CN1403483A - 生物活性提高的人促红细胞生成素的Fc融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本文公开了一类在摩尔基础上，生物活性比rHuEPO更高的人EPO的Fc融合蛋白。这类HuEPO－L－vFc融合蛋白含有人EPO、约20个或更少氨基酸的柔性肽接头、和人IgG Fc变体。这种Fc变体无裂解性，且显示极小的不良Fc－介导的副作用。本文还公开了一种高表达水平制备或产生这类融合蛋白的方法。这类HuEPO－L－vFc融合蛋白表现出血清半衰期延长，且生物活性增加，从而改善药物动力学和药效，因此在一段时间内所需的注射次数较少。

Description

生物活性提高的人促红细胞生成素的Fc融合蛋白
发明背景
促红细胞生成素(EPO)是30.4千道尔顿的糖蛋白激素，其促进红细胞祖细胞的增生并维持它们分化成成熟的红细胞(参见，如Krantz，Blood，77：419-434，1991)。EPO在成年人的肾和胎儿的肝中产生。在成年人中，EPO主要是肾细胞应答缺氧或贫血而产生的，并在血流中循环。EPO靶向几乎只在骨髓红细胞祖细胞表面上的66kDa的特异性受体(EPO-Rc)。与EPO结合后，受体被激活，并发生同源二聚化，随后发生酪氨酸磷酸化。随后，发生一系列细胞内的信号转导，从而增加祖细胞的数量，并促进祖细胞成熟成红细胞(参见，如Lodish等人，ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.，60：93-104，1995)。
重组人EPO(rHuEPO)已广泛应用于在晚期和透析前阶段因肾病引起的慢性贫血患者的治疗中。施用EPO也已成功治疗了患者由癌症的化疗、类风湿性关节炎、HIV感染的AZT治疗和骨髓发育不良综合症所引起的贫血。
正常人血清中的EPO浓度为约0.01到0.03单位/ml。补充EPO是一种理想的对EPO产生减少的肾衰竭的治疗方法。静脉内注射(i.v.)的rHuEPO的血清清除半衰期约为4到13小时。皮下注射(s.c.)rHuEPO的血清最高浓度为注射后的5到24小时，清除半衰期为17小时。因此，相同剂量皮下注射比静脉内注射在血液中能有更长的保留时间。血清清除EPO的机制依旧不明。在动物试验中，肾排泄了5％都不到。而能迅速除去唾液基(asialated)的EPO的肝，未显示在清除EPO中起主要作用(参见，如Fried，Annu.Rev.Nutr.15：353-377，1995)。
IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质。它们的半衰期可高达21天。已有报道说将IgG的Fc区域与其它蛋白质(如各种细胞因子和可溶性受体)结合而形成融合蛋白(参见，如Capon等人，Nature，337：525-531，1989；Chamow等人，Trends Biotechnol.，14：52-60，1996；美国专利No.5,116,964和5,541,087)。原型融合蛋白是通过IgG Fc绞链区中的半胱氨酸残基连接的同源二聚体蛋白质，使蛋白质类似于IgG分子但无CH1区域和轻链。由于结构上的同源，Fc融合蛋白表现出与类似同种型的人IgG相当的体内药物动力学特性。这种方法已用于一些临床上很重要的细胞因子(如IL-2和IFN-α2a)和可溶性受体(如TNF-Rc和IL-5-Rc)(参见，如美国专利No.5,349,053和6,224,867)。为了延长EPO的循环半衰期和/或增加它的生物活性，通过如本发明所公开的和/或所述那样，制造含有与人IgG蛋白质的Fc区域相连的EPO的融合蛋白是有利的。
在大部分已报道的Fc融合蛋白分子中，绞链区作为Fc区域与细胞因子或可溶性受体(氨基末端)间的间隔，使这分子的这两部分功能分开(参见，如Ashkenazi等人，Current Opinion in Immunology，9：195-200，1997)。相对于EPO单体，由两个完整EPO功能域(所述功能域被3-或7-氨基酸肽接头分隔开)构成的融合蛋白显示减弱的活性(Qiu等，J.Biol.Chem.，273：11173-11176，1998)。然而，当两个EPO结构域之间的肽接头长达17个氨基酸时，二聚体EPO分子显示体外和体内活性客观的增强。已显示在小鼠中增强的活性是由于体外活性的增加，并且该活性具有不同的药物动力学特性(参见，如Sytkowski等人，J.Biol.Chem.，274：24773-24778，1999；美国专利号6,187,564)。在人EPO和Fc部分间带有合适肽接头的人EPO融合蛋白(HuEPO-L-Fc)比rHuEPO的活性高，HuEPO-L-Fc的体外活性至少是rHuEPO的2倍(以摩尔计)。本发明发现，在人EPO和人IgG Fc变体间添加的肽接头以两种方式提高HuEPO-L-Fc的体外生物活性：(1)使Fc区域远离EPO上的EPO-Rc结合位点，和(2)使一个EPO远离另一个EPO结构域，从而使两个EPO区域能分别与红细胞样细胞祖细胞上的EPO-Rc反应。对本发明而言，优选长度约为20个或更少氨基酸的柔性肽接头。优选使用包含两个或多个选自以下氨基酸的肽接头：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。
