、１．１７６Ｍｗ／Ｍｎ、１．１７７Ｍｗ／Ｍｎ、１．１７８Ｍｗ／Ｍｎ、１．１７９Ｍｗ／Ｍｎ、１．１８０Ｍｗ／Ｍｎ、１．１８１Ｍｗ／Ｍｎ、１．１８２Ｍｗ／Ｍｎ、１．１８３Ｍｗ／Ｍｎ、１．１８４Ｍｗ／Ｍｎ、１．１８５Ｍｗ／Ｍｎ、１．１８６Ｍｗ／Ｍｎ、１．１８７Ｍｗ／Ｍｎ、１．１８８Ｍｗ／Ｍｎ、１．１８９Ｍｗ／Ｍｎ、１．１９Ｍｗ／Ｍｎ、１．１９１Ｍｗ／Ｍｎ、１．１９２Ｍｗ／Ｍｎ、１．１９３Ｍｗ／Ｍｎ、１．１９４Ｍｗ／Ｍｎ、１．１９５Ｍｗ／Ｍｎ、１．１９６Ｍｗ／Ｍｎ、１．１９７Ｍｗ／Ｍｎ、１．１９８Ｍｗ／Ｍｎ、１．１９９Ｍｗ／Ｍｎ、１．２Ｍｗ／Ｍｎ、１．２１Ｍｗ／Ｍｎ、１．２２Ｍｗ／Ｍｎ、１．２３Ｍｗ／Ｍｎ、１．２４Ｍｗ／Ｍｎ、または１．２５Ｍｗ／Ｍｎのいずれかの多分散指数を有することができる。別の実施形態では、本明細書に記載される単離されたＰＰＳ分画は、約１．１４２〜１．２３７Ｍｗ／Ｍｎの間のＰＤＩを有することができる。

一部の実施形態では、本発明の分画されたＰＰＳ組成物は、未分画ＰＰＳと比較して、改善されたまたは同等のＰ−セレクチン遮断活性を有する。一部の実施形態では、本発明の分画されたＰＰＳ組成物は、未分画ＰＰＳと比較して同一の遮断活性を有する。さらなる実施形態では、本発明の分画されたＰＰＳ組成物は、未分画ＰＰＳと比較して、それらの百分率の間にある値を含む、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％のいずれかまたはそれを超えて改善されたＰ−セレクチン遮断活性を有する。

他の実施形態では、本発明の分画されたＰＰＳ組成物は、Ｅ−セレクチンもしくはＬ−セレクチンのいずれに対しても遮断活性を示さず、または、Ｅ−セレクチンもしくはＬ−セレクチンのいずれかに対しても低下した遮断活性を示す。一実施形態では、本発明の分画されたＰＰＳ組成物は、Ｅ−セレクチンに対して約１０％未満の遮断活性、例えば、Ｅ−セレクチンに対して約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満の遮断活性を示す。別の実施形態では、本発明の分画されたＰＰＳ組成物は、Ｌ−セレクチンに対して約３％未満の遮断活性、例えばＬ−セレクチンに対して約２％または１％未満の遮断活性を示す。

他の実施形態では、本発明の分画されたＰＰＳ組成物は、未分画ＰＰＳと比較して改善された生物学的利用能を有する。一部の実施形態では、本発明の分画されたＰＰＳ組成物は、未分画ＰＰＳと比較して、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％のいずれかまたはそれを超えて改善された生物学的利用能を有する。

さらなる実施形態では、本発明の分画されたＰＰＳ組成物は、未分画ＰＰＳと比較してそれ以下の抗凝固活性を有する。一実施形態では、本発明の未分画ＰＰＳ組成物は、未分画ＰＰＳと比較して同一の抗凝固活性を有する。別の実施形態では、本発明の未分画ＰＰＳ組成物は、未分画ＰＰＳと比較して低い抗凝固活性を有し、例えば、未分画ＰＰＳと比較して、それらの百分率の間の値を含む、約０．５、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％のいずれか、またはそれを超えて低い抗凝固活性を有する。さらなる実施形態では、本発明の分画されたＰＰＳ組成物は、未分画ＰＰＳと比較してそれ以下の抗凝固活性を有し、例えば、未分画ＰＰＳと比較して、それらの百分率の間の値を含む、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％または５％以下のいずれかの抗凝固活性を有する。
Ｃ．医薬組成物

本明細書で、本明細書に記載される単離されたペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）分画のいずれかを含む医薬製剤または組成物が提供される。本明細書で使用される場合、用語「医薬」は、疾患の治癒、治療または予防で使用することが意図され、処方または一般用医薬品として米国食品医薬品局（または、米国以外のその相当物）による承認プロセスを受けるべき化学物質を指す。そのような組成物の製剤化および投与の技術に関する詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）およびＮｉｅｌｌｏｕｄおよびＭａｒｔｉ−Ｍｅｓｔｒｅｓ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ：第２版（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出すことができる。

この開示では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体、アジュバントおよびビヒクルを含有する製剤で、経口的、非経口的、吸入噴霧剤により、局所的、経皮、眼、または直腸を含む様々な手段によって投与することができる。ここで使用される場合、非経口という用語は、限定されずに、様々な注入技術および長期の注射可能薬物または移植による、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、クモ膜下および硬膜外注射を含む。本明細書で使用される場合、動脈内および静脈内注射は、カテーテルによる投与を含む。冠内ステントおよび冠内レザバーによる投与も企図される。本明細書で使用される場合、経口という用語は、限定されずに、経口摂取、または舌下もしくは口内経路による送達を含む。経口投与は、流体飲料、エネルギーバーならびに丸剤製剤を含む。

医薬組成物は、意図された投与方法に適するいかなる形態であってもよい。経口使用のために使用されるとき、例えば、カプセル、ソフトゼラチンカプセル、サッシェもしくはスティックパック、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ、水性もしくは油性の懸濁液もしくは溶液、分散性の粉末もしくは顆粒、乳剤、軟膏、クリーム、ゲル、ハードもしくはソフトカプセル、シロップまたはエリキシル剤を調製することができる。経口使用のための組成物は、医薬組成物の製造のための当技術分野に公知である任意の方法によって調製することができ、そのような組成物は、口に合う調製物を提供するために、甘味料、着香料、着色剤、小さい有機酸または緩衝液、例えば、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸他、ならびに保存剤を含む、１つまたは複数の薬剤を含有することができる。錠剤の製造のために適する無毒の薬学的に許容される賦形剤と混合された薬物化合物で構成される錠剤が、許容される。これらの賦形剤は、例えば、不活性の希釈剤、例えば炭酸カルシウムまたは炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム、微結晶性セルロース、マルトデキストリン、マンニトール他；造粒、結合および崩壊剤、例えばメイズデンプンまたはアルギン酸；結合剤、例えばデンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム；スーパー崩壊剤、例えばクロスカルメロースナトリウム、架橋ポビドンおよびグリコール酸デンプンナトリウム；ならびに潤滑剤；例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、フマル酸ステアリルナトリウム；例えばコロイド状シリカまたはタルクなどの流動またはタック防止試薬であってよい。錠剤、カプセルまたは微粒子はコーティングしなくてもよく、または、胃腸管で崩壊および吸着を遅らせ、ならびに／またはより長い期間の持続作用を提供するために、腸溶コーティング、結腸コーティングまたはマイクロカプセル化を含む公知の技術によってコーティングされてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル単独、またはワックス併用などの時間遅延材料を用いることができる。あるいは、ポリマー、例えば、ポリエチレンオキシド、ポリアクリレートポリマーおよびコポリマー、ポリメタクリル酸メチルコポリマー、アルキル置換セルロース、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、クロスカルメロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポロキサマー、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、エチルセルロース、ペクチン、キサンタンガム、ならびに、ＦＤＡウェブサイトで公開される不活性成分ガイド（ＩＩＧ）で見られる他の薬学的経口許容ポリマーで構成される、制御放出マトリックスまたはコーティング。味覚マスキングコーティング、審美的コーティングおよび他のコーティングを使用することもできる。

拡散および浸食の任意の組合せによって薬物を放出することができ、および親水性膨潤ポリマーで構成される、ＰＰＳまたはその分画の膨潤可能な胃保持性剤形を、胃および小腸に薬物またはコーティングされた薬物の粒子を放出するのに使用することができる。ＰＰＳまたはその分画の制御放出送達が所望される場合、および結腸透過性が小腸でのそれよりかなり低いときは、胃保持性剤形が望ましい可能性がある。ＰＰＳまたはその分画のための膨潤する胃保持性剤形のための好ましいポリマーは、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）またはヒプロメロース（ＨＰＭＣ）である。大部分拡散性の放出が必要とされるとき、４，０００，０００から１０，０００，０００のより高い分子量範囲のＰＥＯが好ましい。より高い粘度のＨＰＭＣを、使用することもできる。膨潤による浸食的放出が必要であるとき、９００，０００から４，０００，０００のより低い分子量範囲が好ましい。これらの態様は米国特許第６，６３５，２８０号および第７，９７６，８７０号に記載され、それらは参照により組み込まれる。膨潤剤形。パルス方式で送達される腸溶性粒子のための胃保持性剤形は、米国特許出願第２００９００２８９４１号に記載され、それも参照により組み込まれる。これらの膨潤性剤形については、食物と一緒に与えられるときに最適な生物学的利用能が達成され、最良のタイミングはしばしば夕食と一緒のときである。ＰＰＳまたはその分画を小腸に直接的に送達することが好ましい場合には、薬物のコーティングされたもしくは腸溶性の粒子または薬物およびエンハンサーが、両方の場合にしばしば他の賦形剤とともに、浸食性の親水性ポリマーマトリックスに分散され、浸食によって放出される。エンハンサーが必要であるとき、腸管膜透過性に影響するため、またはＰＰＳもしくはその分画の生物学的利用能を増強するために、マトリックスから一緒に放出される各粒子または粒子の群は、十分なエンハンサー（単数または複数）を含有しなければならない。この制御放出送達の持続時間は短期から中期、一般的に１から８時間、好ましくは２から６時間であろう。薬物含有マトリックス層を有するだけでなく、剤形は、高分子量膨潤ポリマー、好ましくは高分子量ＰＥＯまたはＨＰＭＣで構成される第２の膨潤層を有することができる。胃での保持を助けるように設計されたこの第２の層は、重炭酸ナトリウムなどの気体発生剤をクエン酸、マレイン酸、フマル酸等などの小さい有機酸の有無にかかわらず含有することもできる。剤形は、幽門括約筋が収縮する摂食胃で、胃保持を促進するサイズに膨潤するべきである。

剤形からの放出に最小限の影響を及ぼすＯｐａｄｒｙなどの審美的コーティングで、任意の剤形をコーティングすることができる。エンハンサーの例は、胆汁酸塩、例えば、コール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、ウルソデオキシコール酸、アシルカルニチン、ラウロイルカルニチン、脂肪酸またはそれらの塩、例えば、カプリン酸、カプリル酸、ラウリン酸、オレイン酸、没食子酸エステル、ＴＰＧＳ、レシチン、ベタイン、トコフェロール誘導体、小さい有機酸、例えば乳酸、クエン酸、マレイン酸、フマル酸、ソルビン酸、酒石酸、リンゴ酸他、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬまたはＲＨ４０、Ｔｗｅｅｎ８０、グリセロールモノオレエート、グリセロールカプリレート、レシチン、ソルビタンモノラウレートおよび他のエンハンサーである。

界面活性剤およびエンハンサーを含む、薬物の分散または吸収を助ける他の賦形剤を、剤形に組み込むことができる。

経口使用のための製剤は、薬物化合物が不活性の固体希釈剤、例えばリン酸カルシウムもしくはカオリンと混合される、ハードゼラチンまたはヒプロメロースカプセルとして、または、有効成分が水または油媒体、例えば落花生油（ｐｅａｎｕｔ ｏｉｌ）、流動パラフィンもしくはオリーブ油と、または、ラブラゾル、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬもしくはＲＨ、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、Ｐｅｃｅｏｌ、レシチン他などの可溶化剤と混合されてマイクロエマルジョン、ＳＥＤＤＳまたはＳＭＥＤＤＳを形成するソフトゼラチンカプセルとして提供することもできる。

医薬組成物は、水性懸濁液の製造に適する賦形剤と混合させた水性懸濁液として製剤化することができる。そのような賦形剤には、懸濁剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム（別名クロスカルメロース）、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴム、ならびに、分散または湿潤剤、例えば天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分エステルの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が含まれる。水性懸濁液は、エチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートなどの１つまたは複数の保存剤、１つまたは複数の着色剤、１つまたは複数の着香料、およびスクロースまたはサッカリンなどの１つまたは複数の甘味剤を含むこともできる。細菌または真菌の増殖を回避するために、液体製剤に保存剤がしばしば含まれる。

植物油、例えば落花生油（ａｒａｃｈｉｓ ｏｉｌ）、オリーブ油、胡麻油もしくはヤシ油に、または流動パラフィンなどの鉱油に有効成分を懸濁することによって、油懸濁液を製剤化することができる。経口用懸濁液は、密蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコールなどの増粘剤を含有することができる。口に合う経口調製物を提供するために、上に示すものなどの甘味剤および着香料を添加することができる。これらの組成物は、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸またはその誘導体もしくは塩、トコフェロールまたはその誘導体もしくは塩、ＢＨＴ、ＢＨＡ、没食子酸プロピルもしくは他の没食子酸エステル、クエン酸、ＥＤＴＡ、チオール、例えば亜硫酸ナトリウム、異性重亜硫酸ナトリウム、システイン、モノチオグリセロールおよびＩＩＧの他のものの添加によって保存することができる。異性重亜硫酸ナトリウムはｉｎ ｖｉｔｒｏ鎌状赤血球試験で２０ｍｇ／ｍｌの濃度で鎌状赤血球化を誘導することができるが、この剤形からのヒト血液で可能な異性重亜硫酸ナトリウムの最大濃度はこの値の０．０００８倍であろう。

加水による水性懸濁液の調製に適する本開示の分散性粉末および顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１つまたは複数の保存剤と混合させた有効成分を提供する。適する分散または湿潤剤、および懸濁剤は、上で開示されるそれらによって例示される。さらなる賦形剤、例えば甘味剤、着香料および着色剤が存在してもよい。

本開示の医薬組成物は、水中油型乳剤の形であってもよい。油相は、オリーブ油または落花生油（ａｒａｃｈｉｓ ｏｉｌ）などの植物油、流動パラフィンなどの鉱油、またはこれらの混合物であってよい。適する乳化剤には、天然に存在するゴム、例えばアラビアゴムおよびトラガカントゴム、天然に存在するホスファチド、例えばダイズレシチン、脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来するエステルまたは部分エステル、例えばソルビタンモノオレエート、ならびにエチレンオキシドとのこれらの部分エステルの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが含まれる。乳剤または懸濁液を安定させるために、ＩＩＧに掲載されるいかなる界面活性剤も使用を考えることができる。乳剤は、甘味剤および着香料および保存剤を含有することもできる。

