CN102875654B

CN102875654B - 芋螺毒素多肽Eb1.6的制备方法

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Publication number: CN102875654B
Application number: CN201210361425.6A
Authority: CN
Inventors: 戴秋云; 徐艳; 董铭心; 余硕; 刘珠果; 王孝花; 周尚民; 李海涛; 代琴
Original assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2012-09-25
Filing date: 2012-09-25
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2032-09-25
Also published as: CN102875654A

Abstract

本发明涉及一种芋螺毒素多肽Eb1.6的制备方法。本发明公开了一种制备芋螺多肽Eb1.6的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：1）采用缩合剂DIC/HOBt合成Eb1.6线性肽；2）折叠所述线性肽，即得到芋螺多肽Eb1.6。本发明的方法首先采用缩合剂DIC/HOBT提高了手工合成线性肽的效率；再选取pH值为8.0、浓度为0.1MNH₄HCO₃缓冲液作为折叠缓冲液，不仅价廉易得，而且折叠率高；再将折叠得到的产物经过AmberliteXAD16大孔吸附树脂进行吸附、乙醇浸洗，浸洗液浓缩后可直接用于后续的C18柱纯化，同时乙醇洗涤后的树脂用水洗涤再生，此步骤可实现缓冲体系及树脂的反复循环使用，回收率较高，降低了成本。

Description

芋螺毒素多肽Eb1.6的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种芋螺毒素多肽Eb1.6的制备方法。

背景技术

芋螺属腹足纲软体动物，全世界约有500余种，遍布世界各暖海区，我国有芋螺100多种，主要分布在西沙群岛、海南岛及台湾海域。芋螺多肽是由芋螺毒液管和毒囊内壁的毒腺所分泌，每种芋螺的毒液中含50-200个活性多肽，不同品种芋螺所含的活性肽各不相同，即使同种芋螺因海域不同，其毒素成分也可存在差异，理论上估计约存在5万多种不同活性的多肽（McIntosh JM，Jones RM.Toxicon，2001，39：1447-1451.）。α-芋螺多肽（α-CTX）属于芋螺多肽A超家族，特异作用于肌肉型或神经元型nAChRs。绝大多数α-芋螺多肽含12-18个氨基酸、两对二硫键（CCXmCXnC，连接方式为1-3，2-4）。根据m，n的数目不同，α-芋螺多肽细分为α3/5，α4/3，α4/4，α4/6，α4/7亚家族。目前发现某些α-芋螺多肽具有镇痛活性，其中α-芋螺多肽Vc1.1(GCCSDPRCNYDHPEICONH2)是来自维多利亚芋螺（Conus Victoriae），由16个氨基酸组成，含两对二硫键（二硫键的排列方式为1-3，2-4）（Sandall et al.Biochemistry，2003，42：6904-6911.）。研究表明Vc1.1在神经性疼痛动物模型中表现出了较好的镇痛活性并具有加速损伤神经恢复的作用（Satkunanathan et al.Brain Res.，2005，1059：149-158），2006年已进入临床研究阶段。α-芋螺多肽作用的靶点与传统镇痛药物的靶点不同，且不成瘾，这对开发新一代镇痛药物具有重要意义。

Eb1.6（GCCSNPACMLKNPNLC-NH₂，序列1）来自中国南海西沙群岛黑星芋螺，由-芋螺毒素信号肽保守序列克隆得到，其序列与已报道的α-芋螺毒素显著不同。前期初步研究表明，该肽对大鼠神经病理性疼痛模型具有很强的镇痛作用（刘珠果等..型芋螺多肽及其应用，中国发明专利申请号：ZL201010121879.7）。前期合成Eb1.6采用仪器合成，缩合剂为N,N’-二环己基碳二酰亚胺（DCC）/1-羟基苯并三唑（HOBt），偶合率高。但该方法不利于手工大量合成，因为缩合剂DCC反应后形成不溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）或二氯甲烷（DCM）的N,N’-二环己基脲（DCU），给缩合反应及树脂洗涤带来不便。另外，Eb1.6线性肽折叠成目标物质采用C18柱反相吸附，乙腈洗脱，成本高。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备芋螺多肽Eb1.6（GCCSNPACMLKNPNLC-NH₂）的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1）采用缩合剂DIC/HOBt合成Eb1.6线性肽；2）折叠Eb1.6线性肽得到多肽粗品；

