CN103626850A - 具有细胞穿透功能的多肽及其在药物递送中的用途 - Google Patents

Abstract

本申请涉及具有细胞穿透功能的多肽、编码该多肽的核酸、含有该多肽的复合物和药物组合物、生产该多肽的方法，以及上述多肽、核酸、复合物和药物组合物的用途。本申请还涉及具有细胞穿透功能的多肽在药物递送中的用途，例如可以通过口服途径给药。

Description

具有细胞穿透功能的多肽及其在药物递送中的用途

技术领域

本申请涉及具有细胞穿透功能的多肽及其在药物递送中的用途。

背景技术

随着生物技术的发展，蛋白多肽类药物不断涌现，正越来越多地用于临床，应用于多种疾病的治疗并取得了不可替代的疗效。由于分子量、电荷、脂溶性等多种原因，大部分蛋白多肽类药物很难被导入细胞中去，通常情况下，通过主动运输和自由扩散的方法，仅有那些分子量很小（例如600道尔顿以内）并具有脂溶性的小分子多肽才能够进入细胞。所以，目前蛋白多肽类药物基本都是采用注射给药方式，如何建立一种高效的递送方式、使得蛋白多肽类药物能够有效给药，例如口服给药，是这类药物广泛应用的瓶颈。

口服给药的吸收障碍主要是胃肠酶屏障和黏膜物理屏障。胃酸及胃肠道内蛋白酶的降解作用是导致多肽蛋白质类药物难以口服吸收的重要因素之一，现行的肠溶包衣技术能够部分解决这一问题；此外，胃肠道粘膜的通透性低，使得分子量大、脂溶性差的多数多肽蛋白质类药物不能实现穿肠吸收（Goldberg M.et al,Nat.Rev.Drug Discov.2003,2:289）。

多年以来，科学家们尝试了很多种方法，期待能够促进多肽蛋白类药物的肠黏膜吸收，包括使用各种吸收促进剂（Agarwal,V.et al.,Int.J.Pharm.2001,225:31;Agarwal V.et al.,J.Pharm.Pharmacol.2001,53:1131;Marschütz,M.K.et al.,Pharm.Res.2000,17:468）、蛋白酶抑制剂（Takeuchi H.et al.,Pharm.Res.1996,13:896;Bernkop-Schnürch A.et al.,J.Control.Release,2001,50:215;Lehr C.M.etal.,J.Control.Release,2000,65:19,Lowman,A.M.et al.,J.Pharm.Sci.1999,88:933;Morishita M.J.Control.Release2006,110:587）、可与黏膜吸附的聚合物（Watnasirichaikull S.,J.Pharm.Pharmacol.2002,54:473;Kisel M.A.et al.,Int.J.Pharm.2002,16:105;Sajeesh S.et al.,J.Biomed.Mater.Res.B.Appl.Biomater.2005,76:298）和其它一些如微乳液、脂质体、纳米颗粒等载体转运系统（TozakiH.et al.,J.Pharm.Sci.2001,90:89;Sarciaux J.M.et al.,Int.J.Pharm.1995,120:127;Hillery A.M.et al.,J.Drug Target.1994,2:151;Xia C.Q.et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.2000,295:594）。这些方法，虽然在实验室取得了一定的成功，但是当应用于临床研究时，就出现生物利用度太低或明显不良反应等问题，导致与其他剂型如注射制剂相比没有明显优势，因此很少应用于临床。

近二十年来，在生物细胞学研究领域中，陆续发现了一些具有细胞穿透功能的氨基酸序列，其长度多数小于20个氨基酸，被命名为穿膜肽(Cell PenetratingPeptides,CPPs)或蛋白转导结构域（Protein Transduction Domain,PTD）。它们能够介导其它大分子蛋白或多肽的跨膜运输，具有蛋白转导活性。这些CPPs或者PTD的发现，为大分子蛋白的转运吸收似乎开辟了一条新的通道（Foged,C.et al.,Expert Opin.Drug Deliv.2008,5:105）。

蚯蚓纤溶酶（earthworm fibrinolytic enzyme，EFE），又称蚓激酶，是从蚯蚓体内提取的具有纤溶活性的蛋白水解酶。它具有激活纤溶酶原及直接水解纤维蛋白的纤溶酶活性。研究表明，EFE是一种口服有效的溶栓药物，可作为溶栓药物用来防治心脑血管疾病和肺部栓塞（唐亚娟等,首都医药,2011(03下):39）。Qiao等在2001年从粉正蚓（Lumbricus rubellus）中提取出蚯蚓纤溶酶F-III-1，试验结果显示10%至15%的EFE能够以完整分子的形式通过小肠上皮细胞释放到血液中；免疫组织化学实验能在肠上皮细胞中检测到EFE（Qiao Fan et al.,Biochimica et Biophysica Acta2001,1526:286-292）。这表明，全长的EFE具有一定的细胞穿透活性。但是，全长的EFE同时也具有纤溶活性，这大大限制了EFE作为细胞穿透活性肽的应用，因为在细胞穿透的应用中，通常不需要有纤溶活性，额外的纤溶活性可能带来很大的临床副作用。

本领域仍然需要更多的能够提供细胞穿透功能的穿膜肽或蛋白转导结构域，以提供更好的细胞穿透功能。

发明概述

本申请涉及一种具有细胞穿透功能的多肽、编码该多肽的核酸、含有该多肽的复合物和药物组合物，生产该多肽的方法，以及上述多肽、核酸、复合物和药物组合物的用途。

一方面，本申请涉及一种分离的具有细胞穿透功能的多肽，其包含如SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2所示的序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或者至少99%同源性的氨基酸序列，并且所述多肽不含有如SEQ ID NO:1所示的序列。

在某些实施方式中，本申请所述的具有细胞穿透功能的多肽包含至少100至246个氨基酸，或至少100至159个氨基酸。在某些实施方式中，本申请所述的多肽包含SEQ ID NO:2-4所示的任一氨基酸序列。

另一方面，本申请涉及一种运载复合物，其包含转运部分和货物分子，所述转运部分包含本申请所述的具有细胞穿透功能的多肽。在某些实施方式中，所述货物分子可以是化学化合物或者生物大分子（如多肽或多聚核苷酸）。

在某些实施方式中，所述转运部分可以直接与所述货物分子连接，或者也可以通过接头连接。在某些实施方式中，所述转运部分与所述货物分子通过共价键连接。在某些实施方式中，所述转运部分的羧基末端与所述货物分子的氨基末端通过接头共价连接。在某些实施方式中，所述转运部分的氨基末端与所述货物分子的羧基末端通过接头共价连接。在某些实施方式中，所述接头为连接肽。

在某些实施方式中，所述货物分子是人干扰素α2a、人生长激素、或者增强型绿色荧光蛋白。

另一方面，本申请涉及一种药物组合物，其包含所述运载复合物和药用载体。在某些实施方式中，所述药物组合物为口服制剂、注射制剂、口腔喷雾制剂或鼻腔喷雾制剂。

另一方面，本申请涉及一种在对象中将货物分子递送穿透细胞的方法，所述方法包括向所述对象递送药物组合物，所述组合物包含运载复合物和药用载体，所述运载复合物包含转运部分和货物分子，所述转运部分包含本申请所述的具有细胞穿透功能的多肽。

另一方面，本申请涉及一种分离的核酸，其包含编码所述具有细胞穿透功能的多肽的核酸序列。

另一方面，本申请涉及一种生产所述具有细胞穿透功能的多肽的方法，包括将包含编码所述多肽的核酸的表达载体，在允许表达所述多肽的条件下在宿主细胞中表达；然后收集并纯化表达的所述多肽。

另一方面，本申请涉及将所述具有细胞穿透功能的多肽用于在对象中将货物分子递送穿透细胞的用途，其包含向所述对象给药含有运载复合物的药物组合物，所述运载复合物包含由本申请所述的具有细胞穿透功能的多肽组成的转运部分，和所述货物分子。

附图说明

图1为质粒pET-32a的质粒图。

图2为重组质粒pET-32a-EFEm的酶切和PCR鉴定结果。其中，泳道1和泳道2：pET-32a-EFEm经EcoRI/XhoI双酶切的结果（目的带较暗）；泳道3和泳道4：以pET-32a-EFEm质粒为模板的PCR鉴定结果；泳道5：以pET-32a-EFEm/JM109菌液为模板的PCR鉴定结果；泳道M：DNA标记III(bp)。

图3为EFE的突变体EFEm表达的SDS-PAGE检测结果。其中，泳道M：蛋白标记（kD）；泳道1：pET-32a/BL21(DE3)诱导后；泳道2：pET-32a-EFEm/BL21(DE3)菌诱导前；泳道3：pET-32a-EFEm/BL21(DE3)菌诱导后(46.8KD)；泳道4：pET-32a-EFEm/BL21(DE3)诱导后，菌株破碎离心上清；泳道5：pET-32a-EFEm/BL21(DE3)诱导后包涵体；泳道6：pET-32a-EFE/BL21(DE3)菌导前；泳道7：pET-32a-EFE/BL21(DE3)诱导后(46.9kD)；泳道8：pET-32a-EFE/BL21(DE3)诱导后，菌株破碎离心上清；泳道9：pET-32a-EFE/BL21(DE3)诱导后包涵体。诱导表达条件为1mM IPTG、37°C、4h。

图4为纯化蛋白EFEm的SDS-PAGE检测结果。其中，泳道M：蛋白标记；泳道1-5：EFEm纯化分步收集的部分样品，分子量为46.8KD。

图5为利用纤维蛋白平板法测定EFEm纤溶活性所显示的结果。其中，A：EFE标准品；B：可溶性纯化蛋白EFEm；C：复性后的纯化包涵体EFEm；D：复性前的纯化包涵体EFEm；E：大肠杆菌表达的可溶性纯化蛋白EFE。

图6为质粒pET22b的质粒图。

图7为重组质粒pET22b-IFNα2a的酶切鉴定结果。其中，泳道1：IFNα2aPCR产物；泳道2：DNA标记IV；泳道3：pET22b-IFNα2a质粒Nde I&BamHI双酶切。

图8为重组质粒pET22b-IFNα2a-EFEm的鉴定结果。其中，泳道1：DNA标记IV；泳道2：pET22b-IFNα2a-EFEm质粒Nde I&BamH I双酶切（IFNα2a片段）；泳道3：pET22b-IFNα2a-EFEm质粒BamH I&Xho I双酶切（EFEm片段）；泳道4：pET22b-IFNα2a-EFEm质粒Nde I&Xho I双酶切（IFNα2a-EFEm片段）；泳道5：重组质粒pET22b-IFNα2a-EFEm。

