CN110075272A - 芋螺多肽Bu8及其衍生多肽的应用 - Google Patents

芋螺多肽Bu8及其衍生多肽的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110075272A
CN110075272A CN201910284230.8A CN201910284230A CN110075272A CN 110075272 A CN110075272 A CN 110075272A CN 201910284230 A CN201910284230 A CN 201910284230A CN 110075272 A CN110075272 A CN 110075272A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
sequence
cys
amino acids
conotoxin peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910284230.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110075272B (zh
Inventor
戴秋云
余硕
陈金琴
刘珠果
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Original Assignee
Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS filed Critical Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority to CN201910284230.8A priority Critical patent/CN110075272B/zh
Publication of CN110075272A publication Critical patent/CN110075272A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110075272B publication Critical patent/CN110075272B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1767—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了一种芋螺多肽Bu8及其衍生多肽的应用。本发明提供了特异多肽在制备具有镇痛功能的产品中的应用。本发明还提供了特异多肽在制备对N‑型钙离子通道具有抑制作用的产品中的应用。所述特异多肽为如下(a)或(b)：(a)序列表的序列1所示的多肽；(b)将序列表的序列1所示的多肽进行1至3个氨基酸残基的突变得到的衍生多肽。本发明发现，芋螺多肽Bu8及其衍生多肽选择性作用于N‑型钙离子通道，对其它亚型钙离子通道作用弱，对电压门控钠、钾离子通道无明显作用，具有显著的镇痛活性，相对较低的毒性和不良反应。

Description

芋螺多肽Bu8及其衍生多肽的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及芋螺多肽Bu8及其衍生多肽的应用，更具体涉及具有抑制N-型钙离子通道活性的芋螺多肽Bu8及其衍生多肽在镇痛中的应用。
背景技术
神经性疼痛是一种由中枢或外周神经系统原发性病变或功能障碍而引起的疼痛综合症。神经性疼痛可由癌症、艾滋病、创伤性神经损伤等重大疾病引起，表现出感觉异常、痛觉过敏和痛觉超敏等典型症状。临床上常采用抗惊厥药(如莱提西酞、奥卡西平)、阿片类药(如吗啡等)和抗抑郁药的联用控制严重的神经性疼痛，但长期用药带来的不良反应、耐受性及成瘾性，常导致治疗效果不佳。N-型钙离子通道主要分布在中枢和外周神经系统的突出前神经末梢,与镇痛密切相关，是发展无致瘾慢性镇痛药物的理想靶点。
ω-芋螺多肽(ω-CTX)一般由24-31个氨基酸组成，按基因序列分类属于O超家族，含有3对二硫键，半胱氨酸框架结构为C-C-CC-C-C(框架VI/VII家族)。该类肽主要作用于N、P/Q或L-型钙离子通道，目前已发现约16种。但只有作用于N-型钙离子通道的ω-芋螺多肽，如CVID、GVIA、MVIIA、SO-3等，才具有较好的镇痛活性，可以减轻由疾病、炎症或创伤引起的神经性疼痛及其他疼痛。芋螺多肽MVIIA来源于幻芋螺(C.magus)，于2004年由美国FDA批准上市，商品名为Prialt，作为顽固性非癌症痛、癌症痛及艾滋病相关疼痛的镇痛药，与吗啡联用可以有效控制口服阿片类药物难以控制的疼痛，但其明显的副作用及鞘内给药方式限制了其临床应用。芋螺多肽GVIA来源于地纹芋螺(C.geographus)，其与N-型钙通道的结合几乎不可逆，成药性差。芋螺多肽SO-3来源于线纹芋螺(C.striatus)，含25个氨基酸，对N-型钙通道抑制活性和动物镇痛活性与MVIIA相当，但毒性较低。
含有半胱氨酸框架结构“C-C-CC-C-C”的芋螺毒素还有δ、μO、κ及γ家族等芋螺毒素，分别作用于钠、钾离子通道、烟碱型乙酰胆碱受体等，除μO家族毒素具有镇痛活性外，其余无镇痛活性，因此不能从序列及半胱氨酸骨架结构判断作用靶点及镇痛活性。
发明内容
本发明的目的是提供芋螺多肽Bu8及其衍生多肽的应用。
本发明提供了特异多肽在制备具有镇痛功能的产品中的应用。
本发明还提供了特异多肽在制备对N-型钙离子通道具有抑制作用的产品中的应用。
以上任一所述特异多肽为如下(a)或(b)：
(a)序列表的序列1所示的多肽；
(b)将序列表的序列1所示的多肽进行1至3个氨基酸残基的突变得到的衍生多肽。
序列表的序列1所示的多肽即Bu8多肽。Bu8多肽中，第1位氨基酸残基、第8位氨基酸残基、第15位氨基酸残基、第16位氨基酸残基、第20位氨基酸残基和第25位氨基酸残基形成半胱氨酸框架(C-C-CC-C-C)。Bu8多肽的三对二硫键连接方式为：Cys1-Cys16，Cys8-Cys20和Cys15-Cys25。Bu8多肽的6-8，20-21，24-25位点残基形成三个β-片层结构。