3）纯化所述多肽粗品；即得到芋螺多肽Eb1.6。

上述方法中，采用缩合剂DIC/HOBt合成Eb1.6线性肽包括如下步骤：先用Fmoc保护氨基酸、以Rink树脂为固相载体、DIC/HOBt为缩合剂、哌啶为脱保护剂，从C端依次偶联合成，得到肽树脂；再将所述肽树脂裂解得到Eb1.6线性肽。其中，Fmoc保护氨基酸为Fmoc-Cys(Trt)–OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH。

上述合成Eb1.6线性肽方法中，摸索选用了缩合剂苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）/HOBt/异丙基二乙胺（DIEA），发现仪器与手工合成目标肽均较杂，产率低。最后采用缩合剂DIC/HOBT，仪器合成与手工合成的效率均很高。

上述合成Eb1.6线性肽方法中，步骤1）中，所述Rink树脂和每一个所述Fmoc保护氨基酸的摩尔比为1:4。

上述方法中，折叠Eb1.6线性肽按照包括如下步骤的方法进行：

（a）将Eb1.6线性肽在浓度为0.1-0.3M、pH值为8.0-8.4的缓冲液中折叠；所述缓冲液为碳酸氢铵缓冲液或醋酸铵缓冲液或Tris缓冲液；

（b）将经步骤（a）得到的折叠产物经AmberliteXAD16大孔吸附树脂吸附后，用无水乙醇浸洗，收集浸洗产物，即得到多肽粗品。

上述方法中，所述纯化所述多肽粗品按照包括如下步骤的方法进行：将所述多肽粗品用C18反相HPLC柱纯化，得到芋螺多肽Eb1.6。

上述步骤（a）中的缓冲液具体为浓度为0.25M NH₄Ac缓冲液、浓度为0.2MNH₄HCO₃缓冲液、浓度为0.1M NH₄HCO₃缓冲液或浓度为0.1M Tris-HCl缓冲液，pH值均为8.0~8.4。由于Eb1.6线性肽含有4个半胱氨酸，分子内折叠形成两对二硫键的产物才具有活性，因此对折叠线性肽所需的缓冲溶液进行筛选，发现Eb1.6在NH₄HCO₃、NH₄Ac或Tris缓冲体系缓冲液（pH=8.0~8.4）形成一个主要产物峰，而考虑到规模生产成本，且NH₄HCO₃折叠液价廉易得。因此，在本发明的实施例中采用的缓冲液为浓度为0.1M NH₄HCO₃缓冲液，pH值具体为8.0。上述折叠时间为18h。

在步骤（b）中，在所述收集浸洗产物步骤后，还包括如下步骤：将所述浸洗产物旋蒸浓缩去除乙醇、冻干，得到多肽粗品。

由于Eb1.6线性肽溶解度低，给折叠后多肽的回收、纯化带来不便。文献中多对二硫键多肽的折叠产物富集一般采用C18反相吸附，乙腈或甲醇洗脱，溶剂消耗量大，成本高（K.Sandra,et al.Anal.Bioanal.Chem.,2006,385:671-677），因此，在本发明的实施例中，采用AmberliteXAD16大孔吸附树脂对Eb1.6折叠产物进行吸附，乙醇浸洗，浸洗液浓缩后可直接用C18柱纯化；乙醇洗涤后的树脂用水洗涤再生。此方法可实现缓冲体系及树脂的反复循环使用，回收率较高，降低了成本。AmberliteXAD16大孔吸附树脂也可以用其他离子交换大孔吸附树脂替换。