シロップおよびエリキシルは、グリセロール、ソルビトールまたはスクロースなどの甘味剤と一緒に製剤化されてもよい。そのような製剤は、緩和剤、保存剤、着香料または着色剤を含有することもできる。

本開示の医薬組成物は、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁液などの、無菌の注射可能な調製物の形であってよい。この懸濁液は、上で延べられた、適する分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用する公知の技術によって製剤化することができる。無菌の注射可能な調製物は、１，３−ブタンジオール中の溶液などの無毒の非経口的に許容される希釈剤もしくは溶媒中の無菌の注射可能な溶液もしくは懸濁液であってもよいか、または凍結乾燥粉末として調製されてもよい。用いることができる許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンガー液および等張性の塩化ナトリウム溶液がある。さらに、溶媒または懸濁媒体として、無菌の不揮発性油を従来通り用いることができる。この目的のために、合成のモノ−またはジグリセリドを含む、任意の刺激の少ない不揮発性油を用いることができる。さらに、注射剤の調製でオレイン酸などの脂肪酸を同様に使用することができる。

単一の剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、治療する宿主および特定の投与様式によって異なる。例えば、ヒトへの経口投与のための徐放性製剤は、概ね０．０１ｍｇから１０００ｍｇ、好ましくは２０から６００ｍｇの活性物質を、全組成物の約５から９９％超まで変動してよい適当および好都合な量の担体材料と混合されて含有することができる。投与のために容易に測定可能な量を提供する医薬組成物を調製することが好ましい。一般的に、全身投与されるときの有効量は約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇであり、例えば、対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）の年齢および体重、治療を必要とする正確な状態およびその重症度、投与経路を含むいくつかの因子に依存し、最終的には主治医または獣医の裁量で決められる。しかし、任意の特定患者のための具体的な用量レベルは、当業者がよく理解している通り、用いる具体的な化合物の活性、治療を受けている個体の年齢、体重、一般健康状態、性別および食事；投与の時間および経路；排泄の速度；以前に投与された他の薬物；ならびに、療法を受ける特定の状態の重症度を含む、様々な因子に依存することが理解されるであろう。

上記したように、経口投与に適する本開示の製剤は、個別の単位、例えば、有効成分の所定量を、粉末または顆粒として；水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または、水中油型の液体乳剤もしくは油中水型の液体乳剤として各々含有するカプセル、サッシェまたは錠剤として提供することができる。医薬組成物は、ボーラス、舐剤またはペーストとして投与することもできる。

剤形のための自由流動粉末は、粉末の乾燥ブレンディング、ローラー圧縮またはスラッギングによる粒状化、水性媒体または他の溶媒を使用した高剪断または流動床、噴霧乾燥、押出し、コーティング粒子または他の手段によって調製することができる。粉末または顆粒としての薬物物質および他の賦形剤は、１つまたは複数のステップで篩い分け、粉砕および混合することができる。混合は、キューブ、ドラム、タービュラ、Ｖ−もしくは他のブレンダーまたはミキサーで行うことができる。十分な流量を判定するための流量試験および適当な混合パラメータを判定するための実験計画は、当業技術者に周知である。

一実施形態では、アクリル酸、メタクリル酸またはエタクリル酸のポリマーまたはコポリマー、酢酸セルロース（およびそのコハク酸およびフタル酸誘導体）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ポリ酢酸フタル酸ビニル、ヒドロキシエチルエチルセルロースフタレート、酢酸テトラヒドロフタル酸セルロース、アクリル樹脂またはセラックから作製される腸溶コーティングがある。別の実施形態では、ポリマーは、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ；ｐＨ６より上で溶解する）、ポリ酢酸フタル酸ビニル（ＰＶＡＰ、ｐＨ５で崩壊する）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ、グレードＨＰ５０はｐＨ５で崩壊し、ＨＰ５０は、５．５で崩壊する）、メチルアクリル酸コポリマー（Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ１００およびＬ１２．５は、約６から約７の間で崩壊し、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ−３０およびＬ１００−５５は、ｐＨ５．５より上で崩壊し、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｓ１００、Ｓ１２．５およびＦＳ ３０ＤはｐＨ７より上で崩壊する）から選択される。

一部の実施形態では、コーティングは、当技術分野で周知である、可塑剤およびおそらく他のコーティング賦形剤、例えば着色料、タルクおよび／またはステアリン酸マグネシウムを含有することができ、および通常含有する。適する可塑剤には、クエン酸トリエチル（Ｃｉｔｒｏｆｌｅｘ ２）、トリアセチン（三酢酸グリセリン）、アセチルクエン酸トリエチル（Ｃｉｔｒｏｆｌｅｃ Ａ２）、Ｃａｒｂｏｗａｘ ４００（ポリエチレングリコール４００）、フタル酸ジエチル、クエン酸トリブチル、アセチル化モノグリセリド、グリセロール、脂肪酸エステル、プロピレングリコールおよびフタル酸ジブチルが含まれる。特に、アニオン性カルボン酸アクリルポリマーは、１０〜２５重量％の可塑剤、特にフタル酸ジブチル、ポリエチレングリコール、クエン酸トリエチルおよびトリアセチンを通常含有する。コーティングを塗布するために、流動床またはウースターコーターまたは噴霧もしくはパンコーティングなどの従来のコーティング技術が用いられる。コーティング厚さは、腸管の局所送達の所望の部位に到達するまで経口剤形がインタクトのままであることを確実にするのに十分でなければならない。錠剤が所望の場合、錠剤へのペレットの圧縮の間に腸溶コーティング層（単数または複数）で覆われるペレットの耐酸性が有意に減少しないように、例えばビッカース硬度で例示される機械的特性、すなわち腸溶コーティング層の柔軟性および硬度が調整されるような方法で、可塑剤の量は、各腸溶コーティング層および前記ポリマー（単数または複数）の塗布される量のために最適化される。可塑剤の量は腸溶コーティング層ポリマー（単数または複数）の５重量％を通常超える（一実施形態では、可塑剤の量は１５〜５０％である。別の実施形態では、可塑剤の量は、２０〜５０％である）。塗布される腸溶コーティングの最大厚さは、通常、加工条件および所望の溶解プロファイルによって制限されるだけである。

コーティング材料を可溶化または分散させ、コーティング性能およびコーティングされた生成物を改善するために、可塑剤の他に着色料、界面活性剤、粘着防止剤、消泡剤、滑沢剤（例えば、カルナバワックスまたはＰＥＧ）および他の添加剤をコーティングに添加することができる。腸溶コーティングの溶解を加速するために、半価層、腸溶性ポリマーのダブルコート（例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ３０ Ｄ−５５）を塗布することができ、内側の腸溶コーティングは１０％のクエン酸の存在下でｐＨ６．０までの緩衝剤を有することができ、続いて標準のＥｕｄｒａｇｉｔ Ｌ３０ Ｄ−５５の最終層が続く。

錠剤は、任意選択で１つまたは複数の副成分と一緒に、圧縮または成形によって作成することができる。圧縮錠剤は、任意選択で結合剤（例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルエチルセルロース）、滑沢剤、不活性の希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、グリコール酸デンプンナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤もしくは分散剤または他の賦形剤と混合された、粉末または顆粒などの自由流動形の有効成分を、適するタブレット成形機で圧縮することによって調製することができる。成形錠剤は、不活性の液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物の押出しによって作製することができる。錠剤は、任意選択でコーティングするか切り目をつけることができ、また、例えば所望の放出プロファイルを提供するために様々な割合でヒドロキシプロピルメチルセルロースを使用して、その中の有効成分の持続または制御放出を提供するように製剤化することができる。胃以外の腸の部分で放出を提供するために、錠剤は任意選択で腸溶または結腸溶コーティングで提供することができる。

口への局所投与のために適する製剤には、風味のある基剤、通常スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴムに有効成分を含むロゼンジ；不活性の基剤、例えばゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムに有効成分を含むトローチ；急速溶解性舌下または経口；錠剤またはフィルム；ならびに、適する液体担体に有効成分を含む洗口剤が含まれる。

直腸投与のための製剤は、例えばカカオバターまたはサリチル酸を含む適する基剤を有する坐薬として提供することができる。

膣投与のために適する製剤は、有効成分に加えて適当であることが当技術分野で公知である担体を含有する、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル剤、ペースト、フォームまたは噴霧製剤として提供することができる。

非経口投与のために適する製剤には、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬および製剤を予定レシピエントの血液と等張性にする溶質を含有することができる、水性および非水性の等張性無菌注射溶液；ならびに、懸濁剤および増粘剤を含むことができる、水性および非水性の無菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位用量または多回用量密封容器、例えばアンプルおよびバイアルで提供することができ、使用直前に無菌の液体担体、例えば注射用水の添加だけでよい、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。注射溶液および懸濁液は、前述の種類の無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。

本明細書で使用される場合、薬学的に許容される塩には、限定されずに以下のものが含まれる：酢酸塩、ピリジン、アンモニウム、ピペラジン、ジエチルアミン、ニコチンアミド、ギ酸、尿素、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、リチウム、桂皮、メチルアミノ、メタンスルホン酸、ピクリン酸、酒石酸、トリエチルアミノ、ジメチルアミノおよびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン。追加の薬学的に許容される塩は、当業者に公知である。

特定の患者のための有効量は、治療する状態、患者の全体的健康状態、投与の経路および用量ならびに副作用の重症度などの因子によって異なってもよい。治療および診断の方法のためのガイダンスが入手可能である（例えば、Maynardら（１９９６年）A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice、Interpharm Press、Boca Raton、FL；Dent（２００１年）Good Laboratory and Good Clinical Practice、Urch Publ.、London、UKを参照）。

有効量は１回の用量で与えられてもよいが、１回の用量に限定されない。したがって、投与は、医薬組成物の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれを超える回数の投与であってよい。本方法で医薬組成物の１回を超える投与がある場合は、投与は、１分、２分、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える分数の時間間隔、約１時間、２時間、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間などの間隔があけられてもよい。時間数との関連で、用語「約」は、３０分以内の任意のプラスマイナスの時間間隔を意味する。投与は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日の時間間隔およびその組合せの時間間隔があけられてもよい。本発明は、等時間の間隔をあけられる投与間隔に限定されずに、不等間隔での投与も包含する。

例えば、週１回、週２回、週３回、週４回、週５回、週６回、週７回、２週おきに１回、３週おきに１回、４週おきに１回、５週おきに１回などの投与スケジュールが、本発明で利用可能である。投与スケジュールは、例えば、１週、２週、３週、４週、５週、６週、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月および１２カ月の全期間の投与を包含する。

上記の投与スケジュールのサイクルが提供される。サイクルは、約、例えば７日おき；１４日おき；２１日おき；２８日おき；３５日おき；４２日おき；４９日おき；５６日おき；６３日おき；７０日おきなどに繰り返すことができる。非投与区間がサイクルの間に発生することができ、その区間は、約、例えば、７日；１４日；２１日；２８日；３５日；４２日；４９日；５６日；６３日；７０日などであってよい。この関係において、用語「約」は、プラスマイナス１日、プラスマイナス２日、プラスマイナス３日、プラスマイナス４日、プラスマイナス５日、プラスマイナス６日またはプラスマイナス７日を意味する。

追加の治療剤との同時投与の方法は、当技術分野で周知である（Hardmanら（編）（２００１年）Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics、第１０版、McGraw-Hill、New York、NY；PooleおよびPeterson（編）（２００１年）Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach、Lippincott、Williams & Wilkins、Philadelphia、PA；ChabnerおよびLongo（編）（２００１年）Cancer Chemotherapy and Biotherapy、Lippincott、Williams & Wilkins、Philadelphia、PA）。

ＩＩＩ．発明の方法
Ａ．ＰＰＳ分画の単離方法
本明細書において、未分画ＰＰＳと比較して（ａ）改善されたＰ−セレクチン遮断活性、（ｂ）改善された生物学的利用能、（ｃ）それ以下の抗凝固活性、および（ｄ）より少ない不均一性を有するペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）分画を単離する方法が提供される。

一部の実施形態では、本方法は、限定されずに、水を含む水溶液にＰＰＳを可溶化するステップ、有機溶媒の全体の濃度が少なくとも約５０容量％になるまで可溶化ＰＰＳに有機溶媒を段階的方式で添加するステップ、および沈殿したＰＰＳ分画を単離するステップを包含する。ＰＰＳは、限定されずに、水を含む水溶液に、それらの値の範囲内にある任意の百分率を含む、約５％、１０％、１５％、２０％、または２５％のいずれかまたはそれを超える濃度に可溶化することができる。一部の実施形態では、ｐＨは、中性を超えるｐＨに、好ましくはｐＨ８超、より好ましくはおよそｐＨ９に調整される。一部の実施形態では、分子量によってＰＰＳを沈殿させるために、有機溶媒が可溶化ＰＰＳ溶液に添加される。分子量がより高く、かつより高度に荷電した化学種が最初に沈殿するが、ＰＰＳ溶液中の有機溶媒の濃度が増加するにしたがって、次第に分子量がより低く、かつより低く荷電した化学種も溶液から沈殿する。

本明細書に記載される方法で使用される溶媒は、限定されずに、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノールまたはイソプロピルアルコールなどの有機アルコールを含む、任意の有機溶媒であってよい。本方法は、特異的ＰＰＳ分画の沈殿を引き起こすために、複数濃度の有機溶媒の段階的添加をさらに包含する。例えば、一実施形態では、有機溶媒の濃度が約２５容量％、２６容量％、２７容量％、２８容量％、２９容量％、３０容量％、３１容量％、３２容量％、３３容量％、３４容量％、３５容量％、３６容量％、３７容量％または３８容量％のいずれかに到達するまで、有機溶媒（メタノールなど）は可溶化ＰＰＳ溶液に撹拌しながら滴下方式で添加される。この時点で、溶液を遠心分離し、上清を取り除くことができる。沈殿物は、アルコール、好ましくはエタノールで洗浄して過剰な水溶液を取り除き、次に乾燥させて残りの溶媒を取り除くことができる。遠心分離および上清の除去の後に残された沈殿物は、次に再可溶化し、当技術分野で公知であるまたは下の実施例に記載される方法を使用して、分子量、毛細管電気泳動、Ｐ−セレクチン遮断活性、生物学的利用能および／または抗凝固活性などの特性について評価することができる。