所述衍生多肽为将序列表的序列1所示的多肽进行1个氨基酸残基的突变得到的衍生多肽。
所述(b)中，发生突变的位置不为：第1位氨基酸残基、第8位氨基酸残基、第15位氨基酸残基、第16位氨基酸残基、第20位氨基酸残基、第25位氨基酸残基。
所述(b)中，发生突变的位置为：第3氨基酸残基、第6位氨基酸残基、第7位氨基酸残基、第9位氨基酸残基、第11位氨基酸残基、第12为氨基酸残基、第22位氨基酸残基。
所述衍生多肽具体可为序列表的序列2至序列13中任一所述的多肽。
所述衍生多肽中，第1位氨基酸残基、第8位氨基酸残基、第15位氨基酸残基、第16位氨基酸残基、第20位氨基酸残基和第25位氨基酸残基形成半胱氨酸框架(C-C-CC-C-C)。所述衍生多肽的三对二硫键连接方式为：Cys1-Cys16，Cys8-Cys20和Cys15-Cys25。
以上任一所述特异多肽为C末端已进行乙酰化修饰的多肽。
以上任一所述特异多肽为将线性多肽进行氧化折叠后的得到的多肽。以上任一所述特异多肽为将线性多肽进行氧化折叠再进行纯化后的得到的多肽。氧化折叠具体是在折叠液中进行的。折叠液：含0.5M乙酸铵、1mM GSH和0.1mM GSSG，余量为水，用氨水调节pH值为8.0。氧化折叠的具体方法：将线性多肽用去离子水溶解后加入折叠液中，4℃缓慢搅拌24-48h。具体来说：每50mg线性多肽配比200-500ml折叠液。纯化具体可采用C18反向高效液相色谱。纯化过程具体可为：0-1min，流动相B占流动相的体积份数为5％；1-25min，流动相B占流动相的体积份数由5％线性上升至35％；25-28min，流动相B占流动相的体积份数由35％线性上升至95％。流动相A为含0.1％(体积比)三氟乙酸的去离子水，流动相B为含0.1％(体积比)三氟乙酸的乙腈。流动相由流动相A和流动相B组成。纯化过程中，在230nm波长处监测出峰情况，收集目标峰，然后旋转蒸发除去大部分乙腈，然后冻干，即为多肽产物。
本发明还保护以上任一所述的衍生多肽。
本发明还保护一种具有镇痛功能的产品，其有效成分为以上任一所述特异多肽。
本发明还保护一种对N-型钙离子通道具有抑制作用的产品，其有效成分为以上任任一所述特异多肽。
以上任一所述产品为药品。
本发明通过溶液核磁(NMR)法和圆二色谱法对芋螺多肽Bu8的结构进行了确证。结果表明：Bu8多肽含有典型的半胱氨酸框架(C-C-CC-C-C)及保守的三对二硫键连接方式(Cys1-Cys16，Cys8-Cys20和Cys15-Cys25)，Bu8多肽的6-8，20-21，24-25位点残基形成三个β-片层结构。
本发明通过全细胞膜片钳法对芋螺多肽Bu8的作用靶点、选择性进行了研究。结果表明：芋螺多肽Bu8可特异性作用于N-型钙离子通道(图3和图4)，IC50值为0.089(0.085-0.093)μM，MVIIA多肽的IC50值为0.208(0.180-0.239)μM，芋螺多肽Bu8的抑制活性是MVIIA多肽的2倍；芋螺多肽Bu8的选择性良好，对其它亚型钙通道作用弱，对电压门控钠、钾离子通道无明显作用，10μM的芋螺多肽Bu8对P/Q-型钙通道电流抑制率为27.36±4.48％，对L-型钙通道抑制率为2.82±1.02％，对电压门控钠通道的抑制率为0.87±1.10％，对电压门控钾通道的抑制率为3.20±1.70％。
本发明分别采用小鼠热板法和醋酸扭体法测定芋螺多肽Bu8的镇痛活性。结果表明：芋螺多肽Bu8对热敏感型疼痛的镇痛活性与MVIIA多肽相当(图5)；对化学疼痛的镇痛活性比MVIIA多肽强(图6)，是MVIIA多肽的2倍。
本发明分别采用金鱼毒性试验和小鼠疲劳转棒模型对芋螺多肽Bu8的副作用进行了研究。结果表明：芋螺多肽Bu8对金鱼的毒性与MVIIA多肽相当(图7)。对小鼠运动协调性影响显著小于MVIIA多肽(图8)。
本发明通过全细胞膜片钳法对芋螺多肽Bu8的衍生物的N-型钙离子通道活性进行了研究。结果表明：芋螺多肽Bu8与N-型钙离子通道结合的重要位点为Arg3、Arg9及Thr11，Loop 1中的Arg3协同Loop 2中的Arg9和Thr11，共同增强与N-型钙通道的结合活性，Thr11突变为Leu后对N-型钙通道的抑制活性增强(表1、图9)。
本发明发现，芋螺多肽Bu8及其衍生多肽选择性作用于N-型钙离子通道，对其它亚型钙离子通道作用弱，对电压门控钠、钾离子通道无明显作用，具有显著的镇痛活性，相对较低的毒性和不良反应。
附图说明
图1为Bu8多肽的溶液核磁结果，A为20种低能骨架重叠结构图；B为二硫键连接示意图，箭头处代表硫原子形成的二硫键。
图2为Bu8多肽及其衍生物的圆二色谱图。
图3为Bu8多肽和MVIIA多肽的剂量效应关系曲线图。
图4为Bu8多肽和MVIIA多肽的IC50值比较图。
图5为Bu8多肽、MVIIA多肽和生理盐水(Saline)在热致痛中的镇痛活性图(热板法)，显示脑室给药后对热致痛的耐受情况。
图6为Bu8多肽、MVIIA多肽和生理盐水(Saline)在醋酸致痛中的镇痛活性图，以柱状图的形式分别比较脑室给药后小鼠醋酸刺激诱导的扭体次数。
图7为Bu8多肽和MVIIA多肽的剂量对金鱼致死率的关系图。
图8为Bu8多肽、MVIIA多肽和生理盐水(Saline)对小鼠运动功能协调性的影响图；A、B分别为脑室给药0.5小时、2小时后的小鼠转棒实验结果。
图9为Bu8多肽的衍生物对N-型钙离子通道的抑制活性图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、芋螺多肽Bu8及其衍生多肽的合成
芋螺多肽Bu8，来源于泡芋螺(Conus bullatus)，又称Bu8多肽。芋螺多肽MVIIA，来源于幻芋螺(C.magus)，又称MVIIA多肽。
分别制备如下13条多肽(C末端均已进行乙酰化修饰)：
Bu8多肽(序列表的序列1)：CKRKGSSCRRTSYDCCTGSCRNGKC；
Bu8[R3A]多肽(序列表的序列2)：CKAKGSSCRRTSYDCCTGSCRNGKC；
Bu8[S6A]多肽(序列表的序列3)：CKRKGASCRRTSYDCCTGSCRNGKC；
Bu8[S7A]多肽(序列表的序列4)：CKRKGSACRRTSYDCCTGSCRNGKC；
