MXPA04003940A - Metodos y medios para producir proteinas con modificaciones postraduccionales predeterminadas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona metodos para identificar, seleccionar y obtener celulas de mamifero que sean capaces de producir moleculas proteinaceas que comprenden modificaciones postraduccionales predeterminadas, en donde las modificaciones postraduccionales se realizan por la celula de mamifero en la cual se expresa la molecula proteinacea. Preferiblemente, las modificaciones postraduccionales predeterminadas comprenden glucosilacion. La invencion proporciona ademas metodos para obtener y producir moleculas proteinaceas, utilizando celulas de mamifero que se pueden obtener por un metodo de la presente invencion. Preferiblemente, tales moleculas proteinaceas comprenden eritropoyetina (EPO), dado que el efecto de EPO (recombinante) depende en gran medida del patron de glucosilacion de los oligosacaridos presentes en la proteina. Tambien se proporcionan celulas de mamifero que se han obtenido en base en su capacidad para producir proteinas o modificaciones postraduccionales que son indicativas de una modificacion posttraduccional predeterminada que es deseada. Preferiblemente, las celulas de mamifero tienen caracteristicas y propiedades neurales tales como cantidades importantes de proteinas recombinates que pueden producirse y que albergan propiedades de "tipo neural o cerebral".

Description

MÉTODOS Y MEDIOS PARA PRODUCIR PROTEÍNAS CON MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES PREDETERMINADAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al campo de tecnología de ADN recombinante . La invención se relaciona adicionalmente con la elaboración de proteínas. Más particularmente, la presente invención se refiere a la producción de proteínas recombinantes para uso como un constituyente terapéuticamente activo de una preparación farmacéutica. La invención se relaciona con líneas de células de mamífero identificadas, seleccionadas o creadas para la producción recombinante de proteínas. La invención se relaciona adicionalmente con el uso de las proteínas producidas de esta manera. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se conocen sistemas de expresión celular recombinantes para la producción de proteínas. Estos sistemas abarcan desde bacterias, levaduras y hongos hasta células vegetales y desde células de insecto hasta células- de mamífero. la elección del hospedador de producción y el sistema de expresión generalmente depende de consideraciones tales como la facilidad de uso, el costo de cultivo, las características de crecimiento, los niveles de producción 'de la capacidad para crecer en medio sin suero. Se sabe que los sistemas de expresión celulares mencionados antes también REF: 154784 difieren en su capacidad para ejercer modificaciones cotraduccionales y postraduccionales tales como plegado o naturalización, fosforilación, . carboxilación ? e hidroxilación ?. Pese al reconocimiento de que la selección del sistema de expresión recombinante puede tener consecuencias palpables en la estructura final de las proteínas expresadas, en general las modificaciones postraduccionales no juegan un papel decisivo en la selección de un sistema de expresión adecuado para una proteína dada. En los últimos años, las investigaciones han revelado más acerca de- las complejidades de las modificaciones postraduccionales diferenciales de proteínas humanas y las implicaciones potenciales sobre las funciones en el cuerpo humano. Por ejemplo, los hallazgos relativamente recientes sugieren que los patrones de glucosilación diferenciales de las proteínas humanas que se producen en sangre (las modificaciones denominadas de "tipo sérico") son diferentes de las que se producen en el líquido cefalorraquídeo en el cerebro (modificaciones de "tipo cerebral"). Esta diferencia puede ser un elemento clave que sea de importancia fundamental para el diseño de un tratamiento eficaz. En general las glucoproteínas neurales humanas se caracterizan por su glucosilación, la cual se ha denominado en la literatura como glucosilación de "tipo cerebral" (Margolis and Margolis 1989; Hoffmann et al . 1994). En contraste con las proteínas glucosiladas de "tipo sérico" (es decir, glucoproteínas que circulan en la sangre) , las proteínas glucosiladas de tipo cerebral poseen de manera característica azúcares N unidas de tipo complejo que se modifican con fucosa unida en posiciones al, 3 a N-acetilglucosamina en antenas de tipo lactosamina y de esta manera que forma las estructuras de Lewis x o sialil-Lewis x (figura 5) . Existen dos tipos de estructuras de Lewis x: una con un residuo galactosa terminal y una con un residuo N-acetilgalactosamina (GalNac) terminal. Si estos grupos terminales se unen a un ácido siálico, la estructura de Lewis x se denomina una estructura sialil Lewis x. Otra diferencia entre los oligosacáridos de tipo sérico y de tipo cerebral es que éstos últimos con frecuencia contienen N-acetilglucosamina terminal o galactosa terminal, o ambos, y pueden incluir una modificación de N-acetilgalactosamina terminal, mientras que los oligosacáridos de tipo sérico habitualmente contienen únicamente cantidades bajas de tales estructuras. Los oligosacáridos que se encuentran generalmente sobre las proteínas que circulan en el suero con frecuencia contienen estructuras muy galactosiladas . Esto significa que una galactosa se une a una N-acetilglucosamina periférica y de esta manera forma una estructura de lactosamina. La glucoproteína, de esta manera, queda protegida de endocitosis por los receptores de N-acetilglucosamina (es decir, receptores que reconocen la N-acetilglucosamina terminal) presente en células reticuloendoteliales hepáticas y en macrófagos (Anchord et al. 1978; Stahl et al. 1978) . Los oligosacáridos de tipo sérico habitualmente contienen también ácidos siálicos terminales (denominados con frecuencia como ácido neuramínico) que protegen a la glucoproteína de la depuración a través del receptor asialoglucoproteína. Estos mecanismos de depuración se aplican específicamente a glucoproteínas que circulan en sangre y probablemente no se encuentran en el sistema nervioso central (SNC) humano (Hoffmann et al. 1994) . Los sistemas de expresión recombinantes para la producción de proteínas que comprende modificaciones de "tipo sérico" están disponibles en la técnica, como se ejemplifica por las células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) y las células de riñon de hámster bebé (BH , por sus siglas en inglés) . No obstante, para la producción de proteínas con otras modificaciones, tales como las modificaciones de "tipo cerebral" , no se han descrito tales sistemas convenientes. Y por lo tanto existe la necesidad de sistemas de expresión que tomen en consideración las diferentes modificaciones postraduccionales sobre proteínas terapéuticas. En particular, existe la necesidad de un sistema de expresión eficaz para proteínas que comprenda modificaciones postraduccionales de "tipo cerebral" . Las proteínas que tengan estas necesidades específicas pueden ser benéficas en el tratamiento de toda clase de trastornos, entre los cuales están las enfermedades relacionadas con el SNC, el sistema nervioso periférico y el tejido cardíaco. Los trastornos que afectan al SNC abarcan clases diferentes de malestares tales como daño cerebral agudo, enfermedades neurodegenerativas y otras disfunciones tales como epilepsia, esquizofrenia y trastornos del humor. Otros trastornos patológicos que pueden dañar a las células y tejidos neurales se deben a daños que pueden resultar de hipoxia, desórdenes de ataques, envenenamiento por neurotoxinas, esclerosis múltiple, hipotensión, supresión cardiaca, radiación o hipoglucemia. También se pueden presentar daños neurales durante procedimientos quirúrgicos tales como reparación de aneurisma o extirpación de tumores. Un ejemplo de una proteína que tiene diferentes papeles los cuales están relacionados por lo menos en parte a diferencias en las modificaciones postraduccionales, es una hormona conocida como eritropoyetina (EPO) . La EPO, una proteína famosa por su papel, en la diferenciación de hemocitoblastos hematopoyéticos en eritrocitos, tiene otras funciones diversas, que incluyen funciones en tejidos neurales. Se ha sugerido que la EPO juega cierto papel en el desarrollo del SNC (Dame et al. 2001). La proteína EPO también se ha detectado en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de neonatos humanos y adultos (Juul et al. 1997; Buemi et al. 2000) . La EPO, como se encuentra en el LCR parece ser producido localmente en el cerebro pues no atraviesa la barrera hematoencefálica (Marti et al. 1997; Buemi et al. 2000) . La regulación de la expresión de EPO es específica de tejido, lo que refuerza adicionalmente la hipótesis de que EPO tiene funciones específicas de tejido que son diferentes en el cerebro y en médula ósea ( asuda et al. 1999; Chikuma et al. 2000; Sasaki et al. 2001). Por lo tanto, se ha postulado que la EPO, además de su función hematopoyética puede tener un papel neurotrófico . Los factores neurotróficos se definen como moléculas humorales que actúan sobre neuronas para alterar su desarrollo, diferenciación, mantenimiento y regeneración (Konishi et al. 1993). Los resultados de varios estudios ahora han demostrado que la EPO puede actuar como un factor neurotrófico (por ejemplo Sadamoto et al. 1998; Brines et al. 2000). Además de los efectos mencionados de EPO en la eritropoyesis y neuroprotección, se han descrito otros papeles de la EPO, por ejemplo en células endoteliales y células musculares . Se ha establecido bien en la técnica que el efecto de la EPO (recombinante) depende principalmente del patrón de glucosilacion de los oligosacáridos presentes en la proteína. Los oligosacáridos N-unidos de EPO humana son muy importantes para su actividad biológica bien conocida: la estimulación de eritropoyesis (Takeuchi and Kobata 1991; Wasley et al. 1991; Tsuda et al. 1990; Morimoto et al. 1996; Takeuchi et al. 1989; Misaizu et al. 1995). En el caso de EPO, uno también se puede referir a EPO de tipo sérico (o EPO de "tipo renal" o una EPO de "tipo urinario") para la proteína que se produce en el riñon y que circula en la sangre, en comparación con la EPO que se ha producido por otros tejidos tales como el cerebro (de tipo cerebral) . Los sistemas de producción y purificación para la EPO de tipo sérico se han establecido bien en la técnica, y la EPO de tipo sérico producida recombinantemente se utiliza de manera habitual y con éxito, por ejemplo, en pacientes que padecen de un bajo nivel de eritrocitos. Establecido bien en la técnica que esta EPO recombinante necesita satisfacer todos los requerimientos de una proteína estable que pueda circular en el torrente sanguíneo por una cantidad de tiempo suficiente para permitir la inducción de eritropoyesis . Habitualmente, el sistema de células basado en CHO o BHK se utiliza para la producción de EPO con estas características. No obstante, la EPO de tipo sérico se obtiene de este sistema de producción y purificación es relativamente inútil en el tratamiento de trastornos relacionados con el sistema nervioso central o periférico así como en el tratamiento de enfermedades relacionadas con trastornos inducidos por isquemia/reperfusión. Esto es debido a que su patrón de glucosilación no es el adecuado para el tratamiento de estos trastornos, y también debido a que genera un incremento en el número de eritrocitos (eritropoyesis) debido a su fuerte actividad hematopoyética, lo cual debe ser calificado como efectos colaterales indeseables en el contexto de estos trastornos no hematopoyéticos (Wiessner et al, 2001) . Por lo tanto, existe la necesidad de sistemas de producción nuevos para proteínas tales como EPO, que tengan los rasgos característicos de una molécula de EPO que sea activa en el cerebro o en tejidos que involucran el transporte o direccionamiento basado en selectina. Además, existe la necesidad de preparaciones de proteína farmacéuticamente aceptables tales como EPO, con modificaciones postraduccionales que difieran de la glucosilación de tipo sérica, preferiblemente que tengan glucosilación de tipo cerebral, y sistemas de producción y purificación eficaces para proporcionar estas sustancias . Otro ejemplo de una proteína que tiene patrones de glucosilación diferentes en tejidos separados, lo que se sugiere un papel diferencial de los patrones de glucosilación diferentes, es la transíerrina, que se presenta en cantidades importantes como asialotransferrina en el LCR pero no en dicha forma en suero (Van Eijk et al. 1983; Hoffmann et al. 1995) .

Cierta familia de glucoproteínas , denominadas a selectinas, juega un papel importante en las etapas iniciales de adhesión de leucocitos al endotelio en daño por isguemia/reperfusión. Existen tres miembros en la familia de selectina: la P-selectina, E-selectina y L-selectina. Las selectinas tienen un dominio lectina que reconoce las estructuras de azúcar de los ligandos de glucoproteína que se unen a las mismas. Existe un posible papel para las modificaciones sialil Lewis x en oligosacáridos que se unen a selectinas (Foxall et al. 1992) . Varias investigaciones han indicado la importancia de las selectinas y las estructuras sialil Lewis x para la adhesión de leucocitos en modelos de isquemia/reperfusión. El oligosacárido sialil Lewis x Slex-0S se ha demostrado que es cardioprotector en el modelo felino de isquemia/reperfusión al reducir necrosis cardiaca en 83% (Buerke et al. 1994) . Además, la solicitud de patente WO 02/38168 describe el uso de proteínas que unen selectina que comprende estructuras sialil Lewis x para el uso de agentes antiinflamatorios en el tratamiento de diversas enfermedades . No obstante, no se ha descrito sistemas de expresión adecuados para la preparación de proteínas que comprenden (sialil) Lewis x glucanos . Por lo tanto, existe la necesidad de un sistema de expresión recombinante para proteínas que necesiten estructuras de glucosilación determinadas de antemano, tales como las estructuras (sialil) Lewis x. De manera más general, existe la necesidad por sistemas de expresión para la producción recombinante de proteínas en necesidad de modificaciones postraduccionales predeterminadas . DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS TABLAS ? FIGURAS La tabla 1 es una revisión de las proteínas marcadoras que se pueden utilizar para caracterizar células. La tabla II son tejidos de control positivos que se pueden utilizar par algunas de las proteínas marcadoras que se muestran en la tabla. La tabla III es una información detallada (proveedor y números de catálogo) de anticuerpos dirigidos a proteínas marcadoras que se pueden utilizar para caracterizar la línea de células PER.Ce™. La tabla IV es una calificación de la presencia de proteínas marcadoras en PER.Ce™. La tabla V es la composición de monosacáridos de azúcares unidos a N de PER-ce^-EPO y Eprex. La tabla VI son asignaciones de los picos' de espectro de masas observados para iones moleculares de N-glucanos desializados liberados por N-glucanasa F a partir de EPO producida en DMEM por PER.Ce™ clon P7 productor de EPO. Los picos con valores de masas (m/z) que también se encuentran en Eprex se subrayan y se indican con negrillas . La tabla VII son asignaciones de los picos de espectro de masas observados para los iones moleculares de N-glucanos desializados liberados por M-glucanasa F a partir de EPO producida en DMEM por PER.Ce^ clon P8 productor de EPO. Los picos con valores de masas (m/z) que también se encuentran e Eprex están subrayados e indicados en negrillas. La tabla VIII presenta las actividades FUT en células CHO y PER.6^. La tabla IX es una asignación de los picos de espectro de masas observados para los iones moleculares de N-glucanos desializados liberados por N-glucanasa F a partir de EPO fraccionado en una columna AAL para selección con contenido de glucosa elevado y bajo. La tabla X es la expresión relativa de E1A y la morfología de los clones E1A.E1B.EP0 HT1080 productores de EPO. Se determina por análisis de transferencia Western la cantidad de expresión de E1A. Los clones marcados con * se seleccionan para el ensayo de producción de EPO. La tabla XI presenta la presencia relativa de perfiles de masa de azúcares N-unidos de EPO que se obtiene a partir del HT1080/EPO clon 033, el HT1080/E1A-EPO clon 008 y el HT1080/E1A.E1B-EPO clon 072. Se utiliza el programa de computadora ExPAsy' s para predecir la composición de azúcar. Se muestran en la tabla el número de hexosaminas, hexosas y desoxihexosas presentes en las antenas de los glucanos y las estructuras propuestas.

Las figuras 1A -1G son espectros de masas de los azúcares N-unidos de Eprex, ?7-??0 (acumulados A, B y C) y P8-EP0 (acumulados A, B y C) . (A) Eprex; (B) P7, acumulado A; (C) P7, acumulado B; (D) P7, acumulado C; (E) P8 , acumulado A; (F) P8, acumulado B; y (G) P8, acumulado C. La figura 2 muestra el contenido de ácido siálico de PER.Ce^-EPO y CHO-EPO. La figura 3 muestra las estructuras de Lewis x glucano presentes en PER. CG^-EPO. La figura 4 muestra la expresión de estructura de Lewis x en la superficie de células PER.ce^. La figura 5 es una representación esquemática de las estructuras Lewis x y sialil Lewis x. La figura 6 muestra el efecto de ER.CG^-EPO y Eprex en la erxtropoyesis in vivo. Las figuras 7A - 7B muestran los volúmenes de infarto en ratas no tratadas (controles o testigos) y ratas tratadas con Eprex y con PER.CG1411, en base en los mapas de ADC (figura 7A) y los mapas T2 (figura 7B) generados 24 h después del inicio de reperfusión, utilizando formación de imágenes por resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés) . La figura 8 muestra la concentración de Eprex en los puntos de tiempo indicados después de una inyección única i.v. de 150 uE de Eprex en tres animales. La figura 9 muestra un cromatograma de EPO de PER.C6 fraccionado sobre una columna AAL para seleccionar contenido de glucosa elevado y bajo. La figura 10A muestra los espectros de masa de azúcares unidos N de las fracciones 1-4 a partir de la columna AAL. La figura 10B muestra el espectro de masas de los azúcares N-unidos de la fracción 4 de la columna AAL en un experimento independiente . Las figuras 11A - 11D muestran imágenes de HT1080/EPO clon 033 (A) y de HT1080/E1A.E1B . EPO clon 058 (B) y 026 (C) . Su expresión en E1A se muestra por el análisis de transferencia Western (D) . Los E1A que expresan clones tienen una morfología plana. La figura 12 muestra el perfil de HPAEC-PAD de los N-glucanos liberados a partir de EPO producidos por HT1080/EPO clon 033 y HT1080/E1A. E1B clon 072. Las líneas en la parte inferior indican la elusión de glucanos no cargados (0) , monocargados , con carga doble, con carga triple o tetracargados (1 - 4, respectivamente) . Nótese el desplazamiento a glucanos N-unidos menos cargados del clon 072. Las figuras 13A - 13C muestran el análisis Maldi-MS de EPO producido por 3 clones diferentes (A) . HT1080/EPO clon 033, HT1080/E1A-EPO clon 008 y (C) HT1080/E1A.E1B-EPO clon 072. Estos dos últimos clones muestran un perfil más complejo.

