CN101583273A - 肝素组合物和选择素抑制 - Google Patents
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Abstract
本发明提供鉴别可调节选择素活性的肝素和类肝素的活体外和活体内方法。本发明也提供调节选择素活性的肝素和类肝素。所述肝素调配物的鉴别和分离可调节众多种由P-和/或L-选择素介导的病状,包括血行性转移、炎症相关疾病(例如哮喘、关节炎、过敏性皮炎)、缺血-再灌注损伤、或诸如镰状细胞贫血症等其他病状。可以在低于人类个体中导致过度抗凝血或不期望出血的浓度的血浆浓度下来达成选择素的抑制。
Description
相关申请案交叉参照
本申请案主张优先于2005年7月22日提出申请的美国临时申请案第60/701,893号,其揭示内容以引用方式并入本文中。
关于联邦资助研究的声明
本发明部分是由国立卫生研究院授予的许可号R01CA38701资助的。政府可拥有本发明中的某些权利。
技术领域
本发明一般来说是关于分子生物学,且更确切地说是关于鉴别和/或分离阻断L-选择素和/或P-选择素结合活性并减弱选择素介导转移或其他选择素介导疾病或病症的肝素变体的方法。
背景技术
P-和L-选择素是识别唾液酸化、岩藻糖基化、硫酸化配体的C型凝集素。P-选择素储存在静息血小板和内皮细胞中,且在活化后转移到细胞表面。L-选择素在大多数白细胞类型中组成性表达且介导其与内皮配体的交互作用。两种选择素在炎症位点的外渗期间促进白细胞的初始粘连。P-选择素在止血中也起作用。P-和L-选择素的内源性配体(例如PSGL-1)在白细胞和内皮细胞中表达(对选择素和其配体的综述参见例如Varki A.,Proc Natl Acad Sci USA(1994)91:7390-7;Ley等人,J Immunol(1995)155:525-8;Kansas GS,Blood(1996)88:3259-87;McEver等人,J Clin Invest(1997)100:485-92;Lowe JB.Kidney Int(1997)51:1418-26;Rosen SD.Annu Rev Immunol(2004)22:129-56)。
P-和L-选择素在涉及炎症和再灌注的许多疾病中(Bevilacqua等人,Annu RevMed(1994)45:361-78;Lowe等人,J Clin Invest(1997)99:822-6;Ley K.,Trends MolMed(2003)9:263-8)以及在癌转移中也有病理性作用。许多肿瘤细胞表达选择素配体,并且已报道肿瘤选择素配体表达与存活之间的反比关系(Varki NM,Varki A.SeminThromb Hemost(2002)28:53-66)。同种或异种小鼠模型显示选择素配体-阳性腺癌向肺的转移是P-和L-选择素依赖性的(Kim等人,Proc Natl Acad Sci USA(1998)95:9325-30;Friederichs等人,Cancer Res(2000)60:6714-22;Borsig等人,Proc NatlAcad Sci USA(2001)98:3352-7;Borsig等人,Proc Natl Acad Sci USA(2002)99:2193-8;Ludwig等人,Cancer Res 2004;64:2743-50)。
许多经典研究证明未经分级分离的肝素(UFH)在癌症转移动物模型中具有抑制效应(Zacharski等人,Thromb Haemost(1998)80:10-23;Engelberg H.Cancer(1999)85:257-72;Hejna等人,J Nat Cancer Inst(1999)91:22-36;Smorenburg等人,Pharmacol Rev(2001)53:93-105),且回顾分析显示肝素在人类癌症中可能具有类似效应(Kakkar,Int J Oncol(1995)6:885-8;Hettiarachchi等人,Thromb Haemost(1999)82:947-52;Ornstein等人,Haemostasis(1999)29增刊1:48-60;Smorenburg等人,Thromb Haemost(1999)82:1600-4;及Zacharski等人,Semin Thromb Hemost(2000)26增刊1:69-77)。大量文献也论述了经大量文件证明的癌症与静脉血栓形成的关系,以及经由用肝素或蛭素阻断液相凝血来抑制转移。然而,使用维生素K拮抗剂作为抗凝血替代模式的人类实验显示在大多数癌中其对存活无效。因此,应假定肝素对转移的疗效并非主要基于其抗凝血活性。
基于未经分级分离的肝素通过促进抗凝血酶使因子IIa和Xa失活来抑制液相凝血的能力,人们已经将其用于临床应用中。然而,UFH是包含5000至30000道尔顿的高度硫酸化葡萄糖胺聚糖链的复合多分散混合物的天然产物,实际上只有某些UFH结合抗凝血酶。早期研究显示P-选择素可结合固定化肝素(Skinner等人,BiochemBiophys Res Commun(1989)164:1373-9)。已显示各种肝素和类肝素可抑制P-和L-选择素二者与其天然配体的结合(Nelson等人,Blood(1993)82:3253-8;Norgard-Sumnicht等人,Science(1993)261:480-3;Koenig等人,J Clin Invest(1998)101:877-89;Ma等人,J Immunol(2000)165:558-65;Xie等人,J Biol Chem(2000)275:30718-1)。
人们期望鉴别出可用于抑制L-选择素和P-选择素与存于人类细胞上的配体结合的医药级肝素和类肝素制剂。可进一步精制所述制剂以鉴别不仅调节L-选择素和P-选择素活性,且与此同时在个体中不产生不期望副作用的制剂。
发明内容
本文提供鉴别各种肝素/类肝素(下文中统称为肝素)抑制P/L-选择素活性的能力的方法。本文也提供在两种不同肿瘤模型中以临床相关剂量抑制转移的肝素亚组。此外,本发明根据低分子量肝素(LMWH)不同的选择素抑制活性鉴别其结构差异,并阐述在减弱转移中抗凝血和选择素抑制的相关作用。
在一实施例中,提供一种筛选抑制选择素活性的组合物的方法。所述方法可包括提供包含多个肝素分子的肝素制剂。一般来说,所述制剂是从经FDA批准的肝素批料中获得。所述方法也包括一或多种选自由L-选择素和P-选择素组成的群组的选择素;一或多种所述选择素的配体;以及肝素。所述方法进一步包括在适用于选择素与选择素配体结合的条件下同时或依次使上文所鉴别物品接触,并检测与不存在肝素制剂的情况相比,在肝素制剂存在下一或多种选择素与配体结合的降低程度。
在低于产生一或多种选自由活体内抗凝血活性和活体内不期望出血所组成群组的活性的肝素浓度的肝素制剂浓度下,可检测到选择素与选择素配体结合的降低程度。此外,肝素制剂浓度可能不降低E-选择素与E-选择素配体的结合程度。此外,使一或多种选择素与配体的结合程度降低的肝素浓度可比产生活体内过度抗凝血活性的肝素浓度低2倍至50倍。在某些实施例中,可鉴别选择性抑制选择素的肝素。通常这些肝素缺少其他肝素活性(例如,血管发生抑制、乙酰肝素酶抑制、细胞因子结合和诸如此类)。此外,可鉴别仅具有抗凝血活性但缺少其他活性的肝素部分。
通过本文所提供方法鉴别出的肝素制剂可用作L-选择素或P-选择素相关病状的治疗药剂。
本发明也提供一种筛选抑制选择素活性的组合物的方法。所述方法可包括提供包含多个肝素分子的肝素制剂。一般来说,所述制剂是从FDA批准的肝素批料获得。方法中也包括一或多种选自由L-选择素和P-选择素组成的群组的选择素;选自由L-选择素和P-选择素组成的群组的一或多种选择素的配体;以及肝素。方法可进一步包括分级分离肝素制剂并分离多个包含肝素分子的部分,其中这些部分是基于部分中肝素分子的大小来分离的。所述方法进一步包括在适用于选择素与选择素配体结合的条件下使各部分与配体和选择素同时或依次接触,并在片段存在下检测选择素与配体结合的降低程度,以及鉴别与不存在片段的情况相比,在片段存在下降低一或多种选择素与配体结合程度的片段。
本发明也提供一种鉴别用作L-选择素和/或P-选择素相关病状治疗药剂的肝素部分的方法。
本发明也提供通过本文所揭示方法鉴别出的肝素部分。
本发明提供包括包装材料的制造物件。包装材料中可含有通过本文所提供方法鉴别出的肝素制剂。包装材料可包括标签或包装说明书,其显示肝素制剂抑制选择素活性并可用于在个体中抑制血行性转移。肝素制剂可包括低分子量肝素(LMWH)制剂。实例性制剂包括亭扎肝素(Tinzaparin)(TINZ)。在另一实施例中,提供包括包装材料的制造物件。包装材料中可含有通过本文所提供方法鉴别出的肝素部分。包装材料可包括标签或包装说明书,其指明肝素部分可抑制选择素活性并可用于抑制个体血行性转移。在一实施例中,制造物件包含由于使用本发明方法而具有特异性肝素活性的有用肝素部分。例如,包含肝素部分的制造物件可包含标签或包装说明书,其指明所述肝素部分可用于抑制选择素活性并可用于抑制个体P-和/或L-选择素介导疾病。
本发明也提供一种预防或治疗个体细胞增殖性病症的方法。方法可包括向个体投与有效量的存于医药上可接受载剂中的特异性选择素活性抑制剂。一般来说所述抑制剂可为肝素制剂或肝素部分。
本发明提供一种预防或抑制个体转移的方法。方法包括向所述个体投与有效量的存于医药上可接受载剂中的特异性选择素活性抑制剂。一般来说所述抑制剂是肝素制剂或肝素部分。
本发明一个或多个实施例的细节陈述于附图和下文说明中。根据所述说明及附图以及权利要求书,可清楚地理解本发明的其他特征、目的和优点。
附图说明
图1显示临床上采用的肝素制剂在其抑制P-和L-选择素与癌配体结合的能力上显示显著差异。在各种浓度不同肝素存在下检测人类结肠癌细胞与固定化选择素嵌合体的结合。对照结合是基于在缓冲液单独存在下的测量且背景值是在2.5mM EDTA中加以测量。一式三份检测每种肝素浓度,且所呈现数据是来自多次实验的代表性结果。
图2显示使用单一肝素剂量可达成抗-Xa单位的治疗性范围。在每只小鼠接受各种肝素的“1x”或“3x”单一皮下剂量后30min,在多个小鼠的血浆中测量抗-Xa水平。每个空心圆代表一只小鼠且水平条代表平均值。
图3绘示以临床上可耐受浓度的UFH和TINZ来达成对结肠癌细胞转移的抑制,而FOND(合成五糖)无效。以皮下方式向小鼠注射“1x”肝素(A)或“3x”肝素(B)(或注射PBS作为对照),并在30分钟后经静脉内向小鼠注射MC38GFP细胞。27天后,对小鼠实施安乐死术并通过定量肺组织匀浆的荧光来评估转移。空心圆代表各小鼠并且水平条代表平均值。通过假定为双尾、不等分布的Student′s T实验来测定P值。
图4绘示具有抑制黑素瘤细胞转移的选择素抑制活性的肝素。以皮下方式向小鼠注射“1x”肝素(A)或“3x”肝素(B)(或注射PBS作为对照),并在30分钟后经静脉内向小鼠注射B16F1细胞。17天后,对小鼠实施安乐死术,经气管向肺灌注福尔马林(formalin),然后使其在福尔马林中固定至少24小时。转移通过测量肺重量来定量,其与通过照相术记载(代表性图片显示于定量图下方)的肺物理外观密切相关。每个空心圆代表一只小鼠并且水平条代表平均肺重量。通过假定为双尾、不等分布的Student′s T实验来测定P值。
