CN113429443B - 一种双唾液酸-甘露寡糖复合物及其合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双唾液酸‑甘露寡糖复合物及其合成方法，属于生物医药技术领域。本发明通过低聚甘露糖醛酸接枝双唾液酸构建的双唾液酸‑甘露寡糖复合物，该双唾液酸‑甘露寡糖复合物具有较好的生物识别性，良好的抗氧化及抗炎活性，能够穿透血脑屏障，进入大脑，提高电负性糖链进入大脑与Aβ42作用的效果；同时，能够有效的抑制Aβ42刺激BV‑2细胞产生的活化状态，减轻BV‑2细胞的受损程度和炎性反应，有望应用于阿尔茨海默症的防治。

Description

一种双唾液酸-甘露寡糖复合物及其合成方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，涉及一种双唾液酸-甘露寡糖复合物及其合成方法。
背景技术
阿尔茨海默症(AD)是一种由多因素引起的神经系统退行性疾病，严重危害老年人健康，引起严重公共卫生安全问题。AD发病与年龄密切相关，病因复杂，原因之一主要认为与大脑内β淀粉样蛋白沉积形成的老年斑有关。由于其发病机理复杂，目前临床上仍缺乏有效的治疗或方法，从2003年至今，美国FDA未批准治疗AD新药上市；2021年虽然批准一例靶向Aβ的抗体药物，但是争议很大。而以低聚甘露糖醛酸为主要成分的中国原创新药甘露特钠(GV-971)，可以通过平衡肠道菌群，由肠-脑轴介导，调节减轻Aβ诱发的神经炎症，起到治疗中轻度AD的良好效果；但是用量高达每天900mg，且对重度AD患者无效。
唾液酸，又称为神经氨酸，是一类由九碳糖为基本结构的衍生物的统称，在哺乳动物组织中主要以糖脂和糖蛋白的形式存在，是脊椎动物细胞糖蛋白或糖脂末端的主要部分，是细胞膜表面受体的重要组成，为人体免疫系统中发挥重要作用，具有良好的生物识别功能。聚唾液酸是唾液酸单体通过α2-8糖苷键连接的聚合物，在神经发育过程起重要作用；但是正常成年机体中除了精子之外，未发现有聚唾液酸。近期研究发现，正常人体中不具备毒性的短链Aβ中含有双唾液酸的糖链修饰，而且其中部分双唾液酸内部形成内酯，可提高稳定性。由于聚唾液酸的糖苷键不稳定性，有科学家合成用单唾液酸链接到聚丙烯酰胺纳米颗粒外部，合成了外部包裹大量单体唾液酸的复合物，证明其能与Aβ42结合，降低炎症；另外一些双唾液酸的寡糖如DSLNT的光交联复合物也具有类似效果，但是DSLNT来源于乳汁，含量极低，合成或者分离成本极高。
以往各种研究表明，天然的唾液酸复合物(α2,3-/α2,6-连接的唾液酸化寡糖)在脑中大量累积会促进Aβ42聚集，或同小胶质细胞膜蛋白受体结合，抑制小胶质细胞吞噬Aβ的能力，促进AD进程。因此，聚唾液酸和唾液酸虽然具有良好的生物识别功能，但天然单唾液酸复合物不具有抑制Aβ聚集效果，而聚唾液酸在水溶液中容易降聚。因此，本发明中拟合成一种结构相对稳定、仿生寡聚唾液酸的大分子，采用来源于海藻的低聚甘露糖醛酸接枝上双唾液酸，合成带双唾液酸的电负性糖链结构，利用双唾液酸良好的生物识别功能，可以穿越血脑屏障，进入大脑改善小胶质细胞的Aβ吞噬功能，抑制Aβ聚集，可对防治AD起积极作用。
发明内容
【技术问题】
本发明实际要解决的技术问题是：提供一种具有良好生物识别性、可降低机体炎症反应和与Aβ42结合的聚唾液酸的结构仿生复合物，即双唾液酸-甘露寡糖复合物。
【技术方案】
本发明的目的是为了克服现有技术的局限和不足，提出了一种合成具有良好生物识别性、可降低机体炎症反应和与Aβ42结合的的双唾液酸-甘露寡糖复合物方法。本发明通过低聚甘露糖醛酸接枝双唾液酸，利用双唾液酸良好的生物识别功能，利于酸性寡糖穿透血脑屏障，进入大脑，提高酸性寡糖的生物识别性，最终实现具有良好生物识别性的双唾液酸-甘露寡糖复合物的合成。
本发明的第一个目的是提供一种双唾液酸-甘露寡糖复合物，其结构如下所示：
其中，n为2-15。
本发明还提供一种合成上述双唾液酸-甘露寡糖复合物的方法，其反应路线如下所示：
在本发明的一种实施方式中，所述合成方法包括如下步骤：