Bu8[R9A]多肽(序列表的序列5)：CKRKGSSCARTSYDCCTGSCRNGKC；
Bu8[T11A]多肽(序列表的序列6)：CKRKGSSCRRASYDCCTGSCRNGKC；
Bu8[S12A]多肽(序列表的序列7)：CKRKGSSCRRTAYDCCTGSCRNGKC；
Bu8[N22A]多肽(序列表的序列8)：CKRKGSSCRRTSYDCCTGSCRAGKC；
Bu8[R3G]多肽(序列表的序列9)：CKGKGSSCRRTSYDCCTGSCRNGKC；
Bu8[R9S]多肽(序列表的序列10)：CKRKGSSCSRTSYDCCTGSCRNGKC；
Bu8[T11L]多肽(序列表的序列11)：CKRKGSSCRRLSYDCCTGSCRNGKC；
Bu8[S12M]多肽(序列表的序列12)：CKRKGSSCRRTMYDCCTGSCRNGKC；
Bu8[N22S]多肽(序列表的序列13)：CKRKGSSCRRTSYDCCTGSCRSGKC。
制备如下多肽(C末端已进行乙酰化修饰)：
MVIIA多肽：CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC。
本领域技术人员可以采用任意方法制备以上多肽。
例如，本领域人员可以通过Fmoc-固相肽合成法制备以上多肽。
具体来说，本实施例中制备多肽的方法如下：
1、线性多肽的合成
采用Zinsser Sofars合成仪。偶联体系为HOBt+HBTU+DIEA(本领域技术人员也可自行选择其他偶联体系)。Fmoc保护氨基酸、HOBt、HBTU均为上海吉尔生化公司产品，RinkAmide树脂为天津和成公司产品，DIEA为伊诺凯公司产品，其余试剂均采用国产色谱纯/分析纯试剂。Fmoc氨基酸侧链保护基：三苯甲基Trt(Cys、Asn)，叔丁基tBu(Ser、Thr、Tyr)，2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基Pbf(Arg)，叔丁氧羰基Boc(Lys)，叔丁酯OtBu(Asp)。
Rink Amide树脂在裂解液中室温搅拌3小时，过滤以除去树脂，旋转蒸发以除去大部分三氟乙酸，加入预冷的无水乙醚并4℃沉淀50min，然后过滤，收集滤液并进行冷冻干燥，即为线性多肽，-20℃密封保存。裂解液：由8.8mL三氟乙酸、0.50g DTT、0.50mL H2O和0.4mL三异丙基硅烷组成。
2、氧化折叠与富集
(1)将步骤1制备的线性多肽用去离子水溶解后加入折叠液中(每50mg线性多肽配比200-500ml折叠液)，4℃缓慢搅拌24-48h，期间用HPLC色谱监测折叠情况。折叠结束后，用冰醋酸调体系pH至4.0，即为产物溶液。折叠产物峰主要为单峰，易于纯化。折叠液：含0.5M乙酸铵、1mM GSH和0.1mM GSSG，余量为水，用氨水调节pH值为8.0。GSH全称为还原型谷胱甘肽。GSSG全称为氧化型谷胱甘肽。
(2)用反相高效液相色谱仪C18制备柱(Nucleosil，5μm，25mm×250mm)进行富集和除盐。具体方法：取步骤(1)的产物溶液，用0.45μm孔径的滤膜过滤并收集滤液，超声脱气；用含0.1％(体积比)三氟乙酸和95％(体积比)乙腈的水溶液以4mL/min的流速冲洗柱子25min，再用含0.1％(体积比)三氟乙酸的去离子水以4mL/min的流速平衡柱子25min；然后将超声脱气的产物溶液上样于反相柱，用含0.1％(体积比)三氟乙酸的去离子水以2.5mL/min洗脱50min(目的是去除盐及小分子)，最后用含0.1％(体积比)三氟乙酸和95％(体积比)乙腈的水溶液以4mL/min的流速洗脱目标多肽，在214nm波长处监测出峰情况，收集目标峰，通过减压旋蒸去除大部分乙腈，冻干，-20℃密封保存。
3、纯化与分析
将步骤2的产物用含0.1％(体积比)三氟乙酸的去离子水溶解后，采用反向高效液相色谱仪进行纯化。C18半制备柱，Kromasil，5μm，10mm×250mm，北京分析仪器厂。流动相A为含0.1％(体积比)三氟乙酸的去离子水，流动相B为含0.1％(体积比)三氟乙酸的乙腈。流动相由流动相A和流动相B组成。流动相的流速为3mL/min。洗脱过程：0-1min，流动相B占流动相的体积份数为5％；1-25min，流动相B占流动相的体积份数由5％线性上升至35％；25-28min，流动相B占流动相的体积份数由35％线性上升至95％。在230nm波长处监测出峰情况，收集目标峰，然后旋转蒸发除去大部分乙腈，然后冻干，即为多肽产物，-20℃密封保存待用。分析纯度，各多肽产物的纯度均大于95％。
多肽质谱由国家蛋白质科学中心(北京基地)测定，采用MicroTOF-Q II 10370质谱仪，离子源为电喷雾(ESI)。结果见表1，各肽的实测值与理论计算值相符。
实施例2、芋螺多肽Bu8及其衍生物的结构测定
本实施例中，利用溶液核磁(NMR)法测定芋螺多肽Bu8的溶液三维结构，利用圆二色谱法对芋螺多肽Bu8及其衍生物进行二级结构测定。
1、芋螺多肽Bu8的溶液核磁结构测定
Bu8的溶液核磁结构由中国科学院武汉物理与数学研究所姜凌教授测定，测定方法同文献方法(Yu,et al.Peptides.2016,81:15-20)。Bu8溶于90％H2O/10％D2O(体积比；pH3.5-4.0，用50mM磷酸钠调pH)。NOESY、TOCSY及DQF-COSY用a Bruker AVANCE Ⅲ 850MHz核磁仪在293K测定。距离约束计算包括76内部残基距离、76个序列距离及27个非序列距离，用程序Cyana(法兰克福大学)计算产生200个结构，选择其中20个能量最低的结构，能量优化程序为CNS4。
ω-芋螺毒素Bu8为球形结构，见图1的A。Bu8多肽含有典型的半胱氨酸框架(C-C-CC-C-C)及保守的三对二硫键连接方式(Cys1-Cys16，Cys8-Cys20和Cys15-Cys25)。NMR结果显示，Bu8含有三个不规则β-片层结构，由6-8，20-21，24-25位点残基形成，见图1的B。C1-C16和C15-C25之间的二硫键的连接形成N-、C-末端，C8-C20间的二硫键连接加强三股β片层结构的相互作用，Lys3和Ser6、Arg21和Lys24之间分别形成β-转角。
2、芋螺多肽Bu8及其衍生物的二级结构测定
