CN109641967A - 用GITR激动剂和CpG的组合的抗肿瘤疗法 - Google Patents

Abstract

本公开内容涉及使用糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂作为抗肿瘤剂，例如与CpG寡脱氧核苷酸组合的方法。还描述了以其CDR为特征的特异性抗体作为激动剂。

Description

用GITR激动剂和CpG的组合的抗肿瘤疗法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年7月1日提交的美国临时申请第62/357,750号的权益，该申请通过引用以其整体并入本文。

领域

本申请涉及糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂作为抗肿瘤剂，例如与CpG寡脱氧核苷酸(ODN)组合的用途。还提供了可与此类方法一起使用的试剂盒和组合物。

背景

癌症是一组涉及具有侵入或扩散到身体的其他部分的潜能的异常细胞生长的疾病。2012年，全球约有1410万新发癌症病例(不包括除黑素瘤以外皮肤癌)。癌症引起约820万人死亡或14.6％的人类死亡。男性中最常见的癌症类型是肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌和胃癌。在女性中，最常见的癌症类型是乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌和宫颈癌。对癌症及其转移的有效治疗存在持续的需求。

概述

本文提供了用于治疗哺乳动物(诸如人类、兽医动物或实验动物)中的肿瘤的方法。该方法包括施用有效量的至少一种糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂(诸如瘤内施用或全身性施用)和瘤内施用有效量的至少一种CpG ODN，从而治疗哺乳动物中的肿瘤。在某些实例中，至少一种GITR激动剂和至少一种CpG ODN被同时地或同期地施用。在某些实例中，至少一种GITR激动剂和至少一种CpG ODN在至少两个不同的时机(occasion)被施用至少两次，诸如2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次。在某些实例中，GITR激动剂和CpG ODN两者均以多于一个(multiple)剂量以至少1天，至少2天、至少5天、至少7天、至少14天、或至少30天的间隔被施用。在某些实例中，该方法还包括施用有效量的一种或更多种另外的治疗剂，诸如一种或更多种化学治疗剂、一种或更多种生物剂、一种或更多种抗血管生成剂、一种或更多种生长抑制剂、一种或更多种抗赘生物组合物、手术，或者其组合。

示例性GITR激动剂包括GITR抗体或GITR抗体片段(诸如嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、双特异性抗体、单链抗体、Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab'、或(Fab')₂)、大分子、小分子、或编码GITR的核酸分子。在一个具体实例中，至少一种GITR激动剂是选自Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab'、和(Fab')₂的GITR抗体片段。在一个具体实例中，至少一种GITR激动剂是GITR抗体，所述GITR抗体选自a)包含含有CDR1、CDR2、和CDR3的GITR结合结构域(GITR-BD)的抗体，所述CDR1包含SEQ ID NO:6序列，所述CDR2包含SEQ ID NO:7的序列，所述CDR3包含SEQ ID NO:8的序列；b)包含含有SEQ ID NO:5的序列的GITR-BD的抗体；c)包含两个拷贝的具有结构(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc的多肽的四价分子，其中(i)GITR-BD包含CDR1、CDR2、和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:6的序列，所述CDR2包含SEQ ID NO:7的序列，所述CDR3包含SEQ ID NO:8的序列，(ii)接头是多肽，(iii)铰链是衍生自免疫球蛋白铰链区的多肽，和(iv)Fc是免疫球蛋白Fc多肽；d)包含两个拷贝的具有结构(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc的多肽的四价分子，其中(i)GITR-BD包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，(ii)接头是多肽，(iii)铰链是衍生自免疫球蛋白铰链区的多肽，和(iv)Fc是免疫球蛋白Fc多肽；和e)包含两个拷贝的包含SEQ ID NO:4的序列的多肽的四价分子。

示例性CpG ODN包括B类ODN，诸如以SEQ ID NO:1所示的人类CpG序列(5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3'，具有为硫代磷酸酯的碱基)和以SEQ ID NO:2所示的鼠(murine)CpG序列(5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'，具有为硫代磷酸酯的碱基)。在一个实例中，CpG ODN具有序列5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3'，SEQ ID NO:3(来自Dynavax的ISS1018)。Rachmilewitz等人(Inflammatory Bowel Diseases 12(5):339-45,2006)中提供了其他实例。本领域技术人员将理解，其他TLR9激动剂也可以用作CpG ODN的替代物(或补充)。

在一些实例中，至少一种GITR激动剂的有效量为至少0.01mg/kg，至少0.03mg/kg、至少0.25mg/kg、至少0.3mg/kg、或至少1mg/kg。在一些实例中，至少一种GITR激动剂的有效量不多于1mg/kg、不多于0.3mg/kg、不多于0.25mg/kg、不多于0.03mg/kg、不多于0.01mg/kg、或不多于0.01mg/kg，例如0.1mg/kg至1mg/kg。在一些实例中，至少一种CpG ODN的有效量为至少0.05mg、至少0.3mg、至少1mg、至少3mg、至少6mg、至少18mg、或至少20mg。在一些实例中，至少一种CpG ODN的有效量不多于20mg、不多于10mg、不多于1mg、不多于0.3mg、或不多于0.05mg，诸如0.05mg至20mg。在一些实例中，至少一种GITR激动剂的有效量为0.01mg/kg至0.1mg/kg，并且至少一种CpG ODN的有效量为0.5mg/kg至1.0mg/kg。

可以用所公开的方法治疗的示例性肿瘤包括但不仅限于淋巴瘤、黑素瘤、肉瘤或腺癌。在一些实施方案中，肿瘤是黑素瘤。在一些实例中，肿瘤是乳腺癌、肝癌、脾癌、肾癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、中枢神经系统癌、头颈癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌或胆囊癌。在一些实施方案中，肿瘤选自乳腺癌和结肠癌。本文提供了其他实例。在一些实例中，例如，与未施用GITR激动剂和CpG ODN相比，所公开的方法将注射的肿瘤的尺寸或体积减少至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％。在一些实例中，例如，与未施用GITR激动剂和CpG ODN相比，所公开的方法将未注射的转移性肿瘤的尺寸或体积减少至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％。在一些实例中，例如，与未施用GITR激动剂和CpG ODN相比，所公开的方法将未注射的转移性肿瘤的尺寸或体积减少至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％。

通过参考附图进行的以下详细描述，本公开内容的前述和其他目的和特征将变得更加明显。

附图简述

图1提供了实施例1中使用的方法的概述。

图2A-2F是显示了CpG(A、B)、抗GITR(C、D)或CpG和抗GITR两者(E、F)的直接肿瘤注射对注射的肿瘤或远端未注射的肿瘤的肿瘤消退的结果的图。单独的CpG引起注射的肿瘤的消退(A)，但不引起远端未注射的肿瘤的消退(B)。抗GITR引起一些小鼠中注射的肿瘤(C)和远端肿瘤(D)的消退。CpG和抗GITR的组合引起注射的肿瘤(E)和远端肿瘤(F)的消退。

图3A-3F是显示了CpG的直接肿瘤注射、或抗GITR的i.p.注射或者CpG的直接肿瘤注射和抗GITR的i.p.注射两者对注射的肿瘤或远端未注射的肿瘤的肿瘤消退的结果的图。单独的CpG引起注射的肿瘤消退(A)，但不引起远端未注射的肿瘤的消退(B)。i.p.施用的抗GITR引起一些小鼠中的肿瘤的消退(C、D)。瘤内施用的CpG和i.p.施用抗GITR(例如，全身性抗GITR)的组合引起一些小鼠但不是所有小鼠中的注射的肿瘤(E)和远端肿瘤(F)的消退。

图4A-4D提供了某些多价抗GITR抗体结构的示意性表示。

序列表

核酸序列使用如37C.F.R.1.822中定义的核苷酸碱基的标准字母缩写，和氨基酸的三字母缩写显示每个核酸序列。仅显示一条链，但是应理解对提及所示链的任何提及均包括其互补链。

SEQ ID NO:1-3示出了示例性CpG ODN序列。

SEQ ID NO:4是示例性GITR结合多肽。

SEQ ID NO:5是示例性GITR结合结构域。

SEQ ID NO:6是示例性CDR1多肽。

SEQ ID NO:7是示例性CDR2多肽。

SEQ ID NO:8是示例性CDR4多肽。

SEQ ID NO:9-14示出了示例性蛋白Fc序列。

SEQ ID NO:15-17示出了示例性蛋白铰链序列。

SEQ ID NO:18-24示出了示例性蛋白接头序列。

详细说明

提供以下术语和方法的解释以更好地描述本公开内容并指导本领域普通技术人员实施本公开内容。除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”是指一个或多于一个。例如，术语“包含细胞(comprising a cell)”包括单个或多于一个(plural)细胞，并且被认为等同于短语“包含至少一个细胞”。除非上下文另有明确指示，否则术语“或”指陈述的替代要素的单个要素或两个或多个要素的组合。如本文使用的，“包含(comprises)”意指“包括(includes)”。因此，“包含A或B”意指“包括A、B、或A和B”，而不排除另外的要素。本文提及的登录号的日期是至少早在2016年7月1日可得的序列的日期。本文引用或提及的所有参考文献(包括期刊文章、专利、和专利申请)和登录号均通过引用并入本文。

除非另外说明，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于实施或测试本公开内容，但下文描述了合适的方法和材料。材料、方法、和实例仅是说明性的，而并非意图限制。

为了便于审阅本公开内容的各种实施方案，提供了具体术语的以下解释：

施用：通过任何有效途径提供或给予受试者剂，诸如一种或更多种增强或增加GITR活性的一种或更多种剂(例如，对GITR核酸分子或蛋白或其下游产物特异性的激动剂)，和/或一种或更多种CpG ODN(例如，TLR9激动剂)。示例性施用途径包括但不限于口服，注射(诸如皮下、肌内、皮内、腹腔内、静脉内、瘤周(peritumoral)和瘤内(intratumoral))，舌下、直肠、透皮、鼻内、阴道和吸入途径。在一个实例中，施用途径是瘤内注射。

剂：可用于达到目的或结果的任何物质或物质的任何组合；例如，可用于治疗肿瘤(诸如癌症)的物质或物质的组合。剂包括且不限于蛋白、核酸分子、化合物、小分子、大分子、有机化合物、无机化合物、或感兴趣的其他有用的分子。在一些实施方案中，剂是多肽剂(诸如抗体)、核酸分子(诸如编码GITR的核酸分子或CpG ODN)或药物化合物。技术人员将理解，特定剂可用于实现多于一种结果。

激动剂：增强或增加蛋白(诸如GITR或TLR9)的生物活性、或者增强或增加编码蛋白的核酸的转录或翻译的任何分子。示例性激动剂分子包括但不限于激动剂抗体、激动剂肽、寡肽、有机分子(包括大分子和小分子)、和核酸分子(例如，编码GITR的核酸分子或CpGODN)。术语“GITR激动剂”是指通过以下直接或间接增加或增强GITR表达和/或活性的分子或分子的组合：例如激动效应T细胞、降低调节性T细胞的抑制活性和谱系稳定性、消耗调节性T细胞，或其组合。术语“TLR9激动剂”是指通过以下直接或间接增加或刺激TLR9表达和/或活性的分子或分子的组合：例如诱导B细胞增殖和分化，和/或浆细胞样(pDC)激活和IFN-α分泌。

抗体：包含特异性识别并结合抗原(诸如GITR或其片段)的表位的至少一条轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽。抗体包含重链和轻链，重链和轻链各自具有可变区，称为重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)。V_H区和V_L区共同负责结合抗体所识别的抗原。本公开内容的抗体包括对GITR特异性的抗体，并且在一些实例中，还增强或增加蛋白的生物活性(诸如激动效应T细胞、降低调节性T细胞的抑制活性和谱系稳定性、消耗调节性T细胞，或其两者(both))。

术语抗体包括完整的免疫球蛋白，以及其变体和部分，诸如Fab'片段，F(ab)'₂片段、单链Fv蛋白(“scFv”)、Fv、Fab、和二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过接头结合的融合蛋白，而在dsFv中，链已经被突变，以引入二硫键来稳定该链的缔合。该术语还包括基因工程形式，诸如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)、单链抗体(例如骆驼科动物(camelid)抗体)、和异源缀合抗体(例如双特异性抗体)。还参见Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce ChemicalCo.,Rockford,IL)；Kuby,J.,Immunology,第3版,W.H.Freeman&Co.,New York,1997。

通常，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重链(H)和轻链(L)。存在lambda(λ)和kappa(κ)两种类型的轻链。存在以下五种主要的重链类别(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，它们决定抗体分子的功能活性。

重链和轻链各自包含恒定区和可变区(这些区域也称为“结构域”)。组合时，重链可变区和轻链可变区特异性结合抗原。轻链可变区和重链可变区包含被三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)中断的“框架”区。已经明确了框架区和CDR的范围(参见，Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Healthand Human Services,1991)。Kabat数据库现在在线维护。不同轻链或重链的框架区的序列在一个物种内是相对保守的。抗体的框架区，即组成型轻链和重链的组合的框架区，起在三维空间中定位和排列CDR的作用。

CDR主要负责与抗原的表位结合。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2、和CDR3，从N-末端开始按顺序编号，并且通常也通过特定CDR所位于的链来鉴定。因此，V_H CDR3位于其被发现的抗体重链可变结构域中，而V_L CDR1是来自其被发现的抗体轻链可变结构域的CDR1。结合靶蛋白的抗体将具有特定的V_H区和V_L区序列，以及因此的特定的CDR序列。有不同特异性(诸如针对不同抗原的不同组合位点)的抗体具有不同的CDR。尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但CDR内仅有限数目的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR内的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。

提及“V_H”或“VH”是指免疫球蛋白重链可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的重链可变区。提及“V_L”或“VL”是指免疫球蛋白轻链可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链可变区。

“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单个克隆或由已经转染了单个抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法来产生，例如通过由骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合体制备杂交抗体形成细胞来产生。

“多克隆抗体”是衍生自不同B细胞系的抗体。多克隆抗体是针对特定抗原分泌的免疫球蛋白分子的混合物，每个免疫球蛋白分子识别不同的表位。这些抗体通过本领域已知的方法来产生，例如，通过将抗原注射到合适的哺乳动物(诸如小鼠、兔或山羊)中，诱导B淋巴细胞产生对抗原特异性的IgG免疫球蛋白，然后从哺乳动物血清中纯化对抗原特异性的IgG免疫球蛋白。