人免疫球蛋白的Fc区域在消灭病原体的免疫防御中起重要作用。IgG的效应子功能由Fc介导而通过两种主要机制：(1)与细胞表面Fc受体(FcγRs)的结合，导致通过抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)途径，由杀伤细胞通过吞噬作用或裂解作用而摄食病原体，或(2)与第一补体成分C1的C1q部分的结合，引发依赖于补体的细胞毒性(CDC)途径，从而裂解病原体。在四种人IgG同种型中，IgG1和IgG3能有效地结合FcγR。IgG4与FcγR的结合亲和力比IgG1或IgG3的低一个数量级，而IgG2与FcγR的结合低得难以测定。人IgG1和IgG3还能有效地结合C1q，并激活补体级联反应。人IgG2对补体的固定很弱，而IgG4似乎在激活补体级联反应的能力方面很有缺陷(参见，如Jefferis等人，Immunol.Rev.，163：59-76，1998)。对应用于人的治疗而言，当HuEPO-L-Fc结合于红细胞样细胞祖细胞表面上的EPO-Rc时，融合蛋白的Fc区域必须不能有不良效应子功能，因此不会裂解或除去这些祖细胞。因此，HuEPO-L-Fc的Fc区域必须是非裂解性的，即结合于FcγRs和C1q从而触发效应子功能方面，Fc区域必须是无活性的。显然，没有一种天然的IgG同种型适合产生HuEPO-L-Fc融合蛋白。为了得到非裂解性的Fc，必须使天然Fc区域中的一些氨基酸突变，以减少其效应子功能。
通过比较人和鼠的IgG同种型的氨基酸序列，已显示，CH2区域N末端附近的Fc部分在IgG Fc与FcγRs的结合中起作用。已用基因工程抗体证明在234位到237位基序的重要性(参见，如Duncan等人，Nature，332：563-564，1988)。氨基酸残基编号是按Kabat等人所述的EU编号体系(《SEQUENCESof PROTEINS of IMMUNOLOGICAL INTEREST》，第5版，United StatesDepartment of Health and Human Services，1991)。在四种人IgG同种型中，IgG1和IgG3与FcγRs的结合最好，且具有相同的序列Leu234-Leu-Gly-Gly237(图1仅显示了IgG1)。在以低亲和力与FcγRs结合的IgG4中，其序列含有单个氨基酸取代，即在234位上Phe取代Leu。在不结合FcγRs的IgG2中，有两个取代和一个缺失，从而形成Val234-Ala-Gly237(图1)。为了减少Fc与FcγR的结合和ADCC活性，用Ala替代IgG4中的Leu235(参见，如Hutchins等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：11980-11984，1995)。在此基序中已用IgG2序列中的Pro233-Val-Ala235替代Glu233-Leu-Leu235来改变IgG1。这种替代使IgG1变体在小鼠中失去了FcγR-介导的除去靶细胞的能力(参见，如Isaacs等人，J.Immunol.，161：3862-3869，1998)。
对FcγR与C1q结合至关重要的第二部分位于人IgG的CH2区域羧基端附近(参见，如Duncan等人，Nature，332：738-740，1988)。在四种人IgG同种型中，这部分中仅有一个位点显示取代：IgG4中的Ser330和Ser331替换了IgG1、IgG2和IgG3中的Ala330和Pro331(图1)。Ser330的存在不影响FcγR与C1q的结合。用Ser替代Pro331使IgG1失去了与C1q的结合亲和力，而用Pro替代Ser331部分保留了IgG4的补体固定活性(参见，如Tao等人，J.Exp.Med.，178：661-667，1993；Xu等人，J.Biol.Chem.，269：3469-3474，1994)。