(1)将式1所示的双唾液酸溶于HCl溶液中，混匀、静置反应；反应结束后，调节pH至中性，利用离子交换层析分离，洗脱液浓缩冻干，得到式2所示的内酯化保护的双唾液酸；
(2)将所得内酯化保护的双唾液酸分散在无水甲醇中，加入阳离子树脂，在室温条件下混匀，进行甲酯化反应，待体系澄清后，过滤，收集液体，减压旋蒸，得到甲酯化双唾液酸产物；然后加入吡啶将其完全溶解，在0-15℃条件下滴加乙酸酐，并加入4-二甲氨基吡啶作为催化剂，混匀进行乙酰化反应，反应结束后，萃取纯化，获得式3所示的甲酯乙酰化双唾液酸产物(1-Me-Ac5-diSiaNAc)；
(3)将式4所示的低聚甘露糖醛酸溶于缓冲溶液中，调节pH至7.0-8.0，通入氮气，加入巯基乙胺，在25-35℃下氛围下反应；反应结束后，旋蒸浓缩，透析，冻干反应液，得到式5所示的巯基化低聚甘露糖醛酸(MOS-SH)；
(4)将1-Me-Ac5-diSiaNAc、MOS-SH溶于有机溶剂，在三氟化硼乙醚(BF3·Et2O)催化下进行反应，反应结束后，用超滤系统进行超滤离心，旋蒸浓缩，烘干备用，得到式6所示的双唾液酸-甘露寡糖复合物。
在本发明的一种实施方式中，在步骤(1)中，HCl溶液的浓度为1-2mol/L。
在本发明的一种实施方式中，在步骤(1)中，反应在低温隔夜下完成，低温的温度是指4-10℃；隔夜的时间范围是指8-12h。
在本发明的一种实施方式中，在步骤(1)中，离子交换层析分离包括使用阴离子交换树脂吸附分离。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中具体包括如下过程：
将双唾液酸溶于1M HCl中，于4℃冰箱放置过夜，NaOH中和到中性，用阴离子交换树脂吸附，洗脱后收集液冻干获得内酯化的双唾液酸。
在本发明的一种实施方式中，在步骤(2)中，所述阳离子树脂为IR120等钠型阳离子树脂。
在本发明的一种实施方式中，在步骤(2)所述乙酰化反应中，还可以加入有机溶剂；所述有机溶剂选自为二氯甲烷或乙酸乙酯。
在本发明的一种实施方式中，在步骤(2)所述乙酰化反应的时间为24-48h。
进一步地，在步骤(2)中，阳离子树脂为IR120型号等钠型阳离子树脂。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述甲酯化反应中，双唾液酸、甲醇和阳离子树脂的质量比为1：(8-10)：0.2；具体用量可选1：9.5：0.2，即5g、60mL和1g。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述乙酰化反应中，甲酯化双唾液酸、吡啶、乙酸酐的质量比为1：(8-10)：(3-4)；具体用量可选1：9.8：3.3，即5g、50mL和15mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中甲酯化反应具体包括如下过程：
取内酯化反应后的双唾液酸于烧瓶中，加入无水甲醇，加入阳离子树脂，在室温条件下搅拌24-48h。待体系澄清后，过滤，减压旋蒸，得到甲酯化的双唾液酸产物。
优选地，在20℃下反应24-36h；
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中乙酰化反应具体包括如下过程：
将甲酯化的双唾液酸产物加入适量吡啶将其完全溶解，在0-15℃条件下取乙酸酐滴入体系，加入适量4-二甲氨基吡啶作为催化剂条件下反应24-48h。
优选地，调节反应温度为0℃，反应24-36h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述纯化包括如下过程：
反应结束后，加入HCl溶液，搅拌，加入有机溶剂萃取，再用碳酸盐溶液萃洗，对有机相加入硫酸钠，旋干，得到甲酯乙酰化双唾液酸产物(1-Me-Ac5-di-SiaNAc)，其中，所述碳酸盐溶液为饱和碳酸氢钠或饱和碳酸氢钠溶液。
优选地，碳酸盐溶液为饱和碳酸氢钠溶液，有机溶剂选择二氯甲烷；
进一步地，采用硫酸钠盐为过量无水硫酸钠。
进一步地，所述有机溶剂为二氯甲烷、甲醇或二甲亚砜。优选地，有机溶剂为甲醇。
在本发明的一种实施方式中，在步骤(3)中，所述缓冲溶液为磷酸钠盐缓冲溶液或磷酸钾盐缓冲溶液。
