CN101688210B - 促红细胞生成素融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明涉及重组融合蛋白，其中促红细胞生成素(EPO)通过其C-末端与Fc片段连接，并且其中所述重组融合蛋白在该融合蛋白的伯胺处被进一步氨甲酰化。更具体而言，本发明涉及氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白，其中所述融合蛋白的至少一个、优选两个或更多个赖氨酸胺残基和/或N-末端氨基酸被氨甲酰化。与未修饰的EPO-Fc融合蛋白相比，本发明的氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白具有降低的造血活性，而其组织再生活性，即神经细胞再生活性保持不变或甚至得到增强。本发明还涉及制造这样的融合蛋白的方法以及包含所述融合蛋白的药物组合物，并且涉及这些融合蛋白及药物组合物在医疗上的应用。

Description

促红细胞生成素融合蛋白

技术领域

本发明涉及其中促红细胞生成素(EPO)与蛋白载体尤其是与抗体或抗体片段例如Fc片段连接的重组融合蛋白，其中所述重组融合蛋白被进一步氨甲酰化。本发明还涉及所述融合蛋白的制造方法和含有所述融合蛋白的药物组合物，以及所述融合蛋白和药物组合物在医疗上的应用。

背景技术

促红细胞生成素(EPO)是一种公知的糖蛋白，最初因其对骨髓的激素性影响和参与成熟血红细胞的生长与发育而被鉴定。除这种造血活性之外，最近已发现EPO还在许多组织中作为有效的、局部生成的改善代谢应激的分子而起作用。EPO的组织保护活性通过与促红细胞生成素受体的相互作用而介导。例如，在脑部，EPO和它的受体于局部产生，受到代谢应激物的调控，并提供神经保护和抗炎的功能(Doggrell，SA.(2004)Expert Opin Investig Drugs；13(11)：1517-9)。在脊髓中，EPO提供的有益效果包括抑制神经元、少突胶质细胞和内皮细胞的凋亡和坏死，减少空化，降低脂质过氧化、动员内皮祖细胞，促进血管发生和恢复血管的自我调节(Gorio，A.等(2002)Proc Natl Acad Sci USA；99(14)：9450-5；LeistM.(2004)Science；305(5681)：239-42)。已经证实，EPO通过核因子(NF)-κB通路的成员的调控，以及由janus激酶-2/信号转导物和转录5系统的活化剂而进行信号转导(Gorio A.(2005)Neurosurgery；56(4)：821-7；GrassoG.(2005)Neurosurgery；56(4)：821-7)。

通过化学修饰，即，EPO的赖氨酸和/或N-末端氨基酸的至少一个伯胺基的氨甲酰化，与未经氨甲酰化的EPO相比，该细胞因子的造血活性显著降低，同时其组织保护活性，即其神经细胞再生活性保持基本不变或者甚至得到增强。

WO 2006/014466和WO 2006/002646公开了用于各种医学适应症的氨甲酰化EPO的制造和应用。

由于EPO的血清半衰期相对较短，并且本领域公知将免疫球蛋白恒定区与非免疫球蛋白的蛋白融合可显著地延长所述非免疫球蛋白的蛋白的血清半衰期，因此已有数种方法被用于将免疫球蛋白片段与EPO连接。例如，WO 99/02709揭示了包含EPO和免疫球蛋白Fc部分的融合蛋白的生产与应用，其中EPO-Fc融合蛋白的体内半衰期与天然存在的EPO相比得到增加。

从WO2005/063808可知，通过特定氨基酸的突变、缺失或插入可进一步改善EPO-Fc融合蛋白的药代动力学，即，延长血清半衰期并提高体内效能。

因此，对治疗疾病的需求是简化的且花费更低的EPO疗法，即，需要更低频率的EPO施用，其中理想的是EPO的组织再生活性(即神经细胞再生活性)不变或甚至增强，而同时需要较少或甚至不需要EPO的造血活性，因此将造血活性降低。这些疾病包括但不限于中枢神经系统(CNS)和/或周围神经系统(PNS)的功能异常或损害，特别是包括与神经损伤相关或由神经损伤引起的疾病，所述的神经损伤包括例如机械撞击后的物理神经损坏。