さらに、次第に増加する濃度の有機溶媒（メタノールなど）の添加と、続く遠心分離、上清の除去、および沈殿物の再可溶化によって、上記の初期の分画／沈殿からの上清をさらに分画することができる。有機溶媒の任意の濃度を使用して、このプロセスを任意の回数反復することができる。例えば、ＰＰＳ沈殿およびＰＰＳ分画の以降の単離を引き起こすのに十分な有機溶媒の濃度は、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％のいずれかまたはそれを超えてもよい。一実施形態では、沈殿したＰＰＳ分画を前記のように単離して収集し、上清は、３８容量％、４３容量％、４６容量％、４８容量％、５０容量％、５３容量％および５６容量％の濃度の有機溶媒（メタノールなど）のさらなる添加を受ける。一部の実施形態では、単離したＰＰＳ分画を含む組成物であって、未分画ＰＰＳと比較して改善されたＰ−セレクチン遮断活性、改善された生物学的利用能、および／または低減された抗凝固活性を有する組成物は、５０容量％の有機溶媒（メタノールなど）を使用して単離された分画である。

Ｂ．ＳＣＤおよび関連疾患を治療するための方法
開示される組成物は、ベータグロビン遺伝子（ＨＢＢ遺伝子）に１つまたは複数の突然変異を有する対象を治療するために使用することができる。ベータグロビン遺伝子での突然変異は、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、ベータ地中海貧血症または関連した疾患もしくは状態を引き起こすことができる。ベータグロビン遺伝子での突然変異は、疾患の臨床症状の発現の前か後に同定することができる。本発明の単離されたＰＰＳ分画は、臨床症状の開始の前か後に、ベータグロビン遺伝子に１つまたは複数の突然変異を有する対象に投与することができる。したがって、一部の実施形態では、組成物は、ベータグロビン遺伝子で１つまたは複数の突然変異を診断されたが、臨床症状をまだ示さない対象に投与される。一部の実施形態では、組成物は、ベータグロビン遺伝子での１つまたは複数の突然変異と関連するかまたはそれによって引き起こされる疾患、状態または症候群の１つまたは複数の症状を示す対象に投与される。

鎌状赤血球症（ＳＣＤ）は、ヘモグロビン（すなわち、ＨＢＢ遺伝子のＧＴＧへのＧＡＧ）のベータ鎖遺伝子の第６のコドンのアデニンに代えてチミンを置換する突然変異から一般的に生じる。この突然変異は、Ｈｂベータ鎖の６位でのグルタミン酸からバリンへの置換を引き起こす。ＨｂＳと呼ばれる結果として生じるＨｂは、デオキシ条件下でポリマーを形成する物理的特性を有する。ＳＣＤは、一般的に常染色体劣性障害である。したがって、一部の実施形態では、開示される組成物および方法は、ＨｂＳＳ疾患または鎌状赤血球貧血（ＳＣＤの最も一般的な形態）とも呼ばれる、ヘモグロビンのベータ鎖遺伝子の常染色体劣性突然変異がホモ接合である（すなわち、鎌状赤血球ヘモグロビン（ＨｂＳ）がホモ接合である）対象を治療するために使用される。Ｓグロビンがホモ接合の対象は、重度のまたは中程度重度の表現型を一般的に示し、鎌状異常ヘモグロビン症で最も短い生存を有する。

鎌状赤血球体質またはキャリアー状態は、およそ４０％の鎌状赤血球ヘモグロビン（ＨｂＳ）の存在、貧血の不在、尿を濃縮することができないこと（等張尿）および血尿症によって特徴付けられるヘテロ接合形である。低酸素につながる条件の下で、それは病理学的な危険因子になる可能性がある。したがって、一部の実施形態では、開示される組成物および方法は、ヘモグロビンのベータ鎖遺伝子の常染色体劣性突然変異がヘテロ接合である（すなわち、ＨｂＳがヘテロ接合である）対象を治療するために使用される。

ベータサラセミア（β地中海貧血症）は、β−グロビンの合成の低減または不在をもたらし、無効赤血球生成、加速した赤血球破壊および重度の貧血を引き起こす、不対の不溶性α−鎖の凝集体の蓄積につながる、様々な突然変異機構によって引き起こされる一群の遺伝性血液障害である。ベータサラセミアの対象は、重度の貧血から臨床的に無症状の個体に及ぶ様々な表現型を示す。β地中海貧血症を引き起こす遺伝子突然変異は多様であり、非常に多い。突然変異は、β−グロビン遺伝子の中、近くまたは上流の、一塩基置換または欠失または挿入を含むことができる。例えば、突然変異はβ−グロビン遺伝子の５’プロモーター領域で発生するか、または異常なスプライス変異体の生成を引き起こす。臨床上の地中海貧血症症候群の例には、軽症地中海貧血症、中間型地中海貧血症および重症地中海貧血症が含まれる。

鎌状赤血球体質のキャリアーはＳＣＤを患わないが、ＨｂＳの１コピーおよびヘモグロビンの別の異常な変異体をコードする遺伝子、例えばＨｂＣまたはベータサラセミアの１コピーをもつ個体は、疾患のより重症でない形を有する。例えば、ベータグロビンの別の特異的突然変異は、異なる構造変異体、ヘモグロビンＣを引き起こす。ヘモグロビンＣ（Ｈｂ ＣまたはＨｂＣと略される）は、β−グロビン鎖の６位でのリシン残基によるグルタミン酸残基の置換がある、異常ヘモグロビンである。ＨｂＳおよびＨｂＣに複合ヘテロ接合体である（ＨｂＳＣ疾患）対象は、中等度の臨床重症度の症状によって一般的に特徴付けられる。ベータ地中海貧血症は、正常なβ−グロビン鎖の低減された（β＋）または不在の（β°）生成によって特徴付けられる。ＨｂＳおよびβ＋−地中海貧血症に複合ヘテロ接合体である（ＨｂＳ／β＋地中海貧血症）対象は、ＨｂＳＣ疾患などの中等度の臨床重症度の症状によって一般的に特徴付けられる。ＨｂＳおよびβ°地中海貧血症に複合ヘテロ接合体である（ＨｂＳ／β°地中海貧血症）対象は、ホモ接合のＨｂＳＳ（ＳＣＡ）などの重度の臨床症状によって一般的に特徴付けられる。

ベータグロビンの別の一般的な構造変異体は、ヘモグロビンＥまたはヘモグロビンＥ（Ｈｂ Ｅ；ＨｂＥ）である。ＨｂＥは、β−グロビン鎖の２６位でのリシン残基によるグルタミン酸残基の置換が発生した、異常ヘモグロビンである。ＨｂＳおよびＨｂＥに複合ヘテロ接合体である対象はＨｂＳ／ＨｂＥ症候群を有するが、それはＨｂＳ／β＋地中海貧血症と類似の表現型を通常有する。

他の異常ヘモグロビンとのＨｂＳの稀な組合せには、ＨｂＤロサンゼルス、Ｇ−フィラデルフィア、ＨｂＯアラブ他が含まれる。したがって、一部の実施形態では、開示される組成物および方法は、対象をＨｂＳ／β°遺伝子型、ＨｂＳ／β＋遺伝子型、ＨｂＳＣ遺伝子型、ＨｂＳ／ＨｂＥ遺伝子型、ＨｂＳ／ＨｂＤロサンゼルス遺伝子型、ＨｂＳ／Ｇ−フィラデルフィア遺伝子型またはＨｂＳ／ＨｂＯアラブ遺伝子型で治療するために使用される。

開示される方法のいくつかは、対象に第２の活性薬剤、例えば、ビタミン剤、栄養補助剤、抗不安薬、抗うつ薬、抗凝固剤、凝固因子、抗炎症薬、ステロイド、例えばコルチコステロイド、鎮痛薬などを投与するステップを含む。一部の実施形態では、組成物は、鎌状赤血球症、ベータサラセミアまたは関連障害の治療のために、１つまたは複数の追加の活性薬剤と組み合わせて同時投与される。そのような追加の活性薬剤には、限定されずに、葉酸、ペニシリンまたは別の抗生物質、好ましくはキノロンまたはマクロライド、抗ウイルス薬、抗マラリア予防薬、および疼痛危機を制御する鎮痛薬を含めることができる。一部の実施形態では、組成物は、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現を増加させる１つまたは複数の追加の薬剤、例えばヒドロキシ尿素と同時投与される。

ＳＣＤまたは関連障害を有する対象では、ＲＢＣの生理的変化は、以下の徴候を有する疾患をもたらすことができる：（１）溶血性貧血；（２）血管閉塞危機；および（３）心臓、骨格、脾臓および中枢神経系を含む、微小梗塞からの複数の器官傷害。このように、本明細書に記載される組成物は、ＳＣＤの以下の症状の１つまたは複数を示す対象に、組成物の臨床有効量を投与することによって、ＳＣＤのこれらの一般的な症状のいずれかを緩和するために使用することができる。

ＳＣＤは、溶血性貧血の形態である。対象がＨｂＳに関してホモ接合であるＳＣＤの一部の形態では、赤血球の生存は、１２０日の正常な赤血球生存と比較しておよそ１０〜２０日である。溶血の概ね３分の１は血管内で発生し、血漿中に遊離ヘモグロビン（血漿遊離ヘモグロビン［ＰＦＨ］）およびアルギナーゼを放出する。ＰＦＨは、スカベンジング一酸化窒素（ＮＯ）、炎症誘発性ストレスおよび凝固障害を含む内皮損傷と関連付けられ、血管運動神経不安定性および増殖性脈管障害をもたらす。この増殖性脈管障害の可能な影響は、成人期における肺高血圧の発達である。

小血管内の血液の循環が鎌状赤血球によってふさがれるとき、血管閉塞危機が発生し、虚血損傷を引き起こす。この障害のある血流は、血管内皮へのＳＲＢＣのよりねばねばしたサブセットの接着、ＨｂＳ重合とＳＲＢＣの鎌状赤血球化および硬直化を誘導する低酸素圧へのＳＲＢＣのより長い曝露、ならびに粘着性ＳＲＢＣの後のより硬直したＳＲＢＣの物理的トラッピングの結果である。最も一般的な愁訴は疼痛であり、再発性の発症は不可逆的器官傷害を引き起こすことができる。最も重度の形態の１つは急性の胸部症候群であり、それは肺実質の梗塞の結果として発生する。血管閉塞性の危機は疼痛危機が付随することがあり、それは、突然発生すること、および数時間から数日にわたって持続することがある。疼痛は、体の任意の部分に影響することができる。それは、腹部、骨、関節および軟組織をしばしば巻き添えにし、それは指炎（児童における両側性の痛みを伴う腫脹した手および／または足）、急性の関節壊死もしくは無血管壊死、または急性腹症として現れることがある。脾臓における反復発症により、生命にかかわる感染症の素因になる梗塞および自己脾臓摘出が通常ある。肝臓も梗塞を起こすこと、および時間とともに不全に進行することがある。乳頭状壊死は血管閉塞の一般的な腎臓発現症状であり、等張尿（すなわち、尿を濃縮することができないこと）および血尿症につながる。長骨を含む四肢に、重度の深部疼痛が存在する。腹部の疼痛は重度になることがあり、急性腹症に似る。それは、他の部位または腹腔内固形器官または軟組織梗塞からの投射痛からもたらされることがある。反応性イレウスは、腸管膨張および疼痛につながる。骨の疼痛および腹部疼痛が存在することがある。顔も巻き込まれる可能性がある。疼痛は、発熱、倦怠感および白血球増加が付随することがある。

ＳＣＤの骨格の発現症状には、限定されずに、骨および骨髄の梗塞、溶血性貧血を補償する骨髄過形成、二次性の骨髄炎、二次性の成長不良、血管内血栓形成、骨壊死（無血管壊死／無菌性壊死）、変性骨および関節破壊、骨溶解（急性梗塞で）、関節崩壊、脊髄硬化、骨膜反応（成人では珍しい）、ジストロフィー様の髄質石灰化、骨内骨の外見、頭蓋密度の減少、板間層の拡大による頭蓋外板の厚さの減少、頭蓋冠の毛髪末端の条線、時には両凹椎骨につながる骨粗しょう症、長くて平らな骨での小柱の結晶粒粗大化、および病的骨折、骨の短縮（早発の骨端融合）、カップ状骨幹端による骨端奇形、遠位大腿骨のペグ−イン−ホール欠陥、および椎骨の高さの減少（低い背丈および脊柱後側弯）が含まれる。

ＳＣＤの腎臓発現症状には、限定されずに、様々な機能的異常、例えば、血尿症、近位尿細管機能不全、カリウム排泄障害、およびカリウム過剰血、糸球体ろ過速度の減少、および透析または腎移植を必要とする可能性がある明白な腎不全；ならびに、肉眼的解剖学的変化、例えば、特徴的な平滑な嚢表面を有する肥大した腎臓が含まれる。

ＳＣＤの脾臓の発現症状には、限定されずに、脾臓の腐骨形成危機として知られる急速なおよび／または痛みを伴う拡大を含む拡大、梗塞、洞様脈管および脾索における低ｐＨおよび低酸素圧、機能的障害、自己脾臓摘出（進行症例における脾臓の線維症および縮小）、免疫欠損および敗血症の危険の増加の１つまたは複数を含めることができる。

Ｃ．生物学的でＰＰＳまたはその分画を検出する方法
本明細書において、生物学的でＰＰＳまたはＰＰＳ分画（例えば本明細書に開示されるＰＰＳ分画のいずれか）を検出する方法も提供される。尿中排泄に基づいて、３００〜４５０ｍｇを投与したヒトで、ＰＰＳは３％〜６％の吸収を報告した（Ｅｌｍｉｒｏｎ添付文書）。６％の吸収を仮定すると、１００ｍｇの経口用量は、３．４Ｌの平均血漿容量中に６ｍｇのＰＰＳまたは１．８μｇ／ｍＬをもたらすだろう。

MacGregorら（１９８５年、Thrombosis Haemostasis、５３巻（３号）：４１１〜４頁）によって記載されるように、彼らのＥｌｍｉｒｏｎ ＮＤＡのためのＰＫ分析では、Ｂａｋｅｒ Ｎｏｒｔｏｎは、１２５Ｉ−ＰＰＳの公知の量に競合するポリブレン−セファロースへの電荷をベースとした親和性を利用する競合結合アッセイを使用した。この方法の報告された感度は血漿中で１０ｎｇ／ｍＬであるが、ＮＤＡのＦＤＡレビュアーはこのアッセイの検証の欠如についてコメントした。このアッセイは、実験的に有益であると考えられるための感度レベルが欠如していた。

ＰＰＳを検出するポリクローナルＥＬＩＳＡアッセイが開発されている。しかし、ＰＰＳをヒトまたはラットの血漿と混合したとき、２００ｎｇ／ｍＬ未満の水性緩衝液でのこれらのアッセイの感度は失われた。これらのアッセイのさらなる欠点は、ウサギで生成された抗体が有限の利用可能性を有するということである。

マイクロ流体工学アプローチまたは質量分析（ＭＳ）の方法を使用した血液中のＰＰＳの検出のためのスクリーニングを開発する努力は不成功だった。ＭＳ方法に関して、血漿中を含めてＰＰＳが検出されたが、多重ピークおよびバックグラウンド質量干渉でかなりの問題があった。