我们发现，可以设计至少三种Fc变体(vFc)用于产生HuEPO-L-vFc融合蛋白(图1)。人IgG2不结合FcγR，但显示出弱的补体活性。具有Pro331Ser突变的Fcγ2变体应比天然Fcγ2的变体活性更低，而且仍旧不结合于FcγR。IgG4Fc在激活补体级联中有缺陷，且它与FcγR的结合亲和力比活性最高的同种型(IgG1)低约一个数量级。与天然Fcγ4相比，具有Leu235Ala突变的Fcγ4变体应表现出最小的效应子功能。具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的Fcγ1也表现出比天然Fcγ1低得多的效应子功能。这些Fc变体都比天然存在的人IgG Fc更适于制备EPO融合蛋白。在非裂解Fc的制备中也可引入其它替换，而不危及循环半衰期或导致不良的构型变化。
本发明有许多优点。血清中HuEPO-L-vFc融合蛋白增高的活性和存在时间的延长，能减低剂量以及减少注射的频率。血清中药物浓度波动的减少以意味着安全性和耐受性的改善。注射频率的减低能使患者有更好的顺应性和生活质量。因此具有非裂解Fc变体的HuEPO-L-vFc融合蛋白能显著地有助于治疗包括肾衰竭、癌症化疗、类风湿性关节炎、HIV感染的AZT治疗和脊髓发育不良综合征等病况导致的贫血。
发明简述
本发明的一方面涉及一种HuEPO-L-vFc融合蛋白。这种HuEPO-L-vFc融合蛋白含有人EPO、肽接头(以L表示)和人IgG Fc变体(以vFc表示)。较佳地，使用约20或更小氨基酸长度的柔性肽接头，该肽接头含有2个或多个以下氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。IgG Fc变体是非裂解性的，且与天然IgG Fc相比含有氨基酸突变。
本发明的另一实施例为人Ig Fc，它含有人IgG如人IgG1、IgG2和IgG4的绞链区、CH2和CH3区域。这种CH2区域在228、234、235和331位(由EU编号体系确定的位置)含有氨基酸突变，从而降低Fc的效应子功能。
在本发明的另一实施例中，公开了一种从哺乳动物细胞系如CHO衍生的细胞系制备或生产这种重组融合蛋白的方法。培养转染的细胞系，使得重组融合蛋白在其生长培养基中在24小时期间以超过10(较佳地为30)μg/百万细胞的水平下表达。这些HuEPO-L-vFc融合蛋白显示出更高的生物活性和更长的血清半衰期而无不良副作用，从而改善了药物动力学和药效，进而降低了实现类似药效所需的剂量和注射次数。
附图简述
图1显示了人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和它们变体的绞链区和CH2区域的氨基酸序列的比对。比较这三个部分：氨基酸区域228、234-237和330-331。用粗斜体显示这些变体的氨基酸突变。将EU编号体系用于氨基酸残基。
图2显示了分别在pEFP表达载体内HindIII-EcoRI片段的(A)HuEPO-L-vFcγ2、(B)HuEPO-L-vFcγ4，和(C)HuEPO-L-vFcγ1的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。氨基酸残基-27到-1是人EPO的前导肽。成熟蛋白含有人EPO(氨基酸残基1到165)、肽接头(氨基酸残基166到181)和Fc变体(vFcγ2的氨基酸残基182到409，vFcγ4的氨基酸残基182到410，和vFcγ1的氨基酸残基182到408)。在Fc区域中，粗体的核苷酸和相应的氨基酸变体还用下划线标出。
发明详述
1.构建编码HuEPO-L-vFcγ2融合蛋白的基因
融合蛋白是用数个DNA片段装配而成的。为了获得编码人EPO的前导肽和成熟蛋白的基因，用人胎肝或肾的cDNA文库(从Invitrogen，Carlsbad，CA获得)作为聚合酶链式反应(PCR)的模板。为了便于克隆，将引入限制性酶内切位点(HindIII)的SEQ ID NO：1用作5’寡核苷酸的引物。表1列出了用于克隆HuEPO-L-vFc融合蛋白的寡核苷酸序列。3’引物(SEQ ID NO：2)除去了EPO末端密码子并引入了BamHI位点。将得到的长度约为600bp的DNA片段插入到接受载体(如pUC19)的HindIII和BamHI位点，得到pEPO质粒。由DNA测序验证人EPO基因的序列。
用从人白细胞制备的RNA和合适的5’(SEQ ID NO：3)和3’(SEQ ID NO：4)引物，通过逆转录和PCR得到编码人IgG2的Fc区域(Fcγ2)的基因。将得到的含有IgG2的绞链、CH2和CH3区域完整序列的Fcγ2的DNA片段作为模板，产生Fcγ2Pro331Ser(vFcγ2)变体，其中Fcγ2中331位的Pro被Ser替代。为了引入此突变，产生两个片段，然后用天然Fcγ2作为模板在重叠PCR中将它们装配起来。用SEQ ID NO：3作为5’引物并用SEQ ID NO：5作为3’引物生成5’片段。用SEQ ID NO：6作为5’引物并用SEQ ID NO：4作为3’引物生成3’片段。然后用SEQ ID NO：7作为5’引物和SEQ ID NO：4作为3’引物，将这两个片段在覆盖Pro331Ser突变的区域连接起来。SEQ ID NO：7引物含有编码16氨基酸Gly-Ser肽接头(包括BamHI限制性内切酶位点)的序列。将得到的长度约为700bp的DNA片段插入接受载体(如pUC19)的BamHI和EcoRI位点，得到pL-vFcγ2质粒。用DNA测序验证该基因的序列。