发明内容

因此，本发明的一个目的是通过化学修饰(即，氨甲酰化)来改善与非融合EPO蛋白相比具有延长的血清半衰期的已知EPO-Fc融合蛋白，从而获得经修饰的EPO-Fc融合蛋白，该经修饰的EPO-Fc融合蛋白除了具有延长的血清半衰期之外，与未修饰的EPO-Fc融合蛋白相比还具有减少的造血活性，但仍具有不变的或者增强的再生活性。

本发明所述的经修饰EPO-Fc融合蛋白适用于治疗中枢神经系统(CNS)和/或周围神经系统(PNS)的疾病或功能异常，包括由例如机械撞击、热或辐射导致的神经物理损坏所引起的或相关的疾病。本发明的经修饰EPO-Fc融合蛋白的优势特征之一是与用于相同目的的传统EPO或EPO-Fc相比可施用更大治疗剂量，并且基本上不增加对造血系统即血球计数的不利影响。

相应地，本发明的一个目的是提供经修饰的重组EPO融合蛋白，其中EPO与蛋白载体连接，特别是与免疫球蛋白或免疫球蛋白片段如Fc片段连接，更特别是与IgG分子的Fc部分连接，并且其中所述重组融合蛋白通过氨甲酰化被进一步修饰。

本发明的另一个目的是提供所述氨甲酰化重组EPO-Fc融合蛋白的制备方法。

本发明的另一个目的提供包含所述氨甲酰化重组EPO-Fc融合蛋白的药物组合物。

本发明的另一方面涉及所述氨甲酰化重组EPO-Fc融合蛋白对于医疗的应用。

本发明的另一方面涉及包含所述氨甲酰化重组EPO-Fc融合蛋白的药物组合物对于医疗的应用。

从属权利要求进一步描述了本发明的特征，而本发明各实施方式是独立权利要求的主题。

附图说明

图1显示了挫伤后的大鼠在施用本发明的氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白后运动恢复的测定结果。纵座标＝Beattie-Bresnahan-Basso(BBB)量表；横坐标＝在挫伤前、后选取的时间点；praeOP＝挫伤前；第1组＝以rhEPO蛋白处理的动物(对照)；第2组＝未处理的动物(安慰剂组)；第3组＝以未氨甲酰化的EPO-Fc融合蛋白处理的动物(比较组)；第4组＝以氨甲酰化的EPO-Fc融合蛋白处理的动物(实验组)；第5组＝以甲泼尼龙处理的动物(比较组)。

图2显示了在实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)小鼠模型中，在EAE进展的不同阶段通过确定EAE评分对氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白的效果的评估结果。

纵座标＝实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)评分量表；横坐标＝开始施用之后的天数；图2A＝早期处理：以氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白(测试组；第1组)或PBS(对照组；第2组)处理的动物，施用在EAE诱发后第18天开始；图2B＝中期处理：以氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白(测试组；第3组)或PBS(对照组；第4组)处理的动物，施用在EAE诱发后第28天开始；图2C＝晚期处理：以氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白(测试组；第5组)或PBS(对照组；第6组)处理的动物，施用在EAE诱发后第52天开始。小鼠分组安排的详细信息见表2。图2A至2C显示了各组所用动物的平均EAE评分。

具体实施方式

本发明的第一实施方式提供了化学修饰(即氨甲酰化)的重组EPO-Fc融合蛋白，其与未融合的EPO蛋白相比具有显著延长的血清半衰期，同时，与未修饰的EPO-Fc融合蛋白相比具有降低的造血活性，此外，其神经细胞再生活性与未修饰的EPO或EPO Fc融合蛋白的相应活性相比不变甚至得到改善。

