CN101481420B

CN101481420B - 一种杂合抗菌肽ca-ma及其重组表达方法

Info

Publication number: CN101481420B
Application number: CN200910036902XA
Authority: CN
Inventors: 张文庆; 金丰良; 许小霞; 汪延生; 陈宏鑫; 王娟
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2009-01-22
Filing date: 2009-01-22
Publication date: 2012-08-15
Anticipated expiration: 2029-01-22
Also published as: CN101481420A

Abstract

本发明公开了一种杂合抗菌肽CA-MA及其重组表达方法。利用家蝇泛素ubiquitin为融合伴侣，构建了高效表达杂合抗菌肽CA-MA的融合表达载体pQEUBICAMA。该重组抗菌肽具有高效、广谱的抗菌活性；将重组抗菌肽与家蝇泛素融合后，在大肠杆菌中高效表达可溶性外源蛋白，为抗菌肽的高效表达提供了分子平台；具有表达量高，表达稳定等优点。该pQEUBICAMA载体能以融合蛋白的形式高效表达CA-MA，表达产物溶解性好，融合蛋白在家蝇泛素水解酶下获得准确切割，纯化简易且重组蛋白具有天然的生物活性，所采取纯化稳定可靠，得率高，利于大规模生产，也适用于对CA-MA功能与构象关系的研究。

Description

一种杂合抗菌肽CA-MA及其重组表达方法

技术领域

本发明涉及一种杂合抗菌肽CA-MA及其重组表达方法，属于生物技术领域。

背景技术

抗菌肽(antibacterial peptides)是宿主产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子阳离子肽(Milner et al.，1996；Bals et al.，1999)，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内，除有非特异性抗细菌、真菌、病毒等病原体作用外(Bellm et al.，2000；Hancock et al.，2000)，还有抗肿瘤细胞作用，因此又称为肽抗生素(peptide antibiotics)。抗菌肽抗菌谱广，对多重耐药菌、肿瘤细胞、艾滋病毒有杀伤作用，甚至还可能有抗重症急性呼吸综合征(severe acute kespiratory syndrome，SARS)病毒的作用，抗菌肽独特的杀菌机制，使其成为一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物。但天然抗菌肽在昆虫组织中的含量很少，直接从昆虫血淋巴中纯化抗菌肽成本太高，得率低，工序繁琐，并且在应用中表现出单一天然抗菌肽抗菌活力低和抗菌谱窄等缺陷。这些都不利于抗菌肽的广泛应用。目前国内外学者都借助于基因工程的手段，根据抗菌肽构效和功能的关系，将已知的抗菌肽结构进行改造(Andreu etal，1985；Fink et al，1989)或将已知功能的抗菌肽活性部位杂合(Song，2000)，在体外进行高效表达，希望获得抗菌活力更强，抗菌谱更广的抗菌肽(黄音等，2001；周霞等，2003；黄亚东等，2003a，b)。然后对获得的抗菌肽在体外进行高效表达，以期达到应用的目的(邱定红等，2002；朱嘉明等，2002；陈海旭等，2001；叶玉坤等，1994；韩万江等，1998；陈海旭等，2002)。