由上述的方法制备得到的芋螺多肽Eb1.6也是本发明保护的范围。

本发明的实验证明，本发明合成多肽Eb1.6的过程中，首先采用缩合剂DIC/HOBT提高了手工合成线性肽的效率；再选取pH值为8.0、浓度为0.1M NH₄HCO₃缓冲液作为折叠缓冲液，不仅价廉易得，而且折叠率高；再将折叠得到的产物经过AmberliteXAD16大孔吸附树脂进行吸附、乙醇浸洗，浸洗液浓缩后可直接用于后续的C18柱纯化，同时乙醇洗涤后的树脂用水洗涤再生，此步骤可实现缓冲体系及树脂的反复循环使用，回收率较高，降低了成本；最后通过纯化得到大量合成多肽。该多肽Eb1.6的二硫键配对方式正确，且具有高的镇痛活性。

附图说明

图1为不同缩合剂对Eb1.6线性肽合成效率的影响

图2为折叠缓冲液对Eb1.6线性肽折叠的影响

图3为Eb1.6裂解后的HPLC分析图

图4为Eb1.6折叠后的HPLC分析图

图5为Eb1.6反相高效液相色谱纯化后HPLC分析图

图6为Eb1.6两步折叠法测二硫键的HPLC分析图

图7为静脉注射不同剂量的Eb1.6后2小时的镇痛效果

图8为静脉注射不同剂量的Eb1.6后4小时的镇痛效果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例多肽Eb1.6的氨基酸序列为序列表中的序列1，且C端酰胺化，GCCSNPACMLKNPNLC-NH₂）。

下述实施例中HPLC分析如无特殊说明，分析条件均如下：Kromasil C18柱（4.6mm×250mm，北京分析仪器厂)，洗脱梯度：0～1min,5～10%B；1～25min,10～50%B；25～28min,50～95%B；A为含0.1%TFA的H₂O，B为含0.1%TFA的乙腈（ACN）；流速1ml/min。

DIC化学名称为N,N'-异丙基碳二酰亚胺。

实施例1、芋螺多肽Eb1.6的规模制备

一、芋螺多肽Eb1.6规模制备的条件摸索

1、不同缩合剂对Eb1.6线性肽手工固相合成效率的影响

Eb1.6线性肽的前期合成采用仪器合成，在433A多肽合成仪（ABI美国应用系统生物公司仪器）上进行，使用Fmoc保护的氨基酸(上海吉尔生化有限公司)和取代率为0.60mmol/g的Rink树脂，缩合剂为DCC/HOBt。反应体系中，树脂与氨基酸的摩尔比为1:5，每次合成0.1mmol肽树脂，偶合率高（图1-A）。但该方法不利于手工大量合成，因为缩合剂DCC反应后形成不溶于N，N-二甲基甲酰胺（DMF）或二氯甲烷（DCM）的N,N’-二环己基脲（DCU），给缩合反应及树脂洗涤带来不便。

因此进一步摸索适于手工固相合成的缩合剂：

Eb1.6线性肽合成的过程如下：

采用Fmoc保护氨基酸(Fmoc-Cys(Trt)–OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH)、取代率为0.60mmol/g的Rink树脂、哌啶脱保护，缩合剂分别采用HBTU/HOBt/DIEA和DIC/HOBt；树脂与氨基酸的摩尔比为1:4，每次合成10mmol。上述线性肽合成方法与后面实验二中步骤1的线性Eb1.6线性肽的合成基本相同，不同的是合成量10mmol，且采用的缩合剂分别为HBTU/HOBt/DIEA和DIC/HOBt，HPLC分析。