此处所用“EPO-Fc融合蛋白”是指包含EPO部分和Fc部分的蛋白。此处所用“EPO部分”包含人或其它来源的全长野生型或天然存在的促红细胞生成素，以及促红细胞生成素样分子，所述促红细胞生成素样分子包括促红细胞生成素生物活性片段、促红细胞生成素的类似物、变体、突变体和衍生物。此处所用“Fc部分”包含来源于免疫球蛋白(优选来源于人免疫球蛋白)恒定区的域，包括恒定区的片段、类似物、变体、突变体或衍生物。合适的免疫球蛋白包括IgG，即，IgG 1、lgG2、lgG3和lgG4等亚类，以及其它类别。

此处涉及的促红细胞生成素的“生物活性”应理解为EPO或EPO样分子与促红细胞生成素受体相互作用的能力。

生物活性EPO样分子通常与野生型或天然存在的EPO的相应序列具有关键氨基酸序列相似性或同一性(例如从至少55％至约65％、75％、80％，甚至高达约90％～95％的同一性)，并具有野生型EPO的一种或更多种功能。

此处所用“生物活性片段”是指能发挥与全长蛋白相似的生物学效果的片段。这些片段可通过氨基端和羧基端缺失以及内部缺失来产生。它们还包括促红细胞生成素的截短形式和杂合形式。“截短”形式是一个或更多个N末端和/或C末端残基缺失的促红细胞生成素的较短变种。

本发明的EPO-Fc融合蛋白可以用不同方式连接起来。可以将Fc部分通过其C-末端与EPO部分的N-末端连接，即，EPO-Fc融合蛋白的Fc部分接近EPO-Fc融合蛋白的N-末端；或如本发明所优选，Fc部分通过其N-末端与EPO部分的C-末端连接。

此外，EPO部分和Fc部分可末端对末端地直接融合在一起，也可以通过在EPO部分和Fc部分之间插入的接头(例如肽接头)间接融合在一起。

相应地，本发明的第一方面涉及与EPO相比在体内具有改善的生理学半衰期和降低的造血活性、并还具有体内神经再生活性的重组EPO融合蛋白，该融合蛋白的特征在于其包含人IgG分子的Fc部分和促红细胞生成素(EPO)部分、优选人促红细胞生成素部分，其中Fc部分通过其N-末端与EPO部分的C-末端直接连接，并且其中所述融合蛋白通过氨甲酰化进行修饰。

一般而言，蛋白的氨甲酰化通常作为蛋白纯化中使用尿素的副作用而发生并且是高尿素血清水平导致的结果，这是由于尿素自发分解为氰酸盐。氰酸盐导致伯胺(包括蛋白中的伯胺)的氨甲酰化，并且容易与蛋白(例如EPO糖蛋白)中赖氨酸的和N-末端氨基酸的自由氨基残基发生反应。由氰酸盐引起的氨甲酰化过程依赖于pH，并且也可以通过包括精氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸等蛋白的其它氨基酸发生，不过发生的程度较低。

制备性氨甲酰化通过预定量的氰酸盐与预定量的蛋白反应进行。氨甲酰化的程度取决于氰酸盐与蛋白之间的反应时间，以及氰酸盐和/或目标蛋白的浓度。

在另一方面本发明涉及这样EPO-Fc融合蛋白，其中所述融合蛋白的至少一个、优选两个或更多个赖氨酸残基和/或N-末端氨基被氨甲酰化。

本发明的氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白可以在Fc部分包含另外的修饰，例如，氨基酸突变如氨基酸插入、氨基酸缺失或者保守或非保守氨基酸取代。特别是，现有技术广泛公开了Fc部分中的氨基酸取代可通过降低或消除Fc受体结合或补体固定活性来进一步延长融合蛋白如EPO-Fc融合蛋白的血清半衰期。EPO-Fc融合蛋白还可以在促红细胞生成素部分有附加的修饰，例如氨基酸突变如氨基酸插入、氨基酸缺失、保守或非保守氨基酸取代或氨基酸去糖基化，这降低了对EPO受体的结合亲和力和/或增加了促红细胞生成素的生物活性。