La figura 14 muestra los perfiles obtenidos a partir del análisis de monosacáridos de los glucanos N unidos de HT1080/EPO clon 033, HT1080/E1A-EPO clon 008 y HT1080/E1A.E1B-EPO clon 072. La proporción de los monosacáridos indicados (Fue = Fucosa, . GalN = N-acetilgalactosamina, GlcNac = N-acetiloglucosamina, Gal galactosa, Man = mañosa) se normalizan respecto a mañosa. Las figuras 15A - 15D muestran el análisis Maldi-MS de EPO producido por HT1080/EPO clon 033 (A, B) y HT1080/E1A.E1B-EPO clon 072 (C,D) tratados con (B,D) o sin (A, C) a-fucosidasa . Únicamente se observan diferencias en los perfiles de glucano de EPO derivado del clon 072. Se encuentra un cambio claro de los picos con valores m/z de ~ 2039, ~ 2185 y ~ 1892 (C y D) , lo cual muy probablemente represente la disminución de las estructuras propuestas que contienen desoxihexosas sobresalientes. La figura 16 son diversas isoformas de las preparaciones de EPO diferentes, separadas por IEF. Las isoformas de EPO contienen 0 - 14 ácidos siálicos - por molécula. Se aplican las siguientes muestras (2000 uE por tira) : Eprex (A) ; Eprex tratada con neuroaminodasa (B) ; CHO-EPO, producción total (C) ; PER . C6m-EPO, clon 022 (D) ; frCHO-EPO (E) . La figura 17 es el hematocrito (HCR, por sus siglas en inglés, porcentaje en volumen) de ratas a las que se les inyecta 5000 uE/kg de Eprex, frCHO-EPO, PER. C6 -EPO o con amortiguador diluyente (control) . Las ratas tratadas con EPO muestran un HCR vs . control significativamente superior, frCHO-EPO y PER.Ce^-EPO (p<0.001). La figura 18 muestra el porcentaje de reticulocitos en sangre de ratas a las que se les inyecta con 5000 uE/kg de Eprex, frCHO-EPO, PER.C6MR-EPO o con amortiguador diluyente (control) . Las ratas tratadas con EPO muestran porcentajes de reticulocitos significativamente superiores en comparación con los controles (p<0.001). El porcentaje de reticulocitos en ratas tratadas tanto con Eprex como con frCHO-EPO es significativamente mayor en comparación con PER.ce^-EPO (p<0.001) . La figura 19 muestra el porcentaje de reticulocitos inmaduros (IFR, por sus siglas en inglés) de la población total de reticulocitos cuatro días después de la inyección de 5000 uE/kg de Eprex, frCHO-EPO, PER.CS^-EPO o con amortiguador diluyente (control) . Las ratas tratadas con Eprex muestra porcentaje significativamente superior- de reticulocitos inmaduros en comparación con el control, frCHO-EPO o PER. C6-EPO (p<0.001). La figura 20 muestra el sitio de separación de PNGasa F (marcado con F) y de endoglucosidasa F2 (marcado con F2) . La figura 21A - 21B son espectros MALDI de glucanos PER.CS^-EPO liberados por PNGasa F (A) y con endoglucosidasa F2 (B) . El eje x del espectro inferior se alinea de manera tal que los picos correspondientes de ambos espectros están uno directamente encima del otro (diferencia de 349 unidades Da, véase texto) . La figura 22 presenta algunos enlaces monosacáridos de glucanos N-terminales . La figura 23 es la parte superior del esquema que proporciona los glucanos desializados liberados a partir de PER. Ce^-EPO; los valores en la parte inferior se detectan en el espectro después del tratamiento con galactosidasa. Entre corchetes se proporciona el porcentaje total del espectro reflejado en las estructuras dadas. Los espectros están en la figura 26. La figura 24 es la parte superior del esquema que proporciona los glucanos desializados liberados a partir de PER.CS^-EPO los cuales se incubaron con galactosidasa; los valores en la parte media se detectan en el espectro después de tratamiento con fucosidasa renal bovina y los valores inferiores se obtienen después de incubación con GlcNAc-asa. Entre corchetes se presenta el porcentaje total de espectro reflejado en las estructuras dadas. Los espectros están en la figura 26. La figura 25 es la parte superior del esquema que proporciona los glucanos desializados liberados a partir de PER. CS^-EPO los cuales se incuban, con galactosidasa; los valores en la parte media se detectan en el espectro después de tratamiento con fucosidasa y harina de almendra, y los valores inferiores se obtienen después de incubación con GlcNAc-asa. Entre corchetes se presenta el porcentaje total de espectro reflejado en las estructuras dadas. Los espectros están la figura 27. Las figuras 26A - 26F son los espectros MALDI de tratamientos con exoglicosidasa de los glucanos N-unidos de PER-Ce^-EPO. A. ) PER-C6MR-EPO incubado con PNGasa F y neuraminidasa. B. ) ER-Ce^-E O incubado con PNGasa F, neuraminidasa y galactosidasa. C.) PER-C6MR-EP0 incubado con PNGasa F y neuraminidasa, y tratada posteriormente con galactosidasa y fucosidasa renal bovina. D. ) PER-CS^-EPO incubado con PNGasa F y neuraminidasa, y tratada posteriormente con galactosidasa, fucosidasa renal bovina y GlcNAc-asa. E. ) PER-Ce^-EPO incubado con PNGasa F y neuraminidasa, y tratada posteriormente con galactosidasa y fucosidasa de harina de almendra. F. ) PER-CS^-E O incubado con PNGasa F y neuraminidasa, y tratada posteriormente con galactosidasa, fucosidasa de harina de almendra y GlcNAc-asa. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para identificar, seleccionar y obtener células de mamífero que sean capaces de producir moléculas proteináceas, tales como péptidos y proteínas que comprenden modificaciones postraduccionales , en donde las modificaciones postraduccionales se determinan y se llevan a cabo por la célula de mamífero en la cual se expresa la molécula proteinácea. La invención proporciona adicionalmente métodos para obtener y producir moléculas proteináceas, tales como eritropoyetina (EPO) utilizando células de mamífero que se pueden obtener de acuerdo con los métodos de la presente invención y sobre células de mamífero que se han obtenido en base en su capacidad para producir proteínas o modificaciones postraduccionales que son indicativas de una modificación postraduccional determinada de antemano que se desea. La presente invención proporciona un método para producir una molécula proteinácea que comprende una modificación postraduccional determinada de antemano, que comprende las etapas de: suministrar a una célula de mamífero que se puede obtener por los métodos de acuerdo con la invención, con un ácido nucleico que codifica para la molécula proteinácea de manera tal que la célula de mamífero alberga al ácido nucleico en una forma expresable; y cultivar la células de mamífero bajo condiciones que induzcan la producción de la molécula proteinácea. En una modalidad de la invención, la invención suministra un método para producir una molécula proteinácea que comprende una modificación postraduccional predeterminada, que comprende las etapas de: identificar una célula de mamífero que tenga la capacidad de proporcionar la molécula proteinácea con la modificación postraduccional determinada previamente, suministrar a la célula de mamífero con ácido nucleico que codifique para la molécula proteinácea de manera tal que la célula de mamífero albergue el ácido nucleico en una forma expresable, y cultivar la célula de mamífero bajo condiciones que induzcan la producción de la molécula proteinácea. En otra modalidad, la invención proporciona un método para producir una molécula proteinácea que comprende modificación postraduccional predeterminada, el método comprende las etapas de : identificar una célula de mamífero que teng la capacidad de proporcionar la molécula proteinácea con la modificación postraduccional predeterminada; proporcionar a la célula de mamífero con un ácido nucleico que codifica para la molécula proteinácea de manera tal que la célula de mamífero alberga al ácido nucleico en una forma expresable; cultivar la célula de mamífero bajo condiciones que induzcan la producción de la molécula proteinácea; analizar las modificaciones postraduccional sobre la molécula proteinácea producida de esta manera y determinar si la modificación postraduccional presente en la molécula proteinácea comprende la modificación postraduccional predeterminada. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona células de mamífero que tienen características y propiedades neurales tales como cantidades significativas de proteínas recombinantes que se pueden producir que albergan propiedades de "tipo neural o cerebral" . la producción de proteínas recombinantes como EPO tipo cerebral, que presenta modificaciones postraduccional predeterminadas específicas es factible ahora mediante la utilización de los métodos y medios de la presente invención. La invención además proporciona métodos para producir una molécula proteinácea que comprende una modificación postraduccional predeterminada, el método comprende las etapas de : proporcionar una célula de mamífero obtenible por un método de acuerdo con la presente invención, con un ácido nucleico que codifica para la molécula proteinácea de manera tal que la célula de mamífero alberga al ácido nucleico en una forma expresable; cultivar la célula de mamífero bajo condiciones que inducen la producción de la molécula proteinácea y purificar la molécula proteinácea del cultivo de célula de mamífero.

En otra modalidad, la presente invención proporciona métodos para producir una molécula proteinácea que comprende una modificación postraduccional predeterminada, el método comprende las etapas de; proporcionar una célula de mamífero obtenible por un método de acuerdo con la presente invención, con un ácido nucleico que codifica para la molécula proteinácea de manera tal que la célula de mamífero alberga al ácido nucleico en una forma expresable; cultivar la célula de mamífero bajo condiciones que inducen la producción de la molécula proteinácea; analizar las modificaciones postraduccional sobre la molécula proteinácea producida de esta manera y determinar si la modificación postraduccional presente en la molécula proteinácea comprende la modificación postraduccional predeterminada. Preferiblemente, los métodos para producir molécula proteinácea comprende la etapa adicional de purificar la molécula proteinácea del cultivo de célula de mamífero. Se prefieren adicionalmente los métodos para producir ¦ una molécula proteinácea en una célula de mamífero de la invención, en donde la célula de mamífero es inmortalizada o expresa secuencias adenovirales E1A, o ambas cosas. La inmortalización o introducción de secuencias adenovirales E1A puede llevarse a cabo antes de la identificación de la célula de mamífero obtenida, pero también se puede llevar a cabo después de que la célula ha sido identificada, seleccionada u obtenida . La presente invención adicionalmente proporciona métodos para purificar molécula proteinácea, en donde las molécula proteinácea se purifican a partir de cultivo celular en base en la modificación postraduccional predeterminada presente en la molécula, la modificación postraduccional predeterminada se lleva a cabo por la célula de mamífero en la cual se produce la molécula. La presente invención proporciona adicionalmente el uso de una composición de moléculas similares a eritropoyetina que se seleccionan del grupo que consiste de eritropoyetina, una o más muteinas de eritropoyetina, uno o más derivados de eritropoyetina o una colección de una o más fracciones de molécula de eritropoyetina sialiladas en un grado variable, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno que se selecciona del grupo que consiste de isquemia, daño por reperfusión, trastorno inducido por hipoxia, enfermedades inflamatorias, trastornos neurodegenerativos y daño agudo al sistema nervioso central o periférico, en donde la composición de las moléculas similares a eritropoyetina tienen, en una base de contenido de proteína, una actividad eritropoyética menor in vivo en comparación con moléculas similares a eritropoyetina utilizadas actualmente para el tratamiento de anemia, tal como la epoyetina a. y la epoyetina ß. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden tales moléculas similares a eritropoyetina. La invención también proporciona métodos para el tratamiento o para evitar tales desórdenes, que comprende la administración de tales composiciones. En otros aspectos, la presente invención proporciona un método para producir en una célula de mamífero moléculas proteináceas en necesidad de una estructura de glucosilación que se selecciona del grupo que consiste de un (sialil) Lewis X o LacdiNac que contiene estructuras de glucano unidas a N, caracterizado porque la célula expresa ácido nucleico que codifica para E1A a partir de un adenovirus, con la condición de que la molécula proteinácea sea eritropoyetina, y la célula de mamífero no sea la célula PER. €5^, cuando la molécula proteinácea es glucodelina o proteína C o inhibidor de la vía de factor tisular, la célula de mamífero no es una célula HEK293, y cuando la molécula proteinácea es metaloproteasa 1 de matriz, la célula- de mamífero no es una célula HT1080. Otro aspecto de la invención es proporcionar un método para producir una fracción con alta concentración de una molécula proteinácea que tiene glucanos N-unidos que comprende estructuras (sialil) Lewis X o LacdiNac, o ambas, que comprenden las etapas de: a) expresar de manera recombinante la molécula proteinácea en una célula que exprese ácido nucleico que codifica para E1A a partir de un adenovirus; y b) fraccionar las moléculas proteináceas producidas de esta manera, por lo que se obtiene una fracción la cual es enriquecida en moléculas que tienen glucanos N-unidos que comprende estructuras (sialil) Lewix X y o LacdiNac, o ambas. En otro aspecto, la invención proporciona un método para fraccionar una mezcla que comprende moléculas proteináceas que comprenden estructuras Lewis X, el método utiliza la unión de las moléculas a una lectina AAL. En otras modalidades, se proporcionan fracciones obtenidas de esta manera. Otro aspecto de la presente invención es proporcionar composiciones que comprenden moléculas similares a eritropoyetina que se seleccionan del grupo que consiste de eritropoyetina, una o más muteínas de eritropoyetina y uno o más derivados de eri ropoyetina, caracterizados porque el número promedio de estructuras de Lewix-X sobre los glucanos N-unidos por molécula similar a eritropoyetina es de por lo aproximadamente 2.2. En otras modalidades, el número promedio es de por lo menos aproximadamente 2.6, 2.7, 3.6, 4.1 ó 5.7. En otro aspecto, las composiciones o fracciones de acuerdo con la invención se utilizan para la preparación de un medicamento. En otro aspecto la invención proporciona el uso de una eritropoyetina que se puede producir recombinantemente en una célula de mamífero que expresa ácido nucleico que codifica para E1A a partir de un adenovirus, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un desorden que se selecciona del grupo que consiste de isquemia, daño por reperfusión, desorden inducido por hipoxia, una enfermedad inflamatoria, un trastorno neurodegenerativo y daño agudo al sistema nervioso central o periférico. En otra modalidad, la invención proporciona un método para el tratamiento preventivo o terapéutico de un desorden que se selecciona del grupo que consiste de isquemia, daño por reperfusión, desorden inducido por hipoxia, enfermedad inflamatoria, desorden neurodegenerativo y daño agudo al sistema nervioso central o periférico, el método comprende la etapa de administrar a un sujeto humano o animal una composición de moléculas similares a eritropoyetina que se seleccionan del grupo que consiste de eritropoyetina, una o más muteinas de eritropoyetina, uno o más derivados de eritropoyetina, en donde la composición de moléculas similares a eritropoyetina se caracteriza porque se puede producir de manera recombinante en una célula- de mamífero que comprende ácido nucleico que codifica para E1A a partir de un adenovirus. En algunas modalidades preferidas, la célula es una célula PER.Ce" . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El mérito de la presente invención es proporcionar sistemas de producción recombinantes adecuados para la producción de proteínas en necesidad de una modificación postraduccional predeterminada. En un primer aspecto, tales sistemas recombinantes de pueden proporcionar utilizando métodos de acuerdo con la invención para identificar sistemas de expresión capaces de aplicar la modificación postraduccional necesaria para la proteína en cuestión, o el uso propuesto de la proteína en cuestión. En un segundo aspecto, la invención proporciona un método para elaborar sistemas de expresión que tenga la capacidad de aplicar una modificación postraduccional deseada de una proteína en necesidad de la misma. Los aspectos adicionales de la invención comprenden proteínas aisladas que tienen modificaciones postraduccional predeterminadas producidas de esta manera, métodos de uso y composiciones farmacéuticas que comprenden a las mismas. De esta manera, la presente invención proporciona un método para identificar una célula de mamífero capaz de producir una molécula protein cea que comprende una modificación' postraduccional predeterminada, el método comprende las etapas de : a) analizar la modificación postraduccional de una proteina producida por la célula de mamífero; y b) determinar si la proteína comprende la modificación postraduccional predeterminada. En otra modalidad, la invención proporciona un método para seleccionar una célula de mamífero capaz de producir una molécula proteinácea que comprende una modificación postraduccional predeterminada, el método comprende las etapas de: a) analizar la presencia o ausencia de un marcador especifico de tejido o una combinación de marcadores específicos de tejido en la célula de mamífero o sobre la superficie celular de la célula de mamífero, marcador o combinación de marcadores los cuales son indicativos de la capacidad de la célula para aplicar la modificación postraduccional predeterminada en una molécula proteinácea en necesidad de la misma, cuando se produce en la célula utilizando técnicas de ADN recombinante y cultivo celular de otra manera bien conocida por aquellos expertos en la técnica; y b) seleccionar la célula de mamífero en base en la presencia o ausencia de los marcadores específicos de tejido. En otra modalidad adicional, la invención proporciona un método para obtener una célula de mamífero a partir de una población de células heterogéneas, la célula de mamífero es capaz de producir una molécula proteinácea que comprende una modificación postraduccional predeterminada) el método comprende las etapas de: a) clasificar las células en base en las modificaciones postraduccional sobre las proteínas producidas por las células en la población de células heterogéneas; y b) seleccionar las células capaces de producir proteínas que comprenden la modificación postraduccional predeterminada. Tal clasificación se puede llevar a cabo utilizando métodos conocidos en la técnica, que incluyen pero que no se limitan a clasificación de las células utilizando anticuerpos marcados fluorescentemente que reconocen la modificación postraduccional predeterminada. En otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar una célula de mamífero capaz de producir una molécula proteinácea que comprende una modificación postraduccional predeterminada, el método comprende las etapas de: proporcionar la célula de mamífero con un ácido nucleico que codifica para una proteína en necesidad de la misma y capaz de recibir modificaciones traduccionales, de manera tal que la célula de mamífero alberga al ácido nucleico en una forma expresable; cultivar la célula de mamífero bajo condiciones que induzcan la producción de la proteína; analizar la modificación postraduccional sobre la proteína producida por la célula de mamífero y verificar la presencia de la modificación postraduccional en la proteína. De acuerdo con otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar una célula de mamífero capaz de producir una molécula proteinácea que comprende una modificación postraduccional predeterminada, el método comprende las etapas de : proporcionar una célula de mamífero con un ácido nucleico que codifica para la molécula proteinácea capaz de comprender las modificaciones postraduccional, de "manera tal que la célula de mamífero alberga al ácido nucleico en una forma expresable; cultivar la célula de mamífero bajo condiciones que induzcan la producción de la molécula proteinácea; analizar la modificación postraduccional sobre la molécula proteinácea producida por la célula de mamífero; y determinar si la modificación postraduccional presente en la molécula proteinácea comprende la modificación postraduccional predeterminada . Una molécula proteinácea, como se utiliza en la presente, se refiere, pero no se limita a moléculas tales como péptidos, polipéptidos y proteínas, así como imitantes de péptidos, polipéptidos y proteínas (moléculas que comprenden supresiones, mutaciones puntuales, traslapes o alteraciones inducidas químicamente) , en la medida en que sean capaces de recibir la modificación postraduccional predeterminada, es decir, que tengan uno o varios residuos aminoácidos requeridos en el contexto adecuado susceptibles de modificación (por ejemplo, deben comprender una secuencia Asn-X-Ser/Thr en caso que se desee una adición de - una estructura de glucano unida a N, la cual se puede aplicar al residuo Asn en este contexto) . También se refiere a péptidos, polipéptidos y proteínas que presentan etiquetas u otras marcas proteináceas y no proteinaceas (por ejemplo compuestos radioactivos) . Un ejemplo de tales proteínas es la EPO humana, la cual tiene, además de la forma de tipo renal o sérica, otros fenotipos tales como la forma de tipo cerebral. Otros ejemplos no limitantes de clases de proteínas que tienen ciertas características que posiblemente juegan un papel importante en la funcionalidad de la proteína en ciertos tejidos y que deberían albergar (cuando se expresan recombinantemente) las modificaciones postraduccional predeterminada para una función apropiada incluyen anticuerpos monoclonales, neurotrofinas , citocinas, factores de crecimiento similares a insulina, factores de crecimiento similares a TGF-ß, factores de crecimiento de fibroblastos, factores de crecimiento epidérmico, factores de crecimiento que unen heparina, ligando receptores de tirosina cinasa y otros factores tróficos. La mayor parte de estos factores están relacionados con síndromes de enfermedad y por lo tanto la mayor parte de las proteínas pueden ser utilizadas en forma recombinante en el tratamiento de humanos, con la condición de que las proteínas alberguen las modificaciones postraduccionales necesarias para que sean activas in vivo. Por lo tanto, estas proteináceas se deben producir sobre sistemas de expresión que sean capaces de proporcionar las modificaciones postraduccional deseadas. Los ejemplos de tales proteínas son, pero no se limitan a transíerrina, glucodelina, factor de crecimiento nervioso (NGF, por sus siglas en inglés) , factor neurotrofico derivado de cerebro, neurotrofina-3 , -4/5 y -6, factor neurotrofico ciliar, factor inhibidor de leucemia, cardiotrofina-1, oncostatina-M, varias interleucinas, GM-CSF, G-CSF, IGF-1 y -2, TGF-ß, factor neurotrófico derivado de neuroglía, neurturina, persefina, miostatina, factor de crecimiento de fibroblastos-1 , -2 y -5, anfirregulina, actividad inductora de receptor de acetilcolina, netrin-1 y -2, neurregulina-2 y -3, pleyotrofina, factor de hemocitoblastos (SCF, por sus siglas en inglés), agrina, CSF-1, PDGF y saposina C. Los anticuerpos monoclonal.es, como se utilizan en la presente, se refieren a anticuerpos humanos y humanizados, a partes de los mismos y a equivalentes tales como fragmentos de la cadena Fv única (scFv) fragmentos Fab, regiones CDR, regiones variables, cadenas ligeras y cadenas pesadas, o cualquier otra forma adecuada para uso como un ligando especifico. De acuerdo con una modalidad específica se proporcionan sistemas de producción que son capaces de aplicar estructuras Lewis X o LacdiNAc sobre proteínas capaces de recibir estructuras de glucano unidas a N. De acuerdo con la presente invención, tales sistemas · de expresión se pueden identificar, seleccionar o diseñar específicamente. Un ejemplo de tal diseño con propósito es la introducción en una célula de mamífero de un ácido nucleico que comprende una secuencia E1A de un adenovirus de manera tal que al secuencia de E1A se expresa en la célula de mamífero. Los ejemplos de tales células que ya se encuentran en existencia son HEK293, PER.C6 y 911. Aunque estas líneas de células se conocen por sí mismas y se han utilizado para la producción de proteínas (Van den Nieuwenhof et al, 2000; WO 00/63403; Grinnell et al, 1994), hasta ahora no se ha apreciado el efecto decisivo de E1A en la capacidad de aplicar estructuras Lewis X o LacdiNAc a proteínas producidas en estas células. Una modificación postraduccional como se utiliza en la presente se refiere a cualquier modificación que esté presente sobre o dentro de la molécula proteinácea. Se refiere a modificaciones que se introducen durante o posteriores a la traducción de la molécula a partir de ARN, in vivo o in vitro. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a glucosilación, plegado o naturalización, fosforilación, carboxilación ?, hidroxilación ?, multimerización, formación de puentes sulfuro y, por ejemplo sucesos de procesamiento tales como clipping-off o la adición de uno o más aminoácidos. Una modificación postraduccional predeterminada, como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier modificación postraduccional que es útil para el tratamiento seleccionado. De acuerdo con una modalidad preferida, la modificación postraduccional predeterminada se refiere a una forma de modificación que hace a la proteína modificada particularmente útil para tratar desórdenes de tejidos, órganos, compartimientos o células específicas del cuerpo humano o animal . La molécula proteinácea que presenta tales modificaciones postraduccionales predeterminada puede, como resultado de la carencia de un efecto significativo (tales como efectos secundarios perjudiciales u otros efectos no deseados) además del tejido, órgano, compartimiento o célula que va a ser tratado. De acuerdo con una modalidad, la modificación postraduccional predeterminada provoca que la proteína que comprende la modificación postraduccional predeterminada sea depurada del cuerpo con mayor rapidez, por ejemplo para reducir los efectos adversos secundarios. La modificación postraduccional predeterminada puede comprenderse completamente con detalle por adelantado, pero también se le puede denominar generalmente indicando que es un estado deseado que se requiere para una actividad adecuada y deseada de la molécula proteinácea que comprende tal modificación postraduccional predeterminada, lo que significa que las modificaciones detalladas presentes en la molécula proteinácea de interés no necesariamente deben ser entendidas o definidas completamente en la medida en que se encuentre la actividad deseada. Los ejemplos de modificaciones de glucosilación deseadas en 0- o N-glicanos, dependen del uso propuesto, son estructuras tales como Lewis x, sialil Lewis x, GalNac, GlcNac, LacdiNAc, fucosa unida al, 3-unida a N-acetilglucosamina, N-acetilglucosamina terminal, galactosa terminal, N-acetilglucosamina bisectante, un grupo sulfato y ácido siálico. Las células de mamífero de la presente invención preferiblemente son humanas o de origen humano, para la producción de proteínas humanas para elaborar proteínas que muy probablemente presenten características de mamífero y preferiblemente humanas. Para elaborar moléculas proteináceas que deberían tener modificaciones postraduccionales, se prefiere utilizar células que tengan características neurales, tales como marcadores de proteína que son indicativos de células neurales.. Esto no excluye que las células no neurales puedan ser extremadamente útiles en la elaboración de proteínas que comprenden modificaciones postraduccionales de tipo neural . Depende de la actividad proteínica que se requiera, para seleccionar, identificar u obtener una célula que sea capaz de producir tales modificaciones postraduccionales . Puesto que se requiere producir grandes cantidades de proteína cuando estas se aplican en ambientes terapéuticos, se prefiere que las células de mamífero de la invención sean inmortalizadas. La inmortalización se puede llevar a cabo de muchas maneras. Los ejemplos de métodos para obtener células inmortalizadas son transformación activa de una célula en reposo, en una célula en división mediante la adición de ácidos nucleicos que codifican proteínas transíortadoras o inmortalizantes, o a través de tratamiento químico a través del cual las proteínas endógenas se pueden volver transformantes, o al adquirir células de material tumoral . Un método preferido para inmortalizar células no tumorales es por la adición de la región El de adenovirus, como se ha demostrado para líneas de células tales como 911 y PE .Ce1111. Se conocen otros métodos de inmortalización de células, tales como transformación utilizando ciertas secuencias que codifican para proteína de papilomavirus humano (HPV) (por ejemplo células HeLa) . La adición de ciertas proteínas virales tales como, El a partir de adenovirus puede ser benéfico para la producción de proteínas recombinantes, dado que muchas de tales proteínas tienen características activadoras de transcripción, así como efectos antiapoptóticos . Ahora se ha encontrado sorprendentemente que la expresión de ElA de adenovirus en la célula hospedadora utilizada como sistema de expresión de acuerdo con la invención, cambia las características del sistema de expresión de manera que adquiere la capacidad de aplicar estructuras de glucosilacion N-unidas que comprenden Lewis X o LacdiNAc, o ambas. Una línea de células adecuada para los métodos para la elaboración de moléculas proteináceas en necesidad de glucanos unidos N que contienen Lewis X o LacdiNAc es PER.C6MR, depositada bajo el número 96022940 en la European Collection of Animal Cell Cultures en el Center for Applied Microbiology and Research. Otras líneas de células adecuadas de acuerdo con este aspecto incluyen a HEK293, 911 y otras células de mamífero que se pueden modificar por introducción en una o más de tales células o ancestros de las mismas, de ácido nucleico que contiene secuencias de E1A de un adenovirus en un formato expresable. Opcionalmente se incluyen las secuencias ElB en un formato expresable, el cúal puede ser ventajoso debido a los efectos antiapoptóticos ejercidos por ElB, para contrarrestar los efectos apoptoticos potenciales de la expresión de E1A. Los métodos para producir moléculas proteináceas de acuerdo con la invención comprenden además la etapa adicional de purificar la molécula proteinácea del cultivo de célula de mamífero. La purificación, como se utiliza en la presente, se puede llevar a cabo mediante la utilización de métodos convencionales que se han descrito en la técnica, no obstante, se prefiere utilizar métodos de purificación que comprenden una etapa en la cual se utilicen las modificaciones postraduccionales presentes dentro o sobre- las moléculas proteináceas. Se prefieren adicionalmente los métodos de purificación que comprenden una etapa en la cual se utilizan modificaciones postraduccionales predeterminadas presentes dentro o sobre las moléculas proteináceas . Cuando se aplican métodos de purificación por afinidad, se prefiere el uso de anticuerpos u otros aglutinantes, tales como lectinas, para porciones específicas de carbohidrato particulares y que están dirigidas contra ciertos tipos de modificaciones postraduccionales . Los ejemplos de tales anticuerpos son anticuerpos dirigidos contra las estructuras de Lewis x (sialilo) , estructuras, lacdiNac o estructuras GalNac Lewis x. Los ejemplos no limitantes de lectinas útiles de acuerdo con este aspecto de la invención son AAL y selectinas, tales como E-selectina, P-selectina, L-selectina,.. La utilización de tales aglutinantes permite purificar las proteínas (recombinantes) de manera que un porcentaje alto de la proteína purificada presenta la modificación postraduccional predeterminada que se desea. Se prefieren incluso de manera adicional métodos en los cuales la molécula proteinácea es purificada hasta homogeneidad. Los ejemplos de métodos para purificación de proteínas a partir de cultivo de célula de mamífero se proporcionan por la presente invención y abarcan, por ejemplo, métodos de cromatografía de afinidad para la purificación de EPO glucosilada de tipo cerebral mediante la utilización de anticuerpos o lectinas que reconocen estructuras de Lewis x presentes en los N-glucanos del producto elaborado de manera reco binante . La presente invención proporciona una composición farmacéuticamente aceptable que comprende una molécula proteinácea que tiene una modificación postraduccional predeterminada que se puede obtener de acuerdo con los métodos de la presente invención, y un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables se conocen por aquellos habitualmente expertos en la técnica. En una modalidad preferida la molécula proteinácea en la composición farmacéuticamente aceptable es eritropoyetina . De acuerdo con la invención, la eritropoyetina producida en las células con marcadores de proteína neural adquiere una modificación postraduccional que es activa en el tejido neural o sobre células neurales. No obstante, las modificaciones postraduccional no son comparables con las modificaciones postraduccionales que se observan sobre EPO que circula en la sangre. Los efectos eritropoyéticos de EPO producidos sobre células con los marcadores de proteína neural son significati amente menores. De acuerdo con la presente invención, ahora se sugiere fuertemente que esto se debe a la ausencia de un porcentaje elevado de ácidos siálicos o a la presencia de características de tipo cerebral tales como estructuras de Lewis x y galactósidos terminales. Esto es ventajoso dado que una EPO de tipo cerebral se puede utilizar en dosificaciones relativamente elevadas en el tratamiento de desórdenes relacionados con tejido neural o en el tratamiento de tejido dañado por isquemia (tal como corazón isquémico) , y al mismo tiempo se tiene un efecto reducido significativamente en la eritropoyesis, en comparación con las preparaciones de EPO disponibles actualmente. La invención proporciona una eritropoyetina recombinante que comprende por lo menos una modificación postraduccional a partir del grupo que consiste de: estructura de sialil Lewis x, una estructura Lewis x, una fucosa unida al, 3, unida N-acetilglucosamina, una estructura LacdiNAc, un grupo N-acetilglusamina terminal y un grupo galactosa terminal. La eritropoyetina recombinante es reproducible en una célula de mamífero que se puede obtener de acuerdo con la presente invención, asi como sobre células de mamífero conocidas previamente, pero que previamente no se había considerado como adecuadas para este propósito. Un ejemplo son las células PER.C6MR. La presente invención de acuerdo con una modalidad adicional proporciona el uso de células PER.C6m para la elaboración de una molécula proteinácea que comprende una modificación postraduccional predeterminada, en donde se prefiere que la molécula proteinácea sea depurada rápidamente de la sangre o utilizada en una dosificación elevada. En el caso de EPO, susceptible de ser producida en PER.ce"1, se puede utilizar una dosificación elevada para tratar o impedir el daño agudo relacionado con hipoxia y al mismo tiempo limitar los efectos secundarios adversos de la eritropoyesis. En una modalidad de la presente invención, las moléculas proteináceas de la presente invención son adecuadas para el tratamiento de un humano o del cuerpo humano por cirugía, terapia o diagnóstico. Preferiblemente, las moléculas similares a EPO de acuerdo con la invención se utilizan para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de desórdenes inducidos por hipoxia, trastornos neurodegenerativos o daño agudo al sistema nervioso central o periférico. En otra modalidad preferida, las moléculas proteináceas tales como EPO se utilizan para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de daños por isquemia o reperfusión. En otra modalidad preferida adicional, se utilizan las moléculas proteináceas tales como EPO para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de trastornos inmunológicos o enfermedades inflamatorias . Se describen en la presente métodos y composiciones para la producción y elaboración de proteínas recombinantes humanas. La invención es particularmente útil para la producción de proteínas que requieren modificaciones co-traduccionales o postraduccionales tales como glucosilación y plegado o naturalización adecuada y se relaciona además con el uso de células humanas capaz de producir modificaciones de tipo cerebral o postraduccionales sobre las moléculas proteináceas . Estas células se pueden utilizar, por ejemplo, para la elaboración de glucoproteínas humanas con características neurales que pueden ser terapéuticamente benéficas, debido a sus características ' neurales . La presente invención también proporciona el uso de una línea de células humanas con características neurales que modifica las proteínas que se expresan de manera recombinante con propiedades neurales tales como modificaciones postraduccionales de "tipo cerebral" o "tipo neural" tales como glucosilación, fosforilación o plegamiento. Un ejemplo de tal línea de células, denominada PER.CG1^ (Patente de E.U.A. No. 6,033,908), se genera por la inmortalización de células de retina embriónica humana utilizando un constructo (plásmido recombinante) que alberga genes de adenovirus El. Previamente, se ha demostrado que las células PER-Cfí"11 son adecuadas particularmente para la elaboración de proteínas humanas recombinantes, dado que se pueden obtener rendimientos elevados de proteínas tales como EPO humana y anticuerpos monoclonales humanos completos (descrito en el documento WO 00/63403.) . La presente invención describe que las proteínas recombinantes producidas por células PER.ce"11 pueden adquirir ciertas características específicas de tejido tales como las características neurales (por ejemplo modificaciones postraduccionales tales como glucosilación) . Esto se ejemplifica por la producción de una proteína que alberga los oligosacáridos denominados de tipo cerebral. Se ha demostrado que la EPO humana producida por células ??? .?d^ se modifica con azúcares unidos N que difieren significativamente de los azúcares unidos N que se encuentran en EPO urinaria humana o en EPO humana recombinante producida por células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) o células de riñon de hámster bebé (BHK, por sus siglas en inglés) . La EPO urinaria y la EPO humana recombinante producidas en células CHO y BHK contiene estructuras de glucosilación que se pueden denominar como oligosacáridos de "tipo renal" o "tipo sérico" . Típicamente, los azúcares unidos a N de estas preparaciones de EPO que proceden de CHO y de BHK están altamente ramificadas, altamente galactosiladas y altamente sialiladas, mientras que carecen de la fucosa unida al, 3 periférica (Tsuda et al. 1998; Takeuchi et al. 1988; Nimtz et al. 1993; Watson et al. 1994; Rahbek-Nielsen et al. 1997). En la presente, se ha dilucidado la naturaleza de los oligosacáridos unidos a EPO humana producida en PER.ce1^ y se ha demostrado que es significativamente diferente de los oligosacáridos presentes en la EPO urinaria humana y la EPO humana recombinante producida en células CHO y BHK. En primer lugar, el contenido de ácido siálico promedio de los oligosacáridos de EPO humana producida por PER.C6m es significativamente menor que el contenido de ácido siálico promedio de la EPO urinaria humana o la EPO humana recombinante (a partir de CHO y BHK) . El contenido de ácido siálico muy bajo en la EPO humana producida por PER.ce1^ es indicativa de la presencia de oligosacáridos N-unidos que tienen galactosa terminal o N-acetilgalactosamina o N-acetilglucosamina . En segundo lugar, la N-acetilgalactosamina se encuentra en cantidades importantes en los azúcares N-unidos de EPO humana producida por PER.ce" , mientras que no se encuentra N-acetilgalactosamina en los azúcares N-unidos de EPO urinaria humana y la EPO humana recombinante producida por células CHO. Únicamente se han reportado que se presentan cantidades en trazas de N-acetilgalactosamina en los azúcares N-unidos en algunos lotes de EPO humana recombinante producida en células BHK (Nimtz et al. 1993). En tercer lugar, los azúcares N-unidos de EPO humana producidos en células PER.CS1^1 se encuentra que contienen una cantidad muy elevada de fucosa. Una fracción de la fucosa está unida al, 3 a una N-acetilglusomina periférica por lo que se forma lo que se denomina una estructura de Lewis x (figura 5) . Nunca se ha informado que las estructuras de Lewis x se presenten en EPO urinaria humana o en EPO humana recombinante producida en células CHO y BHK. ¦ Las estructuras de Lewis x (sialil) presentes en EPO de acuerdo con la invención hacen que esta EPO sea adecuada para unión a selectinas y se considera una aplicación adicional en la protección cardíaca. Debido a que los oligosacáridos unidos a proteínas tienen un gran impacto sobre las propiedades fisicoquímicas del polipéptido tal como la conformación terciaria, solubilidad, viscosidad y carga, la EPO humana producida por PER. CS"11 tiene propiedades fisicoquímicas que difieren significativamente de la EPO urinaria humana y de la EPO humana recombinante producida por células CHO y BHK (Toyoda et al. 2000) . Claramente, la EPO humana producida por PER.Ce™ está menos cargada que la EPO urinaria humana y la EPO humana recombinante producida por células CHO y BHK debido a un menor contenido de ácido siálico y puede ser más hidrofóbica debido al contenido muy elevado de fucosa. Como un resultado, el pl promedio de la EPO humana producida por PER.C6MR es significativamente mayor que el pl promedio de la EPO urinaria humana o la EPO humana recombinante producida por células CHO y BHK. Debido a que los glucanos de EPO, en particular los ácidos siálicos también influencia sobre la unión al receptor EPO, se espera que la EPO humana producida por PER.ce™1 tenga una afinidad diferente para el receptor EPO en comparación con la EPO urinaria humana y la EPO humana recombinante producida por .células CHO y BHK. Aunque se ha descrito previamente la producción de EPO en células PER.Ce"11 (documento O 00/63403) , ninguno de los detalles estructurales de la EPO producidas ha sido descrito desde entonces. Por lo tanto, los objetivos que se obtienen en la presente justifican la conclusión de que la producción de EPO en PER.CG^ se vuelve adecuado para aplicaciones completamente nuevas, especialmente en donde se considera a la eritropoyesis como un efecto secundario (no deseado) . Por supuesto, otras proteínas se pueden beneficiar de los objetivos nuevos que se proporcionan en la presente. De acuerdo con un aspecto de la invención se proporciona un método para la elaboración de proteína en necesidad de N-glucanos que contienen Lewis X o LacdiNAc, utilizando PER. ce 1 o cualquier célula de mamífero que exprese ?1?. Los ejemplos de proteínas que se pueden beneficiar de tales estructuras y por lo tanto que son producidos adecuadamente sobre tales células son eritropoyetina, transíerrina, una glucodelina tal como glucodelina A (PP14) , factor de crecimiento de nervios (NGF, por sus siglas en inglés) , factor neurotrófico derivado de cerebro, neurotrofina-3 , -4/5 y -6, factor neurotrófico ciliar, factor inhibidor de leucemia, cardiotrofina-1, oncostatina-M, una interleucina, GM-CSF, G-CSF, IGF-1 y 2, TGF-ß, factor neurotrófico derivado de neuroglía, neurturina, persefina, miostatina, factor de crecimiento de fibroblastos-1 , -2 y -5, anfirregulina, actividad de inducción de receptor de acetilcolina, netrina-1 y -2, neurregulina-2 y -3, pleyotrofina, midquina, factor de emocitoblastos (SCF, por sus siglas en inglés) , agrina, CSF-1, PDGF, saposina C, receptor de complemento soluble-1, ácido of-1 de glucoproteína, proteínas de fase aguda, ligando-1 de selectina E, LAM-1, antígenos CD66 similares a antígeno carcinoembriónico, adresina de nodulo linfático periférico, CD75, CD76, CD45 0, CD21, ligando de glucoproteina de selectina P -1, GlyCAM-1, glucoproteínas de tipo mucina, CD34, podocalixina, a?-antiquimiotripsina, inhibidor de proteasa al, a-amilasa, glucoproteínas salivales ricas en prolina, SERP-1, interferón-ß, proteína en trazas ß, proteína C, urocinasa, esquistosoma, glucoproteina, glucodelina A, inhibidor de trayectoria de factor tisular, a-fetoproteína, proteína de embarazo humano tales como hormonas gonadotrópicas tales como hormona estimulante de folículos (FSH, por sus siglas en inglés) , hormona luteinisante (LH, por sus siglas en inglés) , hormona coriogonadotropina (HCG, por sus siglas en inglés) o fragmentos o variantes de cualquiera de estas que sean capaces de recibir las estructuras de glucosilacion. Como se utiliza en la presente, los fragmentos son partes de la proteína que pueden ser péptidos de varios aminoácidos de longitud hasta casi la totalidad de la proteína. Las variantes pueden ser muteínas, proteínas de fusión, proteínas o péptidos acoplados a otras porciones no proteínicas y similares. Tales fragmentos o variantes de acuerdo con la invención deben ser capaces de recibir las modificaciones postraduccionales . En otros aspectos de la invención, se proporcionan métodos para la elaboración de una fracción enriquecida en una molécula proteinácea que tiene glucanos N-unidos que comprende estructuras (sialil) Lewis X o LacdiNac, que comprenden las etapas de: a) expresar recombinantemente la molécula proteinácea en una célula que expresa ácido nucleico que codifica para E1A a partir de un adenovirus; y b) fraccionar las moléculas proteináceas producidas de esta manera, por lo que se obtiene una fracción la cual está enriquecida con moléculas que tienen glucanos N-unidos que comprende estructuras (sialil) Lewix X y o LacdiNac. Las moléculas proteinacesas mencionadas antes se pueden beneficiar de este aspecto de la invención. La proteína C producida en células HEK293 y purificada subsecuentemente se ha descrito que tiene una estructura de glucosilación particular que comprende estructuras GalNAc-lewis X (Grinnell et al, 1994) , pero las proteínas purificadas no se han enriquecido a propósito en este tipo de azúcares, y al no seleccionar deliberadamente una célula de producción que exprese E1A. Existe el mérito de la presente invención al describir que existen células de mamífero que expresan E1A adenoviral y que se pueden utilizar para producir - las proteínas con glucanos N-unidos que comprende estructuras de " (sialil) Lewis X o LacdiNAc, a propósito, y por lo tanto enriquecer estas fracciones particulares. Preferiblemente, tales fracciones se enriquecen por un método que comprende una etapa de purificación por afinidad que utiliza las estructuras de glucano que se desean, tales como las que se utilizan en la unión a lectina o de un anticuerpo monoclonal que se une a glucanos N-unidos que comprende estructuras (sialil) Lewis X o LacdiNAc . En la presente se demuestra que la utilización de estos métodos para la producción de EPO es capaz de obtener fracciones de EPO con perfiles de glucosilación particulares. Un aspecto de la invención es proporcionar composiciones que comprenden moléculas similares a eritropoyetina que se seleccionan del grupo que consiste de eritropoyetina, una o más muteínas de eritropoyetina y uno o más derivados de eritropoyetina, caracterizados porque el número promedio de estructuras Lewis-X sobre glucanos N-unidos por molécula similar a eritropoyetina es de por lo menos aproximadamente 2:2. En otras modalidades, el número promedio de estructuras Lewis X sobre glucanos N-unidos por molécula similar a eritropoyetina es de por lo menos aproximadamen e 2.6, 2.7, 3.6, 4.1 ó 5.7. Tales composiciones pueden ser útiles para propósitos médicos, como se describe en la presente. La presente invención además describe el uso de proteínas de tipo cerebral producidas en células humanas para el tratamiento de daño por isquemia/reperfusión en mamíferos y especialmente en humanos. El daño por isquemia/reperfusión, como se utiliza en la presente, se define como el daño celular que se presenta después de reperfusión de tej idos isquémicos previamente viables. El daño por isquemia/reperfusión se relaciona, por ejemplo, pero no se limita a tratamiento trombolítico, angioplastía coronaria, colocación de grapas transversales aórticas, derivación cardiopulmonar, transplante de órganos o tejidos, traumatismos y choques . i La presente invención proporciona el uso de proteínas terapéuticas, producidas en células de mamífero con oligosacárido de tipo cerebral. Estos oligosacáridos de tipo cerebral comprenden en particular estructuras de Lewis x, estructuras sialil Lewis x o derivados de las mismas que contienen la estructura (sialil) Lewis x, para el tratamiento de daño por isquemia/reperfusión en sujetos mamíferos tales como humanos. La presencia de estructuras (sialil) Lewis x en proteínas recombinantes dirige a estas proteínas hacia el sitio del daño de isquemia/reperfusión y de esta manera ejercen un efecto protector contra isquemia/reperfusión de manera más eficaz en comparación que con proteínas que no contienen estructuras (sialil) Lewis x. La presencia de oligosacáridos de tipo cerebral en proteínas que se expresan de manera recombinante se ejemplifica en la presente invención por la eritropoyetina (EPO, por sus siglas en inglés) , la cual se produce en células PER.Ce1411. Este tipo particular de EPO contiene las estructuras Lewis x así como sialil Lewis x. En la presente invención se han descrito experimentos que se muestran la superioridad de EPO de tipo cerebral de PER.C6 (o tipo neural) en comparación con EPO de tipo sérico (o tipo renal) con respecto a la función cardioprotectora en modelos in vivo de daño cardíaco por isquemia/reperfusión y en apoplejía. Otra ventaja representada por la presente invención es que la EPO humana producida por PER.C61J1R tiene una actividad neurotrófica . La EPO producida por PE .CG1^ proporciona a la proteína EPO ventajas fisicoquímicas, farmacocinéticas o farmacodinámicas al funcionar como un agente neurotrófico o neuroprotector . La EPO producida por PER.C6MR tiene una mayor afinidad por células neurales y para la EPO-R sobre células neurales en comparación con la EPO recombinante humana glucosilada de tipo sérico altamente sialilada producida en células CHO y BHK. La EPO humana recombinante producida en células no neurales (Goto et al . 