图5绘示TINZ对选择素的抑制主要是通过具有相对较低抗-Xa活性的高分子量片段来介导的。(A).使5种肝素(UFH、3种LMWH、和FOND)的等份试样流经HPLC大小排除系统,并通过跟踪在206nm处的吸光度来评估其大小分布范围(所显示层析图的相关部分是t=17.5至33.3分钟)。空箭头标识合成五糖FOND的洗脱。(B)使TINZ的等份试样流经与图5相同的HPLC系统并在UV检测器后收集0.5分钟的部分。使用咔唑分析来定量各部分中的糖醛酸总量(μg)。测定各部分抑制P-选择素与sLex结合的能力,并使用适宜稀释度以使得所有读数均在线性范围内(约30-70%抑制)。将一抑制单位任意地定义为P-选择素结合的1%抑制。同样在所述分析的线性范围中确定各部分中抗-Xa单位的总量(如果未检测到活性,则使用分析的最小检测极限)。将总抑制单位和总抗-Xa单位标准化为总糖醛酸含量。如果在样品中未检测到糖醛酸,使用分析的最小检测极限来计算。在图顶部的阴影框指示第28-32部分,当标准化为糖醛酸含量时这些部分具有高P-选择素抑制活性和最小抗-Xa活性。
图6提供选择素-抑制活性的可能机制和较高分子量肝素部分的简单说明。这个说明是例示性的,并不以任何方式将所揭示方法和组合物限制于所述机制中。已知P-选择素(存在于活化血小板或内皮细胞上)具有两个结合袋:一个用于唾液酸化路易斯X(Sialyl Lewis X)部分,而另一个用于其存在于白细胞上的天然配体PSGL-1的富酪氨酸硫酸酯区域(Somers等人,Cell(2000)103:467-79)。后者PSGL-1的区域也富含具有羧酸酯侧链的氨基酸。其他P-或L-选择素配体可为在内皮细胞上或癌细胞上存在的硫酸化、唾液酸化粘蛋白。值得注意的是,这些也是存在高密度负电性硫酸酯和羧酸酯的分子。由于这些天然和病理性配体具有高密度硫酸酯和羧酸酯,即存在类似的“成块糖区域”,因此肝素可模拟这些配体。如果肝素链极短(如在FOND中),其每次只能阻断一个位点,这使其成为极弱的抑制剂(上图)。稍微较长的肝素链可同时与P-选择素上的两个结合位点交互作用,并具有一定的抑制活性(中图)。甚至更长的链可阻断多个P-选择素分子,并且更显著地影响涉及P-选择素配体的细胞-细胞交互作用亲合力(下图)。相反,抗凝血酶-因子Xa复合物是可溶复合物,而且单一五糖(具有与FOND中所发现者相同的序列)必须充分与抗凝血酶结合并催化Xa失活。除非序列中存在不止一个抗凝血酶结合五糖,否则延长肝素分子长度不会改变结果。然而,与细胞:细胞交互作用中P-选择素与其配体的多价、多位点结合不同,对抗凝血酶-Xa交互作用的效应仅是加性的。在这个模型中也没有详述由P-选择素识别的肝素结构特异性。然而,我们和其他人的先前工作(参见正文)指出了连续的结合亲和过程,但必需实施6-O-硫酸化。
图7展示在正常生理和血行性转移中的P-和L-选择素-配体交互作用。肝素疗法可通过抑制白细胞、血小板和内皮细胞与肿瘤细胞和内源性配体间的交互作用使转移最小化。
图8显示在血行性转移实验模型中,P-和L-选择素缺失可改善长期存活。向WT和PL-/-小鼠静脉内注射MC38GPP结肠癌细胞。每天监测小鼠外观并在小鼠濒死时对其实施安乐死术以验证肺转移灶的存在。以存活小鼠数对肿瘤细胞注射后时间绘图。尽管在终止时所有PL-/-小鼠均表现正常,但7只中的5只显示可见肺转移灶。
图9显示在缺失P-和L-选择素的小鼠中高剂量肝素进一步改善存活。在t=0时向PL-/-小鼠静脉内注射肿瘤细胞,并在t=-0.5h、+6h、和+12h时皮下注射PBS或100U存于PBS中的未经分级分离的肝素。注射后50天对小鼠实施安乐死术,并通过定量肺组织匀浆的荧光来测定肺转移的形成。通过实施假定为双尾、不等分布的Student′s T实验来测定P值。
图10A和B显示在缺失P-和L-选择素二者的小鼠中投与临床相关浓度的肝素对转移灶的形成没有显著效果。在t=0时向PL-/-小鼠静脉内注射肿瘤细胞,并在t=-0.5h、+6h、和+12h时皮下注射PBS或19.68U存于PBS中的未经分级分离的肝素(UFH)。注射后55天对小鼠实施安乐死术,并通过计数可见灶数量(A)和通过定量肺组织匀浆的荧光(B)(注意分段的y轴)来测定肺转移的形成。如图9所述测定P值。
具体实施方式
出于所有目的,将美国专利第6,787,365号和美国专利第6,596,705号的全部内容以引用方式并入本文中。本说明书中所提及的所有专利和公开案均表示熟习本发明所属技术者的熟习程度。本发明揭示内容中引用的所有参考文献均以引用方式并入本文中,其并入程度如同每个参考文献的全部内容独立地以引用方式并入本文中一般。
L-选择素、E-选择素和P-选择素介导引导淋巴细胞寻靶至淋巴样器官中的初始粘着事件,以及白细胞和其他炎症细胞与内皮在炎症位点的交互作用。L-选择素在白细胞上表达,E-选择素在内皮上表达,且P-选择素在血小板和内皮上表达。三种选择素与相对细胞上的特异性碳水化合物结构结合,例如,L-选择素与血小板和内皮结合,而P-选择素和E-选择素与白细胞结合。
在诸如病理性再灌注损伤、炎症病症和自身免疫病症等病症中涉及选择素粘着。选择素交互作用也可介导在某些上皮癌症转移中所涉及的主要粘着机制。因此,选择素是特征为由选择素介导的不期望或异常交互作用的病状治疗中的潜在治疗靶。
本文提供鉴别抑制P-和/或L-选择素活性的肝素的类型和批料的活体外和活体内方法。所述方法提供鉴别与P-和/或L-选择素结合的肝素形式的各种方式。随后,所鉴别肝素形式可用于抑制癌症细胞转移。此外,本文提供鉴别具有与抗凝血活性相关抑制活性的肝素片段的方法。
肝素具有许多与实体瘤扩散潜在相关的其他生物学效应,包括抑制在降解基底膜中所涉及的乙酰肝素酶、对各种肝素结合生长因子或细胞外蛋白酶的调节效应、在细胞粘着中改变整合素机能、抑制血管发生等。在所有这些潜在的非抗凝血机制中,P/L-选择素抑制是在肿瘤细胞最初进入血流中时可能首要相关的机制。在肿瘤细胞存活所涉及的级联事件开始时且在肿瘤细胞最终外渗并形成为转移灶前也存在这种效应。对于任何级联,阻断第一步都可使所有后续机制实质上无关。实际上,已显示在静脉内引入肿瘤细胞前所给与单一剂量UPH的效应可通过对P/L-选择素的抑制来解释,因为在同时缺失两种选择素的小鼠中肝素对转移没有进一步效应。在肝素减弱炎症的效应方面可看到类似结果,且相关活性同样被限制为P-和L-选择素抑制。
总的来说,解释在实体瘤转移中肝素作用的模型是P/L-选择素的抑制,以及未知程度地阻断通过液相凝血途径形成的血管内纤维蛋白。然而,在大多数先前研究中投与的相对高剂量由于过度抗凝血不能实用于临床。一般来说UFH也具有弱生物利用度,需要多次每日投药,并且具有诸如肝素诱导血小板减少症等副作用(Rosenberg RD.Semin Hematol(1997)34增刊4:2-8;Hirsh等人,Chest(2004)126:188S-203S)。为防止这种情况发生,使用多种方法通过降解UFH产生许多低分子量肝素(LMWH),降解方法包括化学解聚和酶消化(Rosenerg,上述文献;Linhardt等人,Semin ThrombHemost(1999)25增刊3:5-16)。尽管LMWH也是各种大小片段的混合物(分子量分布范围介于3000至9000道尔顿之间),但其具有更佳动力学和生物利用度,通常仅需要单一日剂量。加上LMWH具有类似临床抗凝血功效(经由抗-Xa活性)和较低副作用(例如肝素诱导血小板减少症)发生率,其在临床实践中越来越受到人们的偏爱(Hirsh等人,上述文献,Valentine等人,Semin Thromb Hemost(1997)23:173-8)。据称磺达肝素(Fondaparinux)(FOND)具有其他益处,其是具有与抗凝血酶特异性结合的限定结构的合成类肝素五糖。
已有人提出在早期癌的初步诊断与其外科手术移除后不久期间使用肝素来限制转移,最近的发现支持这一想法:经LMWH治疗的原发性肿瘤(但没有转移)患者具有较高存活率(Lee等人,J Clin Oncol(2005)23:2123-9)。
然而,将所有这些有前景的想法转换到临床实践中需要实验性评估临床上可接受浓度的各种肝素阻断P/L-选择素和减弱转移的潜力。然而,因为考虑到可能存在与其抗凝血活性相关的不期望副作用,在人类中肝素尚未用于抑制L-选择素和P-选择素结合的目的。
可以临床上可耐受剂量(从抗凝血角度来看)使用FDA已批准可用作抗凝血剂的肝素制剂来抑制P-和L-选择素介导病状,包括缺血、再灌注损伤、急性炎症、慢性炎症、和癌症转移。本研究提供鉴别可调节P-和L-选择素活性的肝素制剂类型和批料的方法。本文提供筛选能最佳抑制P-和L-选择素的肝素组合物的活体内和活体外方法。例如,所鉴别肝素可经标记后用于上述病况。肝素疗法已广泛用于抗凝血适应症,且副作用易于控制。本文也提供可用于非抗凝血治疗的肝素和类肝素制剂。本文也提供与其抗凝血活性相比具有有效选择素抑制活性的肝素片段。
在USA,临床级UFH制剂、三种类型LMWH(亭扎肝素(TINZ)、达肝素(Dalteparin)(DALT)、和依诺肝素(Enoxaparin)(ENOX))、和合成五糖(FOND)可在市场上购得并且代表大部分当前出售用于临床应用的肝素(来源:Physician′s peskReference)。临床上批准的肝素调配物在活体外抑制P-和L-选择素的能力相差极大。值得注意的是,LMWH是通过不同UFH降解方法制备的:TINZ,通过用肝素酶实施β-脱去裂解;DALT,通过用亚硝酸实施脱氨裂解;以及ENOX,通过用碱实施β-脱去裂解。
本发明提供鉴别缺少显著抗凝血活性但仍保留L-选择素和/或P-选择素抑制活性的肝素部分的方法。本发明进一步提供抑制个体转移的方法,其包括投与肝素或肝素部分。本发明提供抑制个体L-选择素和/或P-选择素介导转移的方法,其是通过向所述个体投与一定量不会在所述个体中产生显著抗凝血活性或不期望出血的分级分离肝素来达成的。在一方面中,肝素浓度包括1IU/ml或更低的抗-Xa水平。重要的是,可以低于在哺乳动物个体中导致过度抗凝血或不期望出血的浓度的血浆浓度来达成选择素抑制。
对于本发明方法,将一定量不会产生显著抗凝血活性或不期望出血的肝素投与个体。本文所用关于“一定量不会产生显著抗凝血活性的肝素”意指一定量不导致出血并发症、但可存在轻度抗凝血效应的肝素。
不期望出血的临床体征和症状包括尿中或便中带血、比正常情况严重的月经、鼻出血或小伤口或外科手术位点的过多出血。在出现所述临床现象前可为易发生淤伤的情况。如果发生不期望出血,可通过投与硫酸鱼精蛋白来抵消肝素活性;然而对FOND来说并非如此。
正如本文所揭示,经调配用于临床应用的肝素可抑制P-选择素和L-选择素与其配体结合。所述量和方法也可用于抑制转移。由此,本发明提供抑制个体L-选择素和P-选择素所介导结合的方式,其是通过以在所述个体中不产生显著抗凝血活性或不期望出血的量投与肝素来达成的。投与个体以抑制L-选择素或P-选择素介导转移的肝素量的特征在于,其不产生作为副作用的不期望出血但其可产生轻度抗凝血活性。因此,不必担心诸如出血并发症等与使用用于抗凝血疗法的肝素相关的副作用。在一方面中,本发明显示与L-选择素相比,P-选择素可以更低浓度肝素来抑制,由此提供选择性抑制P-选择素的方式。
尽管经投与以抑制个体中L-选择素和P-选择素介导转移的肝素量可部分取决于个体,但以导致低于0.2单位肝素/ml血浆之量接受肝素的正常成年个体一般不表现不期望出血。可使用业内已知各种分析方法监测经肝素治疗个体是否存在不期望出血。例如,可使用血液凝固时间、活化部分凝血活酶时间(APTT)、或抗-Xa活性来确定经投与肝素个体中的凝血状态是否不期望地增强了。如果发生不期望出血,则中断肝素投与。