一般而言，免疫球蛋白的恒定区被定义为与由木瓜蛋白酶消化产生的免疫球蛋白C-末端域同源的天然存在或合成的多肽。免疫球蛋白重链的恒定区可以包括重链恒定区1的域(CH1)、铰链区、重链恒定区2的域(CH2)和重链恒定区3的域(CH3)。

相应地，本发明的Fc部分可以包含铰链区、CH2和/或CH3域。Fc部分可以进一步包括完整或部分的铰链区、CH2和/或CH3域。

在另一方面，本发明涉及这样的EPO-Fc融合蛋白，其具有Fc部分，该Fc部分包含来自人IgG的铰链区、CH2域和CH3域。

在另一方面，本发明涉及这样的EPO-Fc融合蛋白，其中EPO部分和Fc部分之间的融合在铰链区完成。

一般而言，可使用本领域技术人员熟知的技术通过重组表达的方法生产本发明的EPO-Fc融合蛋白。为了获得糖基化模式与天然存在的EPO和免疫球蛋白基本相同的糖基化重组EPO-Fc融合蛋白，优选地使用真核细胞重组表达EPO-Fc融合蛋白。重组表达的蛋白作为单链多肽分泌到培养基中从而形成EPO-Fc融合蛋白单体，但是它们也可以以其中多肽链通过二硫键连在一起的二聚或多聚的形式分泌到培养基中。

在另一方面，本发明的涉及这样的EPO-Fc融合蛋白，其中两个EPO-Fc融合蛋白单体连接在一起形成同型二聚体。

可通过本领域公知的技术从细胞培养基中分离并进一步纯化所分泌的重组生成的蛋白。

在另一方面，本发明涉及氨甲酰化重组EPO-Fc融合蛋白的制备方法，所述融合蛋白包含人IgG分子的Fc部分和EPO部分，优选人EPO部分，其中所述Fc部分通过其N-末端与EPO部分的C-末端直接连接，该方法包括：

-制备编码EPO-Fc融合蛋白的DNA分子；

-用所述DNA分子转化宿主细胞；

-表达由所述DNA分子编码的所述EPO-Fc融合蛋白；

-收获所述EPO-Fc融合蛋白；

-纯化所述EPO-Fc融合蛋白；和

-使所述EPO-Fc融合蛋白与氰酸盐反应从而使EPO-Fc融合蛋白氨甲酰化，

其中所述融合蛋白的至少一个、优选两个或更多个赖氨酸残基和/或N-末端氨基酸被氨甲酰化。

本发明的EPO-Fc融合蛋白兼有优越的延长的血清半衰期和降低的造血活性，所述延长的血清半衰期通过EPO部分与免疫球蛋白的Fc部分的融合而获得，同时由于该蛋白的至少一个伯胺被氨甲酰化，从而EPO-Fc融合蛋白保持不变的甚至增强的神经细胞再生活性。

在另一方面，本发明涉及应用为药物的所述EPO-Fc融合蛋白。

一般地，无论何时需要以氨甲酰化EPO进行治疗时，所述EPO-Fc融合蛋白可代替氨甲酰化EPO蛋白使用。特别地，所述EPO-Fc融合蛋白可用于制造治疗中枢神经系统(CNS)和/或周围神经系统疾病的药物组合物。

例如，所述EPO-Fc融合蛋白可用于制造治疗下述疾病的药物组合物，所述疾病选自由中风、除中风以外的CNS缺血事件、挫伤、脊髓损伤、外伤性脑损伤和神经退行性疾病组成的组。