在本发明的一种实施方式中，在步骤(3)中，所述低聚甘露糖醛酸的分子量为500Da-5000Da，聚合度为2-15DP。
在本发明的一种实施方式中，在步骤(3)中，所述巯基乙胺与低聚甘露糖醛酸质量比为1：3-5。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)具体包括以下过程：
取适量低聚甘露糖醛酸溶于缓冲溶液，调节pH至7.0-8.0，通入氮气，加入巯基乙胺，在25-35℃下氛围下反应。反应结束后，旋蒸浓缩，透析，冻干反应液，得到巯基化低聚甘露糖醛酸(MOS-SH)；
优选地，调节pH至7.2；反应温度为30℃。
进一步地，缓冲溶液为磷酸钠盐缓冲溶液或磷酸钾盐缓冲溶液。
进一步地，反应条件为在氮气氛围下。
进一步地，低聚甘露糖醛酸分子量为500Da-5000 Da，聚合度为2-15DP。
优选地，低聚甘露糖醛酸分子量的分子量为500Da-3000 Da，聚合度为2-15DP。
进一步地，在步骤(1)中，巯基乙胺与低聚甘露糖醛酸质量比为1∶3-5。
优选地，巯基乙胺与低聚甘露糖醛酸质量比为1∶4。
在本发明的一种实施方式中，在步骤(4)中，所述有机溶剂为二氯甲烷、甲醇或二甲亚砜。
在本发明的一种实施方式中，在步骤(4)中，反应的温度为25-35℃，时间为12-36h。
在本发明的一种实施方式中，在步骤(4)中，所述超滤系统或采用500-3000Da的透析袋，对反应液在甲醇溶液中透析。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)具体包括以下过程：
取活化的1-Me-Ac5-di-SiaNAc以及MOS-SH溶于有机溶剂，在三氟化硼乙醚(BF3·Et2O)催化下在25-35℃条件下反应12-36h，用超滤系统(500Da-5000 Da)进行多次超滤离心，旋蒸浓缩，烘干备用，得到所述的双唾液酸-甘露寡糖复合物。
优选地，调节反应温度为30℃，反应24-36h。
在本发明的一种实施方式中，采用上述合成方法制备双唾液酸-甘露寡糖复合物(MOS-diSia)的反应路线如图1所示。其中，SH代表巯基，diSia代表衍生化双唾液酸。
本发明还提供了上述双唾液酸-甘露寡糖复合物在制备用于治疗炎症、阿尔茨海默症制的药物中的应用。
本发明至少具有以下优点：
本发明构建的双唾液酸-甘露寡糖复合物，通过低聚甘露糖醛酸接枝双唾液酸，利用唾液酸良好的生物识别功能，提高甘露寡糖的生物识别性，在保留甘露寡糖良好的抗氧化及抗炎活性的情况下，助于酸性寡糖穿透血脑屏障，进入大脑，提高电负性糖链进入大脑与Aβ42作用的效果。同时，天然单唾液酸复合物不具有抑制Aβ聚集效果，通过低聚甘露糖醛酸接枝唾液酸，制得具有抑制Aβ聚集效果的唾液酸复合物，而唾液酸复合物对AD的发生发展有重要影响，在一定浓度范围内，MOS-diSia可以有效的抑制Aβ42刺激BV-2细胞产生的活化状态，减轻BV-2细胞的受损程度和炎性反应。
附图说明
图1是本发明实施例1中合成双唾液酸-甘露寡糖复合物的反应路线示意图；
图2是本发明实施例1所合成的MOS-diSia的红外光谱；
图3是本发明实施例1所合成的MOS-diSia与Aβ42的细胞毒性(MTT)实验结果。其中，A为空白对照，B为Aβ42 40μg/mL，C为Aβ42+MOS-diSia 50μg/mL。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
聚甘露糖醛酸购买于青岛博智汇力生物科技有限公司；双唾液酸由聚唾液酸酸水解后分离制备；巯基乙胺购买于上海麦克林生化科技有限公司；β淀粉蛋白(Aβ42)购于南京肽业生物科技有限公司。
实施例1：
(1)将10g双唾液酸置于500ml烧瓶，加入预冷的200ml、1M HCl溶液，搅拌溶解，于4℃冰箱放置过夜，然后用2M NaOH调到中性，用阴离子交换树脂吸附，洗脱后收集液，真空浓缩，冻干后获得内酯化保护的双唾液酸。
(2)取5.0g内酯化保护的双唾液酸于烧瓶中，加入60mL无水甲醇，加入1.0g IR120阳离子树脂，在室温条件下搅拌48h。使用TLC板监测反应程度，待体系澄清后，使用布式漏斗过滤，以除去阳离子树脂，减压旋蒸，得到甲酯化双唾液酸。