结果缩合剂采用HBTU/HOBt/DIEA合成的目标肽非常杂，目标峰附近出现了两个很大的杂峰（结果与图1B无显著差异）；缩合剂采用DIC/HOBt合成的目标肽，目标峰附近只有很小的杂质峰（图1D）。采用DIC/HOBt为缩合剂合成肽树脂的粗产率为94.6%，裂解后线性肽的粗产率为107.8%，粗产率大于100%原因是粗肽中含有水、TFA、有机溶剂等杂质引起，线性肽纯度约为63.6%。

为了排除手工合成与仪器合成可能差别：采用DIC/HOBt、HBTU/HOBt/DIEA缩合剂进行试验仪器合成，结果如图1B和1C所示，1B为HBTU/HOBt/DIEA，1C为DIC/HOBt；看出HBTU/HOBt/DIEA的效果仍很差，排除了手工合成与仪器合成可能差别。

因此，采用缩合剂DIC/HOBt，仪器合成（图1C）与手工合成（图1D）（10mmol）线性肽的效率均很高，目标峰附近只有较少的杂质峰，因此可以采用缩合剂DIC/HOBt手工合成得到的线性肽Eb1.6。

2、折叠缓冲液对Eb1.6线性肽折叠的影响

在pH=8.0的0.25M NH₄Ac、0.2M NH₄HCO₃、0.1M NH₄HCO₃、0.1M Tris-HCl缓冲体系，分别加入线性肽Eb1.6至肽浓度为0.2mg/mL，室温（25℃）搅拌18h进行氧化折叠，HPLC分析。

结果如图2所示，为不同折叠缓冲液对Eb1.6线性肽折叠的影响，A、B、C、D分别为在pH=8.0的0.25M NH₄Ac、0.2M NH₄HCO₃、0.1M NH₄HCO₃、0.1M Tris.HCl缓冲体系中折叠的HPLC分析图，发现Eb1.6线性肽在上述缓冲体系中折叠效率均高。结合规模折叠时成本考虑，选用比较廉价易得的0.1M NH₄HCO₃作为缓冲体系。

上述pH=8.0的0.1M NH₄HCO₃缓冲体系按照如下方法制备：在20mL去离子水中加入0.16g碳酸氢铵搅拌溶解，再用盐酸调节pH=8.0即得20mL pH=8.0的0.1MNH₄HCO₃缓冲体系。

二、芋螺多肽Eb1.6的规模制备

1、Eb1.6线性肽的合成

采用Fmoc保护氨基酸(Fmoc-Cys(Trt)–OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH)、缩合剂DIC/HOBt、Rink树脂、哌啶脱保护，自C端起依次偶联合成，树脂与每一个Fmoc保护氨基酸的摩尔比为1:4；具体合成方法以40mmol Eb1.6线性肽手工固相合成步骤为例描述如下：

1）肽树脂合成

40mmol（66.67g）取代率为0.60mmol/g的Rink树脂加入1升固相反应腔，用250mL左右的二氯甲烷（DCM）浸泡3h；用20%哌啶/DMF分别脱保护两次（10min、30min）；依次用200mL的DMF、甲醇（MeOH）、DCM、DMF、DCM、DMF（3次）洗涤5min；然后加入活化的Fmoc-Cys(Trt)-OH（160mmol，93.712g）(溶于300mlNMP，加入DIC（108mmol，26.28mL，1.05eq）/HOBt（176mmol，23.7812g，1.1eq），在冰浴下活化1h)，振荡(220r/min)6h；茚三酮检测阴性后，用约200mL的DMF，DCM，DMF，DCM，DMF（2次）洗涤5min，即完成了第一个氨基酸Cys的连接。然后按上述方法及多肽序列依次连接剩余氨基酸，缩合时间24小时，缩合后均进行茚三酮检测，若树脂呈蓝色，需进行封闭操作。