但抗菌肽的应用，需要大量的、高活性的抗菌肽做基础，而抗菌肽在天然组织中含量少，直接从天然组织中分离纯化抗菌肽成本太高，得率低，工序繁琐，这些都不利于抗菌肽的广泛应用。基因工程生产抗菌肽是一个较为理想的选择，但是由于抗菌肽分子小，容易被蛋白酶降解，同时由于其表达产物对宿主菌有害，因此不能在原核系统中直接表达，一般采用真核表达或融合表达的形式(Bryksa et al.，2005)。至今，抗菌肽已在原核表达系统(Skosyrev et al.，2003)、昆虫细胞表达系统(Yamada et al.，1990)、酵母表达系统得到表达(Aly et al.，1999；Li et al.，2005；Almeida et al.，2001；Cabral et al.，2003；金丰良等，2005；Jin et al.，2006)。但是在表达过程中发现，表达的抗菌肽对宿主细胞有毒性，而且对宿主本身的蛋白酶非常敏感导致降解，这些都降低了抗菌肽的表达量。近几年来，在原核细胞中采用融合的形式表达抗菌肽已经成为研究者的热点(Smith et al.，1988；Pryoret al.，1997；Guan et al.，1988；LaVallie et al.，1993，1995；Tenno et al.，2004)。大肠杆菌的遗传背景清楚，体外操作容易，可大规模、高密度发酵且培养基成分要求简单，一直是基因工程多肽类药物生产研究中的首选表达宿主细胞(Harris et al.，1983)。将抗菌肽和分子伴侣在细菌中融合表达，分子伴侣不仅降低了抗菌肽对宿主菌的毒性，而且保护了抗菌肽不被蛋白酶所降解。抗菌肽已经和麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein，MBP)(陈海旭等，2001；Hara etal.，1996)、谷胱胺肽S转移酶(glutathione S-transferase，GST)(Skosyrev et al.，2003；王来城等，2005；Feng et al.，2006)、绿色荧光蛋白(Green-fluorescent protein，GFP)(卢强等，2002)在大肠杆菌中成功实现了融合表达。研究中发现，大部分的融合蛋白多呈包涵体的形式存在，增加了抗菌肽的纯化难度(卢强等，2002；王来城等，2005；Li et al.，2006)，而且融合蛋白在外源蛋白酶切割时，往往出现切割不完全或增加了抗菌肽N端多余的氨基酸(Wu et al.，1999；Liang et al.，2006)，这些都降低了抗菌肽的产量和活性。而且外源蛋白酶的使用，使抗菌肽的纯化变得不经济。

泛素(ubiquitin)是分子伴侣家族中的一员，可以起到增加翻译水平和稳定蛋白的作用。泛素特异性蛋白酶(Ubp)广泛存在于酵母等真核生物，可以有效的酶解泛素融合蛋白，与其它用于酶解融合蛋白的特异性蛋白酶如FactorX和Thrombin相比，Ubp具有更高的酶活力和更强的特异性。近年来的研究发现，将外源基因与泛素基因融合后，不仅可以防止表达产物被降解，极大的提高外源基因的表达量，而且表达的融合蛋白在离体或体内条件下，经泛素特异性蛋白酶在泛素分子C-末端切割后，可以释放出完整而有活性的外源蛋白(孙超等，2001；Einhauer，A.，et al，2002)。在大肠杆菌系统中简单经济的表达可溶性抗菌肽，是近几年来科研者一直致力解决的问题(卢晓风等，1999)。为满足抗菌肽的生产需要，快速高效表达和简单经济纯化的表达系统是迫在眉睫的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供一种杂合抗菌肽。本发明的杂合抗菌肽CA-MA(家蝇cecropinA的前8个氨基酸序列和非洲爪蟾magainin2的前12个氨基酸序列)具有高效、广谱的抗菌活性，具有潜在的应用前景；与家蝇泛素(ubiquitin)融合后，在大肠杆菌中高效表达可溶性外源蛋白，为抗菌肽的高效表达提供了分子平台。

本发明的另一目的在于提供一种上述杂合抗菌肽的重组表达方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种杂合抗菌肽(CA-MA)，它具有以下氨基酸序列：KKIGKKIEGIGKFLHSAKKF。

上述杂合抗菌肽的重组表达方法，包括以下步骤：

(1)选择家蝇cecropinA前8个氨基酸序列和非洲爪蟾magainin2的前12个氨基酸序列设计杂合抗菌肽的cDNA；

(2)根据细菌偏爱的密码子，设计引物P1和P2，

P1：5′-AGC

TGGCATGAAATGGAAGATTGGTAAGAAAATCGGCATTGGTAAGTTCTTA-3′(黑斜体表示引入的酶切位点为SacII)，

P2：5′-GGC

TTAGTTGAATTTCTTAGCAGAATGTAAGAACTTACCAATGCCGA-3′(黑斜体表示引入的酶切位点为HindIII)；

(3)进行常规链式聚合酶反应扩增杂合抗菌肽的cDNA。

(4)构建杂合抗菌肽表达质粒pQEUBICAMA；

(5)表达质粒pQEUBICAMA在原核细胞中进行高效融合表达，得到融合蛋白UBICAMA；

(6)融合蛋白UBICAMA的纯化：将步骤(5)所得的诱导融合蛋白经镍螯和层析进行融合蛋白的纯化；

(7)杂合抗菌肽(重组蛋白)的获得：用家蝇泛素C-末端水解酶(FUCH)对步骤(6)所得融合蛋白进行酶切，然后依次经镍螯和层析和超滤法进行重组抗菌肽的纯化。

所述步骤(3)中常规链式聚合酶反应的具体步骤如下：将混合液在94℃预变性5min，然后进入下列循环：94℃、40秒，55℃、40秒，72℃、50秒，共进行35个循环，最后72℃延伸7分钟，扩增完毕后置4℃终止反应。