“嵌合抗体”具有来自一个物种(诸如小鼠、大鼠、食蟹猴(cynomolgus monkey)等)的框架残基和来自另一物种(诸如人类、食蟹猴、鸡等)的CDR。在一些实例中，嵌合抗体包含至少一个小鼠可变区和至少一个人类恒定区。在一些实例中，嵌合抗体包含至少一个食蟹猴可变区和至少一个人类恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体的所有可变区均来自第一物种，并且所有恒定区来自第二物种。

“人源化”免疫球蛋白是包含人类框架区和来自非人类(诸如小鼠，大鼠，或合成)的免疫球蛋白的一个或更多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人类免疫球蛋白被称为“供体”，并且提供框架的人类免疫球蛋白被称为“受体”。在一个实例中，所有CDR均来自人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。恒定区不必存在，但如果它们存在，则它们与人类免疫球蛋白恒定区基本上相同，例如至少约85％-90％相同，诸如约95％或更多地相同。因此，除了可能的CDR以外，人源化免疫球蛋白的所有部分基本上与天然人类免疫球蛋白序列的对应部分相同。人源化免疫球蛋白可以通过基因工程构建(参见例如参见美国专利号5,585,089)。在一些实施方案中，人源化抗体包括至少一个人类恒定区或其片段。在一些实施方案中，人源化抗体是Fab、scFv、(Fab')₂等。

“CDR-接枝抗体(CDR-grafted antibody)”是指第一物种(非人类)的一个或更多个互补决定区(CDR)已经被接枝到第二物种(人类)的框架区(FR)上的人源化抗体。

结合：两种物质或分子之间的缔合，诸如一种核酸分子与另一种核酸分子(或其自身)的杂交，抗体或有机小分子与蛋白的缔合，或者蛋白与另一种蛋白或核酸分子的缔合。可以通过本领域技术人员已知的任何程序检测结合，所述程序包括但不限于：蛋白印迹、免疫印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫共沉淀、表面等离子共振、化学发光、荧光偏振、磷光、免疫组织化学分析、基质辅助激光解吸飞行时间质谱、微细胞计量术(microcytometry)、微阵列、显微术、荧光激活细胞分选术(FACS)、和流式细胞术。

当特定剂(“特异性结合剂”)能够与特定靶特异性反应(例如，与靶特异性免疫反应，与靶特异性杂交，或与靶特异性结合)时，一个分子被称为与另一个分子但不与不相关分子“特异性结合”。例如，GITR特异性结合剂在体外或体内基本上仅与GITR蛋白结合。结合是非随机结合反应，例如特异性结合剂(诸如抗体或其功能片段、蛋白、或核酸分子)和靶(诸如细胞、蛋白、DNA或RNA)之间的非随机结合反应。结合特异性可以从特异性结合剂差异性结合靶和不相关分子的能力的参考点来确定，并因此区分两种不同的分子。例如，如果足够量的寡核苷酸分子形成碱基对或与其靶核酸分子杂交，则寡核苷酸分子与靶核酸分子结合或稳定结合，以允许检测该结合。

在一些实例中，分子(诸如抗体)与靶(诸如蛋白)以比对样品或受试者中其他分子的结合常数大了至少10³M^-1、大了10⁴M^-1或大了10⁵M^-1的结合常数特异性结合。在特定实例中，当组分之间复合物形成的结合常数为至少10⁴L/mol，例如至少10⁶L/mol，至少10⁸L/mol，或至少10¹⁰L/mol时，这两种化合物被称为特异性结合。可以使用本领域熟知的方法确定两种组分的结合常数。

在特定实例中，当两种化合物的结合亲和力为至少约0.1×10^-8M、至少约0.3×10^-8M、至少约0.5×10^-8M、至少约0.75×10^-8M、至少约1.0×10^-8M、至少约1.3×10^-8M、至少约1.5×10^-8M、至少约2.0×10^-8M、至少约2.5×10^-8M、至少约3.0×10^-8M、至少约3.5×10^-8M、至少约4.0×10^-8M、至少约4.5×10^-8M、或至少约5.0×10^-8M时，这两种化合物被称为特异性结合。

在某些实施方案中，与靶结合的特异性结合剂具有以下的解离常数(Kd)：≤104nM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如，10^-8M或更少，例如从10^-8M至10^-13M，例如从10^-9M至10^-13M)。在一个实施方案中，通过用Fab形式的感兴趣的抗体及其抗原进行的放射性标记免疫结合测定(RIA)测量Kd(参见，例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881,1999)。在另一个实例中，以约10个响应单位(RU)，用固定化抗原CM5芯片，在25℃，使用BIACORES-2000或BIACORES-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)，使用表面等离子共振测定测量Kd。

癌症：以异常或不受控制的细胞生长为特征的恶性肿瘤。通常与癌症相关的其他特征包括转移、干扰邻近细胞的正常功能、以异常水平释放细胞因子或其他分泌产物以及抑制或加重炎性或免疫应答、侵入周围或远端组织或器官，诸如淋巴结等。“转移性疾病”是指癌细胞已经离开原始肿瘤部位，并且通过例如血液流动或淋巴系统迁移到身体其他部位。

接触：直接物理缔合的布置；包括固体和液体两种形式，可以在体内或体外发生。接触包括一个分子与另一个分子之间的接触，例如蛋白和抗体之间的连接。接触还可以包括接触细胞或组织，例如通过将测试剂与细胞或组织(诸如肿瘤样品)以直接物理缔合放置或向受试者施用剂。

对照：参考标准。在一些实施方案中，对照是在治疗剂不存在(诸如基本上没有针对例如肿瘤细胞的GITR活性、TLR9活性或者两者的免疫效应)下预期的结果。在一些实施方案中，对照是在增加针对例如肿瘤细胞的免疫介导的GITR活性和/或表达的剂存在下预期的结果。在一些实施方案中，对照是在增加针对例如肿瘤细胞的免疫介导的TLR9活性和/或表达的剂存在下预期的结果。在一些实施方案中，对照是在增加针对例如肿瘤细胞的免疫介导的GITR活性和/或表达的剂不存在下预期的结果。在一些实施方案中，对照是在增加针对例如肿瘤细胞的免疫介导的TLR9活性和/或表达的剂不存在下预期的结果。在仍其他实施方案中，对照是历史对照或标准参考值或值范围(诸如先前测试的对照样品，诸如具有已知预后或结果的患者组，或代表基线或正常值的样品组)。在一些实例中，对照样品或值是指从已知或认为未罹患本文提供的方法或组合物将被用于鉴定的疾病或状况的来源获得的样品、细胞或组织。在一个实施方案中，参考样品、参考细胞或参考组织从在其中疾病或状况将使用本文提供的组合物或方法鉴定的同一受试者或患者的身体的健康部分获得。在一个实施方案中，参考样品、参考细胞或参考组织从不是在其中疾病或状况将使用本文提供的组合物或方法鉴定的受试者或患者的至少一个个体的身体的健康部分获得。在一些实施方案中，参考样品、参考细胞或参考组织预先从在发展疾病或状况之前或处于疾病或状况的早期阶段的患者获得。

测试样品和对照之间的差异可以是增加或相反地减少。差异可以是定性差异或定量差异，例如统计学显著差异。合适的统计学分析是本领域熟知的，并且包括但不仅限于学生T检验(Student’s T test)和ANOVA测定。在一些实例中，差异是相对于对照的以下增加或减少：至少约5％，诸如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约500％、或大于500％。

CpG寡脱氧核苷酸(ODN)：在特定序列背景中包含未甲基化的CpG二核苷酸(CpG基序)的短的合成单链DNA分子。CpG ODN被Toll样受体9(TLR9)识别，导致强免疫刺激作用，并且因此是TLR9激动剂。与细菌基因组DNA中发现的天然磷酸二酯(PO)相比，CpG ODN具有部分或完全硫代磷酸酯化(PS)骨架。基于对人类外周血单核细胞(PBMC)，特别是B细胞和浆细胞样树突细胞(pDC)的结构特征和活性，已经鉴定了三类主要的刺激性CpG ODN。这三个类别是A类(D型)、B类(K型)和C类。

B类(K型)CpG ODN(CpG-B ODN)是18-28mer的线性寡脱氧核苷酸。B类(K型)CpGODN(CpG-B ODN)包含具有一个或更多个6mer CpG基序的完全硫代磷酸酯化骨架。在一个实例中，最佳基序是人类中的GTCGTT和小鼠中的GACGTT。CpG-B ODN刺激强B细胞和浆细胞样树突细胞(pDC)激活，但为IFN-α分泌的弱诱导物。CpG-B ODN显示出抗肿瘤活性，并且是有效的Th1佐剂。示例性B类CpG ODN包括人类CpG ODN 2006(5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3'，具有为硫代磷酸酯的碱基，SEQ ID NO:1)、鼠ODN 1826(5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'，具有为硫代磷酸酯的碱基，SEQ ID NO:2)、和5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3'(SEQ ID NO:3)。

在一些实例中，A类或C类CpG ODN用于本文提供的方法中。

减少：相对于对照值，以统计学显著量降低某物的质量，量、或强度。在一个实例中，与不存在疗法时的响应相比，该疗法减少例如肿瘤的尺寸或体积、肿瘤或转移的数目，或其组合。在一些实例中，与对照值相比，减少是减少至少20％、至少25％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或至少100％。

表达：藉以将核酸分子，诸如GITR核酸分子(例如GITR基因)的编码信息转化为细胞的操作性、非操作性或结构性部分的过程，例如蛋白的合成(例如，GITR蛋白)。基因的表达可以在从DNA到RNA到蛋白的途径中的任一处受到调节。调节可以包括对转录、翻译、RNA转运和加工、中介分子(intermediary molecules)(诸如mRNA)的降解的控制，或通过特定蛋白分子在其被产生后的激活、失活、区室化或降解。

核酸分子或蛋白(例如GITR)的表达可以相对于正常的临床病理学(诸如在正常的非癌性细胞中)、或相对于异常的临床病理学(例如在肿瘤细胞中)是改变的。基因表达的改变，诸如差异表达，包括但不限于：(1)过表达(例如，上调)；(2)低表达(underexpression)(例如，下调)；或(3)抑制表达。核酸分子表达的改变可以与对应蛋白表达的变化相关，并且事实上引起对应蛋白表达的变化。

蛋白表达也可以以某种方式改变，使其与正常情况下的蛋白表达不同。这包括但不必限于：(1)使得一个或更多个氨基酸残基不同的蛋白的突变；(2)对蛋白序列的一个或几个(诸如不多于10-20个)氨基酸残基的短缺失或添加；(3)使得完整的蛋白结构域或亚结构域被去除或添加的氨基酸残基(诸如至少20个残基)的较长缺失或添加；(4)与对照量或标准量相比，增加量的蛋白表达(例如，上调)；(5)与对照量或标准量相比，减少量的蛋白表达(例如，下调)；(6)蛋白的亚细胞定位或靶向的改变；(7)蛋白的暂时地调节的蛋白表达的改变(使得蛋白在其正常不将被表达的情况下被表达，或可选地在其正常将被表达的情况下不被表达)；(8)在蛋白保持定位于细胞中时通过延长寿命改变蛋白的稳定性；(9)各自与对照或标准相比，蛋白的定位(诸如器官或组织特异性或亚细胞定位)表达的改变(使得蛋白在其正常将被表达的地方不被表达，或在其正常不将被表达的地方被表达)。

用于与样品比较以用于确定差异表达的对照或标准包括被认为是正常的样品(因为对于期望的特征它们未被改变，例如来自健康受试者的细胞)、被认为是异常的样品(因为对于期望的特征它们被改变，例如肿瘤细胞)，以及实验室值，即使可能是任意设置的，应该考虑到这样的值从实验室到实验室可以不同。实验室标准和值可以基于已知或确定的群体值来设置，并且可以以允许对测量、实验确定的值进行比较的图或表格的格式提供。

糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)：也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员18(TNFRSF18)和激活诱导型TNFR家族受体(AITR)。包括GITR核酸分子和蛋白(例如，OMIM603905)。GITR是在Treg细胞上组成型表达的细胞表面受体跨膜蛋白，并且当T细胞被激活时被上调。GITR已经被证明参与抑制调节性T细胞的抑制活性和延长效应T细胞的存活。人类GITR具有三种同种型，并且小鼠GITR具有两种同种型。GITR由GITR配体(GITRL)激活。

GITR序列是公开可得的，例如从GenBank序列数据库(例如，登录号NP_683700.1(同种型3前体，成熟肽是aa 26-234)、NP_683699.1(同种型2前体，成熟肽是aa 26-255)、NP_004186.1(同种型1前体，成熟肽是aa 26-241)、NP_033426.1(同种型1前体，成熟肽是aa20-228)和NP_068820.1(同种型2前体，成熟肽是aa 22-132)提供了示例性GITR蛋白序列，而登录号NM_148902.1、NM_148901.1、NM_004195.2、NM_009400.2和NM_021985.2提供了示例性GITR核酸序列)。本领域普通技术人员可以鉴定另外的GITR或GITRL核酸序列和蛋白序列，包括保留结合GITR、激动效应T细胞、降低调节性T细胞的抑制活性和谱系稳定性、消耗调节性T细胞或其组合的GITR抗体和GITRL变体。

宿主细胞：可以是或已经是载体或分离的多核苷酸的受体的细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞，诸如肿瘤细胞。

抑制或降低：任何表型特征的减少或停止，或者该特征的发生率、程度或可能性的减少或停止。在一些实施方案中，“减少”或“抑制”意指引起减少至少10％、或至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的能力。

分离的：“分离的”生物组分(诸如GITR蛋白、抗体、或核酸分子、或CpG ODN)已经基本上与该组分存在处的其他组分(诸如其他染色体和染色体外DNA和RNA，以及蛋白)分离、分开产生、或纯化出来。因此，已经被“分离的”核酸分子和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸分子和蛋白，以及化学合成的核酸。纯化的或分离的细胞、抗体、蛋白、或核酸分子可以是至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％纯的。

哺乳动物：该术语包括人类和非人类哺乳动物两者。类似地，术语“受试者”既包括人类又包括兽医受试者(诸如猫、狗、马、牛、和猪)和啮齿动物(诸如小鼠和大鼠)。

平均值和标准偏差：算术平均值是“标准”平均值，通常简称为“平均值”。

平均值是一组值的算术平均值。

标准偏差(由符号sigma，σ表示)表示平均值存在多少变化或“分散”。随机变量、统计总体、数据集或概率分布的标准偏差是其方差的平方根。标准偏差通常用于衡量统计结果的置信度。通常，标准偏差的两倍是95％置信区间的半径。远远超出标准偏差范围的作用通常被认为是统计学显著的。本领域技术人员可以容易地计算出一组值的平均值和标准偏差。