封闭液为乙酸酐(20mmol，30.25mL，8.0eq)/340mmol DIEA(320mmol，58.2mL，8.5eq)/NMP(约250mL)，25℃振荡1h，洗涤顺序同上。最后一个氨基酸Gly连接完毕后，用20%哌啶/DMF脱除Fmoc基两次（10min、30min），再用250ml的DMF，MeOH，DCM，DMF，DCM，DMF，DCM（3次）依次洗涤，抽干。

晾干后得肽树脂199.3g，粗产率为94.6%，合成量为40mmol。

2）肽树脂的裂解

199.3g肽树脂的裂解加入99.7mL 1,2-乙二硫醇（EDT）/39.8mL H₂O、39.8mL三异丙基硅烷（TIS）/1773.8mL三氟乙酸（TFA）裂解3h，减压蒸除TFA等裂解液，加入冷却的无水乙醚约5L搅拌，静置1h后，抽滤，无水乙醚洗涤三次，晾干，得线性多肽Eb1.6粗品72g。

裂解后线性多肽Eb1.6粗品的HPLC分析，结果如图3所示，得到线性多肽Eb1.6粗品。

2、规模氧化折叠

1）氧化折叠

40L不锈钢桶中加入36L 0.1M NH₄HCO₃缓冲液（pH=8），机械搅拌下加入8克由1得到的线性多肽Eb1.6粗品，折叠（搅拌）18小时，折叠产物（折叠液）HPLC分析。结果如图4所示，可看到为一主要目标峰。

2）折叠产物富集

向折叠产物中加入400克AmberliteXAD16大孔吸附树脂（北京慧德昌科技有限责任公司），吸附3h，滤出树脂，先用蒸馏水洗涤3次，然后用0.5升无水乙醇浸洗3次，合并浸洗液，旋蒸浓缩并冻干，得到目标多肽Eb1.6粗品。

目标多肽Eb1.6粗品的回收率为82.3%，取部分多肽Eb1.6冻干进行规模纯化。

3、产品纯化工艺

将上述2得到的目标多肽Eb1.6选用动态轴向压缩柱（Kromasil C18，10μm（5cm×40cm）），江苏汉邦科技有限公司）进行反相液相色谱纯化，上样量：350mgEb1.6粗品，将其溶于100ml 5%乙腈水溶液，离心后上样。上样速度：5ml/min。流速：30ml/min。A为含0.1%TFA的H₂O，B为含0.1%TFA的ACN。洗脱梯度：Time为0~70min、B%为2%~46%、检测波长214nm，收集目标肽，浓缩后冻干，得到纯化多肽Eb1.6。一次纯化得纯度98.5%的目标肽150毫克。

将上述纯化多肽Eb1.6经HPLC分析，结果如图5所示，得到纯化多肽Eb1.6。

实施例2、多肽Eb1.6的检测

上述由实施例1得到的纯化多肽Eb1.6经过测序，氨基酸序列为序列表中的序列1，再将该多肽进行如下进一步检测：

1、多肽Eb1.6二硫键的测定

多肽Eb1.6二硫键的测定采用两步折叠法:

首先合成线性肽Eb1.6(合成方法同上述实施例1实验二的步骤1)，第一步空气氧化折叠形成第一对二硫键（Cys1-Cys3），然后碘氧化出去Acm保护基形成第二对二硫键（Cys1-Cys3，Cys2-Cys4），第一步氧化折叠条件为：0.1M Tris-HCl缓冲液，pH=7.7，磁力搅拌约28h，HPLC分析折叠进程。折叠充分，用稀醋酸终止反应，富集脱盐冻干后，进行下一步折叠。第二步氧化折叠条件：10mM碘液与0.4mg/mL的第一步折叠产物等体积混合，避光反应10min后，加入适量抗坏血酸溶液终止反应，HPLC分析产物情况，富集冻干纯化。将两步折叠产物与一步折叠产物混合进样，进行HPLC分析，判断多肽的二硫键连接方式。