所述混合液组成如下：

含20mM Mg²⁺的10×PCR缓冲液 5μl

浓度为2.5mM的dATP、dTTP、dCTP、dGTP组成的dNTP混合物 4μl

浓度为10μM的引物P1 4μl

浓度为10μM的引物P2 4μl

浓度为5U/μl的高保真DNA聚合酶 0.5μl

灭菌水 32.5μl

步骤(4)所述重组表达质粒pQEUBICAMA的构建包括以下步骤：

(a)原核表达质粒pQEUBI的构建：设计一对特定引物PUF和PUR，以原核表达载体pQE30为模板，利用常规链式聚合酶反应将家蝇泛素(ubiquitin，UBI)的C末端碱基T²²¹突变C，使其含有BamH I、Sac II(Leu⁷³、Arg⁷⁴)和HindIII酶切位点，以及家蝇泛素C-末端水解酶(FUCH)的识别序列(Gly⁷⁵-Gly⁷⁶)；然后经过质量分数为0.8％琼脂糖凝胶电泳回收，再经BamH I和HindIII酶切双切后插入到载体pQE30的BamH I和HindIII酶切窗口，构建成原核表达质粒pQEUBI；

(b)将杂合抗菌肽的cDNA进行SacII和HindIII双酶切，胶纯化回收后，与经同样酶切回收的质粒pQEUBI体外连接，构建重组表达质粒pQEUBICAMA。

所述的特定引物PUF和PUR是：

PUF：5′-GCGGGATCC ATGCAGATTTTC GTGAAAACC-3′，

PUR：5′-GAAGCTTTTAGCCACCGCGGAGGCGAAGGACC-3′。

步骤(5)所述重组表达质粒pQEUBICAMA在原核细胞中进行高效融合表达包括以下步骤：用氯化钙转化法将重组表达质粒pQEUBICAMA导入宿主菌大肠杆菌M15中；用涂布氨苄抗生素和卡那霉素筛选培养基的方法筛选获得重组表达质粒pQEUBICAMA；用乳糖蛋白胨(LB)培养基诱导融合蛋白UBICAMA，培养温度为37℃；加入异丙基-β-D硫代半乳糖(IPTG)和葡萄糖诱导融合蛋白UBICAMA表达。其中IPTG的终浓度为0.4mM，葡萄糖的质量浓度为0.2％，诱导温度为25℃～26℃，诱导时间为8～10hr。

步骤(7)所述超滤法是利用截留分子量为10.0kDa的超率装置进行过滤。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：(1)杂合抗菌肽CA-MA(家蝇cecropinA(1-8)和非洲爪蟾magainin2(1-12)具有高效、广谱的抗菌活性，具有潜在的应用前景；(2)将杂合抗菌肽与家蝇泛素融合后，在大肠杆菌中高效表达可溶性外源蛋白，为抗菌肽的高效表达提供了分子平台，具有表达量高，表达稳定等优点；(3)本发明中构建重组表达质粒pQEUBICAMA能以融合蛋白的形式高效表达CA-MA，表达产物溶解性好，融合蛋白在泛素水解酶下获得准确切割，纯化简易，且重组杂合抗菌肽具有天然的生物活性，所采取纯化稳定可靠，得率高，利于大规模生产，而且也适用于对CA-MA功能与构象关系的研究。