所投与肝素量部分取决于是L-选择素还是P-选择素介导转移,以及由此所确定的是仅抑制P-选择素还是抑制L-选择素和P-选择素二者。例如,可将低于抗凝血剂疗法所用量的肝素量投与个体以达成与L-选择素相比主要抑制P-选择素的目的。投与个体的肝素量也取决于期望治疗效果的强度。
本发明也提供筛选并鉴别抑制P-和/或L-选择素间交互作用的转移抑制剂的方法。方法包括提供i)包含多个肝素分子的肝素制剂或肝素部分,其中所述制剂是从FDA批准的肝素类型和批料获得;ii)一或多种选自由L-选择素和P-选择素组成的群组的选择素;iii)一或多种所述选择素的配体;和b)在适用于选择素与选择素配体结合的条件下使a)i)与a)ii)和a)iii)同时或依次接触;以及c)检测与不存在肝素制剂的情况相比,在肝素制剂存在下一或多种选择素与配体结合的降低程度,其中结合降低指示组合物抑制转移。可用于本文所提供各种方法中的配体包括(但不限于)PSGL-1或唾液酸化路易斯x(SLex)。可将配体固定。配体可存在于诸如内皮细胞等细胞上。实例性细胞包括LS180细胞。
例如,将P-或L-选择素嵌合体固定在经蛋白质-A涂敷的板上且可在不同量肝素存在下结合荧光标记的肿瘤细胞。使用这种方法,本发明显示,当标准化为抗因子Xa活性(活体内抗凝血活性的预测指标)时,UFH是两种选择素的最佳抑制剂(图1)。在三种LMWH之间观察到很多变化,其中TINZ的抑制活性高于DALT和ENOX。有趣的是,尽管FOND被合成设计为具有特异性有效抗凝血活性,但其不能抑制P-或L-选择素。在高抗-Xa浓度下,DALT和ENOX能抑制P-选择素结合(图1,上图),但仅能最低限度地抑制L-选择素结合(图1,下图)。尽管与L-选择素相比,P-选择素的抑制是以更低相对剂量来达成,但总的抑制强弱次序(UFH>TINZ>DALT=ENOX>>FOND)是相同的。
此外,所投与肝素量可取决于个别个体,因为已知个体内肝素的生物利用度是不同的。例如,有时以单位肝素/kg体重投与肝素剂量。然而,因为肝素生物利用度存在差异,所以在个体血浆中达到特异性肝素含量所需的肝素剂量(例如单位肝素/kg体重)在个体间可互不相同。因此,以单位/ml血浆形式表示的个体血液中的肝素浓度是肝素浓度的更可靠量度。可以硫酸鱼精蛋白使用滴定和中和分析来测定个体中的血浆肝素量(对FOND来说并非如此)。
本文所用肝素是指肝素、低分子量肝素、未经分级分离的肝素、与金属阳离子(例如钠、钙或镁)或有机碱(例如二乙胺、三乙胺、三乙醇胺等)形成的肝素盐、肝素酯、存于脂肪酸连结物中的肝素、肝素胆汁酸连结物和硫酸肝素。
本文所用术语关于给定浓度肝素对P-和/或L-选择素或L-选择素与其配体结合的效应的“抑制结合”是指相对不存在肝素时的结合量,P-和/或L-选择素或L-选择素与其配体结合量的降低,并且包括结合降低以及完全抑制结合二者。
本文所提供肝素的“有效量”或“医药有效量”意指足以提供期望治疗效应但无毒的肝素量。不同个体所需准确量不同,取决于年龄、个体的大体状况、细胞增殖性病症或其他P-和/或L-选择素介导病症的严重度、以及所投与的具体肝素、肝素部分等。任一个别病例中的适宜“有效”量可由熟习此项技术者通过参照相关文本和文献和/或使用常规实验来测定。
“医药上可接受”意指由非生物性或原本不需要的材料构成的载剂。术语“载剂”在属类上用于指存在于医药调配物中除活性药剂以外的任一组份,并因此包括稀释剂、粘着剂、润滑剂、崩解剂、填充剂、着色剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂和诸如此类。可基于业内专业技术调配延迟和持续释放的递送调配物。
本文所用术语“治疗”(“treating”和“treatment”)是指降低症状严重度和/或出现频率、消除症状和/或潜在病因、预防症状和/或其潜在病因发生、以及改善或补救损伤。因此例如,“治疗”转移或细胞增殖性病症(例如癌症)的本发明方法涵盖抑制或降低肿瘤灶、细胞增殖能力和诸如此类。
在一方面中,本发明包括向个体投与有效量肝素(例如具有期望分子量的肝素)以抑制转移细胞与内皮的粘着。
用于本发明方法和组合物中的肝素可为具有医药品质的市售肝素制剂或粗肝素制剂,例如从哺乳动物组织或器官提取活性肝素后所获得的肝素制剂。市售产品(USP肝素)可从若干个来源(例如SIGMA Chemical公司、St.Louis,Mo.)获得,一般来说以碱金属盐或碱土金属盐(最普遍地为肝素钠)获得。或者,可从哺乳动物组织或器官(尤其从肠粘膜或肺)提取肝素,例如,使用熟习此项技术者已知的各种方法从牛肉、猪和羊来提取(参见,例如Coyne,Erwin,Chemistry and Biology of Heparin,Lundblad,R.L.等人,(Eds.),第9-17页,Elsevier/North-Holland,N.Y.(1981))。
人们在植物组织中也发现了肝素和肝素样化合物,其中肝素或肝素样化合物以复合物形式与植物蛋白质结合。得自植物组织的肝素和肝素样化合物特别重要,因为其比得自动物组织的肝素和肝素样化合物便宜很多。
含有肝素或肝素样化合物(例如生理上可接受的肝素盐或其功能类似物)的植物也可以是用于本发明的适宜来源。肝素或肝素样化合物的典型植物来源包括魁蒿(artemisia princeps)、nothogenia fastigia(红藻)、copallina pililifera(红藻)、cladophorasacrlis(绿藻)、chaetomorpha anteninna(绿藻)、aopallina officinalis(红藻)、礁膜(monostrom nitidum)、海带(laminaria japonica)、旋果蚊子草(filipendula ulmaria)(绣线菊)、ecklonia kuroma(褐藻)、泡叶藻(ascophyllum nodosum)(褐藻)、银杏(ginkgobiloba)、石莼(ulva rigida)(绿藻)、stichopus japonicus(海参)、人参(panax ginseng)、螺旋藻(spirulina maxima)、钝顶螺旋藻(spirulina platensis)、laurencia gemmifera(红藻)和落叶松属(larix)(落叶松木材)。
肝素可为低分子量肝素(LMWH)或标准或未经分级分离的肝素。本文所用LMWH包括所提及的平均分子量为约3,000道尔顿至约10,000道尔顿、通常为约4,000道尔顿至约8,000道尔顿的肝素制剂。LMWH可以较小百分比包含分子量超过所述范围上限的糖类。例如,亭扎肝素包含少量大于8,000道尔顿的肝素糖。所述LMWH是从多个不同来源购得。可通过熟习此项技术者已知并使用的多种不同离析或分级分离技术来制备本发明肝素化合物。所述技术包括(例如)凝胶渗透色谱(GPC)、高效液相色谱(HPLC)、超滤、大小排除色谱和诸如此类。
当前以若干种不同方式制造LMWH:(i)通过分级分离浓缩存于标准肝素中的LMWH;用乙醇及/或分子筛(例如凝胶过滤或膜过滤)处理;(ii)受控化学解聚(通过亚硝酸、β-脱去或高碘酸盐氧化);和(iii)通过肝素酶实施酶解聚。可谨慎控制解聚条件以产生具有期望分子量的产物。一般使用亚硝酸解聚。也可采用通过β-脱去解聚肝素的苄酯,其产生的片段类型与用肝素酶实施酶解聚相同。
可通过使用高碘酸盐氧化实施解聚来制备具有低抗凝血活性并保留基本结构的LMWH。若干种LMWH可从市场上购得:(i)分子量为4000-6000道尔顿的法安明(Fragmin)是由Kabi Pharmacia Sweden通过来自猪肠粘膜的肝素钠的受控亚硝酸解聚制造的(也可参见美国专利第5,686,431号);(ii)平均分子量为4,500道尔顿的弗希肝素(Fraxiparin)和屈肝素钙(Fraxiparine)是由Sanofi(Chaoy实验室)分别通过来自猪肠粘膜的肝素钙的分级分离或受控亚硝酸解聚制造的;(iii)依诺肝素(Lovenox)(Enoxaparin和Enoxaparine)是由Farmuka SF France使用β-脱去通过解聚来自猪肠粘膜的肝素钠制造的并且是由Aventis以商品名Clexane和Lovenox出售的;以及(iv)分子量为600至20,000道尔顿而且70%以上在1500与10,000道尔顿之间的洛集帕林(Logiparin)(LHN-1,Novo,Denmark)是使用肝素酶通过酶解聚来自肠粘膜的肝素制造的。实例性低分子量肝素片段包括(但不限于)依诺肝素、达肝素、达那帕罗(danaproid)、伽马肝素(gammaparin)、那屈肝素(nadroparin)、阿地肝素(ardeparin)、亭扎肝素、舍托肝素(certoparin)和瑞维肝素(reviparin)。
在另一实施例中,可通过首先解聚未经分级分离的肝素产生低分子量肝素,然后分离或离析出目标部分而自未经分级分离的肝素获得本发明肝素化合物。未经分级分离的肝素是由重复二糖构成的多糖链混合物,所述二糖是由糖醛酸残基(D-葡糖醛酸或L-艾杜糖醛酸)和D-葡糖胺酸残基构成的。这些二糖中许多在糖醛酸残基上和/或葡糖胺残基上硫酸化。一般来说,未经分级分离的肝素的平均分子量为约6,000道尔顿至40,000道尔顿,视肝素来源和所用分离肝素的方法而变化。
在一实施例中,肝素保留与P-和/或L-选择素结合的能力但却呈非抗凝血形式。例如,此实施例的肝素包括通过在肝素的糖醛酸残基的2-O位和/或葡糖胺残基的3-O位使肝素脱硫形成的肝素。肝素和硫酸乙酰肝素由重复二糖单位组成,所述二糖单位包含D-葡糖醛酸(GIcA)或L-艾杜糖醛酸(IdoA)以及经N-硫酸化(GIcNS)、N-乙酰化(GIcNAc)或有时未经取代(GIcNH2)的葡糖胺残基(Esko,J.D.或Lindahl,U.2001.Molecular diversity of heparan sulfate.J.Clin.Invest.108:169-173)。所述二糖可在葡糖胺残基的C6或C3和糖醛酸残基的C2上进一步硫酸化。肝素的有效抗凝血活性可取决于硫酸化糖单位和糖醛酸差向异构体的特异性布局,其形成抗凝血酶的结合位点。参见例如,Wang,L.等人,(2002)J Clin Invest,July 2002,第110卷,第1期,127-136。2-O,3-O-脱硫肝素(2/3DS-肝素)可根据业内已知的任一标准方法加以制备,例如Fryer,A.等人(1997),Selective O-desulfation produces nonanticoagulant heparinthat retains pharmological activity in the lung.J.Pharmacol.Exp.Ther.282:208-219中的方法。肝素和经修饰类肝素的抗凝血活性可通过(例如)酰胺水解抗因子Xa分析法来分析,如在Buchanan,M.R.、Boneu,B.、Ofosu,F.和Hirsh,J.(1985)The relativeimportance of thrombin inhibition and factor Xa inhibition to the antithromboticeffects of heparin.Blood 65:198-201中所述。