核酸分子：可以包含天然和/或非天然核苷酸的核苷酸聚合物。实例包括但不限于DNA、RNA、和PNA。

药学上可接受的运载体(carrier)：可用于本发明的药学上可接受的运载体是常规的。Remington’s Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,第15版(1975)，描述了适用于药物递送本文提供的(诸如一种或更多种增强或增加GITR活性(例如，GITR激动剂)和/或CpG ODN(例如，TLR9激动剂)的一种或更多种剂)的组合物或制剂。

通常，运载体的性质将取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射的流体，所述可注射的流体包括药学上和生理学上可接受的流体，诸如水、生理盐水、平衡盐溶液、水性右旋糖、甘油等作为媒介物。对于固体组分(例如粉末、丸剂、片剂、或胶囊)，常规的无毒固体运载体可以包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、或硬脂酸镁。除生物中性运载体以外，待施用的药物组合物可以包含少量无毒辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂、和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

纯化的：术语纯化的不需要绝对纯度；而是，它预期作为相对术语。因此，例如，纯化的肽或抗体制品(preparation)是其中肽或蛋白比该肽或蛋白在其细胞内的天然环境中更加富集的肽或抗体。在一个实施方案中，纯化制品使得蛋白或抗体占制品的总抗体或蛋白含量的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％。

样品：从感兴趣的受试者获得或衍生的材料，包含例如基于物理、生物化学、化学和/或生理特征的待表征和/或鉴定的细胞和/或其他分子实体。在一些实例中，样品是组织或细胞样品，诸如新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检或抽出物(诸如肿瘤活检或抽出物)；血液或任何血液成分；体液诸如痰、脑脊液、羊水、腹膜液、或间质液；来自受试者妊娠或发育的任何时间的细胞。组织样品也可以是原代细胞或培养的细胞或细胞系。任选地，组织或细胞样品从患病组织/器官获得。组织样品可以包含在自然界不与组织天然混合的化合物，诸如防腐剂、抗凝血剂、缓冲液、固定剂、营养素、抗生素等。在一个实例中，样品是肿瘤或癌症样品。

氨基酸或核酸序列的序列同一性：氨基酸(或核酸)序列之间的相似性以序列之间的相似性的术语来表示，另外还称为序列同一性。序列同一性通常以同一性百分比(或相似性或同源性)的术语来衡量；百分比越高，两个序列越相似。

用于比较的序列比对方法是在本领域熟知的。各种程序和比对算法在以下中被描述：Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988；Higgins和Sharp,Gene 73:237,1988；Higgins和Sharp,CABIOS 5:151,1989；Corpet等人,NucleicAcids Research 16:10881,1988；以及Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988。Altschul等人,Nature Genet.6:119,1994，提供了对序列比对方法和同源性计算的详细考虑。

NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403,1990)可以从几个来源获得，包括美国国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和在因特网上，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。有关如何使用该程序确定序列同一性的说明，在因特网上的NCBI网站上可得。

在使用NCBI Blast 2.0进行与氨基酸序列的全长比对，将带空位的blastp(gapped blastp)设置为默认参数时，天然GITR蛋白的变体被表征为具有至少约80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。对于比较大于约30个氨基酸的氨基酸序列，采用Blast 2序列函数，使用被设置为默认参数(空位存在成本为11，且每残基空位成本为1)的默认BLOSUM62矩阵。当比对短肽(少于约30个氨基酸)时，应使用Blast 2序列函数，采用被设置为默认参数(开放空位为9，延伸空位为1罚分)的PAM30矩阵进行比对。与参考序列具有甚至更大相似性的蛋白当通过该方法评价将显示出增加的同一性百分比，诸如至少95％、至少98％、或至少99％的序列同一性。当比较小于整个序列的序列的同一性时，同源物和变体通常在10-20个氨基酸的短窗口上具有至少80％的序列同一性，并且根据它们与参考序列的相似性可以具有至少85％或至少90％或至少95％的序列同一性。用于在这样的短窗口上确定序列同一性的方法在因特网上的NCBI网站上可得。本领域技术人员将理解，提供这些序列同一性范围仅用于指导；可能获得落在所提供的范围以外的强重要的同源物是完全可能的。

因此，变体GITR蛋白与登录号NP_683700.1(同种型3前体，成熟肽是aa 26-234)、NP_683699.1(同种型2前体，成熟肽是aa 26-255)、NP_004186.1(同种型1前体，成熟肽是aa 26-241)、NP_033426.1(同种型1前体，成熟肽是aa 20-228)和NP_068820.1(同种型2前体，成熟肽是aa22-132)中所显示的任何蛋白序列相比可以具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，其中变体具有激动效应T细胞、降低调节性T细胞的抑制活性和谱系稳定性、消耗调节性T细胞或其组合的能力。

核酸在排除不相关核苷酸序列的中度或高度严格条件下进行“选择性杂交”或“选择性结合”。在核酸杂交反应中，用于实现特定严格度水平的条件将根据被杂交的核酸的性质而变化。在选择杂交条件时，可以考虑，例如，核酸杂交区域的长度、互补性程度、核苷酸序列组成(例如，GC与AT含量)、和核酸类型(例如，RNA与DNA)。另一个考虑是核酸之一是否是固定的，例如，固定在过滤器上。

逐渐更高严格度的条件的具体实例如下：2×SSC/0.1％SDS在约室温(杂交条件)；0.2×SSC/0.1％SDS在约室温(低严格度条件)；0.2×SSC/0.1％SDS在约42℃(中等严格度条件)；以及0.1×SSC在约68℃(高严格度条件)。本领域技术人员可以容易地确定这些条件的变化(例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,第1-3卷,Sambrook等人编著,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)。可以仅使用这些条件中的一种进行洗涤(例如高严格度条件)，或者可以按以上所列的顺序使用每种条件进行洗涤，例如各洗涤10-15分钟，重复所列的任何或所有步骤。然而，如以上提及的，最佳条件将根据所涉及的特定杂交反应而变化，并且可以凭经验确定。

因此，在一些实例中，示例性GITR核酸序列与登录号NM_148902.1、NM_148901.1、NM_004195.2、NM_009400.2、和NM_021985.2中所显示的任何核酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、或至少99％的序列同一性，包括保留激动效应T细胞、降低调节性T细胞的抑制活性和谱系稳定性、消耗调节性T细胞或其组合的能力的GITR变体。

小分子：通常具有少于约1000道尔顿，或在一些实施方案中，少于约500道尔顿的分子量的分子，其中该分子能够调节(例如，增加)靶分子，诸如GITR，的活性至一定可测量的程度。

受试者：任何哺乳动物，诸如人类、非人类的灵长类动物、猪、绵羊、马、牛、犬、猫、啮齿动物等，它们是特定治疗的接受者，所述特定治疗诸如用一种或更多种增强或增加GITR表达和/或活性(例如，对GITR有特异性的激动剂)和CpG ODN的一种或更多种剂的治疗。在两个非限制性实例中，受试者是人类受试者或鼠受试者。在一些实例中，受试者具有肿瘤，诸如癌症。在一些实例中，受试者具有转移肿瘤(metastasis)。

治疗有效量：一种或更多种增强或增加GITR活性的一种或更多种剂(例如，GITR激动剂)单独的或与另外的治疗剂(诸如CpG ODN或其他TLR9激动剂)一起足以治疗疾病或减轻和/或改善任何紊乱或疾病的症状和/或潜在原因的量。在一个实施方案中，“有效量”足以减轻或消除疾病，诸如癌症的症状，例如通过减少肿瘤尺寸、肿瘤体积、转移肿瘤的尺寸、转移肿瘤的体积、肿瘤负荷、转移肿瘤的数目，或其组合。

一种或更多种增强或增加GITR表达和/或活性的一种或更多种剂(例如GITR激动剂)和一种或更多种CpG ODN的治疗有效量可以在治疗过程期间以单次剂量或几次剂量，例如每天被施用。然而，治疗有效量可以取决于被治疗的受试者、被治疗的状况的严重程度和类型、施用方式和被施用的治疗剂的类型。

组织：多于一个(a plurality of)功能相关的细胞。组织可以是悬浮液、半固体或固体。组织包括从受试者收集的细胞，例如肿瘤。

治疗疾病：“治疗”是指在疾病或病理状况开始发展后改善疾病或病理状况的迹象或症状(诸如癌症的体征或症状)的治疗性干预。治疗包括抑制疾病或疾病的进展，抑制或减缓疾病或其进展，阻止其发展，部分或完全缓解疾病，部分或完全缓解疾病的一种或更多种症状，或恢复或修复丢失的、失去的或有缺陷的功能；或刺激低效过程。治疗还可以诱导减退或治愈状况，诸如癌症。治疗不需要疾病完全不存在。例如，减少至少20％或至少50％可能是足够了。可以通过例如受试者中疾病的临床症状的延迟发作、疾病的一些或所有临床症状的严重程度降低、疾病的进展减缓、受试者的整体健康或健康(well-being)的改善，或通过本领域已知的特定疾病特有的其他参数，来证明有益效果。

肿瘤、赘生物、恶性肿瘤或癌症：赘生物是由于过度细胞分裂导致的组织或细胞的异常生长。赘生性生长可以产生肿瘤。个体中肿瘤的量是“肿瘤负荷”，“肿瘤负荷”可以被测量为肿瘤的数目、体积、尺寸或重量。“非癌性组织”是来自形成恶性赘生物的同一器官，但不具有赘生物的特征性病理的组织。通常，非癌性组织在组织学上看起来是正常的。“正常组织”是来自器官的组织，其中该器官不受癌症或该器官的另一种疾病或紊乱的影响。“无癌症”受试者尚未被诊断为患有该器官的癌症并且不具有可检测到的癌症。

在足以…的条件下(Under conditions sufficient for:)：用于描述允许所期望活性的任何环境的措辞。在一个实例中，包括向细胞或受试者施用足以允许期望的活性的治疗剂。在特定实例中，所期望的活性是增加GITR活性(诸如激动效应T细胞、降低调节性T细胞的抑制活性和谱系稳定性、消耗调节性T细胞，或两者)。

单位剂量：包含预定量的活性物质、被计算为单独地或共同地产生期望的作用，诸如治疗作用的物理上离散单元。单个单位剂量或多于一个单位剂量可以用于提供所期望的作用，诸如治疗肿瘤或转移肿瘤。在一个实例中，单位剂量包括一种或更多种增强或增加GITR表达和/或活性的一种或更多种剂(例如GITR激动剂)和一种或更多种CpG ODN的期望量。

上调：当提及分子诸如(例如GITR)基因或蛋白的表达使用时，指的是导致基因产物产量增加的任何过程。基因产物可以是RNA(诸如mRNA、rRNA、tRNA、和结构RNA)或蛋白。因此，上调包括增加基因转录或mRNA翻译以及因此增加蛋白或核酸，诸如GITR蛋白或核酸分子的存在的过程。

可以增加转录的过程的实例包括促进转录起始复合物的降解减少的那些、增加转录起始速率的那些、增加转录延伸速率的那些、增加转录持续性(processivity)的那些和减少转录阻抑的那些。基因上调可以包括将表达增加到高于现有水平。增加翻译的过程的实例包括增加翻译起始的那些、增加翻译延伸的那些和增加mRNA稳定性的那些。在一些实例中，基因表达方法、抗体或其他特异性结合剂被用于增加GITR的表达和/或活性。

上调包括基因产物(诸如GITR蛋白)的任何可检测到的统计学显著增加。在某些实例中，细胞(诸如肿瘤细胞)中可检测的靶蛋白或核酸表达与对照(对应的对照细胞或样品诸如未治疗的肿瘤细胞中检测到的蛋白或核酸的这样的量)相比增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少100％、150％、至少200％、至少250％、至少300％、至少350％、至少400％、至少500％、或大于500％。

载体：在被引入宿主细胞后，从而产生转化的宿主细胞的核酸分子。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包含一种或更多种选择性标志物基因和本领域已知的其他遗传元件。在一些实例中，载体包含启动子和编码GITR的核酸分子。

治疗肿瘤的方法

本文提供了用于治疗受试者，诸如哺乳动物受试者(例如人类、非人的灵长类动物、实验室哺乳动物、或兽医受试者，例如小鼠、大鼠、黑猩猩、猿、马、以及宠物诸如犬和猫)中的肿瘤的方法。受试者可以是儿童或成人。该方法包括瘤内施用有效量的至少一种糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂，和瘤内施用有效量的至少一种CpG ODN或其他TLR9激动剂，从而治疗受试者中的肿瘤。

在一些实例中，至少一种GITR激动剂和至少一种CpG ODN被同时地或同期地施用。在一些实例中，至少一种GITR激动剂和至少一种CpGODN在至少两个不同的时机被施用至少两次，诸如2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次。在一些实例中，GITR激动剂和CpGODN两者以多于一次剂量以至少1天，至少2天、至少5天、至少7天、至少14天、或至少30天的间隔被施用。在一些实例中，该方法还包括施用有效量的一种或更多种另外的治疗剂，诸如一种或更多种化学治疗剂、一种或更多种生物剂、一种或更多种抗血管生成剂、一种或更多种生长抑制剂、一种或更多种抗赘生物组合物，或其组合。在一些实例中，该方法还包括对受试者进行手术，例如切除至少一部分的肿瘤。

GITR激动剂

在一些实例中，GITR激动剂可以增加核酸序列(诸如DNA、cDNA、或mRNA)的表达和/或蛋白。在一些实例中，GITR激动剂增强或增加GITR的生物活性。在一些实例中，使用GITR激动剂的组合。例如，可以使用GITR激动剂，以通过以下增强或增加GITR的活性：例如激动效应T细胞、降低调节性T细胞的抑制活性和谱系稳定性、消耗调节性T细胞、增强GITRL与GITR的结合，或以上的组合。当GITR的下调(或降低的GITR活性)引起、导致或加剧疾病时，这样的增加是可期望的，或者这样的增加是不期望的(例如，增加患有肿瘤的受试者中GITR的生物活性)。

在一些实例中，使用抗体(诸如多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、骆驼科动物抗体、或人源化抗体)、抗体片段、抗体缀合物、有机小分子、无机小分子、大分子、编码GITR的核酸分子、GITR蛋白、GITR配体，或其组合。示例性GITR激动剂靶向GenBank登录号NM_148902.1、NM_148901.1、NM_004195.2、NM_009400.2、或NM_021985.2中所显示的GITR核酸序列(或与这样的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列)、或GenBank登录号NP_683700.1(同种型3前体，成熟肽是aa 26-234)、NP_683699.1(同种型2前体，成熟肽是aa 26-255)、NP_004186.1(同种型1前体，成熟肽是aa 26-241)、NP_033426.1(同种型1前体，成熟肽是aa20-228)或NP_068820.1(同种型2前体，成熟肽是aa 22-132)所显示的GITR蛋白序列(或与这样的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的序列)。在一些实例中，与对照(诸如在治疗之前的量或不存在激动剂时的量)相比，GITR激动剂将GITR的表达和/或活性增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％。