图9为IFNα2a-EFEm融合蛋白的诱导表达及纯化后的SDS-PAGE鉴定结果。其中，泳道1：蛋白标记；泳道2：pET-22b（+）-IFNα2a-EFEm/BL21诱导后菌体破碎液离心的上清；泳道3：pET-22b（+）-IFNα2a-EFEm/BL21诱导后菌体破碎液离心的沉淀；泳道4和泳道5：IFNα2a-EFEm融合蛋白的复性纯化。

图10为VSV-HeLa系统测定IFNα2a–EFEm的抗病毒效价，其中方框所示干扰素IFN标准品的抗病毒活性为1.0IU/ml。

图11为IFNα2a-EFEm的肠膜吸收功能的ELISA检测结果。

图12为重组质粒pMD-EFEm-hGH的酶切鉴定结果。其中，泳道1：D10000DNA标记；泳道2：pMD-EFEm-hGH Xho I单酶切产物；泳道3：Xho I及Msc I双酶切产物；泳道4：EFEm-hGH PCR产物；泳道5：EFEm PCR产物；泳道6：hGH PCR产物；泳道7：D2000DNA标记。

图13为EFEm-hGH的氨基酸序列（SEQ ID NO:26）和核酸序列（SEQ ID NO:27）。

图14为EFEm-hGH融合蛋白的诱导表达图谱。其中，泳道1：分子量标记；泳道2：E.coli BL21/pET22b菌液；泳道3：未经IPTG诱导的E.coliBL21/pET22b-EFEm-hGH（BL21）菌液；泳道4：IPTG诱导的E.coliBL21/pET22b-EFEm-hGH（BL21）菌液。

图15为EFEm-hGH融合蛋白复性纯化的SDS-PAGE检测结果。其中，泳道1：分子量标记；泳道2：纯化的EFEm-hGH。

图16为EFEm-hGH的肠膜吸收功能的ELISA检测结果。

图17为重组质粒pET-32a-EFE_1-159的酶切鉴定结果。其中，泳道1：pET-32a-EFE_1-159质粒EcoR I和Xho I双酶切；泳道2：EFE_1-159PCR产物；泳道3：DNA标记D2000。

图18为EFE_1-159的表达结果。其中，泳道1：蛋白分子量标记；泳道2：pET-32a/BL21(DE3)诱导后表达菌株；泳道3：pET-32a-EFE_1-159/BL21(DE3)诱导前表达菌株；泳道4：pET-32a EFE_1-159/BL21（DE3)诱导后表达菌株（37.7KD）；泳道5：pET-32a-EFE_1-159/BL21(DE3)未诱导表达菌株；泳道6：pET-32a-EFE_1-159/BL21(DE3)诱导后表达菌体超声波破碎液；泳道7：pET-32a-EFE_1-159/BL21(DE3)诱导后表达菌体超声波破碎液离心上清。表达条件：1mMIPTG、37°C、4h。

图19为EFE_1-159的提取纯化结果。其中，A：可溶性蛋白；B：包涵体蛋白；泳道M：蛋白分子量标记；图A泳道1-4和图B泳道1-5：EFE_1-159纯化分步收集的部分样品，分子量为37.7KD。

图20为纤维蛋白平板法测定EFE_1-159纤溶活性所显示的结果。其中，a：EFE标准品；b：大肠杆菌表达的可溶性纯化蛋白EFE；c：可溶性纯化蛋白EFE_1-159。

图21为重组质粒pET32a-EFE_1-100-EGFP的酶切鉴定结果。其中，泳道1：λDNA/HindⅢ标记，泳道2～5：构建成功的阳性克隆用EcoRI及NotI对其进行双酶切鉴定；泳道6：DL2000DNA标记。

图22为EFE_1-100-EGFP的提取纯化和Western印迹实验结果。其中，泳道1：融合蛋白EFE_1-100-EGFP用Ni-NTA亲和柱层析纯化样品；泳道2：蛋白质分子量标准品；泳道3：pET32a(+)-EFE_1-100-EGFP在BL21(DE3)中诱导表达菌体；泳道4：未连入目的基因的空载体pET32a(+)在BL21(DE3)中诱导表达菌体；泳道5：pET32a(+)-EFE_1-100-EGFP在BL21(DE3)中IPTG诱导前菌体；泳道6：pET32a(+)-EFE_1-100-EGFP在BL21(DE3)中未加入IPTG诱导菌体；右图为Western印迹结果，箭头所指为目的融合蛋白。

图23为腹腔注射融合蛋白EFE_1-l00-EGFP后小鼠血清荧光检测结果，其中，A：EFE_1-100-EGFP蛋白样品；B：腹腔注射EGFP2小时后小鼠血清；C：腹腔注射融合蛋白EFE_1-100-EGFP2小时后小鼠血清。

图24为小鼠血清中EFE_1-l00-EGFP的ELISA检测结果。其中，A：小鼠腹腔注射可溶性融合蛋白EFE_1-l00-EGFP后血清ELISA检测结果；B：小鼠腹腔注射复性后包涵体蛋白EFE_1-l00-EGFP后血清ELISA检测结果；C：小鼠腹腔注射生理盐水后血清ELISA检测结果；D：小鼠腹腔注射可溶性EGFP后血清ELISA检测结果。

图25为动物实验小鼠血清Western印迹检测结果。其中，泳道1：小鼠腹腔注射生理盐水后的血清；泳道2：小鼠腹腔注射可溶性融合蛋白EFEP_1-100–EGFP1小时后的血清；泳道3：小鼠腹腔注射可溶性EGFP1小时后的血清；泳道4：小鼠腹腔注射包涵体表达复性后的EFEP_1-100–EGFP之后3小时的血清。

图26为EFE天然蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO:1）和核酸序列（SEQ IDNO:5）。

图27为EFEm的氨基酸序列（SEQ ID NO:2）和核酸序列（SEQ ID NO:6）。

图28为EFE_1-100的氨基酸序列（SEQ ID NO:3）和核酸序列（SEQ ID NO:7）。

图29为EFE_1-159的氨基酸序列（SEQ ID NO:4）和核酸序列（SEQ ID NO:8）。

图30为质粒pUCm-T的质粒图。

图31为质粒pMD-T的质粒图。

发明详述

尽管本申请将在以下公开多个方面和实施方式，但是在不违背本申请主题精神和范围的前提下，本领域技术人员显然可以对其进行各种等同改变和修改。本申请公开的多个方面和实施方式仅用于举例说明，其并非旨在限制本申请，本申请的实际保护范围以权利要求为准。

本申请的一方面涉及一种具有细胞穿透功能的多肽片段。具体地说，本申请涉及一种分离的多肽，其含有EFE的突变体或者部分多肽片段，所述突变体或者片段具有细胞穿透功能，但是基本上不具有纤溶活性。在某些实施方式中，上述EFE的多肽片段为EFE的氨基末端片段。在某些实施方式中，上述EFE的多肽片段具有EFE氨基酸全长序列的氨基末端至少100个氨基酸，或者至少110个氨基酸，或者至少120个氨基酸，或者至少130个氨基酸，或者至少140个氨基酸，或者至少150个氨基酸。在某些实施方式中，上述EFE的多肽片段具有EFE氨基酸全长序列的氨基末端100-159个氨基酸之间的任意长度。

本申请使用的术语“多肽”、和术语“蛋白”以及“肽”可以互换使用，是指氨基酸的聚合物。本申请所述的多肽、蛋白或肽可以含有天然的氨基酸，也可以含有非天然的氨基酸，或氨基酸的类似物、模拟物。本申请所述的多肽、蛋白或肽可以通过本领域公知的任何方法获得，例如但不限于，通过天然分离、重组表达、化学合成等。

“分离的”在本申请中是指一种物质（例如多肽或者核酸）与它在自然界中正常存在的环境相分离或存在于与它在自然界中正常存在的环境不同的环境中。

“细胞穿透功能”在本申请中是指，多肽片段能够穿透细胞膜，从细胞膜的一侧转移到细胞膜的另一侧如从细胞外透过细胞膜进入细胞内，或者能够穿透单层或多层细胞所组成的物理屏障。本申请的多肽片段能够穿透的细胞可以是活的细胞，体外的细胞，或体内的细胞。本申请的多肽片段还可以穿透不同种类的细胞，例如，但不限于，消化道上皮细胞（例如，口腔上皮细胞、食管上皮细胞、胃上皮细胞、十二指肠上皮细胞、小肠上皮细胞、空肠上皮细胞、回肠上皮细胞、结肠上皮细胞）、粘膜细胞（例如，口腔粘膜细胞、鼻粘膜细胞、胃黏膜细胞、小肠粘膜细胞、结肠黏膜细胞、十二指肠黏膜细胞）、皮肤细胞（例如表皮细胞、上皮细胞、真皮细胞、内皮细胞）、或血管细胞（例如血管壁细胞、血管内皮细胞、血管外皮细胞、血管平滑肌细胞）。在某些实施方式中，本申请提供的多肽能够穿透小肠上皮细胞。在某些实施方式中，本申请提供的多肽能够穿透血管壁细胞，从而进入血液循环系统。

在某些实施方式中，本申请的多肽片段能够独自或者以复合物的形式携带其他分子穿透细胞。本申请的多肽片段能够以完整的形式穿透细胞，并且在穿透细胞后仍然具有生物活性。在某些实施方式中，与全长EFE相比，本申请的多肽的细胞穿透活性至少为全长EFE的细胞穿透活性的50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、120%、130%、140%、或者150%。

细胞穿透功能可以通过本领域公知的方法测定。例如，用本申请的多肽片段对实验动物实施灌胃，然后取血，并检测血液中所含的所述多肽片段的量以确定其细胞穿透能力。所述多肽的量可以用任何适合的方法测定。例如，可以通过酶联免疫吸附方法（ELISA）来测定，例如，用EFE抗体包被微孔板，显色抗体为HRP-EFE抗体，用邻苯二胺（OPD）显色，在酶标仪上读取OD₄₉₂，OD值越大，表明穿透过的物质越多，细胞穿透功能越强。再例如，可以通过血清荧光检测方法测定，例如，使用带有细胞穿透功能的本申请提供的穿透多肽EFE_1-l00和绿色荧光蛋白EGFP的融合蛋白EFE_1-l00-EGFP作为待测物质，绿色荧光蛋白EGFP作为阴性对照品，向昆明小鼠腹腔注射相同浓度的EFE_1-l00-EGFP和EGFP，2小时后，检测注射EFE_1-l00-EGFP的小鼠血清在紫外光激发下是否发出荧光。如有荧光发出，则表明EFE_1-l00具有细胞穿透功能。