单独地或与其他P-和/或L-选择素抑制剂组合使用肝素(例如肝素部分)可抑制P-和/或L-选择素与P-和/或L-选择素配体间的交互作用。抑制交互作用意指(例如)P-和/或L-选择素与其配体彼此不能正确结合。所述抑制可能是任一下述各事件的结果,包括(例如)阻止或降低P-和/或L-选择素与配体间的交互作用、通过(例如)裂解或其他修饰使P-和/或L-选择素和/或配体失活、改变P-和/或L-选择素与配体间彼此的亲和力、稀释P-和/或L-选择素和/或配体、阻止P-和/或L-选择素在细胞表面、质膜上的表达或降低P-和/或L-选择素和/或配体的合成、合成异常P-和/或L-选择素和/或配体、合成交替剪接的P-和/或L-选择素和/或配体、阻止或降低P-和/或L-选择素和/或配体的构象正确折叠、调节P-和/或L-选择素和/或配体的结合特性、干扰使P-和/或L-选择素和/或配体活化或失活所需的信号、使P-和/或L-选择素和/或配体在错误的时间活化或失活、或干扰P-和/或L-选择素和/或其配体正常合成或发挥作用所需的其他受体、配体或其他分子。
可与本发明肝素组合使用的其他P-和/或L-选择素抑制剂的实例包括P-和/或L-选择素或配体的可溶形式、抑制蛋白、抑制肽、抑制碳水化合物、抑制糖蛋白、抑制糖肽、抑制硫苷脂、P-和/或L-选择素或配体的合成类似物、某些得自天然产物的物质、颗粒释放的抑制剂、以及P-和/或L-选择素或配体合成或发挥作用所需分子的抑制剂。
例如,P-和/或L-选择素或配体或其部分的可溶形式可与其同类分子竞争互补分子上的结合位点,并由此降低或消除膜结合P-和/或L-选择素与细胞配体间的结合。可溶形式可从(例如)天然存在的P-和/或L-选择素或配体的纯化或分泌、从重组体P-和/或L-选择素或配体、或从合成的P-和/或L-选择素或配体获得。P-和/或L-选择素或配体的可溶形式也意指包括(例如)截短可溶分泌形式、蛋白水解片段、其他片段、和至少部分P-和/或L-选择素或配体与其他分子的嵌合体构成物。P-和/或L-选择素的可溶形式阐述于Mulligan等人,J.Immunol.,151:6410-6417,1993中,且P-和/或L-选择素配体的可溶形式阐述于Sako等人,Cell 75(6):1179-1186,1993中。
可与本发明肝素组合使用的抑制蛋白包括(例如)抗-P-和/或L-选择素抗体(Palabrica等人,Nature 359:848-851,1992;Mulligan等人,J.Clin.Invest.90:1600-1607,1992;Weyrich等人,J.Clin.Invest.91:2620-2629,1993;Winn等人,J.Clin.Invest.92:2042-2047,1993);抗-p-和/或L-选择素配体抗体(Sako等人,Cell 75(6):1179-1186,1993);经由酶裂解生成的抑制抗体的Fab(2)片段(Palabrica等人,Nature359:848-851,1992);P-和/或L-选择素-IgG嵌合体(Mulligan等人,Immunol.,151:6410-6417,1993);以及表达由P-和/或L-选择素识别的碳水化合物部分的载剂蛋白。抗体可针对P-和/或L-选择素或配体或其亚单位或片段。多克隆抗体和单克隆抗体二者都可用于本发明中。通常使用单克隆抗体。抗体可含有得自人类抗体的恒定区和得自抑制小鼠单克隆抗体的可变区。针对人类P-和/或L-选择素的抗体阐述于Palabrica等人,Nature 359:848-851,1992;Stone和Wagner,J.C.I.,92:804-813,1993中;且针对小鼠P-和/或L-选择素的抗体阐述于Mayadas等人,Cell,74:541-554,1993中。针对人类配体的抗体阐述于Sako等人,Cell 75(6):1179-1186,1993中。抵抗人类P-和/或L-选择素的市售抗体包括来自Becton Dickinson,San Jose,Calif的克隆AC1.2单克隆。
可与本发明肝素组合使用的抑制肽可(例如)结合至P-和/或L-选择素配体上的结合位点以降低或消除使P-和/或L-选择素与配体结合的交互作用。抑制肽可(例如)为P-和/或L-选择素的主要结合位点或其一部分(Geng等人,J.Biol.Chem.,266:22313-22318,1991),或其可来自不同结合位点。抑制肽包括(例如)与P-和/或L-选择素配体正常结合的肽或其片段、合成肽和重组体肽。在另一实施例中,抑制肽可与除P-和/或L-选择素或其配体外的分子结合,并由此干扰P-和/或L-选择素与其配体的结合,因为所述分子直接或间接地参与影响P-和/或L-选择素和/或其配体的合成和/或发挥作用。
抑制碳水化合物包括包含唾液酸化路易斯a或唾液酸化路易斯x或相关结构或类似物的寡糖、包含2,6唾液酸的碳水化合物、削减抗凝血活性的肝素部分、肝素寡糖,例如肝素四糖或低分子量肝素以及其他硫酸化多糖。抑制碳水化合物阐述于Nelson等人,Blood 82:3253-3258,1993;Mulligan等人,Nature 364:149-151,1993;Ball等人,J.Am.Chem.Soc.114:5449-5451,1992;De Frees等人,J.Am.Chem.Soc.115:7549-7550,1993中。市售抑制碳水化合物包括(例如)3′-唾液酸-路易斯x、3′-唾液酸化-路易斯a、乳酸-N-岩藻糖III和3′-唾液酸化-3-墨角藻糖基乳糖,其来自OxfordGlycoSystems,Rosedale,N.Y。
抑制P-和/或L-选择素与其配体交互作用的抑制糖蛋白(例如PSGL-1,160kD单一特异性P-和/或L-选择素配体、溶酶体膜糖蛋白、包含唾液酸路易斯x的糖蛋白)和抑制硫苷脂(Suzuki等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.190:426-434,1993;Todderud等人,J.Leuk.Biol.52:85-88,1992)也可与本发明肝素共同用于本发明中。
P-和/或L-选择素或配体的合成类似物或模拟物也可用作抑制剂。P-和/或L-选择素类似物或模拟物是在形状和/或电荷分布上与P-和/或L-选择素相似的物质。至少部分P-和/或L-选择素的类似物可与其同类膜结合P-和/或L-选择素竞争配体上的结合位点,并由此降低或消除膜结合P-和/或L-选择素与配体的结合。配体类似物或模拟物包括在形状和/或电荷分布上与P-和/或L-选择素的碳水化合物配体相似的物质。至少部分配体的类似物可与其同类细胞配体竞争P-和/或L-选择素上的结合位点,并由此降低或消除P-和/或L-选择素与细胞配体的结合。在使用配体类似物的某些实施例中,碳水化合物配体的唾液酸经一基团取代,所述基团增强化合物的稳定性但仍保留或增强其对P-和/或L-选择素的亲和力,例如具有适宜间隔基的羧基基团。增强稳定性的优势在于其使得药剂可经口投用。在还原性末端具有葡萄烯糖的唾液酸化路易斯x类似物和经由β-1,3-和β-1,6-键接固定在半乳糖残基上的二价唾液酸路易斯x也可抑制P-和/或L-选择素的结合(DeFrees等人,J.Am.Chem.Soc,115:7549-7550,1993)。
颗粒释放抑制剂也可干扰P-和/或L-选择素在细胞表面的表达,并由此干扰P-和/或L-选择素的功能。颗粒释放意指通过胞吐作用分泌包含P-和/或L-选择素的储存颗粒:内皮细胞Weibel-Palade小体或血小板的[agr]-颗粒。颗粒膜与质膜的融合导致在细胞表面表达P-和/或L-选择素。这些药剂的实例包括秋水仙素。(Sinha和Wagner,Europ.J.Cell.Biol.43:377-383,1987)。
活性药剂也包括P-和/或L-选择素和/或配体合成、翻译后修饰、或发挥作用所需分子的抑制剂,或抑制P-和/或L-选择素和/或配体合成或发挥作用的分子的活化剂。药剂包括细胞因子、生长因子、荷尔蒙、信号组份、激酶、磷酸酶、同源异形框蛋白质、转录因子、翻译因子和翻译后因子或酶。药剂也意指包括可(例如)至少部分地钝化或破坏P-和/或L-选择素和/或配体的电离辐射、非电离辐射、超声和毒剂。
如上所述,在本发明某些实施例中,活性药剂可为针对P-和/或L-选择素或其配体(例如PSGL-1)的单克隆和/或多克隆抗体。可使用各种免疫策略获得可与P-和/或L-选择素或其配体反应的小鼠或其他非人抗体,例如在美国专利第6,210,670号;第6,177,547号;和第5,622,701号中所述的策略;所述各专利均以引用方式并入本文中。在某些策略中,用P-和/或L-选择素抗原使诸如小鼠等非人动物(通常是非人哺乳动物)免疫。免疫原通常是经P-和/或L-选择素稳定转染并在其细胞表面表达这些分子的细胞。其他免疫原包括P-和/或L-选择素蛋白或包含这些分子中与经例证反应性抗体结合的区段的P-和/或L-选择素的抗原决定部位片段。
将从经免疫动物获得的抗体产生细胞固定化并经选择以供产生可与多种选择素特异性结合的抗体。参见Harlow & Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(C.S.H.P.N.Y.,1988)。
可与本发明涵盖用于本发明的肝素组合使用的其他选择素抑制剂包括阻断P-和/或L-选择素结合的类肝素;阻断选择素-配体交互作用的碳水化合物分子岩藻多糖和诸如OJ-R9188等合成糖衍生物;甘草次酸GM2296和其他唾液酸化路易斯X拟糖化合物的碳-岩藻糖基化衍生物;P-和/或L-选择素表达的抑制剂,例如麦考酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil)、蛋白酶体抑制剂ALLN和诸如PDTC等抗氧化剂;诸如BMS-190394等硫苷脂和硫苷脂类似物;PSGL1的19个氨基酸的末端肽、其他PSGL-1肽、PSGL-1融合蛋白、PSGL-1类似物和诸如β-C-甘露糖苷等PSGL-1结合的选择性抑制剂;诸如化合物2等衍生自ZZZ21322的苯并噻唑化合物;和/或抑制素,特别是由Merck以商品名Zocor出售的辛伐他汀(Simvastatin)。
在某些实施例中,本发明涵盖使用增强剂,例如使用脂质体和/或纳米胶囊以单独递送本发明肝素或递送本发明肝素与其他抑制剂,以使药剂与增强剂化合物复合从而有效增强肝素从胃肠(GI)道至血流中的吸收。所述调配物可用于引入医药上可接受的肝素、抗体和/或本文所揭示其他活性药剂的调配物。一般来说脂质体的调配物和应用对熟习此项技术者是已知的。参见例如Backer,M.V.等人,(2002)Bioconjug Chem13(3):462-7。
在一实施例中,1-(酰氧基烷基)咪唑(AAI)是以对pH敏感的无毒脂质体形式用于本发明中。将AAI纳入脂质体中,如Chen,F等人(2003),Cytosolic delivery ofmacromolecules:I.Synthesis and characterization of pH-sensitiveacyloxyalkylimidazoles Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes,第1611卷,第1-2期,第140-150页中所述。可通过用咪唑亲核取代脂肪酸的氯代烷基酯来合成实例性1-(酰氧基烷基)咪唑(AAI)。前者可从脂肪酸的氯化物和醛来制备。如通过荧光分析所测定,当纳入脂质体时,这些脂质显示明显的pKa值(从1-(棕榈酰氧基甲基)咪唑(PMI)的5.12到1-[(α-肉豆蔻酰氧基)乙基]咪唑(α-MEI)的5.29)。如由针对红细胞的溶血活性所显示,当咪唑部分被质子化时,这些脂质具有表面活性。可在血清中以及在细胞匀浆中水解AAI。如通过MTT分析所测定,这些脂质针对中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary)(CHO)和RAW 264.7(RAW)细胞的毒性显著低于生化上稳定的N-月桂基咪唑(NDI)。