在一些实例中，与对照(诸如在不存在用GITR激动剂治疗时或在用GITR激动剂治疗之前的GITR活性的量)相比，GITR激动剂将GITR活性增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％(诸如增加40％至90％、40％至80％、或50％至95％)。在一些实施方案中，本发明的方法包括测量GITR活性。

在一些实例中，与对照(诸如在不存在用GITR激动剂治疗时或在用GITR激动剂治疗之前的GITR活性的量)相比，GITR激动剂将GITR核酸或蛋白(例如，在肿瘤细胞中)的表达增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％(诸如增加40％至90％、40％至80％或50％至95％)。在一些实施方案中，所公开的方法包括测量GITR核酸或蛋白表达。

GITR激动剂可以对GITR基因序列、编码序列和/或蛋白序列是特异性的。可以用所公开的方法和组合物靶向的示例性序列是已知的(参见以上提供示例性核酸和蛋白序列的示例性登录号)。另外，本领域技术人员将理解，可以靶向保留GITR活性的变体序列。例如，这样的变体可以包括编码具有一个或更多个缺失、取代或添加(或其组合)，诸如1-50个这样的变化(诸如1-40、1-30、1-20、或1-10个这样的变化)的蛋白。在某些实例中，通过所公开的方法或组合物靶向的GITR核酸序列或蛋白序列，与本文提供的登录号具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。

1.用抗体增加GITR生物活性和/或表达

在一个实例中，与一种或更多种CpG ODN组合使用治疗肿瘤的GITR激动剂是抗体。在某些实施方案中，抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人类抗体、双特异性抗体或人源化抗体。在某些实例中，激动剂抗体或抗体片段与哺乳动物GITR，诸如人类GITR特异性结合。这样的抗体的实例包括以高特异性结合GITR的那些抗体。在某些实例中，激动剂抗体以少于1nMK_D结合人类GITR。在一个实例中，激动剂是抗体片段(诸如单链抗体、Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab'、或(Fab')₂)。这样的抗体片段的实例包括以高特异性结合GITR的那些抗体片段。在某些实例中，激动剂抗体片段结合人类GITR。在某些实例中，激动剂抗体片段以少于1nMK_D结合人类GITR。

可以使用的GITR激动剂和抗体的实例包括但不限于：TRX518(来自GITR，Inc.的GITR人源化抗体)、MK-4166(来自Merck的GITR激动剂抗体)、MK-1248(来自Merck)、MEDI1873(来自Medimmune的GITRL-Fc融合蛋白)、BMS(未知实体)、AMG228(来自Amgen)、和INCAGN01876(来自Agenus/Incyte)。另外的激动剂抗GITR抗体被描述在以下中：例如US9493572、US9464139、US9309321、US9228016、US9241992、US8709424、US2017/0145104、US2016/0199487、US2015/0368349、US9005619、WO2017/087678和WO2017/068186。

在一些实施方案中，激动GITR活性的抗体激动效应T细胞、降低调节性T细胞的抑制活性和谱系稳定性、消耗调节性T细胞，或其组合。在一些实施方案中，激动剂抗GITR抗体通过例如激活NF-κB应答激活GITR信号传导功能。如WO 2017/015623的实施例5中所述，可以使用监测NF-κB驱动的报告物分泌型碱性磷酸酶(SEAP)产生的系统来测定该激活。如其中所述，将包含NF-κB驱动的SEAP报告物基因(从Invivogen，San Diego，CA，USA获得)的HEK293细胞系用GITR稳定地转染，并且然后将细胞系与滴定剂量的抗GITR抗体在37℃一起孵育过夜。然后通过监测650纳米处光密度的变化，通过水解显色底物，在细胞培养物上清液中定量每次剂量的SEAP报告物基因表达。由于添加抗体，该测定中的SEAP产量增加超过背景，表明抗体激活GITR信号传导功能。

在一些实施方案中，激动性GITR抗体以以下的结合亲和力(K_D)与GITR结合：少于50nM、少于20nM、少于10nM、或少于1nM。在一些实施方案中，激动性GITR抗体与不相关的非GITR蛋白的结合程度少于抗体与GITR结合的约10％，例如通过放射免疫测定(RIA)测量的。在一些实施方案中，激动性GITR抗体与来自不同物种的GITR中是保守的GITR的表位结合。在一些实例中，激动性GITR抗体与结合人类GITR的人类或人源化GITR抗体相同的表位结合。

在一些实施方案中，激动性GITR抗体针对GITR具有以下解离常数(Kd)：≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10^-8M或更少，例如从10^-8M到10^-13M，例如从10^-9M到10^-13M)。

在一些实施方案中，GITR激动性抗体与来自多于一个物种的GITR结合。例如，在一些实施方案中，抗体与人类GITR结合，并且还与来自选自小鼠、大鼠、犬、豚鼠、和猴中的至少一种哺乳动物的GITR结合。在一些实例中，抗体与来自仅一个物种(诸如仅智人(Homosapiens))的GITR结合。

在一些实施方案中，本文的激动剂抗GITR抗体可以具有一种或更多种以下特性：(a)包含GITR结合结构域，针对GITR具有少于10nM的K_D；(b)与人类和食蟹猴GITR两者结合；(c)阻断GITR与其配体GITRL之间的结合；和(d)共刺激抗肿瘤应答，同时还抑制调节性T细胞(Treg)的抑制作用。

在一个实例中，与GITR结合的激动性抗体是多特异性抗体，诸如双特异性抗体或双重可变结构域抗体。非限制性的示例性双特异性抗体包括包含第一臂和第二臂的抗体，所述第一臂包含结合第一抗原的重链/轻链组合，所述第二臂包含结合第二抗原的重链/轻链组合。在一些实施方案中，双特异性抗体包含结合GITR的第一臂和刺激免疫细胞成熟的第二臂。

在一个实例中，与GITR结合的激动性抗体是单链抗体，诸如骆驼科动物抗体，或者包含衍生自这样的抗体的GITR结合结构域。例如，在一些实施方案中，抗GITR抗体可以包含特异性结合GITR的至少一种多肽，其中所述多肽包含至少一个GITR结合结构域，所述至少一个GITR结合结构域包含衍生自例如单结构域抗体的三个互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，至少一个GITR结合结构域包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)、和互补决定区3(CDR3)，所述互补决定区1(CDR1)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，所述互补决定区2(CDR2)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列)，所述互补决定区3(CDR3)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体是多价的(或多价体multivalent))，并且包含多于一个具有以上CDR组的这样的GITR结合结构域。

在一些实施方案中，激动剂抗GITR抗体可以包含含有至少一个GITR结合结构域的至少一种多肽，其中GITR结合结构域又包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同的序列。在一些实施方案中，抗GITR抗体包含两个、三个或四个GITR结合结构域，所述两个、三个或四个GITR结合结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同的序列。

在一些实施方案中，激动剂抗GITR抗体包含多价体融合蛋白，所述多价体融合蛋白包含与人类恒定区(诸如人类IgG Fc)融合的两个或更多个GITR结合结构域。在一些这样的实施方案中，两个或更多个GITR结合结构域串联(in tandem)(其中“串联”包括其中GITR结合结构域顺序发生但任选地在它们中间具有插入的非Fc序列的构型)。在一些实施方案中，GITR结合结构域衍生自单结构域抗体，并且包含三个互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，至少一个或所有GITR结合结构域包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3，所述互补决定区1(CDR1)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列)，所述互补决定区2(CDR2)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，所述互补决定区3(CDR3)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些这样的实施方案中，人类IgG Fc是人类IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的Fc。在一些实施方案中，多价体融合蛋白包含串联的与选自人类IgG1Fc、IgG2Fc、IgG3Fc、和IgG4Fc的人类IgG Fc融合的两个、三个或四个GITR结合结构域，每个GITR结合结构域具有以上CDR组。

在一些实施方案中，激动剂抗GITR抗体包含多价体融合蛋白，所述多价体融合蛋白包含与人类恒定区(诸如人类IgG Fc，例如人类IgG1Fc、IgG2Fc、IgG3Fc、或IgG4Fc)融合的两个或更多个GITR结合结构域。在一些这样的实施方案中，两个或更多个GITR结合结构域串联。在一些这样的实施方案中，至少一个或所有GITR结合结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5至少90％、至少91％、至少92％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同的序列。在一些这样的实施方案中，人类恒定区是人类IgG Fc，诸如人类IgG1Fc、IgG2Fc、IgG3Fc、或IgG4Fc。在一些实施方案中，多价体融合蛋白包含串联的与选自人类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc的人类IgG Fc融合的两个、三个或四个GITR结合结构域，每个GITR结合结构域包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。

四价分子

在一些实施方案中，抗GITR抗体包含含有两个拷贝的具有以下结构的融合蛋白的四价分子：(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc，其中(a)GITR-BD是GITR结合结构域，包含(i)互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)、和互补决定区3(CDR3)，所述互补决定区1(CDR1)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；所述互补决定区2(CDR2)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；所述互补决定区3(CDR3)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；或者包含(ii)SEQID NO:5氨基酸序列或与SEQ ID NO:5至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同的序列；(b)接头是接头多肽；(c)铰链是衍生自免疫球蛋白铰链区的多肽；且(d)Fc是免疫球蛋白Fc区多肽。

在四价分子的融合蛋白包含铰链的一些实施方案中，铰链包含SEQ ID NO:15、16或17的氨基酸序列。例如，铰链可以包含修饰的IgG1铰链(包含EPKSSDKTHTCPPC(SEQ IDNO:15)的氨基酸序列)，其中与轻链的C-末端半胱氨酸形成二硫键的Cys220被突变为丝氨酸，例如Cys220Ser(C220S)。在其他实施方案中，融合蛋白可以包含含有氨基酸序列DKTHTCPPC(SEQ ID NO:16)的铰链。在一些实施方案中，铰链包含来自被修饰以例如阻止或减少链交换(例如，包含Ser228被突变为Pro(S228P)的氨基酸序列ESKYGPPCPPC(SEQ IDNO:17))的IgG4的铰链。

在四价分子的融合蛋白包含接头的一些实施方案中，接头包含选自GG、GGG、和SEQID NO:18至24中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含SEQ ID NO:18或22的氨基酸序列。在一些实施方案中，四价分子的融合蛋白具有包含SEQ ID NO:16的铰链和包含SEQ ID NO:18或22的接头。

在四价分子的融合蛋白包含Fc的一些实施方案中，Fc是人类Fc，诸如人类IgG1Fc、IgG2Fc、IgG3Fc、或IgG4Fc。在一些实施方案中，Fc包含选自SEQ ID NO:9-14的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9-14之一至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同的序列。在一些实施方案中，Fc包含人类IgG1氨基酸序列诸如SEQ ID NO:9。

示例性四价分子示于图4A和图4B中。例如，图4A说明了二聚体形式的示例性四价分子，其中每个亚基(多肽)具有(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc结构，并且其中每个亚基都通过铰链与另一个亚基缔合，并且其中Fc分子包含CH2和CH3结构域。例如，图4B说明了可选的(GITR-BD)-铰链-Fc-接头-(GITR-BD)结构。图4C和图4D示出了具有与这两种四价分子相关结构的六价分子，即图4C中的(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc和图4D中的(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc-接头-(GITR-BD)。

在一些实施方案中，激动剂抗GITR抗体是包含两个拷贝的多肽的四价分子，所述多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同的序列。

Fc区

在任何前述的实施方案中，Fc可以包含选自SEQ ID NO:9-14的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9-14之一至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同的序列。在一些实施方案中，Fc包含人类IgG1氨基酸序列，诸如SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，Fc包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，但在其中位置Asn297(在序列表中显示的序列中被加框)处被修饰以抑制岩藻糖基化。在一些实施方案中，Fc是人类IgG1Fc，但其中位置Leu235、Leu236、和Gly237(在序列表中显示的序列中被加框)中的一个或更多个已经被修饰为其他氨基酸。在一些实施方案中，Fc包含缺乏Lys447的人类IgG1Fc。在一些实施方案中，Fc是在Glu233、Leu234、或Leu235中的一个或更多个处缺乏氨基酸的人类IgG1Fc，如在例如SEQ ID NO:10中提供的。在一些实施方案中，Fc包含人类IgG2Fc例如SEQ ID NO:11。在一些实施方案中，Fc包含被修饰例如在Asn297(在序列表中被加框)处被突变或缺失Lys447的人类IgG2Fc。在一些实施方案中，Fc包含人类IgG3Fc例如SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，Fc包含被修饰例如在Asn297处被突变，在位置435处Arg至His取代(在序列表中Asn297和Arg两者均被加框)，或缺失Lys447的人类IgG3Fc。在一些实施方案中，Fc包含人类IgG4Fc例如SEQ ID NO:13或14。在一些实施方案中，Fc包含被修饰例如在位置Leu235或Asn297(在序列表中两者均被加框)处被突变或缺失Lys447的人类IgG4Fc。

在一些实施方案中，人类IgG Fc区被修饰以增强FcRn结合。可以增强与FcRn结合的Fc突变的实例是Met252Tyr、Ser254Thr、Thr256Glu(分别为M252Y、S254T、T256E)(Kabat编号,Dall’Acqua等人2006,J.Biol Chem,281(33)23514–24)、Met428Leu和Asn434Ser(M428L、N434S)(alevsky等人2010Nature Biotech,28(2)157-9)、或Met252Ile、Thr256Asp、Met428Leu(分别为M252I、T256D、M428L)(Kabat等人1991Sequences ofProteins of Immunological Interest的EU指数)。

在一些实施方案中，突变的Fc还可以包括用以下取代：使用Kabat编号系统编号的Met252Tyr和Met428Leu(M252Y、M428L)。

在一些实施方案中，人类IgG Fc区可以被修饰，以改变抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如在以下中描述的氨基酸修饰：Natsume等人,2008Cancer Res,68(10):3863-72；Idusogie等人,2001J Immunol,166(4):2571-5；Moore等人,2010mAbs,2(2):181-189；Lazar等人,2006PNAS,103(11):4005–4010,Shields等人,2001JBC,276(9):6591–6604；Stavenhagen等人,2007Cancer Res,67(18):8882-8890；Stavenhagen等人,2008Advan.Enzyme Regul.,48:152-164；Alegre等人,1992J Immunol,148:3461-3468；Reviewed in Kaneko and Niwa,2011Biodrugs,25(1):1-11。可以增强ADCC的突变的实例包括在Ser239和Ile332处的修饰，例如Ser239Asp和Ile332Glu(S239D、I332E)。可以增强CDC的突变的实例包括在Lys326和Glu333处的修饰。在一些实施方案中，Fc区在这些位置的一个或两个处被修饰，例如使用Kabat编号系统的Lys326Ala和/或Glu333Ala(K326A和E333A)。