1988) tiene una afinidad menor por la EPO-R sobre células neurales que para la EPO-R sobre células progenitoras eritroides (Musada et al. 1993 y 1994) . El papel neuroprotector de EPO abren claramente posibilidades nuevas para el uso de EPO humana recombinante como tratamiento neuroprotector en respuesta a sustancias químicas tóxicas que se pueden inducir por inflamación o por hipoxia o bien por isquemia, o en trastornos neurodegenerativos. Además, un inconveniente principal es que, cuando se aplica como un agente neuroprotector, la EPO recombinante presente en circulación sanguínea también generará un incremento en la masa de eritrocitos o el hematocrito. A su vez, esto induce una mayor viscosidad de la sangre lo que puede tener efectos perjudiciales en la isquemia cerebral (Wiessner et al. 2001). La presente invención proporciona una solución para el problema de que la EPO humana recombinante que se ha aplicado hasta ahora como agente neuroprotector tiene efectos secundarios hematotrópicos no deseados (Wiessner et al. 2001) . De esta manera, se demuestra que la EPO humana recombinante glucosilada de tipo cerebral producida por PER.CS"11 tiene un potencial elevado como agente de neurogénesis o neuroprotector mientras que tiene un potencial bajo en estimular la eritropoyesis . De acuerdo con la invención, la EPO producida en una célula de mamífero que expresa E1A, tal como la EPO producida por PER.C6MR, se puede administrar sistémicamente (por vía intravenosa, intraperitoneal o intradérmica) para inhibir, impedir o reparar el daño neural que es causado, ¦ por ejemplo, por desórdenes de daño agudo a la cabeza y el cerebro o trastornos neurodegenerativos. La presente invención también proporciona productos que se pueden utilizar para modular la función de tejidos que pueden dañarse en gran medida por hipoxia, tales como el sistema nervioso central y periférico, tejido de retina y tejido cardíaco en mamíferos. Tales tejidos pueden estar enfermos pero también pueden ser normales y saludables . Los desórdenes que pueden ser tratados por los productos que se proporcionan por la presente invención pueden resultar de daños agudos a la cabeza, cerebro o corazón, enfermedades neurodegenerativas, desórdenes de apoplejía, envenenamiento por neurotoxinas , hipotensión, supresión cardíaca, radiación, esclerosis múltiple o de daños debidos a hipoxia. La hipoxia puede ser el resultado de una carencia prenatal o post-natal de oxígeno, condición de sofocación, enfisema, choque septicémico, supresión cardíaca, choque, pseudoahogamiento de sumersión, crisis de células falciformes, síndrome de malestar respiratorio adulto, disritmia, narcosis por nitrógeno, disfunción cognoscitiva, post-quirúrgica, envenenamiento por monóxido de carbono, inhalación de humo, choque anafil ctico por enfermedad pulmonar obstructiva crónica o choque por insulina. Los daños por ataque o apoplejía incluyen, pero no se limitan a epilepsia, trastorno de apoplejía crónica o convulsiones. En el caso la patología es un resultado de enfermedades neurodegenerativas y el desorden se puede deber a demencia por sida, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, encefalopatía esponjiforme humana, apoplejía, parálisis cerebral, traumatismo de la médula espinal, traumatismo al cerebro, pérdida relacionada con la edad de la función cognositiva, esclerosis lateral amiotrófica, alcoholismo, isquemia de la retina, glaucoma, pérdida neural general, pérdida de memoria o envejecimiento. Otros ejemplos y enfermedades que pueden ser tratadas con los productos que se proporcionan por la presente invención incluyen autismo, depresión, trastornos de ansiedad, trastornos en el humor (cambios de humor) , trastorno de hiperactividad con deficiencia de atención (ADHD, por sus siglas en inglés) y disfunción cognoscitiva. La PER.CG^-EPO puede atravesar pasivamente la barrera hematoencefálica en caso de disfunción de la barrera hematoencefálica . En caso en que la barrera hematoencef lica está intacta, se considera que PER.CS^-EPO es transportado de manera activa sobre dicha barrera hematoencefálica a través de EPO-R. Algunos estudios sugieren que EPO en sí misma es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica cuando se administran dosis elevadas de EPO recombinante (documento WO/61164) . Otra vía predicha para PER.CS^-EPO recombinante para que atraviese la barrera hematoencefálica es por medio de la interacción de las estructuras de (sialil-) Lewis x glucano presentes en la EPO producida por PER.C6MR con moléculas de selectina E presentes en células endoteliales de microvasos cerebrales humanos (Lou et al., 1996). La interacción entre selectina E y EPO puede facilitar el transporte de EPO a través de la barrera endotelial cerebral dado que la selectina E también se ha implicado en la migración de linfocitos T al SNC (Wong et al. 1999). Si se requiere para neuroproteccion óptima, se puede administrar la EPO producida por PER.CS1^ en una dosis significativamente más elevada en comparación con la EPO de tipo sérico, debido a que la PER.ce^-EPO inducirá eritropoyesis con mucho menor eficacia, de manera que se reducen o incluso están ausentes los efectos perjudiciales de un incremento en el hematocrito. En otro aspecto de la invención, la EPO producida en una célula de mamífero que expresa E1A, tal como la PER. C6MR-EP0, se puede administrar por vía intratraqueal por infusión, o a través de un catéter ventricular incrustado, o a través de inyección lumbar, para inhibir o impedir daño neural. Nuevamente, la ventaja de utilizar EPO de tipo cerebral con respecto a EPO de tipo sérico es que en caso de fuga a la circulación sanguínea, en caso de disfunción de la barrera hematoencefálica, debido por ejemplo a apoplejía, no se presentarán efectos secundarios indeseables con respecto a la eritropoyesis. La presente invención establece que las células transformadas en crecimiento indefinido que crecen a densidades muy altas bajo condiciones sin suero y que tienen características neurales tales como "PER.C6m, son muy útiles para generar factores que dependen de su funcionalidad sobre estas características. Esto de manera inherente proporciona también la posibilidad de generar factores que no tengan características neurales o funciones relacionadas con el sistema neural pero que no obstante se beneficien de las modificaciones postraduccionales que se llevan a cabo por tales células . Se puede considerar que algunos factores también juegan un papel en tejido no neural pero que aún requieren estructuras de glucosilación que incluyan, por ejemplo, estructuras de Lewis x o residuos fucosa, como se describe para EPO en la presente invención y que se pueden proporcionar por los medios y métodos de la presente invención. Los ejemplos de factores que se pueden producir por PER.ce™ y que pueden aprovechar las características neurales de las células PER.CG™1 incluyen, pero no se limitan a eritropoyetina de tipo cerebral, transferrina y los diferentes factores mencionados en lo anterior. La invención muestra que es muy probable que la producción de otras glucoproteínas neurotróficas recombinantes se beneficie de las modificaciones de tipo cerebral que se llevan a cabo en dichas células . De acuerdo con la presente invención, se ha encontrado sorprendentemente que las moléculas similares a eritropoyetina que tienen en promedio una cuenta menor de residuos de ácido siálico por estructura principal proteínica aún son eficaces en el tratamiento o prevención de diversos trastornos. Esto abre modos completamente nuevos de utilizar moléculas de EPO y similares a EPO que hasta ahora se consideraban de poco uso o de nulo uso que incluye pero que no se limitan fracciones de EPO bajas en sialilo de lotes de EPO producidos en sistemas de células de mamífero recombinantes , desechados por fraccionamiento debido a su bajo grado de sialilación o poca actividad eritropoyética asociada. De esta manera, la presente invención demuestra que EPO con un contenido bajo de ácido siálico es aproximadamente tan potente en reducir el infarto cardíaco en un ataque inducido experimentalmente en ratas en comparación con EPO con un contenido mayor de ácido siálico. Se ha establecido bien en la técnica que un contenido elevado de ácido siálico en EPO se correlaciona con vidas medias circulatorias más prolongadas y un potencial eritropoyético aumentado in vivo (Tsuda et al. 1990; Morimoto et al. 1996). Por lo tanto, en términos generales, la invención proporciona el uso de una composición de moléculas similares a eritropoyetina que se seleccionan del grupo que consiste de eritropoyetina, una o más muteínas de eritropoyetina, uno o más derivados de eritropoyetina y una composición de una o más fracciones de moléculas de eritropoyetina sialiladas en un grado variable, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno que se selecciona del grupo que consiste de isquemia, daño por reperfusión, trastornos inducidos por hipoxia, una enfermedad inflamatoria, un trastorno neurodegenerativo y daño agudo al sistema nervioso central o periférico, en donde la composición de moléculas similares a eritropoyetina tienen, en una base de contenido de proteína, una actividad eritropoyética menor in vivo en comparación con la epoyetina a y la epoyetina ß . Las modalidades de la invención comprenden composiciones y uso de las mismas en donde la actividad eritropoyética in vivo es de por lo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ó 90% menor en comparación con la epoyetina a (Eprex) o la epoyetina ß. Las moléculas similares a eritropoyetina quieren significar la inclusión en moléculas que tienen una estructura principal proteínica que es idéntica o similar a las formas conocidas actualmente de EPO, por ejemplo las muteínas de EPO, derivados de EPO o moléculas de EPO que difieren en glucosilación de la estructura principal proteínica en el aspecto cualitativo o cuantitativo. Las muteínas como se utilizan en la presente significa que consisten de moléculas similares a eritropoyetina que tienen una o más mutaciones en la estructura principal de proteína por supresión, adición, sustitución o cambio de lugar de los aminoácido en relación a la estructura principal de proteína de epoyetina a e incluirán variantes alélicos que se presenten de manera natural así como variantes que se obtengan genética, química o enzimáticamente . Tales moléculas aún serán capaces de conferir actividad funcional de EPO. Se pueden obtener mediante técnicas estándar de biología molecular, bien conocidas por los expertos en la técnica. Un derivado, como se utiliza en la presente, es una molécula similar a eritropoyetina que se puede obtener de eritropoyetina o epoyetina o¡ o cualquier otra mutexna funcional de epoyetina a por modificación química o enzimática de la misma. El término actividad eritropoyética significa el efecto estimulador de EPO sobre la producción de eritrocitos en un sujeto humano o animal, como se puede medir por un incremento en los valores de hematocrito en cierto punto en el tiempo después de la administración al sujeto humano o animal de moléculas similares a eritropoyetina (véase, por ejemplo, ejemplo 9) , o la medición de la concentración de hemoglobina. Todos estos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica. La epoyetina OÍ en la forma de EPO humana recombinante presente en Eprex-1^ comercializado actualmente -y es similar o idéntica (con respecto a la composición de aminoácidos y carbohidratos) a la eritropoyetina humana aislada de orina en pacientes con anemia. Se han establecido bien los regímenes de tratamiento para propósitos eritropoyéticos . En general, las dosificaciones de EPO se administran en UI (unidades internacionales) , con referencia a la actividad de EPO en la eritropoyesis . Tales UI se relacionan con el contenido de proteína de EPO pero se definen operacionalmente y por lo tanto dicha relación puede variar entre lotes diferentes.

Como una regla empírica, una UI corresponde a 8-10 ng de epoyetina a. Con el fin de describir la invención, la actividad eritropoyética de las moléculas similares a eritropoyetina se denomina en una báse en contenido de proteina, para eliminar la variable introducida por la definición de UI . Será evidente para una persona experta en la técnica que aunque habitualmente se proporcionan UI para preparaciones comerciales de EPO, la concentración de moléculas de EPO en tales preparaciones se puede definir fácilmente de acuerdo con procedimientos estándar. Esto permitirá determinar la actividad específica relativa, por ejemplo, en Ul/g (véase, por ejemplo el documento EP 0428267) . Varios ensayos in vivo e in vit.ro útiles para estos propósitos también se describen en Storring et al. (1992). Los ejemplos de otras formas de EPO actualmente en el mercado son Procrit o Epogen (ambas epoyetinas OÍ) y Aranesp (darbepoyetina OÍ, EPO con sitios de N-glucosilacíón adicionales para aumentar la vida media en circulación y la actividad eritropoyética) . Aunque la actividad eritropoyética puede variar en cierta medida entre las diversas preparaciones comerciales de epoyetina a y de epoyetina ß en el mercado, generalmente se optimizan para una alta actividad eritropoyética. La presente invención describe el uso de moléculas similares a EPO o formas de EPO que tienen menor actividad emopoyética o eritropoyética, y por lo que disminuyen o evitan los efectos secundarios de eritropoyesis aumentada, cuando esto no se desea. De acuerdo con otra modalidad de la invención, una composición de moléculas similares a eritropoyetina se caracteriza por un número promedio de residuos de ácido siálico por molécula similar a eritropoyetina que es por lo menos 10% menor que el número promedio de residuos de ácido siálico por molécula de eritropoyetina en epoyetina a. De acuerdo con otras modalidades, el número promedio de residuos de ácido siálico se puede seleccionar para que sea de por lo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ó 90% menor que el número promedio de residuos de ácido siálico por estructura principal de proteína EPO en epoyetina a. El número promedio de residuos de ácido siálico en la molécula similar a eritropoyetina preferiblemente se encuentra entre 0 y 90% del número promedio de residuos de ácido siálico por molécula de EPO en epoyetina , pero el porcentaje exacto puede depender de un trastorno a otro y, en algunos casos, de un paciente a otro, dado que algunas combinaciones de paciente y el trastorno son menos vulnerables a valores elevados de ematocrito en comparación con otros. De manera alternativa, el número de residuos de ácido siálico se puede describir por molécula similar a EPO, por ejemplo 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, l ó 0 residuos de ácido siálico por molécula similar a EPO. Dado que los valores son promedios calculados para una composición que consiste de moléculas similares a EPO de grado variable de sialilación, son posibles valores diferentes a los números enteros entre los valores mencionados con el fin de definir las moléculas de acuerdo con la invención. El intervalo óptimo se puede determinar empíricamente sin carga indebida por una persona experta en la técnica. El número promedio de residuos de ácido siálico por molécula o el contenido de ácido siálico de EPO se puede determinar de acuerdo con procedimientos publicados y son bien conocidos por las personas expertas en la técnica. Un procedimiento posible se describe en el documento EP 0428267. Brevemente, los residuos de ácido siálico se separan de las moléculas similares EPO por hidrólisis con ácido sulfúrico 0.35 M, a 80°C durante 30 minutos y las soluciones se neutralizan con hidróxido de sodio antes del análisis. De manera alternativa, se pueden separar los ácidos siálicos por separación enzimática de acuerdo con procedimientos estándar. Se calcula la cantidad de EPO utilizando procedimientos bien conocidos, por ejemplo mediante la utilización de equipos de ensayo de proteínas disponibles comercialmente (por ejemplo el ensayo Bradford, Biorad) y curvas estándar utilizando EPO humana recombinante como un estándar, absorbancia a 280 nm, ELISA, RIA y similares. El contenido de ácido siálico se puede analizar por el procedimiento de Jourdian et al. (1971). De manera alternativa, se pueden analizar los ácidos siálicos utilizando cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución, utilizando procedimientos bien conocidos por las personas expertas (por ejemplo análisis de ácidos siálicos utilizando cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución, número de nota de solicitud TN41, Dionex) . El contenido de ácido siálico se puede expresar como moles de ácidos siálico por mol de EPO o un número promedio de residuos de ácido siálico por molécula similar a EPO. Una indicación para el número promedio de residuos de ácido siálico por molécula similar a EPO también se puede proporcionar mediante enfoque isoeléctrico (véase ejemplo 4), el cual mide el pl . Se pueden considerar varias maneras para obtener moléculas similares a eritropoyetina con un número promedio menor de residuos de ácido siálico por molécula similar a eritropoyetina. Estos incluyen, pero no se limitan al tratamiento de moléculas similares a EPO producidas, por ejemplo, de manera recombinante en cualquier línea de célula hospedadora adecuada, utilizando enzimas que separan el ácido siálico en particular, tales como neuraminidasas o enzimas que se separan más sustituyentes (que incluyen al ácido siálico) de las estructuras de glucosilación, tales como, por ejemplo, N-glucanasa P (que separa N-glucano completo) , endoglucosidasa F2 (que separa estructuras biantenarias) , endoglucosidasa F3 (que separa estructuras biantenarias y triantenarias) y similares, o el tratamiento de moléculas similares a EPO con sustancias químicas que incluyen pero que no se limitan a ácidos, lo que resulta en una disminución en el número promedio de residuos de ácido siálico por molécula similar a EPO. En particular, una fracción de EPO altamente sialilada de esta manera se puede desialilar y utilizar en la presente invención. En otra modalidad adicional, las moléculas similares a EPO con un número inferior promedio de moléculas de ácido siálico se obtienen por purificación o separación de tales formas de una mezcla que contiene EPO sialilado tanto superior como inferior. Los sistemas de producción utilizados actualmente generalmente resultan en dichas mezclas, y la EPO que se pretende para propósitos eritropoyéticos se prepara al purificar las formas con un número promedio alto de residuos de ácido siálico. La presente invención describe el uso de otras fracciones de este procedimiento, es decir, las formas de EPO con un número menor de residuos de ácido siálico. La purificación o separación de tales fracciones se puede realizar utilizando técnicas bien establecidas y conocidas por las personas expertas, tales como intercambio iónico, purificación por afinidad y similares. Las moléculas similares a eritropoyetina de la invención preferiblemente se producen de manera recombinante . Esto se puede realizar en cualquier sistema de expresión adecuado, que incluye pero que no se limita a células de ovario de hámster chino, células renales de hámster bebé/ células humanas tales como HeLa, HEK293 o PER-Ce^. También es posible la expresión en células eucarióticas inferiores tales como células de insecto o levadura. La producción de moléculas similares a EPO que tengan un bajo contenido de ácido siálico se puede llevar a cabo en sistemas de células carentes en sialilación, por medio de una carencia natural de enzimas sialilantes tales como algunos hospedadores procariotas, o por mutagénesis o modificación genética de hospedadores que de otra manera son capaces de producir proteínas sialiladas. Los métodos y medios para producir proteínas recombinantes están bien documentados y se conocen por las personas expertas en la técnica, y serán evidentes para las personas expertas que utilicen una fuente diferente para la proteína similar a EPO, las cuales son posibles sin que por estos se aparten del alcance de la invención. En un aspecto de la invención, las moléculas similares a EPO se producen por métodos de acuerdo con la invención y de esta manera se producen moléculas con una modificación postraduccional predeterminada. En otro aspecto de la invención, la composición que comprende moléculas similares a eritropoyetina se caracteriza por la presencia de moléculas similares a eritropoyetina que, una vez que se administran parenteralmente a un sujeto humano o animal, son depuradas de la corriente sanguínea a una velocidad más rápida que la epoyetina a y la epoyetina ß. Se puede medir la depuración de la corriente sanguínea por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo al determinar la vida media de una proteína en sangre tal y como se realiza en el ejemplo 18. En voluntarios sanos, la epoyetina a tiene una vida medio en circulación de aproximadamente 4 horas después de inyecciones intravenosas repetidas . Se ha reportado una vida media de aproximadamente 5 horas en pacientes con insuficiencia renal crónica y de aproximadamente 6 horas en niños . Utilizando el método del ejemplo 8, medimos la vida media de 180 min para la epoyetina a (Eprex) . Debe quedar claro a las personas expertas en la técnica que este método se puede utilizar para determinar la vida media de las composiciones de la invención y que la expresión de esta vida media en horas o en un porcentaje de la vida media de EPO estándar (Eprex) . Son factibles experimentos similares en humanos para determinar la vida media en humanos. Las moléculas similares a eritropoyetina con una proporción menor de estructuras tetraantenarias respecto a estructuras biantenarias también tendrá una vida media más corta en plasma (Misaizu et al. 1995; Takeuchi et al, 1989). La producción de EPO en líneas de células que dan lugar a relaciones mucho menores es factible, o alternativamente estas formas se separan y purifican a partir de las formas que contienen más estructuras tetraantenarias. Tales composiciones comprenden estructuras relativamente más biantenarias y también son útiles de acuerdo con la invención. También es evidente que una ventaja de la invención actual es que se pueden alcanzar concentraciones máximas más elevadas de moléculas similares a eritropoyetina en la circulación, en comparación con las formas de EPO utilizadas actualmente tales como Eprex, Procrit y NESP. Si se desean concentraciones elevadas de moléculas similares a EPO para dicho tratamiento, esto se puede llevar a cabo al administrar dosis elevadas de las composiciones de la invención, por ejemplo en forma de preparaciones farmacéuticas que contienen tales dosis elevadas . La administración de dosis similares en una base de contenido de proteína de las moléculas similares a EPO utilizadas actualmente puede generar una eritropoyesis mayor, el cual es un efecto secundario no deseado para dichos tratamientos. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden moléculas similares a eritropoyetina y métodos para el tratamiento o para evitar desórdenes que se seleccionan de tales grupos, así como composiciones de moléculas similares a eritropoyetina para el tratamiento preventivo o terapéutico del cuerpo humano o animal . EJEMPLOS Ejemplo 1. Estudios sobre la expresión de proteínas marcadoras en células PER.ce111*. Las células que fueron transformadas con la región El del adenovirus humano tipo 5 y que resultaron en la línea de células PER.C6MR (como se deposito bajo ECACC número 96022940) se derivan de retina embriónica humana. Las retinas generalmente comprenden muchos tipos de células diferentes (por lo menos 55 subtipos neurales diferentes) , que incluyen células neurales y similares a fibroblastos ( asland 2001) . Con el fin de realizar un seguimiento del origen celular de PER.06"* se realiza un estudio para probar la expresión de proteínas marcadores dentro o sobre las células. Estos marcadores se conocen en la técnica como característicos para ciertos tipos o tejidos de células. En la tabla I se proporcionan las proteínas marcadoras. Se probó la expresión de proteína marcadora utilizando anticuerpos dirigidos contra las proteínas marcadoras . En cada experimento se corrieron al mismo tiempo un control negativo (células PER.06™- no incubadas con anticuerpos) y un control positivo. Estos controles positivos son secciones o cortes de tejido humano que se sabe expresan la proteína marcadora (tabla II) . Se cultivan las células PER.ce1® sobre cubreobjetos de vidrio en una cámara de medio (Life Technologies, Nunc Lab-Tek, Chamber Slide, esterilizada por radiación, 2 cámaras de medio, catálogo número 154464A) . Las células PER.ce1^ se siembran hasta 55-70% de confluencia (2 pozos por cámara de cultivo) y se cultivan durante 24 h a 37°C (C02 10%, aire 95%) . El medio se aspira y los cubreobjetos de vidrio con las células se lavan con PBS estéril, se separan de la cámara de medio y se secan al aire. Las células se fijan sobre los cubreobjetos por incubación en acetona durante 2 min. Después de secar al aire, los cubreobjetos se envuelven en láminas de aluminio y se congelan a una temperatura inferior a -18°C hasta que se utilizan. Se obtienen tejidos de control positivos de bancos de cubreobjetos de tejido preparados para uso sistemático en la división de patología de Academic Hospital Erasmus University (Rotterdam, Países Bajos) . Los cortes congelados (5 µ??) se preparan y fijan en acetona, de acuerdo con los procedimientos sistemáticos habituales. Los anticuerpos primarios, sus proteínas marcadoras respectivas, los proveedores y los números de catálogo de los anticuerpos se proporcionan en la tabla III. Las diluciones, que también se indican en la tabla III, se realizan en solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) y albúmina sérica bovina 1%. Las incubaciones de los cubreobjetos con el anticuerpo primario se realizan durante 30 min a temperatura ambiente, se enjuagan con PBS y se incuban con el anticuerpo secundario. Estos anticuerpos secundarios son anticuerpos de chivo contra conejo (DAKO E0432; dilución 1:50) o anticuerpo de chivo contra ratón (DAKO E0433, dilución 1:50), con base en la naturaleza del anticuerpo primario utilizado. El anticuerpo secundario se conjuga con biotina. Después de enjuagar con PBS, los cubreobjetos se incuban con un complejo de estreptavidina-avidina/biotina conjugado con fosfatasa alcalina (DAKO, K0376) . Después de 30 min de incubación las muestras se enjuagan con Tris-HCl, pH 8.0, y se revelan con sustrato de fuchsina cromogénico (DAKO K0624) en un cuarto Oscuro durante 30 min. Posteriormente los cubreobjetos se enjuagan con agua corriente durante 2 min y se tiñen de manera contrastante con hematoxilina, de acuerdo con procedimientos sistemáticos bien conocidos por las personas expertas en la técnica. Posteriormente los cubreobjetos se examinan al microscopio y se califican para determinar la expresión de proteína marcadora (negativo o positivo) . En la tabla IV se presentan los resultados. Para tinción de neurofilamentos (resultado positivo) no todas las células PER.eC™ tiñen positivo como resultado de diferentes fases en el ciclo celular o en la maduración de la población de células . Esta es una observación normal para tinciones de neurofilamentos . A partir de los datos obtenidos se concluye que las células PER.ec"11 son de origen neural dado que dichas células presentan tinción positiva para vimentina, sinaptofisina, neurofilamentos, GFAP y N-CAM. Ejemplo 2. Composición de monosacáridos de N-glucanos derivados de PER. C6101-EPO en comparación con el de Eprex Una primera etapa en la caracterización de las estructuras de N-glucano producidas por PER.ec1^ es la medición de la proporción molar de los diversos monosacáridos . El análisis de monosacáridos se realiza utilizando cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución con detección amperométrica por pulsos (HPAEC-PAD, por sus siglas en inglés) . Las muestras de EPO, producidas por clones derivados de PER.6(3™ P7; P8 y C25 (P7 y P8 se describen en el documento WO 00/63403) y C25 se produce generalmente de acuerdo con estos métodos, utilizando un gen de resistencia a neomicina como el marcador de selección [plásmido pEP0200l/Neo] ) en medio DMEM o JRH, se seleccionan para este análisis. Se analiza en paralelo Eprex (Jansen Cilag) , el cual es eritropoyetina derivada de CHO recombinante disponible comercialmente y por lo tanto se utilizó como referencia. Las muestras de PER.ec^-EPO se purifican por cromatografía de afinidad utilizando una columna empacada con esferas de Sepharose C4 (volumen de lecho o volumen inerte de 4 mi, Amersham Pharmacia Biotech) acoplado con anticuerpos monoclonales de ratón contra EPO (IgGl) . Las moléculas de EPO unidas se eluyen con clorhidrato de glicina 0.1 M, pH 2.7 y las fracciones resultantes se neutralizan de inmediato al agregar amortiguador de fosfato de sodio/potasio, pH 8.0. Posteriormente, las fracciones que contienen EPO se acumulan y el amortiguador se intercambia a clorhidrato de Tris 20 mM, que contiene 0.1% (v/v) de Tween 20, mediante la utilización de columnas de eliminación de sal Hiprep 26/10 (Amersham Pharmacia Biotech) . Para el análisis de glucano, se dializan durante la noche muestras de EPO purificadas, contra agua grado MilliQ, y se secan en un evaporador Speedvac . Las muestras de EPO secas (las cantidades varían de 39 a 105 \ig) se disuelven en amortiguador de incubación (1:1 diluido con amortiguador de perfilado C3 , Glyko) . Ante la adición de docecilsulfato de sodio (SDS, por sus siglas en inglés) y ß-mercaptoetanol hasta concentraciones finales de 0.1% (p/v) y 0.3% (v/v) , respectivamente, las muestras se desnaturalizan durante 5 min a 100 °C. Posteriormente se agregan Nonidet P-40 (BDH) hasta una concentración final de 0.75% (v/v) y la EPO se desglucosila durante la noche a 37°C utilizando N-glucanasa F (mU, Glyko) . Después de la desglucosilación, los N-glucanos liberados se separan de las proteínas, sales y detergentes mediante la utilización de negro de carbono grafitado (Carbograph) columnas SPE (Alltech) , de acuerdo con Packer et al . (1998) . Las cadenas de N-glucano purificadas se someten a hidrólisis en ácido trifluoroacético (TFA) 2 M a 100°C durante 4 h. Después de la hidrólisis los monosacáridos se secan en un evaporador Speedvac, se lavan con agua y se evaporan nuevamente en un equipo Speedvac . Los monosacáridos secos se disuelven en 26 µ? de agua grado MilliQ. Después de la adición de 6 µ? de desoxiglucosa (100 nmol/ml) , la cual se utiliza como estándar interno, se aplican muestras de 24.5 µ? a un sistema HPAEC-PAD BioLC con una columna CarboPac PA1 de 2 mm de diámetro (Dionex) . La columna se corre isocráticamente en NaOH 16 mM (Baker) a una velocidad de flujo de 0.25 ml/min. Se calcula la composición de monosacárido al comparar el perfil con el que se obtiene con una mezcla de estándares de monosacárido que consisten de fucosa, desoxiglucosa, galactosamina, glucosamina, galactosa y mañosa. El análisis de monosacáridos muestra que el estado de glucosilación de PER.eC^-EPO es significativamente diferente de Eprex (tabla V) . La proporción de los monosacáridos indicados (Man = mañosa, Fue = fucosa, GalNAc = N-acetilgalactosamina, GlcNAc = N-acetilglucosamina, Gal = galactosa) se normaliza a 3 Man. Los valores dobles se proporcionan entre corchetes. Las muestras de PER.eC^-EPO contienen cantidades significativas de GalNAc mientras que los azúcares N unidos de Eprex carecen de este residuo. Esto sugiere que PER.ec^-EPO contiene estructuras denominadas LacdiNAc (por e emplo GalNAcß1-4s????s) . Otra característica de PER.ec^-EPO es la abundancia relativa de residuos fucosa que se muestran en la tabla V. Esto indica fuertemente la presencia de estructuras de Lewis en los N-glucanos de PER. ec^-EPO. En contraste, se sabe que Eprex carece de estructuras de Lewis. En consecuencia, la cantidad de fucosa encontrada en Eprex se puede atribuir únicamente a la fucosilación del núcleo de N-glucano. Resulta notable que los datos del análisis de monosacáridos también muestra que las condiciones de cultivo afectan el estado de glucosilación de EPO en PER.ec^. No se puede concluir que las condiciones de cultivo sean las únicas responsables de las modificaciones postraduccionales predeterminadas que se observan en las proteínas que se producen. Por supuesto, las líneas celulares deben ser capaces de modificar las modificaciones postraduccionales de las proteínas producidas en tales células mediante la presencia de ciertas enzimas específicas de glucosilación tales como las transferasas . Las condiciones de cultivo únicamente pueden ejercer actividades aditivas. Por ejemplo, cuando se cultivan clones productores de EPO (en suspensión) en medio JRH Excell 525, los glucanos unidos a N de EPO se encuentra que contienen concentraciones más altas de GlcNAc, GalNAc, Gal y Fue, en comparación con los azúcares N unidos de EPO derivado de células cultivadas (adherentes) en DMEM (tabla V) . Este efecto es particularmente evidente en el caso del clon P8. La concentración elevada de GlcNAc puede sugerir que se incrementa la ramificación de los azúcares N unidos o que los azúcares N unidos contienen más secuencias repetidas de lactosamina cuando las células se cultivan en medio JRH. El incremento en la N-acetilglucosaminilación y en la (N-acetil-) galactosilación a su vez genera una cantidad aumentada de sitios aceptores de fucosa por lo que se proporciona una explicación del incremento en el contenido de Fue. Ejemplo 3: Análisis de espectrómetro de masas para mostrar las diferencias estructurales entre los N-glucanos de PER.ce^-EPO y Eprex Para obtener una información más detallada respecto a la estructura de los N-glucanos producidos en PER.6Cm, se decide analizar las cadenas de azúcar completas de PER.ec"11-EPO por MALDI-EM. Para este análisis se utilizan muestras de EPO purificadas por afinidad, elaboradas por los clones P7 y P8 derivados de PER.6^ en DMEM, las cuales fueron fraccionadas adicionalmente por cromatografía de intercambio aniónico (como se describe en lo siguiente) . Las muestras de PER. ec^-EPO, purificadas por afinidad como se describe en el ejemplo 2, de las cuales el amortiguador se intercambia posteriormente a PBS, se sometieron a cromatografía de intercambio aniónico mediante la utilización de una columna HiTrap Sepharose Q HP (Amersham Pharmacia Biotech) . Se obtienen tres fracciones secundarias de EPO al aplicar un gradiente paulatino en clorhidrato Tris 20 mM/CuS04 20 µ comenzando con NaCl 45 mM (fracción 1) , seguido por NaCl 75 mM (fracción 2) y finalizando con NaCl 135 mM (fracción 3) . Cada etapa del gradiente dura 10 min con una velocidad de flujo de 1 ml/min. Las fracciones 1 de cuatro corridas se acumularon en el acumulado A, las fracciones 2 en el acumulado B y las fracciones 3 en el acumulado C. Los acumulados resultantes A, B y C posteriormente se les elimina la sal utilizando columnas de eliminación de sal HiPrep 20/10 (Amersham Pharmacia Biotech) . Los glucanos unidos a N se liberan de los acumulados de EPO por tratamiento con N-glucanasa F y se desialilan por tratamiento con neuraminidasa . Se analiza Eprex en paralelo, como una referencia. Los espectros de masa representativos de las diversas muestras de EPO se muestran en las figuras 1A a G: Eprex y las formas purificadas y fraccionadas (acumulados A, B y C de la columna de cromatografía de intercambio aniónico) . Muestras de PER.eC^-EPO derivadas de los clones indicados, cultivados en DMEM que se tratan con glucanasa F y neuraminidasa, y que posteriormente se analizan por MALDI-EM. Los símbolos (que se muestran en el espectro de Eprex) son: cuadro negro es GlcNAc, círculo blanco es Man, círculo negro es Gal, triángulo blanco es Fue. El perfil de masa de los azúcares N unidos de Eprex (figura 1A) corresponde a los datos publicados previamente e indica que los azúcares tetraantenarios con o sin secuencias repetidas de lactosamina predominan en esta preparación de EPO. Aunque Eprex y PER.ec^-EPO contienen estructuras de azúcar con una masa similar (figuras IB a G) , el perfil de las estructuras de azúcar de esta última es mucho más complejo, lo que sugiere que estos azúcares muestran un alto grado de heterogeneidad. Se utilizó el programa de computadora ExPAsy's para predecirla composición de azúcar en base en la masa observada (tabla VI y VII) . También se presentó la abundancia relativa de los diferentes oligosacáridos en cada acumulado. Los datos demuestran que la mayor parte de los oligosacáridos unidos a N derivados de PER . GC^-EPO contienen residuos de fucosa múltiples (tabla VI y VII, véase nivel o concentración de residuos dHex) . Algunos glucanos fueron incluso fucosilados por cuadruplicado. En consecuencia, estos datos concuerdan con nuestros análisis de monosacáridos y sugieren fuertemente que PER.ec^-E O está hiperfucosilada y, por lo tanto, muy probablemente está decorada extensamente con N-glucanos que tienen las estructuras denominadas de Lewis. Los oligosacáridos con epítopos de Lewis x (sialilados) se conocen como secuencias de reconocimiento esenciales para selectinas, que median las adhesiones célula-célula en respuesta tanto inflamatorias como inmunológicas (Varki et al, 1999) y se encuentran característicamente en glucoproteínas del cerebro (Margolis and Margolis 1989) . Por lo tanto, muchas glucoproteínas presentan estas estructuras de Lewis x se ha demostrado que tienen potencial terapéutico al mostrar actividades antiinflamatorias e inmunosupresoras . Se hace notar aquí que la señal de masa no siempre puede ser asignada inequívocamente a cierta estructura de azúcar: por ejemplo, los residuos similares a GlcNAc y GalNAc tienen la misma masa. Debido a que el análisis de monosacáridos de PER.6CMR-EP0 muestra la presencia de GalNAc en los azúcares unidos N, se espera que algunos picos representen N-glucanos con las denominadas estructuras LacdiNAc (por ejemplo 63? ?ß1-4ß1????) . Por ejemplo, los picos con valores m/z de - 2038 y ~ 2185 (tabla VI y VII) más probablemente representan N-glucanos con motivos LacdiNAc. De otra manera, estos picos pueden representar estructuras tetraantenarias , las cuales terminan en GlcNAc debido a la ausencia de Gal o GlcNAc. Aunque tales estructuras pueden estar presentes debido a glucosilación incompleta, la presencia de Fue proximal implica que el azúcar contiene un residuo Gal o GalNAc que es necesario para formar un motivo que sea reconocido por la fucosiltransferasa (FUT, por sus siglas en inglés) que cataliza la formación de la estructura de Lewis. La frecuencia relativa de los diferentes azúcares varia entre las preparaciones de EPO derivadas de dos clones independientes de PER.ec^, a juzgar por la diferencia en la altura relativa de ciertos picos. En particular, los azúcares biantenarios putativos con motivos LacdiNAc (figura 1; tabla VI y VII, señales con valores m/z de ~ 2038 y ~ 2185) son los azúcares principales en las muestras de EPO derivadas de P8, mientras que en las muestras de P7, estas estructuras son mucho menos abundantes. En este último clon, la estructura más abundante es el pico con un valor m/z de ~ 2541, que putativamente corresponde a un glucano tetraantenario completamente galactosilado . Estos datos concuerdan con nuestros análisis de monosacárido los cuales indican de antemano que, cuando crecen en DMEM, P8 produce EPO que presentan glucanos con un grado menor de ramificación que los derivados de P7-EP0 (tabla V) . Ejemplo 4. Comparación del contenido de ácido siálico de PER.06™-EPO y CHO-EPO Se analizó el contenido de ácido siálico de PER.GC^-EPO y se comparó con eritropoyetina derivada de células de ovario de hámster chino (CHO-EPO) mediante enfoque isoeléctrico (IEF, por sus siglas en inglés) utilizando tiras IPG (Amersham Pharmacia Biotech) que tienen un gradiente de pH lineal de 3-10. Después del enfoque, las isoformas EPO se transfieren pasivamente sobre nitrocelulosa y se visualizan utilizando un anticuerpo específico para EPO y ECL (figura 2) . La EPO elaborada por cuatro clones diferentes de PER.ec" (carriles C, D, E y F) y tres clones de CHO diferentes que expresan de manera estable EPO (carriles G, H e I) se analizaron por enfoque isoeléctrico para determinar el contenido de ácido siálico. Las líneas de células de CHO y PER.6CMR productoras de EPO se generaron, de manera general de acuerdo con los métodos descritos en el documento WO 00/63403 utilizando el gen de resistencia a neomicina como un marcador de selección. Se cargaron por tira 1000 Ue de PER.SC^-EPO y 500 Ue de CHO-EPO. Se utilizaron 500 Ue de Eprex (carril A) y Eprex tratado con neuraminidasa (parcialmente desialilada) (carril B) para identificar las diversas isoformas de EPO. Después de someter a enfoque, se transfiere EPO sobre un filtro de nitrocelulosa y se visualiza utilizando un anticuerpo monoclonal contra EPO y ECL. La muestra de Eprex que representa EPO disponible comercialmente es una formulación que contiene isoformas altamente sialiladas y se utiliza como un marcador. Los resultados demuestran que las células CHO son capaces de producir isoformas EPO que contienen una cantidad máxima de por lo menos 12 ácidos siálicos por molécula (carriles G a I) , confirmando los datos obtenidos por Morimoto et al. (1996). En contraste, aunque se producen algunas isoformas con 8 a 10 ácidos siálicos por PER.60^, estas se representan de manera mínima y únicamente son detectables después de exposición prolongada a la película (carriles C a F) . En consecuencia, se puede concluir que PER.eC^-EPO está considerablemente menos sialilada en comparación con CHO-EPO. Ejemplo 5. Actividades de las fucosiltransferasas al, 3-, al, 6- y a.1,2-, sobre las actividades en las células PER.C6m. La glucosilación potencial de una célula está determinada principalmente por un repertorio extenso de glucosiltransferasas involucradas en la biosíntesis paulatina de azúcares unidos a N o a 0. La actividad de estas glucosiltransferasas varía entre las líneas de células y, por lo tanto, las glucoproteínas producidas en las diferentes líneas de células adquieren diferentes glucanos. En vista de los datos mostrados en la presente, que demuestran que los -glucanos de PER.ec^-EPO están muy fucosilados, se analizó la actividad de numerosas fucosiltransferasas (FUT, por sus siglas en inglés) , involucradas en la síntesis de azúcares N unidos utilizando métodos conocidos generalmente por las personas expertas en la técnica (Van den Nieuwenhof et al . 2000) . En este estudio, se examinaron las actividades de al,6-FUT, la cual está involucrada en la fucosilación del núcleo de N-glucanos, al,2-FUT, la cual media el remate (colocación en el extremo) de residuos galactosa terminales, lo que genera los denominados epítopos de Lewis y, al,3-FUT, que genera estructuras de Lewis x. Para comparación, analizamos las actividades FUT correspondientes presentes en células CHO. Las actividades de los FUT indicados en los extractos de células de PER.GC111 y CHO se midieron utilizando un ensayo de actividad de glucosiltransferasa . Este ensayo mide la reacción catalizada por glucosiltransferasa entre sacárido (en este caso fucosa) y un sustrato azúcar. La actividad GalT también se mide como un control interno. Los valores representan valores medios para dos experimentos . Todos los valores, y en particular aquellos de PER.SC™ fueron 2-3 veces menores en el segundo experimento. De manera notable, las actividades se expresaron por mg de proteína (presente en el extracto celular) . Debido a que las células PER.60^ son significativamente más grandes que las células CHO, las diferencias entre las actividades de FU y GalT de células CHO y ER.ec"* pueden ser mayores o más pequeñas que lo que se muestra. En la tabla VIII se muestran los resultados de los ensayos de actividad de glucosiltransferasa y muestran que PER.GC"11, así como CHO, poseen actividad significativa a?,ß-FUT, lo que sugiere que ambas líneas de células pueden producir cadenas de glucano fucosiladas en el núcleo. No obstante, la actividad de al, 3-FUT fue significativa únicamente en células PER.6^ mientras que fue difícilmente detectable en células CHO. Ninguna de las dos líneas celulares mostró actividad al,2-FUT. Tomados juntos, estos datos muestran una diferencia entre el potencial de glucosilación de CHO y PER.6CMR, y explican porque PER.ec^-EPO contiene más fucosas que EPO producido por CHO (Eprex) . Ejemplo 6. Glucanos con epítopos de Lewis x actuales en PER.Ce^-EPO Debido a que PER.6CMR posee actividad de f cosiltransferasa «1,3 pero no al, 2, es muy probable que las cadenas de N-glucano producidas por PER.6CMR contengan epítopos Lewis x en vez de Lewis y. Se verifico esto al marcar PER.eC^-EPO con un anticuerpo monoclonal de ratón (IgM humana contra Lewis x, Calbiochem) que reconoce específicamente estructuras Lewis x, utilizando transferencia Western. Se corrieron cantidades iguales de PER.SC^-EPO (derivada del clon P7, indicado aguí como P7.100) y Eprex, sin tratar (-) o tratada con HC1 (+) , en un gel de SDS-poliacrilamida y se transfieren a una membrana de nitrocelulosa utilizando métodos conocidos por las personas expertas en la técnica. Se utilizó un anticuerpo monoclonal (IgM contra ratón, Calbiochem) y ECL (Amersham Pharmacia Biotech) para detectar el epítopo Lewis x. Como se puede ver en la figura 3, únicamente se puede marcar PER.eC^-EPO con el anticuerpo específico para el epítopo Lewis x. Se indica la ubicación del marcador de peso molecular (52, 35 y 29 kDa) . Debido a que el enlace al,3-fucosa es lábil con ácido, la señal se pierde después del tratamiento con HC1. Ejemplo 7. Expresión de estructuras Lewis x en la superficie celular de células PER-ce115 Para saber si las estructuras de Lewis x generalmente se presentan en células PER.SC"1, se marco la superficie de células CHO y ER.SC11 normales (es decir, no productoras de EPO) con anticuerpos específicos para Lewis x (Calbiochem) . Las células se incubaron con los anticuerpos primarios (anticuerpos monoclonales contra Lewis x (mAb a Lewis x) utilizados a 0.16 µg/ml y mAb sialil-Lewis x, utilizados a 5 g/ml) . Se utilizó anticuerpo contra IgM, conjugado con FITC, como un anticuerpo secundario. Las células marcadas se analizaron por FACS . La línea discontinua representa la señal de células incubadas únicamente con el anticuerpo secundario (control negativo) . Los resultados mostrados en la figura 4 muestran que las células PER.60^ están fuertemente marcadas con los anticuerpos, en contraste con las células CHO que no fueron capaces de producir estas estructuras. De manera notable, observamos repetidamente que las células PER.6(1^ muestran un patrón heterogéneo de teñido con los anticuerpos Lewis x. El marcado con un anticuerpo especifico para estructuras sialil Lewis x (Calbiochem) proporciona una señal positiva moderada únicamente cuando se utiliza una concentración muy alta del anticuerpo. Ejemplo 8. Inhibición de apoptosis por PE .CS^-EPO (tipo cerebral) in vitro, en células T2 y células hNT cultivadas bajo condiciones epóxicas Se compararon EPO producido por PER.C6MR (tipo cerebral) y EPO tipo sérico para determinar su actividad in vitro para proteger células neurales de la corteza de rata, ratón y humano protegiéndolas de su muerte celular bajo condiciones epóxicas y con supresión de glucosa. Para esto se prepararon cultivos de células neurales de embriones de rata como se describe por otros investigadores ( oretz et al. 1994; Nagayama et al. 1999; White et al . 1996) . Para evaluar los efectos de EPO de tipo cerebral producida por VER.C6m y EPO de tipo sérico se mantuvieron las células en cámaras incubadoras modulares en un incubador con chaqueta de agua hasta por 48 h a 37°C en un medio sin suero con glucosa 30 mM y se humidificó con aire 95%/C02 5% (ambiente normóxico) o con medios sin suero, sin glucosa y humidificado con N2 95%/C02 5% (medio hipóxico y carente de glucosa) en ausencia o presencia de EPO 30 pM de tipo cerebral producida por PER.Ce^, purificada o Eprex 30 pM. Los cultivos celulares se expusieron a hipoxia y carencia de glucosa durante menos de 24 horas y posteriormente se regresaron a las condiciones normóxicas por el resto de las 24 horas. Se analizó la citotoxicidad mediante la fluorescencia de azul Alamar, que indica la viabilidad de células como una función de la actividad metabólica. En otro método, los cultivos de células neurales se exponen durante 24 h a L-glutamato 1 mM o ácido a-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propiónico (AMPA, por sus siglas en inglés) bajo condiciones normóxicas, en ausencia o presencia de diversas concentraciones de EPO purificado, producido por PER.ce"11 o Eprex. Se analizó la citotoxicidad por la fluorescencia de azul de Alamar, que indica la viabilidad celular como una función de la actividad metabólica. Se espera que la viabilidad de células tratadas con PER.Ce^-EPO sea similar a la viabilidad de células tratadas con Eprex.

Ejemplo 9. Actividad de PER. C6 -EPO (tipo cerebral) en estimulación de eritropoyesis en ratas, en comparación con EPO de tipo sérico El potencial de EPO humano recombinante para estimular la producción de eritrocitos se puede monitorear en un modelo de roedor que ha sido descrito por Barbone et al. (1994) . De acuerdo con este modelo, se utiliza el incremento en la cuenta de reticulocitos como una medida de la actividad biológica de la preparación de EPO humana recombinante. Los reticulocitos son los precursores de los eritrocitos y su producción, en respuesta a EPO, se puede utilizar como una medida para el potencial de EPO para estimular la producción de eritrocitos. A su vez, una producción aumentada de eritrocitos incrementa el valor del hematocrito. Se compararon las actividades de PE .CS^-EPO y Eprex en seis grupos de tres ratas Wag/Rij . Se inyectaron por vía intravenosa diversas dosis de PER.CS^-E O (P7-EPO) , Eprex y amortiguador diluyente, como un control negativo, en la vena del pene, en el día 0, 1 y 2. Se administró PER.C6HR-EPO a una dosis de 5, 25 ó 125 Ue (unidades de ELISA) determinado por un equipo disponible comercialmente de EPO-específico de R&D ELISA, mientras que se administró Eprex a una dosis de 1 a 5 Ue . Todas las preparaciones de EPO se diluyen hasta la concentración apropiada en PBS/Tween 80 0.05% en un volumen total de 500 µ? . En el día tres, se toman muestras de 250 µ? de sangre con EDTA, por punción en la lengua. En el mismo día, se determina el porcentaje de reticulocitos en la población total de eritrocitos. Como se muestra en la figura 6 (las barras indican el porcentaje de reticulocitos presentes en la población total de eritrocitos) , la administración diaria de 1 Ue de Eprex en ratas, por un período total de tres días, provoca un incremento significativo en las cuentas de reticulocitos al cuarto día en comparación con las cuentas de reticulocitos en ratas que han recibido únicamente amortiguador diluyente. Las cuentas de reticulocitos fueron reforzadas adicionalmente al incrementar en cinco veces la dosis de Eprex. Las cuentas de reticulocitos se incrementan de manera menos clara utilizando cantidades equivalentes de PER.Ce^-EPO. Se observa un incremento similar en las cuentas de reticulocitos cuando se utiliza 1 Ue de Eprex y 25 Ue de PER.Ce^-EPO indicando que PER.CG^-EPO es por lo menos 25 veces menos activo en estimular la producción de eritrocitos, en comparación con Eprex. La diferencia entre el potencial de Eprex y PER.Ce" -EPO en estimular la producción de eritrocitos es incluso más pronunciada a una dosis más altas (es decir, 5 Ue de Eprex y 125 Ue de PER . ?d^-???) . Ejemplo 10. Efecto de PER.ce^-EPO en isquemia cerebral después de hemorragia subaracnoidea experimental . Para demostrar que PER.Ce^-EPO es más eficaz en la protección neuronal durante la isquemia cerebral en comparación con la EPO de tipo sérico, se compararon los efectos de la administración sistémica de EPO de tipo cerebral producida por PER.ce"11 y EPO de tipo sérica en un modelo en conejo de isquemia cerebral aguda inducida por hemorragia subaracnoidea. Por lo tanto, se dividieron a 32 animales en cuatro grupos (n = 8) que fueron los que se estudiaron. Grupo 1, hemorragia subaracnoidea; Grupo 2, hemorragia subaracnoidea más placebo; Grupo 3, hemorragia subaracnoidea más EPO de tipo sérico humano recombinante; y Grupo 4, hemorragia subaracnoidea más EPO producida por PER.C6MR, recombinante. La hemorragia subaracnoidea experimental se induce por una inyección percutánea de sangre autóloga dentro de la cisterna magna, después de anestesiar al animal. Después de la inyección se coloca a los conejos en posición ventral recumbente durante 15 min para permitir la formación de coágulos de sangre ventrales. A los animales de los grupos 2, 3 y 4 se les inyectó con amortiguador diluyente, Eprex y EPO de tipo cerebral producida por PER.C6m purificada, respectivamente a los 5 min después de la inducción de hemorragia subaracnoidea y se continúa durante 8, 16 y 24 h posteriormente. Todas las inyecciones se administraron por ¦vía intraperitoneal . El amortiguador diluyente consiste de 2.5 mg/ml de albúmina sérica, 5.84 mg/ml de cloruro de sodio, 0.057 mg/ml, H20 de ácido cítrico anhidro. Se sacrifica a los animales a las 24 h después de la hemorragia subaracnoidea y se extirpan los cerebros. Posteriormente los cerebros se cortan coronalmente a 10-25 µp? en un micrótomo de congelamiento, comenzando en la bregma y continuando posteriormente para incluir al cerebelo (Ireland and cLeod 1993) . Para visualizar y determinar el número de neuronas dañadas inducidas por isquemia los cortes se tiñen con hematoxilina y eosina. Se determina el número de perfiles neuronales o eosinofílicos que contienen núcleos pignóticos por campo microscópico de alta potencia (lOOx) en cinco cortes seleccionados aleatoriamente de la corteza lateral que se obtiene a varios niveles coronales posteriores al bregma. Los animales tratados con PER.C6MR-EPO se espera que presenten un número menor de neuronas dañadas en comparación con los animales que no son tratados o que son tratados con un placebo. Ejemplo 11. Expresión de receptor de eritropoyetina en cardiomiocitos neonatales de rata después de hipoxia/reoxigenacion Se realizan cultivos primarios de cardiomiocitos de rata neonatales de los ventrículos de ratas Sprague-Dawley de 1 día de edad, como se ha descrito previamente (Simpson and Savion 1982) . Se genera la hipoxia al incubar los cardiomiocitos en una cámara de Plexiglás hermética al aire con <1% de 02 y 5% de C02/95% de N2 a 37°C durante 2 h utilizando el equipo Gas Pak Plus (BBL) . Al sustituir el medio saturado con aire 95% y C02 5%, las células se exponen a atmósfera normotóxica (reoxigenación) . Los cardiomiocitos de lavan dos veces con PBS enfriado con hielo y se aisla el ARN total utilizando Trizol (GIBCO) , extraído por cloroformo y precipitado por alcohol isopropílico. Para la transferencia Northern, se preparan 15 ig de ARN total en un gel de formaldehído 1.5%/MOPS-agarosa, que se transfiere a nitrocelulosa y se hibridiza con una sonda marcada con 32P para el receptor de EPO (fragmento de ADNc de +400 pares de bases) . La hibridación se lleva a cabo durante la noche a 65°C en amortiguador fosfato, pH 7.2 y es seguida por 2 lavados en 2xSSC a temperatura ambiente, 2 lavados en 0.2xSSC/SDS 0.1% a 65°C y 2 lavados en 2xSSC a temperatura ambiente. Las señales de hibridación se visualizan al exponer la membrana a una película de rayos X (Kodak) . Los niveles de expresión se corrigen para los niveles de ARNm para GAPDH. Ejemplo 12. Efecto de PER.ec^-EPO de tipo cerebral y EPO de tipo sérico (Eprex) sobre la apoptosis en cardiomiocitos neonatal de rata, cultivados bajo condiciones hipóxicas Los cultivos primarios de cardiomiocitos de rata neonatales se preparan a partir de los ventrículos de ratas Sprague-Dawley de 1 día edad, como se ha descrito previamente (Simpson and Savion 1982) . Se genera hipoxia al incubar los cardiomiocitos en una cámara de Plexiglás hermética al aire con < 1% de 02 y 5% de C02/95% de N2 a 37°C durante 2 h utilizando Gas Pak Plus (BBL) . Al sustituir el medio saturado con aire 95% y C02 5%, las células se exponen a una atmósfera normotóxica (reoxigenación) . El experimento se divide en 4 grupos: A) cardiomiocitos cultivados bajo condiciones normóxicas (aire 95%/C02 5%) ; B) cardiomiocitos cultivados bajo condiciones de hipoxia/reoxigenación en presencia de EPO producido por PER.CS1^ purificado, 30 pM; C) cardiomiocitos cultivados bajo condiciones de hipoxia/reoxigenación en presencia de Eprex purificado 30 pM; y D) cardiomiocitos cultivados bajo condiciones de hipoxia/reoxigenación en presencia de EPO. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Se cuantifica la apoptosis por análisis morfológico, en formación de escalera de ADN y por formación de etiquetado de extremo de estrechamiento nick de dUTP mediada por desoxirribonucleótido transferasa terminal (TUNEL, por sus siglas en inglés) . Para el análisis morfológico se fijan monocapas de miocitos y se tiñen con colorante Hoechst 33324. Las características morfológicas de apoptosis (encogimiento de células, condensación de cromatina y fragmentación) se moriitorean por microscopía de fluorescencia. Se cuentan por lo menos 400 células de 12 campos seleccionados aleatoriamente por cubreobj etos . Para determinar la formación de escalera de ADN (característica de apoptosis) , los cardiomiocitos se lisan en amortiguador de lisis y se someten a electroforesis en gel de agarosa 2%. El gel se tiñe con bromuro de etidio y los fragmentos de ADN se visualizan bajo luz ultravioleta. La detección in situ de cardiomiocitos apoptóticos se realiza mediante la utilización de TUNEL en un equipo de detección de muerte celular in situ (Boehringer Mannheim) . Ejemplo 13. Efecto de PER.CS^-EPO y EPO sérico sobre el tamaño de infarto en un modelo en rata de isquemia/reperfusión de miocardio Se anestesia a ratas Sprague-Dawley macho adultas (300 a 400 g) con pentobarbital sódico (20 mg/kg, I.P.) y clorhidrato de ketamina (60 mg/kg, I.P.). Se canulan la vena yugular y la traquea y se mantiene la ventilación con oxígeno 100% mediante un ventilador para roedores ajustado para mantener el C02 exhalado entre 3.5% y 5%. Se realiza toracotomia isquemia y se coloca una sutura 3 a 4 mm desde el origen de la arteria coronaria izquierda. Cinco minutos antes de la isquemia se distribuye aleatoriamente a los animales que se les van a proporcionar diversas concentraciones de PER.ce"11-EPO, EPO tipo sérico o solución salina (n = 6 para cada grupo) .

Se inicia la isquemia (30 min) al apretar la sutura alrededor de la arteria coronaria y es seguido por 4 h de reperfusión. Se preparan de manera idéntica ratas operadas en falso, excepto que no se apriete la sutura (n = 6) . Después de la reperfusión, se determina el tamaño del infarto por tinción diferencial con violeta de azul patente (5%) y cloruro de trifeniltetrazolio (TTC, por sus siglas en inglés) . La ligadura coronaria se vuelve a apretar y se suministra una inyección intravenosa de violeta azul patente para teñir las regiones del corazón irrigadas normalmente. El corazón después se separa y se baña en solución salina enfriada con hielo antes de la separación de la aurícula, los vasos grandes y el ventrículo derecho. El ventrículo izquierdo se corta en secciones delgadas y se separa el área no teñida en riesgo (AAR, por sus siglas en inglés) de los cortes azul irrigados normalmente, se corta en piezas de 1-2 mm3 y se incuba con TTC. Con un microscopio de disección, se separan las áreas necróticas (MF, pálidas) de las áreas positivas a TTC (de color rojo ladrillo) . Todas las áreas del miocardio después se pesan individualmente y se calcula el tamaño del infarto. Ejemplo 14. Aislamiento y fraccionamiento de glucoformas de que contienen un contenido elevado de fucosa unida al , 3. Se utiliza la lectina de Aleuria auremtia (AAL, por sus siglas en inglés) específica para fucosa, para purificar de manera preferencial glucoformas de PER. C6 -EPO con un contenido elevado de Lewis x o de sialil-Lewis x. La EPO que se secreta al medio de cultivo por células PER.Ce"11 productoras de EPO primero se depura de los residuos celulares y otros contaminantes mediante cromatografía en columna de afinidad utilizando anticuerpos monoclonales específicos para EPO humana (véase ejemplo 2) . Posteriormente, aproximadamente 270 µg (o 27,000 Ue) o la EPO purificada se someten a un segundo procedimiento de cromatografía en el cual las moléculas de EPO se unen a una columna que contiene AAL inmovilizada a 1 ml/min (columna AAL Hitrap 1 mi, Bio Med Labs) . Las glucoformas de EPO que presentan fucosa se eluyen de la columna mediante la utilización de L-fucosa (Sigma) como un competidor para. unión a AAL. Se obtienen cuatro fracciones secundarias de EPO por aplicación de un gradiente en etapas en PBS (Gibco, que contiene NaCl 154 mM, KH2P04 1.05 mM y Na2HP04 3.0 mM, pH = 7.4), comenzando con fucosa 60 µ (fracción 1), seguido por fucosa 200 µ (fracción 2) , seguido por fucosa 400 µ? (fracción 3) y finalizando con fucosa 1000 µ? (fracción 4) . La primera etapa del gradiente dura 10 min y las otras etapas duran 5 min con una velocidad de flujo de 0.5 ml/min. La señal UV a 214 nm del cromatograma muestra que el material eluye de la columna en cada fracción (véase la figura 9) . Se recolectan porciones de 0.5 mi y dos o tres de las fracciones pico se acumulan (véase la figura 9) . El amortiguador de las fracciones se intercambia utilizando un equipo microcon de 10 kDa (Millipore) a fosfato 20 mM y las fracciones se concentran en el mismo equipo microcon a 20-30 µ?. Los glucanos N-unidos se liberan de los acumulados de EPO por tratamiento con N-glucanasa F y se desialilan por tratamiento con neuraminidasa. Los espectros representativos de MALDI-TOF EM de las diversas muestras de EPO se muestran en la figura 10A. También se presenta la abundancia relativa de los diferentes oligosac ridos en cada acumulado (véase tabla IX) . Los datos demuestran que las fracciones que eluyen posteriormente de la columna AAL contienen relativamente más residuos de fucosa. Por ejemplo, las fracciones que eluyen posteriormente de la columna se enriquecen en glucanos que dan lugar a picos a 2507.9 y 2978.1 unidades dalton, las cuales contienen tres o cuatro residuos fucosa, mientras que los glucanos con una masa de 1891.7 y 2215.8, las cuales únicamente contienen 1 residuo fucosa, están relativamente subrepresentadas en estas fracciones. Por lo tanto, estas fracciones se enriquecen con N-glucanos que tienen las denominadas estructuras de Lewis X. El número promedio de molécula EPO de estructuras de Lewis X en los glucanos unidos a N que se liberan utilizando PNGasaF y que se detectan con MALDI-TOF EM es, para este experimento: 2.2 para la fracción 1, 2.7 para la fracción 2, 3.6 para la fracción 3, 4.1 para la fracción 4. El material inicial contiene 2.6 estructuras de Lewis X por molécula de EPO . En un experimento independiente con el clon C25, se obtiene una fracción 4 (espectro en la figura 10B) que está incluso más enriquecido para estructuras de Lewis X, que tiene 5.7 estructuras de Lewis X sobre los glucanos unidos a N por molécula de EPO. Este método permite a uno purificar la eritropoyetina del medio de cultivo mediante la utilización de las características específicas de las modificaciones postraduccionales, tales como las estructuras de Lewis x que se llevan a cabo por las células en las cuales se produce la proteína. No obstante, esto no implica que no se puedan utilizar otros métodos para una purificación adecuada de la proteína con las modificaciones postraduccionales (predeterminadas) . El material que eluye en la fracción 4 representa una forma novedosa de EPO; contiene predominantemente glucanos unidos a N con una masa de -2185 kDa, que a su vez corresponde con un azúcar N-unido biantenario complejo con estructuras de GalNAc-Lewis x en ambas antenas. La fracción 4 contiene aproximadamente 8% de la EPO total que ha sido eluida en las fracciones 1 a . Esto índica que la forma novedosa de EPO con estructuras de GalNAc-Lewis x predominantemente biantenaria representa una forma abundante baj de EPO, la cual se puede enriquecer utilizando el método que se describe en lo anterior. Ejemplo 15. Aislamiento y fraccionamie to de glucoformas de PER-Ce^-EPO con un contenido alto de LacdiNAc Las glucoformas de PER.CS^-EPO que presentan las denominadas estructuras de oligosacárido LacdiNAc se aislan específicamente por el uso de anticuerpos monoclonales contra estas estructuras de lacdiNAc . Los anticuerpos monoclonales de ratón tales como 99-2A5-B, 100-2H5-A, 114-2H12-C, 259-2A1 y 273-3F2 (Van Remoortere et al. 2000) reconocen específicamente estructuras de lacdiNAc y también se purifican y acoplan a esferas de Sheparose 4B activadas con bromuro de cianógeno, de acuerdo con procedimientos conocidos habitualmente por una persona experta en la técnica. La PER.C6MR-EP0 que es secretada dentro del medio de cultivo por células PER.C6MR productoras de EPO humanas primero se separa de manera aproximada de los residuos celulares y otros contaminantes mediante cromatografía en columna de afinidad utilizando anticuerpos monoclonales específicos para EPO humana. Posteriormente, la EPO purificada se somete a un segundo procedimiento de cromatografía en el cual las moléculas de EPO que presentan estructuras lacdiNAc se unen a una columna que contiene los anticuerpos monoclonales específicos para lacdiNAc inmovilizados. Las glucoformas de EPO que carecen de estructuras lacdiNAc no se unen a la columna y se recolectan en el flujo pasante. Las glucoformas de EPO que presentan las estructuras de lacdiNAc se eluyen de la columna a un pH bajo o por utilización de GalNAc o de oligosacáridos lacdiNAc sintéticos como competidor para la unión de los anticuerpos específicos para lacdiNAc. Las glucoformas de EPO que presentan un porcentaje relativamente elevado de estructuras lacdiNAc se eluyen por separado de la columna al aumentar la concentración de GalNAc o lacdiNAc paulatinamente o de manera gradual, durante la elución. Las glucoformas de EPO con un porcentaje relativamente elevado de estructuras lacdiNAc se eluyen a una concentración superior de GalNAc o lacdiNAc en comparación con las glucoformas de EPO que se procesan en un porcentaje relativamente bajo de estructuras lacdiNAc. De acuerdo con el método descrito antes, también este método permite purificar eritropoyetina del medio de cultivo mediante la utilización de características específicas de las modificaciones postraduccionales, tales como las estructuras de Lewis x y lacdiNAc que se llevan a cabo por las células en las cuales se produce la proteína . Ejemplo 16. Aislamiento y fraccionamiento de glucoformas de PER.CS^-EPO con un contenido elevado de GalNAc-Lewis x Las glucoformas de PER.C6MR-EP0 que presentan las estructuras de oligosacáridos denominadas GalNAc-Lewis x se aislan específicamente mediante el uso de anticuerpos monoclonales contra estas estructuras GalNAc-Lewis x. Los anticuerpos monoclonales de ratón tales como 114-5B1-A, 176-3A7, 290-2D9-A y 290-4A8 (Van Remoortere et al. 2000) reconocen específicamente estructuras GalNAc-Lewis x y se purifican y acoplan a esferas de Sepharose 4B activadas con bromuro de cianógeno, de acuerdo con los procedimientos conocidos habitualmente por las personas expertas en la técnica. La PER.Ce^-EPO que se secreta en el medio de cultivo de células PER.C6m productoras de EPO humano primero se separan de manera general de los residuos celulares y otros contaminantes mediante cromatografía en columna de afinidad utilizando anticuerpos monoclonales específicos para EPO humano. Posteriormente, la EPO purificada se somete a un segundo procedimiento de cromatografía en el cual las moléculas de EPO que presentan estructuras GalNAc-Lewis x se unen a una columna que contiene anticuerpos monoclonales inmovilizados, específicos para GalNAc-Lewis x. Las glucoformas de EPO que carecen de las estructuras GalNAc-Lewis x no se unen a los anticuerpos unidos a la columna y se recolectan en el flujo que pasan. Las glucoformas de EPO unidas que presentan las estructuras GalNAc-Lewis x se eluyen de la columna a pH bajo o mediante la utilización de GalNAc-Lewis x sintético como un competidor para la unión de los anticuerpos específicos para GalNAc-Lewis x. Las glucoformas de EPO que presentan un contenido elevado de GalNAc-Lewis x se pueden eluir por separado de la columna al aumentar la - 39 - concentración de competidor de GalNAc-Lewis x de manera paulatina o gradual durante la elución. Las glucoformas de EPO con un contenido elevado de GalNAc-Lewis x se eluyen a una concentración mayor de GalNAc-Lewis x en comparación con las glucoformas de EPO que procesan un contenido bajo de GalNAc-Lewis x. Nuevamente, de acuerdo con los métodos descritos en lo anterior, -este método también, permite purificar EPO del medio de cultivo utilizando las características específicas de las modificaciones postraduccionales tales como Lewis x, lacdiNAc o estructuras GalNAc-Lewis x que se lleva a cabo por las células en las cuales se elabora la proteína. No obstante, esto no implica que no se pueden utilizar otras modificaciones con las modificaciones postraduccionales (predeterminadas) para una purificación adecuada de la proteína. Se comprenderá por aquellos expertos en la técnica que aunque la invención se ha ilustrado con ejemplos detallados relacionados con EPO, la presente invención no se limita a la producción o purificación de EPO con características de tipo cerebral. Muchos otros péptidos y proteínas terapéuticos o de diagnóstico, los cuales pueden encontrar uso en el tratamiento de desórdenes del cerebro y otras partes del sistema nervioso central o periférico u otros tejidos dañados isquémicos/por reperfusión se pueden elaborar por los medios y métodos de la presente invención.

Ejemplo 17. EPO con un contenido bajo de ácido siálico tiene una potencia similar a EPO con un contenido alto de ácido siálico para reducir el tamaño de infarto después de oclusión de la arteria cerebral media en ratas Se estudió el efecto de PER.C6MR-EP0 y Eprex en el tamaño de un infarto cerebral, el cual induce experimentalmente por la oclusión de la arteria cerebral media (MCA, por sus siglas en inglés) en ratas macho F344/lco con un peso de 200-250 g, utilizando un método similar al método publicado por Sirén et al., 2001. La arteria carótida de los animales se ocluye permanentemente mientras que se ocluye de manera reversible MCA durante 60 min utilizando un broche metálico. Se aplica PER.C6MR-EPO purificada con un contenido promedio de ácido siálico de < 6 unidades de ácido siálico por molécula o Eprex (Jansen-Cilag; EPO disponible comercialmente) con un contenido promedio de ácido siálico > 9 unidades de ácido siálico por molécula) por vía intravenosa, 5 min antes del inicio de la oclusión de MCA a una dosis de 5000 Ue (unidades de ELISA) por kg de peso corporal. De manera notable, el contenido de ácido siálico de la preparación PER.C6MR-EP0 varía en 0-9 ácidos siálicos por molécula mientras que Eprex contiene más de 8 ácidos siálicos por molécula. Después de un período de 60 min, la oclusión finaliza por la separación del broche metálico que circunda a la MCA. Se observa microscópicamente la reperfusión después de la separación del broche . Veinticuatro horas después se examinan los cerebros de las ratas vivas utilizando MRI para mostrar el coeficiente de difusión aparente (ADC, por sus siglas en inglés) y los mapas T2. Estos mapas se utilizan para cuantificar los volúmenes de infarto (figuras 7A y 7B) . Los resultados en las figuras 7A y 7B muestran que las ratas tratadas con PER.Ce^-EPO y preparaciones de Eprex muestran una reducción similar en el tamaño de infarto en comparación con los animales no tratados . Dado que la preparación de PER.CS^-EPO tiene un contenido de ácido siálico mucho menor en comparación con la preparación de Eprex, este resultado demuestra que un contenido elevado de ácido siálico no es esencial para la actividad neuroprotectora de EPO in vivo. Ejemplo 18. Determinación de la vida media de EPO en ratas Para determinar la vida media de Eprex in vivo, se ha inyectado a ratas macho Wag/Rij por vía intravenosa con 150 Ue de Eprex diluido en PBS/Twen-80 0.05% hasta un volumen final de 500 µ? . Justo antes de la administración del sustrato se extrae una muestra de 200 µ? de sangre, tratada con EDTA, como un control negativo utilizando la técnica descrita en la Lab. Animáis 34, 372, En t=5, 15, 30, 60, 120, 180, 240, 300, 360, 420, 480 y 540 min después de la inyección, se extraen 200 µ? de sangre tratada con EDTA de los animales utilizando la misma técnica. Después del último muestreo de sangre, se sacrifica a los animales. La muestra se centrifuga a 760 x g durante 15 min a temperatura ambiente dentro de los siguientes 30 min de recolección. Las muestras de plasma se prueban en una prueba ELISA específica para EPO (R&D) para determinar la concentración de EPO en cada muestra . Como se muestra en la figura 8, la disminución en la concentración de Eprex en el plasma muestra una curva bifásica que representa una fase de distribución y una fase de depuración. En base en estos resultados, se puede calcular que Eprex tiene una vida media de aproximadamente 180 min durante la fase de depuración. Se mide la vida media de PER.ce^-EPO utilizando el mismo protocolo. Ejemplo 19. Efecto de la expresión de ElA sobre la glucosilación de EPO en células HT1080 Se transfectan de manera estable células HT1080 con vectores de expresión que codifican los genes para adenovirus tipo 5 ElA (plg.ElA.neo) o ElA + E1B (plg . ElA . E1B ; ambos plásmidos descritos en la patente de E.U.A. 5,994,128) para determinar la expresión de los genes de adenovirus tipo 5 ElA o E1A+E1B en la glucosilación. Para seguir la glucosilación de una proteína marcadora, las células se cotransfectan con un vector de expresión que codifica para EPO (pEPO200l/neo) . Se transfectan células control HT1080 únicamente con el vector de expresión de EPO.

La transfección se lleva a cabo con lipofectaraina (Gibco) cuando las células alcanzan 70-90% de confluencia utilizando 1.0 µg de pElA.neo o pElA.ElB y 1.0 µg de pEPO2001.neo por caja de 7.85 cm2. El medio se sustituye los días 2, 3, 7, 10 y 13 con medio de selección que contiene DMEM, NEAA 1% (sin aminoácidos esenciales, Invitrogen) , 250 µ?/g de geneticina (Gibco) y FBS, 10%. Los experimentos preliminares con células HT1080 transfectadas con ElA estable muestran que la expresión de ElA provoca una morfología alterada en las células. De acuerdo con las observaciones descritas por Frisch et al. (1991), observamos que una expresión estable del gen ElA induce una morfología plana. Con este conocimiento, se hizo una selección general de clones que expresen ElA al tomar clones planos . Los clones se toman el día 14 y se cultivan en placas de 24 pozos con medio de selección a 37°C/C02 10%. Las células productoras de EPO se seleccionan con base en la presencia de EPO en el medio cuando las células han alcanzado subconfluencia . Se mide la concentración de EPO utilizando una prueba de ELISA específica para EPO (Quantikine™1 IVD human EPO-ELISA, R & D systems) . Los cultivos productores de EPO se incrementan y analizan para determinar la expresión de ElA. Por lo tanto, las células se lisan en amortiguador de lisis (NP40 1%, ácido desoxicólico 0.5%, SDS 0.5%, NaCl 150 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 7.5) suplementado con una tableta de inhibidores de proteínasa Complete ini (Roche Disgnostics) por 10 mi. Los lisados se depuran por centrifugación durante 10 min a 14,000 g. Se someten a electroforesis cantidades iguales (basadas en el contenido de proteína) de los lisados de células depuradas, bajo condiciones reductoras a través de un gel BisTris 10% (NuPAGE, Invitrogen) . Las proteínas después se transfieren a una membrana PDVF (P-Immobilon) utilizando el sistema Trans-Blot de NuPAGE (Invitrogen) . Los puntos se bloquean durante 1 h o bien o/n a temperatura ambiente con Protifar (Nutricia) 5% en TBST, seguido por una incubación con IgG2 de ratón contra ElA humana, monoclonal (clon M73, Santa Cruz) diluido 1:400 en Protifar 5%/TBST durante 1 h a temperatura ambiente o bien o/n a 4°C. Las manchas se lavan con TBST y se incuban con anticuerpo de chivo contra IgG de ratón conjugado con peroxidasa (Biorad) diluido 1:1000 en Protifar 5%/TBST, durante 45 min a temperatura ambiente . Después de lavar con TBST, las manchas se tiñen utilizando el sistema ECL plus (Amersham Pharmacia Biotech) . Una cantidad de 55% de los clones ElA positivos a EPO y 68% de los clones E1A.E1B positivos para EPO muestran una expresión clara de ElA (tabla X) . Los clones HT1080/E1A-EPO y HT1080/E1A.E1B-EPO que expresaron ElA un nivel elevado muestran una morfología plana (por ejemplo véase la figura 11) . Se produce EPO por los clones HT1080/EPO, HT1080/E1A.E1B-EPO y HT1080/E1A.E1B-EPO para análisis de glucano. Por lo tanto, el clon HT1080/E1A. EPO 008, el clon HT1080/E1A.E1B.EPO 072 y el clon HT1080/EPO 033 (tabla X) se siembran en matraces de 175 cm2 con el número de pasajes (pn, por sus siglas en inglés) 7. Después de 24 h, cuando las células alcanzan 60-80% de confluencia se sustituye el medio de selección por medio de producción (D EM, NEAA 1%) . Este medio se cosecha después de 3 días y las células se lisan con amortiguador de lisis. Se purifica EPO del medio, de acuerdo con el ejemplo 2. Los glucanos N-unidos de las diversas preparaciones de EPO se liberan por tratamiento con N-glucanasa F y se analizan posteriormente mediante cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución con detección amperométrica de pulsada (HPAEC-PAD, por sus siglas en inglés; Dionex) . En este sistema de cromatografía particular, las cadenas de glucano derivadas de EPO se separan bajo condiciones alcalinas en base en su carga. Como se demuestra en la figura 12, los glucanos de EPO producidos por las células HT1080/E1A-EPO están menos cargadas que aquellas de EPO producidas por las células HT1080/EPO control, lo que indica que la EPO producida por estas últimas células se encuentra sialilada más extensamente en comparación con la EPO producida por células que expresan E1A. Se obtiene una información más detallada respecto a la estructura de los N-glucanos por el análisis MALDI-EM de las cadenas de azúcar de las preparaciones de EPO. Los glucanos unidos a N se liberan de las preparaciones de EPO por tratamiento con N-glucanasa F y se desialilan por tratamiento con neuraminidasa. En la figura 13 se muestran los espectros de masas de diversas preparaciones de EPO representativas. Se utilizan los elementos de programación (software) GlycoMod (www.expasy-ch/tools/glycomod) para predecir la composición de azúcar en base en la masa observada (tabla XI) . Los datos muestran que el espectro de masa de los glucanos de EPO producido por las células HT1080/EPO control difiere de la EPO producida por las células HT1080/E1A-EPO y HT1080/E1A.E1B-EPO. Los espectros de masa muestran que la EPO producida por estas últimas células poseen relativamente menos hexosas y relativamente más desoxihexosas en comparación con la EPO producida por las células control. Además, las estructuras de glucano con una masa relativamente baja que contienen una cantidad relativamente alta de hexosaminas y desoxihexosas se encuentran en EPO producidas por células HT1080/E1A-EPO y HT1080/E1A.E1B-EPO. Algunas de estas están ausentes en la EPO producida por las células control. Los perfiles de masa de los glucanos de EPO producidas por células HT1080 que expresan ElA o E1A+E1B son similares a los de los glucanos de EPO producidos en células PER.06™* (véase ejemplo 3) lo que sugiere que los glucanos de EPO producidos en las primeras células contienen estructuras Lewis x y LacdiNAc, y estructuras que carecen de galactosas terminales . Para confirmar que EPO producida por células HT1080 que expresan E1A y E1A+E1B contienen más fucosas y GalNAc en comparación con EPO producida por células HT1080 control se realiza un análisis de monosacáridos . Por lo tanto, se liberan los glucanos unidos a N de las preparaciones de EPO por tratamiento con N-glucanasa F y neuraminidasa, y posteriormente se hidrolizan y analizan por HPAEC-PAD. La figura 14 muestra los perfiles de monosacáridos de los glucanos EPO, normalizados para la cantidad de mañosa. Los datos muestran que los glucanos unidos a N de EPO producidos por las células que expresan E1A y E1A + E1B en realidad poseen cantidades relativamente elevadas de fucosa y GalNAc. Los espectros de masa y los datos de monosacáridos sugieren fuertemente que la EPO producida por células que expresan E1A y E1A + E1B contienen residuos de fucosa múltiples. Para fundamentar estos datos, las preparaciones de EPO se tratan con una -fucosidasa (harina de almendra) que separa los residuos o fucosa al-3 y al-4 terminales. Posteriormente se analizan las muestras por la prueba MALDI-EM y los resultados se comparan con los resultados que se obtienen a partir de las preparaciones de EPO que no se someten al tratamiento con a-fucosidasa. La figura 15 muestra que, después del tratamiento con a-fucosidasa los picos que están presentes en N-glucanos con fucosas antenarias disminuyen y los picos que se derivan de estas estructuras aumentan. Por ejemplo, los picos con valores m/z de ~ 2038 y ~ 2184 disminuyen, mientras que el pico - 1892 aumenta. De manera general, estos datos muestran que la expresión de adenovirus ElA solo o junto con ElB puede cambiar el perfil de glucosilación de las células . La observación de que la expresión de ElA sola es suficiente para este cambio indica que ElA es responsable de dicho cambio. Los cambios en glucosilación típicamente incluyen la formación de estructuras Lewis x, LacdiNAc y GalNAc-Lewis x. Se han caracterizado muchas células HT1080 que expresan ElA y ElA + ElB y la mayor parte de estas células producen glucanos que poseen estas estructuras de glucano características. Además, varía la abundancia de estas estructuras, en comparación con las estructuras de glucano que son producidas por las células originales HT1080 (datos no mostrados) . La abundancia de las estructuras de glucano se relaciona en gran medida en el nivel de expresión de ElA. Esto indica que el grado con el cual se altera el perfil de glucosilación por ElA depende en gran medida del nivel en el cual se expresa el gen ElA. Ejemplo 20. Comparación de la actividad hematopoyética de ???.?d^-??? y CHO-EPO a dosis elevadas Se determinó la actividad hematopoyética de PER.CS^-EPO en ratas, y se comparó con la actividad de EPO derivada de células de ovario de hámster chino (CHO-EPO) . Se seleccionaron dos preparaciones de CHO-EPO: (1) Eprex (Jansen Cilag) , la cual es una CHO-EPO recombinante disponible comercialmente con un contenido alto de ácido siálico, y (2) frCHO-EPO, una preparación de CHO-EPO con un contenido menor de ácido siálico (similar al de PER . ?d^-???) (véase la figura 16) , la cual se obtiene al producir EPO por células CHO y purificación subsecuente de estas isoformas poco sialiladas mediante métodos cromatográficos , como se describe en los ejemplos 2 y 3 y en el documento EP 0428267. El estudio se realizó con cuatro grupos de seis ratas WAG/Rij . Se inyectó por vía intravenosa, la vena del pene, una dosis única de 5000 Ue (unidades de ELISA, determinadas por el equipo de ELISA EPO-especifica R&D disponible comercialmente) por kg de peso corporal de Eprex, frCHO-EPO, PERC6-EPO o amortiguador diluyente (como control) . Todas las preparaciones de EPO se diluyeron a la concentración apropiada en amortiguador diluyente (PBS, Tween-80 0.03%, Glicina 0.5%) en un volumen total de 500 µ?. Después de cuatro días se tomaron muestras de sangre de 250 µ? tratada con EDTA, por punción en la lengua. Al mismo día se analizaron las muestras de sangre para determinar el hematocrito y el porcentaje de reticulocitos en la población total de eritrocitos utilizando un hematocitómetro automático . Se determinaron los niveles de hematocrito y se expresan como porcentaje en volumen de eritrocitos empacados, que se obtienen al centrifugar la sangre (figura 17) . Los resultados demuestran que ???.?d^-??? y fr-CHO-EPO no inducen ematocrito, mientras Eprex si. Como se muestra en la figura 18, EPO induce un incremento significativo en las cuentas de reticulocitos en comparación con ratas que reciben únicamente amortiguador diluyente. Eprex y frCHO-EPO muestran una estimulación similar; esta estimulación es significativamente mayor (p<0.001) en comparación con los animales tratados con PER. C6-EPO. La evaluación del contenido de ARN en los reticulocitos nos permite determinar su grado de madurez. En la figura 19 se muestra la fracción de reticulocitos inmaduros (IRF, por sus siglas en inglés) . Las ratas tratadas con Eprex muestran porcentajes significativamente mayores de reticulocitos inmaduros en comparación con las ratas control. Esto indica que la formación de reticulocitos estimulada por Eprex aún se lleva a cabo después de cuatro días de inyección. Este efecto es menos pronunciado o está ausente en las ratas tratadas con frCHO-EPO o con PER. ?ß^-???, respectivamente (figura 19) . De manera general, los datos muestran que la totalidad de las tres preparaciones de EPO inducen la formación de reticulocitos; no obstante, la duración del efecto es más prolongada para Eprex y la duración más corta es para PE .CG^-EPO mientras que frCHO-EPO muestra un efecto intermedio. Esto sugiere que el bajo efecto ematopoyético de PER. C6 -EPO no solo se debe a su bajo contenido de ácido siálico sino también a otros rasgos de glucano . Ejemplo 21. Análisis detallado de estructura de los N-glucanos de PER.ce^-EPO Las señales de masa, que se obtienen por espectrometría de masas, no siempre se pueden asignar inequívocamente a cierta estructura de azúcar, debido al hecho de que pueden existir varias estructuras isométricas . Para obtener información adicional respecto a la estructura de los glucanos unidos a N de PER. C6MR-EPO, se ha utilizado tratamientos con endoglucosidasa y hexoglucosidasa de PER. C6m-EPO. En primer lugar se utilizó la endoglucosidasa F2. Esta enzima separa entre los residuos GlcNAc del núcleo trimanosilo de alta mañosa o los complejos biantenarios del tipo de glucanos unidos a N (figura 20) . En contraste con la PNGasa F, la endoglucosidasa F2 no separa los glucanos triantenarios o tetraantenarios y de esta manera se puede utilizar para diferenciar entre estructuras de glucano biantenarias y triantenarias/tetraantenarias. En la figura 21 se presentan los espectros MALDI de PER.C6MR-EP0 tratados ya sea con PNGasa F o con endoproteinasa F2. Cuando se comparan estos espectros, debe considerarse que los glucanos liberados por endoglucosidasa F2 son más pequeños que los glucanos liberados por PNGasa F. Esta es una diferencia de un residuo GlcNAc y fucosa (349 Da) y se debe a los diferentes sitios de separación de las enzimas (véase figura 20) . Todas las estructuras que se observan en un digerido de PNGasa F en m/z > 2185 son estructuras triantenarias o tetraantenarias , dado que ninguno de estos glucanos se observa en el digerido de endoglucosidasa F2. La mayor parte de las estructuras con las masas más bajas, es decir, m/z 1485, 1648, 1689, 1835, 1851, 1997, 2038 y 2185 tienen un pico correspondiente en el digerido de endoglucosidasa F2 y son biantenarias . Es posible que también estén presentes algunas estructuras triantenarias o tetraantenarias, pero esto no es mucho dado que las proporciones de pico en ambas espectros en la figura 21 son comparables en lo general . El espectro del digerido con endoglucosidasa F2 carece de los picos correspondientes a m/z 1892 y 2054 en el espectro de PNGasa F. Esto demuestra que estos picos representan glucanos que no son biantenarios, sino tetraantenarios, sin o con un residuo galactosa, respectivamente. Estos datos confirman que ???.?d^-??? contiene glucanos con GlcNAc terminal. A continuación se utilizaron hexoglucosidasas para investigar adicionalmente las estructuras de N-glucano. Los glucanos se liberaron de PER.C6MR-EPO por PNGasa F y se desialilaron utilizando neuraminidasa . Posteriormente las muestras se trataron con combinaciones diferentes de las siguientes exoglucosidasas : 1) ß-galactosidasa, la cual separa la parte no reductora, terminal Gaip-4GlcNAc (y Ga^l-4GalNAc en proporciones de enzimas superiores de enlaces Gaipi-3) . 2) a-fucosidasa renal bovina, la cual separa fucosas unidas al-2, 3, 4 y 6 de glucanos N y 0. Separa la fucosa unida l-6 en el núcleo trimanosilo de los glucanos unidos a N más eficazmente que otros enlaces de a-fucosa. 3) a-fucosidasa de harina de almendra, la cual separa los residuos de fucosidasa al-3 o al-4 terminales no reductores . 4) ß-?-acetilglucosaminidasa (GlcNAc-asa) , la cual separa N-acetilglucosamina unida ß1-2, 3, 4 y 6 terminal, no reductora, de carbohidratos complejos. No separa residuos N-acetilgalactosamina. En la figura 22 se muestran los tipos de enlace que se espera en los glucanos PER. Ce^-EPO. Las incubaciones de galactosidasa y fucosidasa se llevaron a cabo simultáneamente, es decir, durante la incubación de fucosidasa aún estaba presente galactosidasa activa. Además, los tratamientos con GlcNAc-asa se realizaron cuando la galactosidasa y fucosidasa habían perdido su actividad. En la figura 23 se presentan los resultados para el tratamiento con galactosidasa. En esta figura los valores m/z y las intensidades relativas se proporcionan para todos los picos en el espectro, los cuales tienen una intensidad relativa (es decir, la altura del pico dividida entre las alturas sumadas de todos los picos) de 5% o superiores. También se indican las estructuras de glucano propuestas . Los picos que fueron asignados a las estructuras galactosiladas han sido desplazadas después del tratamiento con galactosidasa, aunque no siempre de manera completa. Se ha encontrado que la galactosidasa no libera galactosa cuando está presente una fucosa en el residuo GlcNAc adyacente. Algunos glucanos triantenarios parecen presentarse después del tratamiento con galactosidasa (m/z 1689) . Esto es causado por GlcNAc-asa contaminante, la cual se demuestra que está presente en la preparación de galactosidasa utilizando glucanos estándar (datos no mostrados) . Los glucanos tratados con galactosidasa después se someten a tratamiento con fucosidasa (figura 24 y 26) . En el caso de fucosidasa renal bovina, esto resulta en un desplazamiento de 146 Da de todos los picos en el espectro. ¦ Esta es la masa de un residuo fucosa. Dado que esta fucosidasa separa preferiblemente residuos fucosa unidos al- 6, y puesto que todos los picos pierden únicamente una unidad de 146 Da, esto indica que todos los glucanos contienen un núcleo de fucosa. El acumulado de glucano tratado con galactosidasa que fue incubado posteriormente con fucosidasa de harina de almendra proporciona un espectro relativamente sencillo (figura 25 y 26) . Todos los residuos fucosa fueron separados de las antenas, dejando solo glucanos fucosilados solos (núcleo) . Los residuos galactosa terminales remanentes también fueron separados debido a que la galactosidasa aún estaba activa durante la incubación con fucosidasa. Después del tratamiento con GlcNAc-asa de los glucanos desfucosilados quedaron únicamente cuatro picos . El pico principal se observa en m/z 1079 y representa el núcleo triomanosilo fucosilado. Los picos en m/z 1485 y m/z 1891 confirman la presencia de residuos GalNAc en la antena, dado que este residuo no se separa por la GlcNAc-asa. El pico en m/z 1444 demuestra la presencia de secuencias repetidas de lactosamina : la galactosa debe haber sido cubierta por GlcNAc durante el tratamiento con galactosidasa. 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Etiqueta epitelio normal y neoplásico S100 Proteínas de unión de Ca¿+ de tipo de banda EF. Que se expresan en tejidos neurales y otros tejidos Vimentina Filamentos intermedios citoesqueléticos (= proteína estructural). Es un marcador general de células que se originan en el mesenquima. Se expresa durante el desarrollo de músculo esquelético Desmina Filamentos intermedios citoesqueléticos (= proteina estructural). Se expresa durante el desarrollo de músculo esquelético Actina s.m. Actina de célula de músculo liso. Tiñe células de músculo liso y células mioepiteliales. Sinaptofisina Reacciona con células neuroendocrinas. Cromogranina Glucoproteínas ácídas que se expresan ampliamente dentro de gránulos secretores de tejido endocrino, neuroendocrino y neural. NSE Enolasa específica de neurona. Marca células de origen neural y neuroendocrino Neurofilamento Reacciona con proteína de neurofilamento fosforilada y marca procedimientos neurales y nervios periféricos así como células de ganglios simpáticos y médula suprarrenal GFAP (policon) Proteína ácida fibrilar de neurogía. GFAP se encuentra específicamente en astroglía, la cual es muy sensible a ataques neurológicos. La astrogliosis se encuentra como resultado de traumatismos mecánicos, demencia por SIDA e infección por priones y se acompaña por un incremento en la expresión de GFAP. Es un marcador inmunohistoquímico para localizar astrocitos benignos y células neoplásicas de origen de neuroglía en el sistema nervioso central. CD31 Reacciona con PECAM-1. Presente en plaquetas, monocitos, granulocítos, linfocitos y células endoteliales. CD34 Reconoce glucoproteína transmembranal O-glucosilada. Se expresa en eritroblastos hemopoyéticos, EC vascular, fibroblastos embriónicos, algunas células en tejido nervioso adulto fetal. N-CAM Moléculas de adhesión de células neuronales. N-CAM está involucrado en las interacciones célula-célula durante el crecimiento.

Tabla II Tabla III Proteína Proveedor Anticuerpo Número de Dilución de marcadora catálogo anticuerpo Panqueratina Biogenex lgG1 de ratón MU071-UC 1:200 EMA Dako lgG2a de ratón M0613 1:50 S100 Dako Conejo Z0311 1:3000 Vimentina Biogenex lgG1 de ratón MU074-UC 1:3200 Desmina Sanbio IgG de ratón MON 3001 1:50 actina s.m. Biogenex lgGg2a de ratón MU128-UC 1:150 Sinaptofisina Dako lgG1 de ratón M0776 1:50 Cromogranina Biogenex lgG1 de ratón MU126-UC 1:150 NSE Dako lgG1 de ratón M0873 1:250 Neurofilamento Sanbio IgG de ratón MON3004 1 :300 GFAP (policon) Dako lgG1 de ratón M0761 1 :200 CD31 Dako lgG1 de ratón M0823 1:60 CD34 Biogenex lgG1 de ratón MU236-UC 1 :20 N-CAM (CD56) Neomarkers lgG1 de ratón MS.204.P 1:10 Tabla IV Tabla V Clon y Proporción molar de monosacáridos neutros normalizados a tres condiciones residuos mañosa de cultivo Man Fue GalNAc GIcNAc Gal P8 - DMEM 3 0.5 (0.9) 0.4 (0.4) 2.2 (2.7) 1.7 (1.3) P8 - JRH 3 1.5 (1.4) 0.7 (0.8) 6.1 (6.4) 3.5 (3.9) P7 - DMEM 3 1.5 (1.4) 0.4 (0.3) 5.5 (6.1) 2.3 (3.3) P7 - JRH 3 1.8 (1.7) 0.4 (0.4) 6.1 (6.8) 3.6 (4.2) C25 - DMEM 3 2.0 1.0 6.0 2.2 Eprex 3 0.7 - 5.4 4.1 Tabla VI P7 Porcentaje de total Proporción de Masa (m/z) Acumulado A Acumulado B Acumulado C Hex:HexNAc:dHex 1809.64 2.34 2.99 2.44 5:4:1 1850.67 2.57 5.31 2.49 4:5:1 1891.69 5.06 10.39 1.31 3:6:1 1955.70 - 1.95 2.16 5:4:2 1996.72 6.37 7.96 6.38 4:5:2 2037.75 6.33 5.16 5.39 3:6:2 2053.74 3.70 4.11 1.98 5:5:1 2142.78 2.19 3.68 2.45 4:5:3 2174.77 6.63 3.63 8.04 6:5:1 2183.81 6.69 5.02 7.57 3:6:3 2199.80 3.78 4.65 1.58 4:6:2 2215.80 4.13 4.95 4.15 5:6:1 2256.82 - 1.30 - 4:7:1 2320.83 2.34 2.04 3.29 6:5:2 2361.86 4.35 3.30 3.23 5:6:2 2377.85 3.77 3.79 2.86 6:6:1 2507.91 1.62 2.32 1.32 5:6:3 2523.91 2.09 2.60 1.61 6:6:2 2539.90 1 1.89 4.81 19.32 7:6:1 2580.93 3.32 1.53 1.69 6:7:1 2612.94 - - 1.78 6:5:3 2669.97 1.95 2.34 - 6:6:3 2685.96 6.21 3.11 5.81 7:6:2 2726.99 1.62 1.38 1.36 6:7:2 2832.02 3.64 1.55 3.08 7:6:3 2905.04 1.79 - 2.45 8:7:1 2978.08 2.23 1.65 - 7:6:4 Tabla. VII P7 Porcentaje de total Proporción de Masa (m/z) Acumulado A Acumulado B Acumulado C Hex:HexNAc:dHex 1809.64 - 1.03 - 5:4:1 1850.67 3.36 2.05 - 4:5:1 1891.69 5.11 2.11 3.04 3:6:1 1955.70 1.46 1.22 1.08 5:4:2 1996.72 5.05 4.61 6.54 4:5:2 2012.72 1.34 1.38 1.35 5:5:1 2037.75 14.62 14.34 12.48 3:6:2 2053.74 3.73 2.76 4.29 4:6:1 2142.78 2.57 1.97 2.06 4:5:3 2158.78 1.43 1.91 - 5:5:2 2174.77 2.40 2.53 5.58 6:5:1 2183.81 16.91 15.79 14.90 3:6:3 2199.80 1.74 3.18 4.90 4:6:2 2215.80 4.23 4.20 3.08 5:6:1 2256.82 2.08 3.04 2.17 4:7:1 2320.83 1.67 1.88 2.23 6:5:2 2361.86 3.25 2.25 3.02 5:6:2 2377.85 1.50 1.84 2.73 6:6:1 2402.88 2.05 2.20 4.26 4:7:2 2418.88 0.97 1.54 - 5:7:1 2466.89 1.03 - - 6:5:3 2507.91 2.04 2.48 - 5:6:3 2523.91 1.58 1.73 1.47 6:6:2 2539.90 2.48 4.79 9.56 7:6:1 2548.94 1.26 1.14 0.66 4:7:3 2580.93 1.87 2.07 2.48 6:7:1 2685.96 2.74 3.39 4.30 7:6:2 2726.99 2.55 3.12 - 6:7:2 2832.01 1.35 - - 5:8:2 2832.02 2.14 3.06 1.91 7:6:3 2873.05 1.70 1.81 1.63 6:7:3 2889.04 1.14 0.67 - 7:7:2 2978.08 0.89 0.99 2.39 7:6:4 3019.10 1.09 1.26 - 6:7:4 Tabla VIII Actividades de FT (nmol/h/mg de proteina al,2FT al,3-FT al, 6 FT GalT CHO < 0.01 0.03 4.31 12.5 PER.C6 <0.01 0.65 3.62 3.41 Tabla IX Masa (m/z) Hex HexNAc dHex Fracción 1 Fracción 2 Fracción 3 Fracción 4 1631.6 3 4 2 ND ND ND 1.16 1688.6 3 5 1 3.22 3.09 2.22 2.82 1793.7 4 4 2 1.29 1.15 ND 0.83 1809.6 5 4 1 ND 1.50 2.10 2.82 1834.7 3 5 2 1.71 1.77 1.73 1.41 1891.7 3 6 1 10.98 7.96 5.19 4.31 1955.7 5 4 2 0.86 3.36 0.87 1.33 1996.7 4 5 2 2.40 2.65 2.47 2.32 2037.8 3 6 2 4.03 4.86 4.82 3.65 2053.7 5 5 1 6.43 5.39 3.89 2.65 2101.8 5 4 3 1.29 1.55 ND ND 2142.8 4 5 3 1.71 2.03 1.36 2.98 2174.8 6 5 1 1.29 1.95 1.36 0.00 2183.8 3 6 3 8.57 11.05 16.44 22.54 2199.8 4 6 2 4.54 5.04 4.94 3.81 2215.8 5 6 1 5.66 4.60 2.84 2.32 2256.8 4 7 1 1.97 1.77 0.87 1.33 2320.8 6 5 2 1.03 1.27 0.87 1.49 2361.9 5 6 2 4.46 4.86 4.39 3.31 2377.9 6 6 1 5.23 2.21 2.10 1.66 2507.9 5 6 3 1.65 1.68 3.71 5.47 2523.9 6 6 2 3.43 2.21 2.22 1.82 2539.9 7 6 1 10.72 6.19 4.94 4.47 2580.9 6 7 1 2.14 2.21 1.85 1.16 2670.0 6 6 3 0.86 1.68 2.47 2.82 2686.0 7 6 2 6.69 6.90 5.93 3.81 2727.0 6 7 2 2.70 3.36 2.72 1.82 2832.0 7 6 3 2.83 4.60 6.43 3.81 2873.1 6 7 3 1.29 1.55 4.57 2.98 2978.1 7 6 4 1.03 1.55 3.58 3.73 3019.1 6 7 4 ND ND 2.47 2.90 2124.1 7 6 5 ND ND 0.62 2.49 Tabla X LPOEPOEAione.. Clon Morfología Expresión ?1? 004 Plano ++ 008* Plano ++ 025 Plano +++ 028 Agujas pequeñas - ta 034 Plano +- <D 056 Plano + original - C O ¦H 062 Plano +++ ü 066 Plano ++ 076 Original - 002 lano ++ 003 Plano + Original ++ 005 Plano ++ 023 Plano +++ 025 Plano + Original - 026 Plano +++ 028 Plano + Original + 031 Plano + 033 Plano +++ 035 Original - 049 Plano ++ 051 Plano + Original + 057 Plano, irregular + 058 Plano ++ 062 Plano ++ << 067 Plano ++ ? 072* Plano, irregular ++ w 076 Plano +++ a 077 Plano +++ Tabla XI Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (43)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una composición que comprende moléculas similares a eritropoyetina que se seleccionan del grupo que consiste de eritropoyetina, una o más muteinas de eritropoyetina y uno o más derivados de eritropoyetina, caracterizada porque el número promedio de estructuras Lewis X sobre glucanos unidos a N por molécula similar a eritropoyetina es de por lo menos aproximadamente 2.2. 2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el número promedio de estructuras de Lewis X sobre glucanos unidos a N por molécula similar a eritropoyetina es de por lo menos aproximadamente 2.6.
3. 3. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el número promedio de estructuras de Lewis X sobre glucanos unidos a N por molécula similar a eritropoyetina es de por lo menos aproximadamente 2.7.
4. 4. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el número promedio de estructuras de Lewis X sobre glucanos unidos a N por molécula similar a eritropoyetina es de por lo menos aproximadamente 3.6. 5. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el número promedio de
5. 5 estructuras de Lewis X sobre glucanos unidos a N por molécula similar a eritropoyetina es de por lo menos aproximadamente 4.1.
6. 6. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el número promedio de • 10 estructuras de Lewis X sobre glucanos unidos a N por molécula similar a eritropoyetina es de por lo menos aproximadamente 5.7.
7. 7. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque los 15 glucanos unidos a N sobre las moléculas similares a eritropoyetina son principalmente estructuras biantenarias .
8. 8. Una preparación farmacéutica que comprende una composición de moléculas similares a eritropoyetina que se seleccionan del grupo que consiste de eritropoyetina, una o 20 más muteínas de eritropoyetina y uno o más derivados de eritropoyetina, en donde la composición de moléculas similares a eritropoyetina se caracteriza porque el número promedio de estructuras de Lewis X sobre los glucanos unidos a N por molécula similar a eritropoyetina es de por lo menos 25 aproximadamente 2.2.
9. 9. Una composición de moléculas similares a eritropoyetina que se selecciona del grupo que consiste de eritropoyetina, una o más muteínas de eritropoyetina y uno o más derivados de eritropoyetina, en donde la composición de moléculas similares a eritropoyetina está caracterizada porque el número promedio de estructuras de Lewis X sobre los glucanos unidos a N por molécula similar a eritropoyetina es de por lo menos aproximadamente 2.2, para uso como un medicamento .
10. 10. El uso de una composición de moléculas similares a eritropoyetina que se selecciona del grupo que consiste de eritropoyetina, una o más muteínas de eritropoyetina y uno o más derivados de eritropoyetina, en donde la composición de moléculas similares a eritropoyetina tiene un número promedio de estructuras de Lewis X sobre los glucanos unidos a N por molécula similar a eritropoyetina es de por lo menos aproximadamente 2.2, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno que se selecciona del grupo que consiste de isquemia, daño por reperfusión, desorden inducido por hipoxia, una enfermedad inflamatoria, un desorden neurodegenerativo y un daño agudo al sistema nervioso central o periférico.
11. 11. Una preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, o una composición de conformidad con la reivindicación 9, o un uso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el número promedio de estructuras de Lewis X sobre glucanos unidos a N por molécula similar a eritropoyetina es de por lo menos aproximadamente 2.6.
12. 12. Una preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, o una composición de conformidad con la reivindicación 9, o un uso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porgue el número promedio de estructuras de Lewis X sobre glucanos unidos a N por molécula similar a eritropoyetina es de por lo menos aproximadamente 2.7.
13. 13. Una preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, o una composición de conformidad con la reivindicación 9, o un uso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el número promedio de estructuras de Lewis X sobre glucanos unidos a N por molécula similar a eritropoyetina es de por lo menos aproximadamente 3.6.
14. 14. Una preparación f rmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, o una composición de conformidad con la reivindicación 9, o un uso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el número promedio de estructuras de Lewis X sobre glucanos unidos a N por molécula similar a eritropoyetina es de por lo menos aproximadamente 4.1.
15. 15. Una preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8 , o una composición de conformidad con la reivindicación 9, o un uso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el número promedio de estructuras de Lewis X sobre glucanos unidos a N por molécula similar a eritropoyetina es de por lo menos aproximadamente 5.7.
16. 16. Un método para expresar y purificar eritropoyetina, o una muteína o un derivado de la misma que tiene por lo menos un glucano unido a N, caracterizado porque comprende una estructura de Lewis X, el método comprende: a) expresar ácido nucleico que codifica para la eritropoyetina o muteina o derivado de la misma en una célula de mamífero la cual expresa ácido nucleico que codifica E1A de un adenovirus, y b) purificar la eritropoyetina expresada o la muteína o derivado de la misma, la purificación comprende la etapa de la unión de la eritropoyetina expresada o la muteína o derivado de la misma a una leetina o a un anticuerpo monoclonal que se une a glucanos unidos a N que comprenden estructuras de Lewis X.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende la etapa de la unión de la eritropoyetina expresada o muteína o derivado de la misma a una lectina AAL.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 16 o la reivindicación 17, caracterizado porque durante la purificación de la eritropoyetina o muteína o derivado de la misma es fraccionada en base en el contenido de Lewis X.
19. 19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado porque la célula de mamífero se deriva de la célula depositada bajo el número 96022940 en la European Collection of Animal Cell Cultures at the Center for Applied Microbiology and Research.
20. 20. Un método para purificar eritropoyetina, o una muteína o derivado de la misma que tiene por lo menos un glucano unido a N que comprende una estructura de Lewis X, caracterizado porque comprende una etapa de unión de la eritropoyetina o muteína o derivado de la misma a una lectina o a un anticuerpo monoclonal que se une a glucanos unidos a N que comprende estructuras de Lewis X.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque comprende la etapa de unión de la eritropoyetina o muteína o derivado de la misma a una lectina AAL.
22. 22. Un método para producir una fracción enriquecida en una molécula proteinácea que tiene glucanos unidos a N que comprende estructuras (sialil) Lewis X o LacdiNac, caracterizado porque comprende las etapas de: a) expresar recombinantemente la molécula proteinácea en una célula que expresa ácido nucleico que codifica para E1A a partir de un adenovirus; y b) fraccionar las moléculas proteináceas producidas de esta manera, por lo que se obtiene una fracción de moléculas proteináceas que tienen, por molécula proteinácea, un contenido mayor de estructuras (sialil) Lewis X o LacdiNac en sus N-glucanos . ¦ ·
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la molécula proteinácea se selecciona del grupo de eritropoyetina, transferrina, una glucodelina tal como glucodelina A (PP14) , factor de crecimiento de nervios (NGF, por sus siglas en inglés) , factor neurotrófico derivado de cerebro, neurotrofina-3 , -4/5 y -6, factor neurotrófico ciliar, factor inhibidor de leucemia, cardiotrofina-1 , oncostatina-M, una interleucina, GM-CSF, G-CSF, IGF-1 y -2, TGF-ß, factor neurotrófico derivado de neuroglía, neurturina, persefina, miostatina, factor de crecimiento de fibroblastos-1, -2 y -5, amfirregulina, actividad inductora de receptor de acetilcolina, netrina-1 y -2, Neurregulina-2 y -3, pleotrofina, midcina, factor de las células madres (SCF, por sus siglas en inglés) , agrina, CSF-1, PDGF, saposina C, receptor-1 de complemento soluble, glucoproteina de a-1 ácido, proteínas de fase aguda, ligando-1 de selectina E, LAM-1, antígenos CD66 similares a antígeno carcinoembriónico, adresina de nodulo linfático periférico, CD75, CD76, CD45RO, CD21, ligando-1 de glucoproteína de selectina P, GlyCAM-1, glucoproteínas de tipo mucina, CD34, podocalixina, al-antiquimiotropisina, inhibidor de proteasa al, a-amilasa, glucoproteínas ricas en prolinas salivales, SERP-1, interferón ß, proteína en traza ß, proteína C, urocinasa, glucoproteína de esquitosoma, glucodelina A, inhibidor de la vía de factor de tejido, a-fetoproteína, proteínas del embarazo humano tales como hormonas gonadotropicas tales como hormona estimulante de los folículos (FSH, por sus siglas en inglés) , hormona luteinizante (LH, por sus siglas en inglés) , coriogonadotropina humana (hCG, por sus siglas en inglés) , o fragmentos o variantes de cualquiera de estos que sean capaces de recibir tales estructuras de glucosilacion.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la molécula proteinácea es eritropoyetina o una molécula similar a eritropoyetina.
25. 25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, caracterizado porque la fracción está enriquecida por un método que comprende una etapa de purificación de afinidad que utiliza las estructuras de glucano .
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la etapa de purificación utiliza la unión de las moléculas a una lectina o a un anticuerpo monoclonal que une los glucanos unidos a N que comprenden estructuras de (sialil) Lewis X o LacdiNac .
27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la etapa de purificación utiliza la unión de los glucanos unidos a N que comprenden estructuras de (sialil) Lewis X o LacdiNac, a una lectina AAL.
28. 28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27, caracterizado porque la célula de mamífero se deriva de la célula depositada bajo el número 96022940 en la European Collection of Animal Cell Cultures en el Center for Applied Microbiology and Research.
29. 29. Un método para seleccionar una célula de mamífero capaz de producir una molécula proteinácea que comprende una modificación postraduccional predeterminada, caracterizado porque comprende las etapas de: a) analizar la presencia o ausencia de un marcador específico de tejido o una combinación de marcadores específicos de tej ido en la célula de mamífero sobre la superficie celular de la célula de mamífero, marcador o combinación de marcadores los cuales son indicativos de la modificación postraduccional predeterminada que está presente en la molécula proteinácea; y b) seleccionar la célula de mamífero en base en la presencia o ausencia de los marcadores específicos de tejido.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la modificación postraduccional predeterminada comprende glucosilación.
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la .glucosilación comprende por lo menos una modificación que se selecciona del grupo que consiste de la estructura Lewis x, sialil Lewis x, GalNac, una estructura GlcNac, una estructura LacdiNAc, una fucosa unida al, 3, que a su vez se une a N-acetilglucosamina, una N-acetilglucosamina terminal, una galactosa terminal, una N-acetilglucosamina bisectante, un grupo sulfato y ácido siálico .
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la glucosilación comprende estructuras de Lewis x o sialil Lewis x.
33. 33. Un método para obtener una célula de mamífero a partir de una población de células heterogénea, la célula de mamífero es capaz de producir una molécula proteinácea que comprende estructuras de Lewis x o sialil Lewis x, caracterizado porque comprende las etapas de: a) clasificar las células en base en las estructuras de Lewis x o sialil Lewis x sobre proteínas producidas por las células en la población de células heterogéneas ; y b) seleccionar las células capaces de producir proteínas que comprenden las estructuras de Lewis x o sialil Lewis x.
34. 34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33, caracterizado porque las células de mamífero es de origen neural .
35. 35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 34, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula humana.
36. 36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 35, caracterizado porque la célula de mamífero se ha proporcionado con un ácido nucleico que codifica para la región El, o una parte de la misma, a partir de adenovirus humano de manera tal que la célula de mamífero alberga al ácido nucleico en una forma expresable.
37. 37. Un método para producir una molécula proteinácea que comprende la modificación postraduccional predeterminada en una célula de mamífero, caracterizado por comprende una etapa de identificar, seleccionar u obtener una célula de mamífero por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, y expresar la molécula proteinácea en la célula de mamífero.
38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula como se deposita bajo el número 96022940 en la European Collection of Animal Cell Cultures en el Center for Applied Microbiology and Research.
39. 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque comprende la etapa adicional de purificar la molécula proteinácea del cultivo de células de mamífero.
40. 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la purificación comprende una etapa que utiliza la modificación postraduccional predeterminada.
41. 41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la purificación comprende una etapa en la cual se utiliza un anticuerpo que es especifico para un epítopo presente en la modificación postraduccional predeterminada .
42. 42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la purificación comprende una etapa de unión de lectina.
43. 43. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 42, caracterizado porque la molécula proteinácea es eritropoyetina .