由于与氨甲酰化的非融合EPO蛋白相比本发明EPO-Fc融合蛋白的血清半衰期得以延长，因此含有所述EPO-Fc融合蛋白的药物组合物所需的施用频率低于含有氨甲酰化的非融合EPO蛋白的药物组合物。因此，对于需要这种治疗的患者而言使用本发明EPO-Fc融合蛋白的疗法更加轻松。

在另一方面，本发明涉及包含所述EPO-Fc融合蛋白的药物组合物，该药物组合物可选地还含有药用载体。

在另一方面，本发明涉及但不限于适于胃肠外施用的所述药物组合物。由于有效的EPO疗法需要EPO血清水平达到治疗水平，因此理想的是将所述药物组合物作为其中本发明的EPO-Fc融合蛋白以与药用载体物质的混合剂存在的注射溶液。在本发明的优选实施方式中，将所述药物组合物提供为适合静脉注射或皮下注射的盖伦形式(galenic form)。

在另一方面，本发明涉及用于治疗中枢神经系统(CNS)和/或周围神经系统疾病的所述药物组合物的应用。

在另一方面，本发明涉及所述药物组合物用于治疗下述疾病的应用，所述疾病选自由中风、除中风的CNS缺血事件、挫伤、脊髓损伤、外伤性脑损伤、和神经退行性疾病组成的组。

为了使此处描述的本发明得到更加充分地理解，阐述了以下实施例。这些实施例仅用于说明目的，而不应理解为在任何方面限制本发明。

实施例

实施例1：氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白的制备和表征

a)构建编码EPO-Fc融合蛋白的表达载体：

通过人EPO基因和人IgG 1铰链-CH2-CH3片段的融合PCR产生EPO-Fc融合蛋白。EPO位于构建体的N末端，并与人IgG1的铰链区融合。为了使蛋白分泌到培养上清液中的，使用了与EPO cDNA共同扩增的促红细胞生成素信号序列。这种构建使得能够分泌同型二聚EPO-Fc分子。

使用可获得576bp DNA片段的寡核苷酸epo back BamHI(被设计用于在DNA片段5′端添加唯一BamHI限制位点)和epo hyb hinge，通过PCR从质粒phEpo中扩增了人Epo cDNA(epo back BamHI：5′GGGGGATCCGCCATGGGGGTGCACGAATGTCC 3′[SEQ ID NO 1]；epo hyb hinge for：5′AGATTTGGGCTCTCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3′[SEQ ID NO 2])。用可获得671bp DNA片段的寡核苷酸CH3 for NotI(被设计用于在DNA片段3′端添加唯一NotI限制位点)和hinge hyb epo back通过PCR从质粒p2G12HC扩增了人IgG 1铰链-CH2-CH3片段(CH3 forNotI：5′GGGGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGG 3′[SEQ ID NO 3]；hinge hyb epo back：5′ACAGGGGACAGAGAGCCCAAATCTTGTGAC 3′[SEQ ID NO 4])：使用20ng质粒模板、各寡核苷酸10pmol、250μM核苷酸、1×PCR缓冲液和5单位热稳定Taq聚合酶，在50μl总体积中进行扩增。两个PCR反应都进行25个循环：94℃20秒，56℃30秒和72℃1分钟。

以Qiaquick纯化试剂盒(Qiagen)纯化2个片段之后，使用50ng的IgG 1铰链-CH2-CH3 cDNA、50ng EPO cDNA、250μM核苷酸、1×PCR缓冲液和5单位Taq聚合酶在50μl体积中进行融合PCR。在第一步完成6个循环：94℃20秒、60℃30秒和72℃1分钟。在加入各10pmol的外侧引物(epo back BamHI和CH3 for NotI)后，PCR继续进行25个循环：94℃20秒、56℃30秒和72℃1.5分钟。