配制多肽溶液35μmol/L(溶剂为0.01mol/L的磷酸缓冲液，pH＝7.2)，用圆二色谱仪(型号：Chirascan plus，应用光物理公司，英国)在室温(25℃)下测定园二色光谱，扫描波长λ范围为190～260nm，光程为1mm。设置磷酸缓冲液为空白对照，所有实验均重复3次。摩尔椭圆率图见图2。
理论上，多肽的α-螺旋二级结构在222nm、208nm处呈负峰，190nm附近为正峰，β-折叠在217-218nm处呈负峰，195-198nm为正峰。从图2可看出，Bu8多肽及其衍生物均在195nm附近有一个正峰，217nm附近有一个负峰，表明Bu8多肽及其衍生物均含有典型的β折叠，说明其构象相似。Bu8的NMR溶液结构显示其二硫键连接方式为“1-4,2-5,3-6”，由于Bu8衍生物的园二色谱类似，可以推断它们的二硫键排列方式一致。
实施例3、芋螺多肽Bu8的作用靶点测定及活性评价
本实施例利用全细胞膜片钳实验测定芋螺多肽Bu8对N-型钙离子通道的抑制活性。
采用HEK293T细胞进行实验。细胞培养条件：37℃、5％CO2。细胞培养基：含10％胎牛血清的Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)培养基。取24孔板，铺板HEK293T细胞(每孔约2×105个细胞)，采用Lipofectamine 2000转染试剂将N-型钙通道质粒α1B、N-型钙通道质粒α2δ1、N-型钙通道质粒β和及pEGFP-C1质粒共同转染HEK293T细胞(每孔转染质粒的总量约为2μg，上述四种质粒的质量配比依次为1：1：1：0.6)，培养24小时，然后将细胞转移至多聚-L-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上并培养6小时，进行膜片钳实验。N-型钙通道质粒α1B：addgene公司,货号为#26569。N-型钙通道质粒α2δ1：addgene公司,货号为#26575。N-型钙通道质粒β：addgene公司,货号为#26574。pEGFP-C1质粒：Clontech，#6084-1。
使用Axon 700B膜片钳系统进行全细胞膜片钳记录，包括MultiClamp 700B放大器、DigiData1440A数模转换器及Clampex 10.3数据采集分析系统(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)。所有实验均在室温下(25℃)进行。电极内液：含140mM CsCl、10mM NaCl、10mM HEPES、1mM EGTA，余量为水，用CsOH调pH至7.3。细胞外液：含135mM NMDG、20mMBaCl2·2H2O、2mM MgCl2·2H2O、10mM HEPES，余量为水，调pH至7.2。采用四步拉制法拉制硼硅酸盐玻璃电极并抛光，玻璃电极的电阻为2-5MΩ。通过显微操作使玻璃电极尖端和表达N-型钙离子通道蛋白的细胞形成高阻封接(电阻达到1GΩ以上)。设置周期性电刺激方法：钳制电位为-80mV，激发电压为+10mV，10s/周期，激发电压持续时间为200ms。以Ba2+为电流载体，记录每个周期的内向电流，采样率为5KHz，膜电流经2KHz低通滤波器整流。供试多肽加入至细胞外液中，设置不同的供试多肽浓度，每种浓度设置三个以上的平行处理。供试多肽为实施例1制备的Bu8多肽或MVIIA多肽。
抑制率(％)＝1-I/I0。剂量-响应曲线的数据点用平均值±标准误差的形式表示，按Hill方程进行拟合：I＝I0{[CToxin]nH/(IC50 nH+[CToxin]nH)}。其中I0为给药前的电流峰值，I为给药后电流峰值，[CToxin]为多肽浓度，IC50为半数有效浓度，nH为Hill系数。
不同多肽浓度下的抑制率见图3。Bu8多肽和MVIIA多肽的IC50值见图4。Bu8多肽的IC50值为0.089μM，95％置信区间为0.085-0.093μM。MVIIA多肽的IC50值为0.208μM。结果表明，Bu8多肽对N-型钙离子通道电流具有显著的抑制作用，抑制活性为MVIIA多肽的两倍。
实施例4、芋螺多肽Bu8的选择性
利用全细胞膜片钳实验，采用Wistar大鼠背根神经节(Dorsal Root Ganglion，DRG)细胞研究芋螺多肽Bu8对钠、钾离子通道的抑制活性。
从3-5周龄的雄性Wistar大鼠脊柱中急性分离DRG细胞，将细胞转移至多聚-L-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，37℃、5％CO2培养2小时，取直径为25-35μm的神经元细胞进行电生理实验。
使用Axon 700B膜片钳系统进行全细胞膜片钳记录，所有实验均在室温下(25℃)进行。玻璃电极的电阻为2-6MΩ。电极内液：含140mM K-gluconate、20mM KCl、10mM HEPES、5mM EGTA、2mM MgATP、0.3mM GTP-Na2，余量为水，用KOH调pH至7.2。细胞外液：含145mMNaCl、10mM HEPES、10mM glucose、4mM MgCl2、2.5mM KCl、1mM EGTA，余量为水，用KOH调pH至7.3。设置周期性电刺激方法：电压门控钠通道钳制电位为-120mV，激发电压为-20mV；电压门控钾通道钳制电位为-90mV，激发电位为+40mV；10s/周期，激发电压持续时间为180ms。记录每个周期的膜电流，采样率为5KHz，膜电流经2KHz低通滤波器整流。供试多肽加入至细胞外液中，浓度为10μM，设置三个以上的平行处理。供试多肽为实施例1制备的Bu8多肽。
给药后的钠离子通道电流、钾离子通道电流几乎完全与空白对照电流重合。芋螺多肽Bu8对DRG细胞的钠离子通道的抑制率为0.87±1.10％，芋螺多肽Bu8对DRG细胞的钾离子通道的抑制率3.20±1.70％，表明芋螺多肽Bu8对钠、钾通道无抑制活性。
实施例5、芋螺多肽Bu8的镇痛活性
供试多肽为实施例1制备的Bu8多肽或MVIIA多肽。
一、采用热板法测定芋螺多肽Bu8的镇痛活性
热板法实验使小鼠足部受到热刺激引发生疼痛，产生舔足反应，以小鼠发生第一次舔足反应时间为镇痛指标。