为了制备HuEPO-L-vFcγ2融合基因，用HindIII和BamHI从pEPO质粒上切下EPO片段，然后用琼脂糖凝胶电泳纯化。然后将纯化的片段插入pL-vFcγ2质粒肽接头的5’末端，得到pEPO-L-vFcγ2质粒。该融合基因含有HuEPO、Gly-Ser肽接头和Fcγ2变体基因。
在EPO和Fc部分间存在的肽接头，增加了EPO区域的柔性，因而提高了其生物活性(见例如Sytkowski等，J.Biol.Chem.274：24773-8，1999)。对本发明而言，优选的是长度为约20个或更少氨基酸的肽接头。可使用含有2个或更多选自以下氨基酸的肽接头：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。一种肽接头的例子含有Gly-Ser肽构件，如GlyGlyGlyGlySer。图2A显示了融合基因，它含有编码HuEPO序列、16个氨基酸的肽接头(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGly GlySerGLyGlyGlyGlySer)和Fcγ2Pro331Ser变体的序列。
然后将编码HuEPO-L-vFc融合蛋白的完整基因插入哺乳动物表达载体如pcDNA3(Invitrogen)的HindIII和EcoRI位点。最终的表达载体质粒(称为pEFP2)含有在哺乳动物细胞中高水平表达所需的巨细胞病毒早期基因启动子-增强子。该质粒还含有可选择性标记基因，从而在细菌中赋予氨苄青霉素抗性，而在哺乳动物细胞中赋予G418抗性。另外，当宿主细胞DHFR基因表达缺陷时，pEFP2表达载体含有二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，从而能在氨甲蝶呤(MTX)存在下共扩增HuEPO-L-vFγ2融合基因和DHFR基因(见例如美国专利No.4,399,216)。
2.编码HuEPO-L-vFcγ4融合蛋白的基因的构建
由于绞链区域中重链间二硫键的解离，人IgG4部分会形成被视为半抗体的分子。而这种情况在其它三种人IgG同种型中却没有观察到。用Pro(在IgG1和IgG2中的该位置发现的残基)替代Ser228的单氨基酸取代，导致IgG4完整的抗体分子(参见，如Angal等人，Molec.Immunol.，30：105-108，1993；Owens等人，Immunotechnology，3：107-116，1997；美国专利No.6,204,007)。含有Leu235Ala突变以降FcR结合的Fcγ4变体，加上Ser228Pro突变，也会产生这种同型的融合蛋白制备物。
用从人白细胞制备的RNA和合适的5’引物(SEQ ID NO：8)和3’引物(SEQID NO：9)，通过逆转录和PCR得到编码人IgG4的Fc区域(Fcγ4)的基因。将得到的含有IgG4的绞链、CH2和CH3区域完整序列的Fcγ4的DNA片段作为模板，产生Ser228Pro和Leu235Ala突变的Fcγ4变体(vFcγ4)，其中Ser228和Leu235分别被Pro和Ala替代。用3’引物(SEQ ID NO：9)和含有Leu235Ala突变的5’引物(SEQ ID NO：10)扩增CH2和CH3区域。用SEQ ID NO：12作为5’引物和SEQ ID NO：9作为3’引物，在PCR中将这种扩增的片段与合成的长度为60个碱基且含Ser228Pro和Leu235Ala突变的寡核苷酸(SEQ ID NO：11)连接起来。SEQ ID NO：12引物含有编码16氨基酸Gly-Ser肽接头(包括BamHI位点)的序列。将得到的长度约为700bp的DNA片段插入接受载体(如pUC19)的BamHI和EcoRI位点，得到pL-vFcγ4质粒。用DNA测序验证该基因的序列。
为了制备HuEPO-L-vFcγ4融合基因，用HindIII和BamHI从pEPO质粒上切下HuEPO片段，然后插入pL-vFcγ4质粒肽接头的5’末端，得到pEPO-L-vFcγ4质粒。此融合基因含有HuEPO、16个氨基酸的Gly-Ser肽接头和Fcγ4变体基因，然后将其插入哺乳动物表达载体如pcDNA3(Invitrogen)的HindIII和EcoRI位点(如HuEPO-L-vFcγ2融合蛋白所述)。将这种最终表达的载体质粒命名为pEFP4。图2B显示了融合基因，它含有编码HuEPO、16个氨基酸的肽接头(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)、和具有Ser228Pro和Leu235Ala突变的Fcγ4变体的融合基因。