したがって、本明細書で、個体への投与の後にＰＰＳまたはＰＰＳ分画（例えば、本明細書で提供されるＰＰＳ分画のいずれか）を測定する、高感度で定量可能なアッセイが提供される。本方法は、試料をプロテアーゼと接触させるステップ；試料中のＰＰＳまたはＰＰＳ分画を抽出して沈殿させるステップ；およびＰＰＳまたはＰＰＳ分画に結合する抗体と試料を接触させるステップであって、抗体は検出が直接的または間接的に可能であるステップ；および抗体を検出し、それによって生物学的中のＰＰＳまたはＰＰＳ分画の存在を検出するステップを含む。

生物学的は、動物または個体への投与の後の、ＰＰＳまたはＰＰＳの特異的分画を含有する個体からの任意の試料であってよい。したがって、生物学的には、限定されずに、血液、尿、唾液、汗、涙、精液、母乳または糞便を含めることができる。一部の実施形態では、生物学的は、血液または血液に由来する生成物、例えば、限定されずに血清または血漿である。

本方法は、約０．５ｎｇ／ｍＬから約１０ｎｇ／ｍＬの間の検出下限（ＬＬＯＤ）（２×シグナル／バックグラウンド）を有するＰＰＳまたはその分画の存在を検出することができる。一部の実施形態では、ＬＬＯＤは、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約５ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約２．５ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約１．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ〜約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ〜約５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ〜約２．５ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ〜約７．５ｎｇ／ｍＬまたは約２ｎｇ／ｍＬ〜約５ｎｇ／ｍＬの間である。他の実施形態では、ＬＬＯＤは、約０．１ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．６ｎｇ／ｍＬ、０．７ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、０．９ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１．１ｎｇ／ｍＬ、１．２ｎｇ／ｍＬ、１．３ｎｇ／ｍＬ、１．４ｎｇ／ｍＬ、１．５ｎｇ／ｍＬ、１．６ｎｇ／ｍＬ、１．７ｎｇ／ｍＬ、１．８ｎｇ／ｍＬ、１．９ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、２．１ｎｇ／ｍＬ、２．２ｎｇ／ｍＬ、２．３ｎｇ／ｍＬ、２．４ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、２．６ｎｇ／ｍＬ、２．７ｎｇ／ｍＬ、２．８ｎｇ／ｍＬ、２．９ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、３．１ｎｇ／ｍＬ、３．２ｎｇ／ｍＬ、３．３ｎｇ／ｍＬ、３．４ｎｇ／ｍＬ、３．５ｎｇ／ｍＬ、３．６ｎｇ／ｍＬ、３．７ｎｇ／ｍＬ、３．８ｎｇ／ｍＬ、３．９ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、４．１ｎｇ／ｍＬ、４．２ｎｇ／ｍＬ、４．３ｎｇ／ｍＬ、４．４ｎｇ／ｍＬ、４．５ｎｇ／ｍＬ、４．６ｎｇ／ｍＬ、４．７ｎｇ／ｍＬ、４．８ｎｇ／ｍＬ、４．９ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、５．１ｎｇ／ｍＬ、５．２ｎｇ／ｍＬ、５．３ｎｇ／ｍＬ、５．４ｎｇ／ｍＬ、５．５ｎｇ／ｍＬ、５．６ｎｇ／ｍＬ、５．７ｎｇ／ｍＬ、５．８ｎｇ／ｍＬ、５．９ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、６．１ｎｇ／ｍＬ、６．２ｎｇ／ｍＬ、６．３ｎｇ／ｍＬ、６．４ｎｇ／ｍＬ、６．５ｎｇ／ｍＬ、６．６ｎｇ／ｍＬ、６．７ｎｇ／ｍＬ、６．８ｎｇ／ｍＬ、６．９ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、７．１ｎｇ／ｍＬ、７．２ｎｇ／ｍＬ、７．３ｎｇ／ｍＬ、７．４ｎｇ／ｍＬ、７．５ｎｇ／ｍＬ、７．６ｎｇ／ｍＬ、７．７ｎｇ／ｍＬ、７．８ｎｇ／ｍＬ、７．９ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、８．１ｎｇ／ｍＬ、８．２ｎｇ／ｍＬ、８．３ｎｇ／ｍＬ、８．４ｎｇ／ｍＬ、８．５ｎｇ／ｍＬ、８．６ｎｇ／ｍＬ、８．７ｎｇ／ｍＬ、８．８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、９．１ｎｇ／ｍＬ、９．２ｎｇ／ｍＬ、９．３ｎｇ／ｍＬ、９．４ｎｇ／ｍＬ、９．５ｎｇ／ｍＬ、９．６ｎｇ／ｍＬ、９．７ｎｇ／ｍＬ、９．８ｎｇ／ｍＬ、９．９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１０．５ｎｇ／ｍＬ、１１ｎｇ／ｍＬ、１１．５ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１２．５ｎｇ／ｍＬ、１３ｎｇ／ｍＬ、１３．５ｎｇ／ｍＬ、１４ｎｇ／ｍＬ、１４．５ｎｇ／ｍＬまたは１５ｎｇ／ｍＬである。

一部の実施形態では、本明細書に開示される本方法で使用するための検出可能な抗体は、当技術分野で周知である方法によって、ＰＰＳまたはＰＰＳの分画（例えば、本明細書に開示されるＰＰＳ分画のいずれか）を免疫原として使用して生成される。抗体はモノクローナル抗体またはその機能的断片であってよく、標識を通して直接的または間接的に検出可能であってよい。抗体に関して用語「標識された」は、抗体に検出可能な物質をカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことによる抗体の直接的標識化、ならびに直接的に標識される別の試薬との反応性による抗体の間接的標識化の両方を包含する。間接的標識化の方法は、標識化二次抗体を使用することによる、抗ＰＰＳまたは抗ＰＰＳ分画モノクローナル抗体の検出を含む。直接的に検出可能な標識の例には、酵素（例えば、限定されずに、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ）、補欠分子族（例えば、限定されずに、ストレプトアビジン／ビオチンまたはアビジン／ビオチン）、蛍光体（例えば、限定されずに、ＦＩＴＣまたはテキサスレッド）、タンパク質（例えば、限定されずに、緑色蛍光性タンパク質ＧＦＰ）または放射性同位体（例えば、限定されずに、^３Ｈ、^３５Ｓまたは^１２５Ｉ）が含まれる。

さらなる実施形態では、ＰＰＳまたはＰＰＳの分画は、有機溶媒（例えば、限定されずに、クロロホルム）で抽出し、次に塩（例えば、限定されずに、酢酸アンモニウム）で沈殿させた後に、抗体と接触させることができる。抽出／沈殿ステップに関連したさらなる情報は、Mielkeら、（１９９９年、Clin Appl Thrombosis/Hemostasis、５巻（４号）：２６７〜７６頁に見出すことができ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。

同様に、他の実施形態では、生物学的のタンパク含有量を減少させるために、生物学的をプロテアーゼと接触させる。プロテアーゼの市販の供給源は広く利用可能であり、例えばプロナーゼが含まれ、それは、個々のアミノ酸への完全なまたはほぼ完全な消化につながる、変性したおよび天然のタンパク質の両方にわたる活性を有する、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓの細胞外液から単離されるプロテアーゼの混合物である。一部の実施形態では、生物学的の１００μＬごとに、約５０〜１５０単位（Ｕ）、７５〜１２５Ｕ、９０〜１１０Ｕまたは９５〜１０５Ｕのいずれかのプロテアーゼが使用される。他の実施形態では、生物学的の１００μＬごとに、７５Ｕ、８０Ｕ、８５Ｕ、９０Ｕ、９５Ｕ、１００Ｕ、１０５Ｕ、１１０Ｕ、１１５Ｕ、１２０Ｕまたは１２５Ｕ（これらの数値の間にある全ての値を含む）のいずれかのプロテアーゼが使用される。他の実施形態では、プロテアーゼ消化は、約３５℃から約３９℃の間、例えば、約３５℃、３６℃、３７℃、３８℃または３９℃のいずれかで行われる。さらに他の実施形態では、試料は、約１〜４８時間、例えば約５〜４０時間、約１０〜３０時間、約１５〜２５時間、約１８〜２０時間のいずれか、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０時間のいずれかまたはそれ超えの時間、プロテアーゼと接触させる。
ＩＶ．キット

さらに、本発明は、単離されたペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）分画、例えば本明細書に記載されるそれらのいずれか、ならびに１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、担体、アジュバントまたはビヒクル、例えば本明細書に記載されるそれらのいずれかを含む、１つまたは複数のキットを含む。本記載の方法を実施するために有益な他の材料が、キットの一部として含まれてもよい。例えば、キットは、未分画ＰＰＳに由来するＰＰＳ分画を取得し、保存するのに必要な緩衝液または実験器具を含むことができる。組成物またはキットをどのように使用するかをユーザーに指示するために、本記載の方法に含まれるステップを記載する文書資料が含まれてもよい。キットは、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）に関連した症状を治療または予防するための、単離されたＰＰＳ分画およびそれを含む関連した医薬組成物を使用するための説明書を含むことができる。

この明細書全体で与えられるあらゆる最大数値限界は、そのようなより低い数値限界が本明細書に明示的に記述されているかのように、あらゆるより低い数値限界を含むことが意図されている。この明細書全体で与えられるあらゆる最小数値限界は、そのようなより高い数値限界が本明細書に明示的に記述されているかのように、あらゆるより高い数値限界を含むであろう。この明細書全体で与えられるあらゆる数値範囲は、そのようなより狭い数値範囲が本明細書に全て明示的に記述されているかのように、そのようなより広い数値範囲に入るあらゆるより狭い数値範囲を含むだろう。
本発明は、例示として提供され、限定するものではない以下の実施例を参照することによって、さらに理解することができる。

（実施例１：ＰＰＳの分画）
市販されているＰＰＳは、約４〜６ｋＤａと報告される分子量（ｍｗ）を有する。この化合物のＰ−セレクチン遮断活性対濃度の幅は５桁超であり（Kutlarら、（２０１２年）Am J Hematol、８７巻、５３６〜５３９頁とオンライン補足資料）、活性が多様な分子群によって提供され、その一部は不均衡な活性を提供することを表す。この実施例は、ＰＰＳがＰＰＳの異なる分子量または他の特性によって別個の実体に分画することができることを実証し、それらは活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）および／または他の機能的活性についてアッセイすることができる。

材料および方法
未分画ＰＰＳは、ｂｅｎｅ ｐｈａｒｍａＣｈｅｍ、ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｉｔｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られた。ＰＰＳをＨ_２Ｏに溶解させて、１０％溶液を作製した。この実施例では、１００ｇの固体を１００ｍＬの全体溶液に溶解させた。この溶液のｐＨは、ＮａＯＨの添加によっておよそ９．０に調整した。有機溶媒（この実施例では、メタノール）を滴下方式で添加し（撹拌中に）、３８容量％の全体濃度にした。高分子量分画が最も低可溶性であり、メタノールなどの有機溶媒を添加することはそれらの溶解性に影響するので、メタノールを添加した。高分子量分画が、溶液から最初に沈殿した。第１の分画を取り除き、全溶液を次に遠心分離した。次に上清にメタノールを同様に添加して全体濃度を４３容量％にし、生じた沈殿（第２の分画）を取り除いて、前記のように溶液を再び遠心分離した。これらのステップを次に繰り返し、メタノールの濃度を４６％（分画３）、４８％（分画４）、５０％（分画５）、５３％（分画６）、５６％（分画７）、６０％（分画８）、６７％（分画９）および１００％（分画１０）まで増加させた。各分画のために、結晶からできるだけ多くの水性溶液を取り除くために、追加のエタノールを使用して沈殿物をさらに洗浄した。

分画の分子量は、屈折率（ＲＩ）によって同定し、表Ｉに各分画の活性化部分トロンボプラスチン時間とともに示す（ＡＰＴＴ；Marlarら、（２００８年）One-Stage Prothrombin Time (PT) Test and Activated Partial Thromboplastin Time (APTT) Test; Approved Guideline-Second Edition、第２版、１〜３１頁、Clinical and Laboratory Standards Institute、Wayne、PAを参照）。

（実施例２：強健なＰ−セレクチン遮断活性を有する均一なＰＰＳ分画の同定）
この実施例の目的は、選択的メタノール（ＭｅＯＨ）沈殿によって調製された８個の中から少なくとも未分画ＰＰＳと等しいＰ−セレクチン遮断比活性を有するペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）分画を同定することであった（Stajic.（２０１０年）A SULFATED POLYSACCHARIDE COMPOUND AND THE PREPARATION AND USE THEREOF、（PCT編）、１〜９１頁、Parnell Laboratories Pty Ltd.）。理想的な分画の追加の特性は、低い多分散および低分子量（ｍｗ）として下で記載される、より均一な組成であり、それは経口生物学的利用能（ＢＡ）を増加させると予測される。

材料および方法
１．８８ｇ／Ｌ ＮａＰＯ４／イソプロピルアルコール／テトラヒドロフラン溶媒と８０／１０／１０水と直列の２つのＪｏｒｄｉスルホン化プラス混合床カラムおよびＪｏｒｄｉスルホン化プラス１０００Åカラムによる、三重検出ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して、８個のＰＰＳ分画の分子量（ｍｗ）を再調査した（Striegel, A.、Yau, W. W.、Kirkland, J. J.およびBly, D. D.（２００９年）Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography: Practice of Gel Permeation and Gel Filtration Chromatography、第２版、２版、Wiley、Hoboken）。

シアリルルイスＡ（ｓＬｅＡ）へのＰ−セレクチン結合のアッセイを使用して、ＰＰＳ試験アイテムの分子Ｐ−セレクチン遮断活性を判定した（Kutlarら、（２０１２年）Am J Hematol、８７巻、５３６〜５３９頁とオンライン補足資料）。０．０５から５０００μｇ／ｍＬの範囲の最終濃度まで、試験アイテムをＰ−ｓｅｌ−Ｉｇ溶液に希釈した。インキュベーションおよび洗浄の後、ヤギ抗ヒトＩｇ、発色およびマイクロプレートリーダーを使用して、ｓＬｅＡに結合したＰ−ｓｅｌ−Ｉｇを定量した。非線形曲線をあてはめるためにＰｒｉｓｍソフトウェア（Miller, J. R.（２００３年）GraphPad Prism Version 4.0 Step-by-Step Examples, In Nonlinear Standard Curves: RIA and ELISA、GraphPad Software, Inc.、San Diego）を用い、各試験アイテムの、Ｐ−セレクチン結合が５０％阻害される濃度（ＩＣ５０）（より低いＩＣ５０値はより大きな遮断活性を表す。）を判定するために４−パラメータアルゴリズム（Plikaytisら、（１９９１年）Journal of clinical microbiology、２９巻、１４３９〜１４４６頁；FindlayおよびDillard、（２００７年）The AAPS journal、９巻、Ｅ２６０〜２６７頁）を用いて、平均した３反復データを分析した。表ＩＩのＭｗ値を使用して、ＩＣ５０値を比活性（ＳＡ）に変換した。