许多吸收增强剂是业内已知的并可用于本发明中。例如,中链甘油酯显示具有可增强跨肠粘膜吸收亲水性药物的能力(Pharm.Res.第11卷:1148-54(1994))。已报道癸酸钠可通过细胞旁路途径增强肠和结肠的药物吸收(Pharm.Res.10:857-864(1993);Pharm.Res.5:341-346(1988))。美国专利第4,545,161号揭示一种通过添加非离子型表面活性剂来增强肝素和类肝素肠吸收能力的方法,所述表面活性剂是(例如)可通过使环氧乙烷与脂肪酸、脂肪醇、烷基酚或失水山梨糖醇脂肪酸酯或脂肪酸甘油酯反应来制备的表面活性剂。
可使用一种通过共投与砜和脂肪醇与肝素来增强经粘膜吸收肝素的方法(美国专利第3,510,561号)。颁予Sache等人的美国专利第4,239,754号阐述用于肝素经口投与的脂质体调配物,其意欲提供延长的作用持续时间。肝素保持在脂质体之内或之上,脂质体通常是从包含衍生自不饱和脂肪酸的酰基链的磷脂形成的。
用于本发明肝素的其他递送方法阐述于下列专利中:颁予Teng的美国专利第4,654,327号(关于以具有四级铵离子的复合物形式经口投与肝素)、颁予Herr的美国专利第4,656,161号(阐述一种通过经口投与药物和诸如聚氧乙烯-20鲸蜡基醚、聚氧乙烯-20硬脂酸盐、其他聚氧乙烯(聚乙二醇)-基表面活性剂、聚氧丙烯-15硬脂酰醚、蔗糖棕榈酸酯硬脂酸酯、或辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷等非离子型表面活性剂来促进肝素或类肝素肠吸收能力的方法)、颁予Bauer的美国专利第4,695,450号(阐述一种包含聚乙二醇、诸如丙二醇等二元醇、或诸如甘油等三元醇的亲水性液体和尤其是动物油、矿物油或合成油的疏水性液体的无水乳剂)、颁予Bodor的美国专利第4,703,042号(阐述聚阴离子肝素酸盐和聚阳离子肝素酸盐的经口投与)、颁予Longenecker等人的美国专利第4,994,439号(阐述一种通过共投与药物与胆汁盐或夫西地酸钠(fusidate)或其衍生物和非离子型去污剂(表面活性剂)来改善诸如肽和蛋白质等大分子药物跨膜吸收能力的方法)、颁予Owen等人的美国专利第5,688,761号(主要是关于使用通过添加水性流体可容易地转化为水包油乳剂的油包水型微乳剂调配物来递送肽类药物,其中肽或其他水溶性药物释放后由身体吸收)、颁予Owen等人的美国专利第5,444,041号、第5,646,109号和第5,633,226号(是关于递送诸如蛋白质或肽等生物活性药剂的油包水微乳剂,其中活性药剂最初储存在乳剂的内部水相中,但当组合物与体液混合后转化为水包油乳剂时活性药剂被释放出来)、颁予Einarsson的美国专利第5,714,477号(阐述一种通过投与活性药剂与一种或若干种脂肪酸甘油酯来改善肝素、肝素片段或其衍生物的生物利用度的方法)、颁予New的美国专利第5,853,749号(阐述一种通过共投与生物活性药剂和胆汁酸或胆汁盐和缓冲剂来将肠pH缓冲至7.5至9的调配物)。
在一实施例中,本发明剂型实质上是延迟释放的,以使得在经口投与后组合物自剂型中的释放延迟,并且通常可在下GI道中发生。到达预期释放位点后,可存在或不存在进一步的机制来控制组合物自剂型中释放。也就是说,自剂型延迟释放组合物可为速发型并实质上在预期释放位点完成,或者,在预期位点的释放可以持续方式在延长时间段内进行或以阶段性或脉冲方式进行。例如,可通过体外/体内可植入泵来递送肝素。所述泵可递送基本量和/或推注量的肝素。
如上所述,以可有效抑制转移癌症细胞与P-和/或L-选择素结合的量单独地或与其他选择素抑制剂一起投与本发明肝素。可通过业内已知各种方法来分析这种结合抑制。
本发明肝素可单独或与其他选择素抑制剂共同纳入用于治疗性投与的各种调配物中。更具体来说,可通过与适宜的医药上可接受的载剂或稀释剂组合来将肝素单独或与其他药剂共同调配至医药组合物中,并且可将其调配至各种制剂中,包括以诸如浆液和溶液等液体形式调配。可通过经口投与来达成活性药剂的投与。
适用于本发明中的调配物可参见Remington′s Pharmaceutical Sciences(MackPublishing Company,Philadelphia,Pa.,第19版(1995)),其教示以引用方式并入本文中。此外,药物递送方法的概述可参见Langer等人(1990)Science 249:1527-1533,其教示以引用方式并入本文中。可以熟习此项技术者已知的方式来制造本文所述医药组合物,即通过习用混合、溶解、研磨、乳化、包埋或冻干制程来制造。下述方法和赋形剂仅为例示性并且决非限制性的。
适用于本发明的医药组合物包括其中以治疗有效量包含活性成份的组合物。当然,所投与组合物的量可取决于所治疗个体、个体体重、患病严重性、投与方式和处方医师的判断。熟习此项技术者精通有效量的确定,尤其可根据本文提供的详细揭示内容来确定。
本发明医药组合物可使用任一习用方法来制造,例如混合、溶解、粒化、研磨、乳化、包封、包埋、熔融纺丝、喷雾干燥、或冻干制程。然而,可端视投与途径和期望剂量由熟习此项技术者确定最佳医药调配物。所述调配物可影响所投与药剂的物理状态、稳定性、活体内释放速率、和活体内清除速率。端视所治疗病况,可全身性或局部性调配并投与这些医药组合物。
也可通过多种途径投与本发明医药组合物,包括(但不限于)局部地、经直肠、经口、经阴道、经鼻、经皮。经肠投与模式包括(例如)经口(包括含服和舌下给药)和经直肠投与。经上皮投与模式包括(例如)经粘膜投与和经皮投与。经粘膜投与包括(例如)经肠投与以及经鼻、吸入、和深度肺投与;经阴道投与;和经直肠投与。经皮投与包括被动或主动经真皮或经表皮模式,包括(例如)贴剂和离子电渗装置,以及糊剂、膏剂或软膏剂的局部施用。
调配医药组合物以使其包含适宜医药上可接受的载剂,并视需要可包含有助于将活性化合物加工为医药上可用制剂的赋形剂和辅助剂。一般来说投与模式可决定载剂性质。对于组织或细胞投与来说,在调配物中可使用适于穿越拟透过屏障的渗透剂。一般来说这些渗透剂是业内已知的。对于某些制剂调配物可包含稳定材料,例如多元醇(例如蔗糖)和/或表面活性剂(例如非离子型表面活性剂)和诸如此类。
这些制剂可包含一或多种赋形剂,其包括(但不限于):a)稀释剂,例如糖,包括乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、或山梨糖醇;b)粘着剂,例如硅酸镁铝、来自玉米、小麦、稻、马铃薯等的淀粉;c)纤维素材料(例如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、和羧甲基纤维素钠)、聚乙烯基吡咯烷酮、树胶(例如阿拉伯树胶和黄蓍胶)、和蛋白质(例如明胶和胶原);d)崩解剂或增溶剂,例如交联聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、琼脂、海藻酸或其盐(例如藻酸钠)、或泡腾组合物;e)润滑剂,例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸或其镁或钙盐,和聚乙二醇;f)矫味剂和甜味剂;g)着色剂或颜料,例如用来鉴别产物或表征活性药剂的量(剂量);和h)其他成份,例如防腐剂、稳定剂、溶胀剂、乳化剂、溶液促进剂、调节渗透压的盐、和缓冲液。
可以活性药剂的盐形式提供医药组合物,这些盐可用多种酸来形成,包括(但不限于)氢氯酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。在水性溶剂或为对应游离碱形式的其他质子型溶剂中盐更易于溶解。
如上所述,药剂自身和药剂调配物的特性可影响所投与药剂的物理状态、稳定性、活体内释放速率和活体内清除速率。所述药物动力学和药物药效学信息可通过活体外和活体内临床前研究来收集,之后在临床实验过程期间于人类中加以证实。因此,对于本发明方法中所用任一化合物,在哺乳动物中,尤其在人类中的治疗有效剂量最初可根据生化分析和/或基于细胞的分析来估算。然后,可在动物模型中调配剂量以达成调节P-和/或L-选择素结合的期望治疗剂量范围。
所述化合物的毒性和治疗效用可在诸如活体外人类脐带静脉内皮细胞等细胞培养物或实验动物中通过标准医药程序来测定,例如,用于测定LD50(可导致群体中50%死亡的剂量)及ED50(对群体中50%具有治疗效果的剂量)的程序。
对于本发明方法,可使用调节用药时限和顺序的任一有效投药方案。活性药剂的剂量包括包含有效量药剂的医药剂量单位。
通常,活性产物(例如肝素)可以下述浓度存于医药组合物中:约1mg/剂量至3,000mg/剂量,并且更通常为约40mg(10,000单位)/剂量至约2,700mg(300,000单位)/剂量,或约50mg/剂量至约600mg/剂量。然而,可根据肝素调配物而有所改变(例如,如果其是对选择素具有集中抑制作用的部分,则可给与较少肝素)。在一实施例中,活性药剂可以设计为可促进自GI道吸收的片剂或胶囊形式来投与。在另一实施例中,活性药剂包含于适用于经口投与的固体或胶囊形式中,总剂量为约50mg至约500mg,而且通常总剂量为50mg(6,250单位)、100mg(12,500单位)、250mg(31,250单位)或500mg(62,500单位)。
端视特定活性药剂的特异性活性,日剂量可大幅度变化。端视投与途径,可根据体重、体表面积或器官大小来计算适宜剂量。主治医师可参照良好医疗实践,考虑改变药物作用的各种因素来确定最终剂量方案,这些因素例如药剂的特异性活性、疾病状态的严重度、患者反应性、年龄、病况、体重、性别和患者饮食、任何感染的严重度和诸如此类。可考虑的其他因素包括投与时间和频率、药物组合、反应敏感性和对治疗的耐受/反应。适用于涉及本发明所提及任一调配物的治疗的剂量的进一步改进是由熟练从业者未经过度实验以常规方式达成的,尤其是根据所揭示的剂量信息和分析,以及在临床实验中所观察到的药物动力学数据来达成。可通过使用在体液或其他样品中测定药剂浓度连同剂量反应数据的既定分析来确定适宜剂量。
投药频率可取决于药剂的药物动力学参数和投与途径。可调节剂量和投与以提供充足的活性药剂浓度或维持期望效应。因此,可根据需要以单一剂量、多次分开剂量、连续输注、持续释放贮藏物质或其组合投与医药组合物以维持药剂的最低期望浓度。
短效医药组合物(即短半衰期)可每天投与一次或每天投与一次以上(例如每天两次、三次或四次)。长效医药组合物可每3至4天、每周、或每两周投与一次。
可制备包含调配在医药上可接受载剂中的本发明活性药剂的组合物,将其置于适宜容器中,并作好标记以用于适应症的治疗。标记适应症可包括(但不限于)细胞增殖性病症和转移的治疗。也涵盖试剂盒,其中试剂盒包括医药组合物的剂型和包含在医学病况的治疗中所述组合物的使用指导的包装说明书。
一般来说,以有效量向个体投与用于本发明的活性药剂。一般来说,有效量是对下述情况有效的量:(1)减少欲治疗疾病的症状,(2)引发与治疗欲治疗疾病相关的药理学变化,和/或(3)预防待治疗疾病的症状。