采用SPF级昆明小鼠，雌性，18-22g，北京维通利华实验动物技术有限公司(SCXK(京)2016-0011)。Bu8多肽设置三个剂量组(3μg多肽/kg体重、1μg多肽/kg体重、0.33μg多肽/kg体重)，均给予Bu8多肽溶液(溶剂为生理盐水)。MVIIA多肽设置三个剂量组(3μg多肽/kg体重、1μg多肽/kg体重、0.33μg多肽/kg体重)，均给予MVIIA多肽溶液(溶剂为生理盐水)。设置阴性对照组，用生理盐水代替多肽。给药方式均为脑室给药，给药体积均为10μl。实验前将小鼠放在恒温热板上(保持55℃)，筛选基础痛阈值为7～18秒的小鼠，并将其随机分组，每组12只。分别记录小鼠给药0.5小时、1小时、2小时、3小时和4小时后的第一次舔足时间。小鼠60秒不舔足设为最大值，超过60秒将小鼠从热板上移去。
结果见图5。Bu8多肽的热板镇痛活性与MVIIA多肽相当。给药30分钟后，镇痛活性达到最高。给药剂量为3μg/kg时，Bu8多肽和MVIIA多肽的痛阈为60秒(镇痛率为100％)，给药4小时后，镇痛效果仍维持最高值。给药剂量为1μg/kg时，Bu8多肽与MVIIA多肽的镇痛效果相当(P>0.05)。给药剂量为0.33μg/kg时，给药30分钟后Bu8多肽的镇痛效果高于MVIIA多肽(P<0.05)。各个给药组的镇痛活性均与生理盐水组存在明显差异(P<0.05)。
二、利用醋酸扭体法测定芋螺多肽Bu8的镇痛活性
小鼠腹腔注射0.4ml 1％(体积比)醋酸水溶液，刺激腹膜产生疼痛，外在表现为小鼠腹部肌肉收缩，身体拉伸扭动。小鼠在一段时间范围内的扭体次数可以反映疼痛的程度。
采用SPF级昆明小鼠，雄性，18-22g，北京维通利华实验动物技术有限公司(SCXK(京)2016-0011)。将小鼠随机分为9组，每组12只。
Bu8多肽设置三个剂量组(3μg多肽/kg体重、1μg多肽/kg体重、0.33μg多肽/kg体重)，均给予Bu8多肽溶液(溶剂为生理盐水)。MVIIA多肽设置三个剂量组(3μg多肽/kg体重、1μg多肽/kg体重、0.33μg多肽/kg体重)，均给予MVIIA多肽溶液(溶剂为生理盐水)。设置阴性对照组，用生理盐水代替多肽。给药方式均为脑室注射，注射体积均为10μl。各组给药20分钟后每只小鼠腹腔注射0.4ml 1％(体积比)醋酸水溶液，观察并记录小鼠腹腔注射醋酸5-20分钟间的扭体次数。
结果见图6。Bu8多肽对醋酸引起的化学疼痛的镇痛活性高于MVIIA多肽。给药剂量为0.33μg/kg时，Bu8多肽的镇痛率是MVIIA多肽的2倍(镇痛率分别为27.5％和63.1％)。给药剂量为1μg/kg时，Bu8多肽的镇痛率约为MVIIA多肽的3倍(镇痛率分别为26.9％和75.6％)。给药剂量为3μg/kg时，Bu8多肽和MVIIA多肽的镇痛活性相当(镇痛率分别为73.0％和75.6％)。
实施例6、芋螺多肽Bu8的毒副作用
供试多肽为实施例1制备的Bu8多肽或MVIIA多肽。
一、利用金鱼毒性实验评价芋螺多肽Bu8的毒性
用生理盐水作为溶剂，制备6种浓度的Bu8多肽溶液及6种浓度的MVIIA多肽溶液，作为供试溶液。设置12组，每组12只草金鱼(体重2g±0.2g)，分别给予不同供试溶液。注射6μl供试溶液至草金鱼的背部肌肉，统计4小时内金鱼死亡只数，采用SPSS软件计算半数致死剂量(LD50)。结果见图7。
MVIIA多肽和Bu8多肽的LD50值分别为0.2μg/只、0.3μg/只。结果表明，芋螺多肽Bu8对金鱼毒性低于MVIIA多肽。
二、利用疲劳转棒实验评价芋螺多肽Bu8对小鼠运动协调性的影响
ω-芋螺多肽的不良反应主要是对N-型钙离子通道的非特异性选择而导致的中枢神经抑制症状。主要的临床表现为共济失调、眼球震颤、头晕、木僵等。疲劳转棒实验可反应药物对中枢神经抑制的情况。本实验采用YLS-4C型转棒式疲劳仪(济南益延科技发展有限公司)，通过红外感应监测小鼠落棒，小鼠脑室给药后由于药物作用，协调能力变差，在棒时间将明显缩短。
采用SPF昆明小鼠，雌雄各半，18-22g，北京维通利华实验动物技术有限公司(SCXK(京)2016-0011)。Bu8多肽设置三个剂量组(0.9nmol多肽/kg体重、3nmol多肽/kg体重及9nmol多肽/kg体重)，均给予Bu8多肽溶液(溶剂为生理盐水)。MVIIA多肽设置三个剂量组(0.9nmol多肽/kg体重、3nmol多肽/kg体重及9nmol多肽/kg体重)，均给予MVIIA多肽溶液(溶剂为生理盐水)。设置阴性对照组，用生理盐水代替多肽。给药方式为脑室注射，给药体积为6μl。随机分组，每组8-10只。实验前小鼠需进行在棒训练，以熟悉转棒环境，转速为10rpm，180秒/天，训练三天。最后一天淘汰在棒时间少于120秒/天的小鼠。分别在给药30分钟、2小时后，测定小鼠在棒时间，转速为30rpm。在棒时间超出180秒的按180秒计算。实验数据采用t检验进行统计分析，结果以平均值±标准误差表示。
结果见图8。图8A为给药半小时后，图8B为给药2小时后。给药半小时后：当剂量为0.9nmol/kg时，给予Bu8多肽和给予MVIIA多肽的小鼠在棒时间分别为(125.18±23.19)s，(32.09±7.52)s，差异极显著(P<0.005)；当剂量为3nmol/kg时，给予Bu8多肽和给予MVIIA多肽的小鼠在棒时间分别为(39.00±11.62)s、(9.9±1.71)s，差异显著(P<0.01)；当剂量为9nmol/kg时，给予Bu8多肽和给予MVIIA多肽的小鼠在棒时间分别为(17.00±5.72)s和(5.64±1.24)s，差异显著(P<0.05)。给药2小时后：低、中、高剂量组Bu8多肽和MVIIA多肽的小鼠在棒时间分别为(157.45±15.32)s和(101.73±15.02)s、(75.64±14.48)s和(41.82±8.29)s、(29.8±10.81)s和(21.64±6.84)s，低、中剂量组差异显著，高剂量组小鼠在棒时间相当。总分的来说，芋螺多肽Bu8对小鼠运动协同性影响小于MVIIA多肽。
实施例7、芋螺多肽Bu8衍生物的N-型钙通道抑制活性
供试多肽为实施例1制备的14种多肽。
方法同实施例3。
IC50值结果见表1。抑制率和IC50值结果见图9。
表1 Bu8各衍生物对N-型钙通道的半数抑制浓度IC50(μM)