結果
屈折率（ＲＩ）によって判定された元のｍｗおよび三重検出ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）による３つの新しいｍｗ判定（ＲＩ、光散乱［ＬＳ］、粘度法）を、表ＩＩに示す。ＧＰＣおよびＲＩによって判定される数平均ｍｗ（Ｍｎ）は、試料の最も低いｍｗ部分に関する情報を提供する；ＧＰＣ ＬＳによって判定される重量平均ｍｗ（Ｍｗ）は、クロマトグラフピークの中心に最も近い平均ｍｗである；ＧＰＣ粘度法によって判定されるＺ平均ｍｗ（Ｍｚ）は、試料のより大きなｍｗ部分を反映する。Ｍｗ／Ｍｎは、多分散指数（ＰＤＩ）である。ＰＤＩ＜１．２は、単分散の（単分子の；均一な）試料を反映する。ＰＤＩ＞１．２は、多分散の（多分子の；不均一な）試料を反映する。

分画３〜９はＰＰＳより多分散しておらず、分画５〜９はＰＤＩ＜１．２を有し、それはより一貫した吸収および薬力学的活性を予測する。ここで、ＰＤＩ≦１．２５は、単離されたＰＰＳ分画と考えるのに十分に均一であると考えられる。より低いＭｗおよびより大きな均一性のそれらの組合せのため、これらの分析の後に分画５〜９は有望な候補とみなされた。

ＰＰＳ試験アイテムの分子Ｐ−セレクチン遮断活性に関しては、図１および表ＩＩは、分画３だけがＭｗ＞ＰＰＳを有し、分画３〜５がＰ−セレクチン遮断比活性＞ＰＰＳを有し；分画６〜９がＭｗ＜ＰＰＳおよび次第により低いＰ−セレクチン遮断比活性を有したことを示す（表Ｉ；図１）。そのより大きなＰ−セレクチン遮断比活性、より低いＭｗおよび均一性のために、分画５はさらなる研究のための可能な候補とみなされた。分画６および７は未分画ＰＰＳより低いＰ−セレクチン遮断活性を有したが、それらは未分画ＰＰＳより低い不均一性およびより低いＭｗを、可能なまたは測定されたより大きな経口生物学的利用能とともに有していた。したがって、これらの候補も、将来の開発のための可能な代替物と考えられた。

Ｐ−セレクチン媒介細胞接着に及ぼす添加された化合物の阻害効果を判定するために、Ｐ−セレクチン遮断活性もまた、流動条件下で固定化組換えヒトＰ−セレクチン−ＩｇへのＨＬ６０細胞接着を使用してアッセイされた（Frangosら、（１９８８年）Biotechnol Bioeng、３２巻、１０５３〜１０６０頁；Matsuiら、（２００２年）Blood、１００巻、３７９０〜３７９６頁）。これらの研究では、それらの豊富なＰ−セレクチンリガンド（Wilkinsら、（１９９５年）J Biol Chem、２７０巻、２２６７７〜２２６８０頁）がＰ−セレクチン遮断の強健なアッセイを提供するので、ＨＬ−６０細胞を使用した。ＨＬ−６０細胞懸濁液の流れは、全体を通して正常な後毛細管細静脈流量の１ダイン／ｃｍ^２剪断応力（Turitto, V. T.（１９８２年）Prog. Hemost. Thromb.６巻、１３９〜１７７頁）および３７℃に維持した。細胞接着は、ビデオ顕微鏡法を使用して捕捉した。Ｐ−セレクチン媒介細胞接着の遮断に関する予備的結果は、上で詳述される分子接着結果と整合していた。一般に、ローリング細胞の数の減少およびローリング細胞の速度の増加に及ぼす効果は、分画のｍｗに正比例して低下した。

要約すると、この実施例は、Ｐ−セレクチン遮断比活性≧ＰＰＳを有する最も低いｍｗのＰＰＳ分画として分画５を同定し、およびそれらのより低いｍｗに基づいて、分画５〜９の全てをさらなる生物学的利用能／薬物動態学（ＢＡ／ＰＫ）研究のための候補として同定した。

（実施例３：増加した抗凝固剤活性を有するＰＰＳ分画の同定）
この実施例のこの目標は、出血性副作用と潜在的に関連する可能性がある予想外に高い抗凝固活性を有するＰＰＳ分画を同定して、開発から排除することであった。この懸念は、ＡＰＴＴに及ぼすＰＰＳ分画の効果に及ぼす、ｍｗの観察された影響に基づく（表１を参照）。

材料および方法
ＡＰＴＴ、抗Ｘａ活性およびトロンビン時間（ＴＴ）に及ぼす、プールされた正常ヒト血漿に溶解させた８つのＰＰＳ試験アイテム（分画１０は試験されていない）の異なる濃度の効果のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを、公知の方法によって実行した（Soriaら、（１９８０年）Thromb Res、１９巻、４５５〜４６３頁；Scullyら、（１９８３年）Thromb Res、３１巻、８７〜９７頁；Sieら、（１９８６年）Br J Haematol、６４巻、７０７〜７１４頁；Wagenvoordら、（１９８８年）Thromb Haemost、６０巻、２２０〜２２５頁；Marlarら、（２００８年）One-Stage Prothrombin Time (PT) Test and Activated Partial Thromboplastin Time (APTT) Test; Approved Guideline-Second Edition、第２版、１〜３１頁、Clinical and Laboratory Standards Institute、Wayne、PA）。各試験アイテムの濃度は、ＰＰＳが、各アッセイで１×と指定された効果（ＡＰＴＴでは約７．５μｇ／ｍＬ、抗Ｘａでは４０μｇ／ｍＬおよびＴＴでは２５μｇ／ｍＬ）を有することが報告されたそれであった。アッセイは、２反復で判定された。

結果
各アッセイについて、ＰＰＳを含有していないプールされたヒト血漿での反復試験（ｎ＝２０）によって、正常範囲を確立した。結果を、表ＩＩＩに示す。

これらの結果は、分画３だけがＰＰＳより大きな抗凝固活性を有することを実証した。分画６の外れ値ＡＰＴＴ結果は、ピペットの誤操作によると判断された。アッセイは、相対濃度４×、２×、０．５×および０．２５×でも行い、これらの結果も分画３だけがＰＰＳより大きな抗凝固効果を有することを示した。

（実施例４：ＰＰＳ分画の経口生物学的利用能および薬物動態）
この実施例の狙いは、親ＰＰＳ組成物より大きな経口ＢＡを有するＰＰＳ分画を同定することであった。前述の実施例で同定されたＰＰＳ分画５および７と未分画ＰＰＳの特性を、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ；Ｃｙｎｏｓ）で比較した。ＰＰＳと比較してより低い分子量でのその一貫して優れた特性、より少ない多分散、より大きなＰ−セレクチン遮断活性およびそれ以下の抗凝固活性のために、分画５を選択した。分画７は、その予測されたより良好な経口生物学的利用能（そのより低い分子量に基づく）がより良好な全体的薬学特性を提供するかどうか判定するために、その大いにより低いＰ−セレクチン遮断活性にもかかわらず選択された。

材料および方法
分画５、分画７およびＰＰＳは、標準の方法によってトリチウムガスを使用して放射標識し、Ｃｙｎｏｓでの試験のために提供された。使用した試料は、５３．７ｍＣｉ／ｍｇの明記された比活性を有する［^３Ｈ］ＰＰＳ−５、６５ｍＣｉ／ｍｇの明記された比活性を有する［^３Ｈ］ＰＰＳ−７および３０６ｍＣｉ／ｍｇの明記された比活性を有する［^３Ｈ］ＰＰＳであった。

Ｃｙｎｏｓへの［^３Ｈ］ＰＰＳ、［^３Ｈ］ＰＰＳ−５または［^３Ｈ］ＰＰＳ−７の単一経口用量の後に、全体の放射能の血漿中薬物動態、排泄および経口生物学的利用能（ＢＡ）を判定するために、［^３Ｈ］ＰＰＳ、［^３Ｈ］ＰＰＳ−５および［^３Ｈ］ＰＰＳ−７の単一用量経口薬物動態学的研究をＣｙｎｏｓで実行した。この非ＧＬＰ研究は、プロトコールおよび試験施設標準操作手順および標準の放射線安全作業法に従って実行された。磁気撹拌プレートの上の撹拌棒および／または超音波処理を使用して、［^３Ｈ］ＰＰＳ、［^３Ｈ］ＰＰＳ−５または［^３Ｈ］ＰＰＳ−７および対応する非標識のＰＰＳ、ＰＰＳ−５またはＰＰＳ−７（適宜）の適当な量を、ガラス容器中の適当な量の水に溶解させた。透明な溶液が得られるまで、製剤を撹拌した。同位体的に希釈した［^３Ｈ］ＰＰＳ、［^３Ｈ］ＰＰＳ−５または［^３Ｈ］ＰＰＳ−７を含有する用量製剤を、０．５ｍｇ／ｍＬの全体濃度で、およびビヒクル中に概ね６０〜６５μＣｉ／ｍＬの放射濃度で調製した。投与の前後の放射性標識濃度および均一性の判定のために、各用量溶液の３つのランダムに選択したアリコートを分析した。用量の調製物を、ｍｇ／ｍＬの公称濃度、比活性、各動物に投与されたｍＣｉの数および体重１ｋｇあたりのｍｇの用量とともに記録した。

各動物は、経口強制栄養を通して１６ｍｇおよび２ｍＣｉを受けた。投与製剤は投与の１日前に調製して、用量投与の前に２〜１０℃を維持するように設定した冷蔵庫に保存した。用量製剤は投与のために周囲温度に暖め、投与中止の間、絶えず撹拌しながら周囲温度に維持した。

用量製剤アリコートの液体シンチレーション計数（ＬＳＣ）による投与の前後に、用量製剤からの濃度分析および均一性試験のために、放射能濃度／均一性を３反復で判定した。これらの研究で使用されたＣｙｎｏｓは、実験室育ちで実験的に非ナイーブの保存コロニーからのものであった。２〜６才で、体重＞４ｋｇの９頭の雄を使用した。薬物動態学的研究ではサルが一般的に使用され、適当な規制機関によって受け入れられている。この研究で使用される動物の総数は、研究目的を適切に達成するのに必要な最小値であった。この決定は、このタイプの研究のために確立された産業規則に基づいた。動物はそれらの供給元から受けとり、施設ＳＯＰによる施設および管理条件に順応させた。研究に放す前に、獣医スタッフメンバーが動物の健康状態を精査した。投与および試料収集の間、動物はステンレス鋼ケージに個々に収容し、動物の部屋およびケージの洗浄は試験施設ＳＯＰにより実施し、Ｐｕｒｉｎａ認定食Ｎｏ．５０４８または同等物を動物のサイズおよび年齢に適当な量で毎日提供した。それらのホームケージ内の動物にとって、水道水が無制限に利用可能だった。投与のためのプロトコールの以降のセクション（単数または複数）で記したように、動物を絶食させることができる。

偏りを制御するために体重に基づくコンピュータで生成された無作為化手順を使用して、健康で研究のために許容されると考えられた動物を試験群に割り当てた。投与開始の前に最低３日間、動物を試験室に順応させた。手順へのストレスまたは抵抗性のレベルの増加を示した動物を同定して試験から排除するために、動物を試験特異的実験手順に順応させ、それらは試験群から取り除き、予備の動物と交換した。試験に無作為化される動物の選択のために投与前データ（例えば、獣医学的検査、眼科検査など）を収集し、データは試験ファイルに維持した。下の表に示すようにサルを群に割り当て、経口投与した。投与の日を、１日目と考えた。

試験品の単一の経口用量を受ける前に、動物を一晩絶食させた。投与のこの頻度は、試験品の薬物動態を判定するのに適当である。ヒトで提案された投与経路と一致する経路である経鼻的胃強制栄養によって、用量を与えた。食物は、投与の３．５〜４時間後に戻した。Ｅｌｍｉｒｏｎ（登録商標）（有効成分はＰＰＳである）のヒト用量データから、および４００ｍｇまでの用量を使用してアフリカミドリザルで実行されたＰＰＳの事前の研究から、用量レベルを推定した。各動物の最近の体重に基づいた体重によって、用量の量は８ｍＬ／ｋｇまたはそれ未満であった。ライブ観察および測定は、試験全体にわたって少なくとも４時間の間隔の生存度の観察を含んだ。疼痛または苦悩を有することが観察されたいかなる動物も、試験責任者および／またはスタッフ獣医の注目を引いたであろう。下の表に掲載される時点に、尿、糞便、ケージ洗浄液および血漿を収集した。

この試験中に収集された全ての試料を、ラベル付きの容器内に置いた。各ラベルは、試験番号、動物番号、試料タイプおよび収集間隔および収集日を記載した。試料保管のために、プラスチック容器を使用した。ケージ洗浄液試料は、分析まで２〜１０℃を維持するように設定した冷蔵庫に保存した。分析の後、試料は、−２０℃を維持するように設定したフリーザーに保存した。尿および血漿試料は、分析まで−２０℃を維持するように設定したフリーザーに保存した。糞便試料は、可能な将来の分析まで−２０℃を維持するように設定したフリーザーに保存した。

投与前と投与の０〜６、６〜１２、１２〜２４、２４〜４８、４８〜７２および７２〜９６時間後に、各動物からケージトレイを通して尿を連続的に収集した。ケージトレイを傾けて、収集容器に尿を排水させた。各尿試料の重量を測定し、各尿試料の２反復の計量されたアリコートをＬＳＣにより分析した。ＬＳＣ分析の後、可能な将来の分析のために、−２０℃に設定されたフリーザーに全ての残りの尿試料を保存した。

試料のアリコートの濃縮乾固、ＬＳＣによる放射能の定量化、次に、濃縮されなかった同じ試料から得た値と結果を比較することによって、揮発性の放射能の存在を判定するために、尿試料を分析した。

投与前と投与の０〜６、６〜１２、１２〜２４、２４〜４８、４８〜７２および７２〜９６時間後に、各動物から糞便試料を連続的に収集した。ホモジナイズされるまで、全ての糞便試料を−２０℃に設定したフリーザーに保存した。各糞便試料の重量を測定した。各糞便試料に、ＨＰＬＣ水を添加する（概ね２：１の水：糞便比、ｖ：ｗ）。糞便に水を吸収させた後に、糞便は、撹拌／振盪によってホモジナイズされてスラリーを形成する。全体のホモジネート重量が得られる。可能な将来の分析のために、−２０℃に設定されたフリーザーに糞便ホモジネートを保存する。