然后用Qiagen的制备性凝胶提取试剂盒和凝胶提取试剂盒纯化PCR产物。将得到的EPO-Fc cDNA插入到包含人CMV(巨细胞病毒)启动子的经BamHI/NotI开放的真核表达载体中，并转化到E.coli菌株TG 1中。用10ng的EPO-Fc片段、5ng的pECMV载体、1单位的T4-连接酶和1×连接缓冲液(New England Biolabs)在10μl的总体积中，于37℃连接1小时。使用外侧引物进行PCR筛选以鉴定阳性克隆。最终质粒pCMV_EpoFc中的Epo-Fc cDNA的正确性经过序列和限制性分析得到证实。

b)EPO-Fc融合蛋白的表达和纯化：

用来自步骤a)的大规模质粒制备物(pCMV_EpoFc)转染二氢叶酸还原酶阴性CHO细胞。用比例为20∶1的两种质粒pCMV_EpoFc和p2_dhfr对细胞进行脂质体(lipofectin)转染。转染后24小时开始对转染细胞进行筛选(DMEM 4mM L-谷胺酰胺和10％经透析的FCS)，并当克隆开始生长时施加MTX压力(0.05μM和0.1μM MTX)。在筛选和分离出表现最好的克隆后，将培养转为无蛋白条件。从细胞存活率为80％的批量投料发酵物收获细胞上清液。

对上清液进行尺寸过滤(0.2μm的孔径)，并加入1M Tris使最终pH为8.5，然后通过以pH 8.5的0.025M Tris缓冲盐水平衡的蛋白A-Sepharose柱，用pH 3.5的0.1M甘氨酸洗脱。对洗脱产物流分的pH进行pH测量，如有必要，用pH 8.0的1M Tris调至pH 7.0～7.5。

c)氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白的生产：

本程序的起始原料是上述的纯化重组人EPO-Fc融合蛋白，通常包括培养上清液中存在的融合蛋白的所有同等型，这使得可以获得高产率的所需终产物。

首先通过超滤(例如10kD截流膜)将重组人EPO-Fc融合蛋白的蛋白浓度调整至4mg/mL～7mg/mL。将60mg/mg EPO-Fc融合蛋白溶解在pH8的0.6M硼酸钠缓冲液中制备KOCN-硼酸盐溶液。

然后将EPO-Fc融合蛋白溶液和KOCN-硼酸盐溶液按照1∶1的比例混合，将溶液在37℃孵育48小时。将氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白在PBS中用凝胶过滤(例如Sephadex G25)来最终配制(endformulate)。依照用ELISA方法确定的EPO-Fc融合蛋白的标准曲线通过OD_280nm确定了氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白的浓度。

接下来的氨甲酰化程度测定证实基本上所有自由氨基都被氨甲酰化。

实施例2：大鼠挫伤后运动恢复的测定

在动物实验中分析了氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白与未修饰的EPO-Fc融合蛋白相比的体内神经细胞再生活性。氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白和未修饰的EPO-Fc融合蛋白以实施例1公开的方法制备。

将35只重240g～260g的Sprague-Dawley大鼠分为5组，各组分别包括6只动物(第1组)、7只动物(第2、4、5组)或8只动物(第3组)。通过腹腔注射的Ketavet(110mg/kg)和Rompun(12mg/kg)的混合物将动物麻醉，之后在T-11节进行椎板切除术。在脊髓暴露后，使用IH400冲击器(Precision Systems & Instrumentation，Lexington，KY，USA)对实验动物进行150千达因(kdyne)的脊髓挫伤。损伤1小时后，使动物接受1单位剂量的各种蛋白的注射(见表1)。在挫伤事件发生后3天、1周、2周、3周、4周、5周和6周通过Basso-Beattie-Bresnahan评定量表对运动恢复进行评估。Basso-Beattie-Bresnahan评定量表是一种21分的量表，系统地详示了后肢的关节运动功能、步行能力，协调步行和躯干稳定性的精细控制程度。