本步骤过程中的反应条件可替换为在恒温磁力搅拌器搅拌下进行。
取5g甲酯化双唾液酸加入50ml吡啶将其完全溶解。取15ml乙酸酐缓慢滴入体系，加入100mg 4-二甲氨基吡啶作为催化剂，反应24h，使用TLC板监测反应程度，在反应完成后，萃取纯化：向体系中缓慢加入10mL 1.0mol/L的HCl溶液，边滴加边搅拌，加入二氯甲烷萃取，再用饱和碳酸氢钠萃洗，以除去残留的吡啶及HCl，对有机相加入过量的无水硫酸钠，旋干，得到甲酯乙酰化产物1-Me-Ac5-diSiaNAc。
本步骤过程中，反应体系可在冰浴条件下进行。萃取纯化时二氯甲烷还可以替换为乙酸乙酯。
(3)取适量低聚甘露糖醛酸溶于20mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液，使其浓度为10mg/mL，通入氮气10min，除去溶液中的氧气，加入巯基乙胺，使其终浓度为2.5mg/mL，25℃的氮气氛围下反应36h。反应结束后，旋蒸浓缩，转入透析袋(分子量为500Da)中，除去未反应的巯基乙胺等小分子物质，冻干反应液，得到产物MOS-SH。
本步骤过程中，还可以使用乙醇等进行醇沉，除去部分小分子杂质。
(4)取1-Me-Ac5-diSiaNAc以及MOS-SH溶于二氯甲烷，使其浓度分别为15mg/L和10mg/L，在100mg三氟化硼乙醚(BF3·Et2O)催化下，反应10h；反应结束后用1000Da超滤离心管进行多次超滤离心，完全除去体系中未反应的小分子反应物，旋蒸浓缩，烘干备用，得到双唾液酸-甘露寡糖复合物(MOS-diSia)。
本步骤过程中，二氯甲烷还可以替换为甲醇，可用1000Da的透析袋在甲醇溶液中替换超滤离心管进行透析。
图2是MOS-diSia的红外光谱，MOS-diSia在810.9cm-1有吸收峰为糖醛酸的特征吸收峰，表明产物中具有甘露糖醛酸部分。同时出现新的吸收峰，在700cm-1处吸收峰增强，证明了双唾液酸-甘露寡糖复合物的成功合成。
实施例2：
将Aβ42与双唾液酸-甘露寡糖复合物溶于pH7.4的PBS，使其浓度分别为10μmol/L及0.1g/L，在37℃进行孵育36h，以自然孵育的Aβ42为空白，离心除去沉淀，取上清进行冻干，得到“Aβ42-MOS-diSia”。结果发现双唾液酸-甘露寡糖复合物能抑制Aβ42沉积，相比空白(PBS)对照(沉淀率为78％)，加入MOS-diSia后的沉淀率仅为10％，具有显著的沉积抑制作用。
其中，沉淀率＝(总Aβ42浓度–上清液Aβ42浓度)/总Aβ42浓度。
本实施例中，Aβ42可用少量二甲亚砜溶解，而后溶于磷酸盐缓冲液。
实施例3：
将小胶质细胞用0.25％胰酶消化后，离心(1000r/min，5min)，用血球计数板计数，调整浓度后按100μL(5000cells)/孔接种于96孔板中，设置3复孔，继续培养24h；培养待小胶质细胞贴壁后，挑选生长状况正常的细胞，更换培养基(分别更换为10μmol/L的Aβ42，10μmol/L Aβ42与50μg/mL MOS-diSia的混合液，体积都为100μL)，用不加样品的细胞做空白，在细胞培养箱中分别孵育48h。每孔更换90μL新鲜培养基，每孔加入10μL的MTT，37℃，5％CO2培养箱内避光孵育3h。吸净孔内的液体，加入200μL的二甲亚砜，于摇床室温震荡10min。酶标仪490nm波长测出同一时间点OD值，每个样品做3个平行。
图3是双唾液酸-甘露寡糖复合物的细胞毒性(MTT)实验结果，图中，A、B、C分别代表正常培养条件下，只添加Aβ42和添加Aβ42及MOS-diSia的条件下培养48h的小胶质细胞照片，从图中可看出，在整个培养过程中，50μg/mL MOS-diSia与Aβ42共培养条件下细胞的数目并未发生明显减少，形态未发生变化，表明这个浓度下双唾液酸-甘露寡糖复合物对细胞没有毒性，进一步说明本发明的方法所合成的产物在体内具有很好的稳定性和生物相容性，同时在一定浓度范围内，MOS-diSia可以有效的抑制Aβ42刺激BV-2细胞产生的活化状态，减轻BV-2细胞的受损程度和炎性反应。