各尿および糞便の収集の後、ケージ洗浄を実施した。動物が居るときは、ケージを水で洗浄した。終了時、ケージを水で洗浄し、その後メタノール洗浄が続いた。この分析のために、水およびメタノール洗浄が組み合わされた。

ケージ洗浄試料は放射線安全性目的のために収集したが、放射性標識含有量については分析しなかった。これらのケージ洗浄試料は、（必要に応じて）放射化学物質を規制する全ての適用法に従って廃棄される。

血液収集の後、試料を数回反転させ、２〜１０℃を維持するように設定した冷蔵庫に保存し、その後、血漿を得るために５℃で１０分間の１５００×ｇのセットポイントの遠心分離を行った。血漿を別のチューブに次に取り除き、ＬＳＣを使用して各血漿試料の２反復のアリコートを放射能について分析した。残りの血漿試料は、可能な将来の分析まで−２０℃を維持するように設定したフリーザーに保存した。

試料のアリコートの濃縮乾固、ＬＳＣによる放射能の定量化、次に、濃縮されなかった同じ試料から得た値と結果を比較することによって、揮発性の放射能の存在を判定するために、血漿試料を分析した。

血漿中に見出される放射性標識の量は、１グラムあたりのＰＰＳ、ＰＰＳ−５またはＰＰＳ−７のナノグラム当量で表した。各試験品の以下の薬物動態学的パラメータを計算するために、血漿放射能濃度データの分析からのデータを使用した。検証されたソフトウェアシステムとして動作するＷｉｎＮｏｎｌｉｎ、バージョン６．２で、非コンパートメント分析を実行した。指定された収集ウィンドウの外側で収集された場合は、目標時点を使用した。計算したパラメータは以下を含んだ：放射性標識のピーク濃度に到達する時間（Ｔｍａｘ）；Ｔｍａｘ時の放射性標識の濃度（Ｃｍａｘ）；対象領域の濃度対時間曲線の下の全面積（ＡＵＣ）（すなわち、ＡＵＣ_０〜４８）；および、尿中の適用された放射標識された用量のパーセント回収（％ＡＤ）。

ケタミンの注射と続くＦａｔａｌ−Ｐｌｕｓ（登録商標）の注射を使用して、投与の９６時間後に全ての動物を安楽死させた。

この試験で使用されたコンピュータシステムには、限定されずに、薬物動態学的計算のためのＷｉｎＮｏｎｌｉｎバージョン６．２．１の検証されたシステムが含まれた。

結果
ＰＰＳの以前のＢＡ／ＰＫ研究は、信頼できるＰＰＳアッセイの欠如、およびヒトで許容された制限された放射能用量によって制限された。したがって、これらの研究での^３Ｈ−標識ＰＰＳ試験アイテムの１ｋｇあたりの８０倍より多い量の使用は、今日まででＰＰＳの最も有益な情報ＢＡ／ＰＫデータおよびＰＰＳ分画の第１のそのようなデータを提供するように設計された。

サルで確立された^３Ｈ−ＰＰＳ試験アイテムのＢＡ／ＰＫ特性は、最初に血漿および尿中の全放射能を各試験アイテムについて３反復で測定することによって判定された。

トリチウム化水でなかった試料中の放射能を分析するために、揮発性の放射能（約９０％）を全放射能の結果から取り除いた。元の前投与試験アイテム、血漿試料および尿試料の全ての測定で、放射能の概ね９０％は揮発性だった（トリチウム化水）。試料中の放射能は、不揮発性比放射能に基づいて再計算された。Ｃｙｎｏｓで確立された不揮発性^３Ｈ−ＰＰＳ試験アイテムのＢＡ／ＰＫ特性は、表ＶＩに示す。
分画５および７の経口ＢＡは類似し、ＰＰＳより良好であり、ＰＰＳより長く循環中に持続する。本発明者らは、そのより大きな活性および経口ＢＡのために、ＶＴＩ−１９６８として分画５を選択した。

９６時間にわたるＰＰＳ、分画５および分画７の平均の不揮発性累積尿中排泄放射能を図２に示す。データポイントは、投与された用量の％（％ＡＤ）としての、トリチウム水の揮発性放射能が取り除かれた各試験アイテムの３反復測定からの尿中放射能である。図示の通り、分画は、９６時間を通して未分画ＰＰＳと比較して大きな尿中排泄を有する。

ＰＰＳ、分画５および分画７の平均不揮発性放射能濃度を、図３に示す。データポイントは、トリチウム水の揮発性放射能が取り除かれた各試験アイテムの３反復測定からの平均血漿中放射能である。図示の通り、分画は、ＰＰＳより大きな経口ＢＡを有し、未分画ＰＰＳと比較して４８時間後でさえ生物的に利用可能のままである。

（実施例５：ＰＰＳ分画のセレクチン遮断特異性）
この実施例は、未分画ＰＰＳおよび特異的ＰＰＳ分画が、Ｐ−セレクチンへの分子結合を遮断することが可能であるが、Ｌ−またはＥ−セレクチンへの分子結合を遮断することができないことを実証する。前の実施例で同定される未分画ＰＰＳおよび分画５および７の特性を、シアリルルイスＡ（ｓＬｅＡ）へのＰ−セレクチン、Ｅ−セレクチンまたはＬ−セレクチンの分子接着に対する遮断活性に関して比較した。

材料および方法
シアリルルイスＡ（ｓＬｅＡ）へのＰ−セレクチン結合のアッセイの改変を使用して、未分画および分画ＰＰＳ試験アイテムの分子Ｐ−、Ｅ−およびＬ−セレクチン遮断活性を判定した（Kutlarら、（２０１２年）Am J Hematol、８７巻、５３６〜５３９頁とオンライン補足資料）。０．０５から５０００μｇ／ｍＬの範囲の濃度のＰＰＳ試験アイテムを、Ｐ−セレクチン−Ｉｇキメラ、Ｅ−セレクチン−ＩｇキメラまたはＬ−セレクチン−Ｉｇキメラと混合した。インキュベーションおよび洗浄の後、ヤギ抗ヒトＩｇ、発色およびマイクロプレートリーダーを使用して、ｓＬｅＸに結合したセレクチン−Ｉｇキメラを定量した。未分画ＰＰＳおよび各ＰＰＳ分画濃度による遮断百分率および試験した各セレクチンを、グラフに示した。遮断パーセントは、３つのウェルの平均ＯＤ（試料のＯＤ−ブランクのＯＤ）÷（０μｇ／ｍｌのＰＰＳ分画のＯＤ−ブランクのＯＤ）として計算した。

Ｐ−セレクチンの遮断し、かつＥ−セレクチンもしくはＬ−セレクチンを遮断しないまたは弱く遮断するためのこの方法は、その特異性において、このポリマー炭水化物クラスの薬剤に特有なものである。

結果
結果は、図４および表ＶＩＩに示す。未分画ＰＰＳならびに分画５および７は、Ｐ−セレクチンを遮断するがＬ−セレクチンまたはＥ−セレクチンを遮断しないそれらの能力に関して非常に効果的である。このように、これは、未分画ＰＰＳならびに分画５および７が、Ｐ−セレクチンの非常に選択的なブロッカーであることを実証する。さらに、Ｐ−セレクチン遮断の濃度依存性対Ｅ−およびＬ−セレクチン遮断の濃度依存性は、予想される経口用量から予期される濃度において、Ｅ−またはＬ−セレクチン遮断が事実上ないだろうことを表す。

（実施例６：ＰＰＳ分画は、マウスにおいてＰ−セレクチン遮断活性を改善して、Ｐ−セレクチン誘導血流障害から保護することができる）
この実施例は、特異的ＰＰＳ分画が未分画ＰＰＳと比較してＰ−セレクチン遮断活性を改善し、ｉｎ ｖｉｖｏでＰ−セレクチン誘導血流障害から保護することができることを実証する。前の実施例で同定されたＰＰＳおよび分画５の特性を、鎌状細胞キメラマウス系でコンピュータを利用した生体内顕微鏡観察法（ＣＡＩＭ）を使用して、ベースライン血流に及ぼす効果および血流のＰ−セレクチン誘導妨害からの保護効果によって測定した、Ｐ−セレクチンの遮断に関して比較する。

材料および方法
記載したように、ＰＰＳおよび分画５のベースライン血流に及ぼす効果および血流妨害からの保護効果によって測定されるＰ−セレクチン遮断活性は、鎌形赤血球キメラマウス系においてＣＡＩＭを使用して判定される。系はＣＡＩＭを使用して、リン酸緩衝食塩水中で２５％のヘマトクリットまで懸濁させた、Ｐａｓｚｔｙ鎌形赤血球マウス（Pasztyら、１９９７年）からのＸＲＩＴＣ標識鎌状赤血球（ＳＲＢＣ）の流速を判定し、尾静脈注射によって５０μＬをレシピエントマウスに注入して、標識ＲＢＣの非標識ＲＢＣに対する１：２００のｉｎ ｖｉｖｏ比を得、注入量からの血行力学変化を最小にする。レシピエントマウスは、腹腔内ペントバルビタールナトリウムまたはイソフルラン吸入で麻酔をかけた、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｐａｓｚｔｙ鎌形赤血球またはＰ−セレクチンヌル（Bullardら、１９９５年）マウスである。流速は、自家開発のソフトウェア（Cheungら、２００２年）を使用して、外面化させた腹部内臓の粘膜腸管小細静脈でのＣＡＩＭ画像化フローによって判定する。

第１に、未処置のＰａｓｚｔｙ鎌形赤血球マウス（ｎ＝３）、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３）、Ｐ−セレクチンヌルマウス（ｎ＝３）およびＰＰＳ（ｎ＝９）または分画５（ｎ＝９）でそれぞれ前処置したこれらのマウスの各々で、ベースライン血流の速度を判定する。１０μｇから１μｇの範囲の量のＰＰＳおよび分画５を、０．２ｍＬのＰＢＳに溶解させ、速度測定の３０〜６０分前に胃強制栄養によって宿主マウスに投与する。

第２に、ＰＡＲ−１アゴニストペプチド（ＴＦＬＬＲ−ＮＨ２）で腸間膜を満たすことによって、Ｐ−セレクチンを発現するように内皮細胞を活性化した後の流動妨害までの時間を測定する。ＰＡＲ−１誘導血流妨害の前にＰＰＳまたは分画５でレシピエントＣ５７ＢＬ／６宿主マウスを前処置することの保護効果を３反復で判定し、流動妨害までの時間を前処置されなかったレシピエントＣ５７ＢＬ／６マウスの結果と比較する。１０μｇから１μｇの範囲の量のＰＰＳおよび分画５を、０．２ｍＬのＰＢＳに溶解させ、腸間膜をＰＡＲ−１で満たす３０〜６０分前に胃強制栄養によって宿主マウスに投与する。Ｐ−セレクチンノックアウトマウスレシピエントが、陰性対照として使用される。

結果
表ＶＩＩＩは、未処置のＣ５７ＢＬ／６レシピエントマウス、ＰＰＳまたは分画５で前処置したＣ５７ＢＬ／６レシピエントマウス、未処置のＰ−セレクチンヌルレシピエントマウス、およびＸＲＩＴＣ標識鎌状赤血球の注射の後にＰＰＳまたは分画５で前処置したＰ−セレクチンヌルレシピエントマウスの中間サイズ（直径２０〜４０μｍ）の細静脈での、予測されたベースライン流速を示す。

未処置の鎌形赤血球マウスレシピエントでのベースライン血流速度は、内皮細胞Ｐ−セレクチンが活性化されない（鎌形赤血球またはＣ５７ＢＬ／６マウスレシピエント）、不在の（Ｐ−セレクチンヌルマウスレシピエント）レシピエントマウス、または内皮Ｐ−セレクチンがＰＰＳもしくは分画５によって遮断された任意のレシピエントにおけるベースライン血流速度より低いと予測される。ＰＰＳまたは分画５によるＰ−セレクチン遮断は、ベースライン血流速度に対してＰ−セレクチンヌルレシピエントマウスでのＰ−セレクチンの不在と等しい効果を有すると予測される。

表ＩＸは、未処置のＣ５７ＢＬ／６レシピエントマウス、ＰＰＳまたは分画５で前処置したＣ５７ＢＬ／６レシピエントマウス、未処置のＰ−セレクチンヌルレシピエントマウス、およびＰＰＳまたは分画５で前処置したＰ−セレクチンヌルレシピエントマウスの中間サイズ（直径２０〜４０μｍ）の細静脈で測定された、ＰＡＲ−１アゴニストペプチドで腸間膜を満たすことによる粘膜腸管細静脈の活性化の後の、流動妨害までの予測された時間を示す。

未処置のＣ５７ＢＬ／６マウスレシピエントでの流動妨害までの時間は、内皮Ｐ−セレクチンが不在（Ｐ−セレクチンヌルマウスレシピエント）であるか、またはＰＰＳもしくは分画５によって遮断されるＣ５７ＢＬ／６レシピエントマウスにおける流動妨害までの時間より短い。ＰＰＳまたは分画５によるＰ−セレクチン遮断は、血流妨害の予防に対してＰ−セレクチンヌルレシピエントマウスでのＰ−セレクチンの不在と等しい効果を有する。
参考文献：
Bullard, D.C., Qin, L., Lorenzo, I., Quinlin, W.M., Doyle, N.A., Bosse, R., Vestweber, D., Doerschuk, C.M. & Beaudet, A.L. (1995) P-selectin/ICAM-1 double mutant mice: acute emigration of neutrophils into the peritoneum is completely absent but is normal into pulmonary alveoli. J Clin Invest, 95, 1782-1788.
Cheung, A.T., Chen, P.C., Larkin, E.C., Duong, P.L., Ramanujam, S., Tablin, F. & Wun, T. (2002) Microvascular abnormalities in sickle cell disease: a computer-assisted intravital microscopy study. Blood, 99, 3999-4005.
Embury, S.H., Matsui, N.M., Ramanujam, S., Mayadas, T.N., Noguchi, C.T., Diwan, B.A., Mohandas, N. & Cheung, A.T. (2004) The contribution of endothelial cell P-selectin to the microvascular flow of mouse sickle erythrocytes in vivo. Blood, 104, 3378-3385.
Paszty, C., Brion, C.M., Manci, E., Witowska, H.E., Stevens, M.E., Mohandas, N. & Rubin, E.M. (1997) Transgenic knockout mice with exclusively human sickle hemoglobin and sickle cell disease. Science, 278, 876-878.