本文所揭示的结果以及所建立的肝素作为治疗药剂的记录显示,使用低于抗凝血疗法所需量的数量,肝素可用于抑制基于P-和/或L-选择素的交互作用。具体来说,本发明提供包含在亭扎肝素中发现的高分子量肝素的肝素部分(例如大于8,000道尔顿)。理想地,肝素部分分子量大于8,000道尔顿,但并不大到可引起不期望副作用或降低生物利用度。由此,本发明提供一种抑制个体P-和/或L-选择素结合的方法,其是通过向个体投与一定量不会在个体中产生显著抗凝血活性或不期望出血的肝素来达成的。本发明进一步提供治疗P-和/或L-选择素相关病状的方法,其是通过向患有所述病状的个体投与一定量不会在个体中产生显著抗凝血活性或不期望出血的肝素来达成的。
使用本发明方法可治疗其中P-和/或L-选择素具有病理生理性作用的特定急性和慢性病况。例如,根据本发明方法可通过向个体投与肝素来抑制不期望免疫应答,其中自细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞或其他免疫细胞的寻靶或粘着是通过L-选择素与内皮细胞配体的交互作用介导的。例如,嗜中性粒细胞粘着的抑制可干扰由氧自由基的分泌引发的损伤级联和在心肌梗塞中存在的导致组织损伤和心肌收缩功能受损的相关活性。类似地,在个体中,如果P-和/或L-选择素介导的细胞(例如嗜中性粒细胞和血小板)粘着是不期望的,可抑制这种活性。因此,使用本发明方法可降低慢性免疫病症或急性炎症反应的严重度。
当将肝素投与个体时,是以医药组合物的形式加以投与。所述肝素医药组合物可在市场上购得,且肝素投与方案为业内所熟知。所述组合物和投与方案可方便地用于实践本发明。熟习此项技术者可了解,具体肝素医药组合物的选择取决于(例如)投与途径,并且可通过各种途径将肝素医药组合物投与个体,包括(例如)非经肠投与、尤其静脉内投与。可通过静脉内或皮下注射投与肝素组合物,并且可以推注或通过连续输注实施投与。此外,可经口、经直肠或通过吸入来投与肝素的粘膜可吸收形式,前提条件是血液中所达到的肝素浓度不超过在个体中产生显著抗凝血活性或不期望出血的浓度。
尽管上文已概述本发明,但在下文具体揭示内容中阐述本发明的其他方面,其是例示性而非限制性的。
实例
实例1
材料:下述材料是来自UCSD Medical Center Pharmacy:来自AmericanPharmaceutical Partners的未经分级分离的肝素钠(UFH)(20,000U/ml;批号302523、333246);来自Pharmion,USA的Innohep(亭扎肝素,TINZ)(由LEO PharmaceuticalProducts,Denmark许可,20,000IU/ml;批号E9867A和G3371A);来自Pharmacia的法安明(达肝素,DALT)(5000IU/0.2ml;批号94250A51、94683A02和94802A01);来自Aventis的依诺肝素(依诺肝素,ENOX)(30mg/0.3ml;批号30324、9367和9369);以及来自Sanofi-Synthelabo的Arixtra(磺达肝素,FOND)(2.5mg/0.5ml;批号0010000003和0170000010)。除非另外说明,否则所有其他化学物质均是购自SigmaChemical公司,St.Louis。
细胞系:培养LS180人结肠腺癌细胞和MC38GFP细胞(经EGFP稳定转染的小鼠结肠癌细胞系)。在具有10%FCS的DMEM中培养小鼠黑素瘤B16F1细胞。除FCS是来自HyClone之外,所有培养基和添加物均是来自Gibco(Invitrogen)。所有细胞均是在37℃和5%CO2下培养。使用前,通过在37℃下于具有2mM EDTA的PBS中培养5-10分钟来释放细胞,然后将其在具有Ca2+、Mg2+和葡萄糖的PBS中洗涤,之后将其在相同缓冲液中悬浮以用于静脉内注射。
小鼠:随意地用标准食物和水喂养来自Jackson Laboratories的C57BL/6J小鼠(Bar Harbor,Maine),并将其维持在12小时光/暗循环中。某些小鼠是通过室内喂养这些C57BL/6J小鼠获得的。在开始实验前,当所有购得小鼠到达后,使其在动物饲养所内适应最少一周。所有实验都是在AAALAC特许的动物饲养所中根据由University′s IACUC所批准的方案来实施的。
LS180与选择素结合的肝素抑制:基于肝素的抗-Xa活性将肝素浓度标准化。研究细胞与固定化人选择素-Fc嵌合体的结合,但使用加载钙黄绿素AM的LS180细胞。结果表示为使用下式计算的对照结合的百分比:100*(肝素值-EDTA值)/(仅缓冲液值-EDTA值)。以各种的相关浓度在孔中(一式三份)检测每种抗凝血剂。
经由血浆抗-Xa水平滴定肝素剂量:以不同终浓度向小鼠皮下注射100μl稀释于PBS中的UFH、TINZ或FOND。30分钟后,通过心脏穿刺将血液收集至包含30μl10mM EDTA的1cc注射器中。在24℃以2,000rcf将样品离心两次以收集血浆,将其储存在-80℃下直至用于分析抗-Xa活性。将存于155μL 25mM HEPES/150mMNaCl/pH 7.5中的人抗凝血酶III(3.3μg/孔)(Enzyme Research Laboratories)和人类因子Xa(0.02μg/孔)(Enzyme Research Laboratories)添加至1.25μL血浆样品中,然后将其与25μg/孔合成因子Xa发色底物(Chromogenix)共同培养。15分钟后通过添加50μl/孔20%乙酸终止反应。在405nm处测量所获得发色团。通过与掺入肝素的小鼠血浆样品的标准曲线对比以抗-Xa单位/ml来计算血浆肝素浓度。一式三份分析标准品和样品。用于“1x”剂量的最终量为6.56U UFH、7.32IU TINZ和0.0033mgFOND。“3x”剂量使用所述量的三倍。
癌的实验性转移分析:向小鼠皮下注射100μL PBS或存于100μL PBS中的肝素。30分钟后,将500,000MC38GFP细胞静脉内注射至侧面尾部静脉中。以交替顺序向各研究组的小鼠注射,并且在吸取用于每次注射的样品前通过轻弹试管使细胞再悬浮。注射后27天,对小鼠实施安乐死术,移出肺并在溶解产物中定量EGFP荧光。
黑素瘤实验性转移分析:使用癌转移分析中所述方案向小鼠注射肝素和500,000B16F1细胞。注射后17天,对小鼠实施安乐死术,用10%缓冲福尔马林实施气管灌注,并将肺移出置于10%缓冲福尔马林中。使肺固定最少24小时,将其分别从福尔马林中移出,并使用数码相机拍照。通过下述步骤测定肺重量:将肺从福尔马林中移出,暂时将其置于滤纸上以去除多余液体,然后将其在Sartorius分析天平上称重。
肝素二糖分析:二糖分析是由UCSD Glycotechnology Core Facility实施的。简单来说,将5μg每种肝素干燥,再悬浮于100mM乙酸钠、0.1mM乙酸钙、pH 7.0的溶液中,并在37℃下分别与5mU肝素裂解酶I、II和III共同培养18小时。将样品煮沸2分钟并使其流经预洗涤的Microcon 10过滤器。然后干燥样品,将其再悬浮于MilliQ水中,并在60分钟内于Dionex ProPac PA1阴离子交换柱上使用pH 3.5的MilliQ水以50-1000mM的氯化钠梯度通过HPLC将其离析。通过在洗脱液流中使用Eldex双通道泵混合2-氰基乙酰胺(1%)与250mM NaOH来达成伴有荧光检测的柱后衍生法。然后使洗脱液流经加热至130℃的Eppendorf TC-40反应螺管,之后实施冷却浴,再用激发波长设为346nm且发射波长设为410nm的Jasco荧光检测器对其分析。这种方法的灵敏度为约5pmole。
肝素筛分:以0.4ml/min使10mM KH2PO4、0.5M NaCl和0.2%Zwittergent(Calbiochem)流经TosoHaas TSKG2000SW HPLC柱。使用葡聚糖蓝测定外水体积。将胞苷一磷酸(CMP,0.5μg)掺入所有样品中用作内部对照来标记所包括体积。评估各肝素的两个不同批料。用MilliQ水将每个样品补足至10μl的总体积。在整个45分钟的运行期间以206nm波长监测UV吸光度。在一额外运行中,使TINZ的较大等份试样(19.5μl TINZ和2.5μg CMP标记)流经相同柱,并收集200μl部分且评估其针对P-选择素与sLex结合的抑制活性(参见本文分析细节)。使用标准咔唑分析来定量各部分中的糖醛酸含量。
对P-选择素与sLex结合的抑制的分析:用存于50mM碳酸盐缓冲液(pH 9.5)中的2μg/ml sLex-PAA(Gycotech,Maryland)涂敷高结合力96孔ELISA板过夜。用HPLC流动缓冲液的1∶5稀释物(终浓度为2mM KH2PO4、0.1M NaCl和0.04%Zwittergent)将板冲洗两次,然后在HPLC流动缓冲液的1∶5稀释物+0.5%BSA中将其封闭1小时。在所收集HPLC部分的1∶5稀释物(或那些部分在柱缓冲液中的稀释物)或肝素标准品存在下,将人P-选择素嵌合体与山羊抗人IgG-AP(BioRad)(0.25μg∶0.25μl)于室温下预复合搅拌1小时。将样品添加至封闭板中并将其在室温下培养2-3小时。用HPLC缓冲液的1∶5稀释物+0.5%BSA将板冲洗两次,然后用HLPC缓冲液的1∶5稀释物再冲洗两次。将AP底物溶液(150μl;10mM对-硝基苯基磷酸盐、100mM Na2CO3、1mM MgCl2、pH 9.5)添加至板中并使其在室温下显影。用SpectraMax 250板读数器读取在405nm处的光密度。在分析的线性范围内,将一单位抑制活性任意地定义为为选择素结合的1%抑制。结果表示为使用下式计算的总抑制单位:100*[(最大结合-未知结合)/(最大结合-最小结合)]*(200/μl在抑制分析中所检测的部分),其中“最大结合”是在于肝素洗脱前所洗脱部分的存在下的结合量且“最小结合”是在0.5IU/ml TINZ存在下的结合量。
小鼠中进行的用以标准化肝素投药的药物动力学研究。实施比较UFH、TINZ和FOND的额外研究,由此涵盖选择素抑制特性的范围。在文献中未记载关于这些肝素在小鼠中的药物动力学的详细资料。实际上,大多数先前小鼠研究使用高UFH剂量,其可能产生在人类临床应用中不可接受的抗凝血效应。在转移分析中检测这些肝素之前,实施研究以标准化投药,使得每次所投与肝素产生相似的、临床上可接受的活体内抗-Xa水平。皮下递送是投与LMWH的典型途径。由此,优化小鼠中的皮下肝素剂量以达成临床上相关的抗-Xa水平。用于经肝素治疗静脉血栓栓塞的患者的治疗性浓度对于LMWH为约1抗因子Xa单位/ml,其通常是在注射后3-4小时加以测量。全身性皮下投与肝素剂量以在小鼠中达成大致相似的血浆抗-Xa水平。经测定,单一剂量注射量的“1x”UFH、TINZ和FOND可产生在此范围内的平均抗-Xa水平(图2A,如在人类中,个体间单一皮下剂量的效应存在相当大差异)。在皮下递送后30分钟(即在所计划的转移实验中将肿瘤细胞注射至脉管系统中时)分析血浆抗-Xa水平。然而,药物动力学研究显示事实上在小鼠中TINZ的清除比在人类中快得多,在人类中一次日剂量足以维持抗凝血。将单一肝素剂量从″1x″增加至“3x”剂量,并分析抗-Xa水平(图2B)。此处,初期峰值水平可能略高于临床上可接受的水平,但实际上相关水平可持续稍久。将“1x”和“3x”肝素剂量二者用于转移实验,其与服用这些药物的患者中可能发现的浓度范围近似。