表1：小鼠研究的分组安排

第1组	用1000单位/kg(相当于10μg/kg)重组人EPO(rhEPO)处理；对照组
		第2组	用腹腔注射NaCl处理；安慰剂组
第3组	用30μg/kg的rhEPO-Fc处理
		第4组	用30μg/kg的氨甲酰化的rhEPO-Fc处理
第5组	用30mg/kg的甲泼尼龙(MPSS)处理

动物暴露在开放的区域内，挫伤事件发生后3天、1周、2周、3周、4周、5周和6周进行为期5分钟的观察。图1公开了该实验所得的Basso-Beattie-Bresnahan量表的值。

所发现的是与对照组(第1组和第2组)相比，施用氨甲酰化rhEPO-Fc(第4组)和rhEPO-Fc(第3组)显著改善了运动的恢复。与此相反，使用甲泼尼龙处理的动物(第5组)与对照动物几乎没有任何差异。对照动物在约4周后达到稳定状态，并且没有显示任何进一步的再生性改善，而第3组和第4组的动物(分别施用EPO-Fc融合蛋白和氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白)在6周的恢复期内都显示出持续和显著的改善。

还发现与rhEPO-Fc(第3组)相比，施用氨甲酰化rhEPO-Fc(第4组)可显著改善了运动恢复，特别是在挫伤后短时间内。第3天，用rhEPO-Fc处理的动物后肢只有1或2个关节表现出大范围运动(分别为Basso-Beattie-Bresnahan评定量表的值2或3)，而用氨甲酰化rhEPO-Fc处理的动物的后肢至少有2个关节表现出大范围运动并且第三个关节表现出轻微运动或者后肢的全部三个关节都有大范围运动(分别为Basso-Beattie-Bresnahan评定量表的值6或7)。

实施例3：氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白在多发性硬化症小鼠模型中的效果的评估。

在动物实验中对氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白在实验性自体免疫脑脊髓炎(EAE)发展的早期、中期、晚期的体内效果进行了分析。可在啮齿类动物如小鼠中诱发的EAE是广为接受的类似于多发性硬化症(MS)的脱髓鞘紊乱的动物模型。EAE小鼠模型模拟了MS的典型复发和恢复过程。

该实验中所用的氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白按实施例1所述制备。

通过以髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG_35-55)进行免疫，在11只C57BL/6雌性小鼠中诱发EAE(Savino，C.等.(2006)J Neuroimmunol172(1-2)：27-37)。简要地说，在PBS中配制4mg/ml的MOG_35-55溶液。将热灭活的结核分枝杆菌(Difco H37RA)以8mg/ml的浓度悬浮在弗氏不完全佐剂(IFA)中。将悬浮液用MOG_35-55溶液乳化。然后对每只小鼠皮下注射100μl所述乳化液，每侧肋各注射50μl。最后，对每只动物静脉注射溶于PBS的250ng百日咳毒素两次，一次在免疫后立即进行，另一次在免疫后48小时后进行。

为分析氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白在EAE发展不同阶段的效果，将诱发出EAE的动物分为测试组(5只动物)和对照组(6只动物)。测试组的动物用50μg/kg体重剂量的氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白进行处理，而对照组只用PBS处理。从免疫后的18天(早期处理)、28天(中期处理)或52天(晚期处理)开始通过氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白或PBS的腹腔注射进行施用。此外，每个测试组和对照组都进一步被分为3个小组(见表2)。处理进行30天，动物每隔一天接受给药。

表2：小鼠研究的分组安排

监控动物的临床状况和疾病发展。此外，在治疗过程中每天通过根据表3(Buddeberg，B.S.等(2004)J Neuroimmunol 153(1-2)：158-70)所示的分级体系的EAE评分对动物显现的神经功能缺损进行定量评估。