（実施例７：ＰＰＳ分画はＰ−セレクチン遮断活性を提供し、鎌状赤血球症を有する無症状の患者の異常な血流を改善する）
この実施例は、特異的ＰＰＳ分画が、Ｐ−セレクチン遮断活性を提供して、鎌状赤血球症を有する無症状の患者の異常な血流を改善することができることを実証する。小さい皮下前腕血管で閉塞後反応性充血（ＰＯＲＨ）を特徴付けるために、結膜細静脈のコンピュータを利用した生体内鏡検（ＣＡＩＭ）およびレーザードップラー速度測定（ＬＤＶ）を使用して、小血管での血流速度に及ぼす、前の実施例で同定されたＰＰＳおよび分画５の効果を試験する。鎌状赤血球症を有する患者での異常なベースライン血流は、ＣＡＩＭによる正常より低い血流速度、およびＬＤＶによるＰＯＲＨの正常より長い持続時間に反映される。ＰＰＳまたは分画５による効果的Ｐ−セレクチン遮断は、これらの異常な測定を正常なものに戻すと予測される。

材料および方法
本発明者らがおよび他が記載したように、結膜細静脈で血流速度を評価するためにＣＡＩＭを使用して、および前腕の小さい皮下血管でＰＯＲＨを評価するためにＬＤＶを使用して、小血管中の血流速度に及ぼすＰＰＳおよび分画５の効果を判定する（Bachirら、１９９３年、Cheungら、２００２年、Kutlarら、２０１２年、Rodgersら、１９９０年）。ＣＡＩＭ系は、選択した結膜小細静脈で血流速度を非侵襲的にリアルタイムで直接的に測定する。ＬＤＶ系は、血流閉塞期間の後の充血応答の持続時間を特徴付けることによって、血流変化を非侵襲的に判定し、その最も有益な情報を提供するパラメータは閉塞妨害から半分のピーク流量までの時間（ＴＨ１）である。ＰＰＳまたは分画５試験アイテムの経口投与の前後に、鎌状赤血球症を有する無症状の患者で血流を比較するために、ＣＡＩＭおよびＬＤＶ方法を同時に使用する。

鎌状赤血球症を有する無症状の患者（ｎ＝６）および健康な非鎌状対照（ｎ＝３）におけるベースライン処置前血流を、ＣＡＩＭおよびＬＤＶを同時に使用して判定する。選択された結膜小細静脈での血流速度のデジタル式記録を、ＣＡＩＭを使用して行い、記録は後の盲検化解釈のために表示する。ＬＤＶ記録は、前腕に固定される３３℃に設定された３つの熱プローブを使用して、流量が安定した後の１分間、上腕の血圧カフを２００ｍｍＨｇまで膨らませることによる流量閉塞の３分間、充血の全期間、および流量がベースラインに戻るまで、行われ、記録は表示し、半分のピーク流量までの時間のブラインド比較のために保存する。流量パラメータの一式は、ＬＤＶユニットのソフトウェアシステムによって評価し、これらの中で、ＴＨ１は血流変化について最も有益な情報を提供し、この実施例は予想される知見を実証するためにその測定を使用する。

ベースライン血流測定の後に、ＰＰＳの上昇する経口１００、２００および３００ｍｇ用量と分画５の２２、４４および６６ｍｇ用量を各対象に投与し、各用量の間に１週間の流失期間がある。以降の血流測定は、ＰＰＳまたは分画５の投与の０．５、１、２、４、６、８、１２、２４、４８および７２時間後に行う。

各試験日に、上の上昇用量スケジュールに従って、最低用量から始めて早朝に試験対象にＰＰＳを投与する。１週間の流失期間の後、その個体は次のより高い用量のために戻り、さらに１週間後、その個体はＰＰＳの最大用量を受ける。１週後に、試験対象は分画５の最低用量から始まり、ＰＰＳと同様に毎週続ける。１２時間の測定の後、試験対象は帰宅し、２４時間の測定のために翌朝戻り、４８時間の測定のために翌朝戻り、７２時間の測定のために翌朝戻るが、それが最後のものである。

結果
測定方法によって収集された平均データ、試験アイテム、用量および用量スケジュールは、下の表ＸおよびＸＩに示す。

ＰＰＳの最低用量は、治療応答を誘導しない。ＰＰＳの中央用量は、わずかな長期応答を誘導する。ＰＰＳの最大用量は、投与の１時間後から始まって８時間持続的に血流を正常化する。分画５の最低用量は、それがより早くに始まり、より長く持続すること以外は、ＰＰＳの最大用量と類似の応答を誘導する。分画５の中央用量は、最低用量より長く持続するより強力な早期の応答を誘導する。分画５の最大用量は０．５時間後に血流の正常化を開始し、この応答は２４時間持続する。健康な非鎌状対照対象は、処置の前およびその間に、２．４〜２．６ｍｍ／秒の範囲の正常な流量測定を有する。

ＰＰＳの最低用量は、治療応答を誘導しない。ＰＰＳの中央用量は、軽度の長期応答を誘導する。ＰＰＳの最大用量は、投与の１時間後から始まって８時間持続的に血流を正常化する。分画５の最低用量は、それがより早くに始まり、より長く持続すること以外は、ＰＰＳの最大用量と類似の応答を誘導する。分画５の中央用量は、最低用量より長く持続するより強力な早期の応答を誘導する。分画５の最大用量は０．５時間後に血流の正常化を開始し、この応答は２４時間持続する。健康な非鎌状対照対象は、処置の前およびその間に、２．４〜２．６ｍｍ／秒の範囲の正常な流量測定を有する。

両試験アイテムは、小血管で鎌形赤血球血流を改善する。分画５はＰＰＳより大きな活性を有し、その効果はより早くに始まり、より長く持続する。
参考文献：
Bachir, D., Maurel, A., Beuzard, Y., Razavian, M., Kraiem, A., Portos, J.L. & Galacteros, F. (1993) Improvement of microcirculation abnormalities in sickle cell patients upon buflomedil treatment. Microvasc Res, 46, 359-373.
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（実施例８：血液中のＰＰＳ分画を数量化定量するための生物分析方法）
将来の前臨床および臨床試験を支持するために、ラット、サル（カニクイザル）およびヒトの血液中のＰＰＳを定量するために、生物分析方法が必要である。この実施例の目的は、ＰＰＳおよび分画５を検出し、定量するために、ならびに、必要に応じて、感度を増加させるおよび／またはバックグラウンド検出を低減するためにプロトコールを改変するために、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびＥＬＩＳＡを試験することである。

Ｉ．ＥＬＩＳＡアッセイの初期開発
材料および方法
ＨｕＣａｌ（登録商標）ファージディスプレイ抗体生成およびスクリーニングを使用するＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって、ＰＰＳを検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡを開発した。抗原として未分画ＰＰＳを使用して、ｍＡｂを生成した。元のプロトコールは、以下のステップを要した：
１．コート。各ウェルは、２０μＬ／ウェルの捕捉Ａｂでコーティングした。３８４ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＭＴＰ黒色平底ＰＳプレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１０３９５９９１０）の各ウェルに、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍＬのＢｉｏ−Ｒａｄ２４７２２．１をコーティングした。一晩、４℃でインキュベートする。
２．洗浄。洗浄緩衝液（ＰＢＳ ｗ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０；ＰＢＳＴ）で２回洗浄する。
３．ブロック。ブロック緩衝液（ＰＢＳＴに５％ＢＳＡ）の１００μＬ／ウェル。室温で１時間インキュベートする。
４．洗浄。洗浄緩衝液で２回洗浄する。
５．抗原を添加する。マトリックス（ＰＢＳＴまたはＰＢＳＴ中の１０％血漿）中の抗原の２０μＬ／ウェルを添加する。室温で１時間インキュベートする。
６．洗浄。洗浄緩衝液で５回洗浄する。
７．Ａｂを検出する。ＰＢＳＴ中の２μｇ／ｍＬのＢｉｏ−Ｒａｄ２４７１１．１−ＨＲＰの２０μＬ／ウェルを添加する。室温で１時間インキュベートする。
８．洗浄。洗浄緩衝液で１０回洗浄する。
９．検出。ＱｕａｎｔａＢｌｕ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １５１６９）基質（ＱｕａｎｔａＢｌｕ説明書に従って使用する）の２０μＬ／ウェルを添加する。励起３２０±２５ｎｍ、放射４３０±３５ｎｍで読み取る。

結果：
この方法は、緩衝液中の０．５ｎｇ／ｍＬのＰＰＳ、緩衝液中の１０％ラット血漿中の０．５ｎｇ／ｍＬ、緩衝液中の１０％カニクイザル血漿中の２ｎｇ／ｍＬ、および緩衝液中の１０％ヒト血漿中の４ｎｇ／ｍＬの検出下限（ＬＬＯＤ）（２×シグナル／バックグラウンド）を与えた。

分画５の検出は、この方法およびこれらの試薬で感度が低かった。緩衝液、１０％ヒト血漿、１０％ラット血漿および１０％カニクイザル血漿中のＬＬＯＤは、それぞれ、１ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬおよび８ｎｇ／ｍＬであった。これは、未分画ＰＰＳの感度の概ね半分を表す。未分画ＰＰＳの不均一性が主に鎖長によるものであるので、エピトープ特異性が検出の差の原因である可能性は低い。

それにもかかわらず、この方法は、血液中のＰＰＳを検出して定量する以前の方法、例えば、血漿での感度が２００ｎｇ／ｍＬより下で失われるポリクローナルＡｂベースのＥＬＩＳＡ方法に対して実質的に改善された。

ＩＩ．ＥＬＩＳＡ検出のための最適な抗原マトリックスの判定
この試験は、マトリックスでより高い割合の血漿を使用できるかどうか、および血漿または血清がＰＰＳ ＥＬＩＳＡアッセイのためのより良好なマトリックスであるかどうか判定した。ポリクローナルＥＬＩＳＡの開発で、１０％より高い血漿濃度はアッセイで実質的により低い感度を引き起こすと判定された。理論に束縛されることなく、おそらく、可溶性Ｐセレクチンが血漿より血清により高いレベルで存在する可能性がある。このように、これらの実験は、アッセイの感度が血清または血漿のいずれを使用して改善されるか判定する。

材料および方法
この実験のために、上で考察したＥＬＩＳＡ方法を改変して使用した。ＥＬＩＳＡ実験の前に、５℃で０、１または２日間、ＰＰＳをヒトまたはラット血清または血漿と混合した。一部の実験では、インキュベーションの時間は、上に記載したもの（セクションＩに記載される方法のステップ１、３、５および７）と、３０、４５、６０、９０、１２０分、または一晩異なった。最後に、一部の実験では、血清濃度は、１０％、２０％または４０％であった。

結果：
２つの実験では、ＥＬＩＳＡの中のステップ（セクションＩ．Ｂに記載される方法のステップ１、３、５および７）のためのインキュベーション時間を、評価した。以下のインキュベーションは、アッセイの感度に関して最適であると判定された：
１．捕捉Ａｂ：４℃で一晩。
３．ブロック：室温で９０分間。
５．抗原：室温で１２０分間。
７．検出Ａｂ：室温で６０分間。

血漿対血清としてのマトリックスを含むマトリックスの効果およびマトリックスとのＰＰＳのインキュベーションを判定するために、２つの実験を実施した。ラットマトリックス中のＰＰＳは、ヒトマトリックス中のＰＰＳより容易に検出された。血漿と比較して血清でより良好なＰＰＳ検出のわずかな傾向があった（図５）。これは統計的に有意でなく、非常にわずかだったが、全ての実験で真実であった。１または２日間のインキュベーションの後よりも混合直後に使用したときの方が、ＰＰＳは全てのマトリックスでより良好に検出された。

２つの実験では、ヒトおよびラット血清の異なる濃度が使用された。ヒトおよびラット血清の両方で、１０％を超える濃度はＰＰＳ検出を実質的に弱めた。

血漿と血清の間の検出感度の差はわずかで、統計的に有意でなかったが、それは一貫していた。したがって、全ての以降の実験のために、血漿ではなく血清が使用された。１または２日間インキュベートされたマトリックスでのＰＰＳ検出の低減効果は、マトリックス中の物質とのＰＰＳの相互作用の増加によって説明できる可能性がある。臨床または前臨床試験でのＰＰＳを与えた患者または動物から取られた試料は、ＰＰＳが血液中の干渉物質と相互作用する時間を有する。そのような試験のために正確な標準曲線を生成するために、ＰＰＳ−マトリックス混合物を５℃で一晩インキュベートするよう推奨する。

ＩＩＩ．潜在的血液干渉因子（単数または複数）に及ぼすプロテアーゼの効果の判定
この試験は、血漿または血清マトリックス中の抗原のプロテアーゼ処置がアッセイの感度の増加を提供するかどうか判定した。

材料および方法
上のセクションＩで概説されるプロトコールを改変して使用した。ＰＰＳをヒトまたはラット血清と混合し、室温または３７℃で１、２４または４８時間、プロナーゼ（１００μｌ血清につき５００Ｕ）で処置した。その後、ＥＬＩＳＡで抗原として使用する前にタンパク質分解を停止するために、プロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５３９１３４）を使用した。

結果：
タンパク質分解の効果のための初期実験は、抗原としてＰＰＳだけを使用した複数のインキュベーション時間および温度実験を含んだ。最適なインキュベーション時間および温度は、これらの実験において３７℃で一晩（１８〜２０時間）であると判定された。

プロテアーゼとのインキュベーションの後、薄く白い沈殿物が生じた。したがって、アッセイに適用された試料は、溶液ではなく懸濁液であった。沈殿物は、抗原インキュベーションの後、洗浄ステップの間に取り除かれた。

この試験の最終実験では、プロテアーゼ処置を含む方法は、ＰＰＳおよび分画５の５つの濃度：０、２、６．３、２０および６３ｎｇ／ｍＬについて試験した。この実験で使用されたインキュベーション時間および温度は、マトリックス試験（上のセクションＩＩを参照）およびこの試験の第１のパートで見出される最適な設定であった。

ラット血清中のＰＰＳおよび分画５のプロット（それぞれ、「ＲＳ、ＰＰＳ」および「ＲＳ、Ｆ５」）は、セクションＩに記載されるそれらと類似していた。一般に、プロテアーゼ処置は、セクションＩで見られる感度と比較して、ヒトおよびカニクイザル血清中のＰＰＳおよび分画５へのより多くの感度を提供した（図６）。ヒト、ラットおよびカニクイザルの蛍光のベースライン（抗原なし）レベルは、それぞれ、６８１８１５７、３５９７６１４および４０３６９８９であった。上記したように、これらの値は、プロテアーゼ未処置試料より高いが、それらの値は、それらが５５３、１９９および２０６であったセクションＩのプロトコールを使用して報告されたものよりも差が小さい。

プロテアーゼ処置は、ＰＰＳ ＥＬＩＳＡの感度を増加させた。理論に束縛されることなく、プロテアーゼ処置は、一方または他方においてより優勢な可能性があるタンパク質を破壊することによって、３種の血清をより類似したものにする可能性がある。ＥＬＩＳＡにより低い感度を提供するマトリックス、ヒトおよびカニクイザル血清はラット血清よりプロテアーゼ処置による影響を多く受けるので、それらの血清中のタンパク質がアッセイにおける干渉の主要な源であることをこれは表すだろう。