对比例1
参照实施例3中的性能检测过程，将MOS-diSia替换为现有报道的其他电负性大分子，如：50μg/mL低聚甘露糖醛酸(3-15DP)，或者50μg/mL低聚唾液酸(10-20DP)，或者单唾液酸-甘露寡糖复合物，其他不变，进行性能测试。
结果发现：相比低聚甘露糖醛酸，MOS-diSia和低聚唾液酸都具有良好抑制细胞炎症效果；但随着时间延长，低聚唾液酸的抑制炎症效果减弱，而MOS-diSia则持续具有抑制炎症效果。即，双唾液酸-甘露寡糖复合物，相比低聚甘露糖醛酸具有更优良的抑制细胞炎症效果；相比低聚唾液酸，保持同样的炎症抑制效果，同时具有更良好的结构稳定性。
此外，相比唾液酸-甘露寡糖复合物(即低聚甘露糖醛酸接枝一分子唾液酸单体)，双唾液酸复合物具有更好的功能优势，能与SiglecE等受体结合，起到抑制小胶质细胞激活的功能，在穿越血脑屏障方面具有优势。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.具体如下结构的双唾液酸-甘露寡糖复合物，
其中，n为2-15。
2.一种合成权利要求1所述的双唾液酸-甘露寡糖复合物的方法，其特征在于，所述方法的反应路线如下所示：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将式1所示的双唾液酸溶于HCl溶液中，混匀、静置反应；反应结束后，调节pH至中性，利用离子交换层析分离，洗脱液浓缩冻干，得到式2所示的内酯化保护的双唾液酸；
(2)将所得内酯化保护的双唾液酸分散在无水甲醇中，加入阳离子树脂，在室温条件下混匀；待体系澄清后，过滤，收集液体，减压旋蒸，得到甲酯化双唾液酸产物；然后加入吡啶将其完全溶解，在0-15℃条件下滴加乙酸酐，并加入4-二甲氨基吡啶作为催化剂，混匀进行乙酰化反应，反应结束或，萃取纯化，获得式3所示的甲酯乙酰化双唾液酸；
(3)将式4所示的低聚甘露糖醛酸溶于缓冲溶液中，调节pH至7.0-8.0，通入氮气，加入巯基乙胺，在25-35℃下氛围下反应；反应结束后，旋蒸浓缩，透析，冻干反应液，得到式5所示的巯基化低聚甘露糖醛酸；
(4)将甲酯乙酰化双唾液酸、巯基化低聚甘露糖醛酸溶于有机溶剂，在三氟化硼乙醚催化下进行反应，反应结束后，用超滤系统进行超滤离心，旋蒸浓缩，烘干备用，得到式6所示的双唾液酸-甘露寡糖复合物。
4.根据权利要求3所述的双唾液酸-甘露寡糖复合物的合成方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述缓冲溶液为磷酸钠盐缓冲溶液或磷酸钾盐缓冲溶液。
5.根据权利要求3所述的双唾液酸-甘露寡糖复合物的合成方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述低聚甘露糖醛酸的分子量为500Da-5000Da，聚合度为2-15DP。
6.根据权利要求3所述的双唾液酸-甘露寡糖复合物的合成方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述巯基乙胺与低聚甘露糖醛酸质量比为1：3-5。
7.根据权利要求3所述的双唾液酸-甘露寡糖复合物的合成方法，其特征在于：在步骤(2)所述乙酰化反应中，还包括加入有机溶剂；所述有机溶剂选自为二氯甲烷或乙酸乙酯。
8.根据权利要求3所述的双唾液酸-甘露寡糖复合物的合成方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述有机溶剂为二氯甲烷、甲醇或二甲亚砜。
9.根据权利要求3-8任一项所述的双唾液酸-甘露寡糖复合物的合成方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述超滤系统或采用500-3000Da的透析袋，对反应液在甲醇溶液中透析。
10.权利要求1所述的双唾液酸-甘露寡糖复合物在制备用于治疗炎症、阿尔茨海默症的药物中的应用。
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