表3：EAE评分

评分	疾病的临床症状
		0	无临床异常
0.5	部分尾部无力或肌张力轻微下降
		1	尾部无力
1.5	步态稍显笨拙
		2	后肢轻瘫
2.5	后肢轻瘫并且后肢部分拖行
		3	后肢瘫痪
3.5	后肢瘫痪并前肢轻瘫
		4	瘫痪(四肢)
5	濒死或死亡

图2A至2C显示了通过这些动物实验获得的EAE评分，其中各图显示了各组所用动物的平均评分。

与对照组(第2、4和6组)相比发现，施用氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白(第1、3和5组)可减少EAE发展的早期(图2A)、中期(图2B)和后期阶段(图2C)复发率。对照动物的EAE评分上下波动，对于以氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白处理的动物观测到，EAE评分即疾病的严重程度与处理开始时相比不再增高。

还发现与各自的对照相比，早期施用氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白(图2A)比晚期施用氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白(图2C)对EAE进展有更好的效果。更具体地说，从图2A中可以看出，在开始施用后第30天，氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白处理的动物(测试组)的平均评分减少65.2％，而对照动物的平均评分只减少46.1％。

这些实验的结果表明氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白对EAE发展的积极效果。

Claims (16)

1.一种重组EPO融合蛋白，所述蛋白与EPO相比在体内具有改善的生理学半衰期和降低的造血活性，并进一步具有体内神经再生活性，所述蛋白的特征在于它包含人IgG分子的Fc部分和促红细胞生成素(EPO)部分，其中所述Fc部分通过其N-末端与所述EPO部分的C-末端直接连接，并且其中所述融合蛋白通过氨甲酰化被修饰。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述促红细胞生成素(EPO)部分是人促红细胞生成素部分。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白的至少一个赖氨酸残基和/或N-末端氨基酸被氨甲酰化。

4.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白的两个或更多个赖氨酸残基和/或N-末端氨基酸被氨甲酰化。

5.如权利要求1～4中任一项所述的融合蛋白，其中，所述Fc部分包含来自人IgG的铰链区、CH2域和CH3域。

6.如权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合位于所述铰链区。

7.如权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白，其中，两个EPO-Fc融合蛋白单体结合在一起形成同型二聚体。

8.一种包含人IgG分子的Fc部分和EPO部分的氨甲酰化的重组EPO-Fc融合蛋白的制备方法，其中，所述Fc部分通过其N-末端与所述EPO部分的C-末端直接连接，所述方法包括：

制备编码EPO-Fc融合蛋白的DNA分子；

用所述DNA分子转化宿主细胞；

表达由所述DNA分子编码的所述EPO-Fc融合蛋白；

收获所述EPO-Fc融合蛋白；

纯化所述EPO-Fc融合蛋白；和

使一定量的氰酸盐与一定量的所述EPO-Fc融合蛋白反应从而将所述EPO-Fc融合蛋白氨甲酰化，

其中所述融合蛋白的至少一个赖氨酸残基和/或N-末端氨基酸被氨甲酰化。

9.如权利要求8所述的制备方法，其中，所述EPO部分是人EPO部分。

10.如权利要求8所述的制备方法，其中，所述融合蛋白的两个或更多个赖氨酸残基和/或N-末端氨基酸被氨甲酰化。

11.应用为药物的如权利要求1至7中任一项所述的融合蛋白。

12.如权利要求1至7中任一项所述的融合蛋白在治疗中枢神经系统(CNS)和/或周围神经系统疾病的药物组合物的制造中的应用。

13.如权利要求12所述的应用，其中所述疾病选自由中风、除中风的CNS缺血事件、挫伤、脊髓损伤、外伤性脑损伤和神经退行性疾病组成的组。

14.一种包含如权利要求1至7中任一项所述的融合蛋白以及药用载体的药物组合物。

15.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述组合物用于胃肠外施用。

16.如权利要求14所述的药物组合物，所述组合物被配制为注射溶液。

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