ＩＶ．潜在的血液干渉因子（単数または複数）に及ぼすコンドロイチナーゼの効果の判定
この試験は、血漿または血清マトリックス中の抗原のコンドロイチナーゼ（ＣＳ）処置がアッセイの感度の増加を提供するかどうか判定した。血漿中のヘパリン類似物質を検出するための生物分析方法は、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）がアッセイに干渉することを見出した（Mousaら、２００７年、J Clin Pharmacol、４７巻：１５０８〜１５２０頁）。交差反応性試験は、サンドイッチＥＬＩＳＡのために選択された２つの抗体がＣＳを検出しないことを実証した。したがって、マトリックスのコンドロイチナーゼ処置がＰＰＳの検出を改善するかどうかについてさらに評価した。

材料および方法：
上のセクションＩで概説されるプロトコールを改変して使用した。ＰＰＳをヒトまたはラット血清と混合し、室温または３７℃で１、２４または４８時間、プロナーゼ（１００μｌ血清につき５０Ｕ）で処置し、その後、ＥＬＩＳＡで抗原として使用する前にタンパク質分解を停止するために、プロテアーゼ阻害剤カクテルを使用した。

結果：
この試験のために２つの実験を実施し、その両方は類似の結果をもたらした。ここで提示されるデータは、第２のアッセイからのものである。図７に示すように、コンドロイチナーゼで処置したＰＰＳを有する血清は、ヒトおよびラット血清の処置なしのものに類似していた。０ＰＰＳ試料のウェルの蛍光が未処置および処置試料で類似していたので、バックグラウンドへの影響はなかった。

血清中のＰＰＳのコンドロイチナーゼ処置は、ＥＬＩＳＡ方法でシグナルの感知可能な変化を引き起こさなかった。これの可能な説明は、コンドロイチナーゼ感受性の構成成分がＰＰＳのＥＬＩＳＡ検出に影響を及ぼさないということである。これは、コンドロイチン硫酸がｍＡｂの生成のために使用される負の選択抗原の１つであったこと、およびＢｉｏ−Ｒａｄで抗体親和性を評価したときの交差反応性の不在と整合している。コンドロイチナーゼのさらなる試験のための指示はない。

Ｖ．クロロホルム／エタノール抽出の効果の判定
これらの実験は、血漿または血清マトリックス中の抗原のクロロホルム／エタノール抽出がアッセイの感度の増加を提供するかどうか判定した。この方法は、ヒト血漿からヘパリンを精製するMielkeらによる方法に基づく（Mielkeら、１９９９年、Clin Appl Thrombosis/Hemostasis、５巻（４号）：２６７〜７６頁、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。

材料および方法：
上のセクションＩで概説されるプロトコールを改変して使用した。血清中のＰＰＳをクロロホルムと混合し、次に酢酸アンモニウムおよびエタノールで沈殿させた。混合物を遠心分離し、ペレットを脱水し、次にＰＢＳに再溶解させた。

結果：
この試験のために２つの実験を実施し、各々は類似の結果をもたらした。ここで提示されるデータは、第２のアッセイからのものである。図８に示すように、抽出は、ヒトおよびラット血清の両方においてＰＰＳのためのアッセイの感度を増加させた。０ＰＰＳ試料のウェルの蛍光が抽出および未抽出試料で類似していたので、バックグラウンドへの影響はなかった。

脱水および再融解の後、沈殿物は完全に溶解しなかった。この試験のために使用した試料は、薄い懸濁液であった。懸濁物は、抗原インキュベーションの後、洗浄ステップの間に取り除かれた。

血清からのＰＰＳのクロロホルム／酢酸アンモニウム／エタノール抽出は、ＥＬＩＳＡ方法でシグナルの増加を引き起こす。Mielkeらの研究では、この方法は物理的化学的分析のために血漿からヘパリンを精製する方法として記載された。この方法は、ＰＰＳをタンパク質から分離する別の方法である可能性がある。そうであるならば、それは、タンパク質分解方法より少ないバックグラウンド蛍光問題を引き起こす。タンパク質分解方法のように、抽出を行うと、アッセイがさらに１日長くなる。

ＶＩ．最適化された検出方法
上記の全てを考慮すると、導かれる最適化アッセイは以下の通りである：
１．プロテアーゼ処置。バイオハザードキャビネット内で、血清中の７０μＬのＡｇをピペットで無菌の１．６ｍＬ微量遠心チューブに移し、ＰＢＳ中の５０ｋＵ／ｍＬプロナーゼ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５３７０８８−５ＫＵ）の１０μＬを添加する。撹拌し、次に３７℃で一晩（少なくとも１０時間）インキュベートする。
２．プロテアーゼを停止する。２０μＬプロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５３９１３４）を各チューブに添加する。撹拌し、次に室温で１時間インキュベートする。
３．クロロホルム抽出。１００μＬのクロロホルムを各チューブに添加する。撹拌して混合する。
４．沈殿。５０μＬの１０Ｍ酢酸アンモニウムを各チューブに添加する。撹拌して混合する。７５０μＬの９５％エタノールを添加する。撹拌し、次に氷上で３０分間インキュベートする。
５．ペレットの単離。５℃で１０分間、１４ｋＧで遠心分離する。上清を捨てる。遠心分離蒸発器でペレットを一晩乾燥させる。
６．Ａｂを捕捉する。３８４ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＭＴＰ黒色平底ＰＳプレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１０３９５９９１０）の各ウェルに、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍＬのＢｉｏ−Ｒａｄ２４７２２．１の２０μＬ／ウェルをコーティングした。４℃で一晩インキュベートする。
７．洗浄。洗浄緩衝液（ＰＢＳ ｗ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０；ＰＢＳＴ）でプレートを２回洗浄する。
８．ブロック。１００μＬ／ウェルのブロック緩衝液（ＰＢＳＴ中に５％ＢＳＡ）。室温で９０分間インキュベートする。
９．Ａｇの復元。各Ａｇペレットを７０μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎに溶解させる。
１０．洗浄。洗浄緩衝液で２回洗浄する。
１１．抗原。マトリックス（ＰＢＳＴまたはＰＢＳＴ中の１０％血漿）中の抗原の２０μＬ／ウェル。室温で２時間インキュベートする。
１２．洗浄。洗浄緩衝液で５回洗浄する。
１３．Ａｂ検出。ＰＢＳＴ中の２μｇ／ｍＬのＢｉｏ−Ｒａｄ２４７１１．１−ＨＲＰの２０μＬ／ウェル。室温で１時間インキュベートする。
１４．洗浄。洗浄緩衝液で１０回洗浄する。
１５．基質。ＱｕａｎｔａＢｌｕ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １５１６９）基質（ＱｕａｎｔａＢｌｕ説明書に従って使用する）の２０μＬ／ウェル。励起３２０±２５ｎｍ、放射４３０±３５ｎｍで読み取る。

参考文献
1. He, X. Y., Xu, Z., Melrose, J., Mullowney, A., Vasquez, M., Queen, C., Vexler, V., Klingbeil, C., Co, M. S., and Berg, E. L. (1998) Humanization and pharmacokinetics of a monoclonal antibody with specificity for both E- and P-selectin, J.Immunol. 160, 1029-1035.
2. Tardif, J. C., Tanguay, J. F., Wright, S. S., Duchatelle, V., Petroni, T., Gregoire, J. C., Ibrahim, R., Heinonen, T. M., Robb, S., Bertrand, O. F., Cournoyer, D., Johnson, D., Mann, J., Guertin, M. C., and L'Allier, P. L. (2013) Effects of the P-selectin antagonist inclacumab on myocardial damage after percutaneous coronary intervention for non-ST-segment elevation myocardial infarction: results of the SELECT-ACS trial, J Am Coll Cardiol 61, 2048-2055.
3. Gutsaeva, D. R., Parkerson, J. B., Yerigenahally, S. D., Kurz, J. C., Schaub, R. G., Ikuta, T., and Head, C. A. (2011) Inhibition of cell adhesion by anti-P-selectin aptamer: a new potential therapeutic agent for sickle cell disease, Blood 117, 727-735.
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6. Koenig, A., Norgard-Sumnicht, K., Linhardt, R., and Varki, A. (1998) Differential interactions of heparin and heparan sulfate glycosaminoglycans with the selectins. Implications for the use of unfractionated and low molecular weight heparins as therapeutic agents, Journal of Clinical Investigation 101, 877-889.
7. Chang, J., Patton, J. T., Sarkar, A., Ernst, B., Magnani, J. L., and Frenette, P. S. (2010) GMI-1070, a novel pan-selectin antagonist, reverses acute vascular occlusions in sickle cell mice, Blood 116, 1779-1786.

Claims (35)

1. 単離されたペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）分画を含む組成物であって、未分画ＰＰＳと比較して、（ａ）改善されたまたは同等のＰ−セレクチン遮断活性、（ｂ）改善された生物学的利用能、および（ｃ）それ以下の抗凝固活性を有する組成物。
2. 未分画ＰＰＳが１，２２１〜７，６８１Ｄａの平均分子量範囲を有する、請求項１に記載の組成物。
3. 単離されたペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）分画を含む組成物であって、
   ａ．水溶液にＰＰＳを溶解させるステップ；
   ｂ．有機溶媒の全体の濃度が少なくとも約５０容量％になるまで可溶化ＰＰＳに前記有機溶媒を段階的方式で添加するステップ、および
   ｃ．沈殿したＰＰＳ分画を単離するステップ
   によって生成される組成物と同じ特性を有する組成物。
4. 前記有機溶媒の全体の濃度が少なくとも約３８容量％になるまで前記可溶化ＰＰＳに前記有機溶媒が段階的方式で添加される、請求項３に記載の組成物。
5. 少なくとも約４３容量％、４６容量％、４８容量％および／または５０容量％を含む次第に増加する濃度の有機溶媒を使用して、請求項３のステップ（ｂ）および（ｃ）が繰り返される、請求項４に記載の組成物。
6. 前記段階的方式が、上清を取り除き、沈殿したＰＰＳ分画を再可溶化することを含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記特性が、未分画ＰＰＳと比較して、（ａ）改善されたｐ−セレクチン遮断活性、（ｂ）改善された生物学的利用能および（ｃ）それ以下の抗凝固活性である、請求項３〜６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 未分画ＰＰＳが１，２２１〜７，６８１Ｄａの平均分子量範囲を有する、請求項７に記載の組成物。
9. ａ．水溶液にＰＰＳを可溶化するステップ；
   ｂ．有機溶媒の全体の濃度が少なくとも約５０容量％になるまで前記可溶化ＰＰＳに前記有機溶媒を段階的方式で添加するステップ、および
   ｃ．沈殿したＰＰＳ分画を単離するステップ
   によって生成される、請求項３に記載の組成物。
10. 前記有機溶媒の全体の濃度が少なくとも約３８容量％になるまで前記可溶化ＰＰＳに前記有機溶媒が段階的方式で添加される、請求項９に記載の組成物。
11. 少なくとも約４３容量％、４６容量％、４８容量％および／または５０容量％を含む次第に増加する濃度の有機溶媒を使用して、請求項９のステップ（ｂ）および（ｃ）が繰り返される、請求項１０に記載の組成物。
12. 前記段階的方式が、上清を取り除き、前記沈殿したＰＰＳ分画を再可溶化することを含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
13. 前記有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノールからなる群から選択される、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
14. 前記有機溶媒がメタノールである、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
15. 単離された前記ＰＰＳ分画が約３７６１〜４８３２Ｄａの間の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
16. 単離された前記ＰＰＳ分画が約４２７４Ｄａの重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、請求項１５に記載の組成物。
17. 単離された前記ＰＰＳ分画が約１．２３７〜１．１４２Ｍｗ／Ｍｎの間の多分散指数を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
18. 単離された前記ＰＰＳ分画が約１．１６７Ｍｗ／Ｍｎの多分散指数を有する、請求項１７に記載の組成物。
19. Ｐ−セレクチン遮断活性と比較して低減されたＥ−セレクチンおよびＬ−セレクチン遮断活性を示す、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
20. ５％未満のＥ−セレクチン遮断活性を示す、請求項１９に記載の組成物。
21. ２％未満のＬ−セレクチン遮断活性を示す、請求項１９に記載の組成物。
22. 請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬組成物。
23. アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、有機酸および／または抗酸化剤のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
24. それを必要とする対象で鎌状赤血球症（ＳＣＤ）を治療するための方法であって、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物または請求項１９もしくは請求項２０に記載の医薬組成物の臨床的有効量を前記対象に投与するステップを含む方法。
25. 前記組成物または前記医薬組成物が経口投与される、請求項２４に記載の方法。
26. 前記ＰＰＳ分画が、
    ａ．試料をプロテアーゼと接触させるステップ；
    ｂ．前記試料中の前記ＰＰＳまたは前記ＰＰＳ分画を抽出して沈殿させるステップ；
    ｃ．ＰＰＳまたは前記ＰＰＳ分画に結合する抗体と前記試料を接触させるステップであって、前記抗体は検出が直接的または間接的に可能であるステップ；および
    ｄ．前記抗体を検出し、それによって前記生物学的中のＰＰＳまたは前記ＰＰＳ分画の存在を検出するステップ
    によって検出される、請求項２４に記載の方法。
27. ａ．請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物、および
    ｂ．１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、担体、アジュバントまたはビヒクル
    を含むキット。
28. 生物学的中のペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）またはＰＰＳ分画を検出する方法であって、
    ａ．前記試料をプロテアーゼと接触させるステップ；
    ｂ．前記試料中の前記ＰＰＳまたは前記ＰＰＳ分画を抽出して沈殿させるステップ；
    ｃ．ＰＰＳまたは前記ＰＰＳ分画に結合する抗体と前記試料を接触させるステップであって、前記抗体は検出が直接的または間接的に可能であるステップ；および
    ｄ．前記抗体を検出し、それによって前記生物学的中のＰＰＳまたは前記ＰＰＳ分画の存在を検出するステップ
    を含む方法。
29. 前記生物学的が血液である、請求項２８に記載の方法。
30. 前記生物学的が血清または血漿である、請求項２９に記載の方法。
31. 約０．５ｎｇ／ｍＬから約１０ｎｇ／ｍＬの間の検出下限（ＬＬＯＤ）（２×シグナル／バックグラウンド）を有する、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
32. ＰＰＳまたは前記ＰＰＳ分画に結合する前記抗体がＥＬＩＳＡアッセイで使用される、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記ＰＰＳがクロロホルムおよび酢酸アンモニウムで抽出および沈殿される、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
34. ステップ（ｂ）がステップ（ａ）の前に実施される、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記ＰＰＳ分画が請求項１〜２１に記載のＰＰＳ分画のいずれか一つである、請求項３８〜３４のいずれか一項に記載の方法。