在某些实施方式中，本申请提供的分离的多肽基本上不具有纤溶活性。

“纤溶活性”在本申请中是指，把纤维蛋白裂解为小片段的纤维蛋白溶解酶的能力，或把无活性的纤维蛋白溶解酶原转化为有活性的纤维蛋白溶解酶的能力。纤溶活性可以通过本领域公知的方法测定。例如，可以通过纤维蛋白平板法测定（参见，Jespersen J,Astrup T.,A study of the fibrin plate assay of fibrinolyticagents-optimal conditions,reproducibility and precision.Haemostasis,1983,13:301-315）。在某些实施方式中，用琼脂糖、牛纤维蛋白溶解酶原、牛纤维蛋白原及牛凝血酶铺制纤维蛋白平板，在纤维蛋白平板上点上本申请的多肽溶液，通过观察溶圈情况确定纤溶活性。本申请的多肽溶液所在的部分由于纤维蛋白被水解而呈现透明圈，透明圈越大，表明纤溶活性越强。再例如，可以通过纤维蛋白酶谱法测定（参见，武金霞等，纤维蛋白酶谱检测蚯蚓纤溶酶组分。中国药学杂志，2005,40(21):1656-1659）。该方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术与纤维平板法的有机结合，将纤维蛋白原加到聚丙烯酰胺凝胶溶液中，在凝胶凝聚的同时，纤维蛋白原在凝血酶的作用下转化为纤维蛋白，将含有纤溶酶的待测溶液电泳，保温，再经染色脱色，纤溶酶组分所在的部位由于纤维蛋白被水解而呈现透明区带，其余部位为蓝色，就能清晰地从酶谱上观察到纤溶酶组分的数量。

在某些实施方式中，本申请提供的多肽基本上不具有纤溶活性。“基本上不具有纤溶活性”是指，与天然全长EFE相比，纤溶活性至少降低50%、降低60%、降低70%、降低80%、降低90%、降低95%、或降低99%。在某些实施方式中，本申请提供的多肽的纤溶活性检测不到。

EFE的天然全长序列有246个氨基酸，具体序列如SEQ ID NO:1所示：

MELPPGTKIVGGIEARPYEFPWQVSVRRKSSDSHFCGGSIINDRWVVCAAHCMQGEAPALVSLVVGEHDRSAASTVRQTHDVDSIFVHEDYNTNTLENDVSVIKTSVAITFDINVGPICAPDPANDYVYRKSQCSGWGTINSGGICCPNVLRYVTLNDTTNQYCEDVYPLNSIYDDMICASDNTGGNDRDSCQGDSGGPLSVKDGSGIFSLIGIVSWGIGCASGYPGVYSRVGFHAAWIT DIITNN（SEQ ID NO:1）。

在某些实施方式中，本申请提供了一种EFE的突变体EFEm，该突变体EFEm在EFE的天然全长序列中第192和221位的Cys突变为Gly。突变体EFEm丧失了其原有的纤溶活性，但是保留了细胞穿透功能，能够有效地穿透肠黏膜进入血液循环系统，且穿透效率高于未经突变的EFE。突变体EFEm的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示：

MELPPGTKIVGGIEARPYEFPWQVSVRRKSSDSHFCGGSIINDRWVVCAAHCMQGEAPALVSLVVGEHDRSAASTVRQTHDVDSIFVHEDYNTNTLENDVSVIKTSVAITFDINVGPICAPDPANDYVYRKSQCSGWGTINSGGICCPNVLRYVTLNDTTNQYCEDVYPLNSIYDDMICASDNTGGNDRDSGQGDSGGPLSVKDGSGIFSLIGIVSWGIGGASGYPGVYSRVGFHAAWITDIITNN（SEQ ID NO:2）。

在某些实施方式中，本申请提供了含有EFE的氨基末端100个氨基酸的多肽片段（SEQ ID NO:3），该多肽片段（EFE_1-100）不具有纤溶活性，但保留了细胞穿透功能。

在某些实施方式中，本申请提供了含有EFE的氨基末端159个氨基酸的多肽片段（SEQ ID NO:4），该多肽片段（EFE_1-159）不具有纤溶活性，但保留了细胞穿透功能。

在某些实施方式中，本申请所述的具有细胞穿透功能的多肽与SEQ ID NO:2所示多肽序列EFE_m具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%同源性，并且所述多肽不含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，本申请所述的具有细胞穿透功能的多肽与SEQ ID NO:3所示多肽序列EFE_1-100具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%同源性，并且所述多肽不含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，本申请所述的具有细胞穿透功能的多肽与SEQ ID NO:4所示多肽序列EFE_1-159具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%同源性，并且所述多肽不含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

“同源性”的百分比定义为，针对氨基酸序列而言，将候选氨基酸序列与对比氨基酸序列进行序列对比，并在必要时引入间隔，使相同的氨基酸数目达到最多，并在此基础上计算两条氨基酸序列之间相同氨基酸的百分比；针对核酸序列而言，将候选核酸序列与对比核酸序列进行序列对比，并在必要时引入间隔，使相同的核苷酸数目达到最多，并在此基础上计算两条核酸序列之间相同核苷酸的百分比。

可以通过本领域所知的多种方式来对比以确定同源性的百分比。例如，可以用公开可用的以下工具进行序列对比，所述工具如BLASTp（美国国家生物技术信息中心网站（NCBI）：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，也可参见，AltschulS.F.et al.,J.Mol.Biol.，215:403–410(1990);Stephen F.et al,，Nucleic Acids Res.，25:3389–3402(1997)）、ClustalW2（欧洲生物信息研究所网站：http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/，可参见，Higgins D.G.et al.，Methods inEnzymology，266:383-402(1996);Larkin M.A.et al.，Bioinformatics(Oxford、England)，23(21):2947-8(2007)）和TCoffee（瑞士生物信息学研究所网站，可参见，Poirot O.et al.，Nucleic Acids Res.，31(13):3503-6(2003);Notredame C.et al.，J.Mol.Boil.，302(1):205-17(2000)）。使用软件进行序列比对时，可以使用软件提供的默认参数，也可以根据对比的需要适当调整参数，这些都在本领域技术人员的知识范围之内。

在某些实施方式中，与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有同源性的多肽具有细胞穿透功能，并且基本上不具有纤溶活性。这些同源多肽的细胞穿透功能和纤溶活性可以通过前述方法进行测定和验证。

本申请提供的多肽包含其类似物。所述多肽类似物指的是一种多肽，其具有的功能或结构特征与本申请提供的多肽（即母体多肽）的全部或部分基本相似。所述多肽类似物可以是母体多肽的部分片段、突变体、衍生物或变体，并可以包含化学或生物的修饰。所述多肽类似物可以具有母体多肽一个或多个氨基酸的替换、增加、删除、插入、截断、修饰（例如，磷酸化、糖基化、标记等）或其任意组合。类似物可以包括母体多肽天然存在的变体和人工产生的变体，如通过重组方法或化学合成获得的人工多肽序列。类似物可以包含非天然存在的氨基酸残基。

氨基酸残基的保守替换是指性质相似的氨基酸之间的替换，例如极性氨基酸之间的替换（如谷氨酰胺和天冬酰胺之间的替换），疏水性氨基酸之间的替换（如亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和缬氨酸之间的替换），以及带相同电荷的氨基酸之间的替换（如精氨酸、赖氨酸和组氨酸之间的替换，或者谷氨酸和天冬氨酸之间的替换）等。在某些实施方式中，本申请所述的具有细胞穿透功能的多肽与SEQID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示序列相比仅在一个或多个氨基酸位点有氨基酸的保守替换。在某些实施方式中，本申请所述的具有细胞穿透功能的多肽与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示序列相比在2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、或20个氨基酸位点有氨基酸的保守替换。

在不影响活性的前提下，本申请所述的具有细胞穿透功能的多肽还可以含有非天然的氨基酸。非天然的氨基酸包括例如，β-氟代丙氨酸、1-甲基组氨酸、γ-亚甲基谷氨酸、α-甲基亮氨酸、4,5-脱氢赖氨酸、羟基脯氨酸、3-氟代苯基丙氨酸、3-氨基酪氨酸、4-甲基色氨酸等。

在某些实施方式中，本申请所述的具有细胞穿透功能的多肽的长度为至少50个、60个、70个、80个、90个、100个、105个、110个、115个、120个、125个、130个、135个、140个、145个、或者150个氨基酸。在某些实施方式中，本申请的具有细胞穿透功能的多肽的长度为不超过246个、245个、244个、243个、242个、241个、240个、235个、230个、225个、220个、215个、210个、205个或者200个氨基酸。在某些实施方式中，上述的多肽包含有SEQ ID NO:2-4所示的任一氨基酸序列的部分或全部序列。

在某些实施方式中，本申请所述的具有细胞穿透功能的多肽的长度为50个至100个氨基酸、60个至100个氨基酸、70个至100个氨基酸、80个至100个氨基酸、或者90个至100个氨基酸。在某些实施方式中，本申请所述的具有细胞穿透功能的多肽的长度为100个至120个氨基酸、100个至130个氨基酸、100个至140个氨基酸、100个至150个氨基酸、100个至160个氨基酸、100个至170个氨基酸、100个至180个氨基酸、100个至190个氨基酸、100个至200个氨基酸、100个至210个氨基酸、100个至220个氨基酸、100个至230个氨基酸、或者100个至240个氨基酸。在某些实施方式中，本申请所述的具有细胞穿透功能的多肽的长度为100至151个氨基酸、100至152个氨基酸、100至153个氨基酸、100至154个氨基酸、100至155个氨基酸、100至156个氨基酸、100至157个氨基酸、100至158个氨基酸、或者100至159个氨基酸。本申请所述的具有细胞穿透功能的多肽具有的氨基酸数可等于上述数值范围内的任何整数值，包括所述范围的端点。在某些实施方式中，上述的多肽包含有SEQ ID NO:2-4所示的任一氨基酸序列的部分或全部序列。

本申请提供的具有细胞穿透功能的多肽可以通过本领域的已知技术来制备。可以通过化学合成方法制备，也可以通过基因工程方法制备。

化学合成方法主要包括固相合成和液相合成两种方法。固相多肽合成方法包括，例如Merrifield固相合成法，该方法已详细记载在文献“Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154”和“M.Bodanszky等人,"Peptide Synthesis",JohnWiley&Sons,Second Edition,1976”以及“J.Meienhofer,"Hormonal Proteins andPeptides",Vol.2,p.46,Academic Press(New York),1983”中。在此通过引用方式将这些文献全文并入到本申请中用作参考。Merrifield固相合成法主要包括以下步骤，根据目标多肽的氨基酸序列，先使被保护的羧基末端氨基酸与树脂连接；连接后洗涤树脂；脱去羧基末端氨基酸α氨基上的保护基（例如，叔丁氧羰基），脱去这个保护基的时候必须要确保不断裂该氨基酸和树脂间的连接键；然后在所得的树脂上偶联倒数第二个羧基末端被保护的氨基酸，进行这一偶联时，在第二个氨基酸的游离羧基和连在树脂上的第一个氨基酸的氨基之间形成一个酰胺键；根据目标多肽的氨基酸连接顺序，依次重复前述反应过程，直到所有氨基酸都连接到树脂上；最后，从树脂上切落被保护的肽，脱去保护基即可得到目标多肽。本申请的多肽也可以通过液相合成方法制备，例如可以用标准的溶液肽合成法制备，该方法已详细记载在文献“E.Schroder and K.Kubke,"The Peptides",Vol.1,Academic Press(New York),1965”中。在此通过引用方式将该文献全文并入到本申请中用作参考。液相合成法主要包括，利用形成酰胺键的化学或酶方法分步偶联氨基酸或肽片段。

基因工程方法为利用编码相应多肽的核酸序列在适合的宿主细胞中表达生成相应多肽的方法。有关该方法的详细描述可参考Sambrook等人编著的“分子克隆”（实验手册，冷泉港，1989）。

本申请的多肽也可以使用本领域公知的方法进行修饰。例如，但不限于，PEG化、糖基化、氨基端修饰、脂肪酰化、羧基端修饰、磷酸化、甲基化等。

另一方面，本申请涉及一种运载复合物，其包含转运部分和货物分子。“转运部分”在本申请中是指，具有细胞穿透功能的多肽，例如本申请所述的具有细胞穿透功能的多肽。“货物分子”在本申请中是指，待转运穿透细胞的分子或物质。

在某些实施方式中，货物分子是小分子化合物。适合的小分子化合物的例子包括，但不限于，化学药物、荧光分子、放射性标记。化学药物的例子包括，但不限于，抗肿瘤药物（例如，紫杉醇、奥沙利铂、多西他赛、表柔比星等）、心血管类药物（例如，硝酸甘油、硝苯地平、盐酸地尔硫卓、厄贝沙坦、非洛地平、阿伐他汀等）、抗炎药物（例如，阿司匹林、布洛芬、对乙酰氨基酚、尼美舒利、塞来昔布、水杨酸镁、萘普生等）、抗病毒药物（例如，干扰素、利巴韦林、阿昔洛韦等）、消化系统药物（例如，西咪替丁、奥沙拉嗪钠、法莫替丁、哌仑西平、奥美拉唑等）、神经系统药物（例如，卡马西平、苯妥英钠、培他司汀、金刚烷胺、苯巴比妥、唑吡坦等）、呼吸系统药物（例如，沙丁胺醇、特布他林、克伦特罗、氨茶碱、溴己新等）、免疫系统药物（例如，硫唑嘌呤等）、泌尿系统药物（例如，氢氯噻嗪、特拉唑嗪、坦洛新等）、诊断用药（例如，泛影葡胺、碘海醇、碘帕醇、胆影葡胺等）、皮肤用药（例如，倍氯米松、曲安奈德、莫匹罗星、红霉素、克霉唑等）。荧光分子包括，但不限于，BODIPY及其类似物、稀土螯合物、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹黄酰等。放射性标记包括，但不限于，³H、¹⁴C、³⁵S、¹⁸F、³²P、³³P、¹²⁵I、³⁶Cl等。

在某些实施方式中，货物分子是生物大分子，包括但不限于，核酸、多聚核苷酸、蛋白、多肽、碳水化合物、多糖、糖蛋白、脂类等。在某些实施方式中，所述生物大分子包括，例如，酶、抗体、激素、蛋白类药物或前药等。在某些实施方式中，所述生物大分子是多肽或多聚核苷酸。在某些实施方式中，所述生物大分子是人干扰素α2a、人生长激素或者增强型绿色荧光蛋白。

所述转运部分可以与所述货物分子通过任何适当的方式直接或间接、通过共价键或非共价键连接以形成运载复合物。在某些实施方式中，所述转运部分直接与所述货物分子连接。在某些实施方式中，所述转运部分与所述货物分子通过接头连接。在某些实施方式中，所述转运部分与所述货物分子通过共价键连接。在某些实施方式中，所述转运部分与所述货物分子通过酯键、醚键、磷酸酯键、酰胺键、肽键、二酰亚胺键、碳-硫键，或者碳-磷键相互共价连接。

在某些实施方式中，当转运部分和货物分子都是多肽或蛋白时，所述转运部分的羧基末端与所述货物分子的氨基末端共价连接，或者所述转运部分的氨基末端与所述货物分子的羧基末端共价连接。在某些实施方式中，当转运部分和货物分子都是多肽或蛋白时，可以通过将转运部分和货物分子的编码核酸连接起来，然后在合适的表达载体和表达细胞中进行重组表达，生成融合蛋白，即运载复合物。

在某些实施方式中，所述转运部分与所述货物分子通过接头共价或非共价连接。本申请使用的术语“接头”是指用于共价或非共价连接转运部分和货物分子的结构单元，该结构单元的引入不会对运载复合物本身的生物特性产生损害。

在某些实施方式中，所述接头为多肽，例如柔性连接肽。“柔性连接肽”在本申请中是指，一定数量的甘氨酸和丝氨酸相互连接而成的肽链。由于甘氨酸和丝氨酸的空间柔性能使转运部分和货物分子在空间上自由伸展，所以不会造成活性位点的相互掩盖。在某些实施方式中，所述柔性连接肽可选自以下一种或多种接头：GGSGSGGSGGSGSGG（SEQ ID NO:9）、GGGGSGGGGSGGGGS（SEQID NO:10）或GS。在某些实施方式中，所述多肽接头可以通过基因重组技术插入到运载复合物中。例如，当货物分子也是蛋白或多肽时，可以将多肽接头的核苷酸编码序列与本申请所述具有细胞穿透功能的多肽的编码序列以及和货物分子的编码序列操作性连接，从而允许通过重组表达获得由多肽接头连接的本申请所述具有细胞穿透功能的多肽与货物分子的融合蛋白。

在某些实施方式中，所述接头为化学偶联分子或基团（如N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）、含巯基基团、戊二醛）。在某些实施方式中，所述多肽片段或货物分子上可以被引入一个或多个化学偶联基团，通过化学偶联基团之间的反应，可以在多肽和货物分子间形成化学偶联。在某些实施方式中，所述转运部分可以通过化学接头（例如C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、芳基或杂芳基等结构）与货物分子连接。

在某些实施方式中，所述转运部分为EFE_1-100，所述货物分子是人干扰素α2a，并且所述转运部分的氨基末端与所述人干扰素α2a的羧基末端通过接头共价连接，形成运载复合物。在某些实施方式中，所述接头为柔性连接肽，其氨基酸序列为GGSGSGGSGGSGSGG（SEQ ID NO:9）。

在某些实施方式中，所述转运部分为EFE_1-100，所述货物分子是人生长激素，并且所述转运部分的羧基末端与所述人生长激素的氨基末端通过接头共价连接，形成运载复合物。在某些实施方式中，所述接头为柔性连接肽，其氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO:10）。

在某些实施方式中，所述转运部分为EFE_1-100，所述货物分子是增强型绿色荧光蛋白，并且所述转运部分的羧基末端与所述增强型绿色荧光蛋白的氨基末端选择性地通过接头共价连接，形成运载复合物。在某些实施方式中，所述接头为柔性连接肽，其氨基酸序列为GS。

在某些实施方式中，所述共价连接的接头可以被选择性地酶切，从而在特定环境下释放出游离的货物分子。例如，所述特定环境可以是特定的pH条件，所述接头为组织蛋白酶B可水解接头，其可以在碱性pH条件下以完整形式存在，但在酸性条件下被组织蛋白酶B剪切断开（Walker MA,Dubowchik GM,Hofstead SJ,et al.,Synthesis of an immunoconjugate of camptothecin.Bioorg Med Chem Lett,2002,12(2):217-219.）。

在某些实施方式中，所述接头通过非共价键连接多肽与货物分子。非共价键例如可以是通过离子间的相互作用力、疏水作用，或者氢键相互连接。所述接头可以是，例如，亲和素（avidin）和生物素（biotin），其中，所述多肽可以缀合有亲和素（avidin），而货物分子可以缀合有生物素（biotin），通过亲和素和生物素之间形成的紧密的非共价结合，可以将多肽与货物分子通过非共价键连接。

另一方面，本申请涉及一种分离的核酸，其包含编码本申请所述多肽的核酸序列。本申请使用的术语“核酸”或“多聚核苷酸”指核糖核酸（RNA）、脱氧核糖核酸（DNA）、或核糖核酸-脱氧核糖核酸的混合物如DNA-RNA杂交物。核酸或多聚核苷酸可以是单链或双链DNA或RNA或DNA-RNA杂交物。核酸或多聚核苷酸可以是线性的或环状的。本申请使用的术语“编码”或“为……编码”指能够转录为mRNA和/或翻译为肽或蛋白。“编码序列”或“基因”指编码mRNA、肽或蛋白的多聚核苷酸序列。在本申请中这两个术语可以互换使用。

在某些实施方式中，所述分离的核酸包含SEQ ID NO:6-8所示的任一核酸序列。

SEQ ID NO:5是编码SEQ ID NO:1的核酸序列，其具体序列参见图26。

SEQ ID NO:6是编码SEQ ID NO:2的核酸序列，其具体序列参见图27。

SEQ ID NO:7是编码SEQ ID NO:3的核酸序列，其具体序列为参见图28。

SEQ ID NO:8是编码SEQ ID NO:4的核酸序列，其具体序列为参见图29。

在某些实施方式中，本申请提供的分离的核酸包含与SEQ ID NO:5-8所示的任一核酸序列具有至少70%同源性的核酸序列，例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、或99%的同源性。

在某些实施方式中，本申请提供了编码SEQ ID NO:2、3、或4的核酸序列，但其核酸序列由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:6-8所示的任一核酸序列。

“遗传密码的简并性”在本申请中是指，同一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象。例如，脯氨酸具有4个同义密码子CCU、CCC、CCA、CCG。本领域公知，由于核酸遗传密码的简并性，可以将某已知核酸序列中的某些位置的核酸进行替换，但却不改变编码的氨基酸序列。本领域技术人员可以很容易地进行遗传密码简并性的替换，例如，通过碱基的定点突变技术。不同生物体对不同的密码子的偏好性存在区别，为在某个选定的生物细胞内表达本申请的多肽，可以选择该生物细胞所偏好的密码子，获得相应的编码序列，通过重组表达得到本申请的多肽序列（例如SEQ ID NO:2-4）。

另一方面，本申请涉及一种生产所述多肽的方法，包括：

i)将包含所述多肽的核酸的表达载体，在允许表达所述多肽的条件下在宿主细胞中表达；

ii)收集并纯化表达的所述多肽。

所述表达载体可以是，例如，DNA质粒、细菌质粒、病毒等。表达载体的非限制性例子为如Paul等,2002,Nature Biotechnology,19,505;Miyagishi andTaira,2002,Nature Biotechnology,19,497;Lee等,2002,Nature Biotechnology,19,500;以及Novina等,2002,Nature Medicine,advance online publication doi:10.1038/nm725中所描述的。所述表达载体中可以进一步含有启动子，其与所述多肽的编码序列操作性连接，使得当所述表达载体进入宿主细胞后，所述启动子能够启动编码序列的表达。表达载体可以通过适当的方法导入宿主细胞，例如，但不限于，磷酸钙转染、脂质体转染、电穿孔转染、细菌热休克等，具体的方法请参见，Sambrook等人编著的“分子克隆”（实验手册，冷泉港，1989）。

所述宿主细胞可以是真核细胞，也可以是原核细胞。适当的真核细胞可以包括，例如，哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞（CHO）。适当的原核细胞可以包括，例如，细菌，如大肠杆菌。

另一方面，本申请涉及所述多肽用于在对象中将货物分子递送穿透细胞的用途，其包含向所述对象给药含有运载复合物的药物组合物，所述运载复合物包含由所述多肽组成的转运部分和所述货物分子。

“对象”在本申请中是指，人类和非人类的动物。非人类的动物包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物。“对象”也可以是家畜动物，例如牛、猪、羊、家禽和马，或家养动物，例如狗和猫。“对象”可以是雄性或者雌性，可以是老年、成年、青少年、儿童或者婴儿。人类“对象”可以是高加索人、非洲人、亚洲人、闪族人，或其他种族或所述种族背景的混合。

另一方面，本申请涉及一种药物组合物，其包含所述的运载复合物和药用载体。

“药用载体”在本申请中是指，用于给对象递送运载复合物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或任何其它药理上惰性的媒介物，其不干扰运载复合物的结构和性质。某些此类载体能使运载复合物配制成例如片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆剂、浆液、混悬液和锭剂以给对象口服摄入。某些此类载体能使运载复合物配制成注射、输注或局部给药。

可以用在本申请的药物组合物中的药用载体包括，但不限于，例如，药学可接受的液体、凝胶、或固体载剂、水相介质（例如，氯化钠注射液，林格氏液注射液，等渗葡萄糖注射液，无菌水注射液，或葡萄糖和乳酸林格注射液）、非水相介质（例如，植物来源的不挥发性油、棉花子油、玉米油、芝麻油、或者花生油）、抗微生物物质、等渗物质（例如氯化钠或葡萄糖）、缓冲液（例如磷酸盐或枸橼酸盐缓冲液）、抗氧化剂（例如硫酸氢钠）、麻醉剂（例如盐酸普鲁卡因）、悬浮剂/分散剂（例如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、或聚乙烯吡咯烷酮）、螯合剂（例如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸)）、乳化剂（例如聚山梨醇酯80(吐温-80)）、稀释剂、佐剂、辅料、或无毒辅助物质，其他本领域公知的组分、或以上的多种组合。适用的组分可包括，例如，填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲液、防腐剂、润滑剂、搅味剂、增稠剂、着色剂或乳化剂。

在某些实施方式中，所述的药物组合物为口服制剂。口服制剂包括，但不限于，胶囊、囊剂、药丸、片剂、锭剂（用于味道的基底，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶）、粉末、颗粒剂、或者是水或非水溶液或悬浮液、或者油包水或水包油的乳剂、或者是酏剂或糖浆、或者是糖果锭剂（适用惰性基质，如白明胶和甘油，或蔗糖或者阿拉伯胶）和/或漱口药及其类似物。

口服的固体制剂（如胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉末、颗粒等）中包括所述的运载复合物与一种或多种药学上可接受的载体，如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或以下物质：（1）填料或者补充剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇，和/或硅酸；（2）粘合剂，例如，羧甲基纤维素、藻朊酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖、和/或阿拉伯胶；（3）湿润剂，例如，丙三醇；（4）分裂剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或者木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐、与碳酸钠，（5）阻滞剂溶液，例如石蜡；（6）加速吸收剂，例如季铵化合物；（7）润滑剂，例如，乙酰醇与单硬脂酸甘油酯；（8）吸收剂，例如高岭土与皂土；（9）润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、及其混合物；与（10）着色剂。

口服的液体制剂包括药学可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂和酏剂等。除了运载复合物之外，液体剂型还可以含有常用的惰性稀释剂，例如，水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯（甲）酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油类（特别地，棉籽油、花生油、玉米油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油）、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脂肪酸山梨醇酯、以及混合物。除了惰性稀释液之外，口服组合物也可以添加佐剂例如，润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、颜料、香料和防腐剂。

在某些实施方式中，所述的药物组合物为注射制剂。注射制剂包括无菌水溶液或分散液、混悬剂或乳剂。在所有情况下，所述的注射制剂应当无菌且应当是液体以方便注射。它在生产和贮存条件下应保持稳定，并应当抗微生物（例如细菌和真菌）的污染。载体可以是一种溶剂或分散介质，其包含，例如，水、乙醇、多羟基化合物（例如，甘油、丙二醇，以及液体聚乙二醇等）及其适当的混合物和/或植物油。所述的注射制剂应保持适当的流动性，适当的流动性可通过多种方式维持，例如，通过使用如卵磷脂等涂层，使用表面活性剂等。可以通过加入各种抗菌和抗真菌剂（例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等）来实现抗微生物污染。

在某些实施方式中，所述的药物组合物为口腔喷雾制剂或鼻腔喷雾制剂。所述喷雾制剂包括，但不限于，水性气雾剂、非水性悬浮液、脂质体制剂或者固体颗粒制剂等。水性气雾剂是通过将作用剂的水性溶液或者悬浮液和常规的药学上可接受的载体与稳定剂一同配制。该载体与稳定剂根据特定化合物的需要而变化，但是其一般包括非离子型表面活性剂（吐温类、或聚乙二醇）、油酸、卵磷脂、氨基酸如甘氨酸，缓冲液、盐、糖或者糖醇。气雾剂通常由等渗溶液制备，可以通过喷雾器递送。

在某些实施方式中，所述的药物组合物可以和一种或多种其他药物混合使用。在某些实施方式中，所述的药物组合物包含至少一种其他药物。在某些实施方式中，所述的其他药物为抗肿瘤药物、心血管类药物、抗炎药物、抗病毒药物、消化系统药物、神经系统药物、呼吸系统药物、免疫系统药物、皮肤用药等。

在某些实施方式中，所述药物组合物可以通过适当的途径递送到对象中，包括但不限于，通过口服途径、注射途径（如静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、心内注射、鞘内注射、胸膜腔内注射、腹腔内注射等）、粘膜途径（如鼻腔内给药、口腔内给药等）、舌下途径、直肠途径、经皮途径、眼内途径、肺部途径。在某些实施方式中，所述药物组合物可通过口服途径给药。

另一方面，本申请涉及一种在对象中将货物分子例如药物递送穿透细胞的方法，其包括向所述对象递送药物组合物，所述组合物包含运载复合物和药用载体，所述运载复合物包含由所述多肽组成的转运部分和货物分子。

在某些实施方式中，所述方法包括向对象递送治疗有效量的药物组合物。“治疗有效量”在本申请中是指，可以实现抑制对象的疾病或症状，或者可以预防性地抑制或防止疾病或症状发生的药物组合物的量。治疗有效量可以是将对象的一种或多种疾病或症状缓解到一定程度的药物组合物的量；可以将那些跟疾病或症状成因相关的一种或多种生理或生物化学参数部分或完全恢复到正常的药物组合物的量；和/或可以降低疾病或症状发生的可能性的药物组合物的量。

另一方面，本申请涉及所述药物组合物在治疗或预防疾病或症状中的用途。所述疾病或症状包括，但不限于，糖尿病（I型和II型）、心律不齐、动脉粥样硬化、心力衰竭、循环障碍、关节炎、肝炎、癌症、高血压、十二指肠溃疡、肺病等。

具体实施方式

所有实施例中的涉及的生物学材料如大肠杆菌菌株、各种克隆与表达质粒、培养基、工具酶、缓冲液，和各种培养方法、蛋白提取和纯化方法、其它的分子生物学操作方法，均为该领域技术人员所熟悉，可以参考Sambrook等人编著的“分子克隆”（实验室手册，冷泉港，1989）及“精编分子生物学实验指南”（美/F.奥斯伯等著，颜子颖等译，北京，科学出版社，1998）。

实施例1

EFEm的制备与分析

1.EFEm的基因合成

取5～10条粉正蚓（购自华中农业大学）成体，用DEPC水（0.1%焦炭酸二乙酯的水溶液）清洗干净后，在液氮中研磨成粉末状，按照RNeasy mini kit试剂盒(购自Qiagen公司)的操作说明书提取总RNA。然后以其总RNA为模板合成cDNA第一链（Reverse Transcription System，购自Promega公司）；设计以下两条特异性引物，PCR扩增EFE的编码区DNA：

EFE-P1’（正向引物）:5’CATGGAACTTCCTCCCGA（SEQ ID NO:34）

EFE-P2’（反向引物）:5’ATCACCAACAACTAAACCG（SEQ ID NO:35）

PCR扩增得到EFE基因片段。将EFE基因片段与pUCm-T载体（购自上海生工生物工程公司，质粒图参见图30）连接后转化大肠杆菌JM109，酶切筛选阳性克隆后测定插入的EFE基因序列。测序结果证实，所克隆的EFE基因，含一个741bp的公开阅读框架，编码246个氨基酸所组成多肽链（胡燕，孟小林等，武汉大学学报（理学版），2004,50:211）。

以重组质粒pUCm-T-EFE质粒（胡燕,孟小林等,武汉大学学报(理学版),2004,50:211）为模板，设计以下6条引物：

EFE-P1（正向引物）:5’GCCGAATTCATGGAACTTCCTCCCGGA（SEQ IDNO:11）（画下划线部分为EcoRI酶切位点）；

EFEm-P2（反向引物）:5’CTGTCCGGAGTCTCTGTCGT（SEQ ID NO:12）（画下划线部分为第192位Cys突变）；

EFEm-P3（正向引物）:5’ACGACAGAGACTCCGGACAG（SEQ ID NO:13）（画下划线部分为第192位Cys突变）；

EFEm-P4（反向引物）:5’AGCTCCACCAATTCCCCAAG（SEQ ID NO:14）（画下划线部分为第221位Cys突变）；

EFEm-P5（正向引物）:5’CTTGGGGAATTGGTGGAGCT（SEQ ID NO:15）（画下划线部分为第221位Cys突变）。

EFE-P6（反向引物）:5’GCGCTCGAGTTAGTTGTTGGTGATGAT（SEQ IDNO:16）(画下划线部分为XhoI酶切位点)。

以EFE-P1、EFEm-P2、EFEm-P3、EFEm-P4、EFEm-P5、EFE-P6为引物用重叠聚合酶链式反应（PCR）方法扩增EFEm基因，正反向引物各加入2微升；反应条件为：95°C预变性5分钟，94°C变性45秒，55°C退火45秒，72°C延伸90秒，30个循环，72°C延伸10分钟。扩增产物经1%琼脂糖电泳检测，可见分子量为759bp的条带（图2）。PCR产物用胶回收法纯化。

PCR产物和pET-32a质粒（购自Invitrogen公司，质粒图如图1所示），用EcoRI和XhoI酶切，酶切产物回收后用T4DNA连接酶连接，获得质粒pET-32a-EFEm。使用所得质粒pET-32a-EFEm转化用CaCl₂法制备的大肠杆菌JM109菌株感受态细胞，涂布于含60mg/L氨苄青霉素（Amp）的LB基本培养基琼脂平板（含10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，15g/L琼脂粉，pH7.0）。

收集生长的大肠杆菌，用碱裂解法小量提取质粒pET-32a-EFEm，酶切鉴定阳性转化子（图2）。

阳性转化子经质粒的基因序列测定，证实所合成的EFEm基因序列在第192和221位的Cys突变成为了Gly。

2.EFEm的表达

提取pET-32a-EFEm质粒，转化CaCl₂法制备的大肠杆菌BL21(DE3)菌株的感受态细胞，获得表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET32a-EFEm，阳性转化子用上述EFE-P1和EFE-P6引物做PCR鉴定。

将经鉴定的阳性转化子接种于含有100mg/L的Amp的20ml LB培养基中，37°C震荡培养过夜。次日取1ml培养物接种于含相同浓度Amp的20ml LB培养基中，37°C震荡培养至OD₆₀₀值为0.6左右，加入终浓度为1.0mmol/L IPTG，37°C诱导表达4小时。

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果如图3所示，EFEm得到了大量表达，图中泳道3为pET-32a-EFEm/BL21(DE3)菌诱导后菌株的检测结果，所显示的分子量大小也与带有部分质粒pET-32a表达片段的EFEm的理论值46.8KD相符。

3.EFEm的提取纯化

通过离心收集经过诱导表达的细菌体，按每克细菌体30ml的体积加入裂解缓冲液（含100mM NaCl的10mM Tris）重新悬浮，反复冻融3次，再进行超声波破碎（4°C，工作3秒，间歇3秒），至菌液破碎至清亮。离心后，分别收集上清液和沉淀。

上清液和沉淀用SDS-PAGE分析，结果显示EFEm主要存在于上清液中（图3）。上清液中可溶性表达的EFEm，微孔滤膜法过滤后用Ni-NTA Superflow柱（QIAGEN）亲和层析法纯化。

沉淀（包涵体）部分，用含2M尿素的洗涤液（2M尿素，1.15g Na₂HPO₄，0.2g KH₂PO₄，8g NaCl,加双蒸水至1L，pH8.0）洗涤两次，溶解于含8M尿素的变性液，上Ni-NTA Superflow柱亲和层析柱，线性降低洗涤液中的尿素浓度洗涤，洗脱回收柱原位复性的EFEm。

取分步收集的可溶性和包涵体纯化后蛋白进行SDS-PAGE检测纯化效果（图4），表明利用Ni-NTA亲和层析可使两种形式的目的蛋白得到有效纯化。

4.EFEm的纤溶活性分析

实验材料：牛纤维蛋白溶酶原、牛纤维蛋白原、牛凝血酶和EFE标准品，均购自中国药品生物制品检定所。

纤溶活性分析采用纤维蛋白平板法。将溶解均匀的琼脂糖溶液冷却至并保持在45°C，加入适量的牛纤维蛋白溶酶原、牛纤维蛋白原及牛凝血酶，铺制纤维蛋白平板。在纤维蛋白平板上分别点上10μl浓度为0.5mg/ml可溶性纯化蛋白EFEm、复性后的纯化包涵体EFEm、复性前的纯化包涵体EFEm以及EFE标准品（阳性对照）和大肠杆菌表达的可溶性纯化蛋白EFE（含pGEM-T-EFE质粒的表达菌株，表达纯化方法如上），37°C保温12h后观察溶圈情况。

实验结果如图5所示，其中A和E分别是EFE标准品和大肠杆菌表达的可溶性纯化蛋白EFE，B表示可溶性纯化蛋白EFEm；C表示复性后的纯化包涵体EFEm；D表示复性前的纯化包涵体EFEm。结果表明，EFE标准品和大肠杆菌表达的可溶性纯化蛋白EFE呈现明显的纤溶活性；而几种形式的EFEm样品，均没有产生可见的透明圈，说明EFEm丧失了纤溶活性。

5.EFEm的穿肠活性分析

取昆明小鼠（平均体重20g，雌雄各半）15只随机平均分为5组：生理盐水组、大肠杆菌表达的EFE可溶性纯化组、EFEm可溶性纯化组、EFEm包涵体复性组、EFEm包涵体组，每组三只；饥饿36小时后，用以上样品各1ml（样品均溶解在生理盐水中，0.5mg/ml）对小鼠实施灌胃。

2小时后小鼠眼眶取血，离心取血清，夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）：包被用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释的兔抗EFE抗体（本实验室制备，稀释度1：500）；显色抗体为用PBST稀释的HRP-EFE抗体（本实验室制备，稀释度1：100），邻苯二胺(OPD)显色，在酶标仪上读取OD₄₉₂。

ELISA结果如下表1所示。除生理盐水组外，其它各组均为阳性结果；且EFEm的细胞穿透活性比EFE强；EFEm蛋白的三种不同形式：包涵体、包涵体复性、可溶性蛋白的细胞穿透活性信号依次增强。试验结果表明，EFEm不仅保留了EFE的细胞穿透活性，甚至细胞穿透活性有所增强。

表1生理盐水和EFE、EFEm血清的ELISA检测结果比较

实施例2

IFNα2a-EFEm的制备与分析

1.pET22b-IFNα2a-EFEm的构建

用含有人IFNα2a基因片段的质粒（pshuttle-IFNα2a，购自上海锐捷生物科技有限公司）做为模板DNA，根据人IFNα2a基因序列设计两条特异性引物：

IFNα2a上游引物（正向引物），

GCCCATATGCAGGACCCTTATGTAAAAGAAGCA（SEQ ID NO:17）（画下划线部分为NdeI酶切位点）；

IFNα2a下游引物（反向引物），

ACCGGATCCAGAACCACCCTGGGATGCTCTTCGACCTCGAAAC（SEQ ID NO:18）（画下划线部分为BamHI酶切位点）。

PCR扩增得到IFNα2a基因片段。将IFNα2a基因片段通过SDS-PAGE凝胶电泳纯化，然后用NdeI/BamHI酶切，与同样经过NdeI/BamHI酶切的质粒pET22b连接，得到重组质粒pET22b-IFNα2a。使用重组质粒pET22b-IFNα2a转化E.coli JM109，在含有氨苄青霉素的LB基本培养基琼脂平板上培养，挑取阳性克隆。提取质粒pET22b-IFNα2a进行酶切鉴定，pET22b的质粒图如图6所示，IFNα2a插入到BamHI(198)和NdeI(288)之间，酶切鉴定结果如图7所示，其中泳道3为IFNα2a多肽片段。

以含EFEm基因的质粒为模板，根据EFEm序列及表达载体pET22b上的多克隆位点设计引物：

EFEm上游引物P1（正向引物）:

TCTGGATCC

ATGGAACTTCCTCCCGGAACA（SEQ ID NO:19）（画下划线部分为BamHI位点，方框处为连接肽GGSGSGGSGGSGSGG的编码序列）；

EFEm下游引物P2（反向引物）:

CGCCTCGAGGTTGTTGGTGATGATGTCGGTG（SEQ ID NO:20）(画下划线部分为XhoI酶切位点)。

使用上述EFEm引物P1和P2，通过PCR扩增EFEm片段。用BamHI、XhoI双酶切PCR产物和pET22b-IFNα2a，分别通过凝胶电泳回收酶切后的EFEm片段和pET22b-IFNα2a，然后将两个片段通过BamHI和XhoI位点连接，然后结合形成重组质粒pET22b-IFNα2a-EFEm，其中EFEm通过连接肽连接于IFNα2a的羧基端。用重组质粒pET22b-IFNα2a-EFEm转化大肠杆菌E.coli JM109，将其置于含氨苄青霉素的LB培养平板上培养，挑取阳性克隆，提取重组质粒pET22b-IFNα2a-EFEm进行酶切鉴定，酶切鉴定图如图8所示，其中泳道5为重组质粒pET22b-IFNα2a-EFEm。

2.IFNα2a-EFEm的表达

质粒pET22b-IFNα2a-EFEm转化E.coli BL21(DE3)，获IFNα2a-EFEm融合蛋白的基因表达工程菌E.coli BL21(DE3)/pET22b-IFNα2a-EFEm。

接种经鉴定正确的菌种于含100ug/ml氨苄青霉素（Amp）的20ml LB培养基中，37°C震荡培养过夜。次日取1ml培养物接种于含相同Amp的20ml LB培养基中，37°C震荡培养至OD₆₀₀值为0.6左右，加入终浓度为1.0mmol/L IPTG，37°C诱导4h后，4°C12000g离心10分钟，收集菌体，用10mM PBS（Na₂HPO₄1.15g，KH₂PO₄0.2g，NaCl8g，加双蒸水至1L，pH8.0）重悬，超声波破碎，离心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。

蛋白表达的检测结果如图9所示，其中泳道4和泳道5是IFNα2a-EFEm融合蛋白的复性纯化结果。IFNα2a-EFEm的表达形式主要为包涵体，分子量46KD符合其理论值。

3.IFNα2a-EFEm提取和纯化

按照上述诱导表达的方法，准备1L体积的工程菌发酵液，收集湿菌体并称量重量。按1g湿菌体加入30ml裂解缓冲液（20mM Tris-HCl，500mM NaCl溶解于400ml ddH₂O，调整PH至7.9，最后加双蒸水（ddH₂O）定容至500ml），-20°C反复冻融3次，再进行超声波破碎（4°C，工作3秒，间歇3秒），待菌液破碎至清亮。将破碎后的菌液于4°C，10000rpm离心20分钟，收集上清及沉淀。

取1g沉淀加入20ml包涵体洗涤液（2M尿素，1.15g Na₂HPO₄，0.2g KH₂PO₄，8g NaCl，加双蒸水至1L，pH8.0），用超声波破碎仪充分洗涤后，4°C，10000rpm离心10分钟，收集沉淀。向洗涤后的包涵体沉淀中加入10ml包涵体裂解液（50mM Tris-HCl，5mM EDTA，8M尿素，0.15M NaCl，pH8.0）于冰上裂解过夜。裂解液经12000rpm10min离心后弃沉淀，上清液以1:20的比例稀释于蛋白复性液（50mM Tris-HCl，5mM EDTA，2M尿素，0.5M L-Arg，0.15M NaCl，pH8.0）中，4°C复性过夜。次日将复性液装入透析袋于对透析液（50mM Tris-HCl，5mM EDTA，0.15M NaCl，pH8.0）透析24h，期间更换透析液2次。蛋白经聚乙二醇浓缩后，12000rpm离心10分钟，上清即为复性好的IFNα2a-EFEm蛋白。用SDS-PAGE检测蛋白的复性纯化结果，结果如图9所示，其中泳道4和泳道5为IFNα2a-EFEm融合蛋白的复性纯化结果。

4.IFNα2a-EFEm抗病毒活性和穿肠活性分析

4.1抗病毒活性分析

融合蛋白IFNα2a-EFEm的抗病毒活性，采用水泡性口炎病毒（VSV）-HeLa细胞系统，在96孔板上用结晶紫染色法测定（刘长暖等,中国生物制品学杂志,1999,12:37）。VSV和Hela细胞购自中国典型培养物保藏中心，人IFN2a标准品（冻干粉，5000IU/管，购于中国药品生物制品检定所）。

活性测定结果如图10所示。以干扰素IFN标准品孔为标准，对IFNα2a-EFEm蛋白抗病毒效价进行计算，结果见图10。图中方框所示干扰素IFN标准品的抗病毒活性为1.0IU/ml浓度，具备相同抗病毒活性的IFNα2a–EFEm（方框所示）浓度为4^-10mg/ml，计算得到：IFN-α2a-EFEm蛋白（1mg/ml）对应于4¹⁰IU/mg效价，即IFNα2a-EFEm的抗病毒效价大致为1.0x10⁶IU/mg。

重组人IFN-α2a分子量是19KD，其抗病毒比活性一般是1.0x10⁸IU/mg；考虑到IFNα2a–EFEm是融合蛋白，分子量大，为46KD，加之本实例中只是对融合蛋白做了初步的复性纯化，所以认为本申请制备的IFNα2a–EFEm，具备有α干扰素正常的抗病毒活性。

4.2穿肠活性分析

融合蛋白IFNα2a-EFEm家兔口服实验：取复性浓缩后的IFNα2a-EFEm蛋白，用PBS（pH7.4）调整浓度为1mg/ml，用玉米淀粉于25°C下吸附，干燥，过筛后灌装于肠衣胶囊。新西兰大白兔雄性2只，取IFNα2a-EFEm蛋白胶囊灌胃。于1h、2h、3h、4h、5h、6h于耳缘静脉取血。所采血液用1：9的0.109M柠檬酸钠抗凝处理。3000rpm离心10分钟，取澄清血清用PBS（pH7.4）稀释2倍，用人干扰素IFNα2a酶联免疫试剂盒（购自美国Rapidbio公司）检测血清中的IFNα2a，结果如图11所示。

结果表明，口服一个小时以后，在血液中即可检测到IFNα2a，并在3小时达到峰值浓度，ELISA的信号很强。

实施例3

EFEm-hGH的制备与分析

1.pET22b-EFEm-hGH的构建

根据已知的EFE和人体生长激素（hGH）两段目的基因的DNA序列以及接头的氨基酸序列，利用Primer Premier5.0设计五条引物。分别为

f1（EFEm正向引物）:

5’ACTGGCCATGGAACTTCCTCCCGGA（SEQ ID NO:21）（画下划线部分是MscI酶切位点）

r1（EFEm反向引物）:

5’CTCCGCCTGATCCGCCACCGCCGTTGTTGGTGATGATGTCGG（SEQID NO:22）

r2（连接肽反向引物）:

5’ACCTCCACCACCAGAGCCGCCTCCGCCTGATCCGCCACCG（SEQ IDNO:23）

f3（hGH正向引物）:

5’GCGGCTCTGGTGGTGGAGGTTCTTTCCCAACCATTCCCTTATC（SEQID NO:24）

r3（hGH反向引物）:5’TTACTCGAGTTAGAAGCCACAGCTGCCCT（SEQID NO:25）（画下划线部分是XhoI酶切位点）

共进行4次PCR反应：

反应1：以含实施例1中所述的EFEm基因的pMD-EFEm为模板，用f1和r1扩增EFEm的基因片段；

反应2：以上述反应1产物为模板，用f1和r2扩增出3’端带有接头序列的EFEm；

反应3：以含有hGH基因的pMD-hGH质粒（本实验室保存）做为模板DNA，用f3和r3扩增hGH基因；

反应4：以反应2和反应3产物为混合模板，用f1和r3扩增出EFEm-hGH的融合基因。

最终获得的PCR产物，长度约为1.37kb。PCR产物与质粒pMD-T（购自大连Takara公司，质粒图如图31所示）连接获得重组质粒pMD-EFEm-hGH。用重组质粒pMD-EFEm-hGH转化E.coli JM109。挑取阳性克隆，提取质粒pMD-EFEm-hGH进行酶切鉴定，酶切鉴定图如图12所示，其中泳道4显示的是EFEm-hGH PCR产物。

然后通过测序鉴定确认产物正确。EFEm-hGH融合基因共1362bp，编码的453个氨基酸，理论分子量约为50KD。EFEm-hGH融合蛋白的氨基酸序列（SEQID NO:26）如图13所示。

SEQ ID NO:27是编码如SEQ ID NO:26所示的EFEm-hGH融合蛋白的核酸序列，其具体序列如图13所示。

SEQ ID NO:26中下划线部分为EFEm和hGH之间的接头序列，接头的核酸序列为

5’GGCGGTGGCGGATCAGGCGGAGGCGGCTCTGGTGGTGGAGGTTCT（SEQID NO:28），编码的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO:10）。

2.EFEm-hGH的表达

用MscI和XhoI分别酶切质粒pMD-EFEm-hGH和pET22b，回收EFEm-hGH基因片段和pET22b，通过酶连接后转化E.coli BL21(DE3)，获EFEm-hGH融合蛋白的基因表达工程菌E.coli BL21(DE3)/pET22b-EFEm-hGH。EFEm-hGH接种表达的具体实施方式参见实施例2“2.IFNα2a-EFEm的表达”。

表达结果如图14所示，其中泳道4显示的是IPTG诱导的大肠杆菌BL21/pET22b-EFEm-hGH（BL21）菌液的表达结果。EFEm-hGH的表达形式主要为包涵体，分子量约为50KD，符合其理论值。

3.EFEm-hGH提取和纯化

EFEm-hGH提取和纯化的具体实施方式参见实施例2“3.IFNα2a-EFEm的提取和纯化”。

用SDS-PAGE检测蛋白的复性纯化结果，结果如图15所示，其中泳道2显示的是EFEm-hGH的复性纯化结果。

4.EFEm-hGH穿肠活性分析

EFEm-hGH穿肠活性分析的具体实施方式参见实施例2“4.穿肠活性分析”。

用ELISA检测EFEm-hGH的穿肠活性，结果如图16所示，结果表明，口服1.0小时以后，在血液中即可检测到hGH，并在2.0至3.0小时达到峰值浓度，ELISA的信号很强。

实施例4

EFE_1-159的制备与分析

1.EFE_1-159的基因工程菌的构建

EFE_1-159基因工程菌构建的具体实施方式与实施例1相同，只是使用的引物不同。构建EFE_1-159设计的2条引物为：

EFE-P1（正向引物）：5’GCCGAATTCATGGAACTTCCTCCCGGA3’（SEQ IDNO:11）（画下划线部分为EcoRI酶切位点）

EFE_1-159-P2（反向引物）：5’GCGCTCGAGTTATGTGTCATTCAGCGTCA3’（SEQ ID NO:29）(画下划线部分为XhoI酶切位点)。

通过PCR扩增EFE_1-159基因。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果可见到一条498bp左右的带型，与预期片段的大小相符，如图17所示，其中泳道2显示的是EFE_1-159PCR产物。

将EFE_1-159的PCR产物进行EcoRI、Xho I双酶切，并经过凝胶电泳回收，与经同样酶切回收的pET-32a大片段连接成重组质粒pET-32a-EFE_1-159，转化E.coli JM109。用上述两个引物通过PCR筛选鉴定阳性转化子。从阳性转化子中提取质粒pET-32a-EFE_1-159，用EcoR I和Xho I再进行双酶切鉴定（图17），其中泳道1显示的是pET-32a-EFE_1-159质粒EcoR I和Xho I双酶切结果。用阳性转化子转化E.coli BL21(DE3)，构建EFE_1-159的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-32a-EFE_1-159，用于表达EFE_1-159。

2.EFE_1-159的表达

EFE_1-159的表达的具体操作参见实施例1。

用SDS-PAGE分析确定目的蛋白的表达，结果如图18所示，其中泳道6表示EFE_1-159的表达结果。结果表明，EFE_1-159得到了大量表达，图中所显示的分子量大小与其理论值37.7KD相符。

3.EFE_1-159的提取纯化

EFE_1-159提取纯化的具体操作见实施例1。SDS-PAGE的结果表明其表达方式主要为可溶性表达，如图18所示，其中泳道7表示EFE_1-159的表达产物主要存在于破菌上清液中。

可溶蛋白EFE_1-159和经8M尿素溶解的EFE₁₅₉包涵体分别纯化后的洗脱样品用SDS—PAGE电泳分析，结果如图19所示，其大小与理论值相符，表明利用Ni-NTA亲和层析可使两种形式的目的蛋白得到有效纯化。

4.EFE_1-159的纤溶活性分析

EFE_1-159纤溶活性分析的具体操作见实施例1。分析结果见图20，其中c为可溶性纯化蛋白EFE_1-159，其周围没有产生可见的透明圈，表明EFE_1-159并不具有纤溶活性。

5.EFE_1-159的穿肠活性分析

EFE_1-159穿肠活性分析的具体操作见实施例1。EFE_1-159的穿肠活性分析结果见下表2。

表2三种形式的EFE_1-159和生理盐水的ELISA检测结果比较

由表2可知，除生理盐水组外，其它各组均为阳性结果；EFE_1-159蛋白的三种不同形式：包涵体、包涵体复性、可溶性蛋白穿膜活性信号依次增强。试验结果表明，EFE_1-159保留了EFE的穿肠活性。

实施例5

EFE_1-100-EGFP的制备与分析

1.EFE_1-100-EGFP的基因合成

EFE_1-100-EGFP基因合成的具体操作与实施例2相同，只是使用的引物不同。

用于扩增EFE基因氨基端1至100个氨基酸片段（EFE_1-100）的引物为：

P1（正向引物）：GGCTCGAG

ATGGAACTTCCTCCCGGA（SEQ ID NO:30）(画下划线部分为XhoI酶切位点，方框为EcoRI酶切位点)；

P2（反向引物）：GCCGGGATCCAACGTCGTTCTCTAGG（SEQ ID NO:31）（画下划线部分为BamHI酶切位点)

用于扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的引物为：

P1’（正向引物）：

GCCGGGATCCATGGTGAGCAAGGGGCGAGGAGCTGTT（SEQ ID NO:32）（画下划线部分为BamHI酶切位点)；

P2’（反向引物）：

GCCGTCTAGATTACTGTACAGCTCGTCCATCGCCGA（SEQ ID NO:33）（画下划线部分为XbaI酶切位点)。

用含EFE和EGFP基因的质粒作为模板（pGEM-EFE和pEGFP-N3，均为本实验室保存），PCR扩增EFE_1-100和EGFP的基因。

PCR产物经凝胶电泳回收，分别与pGEM-T载体连接，连接产物转化E.coliJM109感受态细胞，经PCR和限制性酶切反应鉴定阳性重组子后，扩增，小量碱裂解法提取得到pGEM-T-EFE_1-100和pGEM-T-EGFP重组质粒。

用BamHI/PstI双酶切pGEM-T-EFEPM_1-100和pGEM-T-EGFP，酶切得到的EGFP片段与开环的pGEM-T-EFE_1-100进行连接，得到重组质粒pGEM-T-EFE_1-100–EGFP。

将pGEM-T-EFE_1-100-EGFP和pET32a+用EcoRI和NotI进行双酶切，并将酶切得到的基因片断和表达载体相连，转化E.Coli BL21（DE3）感受态细胞，鉴定出阳性重组子，获得E.Coli BL21（DE3）/pET32a-EFE_1-100–EGFP基因工程菌用于表达。

上述各种PCR产物、质粒的酶切图谱见图21所示。

2.EFE_1-100-EGFP的表达和提取纯化

E.Coli BL21（DE3）/pET32a--EFE_1-100–EGFP基因工程菌接入20ml LB培养基（Amp^＋）中，37°C下培养过夜，第二天转接500ul至另一个20ml2×YT培养基（Amp^＋）中，培养至OD₆₀₀大约为0.6时加入IPTG至终浓度为1mM，诱导目的蛋白的表达，培养4h后离心收集菌体。

SDS-PAGE结果如图22所示，结果表明：EFE_1-100–EGFP融合蛋白在合适诱导条件下实现了高效表达，显示的分子量和理论值符合；用抗EGFP抗体做Western印迹实验，显示反应结果为阳性。

EFE_1-100–EGFP可溶性表达产物和包涵体的提取纯化具体实施方法参见实施实例1。

3.EFE_1-100-EGFP的穿肠活性分析

3.1动物实验小鼠血清荧光检测

腹腔注射昆明小鼠相同浓度的融合蛋白EFE_1-100–EGFP和EGFP，注射融合蛋白EFE_1-100–EGFP后2小时的小鼠血清（管C）同注射前融合蛋白EFE_1-100–EGFP样品（管A）一样，在紫外光激发下可以发出清晰可见荧光，但注射对照样品EGFP的小鼠血清（管B）却无荧光发出，如图23所示。

这一试验结果表明：EFE的氨基末端的前100个氨基酸可以携带原本不能穿过细胞膜的外源蛋白(EGFP)突破细胞膜屏障进入血液，而且外源蛋白仍然保持其原有的生物学功能，直接证明了该片段具有蛋白转导功能。

3.2动物实验小鼠血清ELISA检测

昆明种小鼠分别腹腔注射相同浓度的融合蛋白EFE_1-100-EGFP(可溶性蛋白和包涵体蛋白)以及EGFP，设立等体积生理盐水对照，分时间点采集小鼠血清，直接血清包板进行ELISA；一抗为兔抗EGFP IgGs，稀释倍数为1：2000；二抗为HRP标记的羊抗兔IgGs，稀释倍数为1：5000）。

ELISA结果如图24所示，结果表明，无论是可溶性的蛋白EFE_1-100–EGFP，还是复性后的包涵体蛋白EFEP_1-100–EGFP，通过腹腔注射后均能在血液中检测到；但作为对照组的生理盐水和绿色荧光蛋白EGFP，则不能在腹腔注射后的小鼠血液中检测到。

由ELISA粗略定量和Western印迹（图25）结果表明，可溶性融合蛋白EFE_1-100–EGFP给昆明小鼠腹腔注射后约60min左右可以在血液中检测到约10％的完整分子，并在小鼠血清中达到峰值。复性后的包涵体蛋白注射后可在血液中检测到约15％的完整分子，并在注射后180min达到峰值。

同样，采用夹心法ELISA对腹腔注射后小鼠血清进行检测（一抗为抗-EFEIgGs，稀释倍数为1：500；二抗为与HRP交联的抗-EFE IgGs，稀释倍数为1：100），得到的数据趋势与图24相当。

以上结果表明，EFE的氨基末端的前100个氨基酸可以携带原本不能穿过细胞膜的外源蛋白(EGFP)突破细胞膜屏障进入试验动物血液，这就直接证明了该片段具有蛋白转导功能，而且转导肽及被转导的蛋白仍然保留着各自的免疫学特性。

Claims (25)

1.一种分离的具有细胞穿透功能的多肽，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少70%同源性的氨基酸序列，并且所述多肽不含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽具有100至246个氨基酸。

3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述多肽具有100至159个氨基酸。

4.根据权利要求2所述的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID NO:2-4所示的任一氨基酸序列。

5.一种运载复合物，其包含由权利要求1所述的多肽组成的转运部分，和货物分子。

6.根据权利要求5所述的运载复合物，其中所述货物分子是化学化合物。

7.根据权利要求5所述的运载复合物，其中所述货物分子是生物大分子。

8.根据权利要求7所述的运载复合物，其中所述生物大分子是多肽或多聚核苷酸。

9.根据权利要求8所述的运载复合物，其中所述多肽是人干扰素α2a、人生长激素、或者增强型绿色荧光蛋白。

10.根据权利要求5所述的运载复合物，其中所述转运部分通过接头与所述货物分子共价连接。

11.根据权利要求10所述的运载复合物，其中所述转运部分的氨基末端与所述货物分子的羧基末端通过接头共价连接。

12.根据权利要求10所述的运载复合物，其中所述转运部分的羧基末端与所述货物分子的氨基末端通过接头共价连接。

13.根据权利要求10所述的运载复合物，其中所述接头为柔性连接肽，其氨基酸序列为GGSGSGGSGGSGSGG、GGGGSGGGGSGGGGS或GS。

14.根据权利要求11所述的运载复合物，其中所述货物分子是人干扰素α2a。

15.根据权利要求12所述的运载复合物，其中所述货物分子是人生长激素。

16.根据权利要求12所述的运载复合物，其中所述货物分子是增强型绿色荧光蛋白。

17.一种药物组合物，其包含权利要求5所述的运载复合物和药用载体。

18.根据权利要求17所述的药物组合物，所述组合物为口服制剂、注射制剂、口腔喷雾制剂或鼻腔喷雾制剂。

19.根据权利要求17所述的药物组合物，其包含至少一种其他药物。

20.根据权利要求19所述的药物组合物，所述的其他药物为抗病毒药物。

21.一种在对象中将货物分子递送穿透细胞的方法，所述方法包括向所述对象递送药物组合物，所述组合物包含运载复合物，所述运载复合物包含由权利要求1所述的多肽组成的转运部分，和货物分子。

22.一种分离的核酸，其包含编码权利要求1所述的多肽的氨基酸序列的核酸序列。

23.根据权利要求22所述的核酸，其包含SEQ ID NO:6-8所示的任一核酸序列。

24.一种生产权利要求1所述的多肽的方法，包括：

i)将包含编码权利要求1所述多肽的核酸的表达载体，在允许表达权利要求

1所述的多肽的条件下在宿主细胞中表达；

ii)收集并纯化表达的权利要求1所述的多肽。

25.权利要求1所述的多肽用于在对象中将货物分子递送穿透细胞的用途，其包含向所述对象给药含有运载复合物的药物组合物，所述运载复合物包含由权利要求1所述的多肽组成的转运部分，和所述货物分子。

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