3.构建编码HuEPO-L-vFcγ1融合蛋白的基因
人IgG1重链的绞链区域含有包括3个半胱氨酸的15个氨基酸残基(GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysPro)。在这3个半胱氨酸残基中，第2和第3个参与两个重链间二硫键的形成。第1个半胱氨酸残基参与与IgG轻链的二硫键结合。由于Fc融合蛋白分子中不存在轻链，该半胱氨酸残基可能与其它半胱氨酸残基配对，而导致非特异性二硫键合。可以将Fcγ1的绞链区域切短，以消除第1个半胱氨酸残基(AspLysThrHisThrCysProProCysPro)。用从人白细胞制备的RNA和合适的5’引物(SEQ ID NO：13)和3’引物(SEQID NO：4)，通过逆转录和PCR得到编码Fcγ1区域的基因。将得到的含有Fcγ1截短的绞链区域和CH2及CH3完整序列的DNA片段用作模板，产生具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的Fcγ1变体(vFcγ1)。
一种引入这些突变的方法如下：产生两个片段，然后用天然Fcγ1作为模板在重叠PCR中将它们装配起来。用SEQ ID NO：14作为5’引物并用SEQ IDNO：5作为3’引物生成5’片段。此5’引物含有Leu234Val、Leu235Ala突变，3’引物含有Pro331Ser突变。用SEQ ID NO：6作为5’引物并用SEQ ID NO：4作为3’引物生成3’片段。然后用SEQ ID NO：14作为5’引物和SEQ ID NO：4作为3’引物，将5’和3’片段在覆盖Pro331Ser突变的区域连接起来。用SEQ IDNO：16作为5’引物、SEQ ID NO：4作为3’引物，通过PCR将此扩增的长度约650bp的片段和合成的55碱基的寡核苷酸(SEQ ID NO：15)(含有Leu234Val和Leu235Ala)连接起来。SEQ ID NO：16引物含有编码16个氨基酸Gly-Ser肽接头(包括BamHI位点)的序列。将得到的长度约为700bp的DNA片段插入接受载体(如pUC19)的BamHI和EcoRI位点，得到pL-vFcγ1质粒。用DNA测序验证该基因的序列。
为了制备HuEPO-L-vFcγ1融合基因，用HindIII和BamHI从pEPO质粒上切下EPO片段，然后插入pL-vFcγ1质粒肽接头的5’末端，得到pEPO-L-vFcγ1质粒。此融合基因含有HuEPO，16个氨基酸Gly-Ser肽接头和Fcγ1变体基因，然后将其插入哺乳动物表达载体如pcDNA3(Invitrogen)的HindIII和EcoRI位点(如对HuEPO-L-vFcγ2融合蛋白所述)。将这种最终表达的载体质粒命名为pEFP1。图2C显示了融合基因，它含有编码HuEPO、16个氨基酸肽接头(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)、和具有Ser234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的Fcγ1变体的融合基因。
4.在转染的细胞系中融合蛋白的表达
将重组pEFP1、pEFP2或pEFP4表达载体质粒转染入哺乳动物宿主细胞系，以表达HuEPO-L-vFc融合蛋白。为了稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是DHFR酶缺陷的CHO细胞(参见，例如美国专利No.4,818,679)。一种优选的转染方法是电穿孔。也可以使用其它方法，包括磷酸钙共沉淀、脂转染和原生质融合。在电穿孔中，用设置为250V电场和960μFd电容的Gene PulserElectroporator(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，在比色杯内的2-5×107个细胞中加入10μg用BspCI线性化的质粒DNA。在转染2天后，将培养基改成含0.18mg/ml G418的生长培养基。用抗人IgG Fc ELISA，测试对选定药物具有抗性的转染子是否分泌融合蛋白。也可用抗-HuEPO试验，通过ELISA进行表达的融合蛋白的定量分析。通过在96孔板上极限稀释，亚克隆产生高水平Fc融合蛋白的孔。
为了实现融合蛋白较高水平的表达，宜用受MTX药物抑制的DHFR基因进行共扩增。在含有递增浓度MTX的生长培养基中，转染的融合蛋白基因与DHFR基因共扩增。能在高达1μg/ml MTX培养基中生长的转染子，再次通过极限稀释法进行亚克隆。通过测定分泌率，对亚克隆的细胞系进行进一步的分析。分泌率水平超过约10(较佳地约30)μg/106(即百万)个细胞/24小时的细胞系，适合使用无血清生长培养基的悬浮培养。然后用条件培养基纯化融合蛋白。
糖侧链结构对于EPO的体内活性是关键的。Asn-连接的碳水化合物的末端糖链含有唾液酸，重复的聚-N-乙酰乳糖酰胺和半乳糖。已知在一些哺乳动物细胞，例如NS0细胞中表达的重组HuEPO，得到的是具有低唾液酸含量的蛋白质。除去唾液酸会导致暴露次末的半乳糖残基，这提高了肝脱唾液酸糖蛋白结合性凝集素的亲和力。该捕获途径导致在整个动物内测量的体内生物活性下降。在CHO细胞中产生的重组HuEPO显示与天然EPO中发现的非常相似的糖基化模式(见例如Takeuchi等，Proc.Nat l.Acad.Sci.USA86：7819-22，1989)。根据本发明表达和生产的HuEPO-L-vFc融合蛋白，当与rHuEPO基于摩尔比较时，显示出更高的生物活性。
5.融合蛋白的纯化和定性
用1N NaOH将含有融合蛋白的条件培养基滴定到pH7到8，然后用0.45微米的硝酸纤维素过滤器过滤。将滤液加样到磷酸盐缓冲盐水(PBS)平衡的Prosep A柱上。待融合蛋白结合于Prosep A后，弃去流穿组分。用PBS洗涤该柱，直到280nm处的OD值低于0.01。然后用0.1M pH3.75的柠檬酸缓冲液洗脱结合的融合蛋白。用0.4体积的1M K2HPO4中和，合并含有纯化蛋白的组分，并用PBS透析。然后溶液用0.22微米的硝酸纤维素过滤器过滤，并存储在4℃。在非还原条件下，由SDS-PAGE测得纯化的HuEPO-L-vFc蛋白质的分子量范围为110到130kDa。在还原条件下，纯化的蛋白迁移至约60kDa。用BSA作为标准，通过BCA蛋白质分析定量该融合蛋白。
6.体外生物分析
可测定转染子的上清液或纯化蛋白质刺激TF-1细胞的增殖能力(Kitamura等，J.Cell.Physiol.，140：323-334，1989)。TF-1细胞天然在细胞表面表达EPO-Rc，并对EPO反应。将细胞维持在生长培养基(RPMI-1640培养基，含有10％FCS和1-5ng/ml人IL-5)。收集对数期的TF-1细胞，并用分析培养基洗涤(不含人IL-5的生长培养基)。将每份共1×104个细胞的TF-1样品(50μl)加到96孔组织培育板的各孔中。用50μl含有0.01-100nM各种浓度HuEPO-L-vFc融合蛋白或rHuEPO对照的分析培养基培养这些细胞。在37℃、5％CO2湿润培养箱中培养该平板4天，然后在各孔中添加10μl MTT(用PBS配制成2.5mg/ml)。然后在各孔中添加10μl MTT(用PBS配制成2.5g/ml)。4小时后，在每孔中加入100μl 10％SDS的0.01N HCl，以溶解细胞和Formazan。然后在550nm对该平板进行读数，其中参考光束设为690nm。OD读数相对于rHuEPO或融合蛋白的浓度作图。S形曲线的拐点表示产生50％最大效果(ED50)的浓度。因此可定量地比较HuEPO-L-vFc相对于rHuEPO的生物活性。较佳地，按摩尔计，重组融合蛋白应表现出比rHuEPO高至少2倍的活性。在本发明的一实施例中，HuEPO-L-vFc融合蛋白的比活力范围约为6-8×106单位/μmol，而rHuEPO约为3-4×106单位/μmol。
也可测试转染子上清液或纯化蛋白悬浮液刺激人骨髓祖细胞增生和分化形成红血细胞集落(集落形成单位-红细胞样细胞(CFU-E))的能力。方法如下。洗涤用Ficoll-Pague离心的人骨髓的低密度细胞，并以1×106细胞/ml悬浮在含有5％FCS的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)中。在37℃和5％CO2下，将这些细胞在组织培育皿中培养过夜，以除去所有粘附的细胞(包括单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞)。然后将悬浮液中的细胞调节成1×105细胞/ml含5％FCS的IMDM。混合0.3ml细胞、15微升20μg/ml干细胞因子、2.4ml甲基纤维素和0.3ml含数种浓度HuEPO-L-vFc(或rHuEPO对照)的培养基，以便分析。将1ml这种细胞混合物置于35-mm培养皿上。然后将此培养皿置于37℃、5％CO2中保持10-14天，然后计数集落量。与rHuEPO的浓度相对，可以对HuEPO-L-vFc浓度作剂量反应曲线图。
7.大鼠中体内药物动力学研究
通过尾静脉进行静脉注射或通过皮下注射，将100单位的rHuEPO或HuEPO-L-vFc融合蛋白注射入平均体重约为500g的Fisher大鼠(HarlanBioproducts for Science，Indianapolis，IN)。注射相同体积的PBS作为对照。注射后，在不同时间点(0、0.2、1、4、24、48、96和168小时)通过眶后放血法采集一系列0.5ml的样品。每个时间点3只大鼠。将全血收集在含有抗凝剂的试管中，除去细胞，并在-70℃冷冻血浆直到进行分析。
将血浆样品用于TF-1细胞分析，测定EPO-介导的细胞增殖的活性。在96孔培育板的各孔中加入每50μl总计为1×104细胞的样品。用50μl含有各种浓度滴定过的血液样品的分析培养基培养这些细胞。将平板在37℃、5％CO2湿润培养箱中放置4天。用10μl MTT(用PBS配的2.5mg/ml溶液)染色活细胞。4小时后，每孔加入100μl 10％SDS的0.01N HCl溶液以溶解细胞和Formazan。然后在550nm读取该平板(参考光束是690nm)。将血清样品的活性对时间点作图，以计算循环时间。HuEPO-L-vFc的活性比rHuEPO对照的降低慢许多，表明大鼠中融合蛋白的半衰期更长。
以上实施例仅起说明的作用。不能也不应将它们视为对本发明范围或精神的限制。本领域技术人员可以理解对于本发明的目的而言，可使用其它变化或替代形式，而本发明的目的仅由本说明书和所附权利要求书定义。
表1.寡核苷酸序列
SEQ ID NO：1
5′-cccaagcttggcgcggagatgggggtgca-3′
SEQ ID NO：2
5′-cggatccgtcccctgtcctgcaggcct-3′
SEQ ID NO：3
5′-gagcgcaaatgttgtgtcga-3′
SEQ ID NO：4
5′-ggaattctcatttacccggagacaggga-3′
SEQ ID NO：5
5′-tggttttctcgatggaggctgggaggcct-3′
SEQ ID NO：6
5′-aggcctcccagcctccatcgagaaaacca-3′
SEQ ID NO：7
5′-cggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcag
agcgcaaatgttgtgtcga-3′
SEQ ID NO：8
5′-gagtccaaatatggtccccca-3′
SEQ ID NO：9
5′-ggaattctcatttacccagagacaggga-3′
SEQ ID NO：10
5′-cctgagttcgcggggggacca-3′
SEQ ID NO：11
5′-gagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgagttcgcgg
ggggacca-3′
SEQ ID NO：12
5′-cggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcagag
tccaaatatggtccccca-3′
SEQ ID NO：13
5′-gacaaaactcacacatgccca-3′
SEQ ID NO：14
5′-acctgaagtcgcggggggaccgt-3′
SEQ ID NO：15
5′-gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagtcgcggggggac
cgt-3′
SEQ ID NO：16
5′-cggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcagac
aaaactcacacatgccca-3′

Claims (16)

1.一种重组HuEPO-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白含有人EPO、肽接头和人IgG Fc变体。
2.如权利要求1所述的重组HuEPO-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的肽接头含有约20个或更少的氨基酸，该肽接头存在于人EPO和人IgG Fc变体之间；且所述的肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸。
3.如权利要求1或2所述的重组HuEPO-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的人IgG Fc变体为含有Pro331Ser突变的人IgG2的绞链、CH2和CH3区域。
4.如权利要求1或2所述的重组HuEPO-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的人IgG Fc变体为含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4的绞链、CH2和CH3区域。
5.如权利要求1或2所述的重组HuEPO-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的人IgG Fc变体为含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1的绞链、CH2和CH3区域。
6.如权利要求1-5任一所述的重组HuEPO-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的HuEPO-L-vFc融合蛋白显示在摩尔基础上比rHuEPO高至少2倍的体外生物活性。
7.一种CHO衍生的细胞系，其特征在于，所述的细胞系在其生长培养基中在每24小时期间内，产生超过10μg/百万个细胞的如权利要求1-6任一所述的HuEPO-L-vFc融合蛋白。
8.如权利要求7所述的CHO-衍生的细胞系，其特征在于，在生长培养基中，在每24小时期间内，产生超过30μg/百万个细胞的HuEPO-L-vFc融合蛋白。
9.一种产生权利要求1所述的HuEPO-L-vFc融合蛋白的CHO-衍生的细胞系的方法，其特征在于，其中人IgG Fc变体含有选自IgG1、IgG2和IgG4的人IgG的绞链、CH2和CH3区域，且IgG Fc含有降低效应子功能的氨基酸突变。在人EPO和人IgG Fc变体间存在含有约20个或更少氨基酸的柔性肽接头，且HuEPO-L-vFc融合蛋白的特性为且表现出在摩尔基础上比rHuEPO高至少两倍的体外生物活性。
10.一种制备含有人EPO、柔性肽接头和人IgG Fc变体的重组融合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括：(a)生成CHO衍生的细胞系；(b)在重组融合蛋白在其生长培养基中在每24小时期间内表达超过10μg/百万个细胞的条件下，培养这种细胞系；和(c)纯化步骤(b)表达的蛋白质，其中重组融合蛋白显示体外生物活性在摩尔基础上至少比rHuEPO提高2倍。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，在人EPO和人IgG Fc变体间存在含有约20或更少个氨基酸的柔性肽；且所述的柔性肽接头含有2个或多个选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的人IgG Fc变体为含有包括Pro331Ser突变的人IgG2的绞链区、CH2和CH3区域。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的人IgG Fc变体为含有包括Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4的绞链区、CH2和CH3区域。
14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的人IgG Fc变体为含有包括Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1的绞链区、CH2和CH3区域。
15.如权利要求10、11、12、13和14任一所述的方法，其特征在于，在所述的步骤(b)中每24小时期间内每百万细胞表达超过30μg蛋白。
16.一种制备含有人EPO、柔性肽接头和人IgG Fc变体的重组融合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括：(a)生成CHO衍生的细胞系；(b)用让重组融合蛋白在其生长培养基中在每24小时期间内表达超过10μg/百万个细胞的条件下，培养这种细胞系；和(c)纯化步骤中(b)表达的蛋白质，其中重组融合蛋白的特征为且表现出提高的体外生物活性，其体外生物活性在摩尔基础至少是rHuEPO的2倍；其中在人EPO和人IgG Fc变体间存在含有约20个或更少氨基酸的柔性肽接头；和柔性肽接头含有2个或多个选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸；和其中人IgG Fc变体含有选自以下的人IgG的绞链区、CH2和CH3区域：Pro331Ser突变的人IgG2；Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4；和Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1。
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Granted publication date: 20060802

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