在一些实施方案中，人类IgG Fc区可以被修饰，以诱导异二聚化。例如，在CH3结构域内在Thr366处具有氨基酸修饰(当Thr366被更大体积氨基酸例如，Typ代替(T366W))时)，能够与具有在位置Thr366、Leu368、和Tyr407处分别为不太大体积氨基酸,例如Ser、Ala和Val的氨基酸修饰(T366S/L368A/Y407V)的第二CH3结构域优先配对。例如，另外的CH3结构域修饰可以包括在相对的CH3结构域上将Ser354改变为Cys(S354C)和将Y349改变为Cys(Y349C)(在Carter,2001Journal of Immunological Methods,248:7–15中综述的)。

在一些实施方案中，人类IgG Fc区被修饰，以阻止或降低Fc结构域的二聚化。例如，残基Thr366可以被带电荷的残基取代，例如，Thr366Lys、Thr366Arg、Thr366Asp、或Thr366Glu(分别为T366K、T366R、T366D、或T366E，这在一些情况下可以阻止CH3-CH3二聚化。

在一些实施方案中，Fc区可以在以下位置的一个或更多个处被改变，以降低Fc受体结合：Leu 234(L234)、Leu235(L235)、Asp265(D265)、Asp270(D270)、Ser298(S298)、Asn297(N297)、Asn325(N325)或Ala327(A327)。例如，Leu 234Ala(L234A)、Leu235Ala(L235A)、Asp265Asn(D265N)、Asp270Asn(D270N)、Ser298Asn(S298N)、Asn297Ala(N297A)、Asn325Glu(N325E)或Ala327Ser(A327S)。在一些实施方案中，Fc区内的修饰当对新生儿Fc受体具有最小影响时可以降低与Fc-γ受体的结合。

序列表

a.人源化抗体

在一个实例中，与GITR结合的激动性抗体是人源化抗体。人源化抗体可用作治疗性分子，因为人源化抗体降低或消除对非人类抗体的人类免疫应答(诸如人类抗小鼠抗体(HAMA)应答)，对非人类抗体的人类免疫应答可以导致对抗体治疗剂的免疫应答、和减少的治疗效力。抗体可以通过任何方法被人源化。非限制性的示例性人源化方法包括例如在以下中描述的方法：美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；6,180,370；Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-27(1988)；Verhoeyen等人,Science 239:1534-36(1988)；和美国公布号US2009/0136500。

人源化抗体是其中非人类可变区的框架区中的至少一个氨基酸已经被来自人类框架区中的对应位置的氨基酸代替的抗体。在一些实施方案中，非人类可变区的框架区中的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少10个、至少11个、至少12个、至少15个、至少20个氨基酸被来自一个或更多个人类框架区中的一个或更多个对应位置的氨基酸代替。

在一些实施方案中，用于取代的对应的人类氨基酸的一些来自不同人类免疫球蛋白基因的框架区。即，在一些这样的实施方案中，一种或更多种非人类氨基酸中的一个或更多个可以被来自第一人类抗体的人类框架区的对应氨基酸代替，或者由第一人类免疫球蛋白基因编码；一种或更多种非人类氨基酸中的一个或更多个可以被来自第二人类抗体的人类框架区的对应氨基酸代替，或者由第二人类免疫球蛋白基因编码；一种或更多种非人类氨基酸中的一个或更多个可以被来自第三人类抗体的人类框架区的对应氨基酸代替，或者由第三人类免疫球蛋白基因编码，等等。此外，在一些实施方案中，被用于在单个框架区例如FR2中取代的所有对应的人类氨基酸，不需要来自同一人类框架区。然而，在一些实施方案中，被用于取代的所有对应的人类氨基酸来自同一人类抗体或由同一人类免疫球蛋白基因编码。

在一些实施方案中，通过用对应的人类框架区代替一个或更多个整个框架区来对抗体进行人源化。在一些实施方案中，选择与被代替的非人类框架区具有最高水平同源性的人类框架区。在一些实施方案中，这样的人源化抗体是CDR-接枝抗体。

在一些实施方案中，在CDR接枝后，将一个或更多个框架氨基酸改变回小鼠框架区中的对应氨基酸。在一些实施方案中，进行这样的“回复突变(back mutations)”以保留一个或更多个小鼠框架氨基酸，该一个或更多个小鼠框架氨基酸似乎有助于一个或更多个CDR的结构，和/或可能参与抗原接触，和/或似乎参与抗体的整体结构完整性。在一些实施方案中，对CDR接枝后的抗体的框架区进行10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、一个、或零个回复突变。

在一些实施方案中，人源化抗体还包括人类重链恒定区和/或人类轻链恒定区。

b.嵌合抗体

在一个实例中，GITR特异性激动性抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，GITR特异性激动性抗体包含至少一个非人类可变区和至少一个人类恒定区。在一些这样的实施方案中，GITR特异性激动性抗体的所有可变区是非人类可变区，并且GITR特异性激动性抗体的所有恒定区是人类恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体的一个或更多个可变区是小鼠可变区。嵌合抗体的人类恒定区不需要具有与它所替换的非人类恒定区(如果有的话)相同的同种型。嵌合抗体在以下中被描述：例如美国专利红啊4,816,567；和Morrison等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-55(1984)。

c.人类抗体

在一个实例中，GITR激动性抗体是人类抗体。可以通过任何合适的方法制备人类抗体。非限制性的示例性方法包括，在包含人类免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制备人类抗体。参见，例如，Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551-55(1993)；Jakobovits等人,Nature 362:255-8(1993)；Lonberg等人,Nature 368:856-9(1994)；和美国专利号5,545,807；6,713,610；6,673,986；6,162,963；5,545,807；6,300,129；6,255,458；5,877,397；5,874,299；和5,545,806。非限制性的示例性方法还包括，使用噬菌体展示文库制备人类抗体。参见，例如，Hoogenboom等人,J.Mol.Biol.227:381-8(1992)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-97(1991)；和PCT公布号WO 99/10494。

d.人类抗体恒定区

在一些实施方案中，本文描述的人源化、嵌合、或人类GITR激动性抗体包含一个或更多个人类恒定区。在一些实施方案中，人类重链恒定区具有选自IgA、IgG、和IgD的同种型。在一些实施方案中，人类轻链恒定区具有选自κ和λ的同种型。在一些实施方案中，GITR激动性抗体包含人类IgG恒定区，例如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。在一些实施方案中，抗体或Fc融合配偶体包含C237S突变(例如在IgG1恒定区中)。在一些实施方案中，GITR激动性抗体包含人类IgG2重链恒定区。在一些这样的实施方案中，IgG2恒定区包含P331S突变，如美国专利号6,900,292中所述。在一些实施方案中，GITR激动性抗体包含人类IgG4重链恒定区。在一些这样的实施方案中，GITR激动性抗体在人类IgG4恒定区中包含S241P突变。参见，例如，Angal等人Mol.Immunol.30(1):105-108(1993)。在一些实施方案中，GITR激动性抗体包含人类IgG4恒定区和人类κ轻链。

重链恒定区的选择可以确定抗体在体内是否将具有效应物功能。在一些实施方案中，这样的效应物功能包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，并且可以导致杀死与抗体结合的细胞。通常，包含人类IgG1或IgG3重链的抗体具有效应物功能。

在一些实施方案中，效应物功能是不期望的。例如，在一些实施方案中，在肿瘤治疗中，效应物功能可能是不期望的。在一些这样的实施方案中，选择或设计人类IgG4或IgG2重链恒定区。在一些实施方案中，IgG4恒定区包含S241P突变。

e.抗体缀合物

在一些实施方案中，激动性GITR抗体与标记物缀合。标记物是促进抗体检测和/或促进与抗体结合的分子检测的部分。非限制性的示例性标记物包括但不限于放射性同位素，荧光基团、酶促基团、化学发光基团、生物素、表位标记、金属结合标签等。在一些实施方案中，在体外，使用化学方法将标记物与抗体缀合。非限制性的示例性化学缀合方法是本领域熟知的，并且包括从以下商购可得的服务、方法和/或试剂：例如Thermo ScientificLife Science Research Produces(以前被称为Pierce；Rockford,IL)、Prozyme(Hayward,CA)、SACRI Antibody Services(Calgary,Canada)、AbD Serotec(Raleigh,NC)等等。在一些实施方案中，当标记物是多肽时，该标记物可以由具有至少一条抗体链的同一表达载体表达，以产生包含与抗体链融合的标记物的多肽。

在一些实施方案中，将特异性结合并杀死调节性T细胞而不是效应T细胞的激动性GITR抗体与化合物(诸如毒素或药物)例如通过接头缀合。这样的化合物有时被称为抗体药物缀合物(ADC)。接头可以是可裂解的或不可裂解的。示例性毒素包括但不限于细胞毒素(诸如，化学治疗剂、损害DNA的剂、干扰微管蛋白聚合的剂)，或放射性核素(在本公开内容的其他地方提供了这样的细胞毒素的实例)。在一个实例中，毒素是植物来源的蛋白毒素(诸如白树毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素或美洲商陆(pokeweed)抗病毒蛋白)、或细菌毒素(诸如假单胞菌(Pseudomonas)外毒素和白喉(Diphtheria)毒素)。

f.抗体的产生

在一些实例中，使用产生多克隆或单克隆抗体的常规方法产生GITR抗体。

在一些实施方案中，本文描述的GITR抗体在无细胞系统中产生。非限制性的示例性无细胞系统在以下中被描述：例如，Sitaraman等人,Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,Trends Biotechnol.22:538-45(2004)；Endo等人,Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)。

在一些实例中，本文描述的GITR抗体由核酸分子产生，其中所述核酸分子编码本文描述的抗体的一条或更多条链。在一些实例中，核酸分子包括编码本文描述的GITR抗体的重链或轻链的多核苷酸。在一些实例中，核酸分子包括编码本文描述的GITR抗体的重链的多核苷酸和编码本文描述的GITR抗体的轻链的多核苷酸两者。在一些实施方案中，第一核酸分子包括编码重链的第一多核苷酸，并且第二核酸分子包括编码轻链的第二多核苷酸。在一些这样的实例中，重链和轻链由一个核酸分子或者作为两个单独的多肽由两个单独的核酸分子表达。在一些实施方案中，诸如当抗体是scFv时，单个多核苷酸编码包含连接在一起的重链和轻链的单个多肽。

在一些实例中，编码GITR抗体的重链或轻链的多核苷酸包含编码前导序列的核苷酸序列，前导序列在翻译时位于重链或轻链的N末端。如上所讨论的，前导序列可以是天然重链或轻链前导序列，或者可以是另一种异源前导序列。

可以使用重组DNA技术构建核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子是适用于在选择的宿主细胞中表达的表达载体(诸如下文描述的那些载体)。GITR抗体的重链和/或轻链可以在原核细胞，诸如细菌细胞；或在真核细胞，诸如真菌细胞(诸如酵母)、植物细胞、昆虫细胞、和哺乳动物细胞中表达。在一些实例中，根据任何合适的方法，可以在已经用编码多肽的一个或更多个核酸分子工程化或转染的动物体内产生一种或更多种多肽。

可以通过任何合适的方法纯化GITR抗体，所述任何合适的方法诸如通过使用亲和基质或疏水性相互作用层析。合适的亲和配体包括与抗体结合的抗原和/或表位、以及结合抗体恒定区的配体。例如，蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、或抗体亲和柱可以被用于结合恒定区并纯化抗体。在一些实施方案中，疏水性相互作用层析(例如丁基或苯基柱)，也用于纯化一些多肽。

2.用核酸增加GITR生物活性和/或表达

在一个实例中，通过使用编码GITR的核酸分子增强或增加GITR生物活性。例如，编码GITR的核酸分子可以被用于增加GITR的基因表达，例如在上调是期望的情况下(例如，增加肿瘤中或肿瘤的区域中的GITR的表达)。

在一些实例中，编码GITR的核酸分子将GITR的表达增加，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少75％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、或至少500％。在一些实例中，例如，相对于不存在编码GITR的核酸分子时的GITR的生物活性，编码GITR的核酸分子将GITR的生物活性增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、或至少500％。示例性编码GITR的核酸分子以以下来提供：在GenBank登录号NM_148902.1、NM_148901.1、NM_004195.2、NM_009400.2、和NM_021985.2(或与这样的序列具有至少70％、至少80％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、或至少99％序列同一性的序列)

编码GITR的核酸分子可以使用常规方法引入受试者的细胞(诸如肿瘤细胞)，常规方法诸如通过用重组载体(例如，质粒或病毒载体，例如将编码GITR的核酸分子置于适合的启动子控制下)；或通过使用裸露的核酸或核酸复合物(非病毒方法，诸如脂质体包封的RNA)。示例性载体包括但不限于DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、和逆转录病毒载体。可以使用的示例性病毒载体包括但不限于：痘病毒、重组痘苗病毒、逆转录病毒(诸如慢病毒)、复制缺陷型腺病毒株、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒、或脊髓灰质炎病毒。示例性启动子包括组成型或诱导型启动子，诸如组织特异性启动子。

可以通过任何方法将一种或更多种核酸引入所期望的宿主细胞，所述方法包括但不限于磷酸钙转染DEAE-右旋糖酐介导的转染阳离子脂质介导的转染电穿孔转导感染等等。非限制性的示例性方法在以下中被描述：例如Sambrook等人,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)。根据任何合适的方法，可以在所期望的宿主细胞中瞬时地或稳定地转染核酸。

在一些实例中，编码GITR的核酸分子仅被引入某些细胞或组织中。例如，将编码GITR的核酸分子仅引入肿瘤可能就足够了。然而，在一些情况下，通过例如血管内施用，可能更加在治疗上有效且简单的治疗所有受试者的细胞，或者更广泛地传播编码GITR的核酸分子。在一些实例中，编码GITR的核酸分子被直接施用至受试者，例如通过注射(皮内、肌内、静脉内、瘤内、或皮下)、局部施用、口服施用、吸入、输注、沉积、或植入。