仅可通过某些肝素来减弱癌转移。所有后续活体内研究都使用“实验性”转移模型,其中肿瘤细胞是经静脉内注射。这种方法使得可以受控方式在已知时间点(即“自发性”转移实验不适合)研究在肿瘤细胞进入脉管系统的最初几小时内肿瘤细胞和血细胞之间的交互作用。我们的实验采用在注射肿瘤细胞前单次推注注射肝素。
已显示可通过在注射肿瘤细胞前30分钟静脉内注射100U UFH来减弱人类和小鼠结肠癌细胞的实验性转移。在注射肿瘤细胞前使用12.5或60IU UFH的其他人的研究也显示黑素瘤细胞转移的降低。尽管这些以及大多数先前研究显示肝素具有降低转移的潜力,但其是使用临床上不可接受的肝素剂量来实施的。为在临床相关性更强的环境中评估肝素治疗,实施转移分析来比较“1x”和“3x”剂量的UFH、TINZ和FOND。在以“1x”投药或“3x”剂量用肝素或用PBS对照实施皮下投药后30min,向小鼠静脉内注射已知携带选择素配体的同源MC38GFP结肠癌细胞。使用“1x”剂量的结果显示与所观察到的活体外选择素抑制活性相匹配的降低转移的趋势(即,UFH>TINZ>>FOND)(图3A)。然而这些结果在统计学上不显著。以UFH和TINZ注射“3x”肝素几乎完全减弱转移,但在FOND与PBS之间仍无显著差异(图3B)。值得注意的是,这种FOND剂量产生相当于或高于临床抗凝血的所接受范围的血浆抗-Xa水平(图2B)。
黑素瘤转移的肝素抑制也取决于选择素抑制活性。用MC38GFP细胞所获得的结果显示结肠癌转移的抑制与肝素抑制P-和L-选择素的能力之间的关系。为确定这种现象是否适用于其他癌症转移模型,在皮下注射UFH、TINZ或FOND(PBS作为对照)的“1x”剂量或“3x”剂量后30分钟向小鼠静脉内注射B16F1黑素瘤细胞。注射后17天,切除肺并评估转移灶的存在。不计数转移灶,而是获得肺重量并与来自未注射肿瘤细胞的小鼠的肺重量作比较。其他人已使用这种方法,而且其与肺的物理外观密切相关(参见图4)。在接受“1x”肝素剂量的小鼠中,在接受UFH和TINZ的小鼠中观察到转移在统计学上显著降低(图4A)。同样,FOND没有效果,肺的外观与注射PBS的小鼠的肺的外观相当。当肝素量增加至“3x”剂量时,用UFH和TINZ治疗可观察到甚至更大的转移降低,其肺重量与未接受肿瘤细胞的小鼠的肺重量相似(图4B)。同样,FOND对转移无效,即使以更高剂量投药也是如此。因此,在即将注射黑素瘤细胞之前给与单次推注低剂量UFH和TINZ能降低转移。这种趋势符合用结肠癌细胞所观察到的结果,此证实了在多种肿瘤细胞类型中选择素抑制的重要性(且抗凝血效应缺乏重要性)。
LMWH抑制选择素的能力差异与二糖组成无关。肝素是具有多分散分布硫酸化和差向异构化模式的复合多糖。先前已显示硫酸化模式可影响经化学修饰肝素抑制选择素的能力。考虑到制备三种LMWH调配物的不同方法,独特的硫酸化模式可解释其抑制P-和L-选择素的不同能力。FOND的结构是人所皆知的。如“材料和方法(Materials and Methods)”中所述评估两批料每种UFH的二糖组成和三种LMWH每种的二糖组成。可注意到各种二糖的百分比间无显著差异。因此,所观察到的各种LMWH间的抑制差异可能不能归因于基本硫酸化模式中的主要差异。而是,应归因为高级结构和/或总长度。对于后一种可能性的证据,我们先前的工作显示在1-7个二糖范围内增加长度与增强抑制P-和L-选择素的能力有关。
通过大小分级分离鉴别具有与抗凝血活性相关的有效选择素抑制特性的肝素。肝素调配物的随附包装说明书表明TINZ可能比DALT或ENOX含有更多高分子量(HMW)肝素片段。>8000道尔顿的片段量指定为:TINZ是22-36%,DALT是14-26%,且ENOX是0-18%。为确定这种HMW含量的潜在差异是否存在于我们的样品中,对所有五种肝素实施大小排除HPLC分析。通过监测在206nm处的UV吸光度来测定每种肝素的大小分布范围(图5A)。三种LMWH中每种的肝素片段的大小分布范围显著小于UFH。ENOX的分子量分布范围小于TINZ和DALT二者。尽管TINZ和DALT的平均分子量似乎相似,但TINZ的分子量分布范围比DALT更广。因此,TINZ包含少量在DALT中不存在的更高分子量分子(图5A)。
为确定这种少量较大片段是否不成比例地参与P-选择素抑制,在HPLC大小分离TINZ的较大等份试样后收集各部分。通过使用标准咔唑分析测量糖醛酸含量来测定各部分中的总肝素量。评估部分的P-选择素抑制单位总量。在少量最高分子量部分中记录到大量P-选择素抑制活性(图5B)。实际上,甚至在样品中可检测到糖醛酸以前就已观察到这种活性,其表示相对少量的HMW材料具有高P-选择素抑制活性。这个结果强有力地支持了我们的假说:长度是决定抑制活性的重要因素。
当在TINZ的大小分级分离特性曲线(图5B)中评估抗-Xa单位总量时,可看到在P-选择素抑制和抗-Xa的峰之间存在偏移。事实上,当这些变量标准化为各部分中的糖醛酸量时,可看到存在少量包含极高量P-选择素抑制活性和最低抗-Xa活性的部分的亚组(部分28-32,在图顶部由阴影框表示)(图5B)。因此,市场上有售的肝素包含在给定浓度下能抑制P-选择素与其配体结合同时仅最低限度对影响凝血过程的片段亚组。
已有文件详细记载了癌症与过度全身性血栓形成之间的密切关系,而且在所述情况下显然需要抗凝血。在本发明中阐述了抗凝血是否影响癌症扩散。许多先前研究显示,在小鼠中UFH抑制实体瘤转移,而且有限的数据表明所述效应可能也与人类相关。因此基本假定在减弱转移过程中其作用的主要机制是抗凝血。如先前所讨论的,肝素是具有与实体瘤的整体生物学潜在相关的许多效应的生物活性分子的复合混合物。数据表明在循环中与肿瘤细胞的初期存活相关的肝素效应主要归因于抑制P/L-选择素,还可能归因于阻断经由液相凝血途径达成的血管内纤维蛋白形成。如果按照建议在临近手术时才给与肝素,那么在脉管系统中肿瘤细胞的无活性期间肝素的其他效应可有益于患者,因为其可由于对血管发生、乙酰肝素酶等的抑制而能降低原发性肿瘤生长和侵袭以及已形成转移灶的生长。
几乎所有在啮齿类动物中的研究都以相对高的剂量使用肝素,而且从未以临床相关剂量实施过当前出售的各种类型肝素的分析。本发明首次显示不同肝素在活体外抑制P-和L-选择素的能力与其抑制两种不同类型的同源鼠类肿瘤转移的能力相关。也显示这种转移的降低与肝素的抗凝血活性无关,因为如活体内所测量,在相同水平的临床上可耐受的抗-Xa活性下优良的抗凝血剂FOND不能抑制转移。就此而言,最近在小鼠中用蛭素(有效的抗凝血酶)抑制转移的研究使用了远高于推荐在人体中使用的剂量,并且有时导致抗凝血水平超出其分析的检测上限。因此,虽然先前所报道高剂量肝素和蛭素对支持肿瘤转移的纤维蛋白形成的效应可能是正确的,但其未必与人类患者的临床情况高度相关。最近报道,即使在蛭素存在下,特鲁索综合症(TrousseauSyndrome)的血小板和白细胞介导的P/L-选择素依赖性微血管凝血症也可通过向小鼠注射肿瘤粘蛋白来引发。
本文所提供数据显示,选择素抑制是肝素以临床相关剂量影响肿瘤转移的重要作用。各种肝素活体外抑制P-和L-选择素的能力的强弱次序与活体内对减弱转移的效应相匹配。同样,这些研究使用产生临床上可耐受抗-Xa水平的肝素的单次推注剂量,其在几小时内就被自体内清除。因此,肝素的许多其他后续作用(例如血管发生抑制、乙酰肝素酶抑制等)可能与所揭示转移研究无关,因为单一剂量肝素在体内存留时间不够长,不能影响这些交互作用。此外,在所述转移模型中肝素的这些其他作用是在选择素效应的下游,因为肿瘤细胞是直接引入脉管系统中的,其中肿瘤细胞首先与承载血细胞和内皮细胞的P-和L-选择素交互作用。在连续投与肝素的临床环境中,其在不同情况下可能会有或没有不同程度的贡献。应注意,在临床环境中每次投药后肝素可在循环中存留更久(因为其在人类中半衰期延长)。也可存在延长更多的治疗持续时间。因此,在这些单次注射研究中观察到的显著效应在临床环境中可能甚至会更明显。
血小板和白细胞可通过与在肿瘤细胞上表达的选择素-配体交互作用来支持转移。然而,先前显示这些研究中所用的黑素瘤细胞系表达低浓度的sLex(选择素配体的主要组份),并且在我们的实验室中实施的实验表明重组体P-选择素最低限度地与这些细胞结合。这表明黑素瘤细胞的肝素抑制可能也归因于内源性选择素-配体交互作用例如PSGL-1与P-选择素之间的交互作用)的抑制(。最新发现支持这一论点:即使在肿瘤细胞未携带P-选择素配体时,血小板在肿瘤细胞周围的聚集也可发生。通过肝素抑制P-选择素和/或阻断L-选择素的其他效应干扰这些血小板聚集可能足以降低转移。因此,肝素疗法不一定限制于仅对其肿瘤细胞携带选择素配体的患者实施。
本发明提供设计预期临床实验评估手术前、手术期间和手术后的肝素疗法与原发性恶性肿瘤去除手术的关系的方法,该手术是恶性细胞可进入脉管系统的时期。其还显示了选择已知为有效的P/L-选择素结合抑制剂的肝素制剂的重要性。本文所述活体外和活体内数据可表明TINZ比DALT和ENOX更能增强无转移存活并且FOND对结果无影响。因此,对于使用DALT疗法显示患者存活率增高的近期临床实验,如果将TINZ引入其研究,可能会得到甚至更强的效果。本文所鉴别的是传统上具有较小有害副作用风险的LMWH,其也能经由选择素抑制来降低转移。此外,本发明研究评估TINZ的各种部分,显示最终有可能分离出一种肝素片段亚组,其容许投与不影响患者凝血状态、但仍能显著抑制P-选择素的极低剂量。最后,因为无论如何癌症患者都频繁需要抗凝血剂疗法来治疗血栓形成,本发明数据显示应更关注抗凝血剂的选择,因为其可能可以与抗凝血无关的方式改善存活。
尽管不必鉴定本发明如何起作用的理论,但本发明仍提供所揭示肝素和类肝素可能的作用机制的论述。因此,保证简要论述抗凝血效应和选择素抑制效应之间差异的潜在原因(细节参见图6)。最有可能的原因是由于P-选择素凝集素结构域的延伸双位点性质和涉及细胞表面的选择素-配体结合的多价亲合力。这与肝素-抗凝血酶结合相反,其仅涉及一个特异性需要在FOND中所发现精密结构的五糖结合位点,有人发现这种结构也沿着较长肝素链长度分布。图6中通过模型描述这些概念并在图例中加以解释。另一可能(并非互相抵触)解释在于下述事实:当阴离子多糖长度增加时,在链中部可能发生许多变化,包括构象和电荷变化。因此,延长的肝素链可能具有适合P/L-选择素的新内部特征。
先前已讨论了设计抗凝血活性降低但仍保留其他活性的新类型肝素;然而,在这些经修饰新肝素最终可获得批准用于人类之前,其需要完整的临床前和阶段I-III临床检测。本发明显示不需要特殊修饰,且可自当前经FDA批准肝素形式中的片段亚组分离有效制剂。
本发明阐述由肝素抑制P/L-选择素在降低转移中的重要性,同时所述发现对治疗其中P/L-选择素具有重要作用的许多其它人类疾病也很重要。这些疾病包括炎症性疾病,例如过敏性皮炎、哮喘、动脉粥状硬化、和炎症性肠道疾病;其中缺血再灌注损伤起关键作用的疾病,例如器官移植、阻塞性冠状动脉炎的血管成形术后的心肌功能障碍等(Bevilacqua等人,Annu Rev Med(1994)45:361-78;Lowe等人,J Clin Invest(1997)99:822-6;和Ley K.,Trends Mol Med(2003)9:263-8);以及其他疾病,例如镰状红细胞病(Matsui等人,Blood(2002)100:3790-6)。
实例2
细胞系:MC38GFP细胞是经增强绿色荧光蛋白(GFP)稳定转染的小鼠结肠癌细胞,将其培养并制备用于注射。