一、芋螺多肽Bu8功能性氨基酸突变体的N-型钙通道抑制活性
Bu8[S6A]、Bu8[S7A]、Bu8[S12A]、Bu8[N22A]对N-型钙离子通道抑制作用的IC50与芋螺多肽Bu8的IC50差异较小，说明Ser6、Ser7、Ser12和Asn22位点的氨基酸对N-型钙离子通道的结合活性影响较小。Bu8[R3A]、Bu8[R9A]、Bu8[T11A]对N-型钙离子通道抑制作用的IC50，与芋螺多肽Bu8的IC50相比抑制活性分别降低1倍、4倍和9倍，表明Arg3、Arg9及The11是与N-型钙通道结合的功能性氨基酸。
二、芋螺多肽Bu8与MVIIA混合突变体的N-型钙通道抑制活性
Bu8[R3G]、Bu8[R9S]、Bu8[S12M]对N-型钙离子通道抑制作用的IC50抑制活性均低于芋螺多肽Bu8。Thr11突变为Leu后抑制活性增强。Bu8[N22S]对N-型钙通道抑制作用的IC50与芋螺多肽Bu8相近。
上述结果表明芋螺多肽Bu8与N-型钙离子通道结合重要位点为Arg3、Arg9及Thr11，Loop 1中的Arg3协同Loop 2的Arg9和Thr11，共同增强与N-型钙通道的结合活性。Thr11突变为Leu后对N-型钙通道的抑制活性增强。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 芋螺多肽Bu8及其衍生多肽的应用
<130> GNCYX190586
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> Conus bullatus
<400> 1
Cys Lys Arg Lys Gly Ser Ser Cys Arg Arg Thr Ser Tyr Asp Cys Cys
1 5 10 15
Thr Gly Ser Cys Arg Asn Gly Lys Cys
20 25
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 2
Cys Lys Ala Lys Gly Ser Ser Cys Arg Arg Thr Ser Tyr Asp Cys Cys
1 5 10 15
Thr Gly Ser Cys Arg Asn Gly Lys Cys
20 25
<210> 3
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 3
Cys Lys Arg Lys Gly Ala Ser Cys Arg Arg Thr Ser Tyr Asp Cys Cys
1 5 10 15
Thr Gly Ser Cys Arg Asn Gly Lys Cys
20 25
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 4
Cys Lys Arg Lys Gly Ser Ala Cys Arg Arg Thr Ser Tyr Asp Cys Cys
1 5 10 15
Thr Gly Ser Cys Arg Asn Gly Lys Cys
20 25
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 5
Cys Lys Arg Lys Gly Ser Ser Cys Ala Arg Thr Ser Tyr Asp Cys Cys
1 5 10 15
Thr Gly Ser Cys Arg Asn Gly Lys Cys
20 25
<210> 6
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 6
Cys Lys Arg Lys Gly Ser Ser Cys Arg Arg Ala Ser Tyr Asp Cys Cys
1 5 10 15
Thr Gly Ser Cys Arg Asn Gly Lys Cys
20 25
<210> 7
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 7
Cys Lys Arg Lys Gly Ser Ser Cys Arg Arg Thr Ala Tyr Asp Cys Cys
1 5 10 15
Thr Gly Ser Cys Arg Asn Gly Lys Cys
20 25
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 8
Cys Lys Arg Lys Gly Ser Ser Cys Arg Arg Thr Ser Tyr Asp Cys Cys
1 5 10 15
Thr Gly Ser Cys Arg Ala Gly Lys Cys
20 25
<210> 9
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 9
Cys Lys Gly Lys Gly Ser Ser Cys Arg Arg Thr Ser Tyr Asp Cys Cys
1 5 10 15
Thr Gly Ser Cys Arg Asn Gly Lys Cys
20 25
<210> 10
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 10
Cys Lys Arg Lys Gly Ser Ser Cys Ser Arg Thr Ser Tyr Asp Cys Cys
1 5 10 15
Thr Gly Ser Cys Arg Asn Gly Lys Cys
20 25
<210> 11
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 11
Cys Lys Arg Lys Gly Ser Ser Cys Arg Arg Leu Ser Tyr Asp Cys Cys
1 5 10 15
Thr Gly Ser Cys Arg Asn Gly Lys Cys
20 25
<210> 12
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 12