3.用GITR蛋白增加GITR生物活性

在一个实例中，通过使用GITR蛋白增强或增加GITR生物活性。例如，GITR蛋白可以被用于增加GITR活性，例如在上调是期望的情况下(例如，增加肿瘤区域中GITR的活性)。

可以用于增加GITR活性的示例性GITR蛋白包括具有登录号NP_683700.1(同种型3前体，成熟肽是aa 26-234)、NP_683699.1(同种型2前体，成熟肽是aa26-255)、NP_004186.1(同种型1前体，成熟肽是aa26-241)、NP_033426.1(同种型1前体，成熟肽是aa 20-228)或NP_068820.1(同种型2前体，成熟肽是aa 22-132)所显示的GITR蛋白序列，或与这样的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、或至少99％序列同一性的GITR序列的那些。

在一些实例中，与对照(诸如在治疗之前的量或不存在蛋白时的量)相比，施用GITR蛋白将GITR的活性增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％。

CpG ODN

示例性CpG ODN包括B类ODN，诸如SEQ ID NO:1(5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3'，具有为硫代磷酸酯的碱基)中所显示的人类CpG序列，和SEQ ID NO:2(5’-tccatgacgttcctgacgtt-3’，具有为硫代磷酸酯的碱基)中所显示的鼠CpG ODN序列。在一个实例中，CpG ODN具有序列5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3'SEQ ID NO:3(来自Dynavax的ISS1018)。

施用和剂量

所公开的方法包括向具患肿瘤的受试者提供治疗有效量的一种或更多种GITR激动剂和一种或更多种CpG ODN或其他TLR9激动剂，例如与治疗有效量的其他疗法组合提供。一种或更多种GITR激动剂和一种或更多种CpG ODN(或其他TLR9激动剂)被例如同时地或同期地瘤内施用。本文显示，瘤内施用相对于全身性施用提供了出乎意料且优异的结果。根据受试者的物种、年龄、体重和一般状况所使用的具体治疗剂及其施用方式，所需剂量可以从受试者到受试者不同。在一些实例中，所公开的方法还包括与一种或更多种GITR激动剂和一种或更多种CpG ODN(或其他TLR9激动剂)组合，例如，顺序地、基本上同时地、或同时地向受试者提供手术和/或其他疗法一种或更多种一种或更多种。

施用可以通过单次剂量或多于一次剂量来完成。在一些实例中，治疗可能包括在几天到几个月、或甚至几年的时间内，每天一次或每天多次或少于每天一次(诸如每周一次或每月一次等)剂量的本文提供的一种或更多种治疗剂。例如，治疗有效量的一种或更多种GITR激动剂可以以单次剂量、每天两次、每周一次或以几次剂量例如每天、或在治疗过程期间被施用。例如，治疗有效量的一种或更多种CpG ODN(或其他TLR9激动剂)可以以单次剂量、每天两次、每周一次或以几次剂量例如每天、或在治疗过程期间被施用。在特定的非限制性实例中，治疗包括每天一次剂量或每天两次剂量的一种或更多种GITR激动剂和一种或更多种CpG ODN(或其他TLR9激动剂)。在一些实例中，一种或更多种GITR激动剂和一种或更多种CpG ODN(或其他TLR9激动剂)被施用至受试者每月一次，少于每月一次诸如例如每两个月、每三个月、或每六个月。在其他实例中，一种或更多种GITR激动剂和一种或更多种CpGODN(或其他TLR9激动剂)被施用多于每月一次诸如例如，每两周、每周、每周两次、每周三次、每天一次、每天多于一次。因此，在一些实例中，所公开的方法包括至少两次单独的瘤内施用有效量的至少一种GITR激动剂和至少两次单独的瘤内施用有效量的至少一种CpGODN。

一种或更多种GITR激动剂和/或一种或更多种CpG ODN(或其他TLR9激动剂)可以呈固体、溶液、乳液、分散体、微团(micelle)、脂质体等的形式，例如，与适用于瘤内应用的有机或无机运载体或赋形剂混合使用。一种或更多种GITR激动剂和/或一种或更多种CpGODN(或其他TLR9激动剂)可以与例如用于丸剂、溶液、乳液、悬浮液和任何其他适合使用的无毒、药学上可接受的载体混合。可用于本公开内容的药学上可接受的运载体(媒介物)是常规的。E.W.Martin的Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,PA,第15版(1975)，描述了适用于药物递送一种或更多种治疗剂的组合物和制剂。示例性运载体包括葡萄糖、乳糖、阿拉伯胶、明胶、甘露醇、淀粉糊、三硅酸镁、滑石、玉米淀粉、角蛋白、胶体二氧化硅、马铃薯淀粉、尿素、中链长度甘油三酯、右旋糖酐，以及适用于在制备固体、半固体、或液体形式的制品中使用的其他运载体。另外，可以使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、和着色剂以及香料。

通常通过注射实现瘤内施用。可注射剂(injectables)可以以常规形式被制备为液体溶液或悬浮液、适于在注射前以液体的溶液或悬浮的固体形式，或者为乳液。注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒剂、和片剂来制备。用于瘤内施用的制品(诸如无菌可注射悬浮液)包括无菌水性溶液或非水性溶液、悬浮液、和乳液。悬浮液可以根据已知方法使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油、和可注射的有机酯诸如油酸乙酯。水性运载体包括水、醇/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇，及其组合。示例性媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液(lactatedRinger's)、或不挥发性的油。还可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、缓冲液和惰性气体等。在一个实例中，包含一种或更多种GITR激动剂和/或一种或更多种CpG ODN(或其他TLR9激动剂)的无菌可注射制品是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如，如在1,3-丁二醇中的溶液。无菌的不挥发性油可以用作溶剂或悬浮介质。为这个目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成甘油单酯或甘油二酯，脂肪酸，天然存在的植物油如芝麻油、椰子油、花生油、棉籽油等，或合成脂肪媒介物如油酸乙酯等。

在一个实例中，包含一种或更多种GITR激动剂和/或一种或更多种CpG ODN(或其他TLR9激动剂)的组合物通过以下被配制用于注射，包括瘤内施用：将它们溶解、悬浮或乳化在水性或非水性溶剂(诸如植物油或其他油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯、或丙二醇)中；并且如果期望，用常规添加剂诸如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂配制。在多种实施方案中，组合物还可以用诸如生物可降解或生物不可降解的聚合物被配制成持续释放微胶囊。非限制性的示例性生物可降解制剂包括聚乳酸-乙醇酸聚合物。非限制性的示例性生物不可降解制剂包括聚甘油脂肪酸酯。制备这样的制剂的某些方法在例如EP 1 125 584A1中被描述。

一种或更多种GITR激动剂和/或一种或更多种CpG ODN(或其他TLR9激动剂)单独地或与其他疗法组合可以以如下形成的药学上可接受的酸-或碱-加成盐被施用：通过与无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸)和有机酸(诸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸)反应；或通过与无机碱(诸如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾)和有机碱(如单-烷基、二烷基-、三烷基和芳基胺和取代的乙醇胺)反应。

在一些实施方案中，核酸分子(诸如编码GITR的核酸分子或CpG ODN)使用基因疗法递送。作为非限制性实例，核酸分子可以被涂覆在金微粒上并且通过粒子轰击装置或“基因枪”递送，例如，如文献中所述(参见，例如，Tang等人,Nature 356:152-154(1992))。

一种或更多种GITR激动剂和/或一种或更多种CpG ODN(或其他TLR9激动剂)的治疗剂量可以由有经验的临床医生确定。其他治疗剂，例如用于治疗肿瘤的剂，也适用于与一种或更多种GITR激动剂和一种或更多种CpG ODN(或其他TLR9激动剂)组合施用。

在一些实施方案中，GITR激动性抗体、抗体片段、或抗体缀合物的剂量少于用于全身性施用的剂量，诸如少于用于全身性施用的剂量的至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少75倍、或至少100倍。在一些实例中，GITR激动性抗体的剂量不多于1mg/kg、不多于0.3mg/kg、不多于0.25mg/kg、不多于0.03mg/kg、不多于0.01mg/kg。在一些实施方案中、GITR激动性抗体的剂量为至少0.01mg/kg、至少0.03mg/kg、至少0.25mg/kg、至少0.3mg/kg、或至少1mg/kg。在一些实施方案中，GITR激动性抗体的剂量为约0.001mg/kg至约5mg/kg，诸如约0.01mg/kg至约5mg/kg、约0.01mg/kg至约1mg/kg、或约0.03mg/kg至约1mg/kg。在一些实例中，抗体的剂量为约0.01mg/kg、约0.02mg/kg、约0.03mg/kg、约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.25mg/kg、约0.3mg/kg、约0.5mg/kg、约0.8mg/kg、或约1mg/kg。

在一些实施方案中，GITR蛋白的剂量为至少0.2μg、至少0.5μg、至少1μg、至少2μg、至少5μg、或至少10μg。在一些实例中，至少一种GITR蛋白的有效量不多于100μg、不多于50μg、不多于25μg、不多于10μg、或不多于2μg，例如1μg至100μg。

在一些实例中，至少一种CpG ODN的剂量为至少0.05mg、至少0.3mg、至少1mg、至少3mg、至少6mg、至少18mg、或至少20mg，例如0.05mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、1mg、3mg、6mg、14mg或18mg。在一些实例中，至少一种CpG ODN的剂量不多于20mg、不多于10mg、不多于1mg、不多于0.3mg，或不多于0.05mg，诸如0.05mg至20mg。

在一些实施方案中，激动性小分子的剂量为至少1mg/kg、至少10mg/kg、至少50mg/kg、至少100mg/kg、至少500mg/kg、或至少1000mg/kg，诸如约1mg/kg至约1000mg/kg、约10mg/kg至约200mg/kg、约10mg/kg至约100mg/kg、或约100mg/kg至约500mg/kg。在一些实例中，激动性小分子的剂量为约1mg/kg、约2mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约8mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、或约25mg/kg。在其他实施方案中，激动性小分子的剂量为至少1mg/m²、至少10mg/m²、至少50mg/m²、至少100mg/m²、或至少500mg/m²，诸如约50mg/m²至约500mg/m²，诸如约50mg/m²至约400mg/m²、约100mg/m²至约400mg/m²、或约250mg/m²至约400mg/m²。在一些实例中，剂量为约50mg/m²、约100mg/m²、约150mg/m²、约200mg/m²、约250mg/m²、约300mg/m²、约400mg/m²、或约500mg/m²、。

在一些实例中，编码GITR的核酸(单独的或作为质粒或载体的一部分)的剂量为约1mg至约1000mg、约10mg至约500mg、约1mg至约10mg、或约50mg至约100mg。在一些实例中，编码GITR的核酸的剂量为约1mg、约2mg、约2.5mg、约3mg、约5mg、约10mg、约50mg、约100mg、约250mg、约500mg或约1000mg。在一些实施方案中，编码GITR的核酸的剂量为约1mg/kg至约100mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约5mg/kg至约500mg/kg、约10mg/kg至约100mg/kg、或约25mg/kg至约50mg/kg。在一些实例中，编码GITR的核酸的剂量为约1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、约5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、约10mg/kg、约12.5mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg或约100mg/kg。应当理解，这些剂量仅仅是实例，并且适当的剂量可以由本领域普通技术人员来确定。

在一些实例中，包含编码GITR的核酸的病毒颗粒作为制品的一部分被施用，所述制品具有至少1×10⁵pfu/ml、至少1×10⁶pfu/ml、至少1×10⁷，至少1×10⁸pfu/ml、至少1×10⁹pfu/ml、或至少1×10¹⁰pfu/ml、并且在一些实例中，不超过2×10¹¹pfu/ml的病毒颗粒的滴度。包含编码GITR的核酸分子的病毒颗粒可以与药学上可接受的运载体组合，例如以多至10ml的体积被施用。药学上可接受的运载体可以是，例如，液体运载体，诸如盐溶液、硫酸鱼精蛋白或聚凝胺。

另外的治疗剂的施用

本申请包括组合疗法。GITR激动剂和CpG ODN可以与其他生物活性物质或用于治疗肿瘤的其他治疗程序组合被施用至受试者。例如，GITR激动剂和CpG ODN可以单独地或与其他治疗方式一起被施用。它们可以在其他治疗方式(诸如手术、放射疗法、化学疗法和/或生物疗法)之前、基本上同期地或之后被提供。例如，GITR激动剂和CpG ODN可以与一种或更多种抗癌剂诸如化学治疗剂、生长抑制剂、抗血管生成剂、抗赘生物组合物、生物剂(例如治疗性mAb)，或其组合结合被施用。

在一些实例中，GITR激动剂和CpG ODN与可用于治疗癌症的一种或更多种其他剂组合使用，所述其他剂诸如化学治疗剂、生物剂(例如，治疗性单克隆抗体)、抗血管生成剂、生长抑制剂、放射疗法、手术、或其组合。可以使用的化学治疗剂的实例包括但不限于烷化剂(诸如塞替派和环磷酰胺)；烷基磺酸盐(诸如白消安，英丙舒凡和哌泊舒凡)；氮丙啶类(诸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa))；乙烯亚胺和甲基密胺类(methylamelamines)(包括六甲密胺、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲密胺(trimethylolomelamine))；番荔枝内酯类(acetogenins)(特别是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱(包括合成性类似物拓扑替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀；多米卡新(duocarmycin)(包括合成类似物、KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑制素1(spongistatin)；氮芥类(诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥)；亚硝脲类(nitrosoureas)(诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫斯汀和雷莫司汀)；抗生素类诸如烯二炔抗生素(例如加利车霉素，特别是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见，例如，Agnew,Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；蒽环类抗生素(包括dynemicinA)；二膦酸盐(诸如氯膦酸盐)；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地拖比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉子基-多柔比星和去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素(诸如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌罗霉素、三铁阿霉素)；罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物类诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物(诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙)；嘌呤类似物(诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤)；嘧啶类似物(诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮鸟苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷)；雄激素类(诸如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯)；抗肾上腺素类(诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦)；叶酸补充剂(诸如亚叶酸)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲杀；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；elfornithine；依利醋铵；埃坡霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登素类化合物(maytansinoids)(诸如美登素和安丝菌素)；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；单端孢菌毒素类(特别是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(″Ara-C″)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类(taxoids)(例如紫杉醇；(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、不含克列莫佛(Cremophor)、白蛋白工程化纳米颗粒制剂型紫杉醇(American PharmaceuticalPartners，Schaumberg，Illinois)和多西他塞(doxetaxel)；(-PoulencRorer,Antony,France))；苯丁酸氮芥(chloranmbucil)；(吉西他滨)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物(诸如顺铂、奥沙利铂和卡铂)；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；(长春瑞滨)；novantrone；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊本磷酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar,CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸(leucovorin)的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇类(诸如视黄酸)；卡培他滨；康普瑞汀(combretastatin)；亚叶酸(LV)；奥沙利铂(包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX))；PKC-α、Raf、H-Ras，EGFR(例如厄洛替尼(erlotinib))和VEGF-A的、降低细胞增殖的抑制剂以及上述任何物质的药学上可接受的盐、酸和衍生物。

另外的非限制性的示例性化学治疗剂包括用于调节或抑制激素对癌症作用的抗激素剂，诸如抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂(SERM)(包括例如他莫昔芬(包括他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和他莫昔芬)；抑制在肾上腺中调节雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮、依西美坦、福美坦(formestanie)、法倔唑、伏氯唑(vorozole)、来曲唑和阿那曲唑；和抗雄激素类诸如氟他米特、尼鲁米特、比卡米特、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制异常细胞增殖中所涉及的信号转导途径中的基因(诸如例如PKC-α、Ralf和H-Ras)的表达的反义寡核苷酸；核酶诸如VEGF表达抑制剂(例如核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗诸如基因疗法疫苗，例如疫苗、疫苗、和疫苗；rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；以及上述任何物质的药学上可接受的盐、酸和衍生物。

“抗血管生成剂”是直接或间接抑制血管生成、血管发生(vasculogenesis)或不期望的血管通透性的小分子量化合物、多核苷酸(包括例如抑制性RNA(RNAi或siRNA))、多肽、分离的蛋白、重组蛋白、抗体、或者其缀合物或融合蛋白。抗血管生成剂包括结合并阻断血管生成因子或其受体的血管生成活性的那些剂。在一个实例中，抗血管生成剂是血管生成剂的抗体或其他拮抗剂，例如VEGF-A的抗体(例如，贝伐单抗)或VEGF-A受体(例如，KDR受体或Flt-1-受体)的抗体，抗PDGFR抑制剂诸如(甲磺酸伊马替尼)，阻断VEGF受体信号传导的小分子(例如，PTK787/ZK2284、SU6668、/SU11248(苹果酸舒尼替尼)、AMG706，或例如，国际专利申请WO 2004/113304中所描述的那些)。抗血管生成剂还包括天然血管生成抑制剂，例如血管抑制素、内皮抑素等。参见，例如Klagsbrun和D’Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53:217-39；Streit和Detmar(2003)Oncogene 22:3172-3179(例如，表3，列出了恶性黑素瘤中的抗血管生成疗法)；Ferrara&Alitalo(1999)NatureMedicine 5(12):1359-1364；Tonini等人(2003)Oncogene 22:6549-6556(例如，表2，列出了已知的抗血管生成因子)；和,Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8:200-206(例如，表1，列出了临床试验中使用的抗血管生成剂)。

生长抑制剂是指在体外或体内抑制细胞(诸如表达VEGF的细胞)的生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低S期细胞(诸如表达VEGF的细胞)的百分比的生长抑制剂。生长抑制剂的实例包括但不限于阻断细胞周期进展(在除了S期以外的时期(place))的剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的剂。经典的M期阻断剂包括长春花生物碱类(长春新碱和长春碱)、紫杉烷类、和拓扑异构酶II抑制剂(诸如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素)。阻滞G1的那些剂也会使(spill over)S期阻滞，例如，DNA烷化剂(诸如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和ara-C)。另外的信息可以见于Mendelsohn和Israel,编著,The Molecular Basis of Cancer,第1章,Murakami等人的标题为"Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs"(W.B.Saunders,Philadelphia,1995),例如,第13页中。紫杉烷类(紫杉醇和多西他赛)是来自紫杉树的抗癌药物。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进微管蛋白二聚体组装成微管，并且通过阻止解聚来稳定微管，这导致抑制细胞的有丝分裂。

抗赘生物组合物包括可用于治疗癌症的那些组合物，并且包括至少一种活性治疗剂。治疗剂的实例包括但不限于例如化学治疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、用于放射疗法的剂、抗血管生成剂、癌症免疫治疗剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和治疗癌症的其他生物剂，诸如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER/EGFR抑制剂(例如厄洛替尼)、血小板来源生长因子抑制剂(例如，(甲磺酸伊马替尼))、COX-2抑制剂(例如塞来考昔)、干扰素、CTLA4抑制剂(例如，抗-CTLA抗体伊匹单抗)、PD-1抑制剂(例如，抗PD1抗体、BMS-936558)、PDL1抑制剂(例如，抗PDL1抗体、MPDL3280A)、PDL2抑制剂(例如，抗PDL2抗体)、TIM3抑制剂(例如，抗TIM3抗体)、细胞因子，与以下靶ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA、PD-1、PDL1、PDL2、CTLA4、TIM3或VEGF受体、TRAIL/Apo2中一个或更多个结合的拮抗剂(例如，中和抗体)，以及其他生物活性和有机化学剂等。还可以使用其组合。

可以与GITR激动剂和CpG ODN一起使用治疗癌症的生物剂的其他实例包括但不限于：西妥昔单抗、布妥昔单抗、达雷木单抗(daratumumab)、替依莫单抗、易普利姆玛、纳武单抗(nivolumab)、奥法木单抗、帕尼单抗、派姆单抗(pembrolizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、托西莫单抗/和曲妥珠单抗。

治疗响应

可以用所公开的方法治疗的示例性肿瘤，诸如癌症，包括实体瘤(诸如恶性上皮肿瘤(carcinoma)、胚细胞瘤、或肉瘤)。可以用所公开的方法治疗的肿瘤的具体实例包括但不限于：乳腺癌(例如小叶癌和导管癌，诸如三阴性乳腺癌、和浸润性癌(invasivecarcinoma))、肺癌(例如，非小细胞癌、小细胞肺癌、大细胞癌、鳞状细胞癌、和腺癌)、肺间皮瘤、结肠直肠腺癌(诸如结肠癌)、胃癌、前列腺癌、卵巢癌(诸如浆液性囊腺癌和粘液性囊腺癌))、卵巢生殖细胞肿瘤、睾丸癌和生殖细胞肿瘤、胰腺癌、胆管腺癌、肝细胞癌、腹膜癌、膀胱癌(包括，例如，移行细胞癌、腺癌和鳞状细胞癌和膀胱尿路上皮癌(bladderurothelial carcinoma))、甲状腺癌、胆管癌、胆囊癌、肾细胞腺癌、肾透明细胞癌、子宫内膜癌或子宫癌(包括，例如，腺癌和混合苗勒氏瘤(mixed Mullerian tumors)(癌肉瘤))、宫颈癌、宫颈内膜癌、外子宫颈癌、外阴癌和阴道癌(诸如其各自的腺癌和鳞癌(squamouscarcinoma))、前列腺癌、肝癌、胆管癌、皮肤肿瘤(例如，鳞状细胞癌、基底细胞癌、恶性黑素瘤、皮肤附属物肿瘤(skin appendage tumors)、卡波西肉瘤、皮肤淋巴瘤、皮肤附属器肿瘤(skin adnexal tumors)和多种类型的肉瘤和梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma))、食道癌、鼻咽癌和口咽癌(carcinomas of the nasopharynx and oropharynx)(包括其的鳞癌和腺癌)、唾液腺癌、脑和中枢神经系统肿瘤(包括，例如，神经胶质瘤、神经元肿瘤、和脑膜瘤、垂体癌、成胶质细胞瘤、和星形细胞瘤)、周围神经瘤、软组织肉瘤和骨和软骨肉瘤、头颈鳞状细胞癌肉瘤、和淋巴肿瘤(包括B细胞和T细胞恶性淋巴瘤)。在一个实例中，肿瘤是腺癌。在一个实例中，肿瘤是淋巴瘤。

在一些实例中，例如，与未施用GITR激动剂和CpG ODN相比，所公开的方法将注射的肿瘤的尺寸或体积减少至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或甚至100％(例如，无可检测的肿瘤细胞)。在一些实例中，例如，与未施用GITR激动剂和CpG ODN相比，所公开的方法将未注射的转移性肿瘤的尺寸或体积减少至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或甚至100％(例如，无可检测的肿瘤细胞)。在一些实例中，例如，与未施用GITR激动剂和CpG ODN相比，所公开的方法将未注射的转移性肿瘤的数目减少至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％，至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或甚至100％(例如，无可检测的肿瘤细胞)。

在一个实例中，例如，相对于未施用GITR激动剂和CpG ODN或在施用GITR激动剂和CpG ODN之前，本文提供的方法和组合物减少肿瘤进展，诸如降低这样的进展的速率，(例如，减少至少5％、至少10％、至少20％、或至少50％。

在一个实例中，治疗响应是指降低施用疗法的受试者中的调节性T细胞的数目。例如，与不存在治疗性组合物时(或在治疗之前)的调节性T细胞的数目相比，组合物可以将调节性T细胞的数目减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、或100％。

在一个实例中，治疗响应是指增加施用疗法的受试者中的效应T细胞的活性。例如，与不存在治疗性组合物时(或在治疗之前)的效应T细胞的活性相比，治疗性组合物可以将效应T细胞的活性增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍。

在一个实例中，治疗响应是指降低施用疗法的受试者中的调节性T细胞的抑制活性和谱系稳定性。例如，与不存在治疗性组合物时(或在治疗之前)的调节性T细胞的抑制活性和谱系稳定性相比，治疗性组合物可以将调节性T细胞的抑制活性和谱系稳定性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、或100％。

本领域技术人员将理解，可以使用所公开的方法和组合物实现这些治疗响应。

因此，在一些实例中，所公开的方法包括，例如在一段时间内(诸如在施用治疗剂之前和之后)，测量注射的肿瘤的尺寸或体积、未注射的转移性肿瘤的尺寸或体积、未注射的转移性肿瘤的数目、肿瘤的进展、调节性T细胞的数目、调节性T细胞的抑制活性和谱系稳定性、效应T细胞的活性，或其组合。

组合物和试剂盒

还提供了药物组合物和试剂盒，用于在治疗肿瘤中使用。该组合物可以包含一种或更多种GITR激动剂(诸如GITR激动剂抗体)和一种或更多种CpG ODN(诸如SEQ ID NO:1、2、3，或其组合)，具有例如至少一种药学运载体、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可以还包含其他治疗剂，诸如化学治疗剂、生物剂等。在一些实例中，组合物以冻干粉末提供，该冻干粉末在添加合适的液体(例如无菌水)后被重构。在一些实例中，组合物包含抑制蛋白聚集的一种或更多种物质，诸如蔗糖和精氨酸。在一些实例中，组合物包含肝素和/或蛋白多糖。

还提供了试剂盒，所述试剂盒包含一种或更多种GITR激动剂和一种或更多种CpGODN(其可以是单个组合物或例如装在独立的容器或小瓶中的分开的组合物)。这样的试剂盒可以还包含一种或更多种化学治疗剂、一种或更多种生物剂、一种或更多种抗血管生成剂、一种或更多种生长抑制剂、一种或更多种抗赘生物组合物，或其组合。在一些实例中，试剂盒还包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。试剂盒可以还包含从商业和使用者立场所期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、和注射器。这样的另外的试剂可以在单独的容器中存在。

合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。在一些实例中，容器容纳组合物并且可以具有无菌进入端口(例如，容器可以是具有通过皮下注射针可刺破的塞子的小瓶)，所述组合物单自(by itself)或与另一种组合物组合时对治疗肿瘤有效。

该试剂盒可以包含有助于向患者施用治疗剂的任选的组分，诸如用于重构粉末形式的小瓶、用于注射的注射器和定制的瘤内递送系统。该试剂盒可以被制造为用于一名患者的单次使用单位剂量、用于特定患者的多于一次使用(以恒定剂量或其中单独化合物随着治疗进展可以在效力上变化)；或者试剂盒可以包含适用于向多个患者施用的多于一次剂量(“批量包装(bulk packaging)”)。试剂盒组分可以被组装在纸箱、泡罩包装、瓶子、管中等等。

还提供了包含一个或更多个容器的药物剂量包，每个容器包含单次或多于一次剂量的一种或更多种GITR激动剂和一种或更多种CPG ODN。在一些实例中，提供了单位剂量，其中所述单位剂量包含预定量的组合物，所述组合物包含一种或更多种GITR激动剂和一种或更多种CPG ODN，具有或不具有一种或更多种另外的剂。在一些实施方案中，这样的单位剂量以用于注射的单次预充式注射器供应。在多种实施方案中，以单位剂量包含的组合物可以包含盐水、蔗糖等；缓冲剂，诸如磷酸盐等；和/或被配制在稳定且有效的pH范围内。

实施例1

GITR抗体对A20模型中的肿瘤和转移肿瘤消退的作用

该实施例描述了用于证明肿瘤内GITR的T细胞调节诱导全身性抗肿瘤响应的方法。

雌性BALB/c小鼠(6-8周龄，～20g)来自Jackson实验室(Bar Harbor,ME,USA)。在肿瘤细胞植入之前，将小鼠剃毛。

将A20B细胞淋巴瘤细胞(ATCC Manassas,VA,USA:目录号TIB-208)在37℃在具有10％FBS、1％青霉素/链霉素、和0.05mM 2-巯基乙醇的RPMI-1640(ATCC)中以培养物生长。

将每只小鼠在距离小鼠头部右侧和左侧第4个乳突(mammary papilla)(乳头(teat))附近通过两次皮下注射在100μL PBS中的5×10⁶个A20细胞进行接种。测量每个肿瘤的长度和宽度，并且根据下式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm^3)＝(长度×宽度^2)/2。

在第10天、第12天、和第14天，将小鼠用CpG ODN 1826(CpG，50μg，～2.5mg/kg；Adipogen，San Diego，CA，USA：目录号IAX-200-002)和/或抗GITR(5μg，～0.25mg/kg；WuXiBiologics，Shanghai，China)进行治疗，如图1中所示。将瘤内注射合并并且以25μL PBS给予。抗GITR的腹腔(i.p.)注射以100μL PBS给予。

如图2E-2F中所示，CpG和抗GITR的直接肿瘤注射导致注射的肿瘤和远端未注射的肿瘤两者的肿瘤消退。然而，单独的CpG引起仅注射的肿瘤的消退(图2A)，但不引起远端肿瘤的消退(图2B)，并且单独的抗GITR引起一些小鼠中注射的肿瘤(图2C)和远端肿瘤(图2D)两者的消退。

CpG和抗GITR的直接肿瘤注射(图2E，2F)具有比CpG和全身性抗GITR(图3E，3F)更大的抗肿瘤效力，CpG和全身性抗GITR(引起一些(但非所有的)小鼠中的肿瘤消退。

实例2

GITR抗体对CT26模型中肿瘤和转移肿瘤消退的作用

以上实施例表明不仅CpG和抗GITR两者的瘤内注射引起肿瘤消退，而且CpG的瘤内注射和抗GITR的全身性施用(图3E，3F)也引起一些小鼠中的肿瘤消退。因此，将进行进一步的实验，以表明CpG直接到肿瘤的注射增加在远端未注射的肿瘤处对全身性施用的GITR激动剂的响应。

在一个实例中，使用CT26模型确定CpG的瘤内注射和抗GITR的全身性施用的作用。将雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)在右侧和左侧腹侧(在第4乳房脂肪垫附近)用悬浮于100μLDPBS中的约1×10⁶个CT26鼠结肠癌细胞(ATCC Manassas，VA，USA；目录号CRL-2638)进行接种。当肿瘤达到约100mm³时(和/或在植入后约第5-7天时)，将肿瘤之一注射CpG ODN1826(CpG，10-20μg，～0.5-1.0mg/kg；Adipogen，San Diego，CA，USA：目录号IAX-200-002)。将激动剂抗GITR以0.01-0.1mg/kg腹腔(即全身性)施用。测量注射的和未注射的肿瘤的肿瘤体积，从而证明了CpG直接到肿瘤的注射增加在远端未注射的肿瘤处对全身性施用的抗GITR的响应。以上方案(包括CT26接种和肿瘤诱导、治疗时机和持续时间、以及CpG或抗GITR剂量)可以针对模型优化而改变。也可以进行CpG和抗GITR两者的瘤内注射。

以上方案中待使用的激动剂抗GITR抗体包括本文描述的任何抗GITR抗体，包括：a)包含含有CDR1、CDR2、和CDR3的GITR结合结构域(GITR-BD)的抗体，所述CDR1包含SEQ IDNO:6的序列，所述CDR2包含SEQ ID NO:7的序列，所述CDR3包含SEQ ID NO:8的序列；b)包含含有SEQ ID NO:5的序列的GITR-BD的抗体；c)包含两个拷贝的具有结构(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc的多肽的四价分子，其中(i)GITR-BD包含CDR1、CDR2、和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:6的序列，所述CDR2包含SEQ ID NO:7的序列，所述CDR3包含SEQ IDNO:8的序列，(ii)接头是多肽，(iii)铰链是衍生自免疫球蛋白铰链区的多肽，且(iv)Fc是免疫球蛋白Fc多肽；d)包含两个拷贝的具有结构(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc的多肽的四价分子，其中(i)GITR-BD包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，(ii)接头是多肽，(iii)铰链是衍生自免疫球蛋白铰链区的多肽，且(iv)Fc是免疫球蛋白Fc多肽；或e)包含两个拷贝的包含SEQ ID NO:4的序列的多肽的四价分子。

实例3

GITR抗体对4T1模型中肿瘤和转移肿瘤消退的作用

在另外的实例中，使用4T1模型确定CpG的瘤内注射和抗GITR的全身性施用的作用。将雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)在右侧和左侧腹侧(在第4乳房脂肪垫附近)用悬浮于100μL DPBS中的约5×10⁴个4T1鼠乳腺癌细胞(ATCC Manassas，VA，USA；目录号CRL-2539)进行接种。当肿瘤达到约50mm³时(和/或在植入后约第10-14天)，将肿瘤之一注射CpG ODN1826(CpG，10-20μg，～0.5-1.0mg/kg；Adipogen，San Diego，CA，USA：目录号IAX-200-002)。将激动剂抗GITR以0.01-0.1mg/kg腹腔(即全身性)施用。测量注射的和未注射的肿瘤的肿瘤体积，从而证明了CpG直接到肿瘤的注射增加在远端未注射的肿瘤处对全身性施用的抗GITR的响应。以上方案(包括4T1接种和肿瘤诱导、治疗时机和持续时间、以及CpG或抗GITR剂量)可以针对模型优化而改变。也可以进行CpG和抗GITR两者的瘤内注射。

以上方案中待使用的激动剂抗GITR抗体包括本文描述的任何抗GITR抗体，包括：a)包含含有CDR1、CDR2、和CDR3的GITR结合结构域(GITR-BD)的抗体，所述CDR1包含SEQ IDNO:6的序列，所述CDR2包含SEQ ID NO:7的序列，所述CDR3包含SEQ ID NO:8的序列；b)包含含有SEQ ID NO:5的序列的GITR-BD的抗体；c)包含两个拷贝的具有结构(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc的多肽的四价分子，其中(i)GITR-BD包含CDR1、CDR2、和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:6的序列，所述CDR2包含SEQ ID NO:7的序列，所述CDR3包含SEQ IDNO:8的序列，(ii)接头是多肽，(iii)铰链是衍生自免疫球蛋白铰链区的多肽，且(iv)Fc是免疫球蛋白Fc多肽；d)包含两个拷贝的具有结构(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc的多肽的四价分子，其中(i)GITR-BD包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，(ii)接头是多肽，(iii)铰链是衍生自免疫球蛋白铰链区的多肽，且(iv)Fc是免疫球蛋白Fc多肽；或e)包含两个拷贝的包含SEQ ID NO:4的序列的多肽的四价分子。

可以使用其他模型证明CpG直接到肿瘤的注射增加在远端未注射的肿瘤处对全身性施用的抗GITR的响应。这样的模型对GITR激动剂有响应，并且包括使用B16-F10鼠黑素瘤细胞系(ATCC CRL-6475)；MC38鼠结肠腺癌细胞系；和EMT6鼠乳腺癌细胞系(ATCC CRL-2755)的模型。

鉴于可以应用本公开内容原理的许多可能的实施方案，应该认识到，所说明的实施方案仅是本公开内容的实施例，并且不应被视为限制本发明的范围。而是，本公开内容的范围由以下权利要求进行限定。因此，我们要求保护落入这些权利要求的范围和精神内的所有内容作为本发明。

序列表

<110> 戊瑞治疗有限公司

<120> 糖皮质激素诱导的TNFR-相关蛋白(GITR)作为肿瘤靶

<130> 9366-97101-02

<150> 62/357,750

<151> 2016-07-01

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CpG ODN

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(24)

<223> 碱基为硫代磷酸酯

<400> 1

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CpG ODN

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 碱基为硫代磷酸酯

<400> 2

tccatgacgt tcctgacgtt 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CpG ODN

<400> 3

tgactgtgaa cgttcgagat ga 22

<210> 4

<211> 479

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GITR结合肽

<400> 4

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Ser Ile Asp

20 25 30

Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Val Leu Ser Gly Ile Ser Ser Ala Lys Tyr Ala Ala Ser Ala Pro

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr

85 90 95

Ala Asp Val Ser Thr Gly Trp Gly Arg Asp Ala His Gly Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly Ser

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Ser Ile Asp Ala

145 150 155 160

Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala

165 170 175

Val Leu Ser Gly Ile Ser Ser Ala Lys Tyr Ala Ala Ser Ala Pro Gly

180 185 190

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

195 200 205

Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Ala

210 215 220

Asp Val Ser Thr Gly Trp Gly Arg Asp Ala His Gly Tyr Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His

245 250 255

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

260 265 270

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

275 280 285

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

290 295 300

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

305 310 315 320

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

325 330 335

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

340 345 350

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

355 360 365

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

370 375 380

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

385 390 395 400

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

405 410 415

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

420 425 430

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

435 440 445

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

450 455 460

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470 475

<210> 5

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GITR结合结构域

<400> 5

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Ser Ile Asp

20 25 30

Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Val Leu Ser Gly Ile Ser Ser Ala Lys Tyr Ala Ala Ser Ala Pro

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr

85 90 95

Ala Asp Val Ser Thr Gly Trp Gly Arg Asp Ala His Gly Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR1

<400> 6

Ser Gly Ser Val Phe Ser Ile Asp Ala Met

1 5 10

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR2

<400> 7

Leu Ser Gly Ile Ser Ser Ala Lys

1 5

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR3

<400> 8

Tyr Ala Asp Val Ser Thr Gly Trp Gly Arg Asp Ala His Gly Tyr Trp

1 5 10 15

<210> 9

<211> 218

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

1 5 10 15

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

20 25 30

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

35 40 45

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

50 55 60

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

65 70 75 80

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

85 90 95

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

100 105 110

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

115 120 125

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

130 135 140

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

145 150 155 160

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

165 170 175

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

180 185 190

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

195 200 205

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 10

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 在E233、L234、L235处具有缺失突变的人类IgG1 Fc

<400> 10

Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

1 5 10 15

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

20 25 30

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

35 40 45

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

50 55 60

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

65 70 75 80

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

85 90 95

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

100 105 110

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

115 120 125

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

130 135 140

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

145 150 155 160

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

165 170 175

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

180 185 190

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

195 200 205

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 11

<211> 217

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 12

<211> 218

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

1 5 10 15

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

20 25 30

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp

35 40 45

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

50 55 60

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

65 70 75 80

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

85 90 95

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly

100 105 110

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

115 120 125

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

130 135 140

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn

145 150 155 160

Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

165 170 175

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

180 185 190

Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr

195 200 205

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 13

<211> 218

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

1 5 10 15

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

20 25 30

Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

35 40 45

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

50 55 60

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

65 70 75 80

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

85 90 95

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

100 105 110

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu

115 120 125

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

130 135 140

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

145 150 155 160

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

165 170 175

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

180 185 190

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

195 200 205

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215

<210> 14

<211> 218

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

1 5 10 15

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

20 25 30

Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

35 40 45

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

50 55 60

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

65 70 75 80

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

85 90 95

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

100 105 110

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu

115 120 125

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

130 135 140

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

145 150 155 160

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

165 170 175

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

180 185 190

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

195 200 205

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215

<210> 15

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IgG铰链区

<400> 15

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

1 5 10

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IgG铰链区

<400> 16

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

1 5

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IgG铰链区

<400> 17

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys

1 5 10

<210> 18

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 接头序列

<400> 18

Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 接头序列

<400> 19

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 20

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 接头序列

<400> 20

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 21

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 接头序列

<400> 21

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 22

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 接头序列

<400> 22

Gly Gly Gly Gly

1

<210> 23

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 接头序列

<400> 23

Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 24

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 接头序列

<400> 24

Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

Claims (26)

1.一种治疗哺乳动物中的肿瘤的方法，所述方法包括：

施用有效量的至少一种糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂；和

瘤内施用有效量的至少一种CpG寡脱氧核苷酸(ODN)，从而治疗受试者中的肿瘤。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种GITR激动剂被瘤内施用。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种GITR激动剂被全身性施用。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的一种或更多种另外的治疗剂，其中所述一种或更多种另外的治疗剂包括一种或更多种化学治疗剂、一种或更多种生物剂、一种或更多种抗血管生成剂、一种或更多种生长抑制剂、一种或更多种抗赘生物组合物、手术，或者其组合。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述至少一种GITR激动剂包含GITR抗体或GITR抗体片段。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述GITR抗体是嵌合抗体、人源化抗体、或人类抗体。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述GITR抗体是双特异性抗体或单链抗体。

9.根据权利要求6所述的方法，其中所述至少一种GITR激动剂是选自Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab'、和(Fab')₂的GITR抗体片段。

10.根据权利要求6所述的方法，其中所述至少一种GITR激动剂是选自以下的GITR抗体：

a)包含含有CDR1、CDR2、和CDR3的GITR结合结构域(GITR-BD)的抗体，所述CDR1包含SEQID NO:6的序列，所述CDR2包含SEQ ID NO:7的序列，所述CDR3包含SEQ ID NO:8的序列；

b)包含含有SEQ ID NO:5的序列的GITR-BD的抗体；

c)包含两个拷贝的具有结构(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc的多肽的四价分子，其中(i)所述GITR-BD包含CDR1、CDR2、和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:6的序列，所述CDR2包含SEQ ID NO:7的序列，所述CDR3包含SEQ ID NO:8的序列，(ii)所述接头是多肽，(iii)所述铰链是衍生自免疫球蛋白铰链区的多肽，且(iv)所述Fc是免疫球蛋白Fc多肽；

d)包含两个拷贝的具有结构(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc的多肽的四价分子，其中(i)所述GITR-BD包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，(ii)所述接头是多肽，(iii)所述铰链是衍生自免疫球蛋白铰链区的多肽，且(iv)所述Fc是免疫球蛋白Fc多肽；和

e)包含两个拷贝的包含SEQ ID NO:4的序列的多肽的四价分子。

11.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述至少一种GITR激动剂包含GITR肽或编码GITR的核酸分子。

12.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述至少一种GITR激动剂包含大分子。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是淋巴瘤、黑素瘤、肉瘤或腺癌。

14.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是乳腺癌、肝癌、脾癌、肾癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、中枢神经系统癌、头颈癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌或胆囊癌。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述至少一种CpG ODN包括B类ODN。

16.根据权利要求15中任一项所述的方法，其中所述B类ODN包含SEQ ID NO:1(5’-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’，具有为硫代磷酸酯的碱基)、SEQ ID NO:2(5’-tccatgacgttcctgacgtt-3’，具有为硫代磷酸酯的碱基)、SEQ ID NO:3(5′-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3)，或其组合。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述方法将注射的肿瘤的尺寸或体积减少至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述方法将未注射的转移性肿瘤的尺寸或体积减少至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述方法将所述未注射的转移性肿瘤的数目减少至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述至少一种GITR激动剂和所述至少一种CpG ODN被同时地或同期地施用。

21.根据权利要求1、2和4至20中任一项所述的方法，其中所述方法包括至少两次单独瘤内施用有效量的至少一种GITR激动剂和至少两次单独瘤内施用有效量的至少一种CpGODN。

22.根据权利要求1、2和4至20中任一项所述的方法，其中所述至少一种GITR激动剂的有效量为至少0.25mg/kg，并且所述至少一种CpG ODN的有效量为至少2.5mg/kg。

23.根据权利要求1和3至20中任一项所述的方法，其中所述至少一种GITR激动剂的有效量为从0.01mg/kg至0.1mg/kg，并且所述至少一种CpG ODN的有效量为从0.5mg/kg至0.1mg/kg。

24.一种组合物，所述组合物包含：

一种或更多种GITR激动剂；和

一种或更多种CpG ODN。

25.根据权利要求24所述的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的运载体。

26.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求24或25所述的组合物，以及任选地一种或更多种化学治疗剂、一种或更多种生物剂，一种或更多种抗血管生成剂、一种或更多种生长抑制剂、一种或更多种抗赘生物组合物，或者其组合。