小鼠:C57BL/6J(WT)小鼠来自Jackson Laboratories(Bar Harbor,Maine)或来自这些小鼠的室内喂养。开始实验前,当所有购得小鼠到达后,使其在动物饲养所内适应最少一周。缺失P-和L-选择素二者(PL-/-)并与C57BL/6J背景同源的小鼠是业内已知的。随意地用标准食品和水喂养所有小鼠并将其维持在12小时光/暗循环中。在AAALAC特许的动物饲养所中实施实验。与IACUC建议一致,“存活”研究不使用死亡作为终点,而是当小鼠到达明显濒死状态时(基本不动,身体弓起,呼吸急促、并且不寻找食物或水)使用安乐死来代替。
癌的实验性转移分析:向小鼠皮下注射100μL PBS或存于100μL PBS中的肝素(100U或19.68U)。相对于肿瘤细胞注射,在t=-0.5h、+6h、和+12h时实施肝素或PBS注射。在t=0时将MC38GFP细胞静脉内注射至侧面尾部血管中。当WT小鼠表现濒死状态时对其实施安乐死术。在注射后50或55天对所有存活小鼠实施安乐死术。为评估转移,计数所切除肺上的可见灶,和/或定量肺组织匀浆的GFP荧光。
同时缺失P-和L-选择素可显著延长经静脉内注射肿瘤细胞的小鼠的存活。实验性转移研究中显示在PL-/-小鼠中转移灶形成减少。然而,这些研究在第一只WT对照小鼠表现濒死状态的时间点即终止。因此,对P-和L-选择素缺失的改善存活的能力从未作过评估。向WT和PL-/-小鼠实施同源小鼠结肠癌细胞的静脉内注射,并在较长时间段内监测小鼠,且仅在个体动物表现濒死状态时才对其实施安乐死术,并实施典型尸体剖检发现肺薄壁组织几乎完全被融合性肿瘤细胞团所代替。在肿瘤细胞注射后第33天对第一只WT小鼠实施安乐死术(图8)。尽管存活WT小鼠数量继续随时间减少,但在注射肿瘤细胞后第55天研究终止时并未观察到PL-/-小鼠出现濒死状态(图8)。然而在第55天超过半数PL-/-小鼠具有可见肺转移。因此,尽管缺失P-和L-选择素可显著增强存活,但如果实验实施时间更长,这并不是绝对的。长时间存活的PL-/-小鼠仍产生一些转移损伤,这一事实使得能确定肝素对这些动物是否具有任何其他效应。
在缺失P-和L-选择素的小鼠中高剂量肝素进一步降低转移。先前研究显示在血行性转移级联的极早时间点P-选择素可能在转移中起作用,可能是通过促进血小板在肿瘤细胞周围聚集来达成。根据功能阻断抗体研究,在稍晚时间点(肿瘤细胞注射后约6-18小时)L-选择素似乎也具有相对早期的作用。在肿瘤细胞注射前0.5h或在肿瘤细胞注射后6h和12h注射100U肝素可显著降低WT小鼠中转移灶形成。据信在这些研究中肝素的作用机制主要归因于其抑制P-和/或L-选择素的能力。为证实这个假说,在相对于注射经GFP转染的结肠癌细胞的相同时间点-0.5h、+6h和+12h向PL-/-小鼠注射PBS或100U肝素。使这些小鼠在实验中保持50天,使得至少在某些动物中可形成显著转移灶。当定量肺组织匀浆的GFP荧光作为转移灶形成的量度时,与接受PBS对照注射的小鼠相比,在接受三种肝素注射的PL-/-小鼠中可观察到显著降低(图9)。因此,这些高剂量肝素注射对减弱转移具有某些额外效应,这些效应与选择素抑制活性无关。
如上所述,肝素具有许多其他潜在的抗转移效应,包括抗凝血。某些实验性研究显示使用抗凝血酶剂蛭素的抗凝血可降低转移。在这些研究中的一个研究中,在即将静脉内注射肿瘤细胞之前、注射后4h、并随后每隔一天给与小鼠20mg/kg蛭素,共注射10天。观察到转移灶形成显著减少。另一组在注射肿瘤细胞前20分钟以10mg/kg向小鼠注射蛭素。同样,显示用蛭素治疗可降低肿瘤细胞的肺部滞留。然而,如果在注射肿瘤细胞时测量蛭素的抗凝血,几乎所有结果均高于检测极限(在活化部分凝血活酶时间检测中凝固时间>300秒)。由于此剂量约为第一个所提及研究中给予剂量的一半,倘若在所给与剂量下达成过度抗凝血,则两组结果均极有可能是临床上不相关的。将未经分级分离的肝素与无选择素抑制活性的合成五糖磺达肝素作比较。当以类似的临床上可耐受的抗凝血水平给与时,所述五糖对血行性转移无效。习用于小鼠研究的100U肝素的剂量所达成的抗凝血水平在临床应用中也不可接受。
临床上可耐受的肝素剂量对与P-和L-选择素抑制无关的转移无显著效应。研究检测以临床上可耐受浓度给与的未经分级分离的肝素以及除抑制P-和L-选择素之外UFH是否对限制转移具有任何加成效应。因此,实施其中在相同的三个时间点给与肝素的类似实验,以抑制P-选择素和L-选择素。与先前实验(图9)中所给与的高剂量肝素相反,使用肝素的临床相关剂量。正如通过评估可见转移灶数量(图10A)或通过定量肺组织匀浆中的荧光(图10B)可知,在缺失P-和L-选择素的环境中临床相关的肝素注射对转移无显著效应(尽管肝素存在稍微改善的趋势,但这种趋势通过任一量度测量在统计学上均不显著)。
先前已显示这种肝素剂量对WT小鼠中转移灶形成具有显著效应。既然在缺失P-和L-选择素二者的小鼠中未观察到其他效应,可推断临床相关肝素剂量主要是经由抑制P-和L-选择素来减弱转移。当然,始终存在一种可能性:肝素也抑制一或多种与选择素对转移的作用处于相同线性途径内的其他机制。然而,在其中肿瘤细胞是直接投与至脉管系统中并立即与血细胞交互作用的转移实验模型中,转移级联的某些最早步骤可能涉及选择素。因此,抑制级联中的这些早期步骤可使肝素的其他下游效应实际上无关。此外,由于在此实验中所投与的肝素剂量在数小时内被清除,肝素的许多其他效应(例如乙酰肝素酶和血管发生抑制)在所研究时间范围内可能不相关。仍有可能的是,与趋化因子结合的肝素在此时间段内也可相关。
本文已阐述了本发明的许多实施例。然而,应了解,可在不违背本发明精神和范围的情况下作出各种修改。因此,其他实施例均属于下述权利要求书的范畴。
Claims (34)
1、一种筛选抑制选择素活性的组合物的方法,所述方法包括:
a)提供:
i)包括多个肝素分子的肝素制剂,其中所述制剂是从FDA批准的肝素类型和批料获得;
ii)一或多种选择素,其选自由L-选择素和P-选择素组成的群组;
iii)一或多种选择素的配体,所述选择素选自由L-选择素和P-选择素组成的群组;及
b)在适用于选择素与选择素配体结合的条件下使a)i)与a)ii)和a)iii)同时或依次接触;以及
c)检测与不存在所述肝素制剂的情况相比,在所述肝素制剂存在下一或多种选择素与配体结合的降低程度,其中结合的降低指示组合物抑制选择素活性。
2、如权利要求1所述的方法,其中所述结合的降低程度是使用低于产生一或多种活性的肝素浓度的所述肝素制剂浓度来检测的,所述活性选自由活体内抗凝血活性和活体内不期望出血组成的群组。
3、如权利要求2所述的方法,其中所述肝素制剂浓度低于产生选自由血管发生抑制、乙酰肝素酶抑制和细胞因子结合组成的群组的活性的肝素浓度。
4、如权利要求2所述的方法,其中所述肝素制剂浓度不降低E-选择素与E-选择素配体的结合程度。
5、如权利要求3所述的方法,其中使所述一或多种选择素与所述配体的结合程度降低的肝素浓度比产生过度或危险活体内抗凝血活性的肝素浓度低2倍至50倍。
6、如权利要求1所述的方法,其中所述配体是PSGL-1。
7、如权利要求1所述的方法,其中所述配体是唾液酸化路易斯x(sialyl-Lewisx)(SLex)。
8、如权利要求1所述的方法,其中将所述配体固定。
9、如权利要求1所述的方法,其中所述配体存在于细胞上。
10、如权利要求9所述的方法,其中所述细胞是内皮细胞。
11、如权利要求9所述的方法,其中所述细胞是HL-60细胞。
12、如权利要求1所述的方法,其另外包括鉴别肝素制剂作为L-选择素相关病状的治疗药剂。
13、如权利要求1所述的方法,其另外包括鉴别肝素制剂作为P-选择素相关病状的治疗药剂。
14、一种筛选抑制选择素活性的组合物的方法,所述方法包括:
a)提供:
i)包括多个肝素分子的肝素制剂,其中所述制剂是从FDA批准的肝素批料获得;
ii)一或多种选择素,其选自由L-选择素和P-选择素组成的群组;
iii)一或多种选择素的配体,所述选择素选自由L-选择素和P-选择素组成的群组;及
iii)肝素;
b)分级分离a)i)肝素制剂并分离多个包括肝素分子的部分,其中所述部分是基于所述部分中所述肝素分子的大小来分离的;
c)在适用于选择素与选择素配体结合的条件下使b)中各部分与a)ii)和a)iii)同时或依次接触;及
d)鉴别与不存在所述部分的情况相比,在所述部分存在下降低所述一或多种选择素与所述配体的结合程度的部分。
15、如权利要求14所述的方法,其中所述配体是PSGL-1。
16、如权利要求14所述的方法,其中所述配体是唾液酸化路易斯x(SLex)。
17、如权利要求14所述的方法,其中将所述配体固定。
18、如权利要求14所述的方法,其中所述配体存在于细胞上。
19、如权利要求18所述的方法,其中所述细胞是内皮细胞。
20、如权利要求18所述的方法,其中所述细胞是HL-60细胞。
21、一种肝素部分,其通过如权利要求14所述的方法鉴别出。
22、如权利要求21所述的肝素部分,其中所述肝素包括分子量介于约8,000与40,000道尔顿之间的肝素多糖。
23、如权利要求21所述的肝素部分,其中所述肝素包括可用肝素酶实施β-脱去裂解并且分子量为至少8,000道尔顿的肝素多糖。
24、如权利要求21所述的肝素部分,其中所述部分的特征在于其为高分子量的亭扎肝素(tinzaparin)部分。
25、一种制造物件,其包括包装材料并且在所述包装材料内含有通过如权利要求1所述的方法鉴别出的肝素制剂,其中所述包装材料包括标签或包装说明书,其指明所述肝素制剂抑制选择素活性并且可用于抑制个体血行性转移。所述相同标签还提供关于与选择素抑制活性相关的抗凝血活性水平的信息。这使得医师投与的剂量可在活体内提供充足的P-和L-选择素阻断活性而不会导致可能将患者置于出血风险中的过度抗凝血。
26、如权利要求25所述的制造物件,其中所述肝素制剂是包括分子量大于8,000道尔顿的肝素的中间分子量肝素制剂。
27、如权利要求25所述的制造物件,其中所述肝素制剂是亭扎肝素。
28、一种制造物件,其包括包装材料并且所述包装材料中包含通过如权利要求14所述的方法鉴别出的肝素部分,其中所述包装材料包括标签或包装说明书,其指明所述肝素部分抑制选择素的活性并且可用于抑制个体血行性转移或任何其他由P-和/或L-选择素介导的病状。
29、如权利要求24或28所述的制造物件,其中所述选择素选自由P-选择素和L-选择素组成的群组。
30、一种预防或治疗个体细胞增殖性病症的方法,所述方法包括向所述个体投与有效量的特异性选择素活性抑制剂,其包括存于医药上可接受载剂中的中间分子量肝素,其中所述抑制剂是肝素制剂或肝素部分。
31、如权利要求30所述的方法,其中所述中间分子量肝素包括分子量介于约8,000与40,000道尔顿之间的肝素多糖。
32、如权利要求30所述的方法,其中所述中间分子量肝素制剂包括可用肝素酶实施β-脱去裂解并且分子量为至少8,000道尔顿的肝素多糖。
33、一种预防或治疗个体细胞增殖性病症的方法,所述方法包括向所述个体投与有效量的存于医药上可接受载剂中的如权利要求21所述的肝素制剂。
34、一种预防或抑制个体转移或任何其他由P-和/或L-选择素介导病状的方法,所述方法包括向所述个体投与有效量的存于医药上可接受载剂中的特异性选择素活性抑制剂,其中所述抑制剂是包括中间分子量肝素的肝素制剂或肝素部分。
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