Cys Lys Arg Lys Gly Ser Ser Cys Arg Arg Thr Met Tyr Asp Cys Cys
1 5 10 15
Thr Gly Ser Cys Arg Asn Gly Lys Cys
20 25
<210> 13
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 13
Cys Lys Arg Lys Gly Ser Ser Cys Arg Arg Thr Ser Tyr Asp Cys Cys
1 5 10 15
Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Lys Cys
20 25

Claims (10)

1.特异多肽在制备具有镇痛功能的产品中的应用；
所述特异多肽为如下(a)或(b)：
(a)序列表的序列1所示的多肽；
(b)将序列表的序列1所示的多肽进行1至3个氨基酸残基的突变得到的衍生多肽。
2.特异多肽在制备对N-型钙离子通道具有抑制作用的产品中的应用；
所述特异多肽为如下(a)或(b)：
(a)序列表的序列1所示的多肽；
(b)将序列表的序列1所示的多肽进行1至3个氨基酸残基的突变得到的衍生多肽。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述(b)为：将序列表的序列1所示的多肽进行1个氨基酸残基的突变得到的衍生多肽。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述(b)中，发生突变的位置不为：第1位氨基酸残基、第8位氨基酸残基、第15位氨基酸残基、第16位氨基酸残基、第20位氨基酸残基、第25位氨基酸残基。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述(b)中，发生突变的位置为：第3氨基酸残基、第6位氨基酸残基、第7位氨基酸残基、第9位氨基酸残基、第11位氨基酸残基、第12为氨基酸残基、第22位氨基酸残基。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述(b)中所述多肽为序列表的序列2至序列13中任一所述的多肽。
7.如权利要求1至6中任一所述的应用，其特征在于：所述产品为药品。
8.将序列表的序列1所示的多肽进行1至3个氨基酸残基的突变得到的衍生多肽。
9.一种具有镇痛功能的产品，其有效成分为权利要求1至6中任一所述的特异多肽。
10.一种对N-型钙离子通道具有抑制作用的产品，其有效成分为权利要求1至6中任一所述的特异多肽。
CN201910284230.8A 2019-04-10 2019-04-10 芋螺多肽Bu8及其衍生多肽的应用 Active CN110075272B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910284230.8A CN110075272B (zh) 2019-04-10 2019-04-10 芋螺多肽Bu8及其衍生多肽的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910284230.8A CN110075272B (zh) 2019-04-10 2019-04-10 芋螺多肽Bu8及其衍生多肽的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110075272A true CN110075272A (zh) 2019-08-02
CN110075272B CN110075272B (zh) 2022-08-02

Family

ID=67414603

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910284230.8A Active CN110075272B (zh) 2019-04-10 2019-04-10 芋螺多肽Bu8及其衍生多肽的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110075272B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1280136A (zh) * 2000-07-10 2001-01-17 刘建宁 欧米加－海螺毒素变体多肽的基因序列、氨基酸序列以及它们的制备方法和医药用途
US20030119731A1 (en) * 2000-07-21 2003-06-26 University Of Utah Research Foundation Omega-conopeptides
WO2008054171A1 (en) * 2006-11-04 2008-05-08 Anygen Co., Ltd. Omega conotoxins
WO2011032233A1 (en) * 2009-09-21 2011-03-24 The University Of Queensland Novel omega conotoxin peptides
WO2016101275A1 (zh) * 2014-12-26 2016-06-30 深圳华大基因研究院 芋螺毒素肽κ-CPTx-btl02、其制备方法及应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1280136A (zh) * 2000-07-10 2001-01-17 刘建宁 欧米加－海螺毒素变体多肽的基因序列、氨基酸序列以及它们的制备方法和医药用途
US20030119731A1 (en) * 2000-07-21 2003-06-26 University Of Utah Research Foundation Omega-conopeptides
US20040132663A1 (en) * 2000-07-21 2004-07-08 University Of Utah Research Foundation Omega-conopeptides