结果如图6所示，可以看出，Eb1.6二硫键的连接方式为“Cys1-Cys3，Cys2-Cys4”。

2、多肽Eb1.6镇痛活性的测定

规模合成多肽Eb1.6的镇痛活性用大鼠坐骨神经松扎模型（CCI，Bennett GJ，XieYK.Pain，1988，33：87-107）进行验证。大鼠（雄性，体重200-220g，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供）麻醉后，在股段中部切开皮肤和肌肉，暴露坐骨神经干。将约2厘米的神经游离出来，并用2-0号丝线在其上作4道较松的结扎，结扎间距约2毫米，结扎程度以神经有形变但不影响神经被膜血管流通为准（在40倍放大镜下观察）。然后，以4-0号缝合线肌肉和皮肤均用棉线缝合，一周后拆线。手术七天后使用Ugo 37215型压痛仪测试大鼠痛阈值，痛阈值下降40%以上者视为建模成功大鼠。

将建模成功的大鼠分成5组，每组8只：第一组为阳性对照组（吗啡5mg/Kg+加巴喷丁100mg/Kg），吗啡采用皮下注射1mg(0.1mL），加巴喷丁采用灌胃给药的方式0.2mg(0.18mL)；第二至四组分别为实施例1中实验二得到的纯化多肽Eb1.6的三个不同剂量组（1μg/Kg、4.98μg/Kg和49.8μg/Kg），用生理盐水（0.9%）配制，浓度分别为50μg/mL、5μg/mL、1μg/mL，静脉注射剂量均为0.2mL（大鼠体重均约为200g）；第五组为阴性对照组，注射0.2mL浓度为0.9%的生理盐水。给药前和给药2h、4h后，测试大鼠痛阈值，实验设三次重复。实验数据采用Micrsoft Excel软件和软件origin6.0绘图处理，计算痛阈提高率，公式为：（给药后痛阈值-给药前痛阈值）/给药前痛阈值，用平均值±标准差表示。

结果如图7和图8所示，图7为静脉注射不同剂量的Eb1.6后2小时的镇痛效果，图8为静脉注射不同剂量的Eb1.6后4小时的镇痛效果；可见，静脉给予Eb1.64.98μg/Kg和49.8μg/Kg 2小时后，大鼠痛阈提高率分别为46.8%±9.2和57.4%±17.8，显著高于给予阳性对照药物组（39.7%±11.4）。给药4小时后，痛阈提高率分别为26.1%±14.8、36.8%±15.9、39.1%±8.9均高于阳性对照组（19.0%±11.0）。

上述结果表明，采用本发明的方法合成的多肽Eb1.6二硫键连接正确，且具有高的镇痛活性。

Claims

1.一种制备芋螺多肽Eb1.6的方法，包括如下步骤：1）采用缩合剂DIC/HOBt合成Eb1.6线性肽；2）折叠Eb1.6线性肽得到多肽粗品；3）纯化所述多肽粗品；即得到芋螺多肽Eb1.6；

所述采用缩合剂DIC/HOBt合成Eb1.6线性肽包括如下步骤：先用Fmoc保护氨基酸、以Rink树脂为固相载体、DIC/HOBt为缩合剂、哌啶为脱保护剂，从C端依次偶联合成，得到肽树脂；再将所述肽树脂裂解得到Eb1.6线性肽；

所述Rink树脂和每一个所述Fmoc保护氨基酸的摩尔比为1:4；

所述折叠Eb1.6线性肽按照包括如下步骤的方法进行：

（a）将所述Eb1.6线性肽在浓度为0.1-0.3M、pH值为8.0-8.4的缓冲液中折叠；所述缓冲液为碳酸氢铵缓冲液或醋酸铵缓冲液或Tris缓冲液；

（b）将经步骤（a）得到的折叠产物经AmberliteXAD16大孔吸附树脂吸附后，用无水乙醇浸洗，收集浸洗产物，即得到多肽粗品；

其中，芋螺多肽Eb1.6的氨基酸序列为序列表中的序列1。