附图说明

图1是pQE30物理图谱图。

图2是重组表达质粒pQEUBI的构建示意图。

图3是杂合抗菌肽CA-MA的PCR结果图。

图4是重组表达质粒pQEUBICAMA的表达框架图。

图5是重组表达质粒pQEUBICAMA的构建示意图，

其中，M为Marcker I，1，2为CA-MA为扩增片段。

图6是重组质粒的BamHI和HindIII双酶切鉴定图，

其中，M为MakerII，1为pQE30载体，2为pQEUBICAMA。

图7是融合蛋白UBICAMA的SDS-PAGE(A、B)电泳图和Western blot(C)分析图，

其中M1，M2：蛋白marker；1：诱导前；2：IPTG诱导5h；3：HisTrap HP 5ml column纯化后的融合蛋白(1.0μg/lane)；4：IPTG诱导5h的上清；5：IPTG诱导5h的沉淀；6：纯化后的融合蛋白(1.0μg/lane)与Ni-NTA conjugate的杂交。

图8是融合蛋白酶切的Tricine-SDS-PAGE分析图，

其中，M1，M2：蛋白marker；1：纯化的重组蛋白CA-MA；2：FUCH切割后的样品；3：纯化的融合蛋白。

图9为杂合抗菌肽CA-MA的RP-HPLC C18 column分析图，在12.48分钟收集流出液。

图10为纯化后杂合抗菌肽CA-MA的Tricine-SDS-PAGE分析图，

其中，M：蛋白marker；1：纯化的重组抗菌肽CA-MA。

图11为杂合抗菌肽CA-MA的激光飞行时间质谱分析图。

图12为杂合抗菌肽CA-MA的二级结构分析图。

图13为杂合抗菌肽Mdmcec和杂合抗菌肽CA-MA对E.coli K₁₂D₃₁(A)和S.aureus(B)的活性检测图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1原核表达质粒pQEUBI的构建

以PUF和PUR为特定引物，利用PCR技术将家蝇泛素(ubiquitin)定点突变，使其C末端含有编码四个氨基酸(Leu⁷³、Arg⁷⁴、Gly⁷⁵、Gly⁷⁶)的序列。家蝇泛素C-末端带有Sac II酶切位点(Leu⁷³、Arg⁷⁴)和家蝇泛素C-末端水解酶(FUCH)的识别序列(Gly⁷⁵-Gly⁷⁶)，融合蛋白经家蝇泛素C-末端水解酶切割后有利于目的蛋白的释放。Ubiquitin的PCR中含有BamH I、Sac II(Leu⁷³、Arg⁷⁴)和HindIII酶切位点。经过质量分数为0.8％的琼脂糖凝胶电泳回收，再经BamH I和HindIII酶切双切后插入到原核表达载体pQE30(图1)的BamH I和HindIII酶切窗口，构建成质粒pQEUBI。质粒构建的具体过程如图2所示：为了将家蝇ubiquitin引进载体pQE30中，便于ubiquitin下游基因的装配和使下游表达的蛋白的N端不引入其他任何氨基酸，设计一对引物PUF和PUR。为了便于克隆，分别在引物PUF和PUR的的5′端引入BamH I和HindIII酶切位点，并将家蝇ubiquitin核苷酸序列C末端碱基序列TCGCGG突变为CCGCGG(Sac II)。以测序正确的重组质粒pMD18-UBI为模板，PUF和PUR为引物进行PCR扩增，PCR产物经胶回收纯化后，用BamHI和HindIII双酶切，与用BamHI和HindIII双酶切的pQE30载体连接，得到重组表达载体pQEUBI。大肠杆菌的转化、质粒提取、DNA片段的回收、连接、转化均按Sambrook等方法进行(Sambrook et al.，1989)。酶切鉴定后正确的重组质粒经送上海英俊生物技术有限公司进行序列测定。

实施例2重组表达质粒pQEUBICAMA的构建

(1)CA-MA序列的扩增

(a)根据家蝇cecropihA(1-8)的氨基酸序列和非洲爪蟾magainin2(1-12)的氨基酸序列设计重组抗菌肽的cDNA；

(b)根据细菌偏爱的密码子，设计引物P1和P2，

P1：5′-AGC

P2：5′-GGC

由上海英俊生物技术有限公司合成，使用前用ddH₂O稀释至10μM。

(c)进行常规链式聚合酶反应扩增重组抗菌肽。

以P1和P2互为模板互为引物，以高保真DNA聚合酶(Pyrobest DNAPolymerase)进行PCR，CA-MA的PCR反应条件：50μl体系中含有10×PCR buffer(含20mM Mg²⁺)5μl，dNTP mixtures(各2.5mM)4μl，P1(10μM)4μl，P2(10μM)4μl，高保真DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，ddH₂O 32.5μl；将混合液在94℃预变性5min，然后进入下列循环：94℃、40秒，55℃、40秒，72℃、50秒，共进行35个循环，最后72℃延伸7分钟，扩增完毕后置4℃终止反应。得到CA-MA cDNA序列(CGCCTCGAGAAAAGAATGAAATGGAAGATTGGTAAGAAAATCGGCATTGGTAAGTTCTTACATTCTGCTAAGAAATTCAACTAAGAATTCGCC)。PCR产物用质量分数为1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行分析，在90bp附近存在单一的目标条带，结果如图3，表明实验获得了与预期相符的特异DNA片段即重组抗菌肽的cDNA。

所述混合液组成如下：

含20mM Mg²⁺的10×PCR缓冲液 5μl

dNTP混合物(浓度为2.5mM的dATP，dTTP，dCTP，dGTP) 4μl

浓度为10μM的引物P1 4μl

浓度为10μM的引物P2 4μl

浓度为5U/μl的高保真DNA聚合酶 0.5μl

灭菌水 32.5μl

(2)重组表达质粒pQEUBICAMA的构建

由于抗菌肽N端对抗菌活性相当重要，N端额外添加氨基酸会导致抗菌肽活性显著降低(Cabral et al.，2003；Li et al.，2005)。因此设计重组抗菌肽表达质粒pQEUBICAMA时，在扩增CA-MA时，上游引物P1引入载体ubiquitin的四个氨基酸(L、R、G、G)编码序列，使CA-MA cDNA序列位于ubiquitin下游，插入到载体pQEUBI相应的窗口(Sac II和HindIII双酶切)，CA-MA cDNA序列与载体上的泛素序列(ubiquitin)及6×His序列融合。表达框架如图4所示。

将胶纯化回收后CA-MA PCR产物即重组抗菌肽的cDNA进行Sac II和HindIII双酶切，胶纯化回收后，与经同样酶切回收的质粒pQEUBI体外连接，构建重组表达质粒pQEUBICAMA。转化E.coli TG1，Amp+筛选阳性克隆子。阳性重组质粒的提取，酶切和PCR鉴定均按文献(Sambrooket al.，1989)进行。将酶切和PCR鉴定正确的重组质粒送上海英俊生物技术有限公司进行序列测定。

质粒构建过程详见图5。

实施例3重组表达质粒pQEUBICAMA的酶切鉴定

挑选阳性克隆子，抽提质粒pQEUBICAMA，BamHI、HindIII双酶切，产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，出现两条DNA带，位置与预测一致(如图6所示)。

实施例4诱导表达产物的SDS-PAGE分析和免疫印迹分析

将测序鉴定正确的重组表达质粒pQEUBICAMA转化表达宿主菌M15构建成工程菌株。挑取工程菌株单菌落接种于LB液体加富培养基(含100mg/l Amp+、25mg/l kan+)中，37℃剧烈振荡培养16hr，作为种子菌。取种子菌按1∶50体积比接种于新鲜的LB加富培养基(含100mg/lAmp+、25mg/l kan+)中，37℃剧烈振荡放大培养至OD600＝0.8时，加入终浓度为0.4mM IPTG，同时加入终浓度为0.2％的葡萄糖，降低本底的表达。在25℃诱导表达9hr，4℃、12,000r.p.m离心2min，得到含有重组质粒pQEUBICAMA的表达菌株，收集菌体备用。SDS-PAGE电泳及Western印迹分析见图7。由图中可以看出，含有pQEUBICAMA质粒的菌株诱导后表达了一条分子量为12.6kDa的蛋白带，结果如图7(A)，该融合蛋白能被镍-次氮基三乙酸琼脂糖树脂(Ni-NTA-偶联物)特异性的识别，结果如图7(C)，说明融合蛋白的N-端携带有6×His接头。

实施例5表达产物的可溶性分析

将重组表达质粒pQEUBICAMA转化表达宿主菌M15构建成工程菌株，接种于200ml LB中做大量表达，具体操作：挑取工程菌株单菌落接种于LB液体加富培养基(含100mg/l Amp⁺、25mg/l kan⁺)中，37℃剧烈振荡培养16hr，作为种子菌。取种子菌按1∶50体积比接种于新鲜的LB加富培养基(含100mg/l Amp⁺、25mg/l kan⁺)中，37℃剧烈振荡放大培养至OD600＝0.8时，加入终浓度为0.4mM IPTG，同时加入终浓度为0.2％的葡萄糖，降低本底的表达。在25℃诱导表达9hr，4℃、12,000r.p.m离心2min，收集菌体备用。离心收集诱导表达后的菌体，称取湿重。加入超声裂解液(50mM Tris-HCl(pH8.0)和500mMNaCl混合液)，进行超声破碎。12,000g离心30min，分别收集上清液和沉淀，通过SDS-PAGE电泳分析融合蛋白的存在形式。结果如图7(B)，表明融合蛋白存在超声裂解液的上清中。

实施例6融合蛋白UBICAMA的纯化

由于pQE30载体的N端带有6×His纯化标签，可以采用Ni²⁺螯和层析进行纯化融合蛋白。融合蛋白的纯化参考Ni²⁺金属亲和层析HisTrapHP(5ml)系统的说明书进行。将超声裂解的上清经过0.45μM低吸附蛋白的过滤器除去杂质，先用平衡缓冲液(20mM Na₃PO4，0.5M NaCl，5mM咪唑，pH7.4)平衡，进蛋白样品，保持流速1ml/min。用平衡缓冲液洗脱至基线后，收集穿过依次用线性梯度的咪唑浓度(5mM-500mM)的缓冲液(20mM Na₃PO4，500mM NaCl，pH 7.4)洗脱结合蛋白，分别收集流出物，每次收集物均取10μl，SDS-PAGE电泳检测，目的蛋白在0.2M咪唑浓度下可以被洗脱下来。因此本发明中，收集了0.2M咪唑浓度洗脱下来的流出物，取出了10μl的流出物，进行SDS-PAGE分析，结果如图7-B，与预期的大小一致。

实施例7融合蛋白UBICAMA的酶切

将纯化的融合蛋白UBICAMA在25℃家蝇泛素C-末端水解酶(FUCH)缓冲液中(50mM N-2-羟乙基哌嗪-主N-2-乙磺酸钠/NaOH，pH 7.8，0.5mM EDTA乙二胺四乙酸四钠，1mM二硫苏糖醇，0.1mg/ml鸡卵白蛋白)进行酶切16hr，酶切产物经ddH₂O透析后，18％三(羟甲基)甲基甘氨酸十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)电泳分析，结果如图8所示，融合蛋白UBICAMA经家蝇泛素C-末端水解酶酶切后，释放出与预期大小一致的泛素(UBI)和CA-MA单体。表明带有6His标签的重组家蝇泛素C-末端水解酶能够特异的识别泛素C-末端的蛋白，并进行切割，释放出泛素分子和具有天然N末端目的蛋白。

实施例8杂合抗菌肽的纯化

由于泛素(UBI)、家蝇泛素C-末端水解酶(FUCH)、酶切不完全的融合蛋白UBICAMA都带有6×His标签，酶切产物经两次HisTrap HP(5ml)柱纯化，除去带有His-tag的酶切污染，收集流出液，进一步用截留分子量为10.0kDa的超滤装置(Amicon)对重组抗菌肽进行纯化，除去10.0kDa以上的杂蛋白。将纯化后的重组抗菌肽用半制备型的RP-HPLC(reversed-phase HPLC，反相高压液相色谱)的C18(250×4.6mm，5μm

)柱进行分析表明，纯化的重组抗菌肽为单一的峰型，结果如图9。18％Tricine-SDS-PAGE电泳对纯化的重组抗菌肽进行分析表明，纯化的蛋白为单一蛋白条带，分子量分别为2.6kDa，与预期的结果一致，如图10所示。以上结果表明经重复镍螯和层析和超滤后得到较为纯净的杂合抗菌肽。

实施例9杂合抗菌肽CA-MA的激光飞行时间质谱检测

用激光飞行时间质谱对纯化的CA-MA进行分析，结果如图11所示。由图11可知，杂合抗菌肽CA-MA的分子量分别2559.53Da，与通过氨基酸序列计算得到的分子量完全符合。而且杂合抗菌肽CA-MA的质谱结果为单一的峰，说明成分均一，纯度很高。

实施例10杂合抗菌肽CA-MA的圆二色谱分析

杂合抗菌肽CA-MA的圆二色谱测定使用日本产J 810仪圆二色谱仪，在室温测定远红外190-250nm的光谱。结果见图12。圆二色谱的测定结果表明，杂合抗菌肽CA-MA二级结构为17.4％α-螺旋结构和82.6％自由转曲，没有β折叠，杂合抗菌肽CA-MA在200-210nm有一处吸收峰，与化学合成的CA-MA的二级结构一致。

实施例11杂合抗菌肽CA-MA的生物活性检测

重组蛋白CA-MA的冻干粉用灭菌ddH₂O溶解成1μg/ml的溶液，以E.coli K₁₂D₃₁和S.aureus为指示菌，采用琼脂孔穴平板扩散法测定表达产物抑菌活性，以1μg/ml氨苄青霉素为阳性对照，以灭菌ddH₂O作为阴性对照，37℃过夜培养，结果如图13。

从图13中可以看出。杂合抗菌肽CA-MA对E.coli K₁₂D₃₁和S.aureus有较强的抑制作用，对E.coli K₁₂D₃₁抑菌圈直径达到0.5±0.02cm(抑菌圈直径-内径)，对S.aureus抑菌圈直径达到0.45±0.01cm。而灭菌ddH₂O未出现抑菌现象，表明融合蛋白在泛素水解酶的作用下可以释放出具有生物活性的杂合抗菌肽CA-MA。

实施例12杂合抗菌肽的杀菌谱测定

将纯化的杂合抗菌肽CA-MA用0.01％的乙酸和0.2％牛血清白蛋白1/2倍梯度稀释，对其杀菌的广谱性及最小抑制浓度进行了测定，结果如表1。

表1杂合抗菌肽CA-MA对微生物的最小抑制浓度

从表1中可以看出，杂合抗菌肽CA-MA具有相类似的抗菌活力和抗菌谱，都具有广谱抗菌性，不仅对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有广谱的抗性，而且对真菌也有一定的抑制作用。CA-MA对大肠杆菌猪霍乱沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌的MIC分别为1.7μM和1.6μM。对一些真菌有较强的抑制作用，如稻瘟菌MIC＝17.8μM)、灰霉菌(MIC＝14.0μM)、青霉菌(MIC＝11.3μM)、黑腐菌(MIC＝16.8μM)，为杂合抗菌肽CA-MA在抗病虫害上的应用奠定了基础。

实施例13杂合抗菌肽CA-MA的溶血性分析

将用磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH＝7.4)配制的不同浓度的CA-MA溶液，检测对小鼠红细胞的溶血性，结果如表2所示，CA-MA浓度达到50μM都没有出现血细胞的溶解现象，表明杂合抗菌肽CA-MA对小鼠红细胞无溶血性。

表2CA-MA的溶血性分析

溶血百分比＝[(抗菌肽溶液在414nm处吸收率-PBS缓冲液在414nm处吸收率)/(0.1％曲拉通X-100在414nm处吸收率-PBS缓冲液在414nm处吸收率)]100

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>暨南大学

<120>一种杂合抗菌肽CA-MA及其重组表达方法

<130>1

<160>5

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Lys Lys Ile Gly Lys Lys Ile Glu Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser

1 5 10 15

Ala Lys Lys Phe

20

<210>2

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

agcccgcggt ggcatgaaat ggaagattgg taagaaaatc ggcattggta agttctta 58

<210>3

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ggcaagcttt tagttgaatt tcttagcaga atgtaagaac ttaccaatgc cga 53

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gcgggatcca tgcagatttt cgtgaaaacc 30

<210>5

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gaagctttta gccaccgcgg aggcgaagga cc 32

Claims

1.一种杂合抗菌肽，其特征在于：它为以下氨基酸序列：KKIGKKIE GIGKFLHSAKKF。

2.根据权利要求1所述杂合抗菌肽的重组表达方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）选择家蝇cecropinA前8个氨基酸序列和非洲爪蟾magainin2的前12个氨基酸序列设计杂合抗菌肽的cDNA；

（2）根据细菌偏爱的密码子，设计引物P1和P2，

P1:5'-AGC CCGCGG TGGCATGAAATGGAAGATTGGTAAGAAAATCGGCATTGGTAAGTTCTTA-3'， CCGCGG 表示引入的酶切位点为Sac II，

P2:5'-GGC AAGCTT TTAGTTGAATTTCTTAGCAGAATGTAAGAACTTACCAATGCCGA-3'， AAGCTT 表示引入的酶切位点为HindⅢ；

（3）进行常规链式聚合酶反应扩增杂合抗菌肽的cDNA；

（4）构建杂合抗菌肽表达质粒pQEUBICAMA；

（5）表达质粒pQEUBICAMA在原核细胞中进行高效融合表达，得到融合蛋白UBICAMA；

（6）融合蛋白UBICAMA的纯化：将步骤（5）所得的融合蛋白UBICAMA经镍螯和层析进行融合蛋白的纯化；

（7）杂合抗菌肽的获得：用家蝇泛素C-末端水解酶对步骤（6）所得融合蛋白UBICAMA进行酶切，然后依次经镍螯和层析和超滤法进行杂合抗菌肽的纯化；

步骤（4）所述重组表达质粒pQEUBICAMA的构建包括以下步骤：

（a）原核表达质粒pQEUBI的构建：设计一对特定引物PUF和PUR，以原核表达载体pQE30为模板，利用常规链式聚合酶反应将家蝇泛素的C末端碱基T²²¹突变C，使其含有BamHⅠ、Sac II和HindⅢ酶切位点以及家蝇泛素C-末端水解酶的识别序列；然后经过质量分数为0.8%琼脂糖凝胶电泳回收，再经BamHⅠ和HindⅢ酶切双切后插入到载体pQE30的BamHⅠ和HindⅢ酶切窗口，构建成原核表达质粒pQEUBI；

（b）将杂合抗菌肽的cDNA进行SacⅡ和HindⅢ双酶切，胶纯化回收后，与经同样酶切回收的质粒pQEUBI体外连接，构建重组表达质粒pQEUBICAMA；

所述的特定引物PUF和PUR是：

PUF：5'–GCGGGATCC ATGCAGATTTTC GTGAAAACC-3'，

PUR：5'–GAAGCTTTTAGCCACCGCGGAGGCGAAGGACC-3'。

3.根据权利要求2所述杂合抗菌肽的重组表达方法，其特征在于：步骤（3）所述常规链式聚合酶反应的具体步骤如下：将混合液在94℃预变性5min，然后进入下列循环：94℃、40秒，55℃、40秒，72℃、50秒，共进行35个循环，最后72℃延伸7分钟，扩增完毕后置4℃终止反应；

所述混合液组成如下：

含20 mM Mg²⁺的10×PCR 缓冲液 5 μl

浓度为2.5 mM的dATP、dTTP、dCTP、dGTP组成的dNTP 混合物 4 μl

浓度为10μM的引物P1 4 μl

浓度为10μM的引物P2 4 μl

浓度为5U/μl的高保真DNA聚合酶 0.5μl

灭菌水 32.5μl。

4.根据权利要求2所述杂合抗菌肽的重组表达方法，其特征在于：步骤（5）所述重组表达质粒pQEUBICAMA在原核细胞中进行高效融合表达包括以下步骤：用氯化钙转化法将重组表达质粒pQEUBICAMA导入宿主菌大肠杆菌M15中；用涂布氨苄抗生素和卡那霉素筛选培养基的方法筛选获得重组表达质粒pQEUBICAMA；用乳糖蛋白胨培养基诱导融合蛋白UBICAMA，培养温度为37℃；加入异丙基-β-D硫代半乳糖和葡萄糖诱导融合蛋白UBICAMA表达，其中异丙基-β-D硫代半乳糖的终浓度为0.4mM，葡萄糖的质量浓度为0.2 %，诱导温度为25℃～26℃，诱导时间为8～10hr。

5.根据权利要求2所述杂合抗菌肽的重组表达方法，其特征在于：步骤（7）所述超滤法是利用截留分子量为10.0 kDa 的超率装置进行过滤。