WO2008054171A1 (en) * 2006-11-04 2008-05-08 Anygen Co., Ltd. Omega conotoxins
CN101557820A (zh) * 2006-11-04 2009-10-14 安奈根株式会社 ω芋螺毒素
WO2011032233A1 (en) * 2009-09-21 2011-03-24 The University Of Queensland Novel omega conotoxin peptides
WO2016101275A1 (zh) * 2014-12-26 2016-06-30 深圳华大基因研究院 芋螺毒素肽κ-CPTx-btl02、其制备方法及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HU,H.等: "RecName: Full=Omega-conotoxin-like Bu8; Flags: Precursor", 《UNIPROTKB/SWISS-PROT: P0CY66.1》 *
戴秋云: "芋螺毒素的毒理学和药理学研究", 《中国药理学与毒理学杂志》 *
赵重甲等: "芋螺镇痛多肽研究进展", 《药学学报》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110075272B (zh) 2022-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2617646C2 (de) Nonapeptid-amide und Decapeptid-amide mit Gonadoliberin-Wirkung, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Präparate
Bury et al. Biological activity of carbon-terminal partial sequences of substance P
DE69433090T2 (de) Conotoxine, die an den acetylcholinrezeptor anbinden
WO1998036765A1 (en) Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear and cyclo-depsipeptides dolastatin 16, dolastatin 17, and dolastatin 18
NZ516030A (en) Compositions and methods for treatment of sexual dysfunction using MSH analogs containing the sequence His-Phe-Arg-Trp
WO2017181898A1 (zh) 一类阿片和神经肽ff受体的多靶点肽类分子及其制备和应用
CN104530199B (zh) 一种抗肿瘤多肽及其制备方法和应用
CN108676072A (zh) 一种具有抗Aβ42蛋白聚集功能的多肽及其应用与编码该多肽的基因
CN109106942B (zh) 一种可通过血脑屏障的多肽在制备药物中的应用
EP2523968B1 (de) Zyklische peptide zur regulierung von vektoriellen ionenkanalen
DE2822951A1 (de) Neue polypeptide mit thymusaktivitaet oder antagonistischer aktivitaet und verfahren zu ihrer herstellung
EP0502874A1 (de) Neue vom neuropeptid y abgeleitete peptide
CN1044101A (zh) 从一种蜘蛛毒液分离的多肽
US11261222B2 (en) Transdermal peptide with nuclear localization ability and use thereof
CN100516218C (zh) 一种新的线纹芋螺毒素序列、制备方法及其应用
CN110075272A (zh) 芋螺多肽Bu8及其衍生多肽的应用
CN108359001B (zh) 芋螺毒素突变体多肽lv1c-AA及应用和制备方法
CN102875654B (zh) 芋螺毒素多肽Eb1.6的制备方法
CN111606975B (zh) 从棕色扁海绵中提取的环肽类化合物及其制备方法与用途
CN104530120B (zh) 一种磷酸肌酸钠化合物及其晶型
EP0700928A1 (de) Nukleinsäuren-bindende Oligomere für Therapie und Diagnostik
DE3700166A1 (de) In der 6-stellung einen aromatischen aminocarbonsaeurerest aufweisende nonapeptidaethylamide beziehungsweise decapeptidamide, verfahren zur herstellung derselben und diese enthaltende arzneimittel beziehungsweise vermehrungsbiologisch wirksame mittel sowie ihre verwendung
AU671118B2 (en) Tachykinin antagonist tricyclic compounds, preparation of same and pharmaceutical compositions containing such compounds
CN115073556A (zh) 一类阿片/神经肽ff受体多靶点环肽分子及其制备和应用
CA2710952C (en) Compositions and methods for treating erectile dysfunction

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant