WO2013058582A2 - 당전이 효소를 이용한 안사마이신 배당체의 제조방법 - Google Patents

당전이 효소를 이용한 안사마이신 배당체의 제조방법 Download PDF

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WO2013058582A2
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    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin

Definitions

  • the present invention provides a method for producing non-benzoquinone geldanamycin glycosides having ansamycin glycosides or ansamycin skeletons using sugar transfer enzymes, non-benzoquinone geldanamycin glycosides, and for preventing or treating cancer diseases containing the same as active ingredients. It relates to a pharmaceutical composition.
  • Bioconversion sugar transfer technology uses a glycosyltransferase enzyme to develop a pharmaceutical glycoside library with a special structure and function. This technology delivers more than one carbohydrate from a carbohydrate donor to the free OH group of the receptor (aglycone or glycone), which is the core foundation of glycomixes and glycogenetics.
  • glycoside structure determination and functional study information enable the design of structured and functional materials using efficient biotechnological synthesis.
  • Glycomics is a study of carbohydrate structure and physiological functions, along with glycogenetics, which utilizes the functions and characteristics of natural and artificial carbohydrates related to the functions of proteins, which are products of the genome, in the academic field of food science. It is the foundation of medicine, carbobiology, provides the core knowledge of the next-generation life and biotechnology industry, provides an important basic starting material, and has the potential to produce highly precise chemicals such as pharmaceuticals.
  • Non-Patent Document 1 Chemical synthesis technology requires high-temperature and high-pressure reaction conditions, which is highly dangerous. Pollution may occur due to the use of heavy metal catalysts and organic solvents. Fermentation technology has a complex metabolic system that limits the introduction of genetic engineering technology. As it is an industry to use, there is a limit in international competitiveness with China. However, the enzyme-based bioconversion process technology has high precision, specificity, and selectivity in reaction, can be produced with a small device, genetic engineering technology can be applied, and it has high environmental-friendly advantages. Since it is a tech industry, it is expected to be developed as a technology to replace the chemical industry (Non-Patent Document 1).
  • Glycotransferases are enzymes that transfer sugar moieties from activated sugar donors to receptors such as proteins, fats, carbohydrate polymers and natural products. These enzymes have various specificities depending on the sugar donor and acceptor, and various kinds of sugar transfer enzymes are found in both eukaryotic and prokaryotic cells.
  • glycotransferases are classified into 93 families according to the sequence, and more than 15,000 are known.
  • a saccharification reaction using a glucan sucrase enzyme obtained from the leuconostoc mesenteroides B-512FMCM is known in the related art (Patent Document 1), and also, leuconostoc mesterosteroid (Leuconostoc).
  • Mesenteroides) Glycan sucrose obtained from NRRL B-1299 strain and levansucase using Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512 strain are known (Patent Document 2).
  • Ansamycin antibiotics include geldanamycin, herbimycin, macbecin, reblastatin, rifamycin, and ansamitocin.
  • Non Patent Literature 2 antibiotic
  • Non Patent Literature 3 antifungal agent
  • Non Patent Literature 4 antiviral agent
  • Immunsuppressive agent Non Patent Literature 5
  • degenerative neuropathy agent Non-Patent Literature 2 from 1970 to 2000.
  • Patent document 6 the function was confirmed as an anti-inflammatory agent (nonpatent literature 7), and an anticancer agent (nonpatent literature 8).
  • Patent Document 3 a novel geldanamycin derivative, an ansamycin-based compound, and a preparation method thereof are known (Patent Document 3), and a manufacturing method using chemical synthesis of 17-allyl amino geldanamycin and other ansamycins is known.
  • Patent Document 4 the clinical test results of the benzoquinone form of geldanamycin derivatives have problems such as high hepatotoxicity.
  • the present inventors while studying to solve the above problems, by introducing a glucosyl group to an anamycin or non-benzoquinone form of geldanamycin compound having a similar skeleton to prepare a glycoside, solubility of these glycosides is increased, The present invention was completed by confirming that the bioavailability can be increased.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a non-benzoquinone geldanamycin glycoside having an anamycin skeleton.
  • Another object of the present invention is to provide a non-benzoquinone geldanamycin glycoside or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for inhibiting ATPase activity of a heat shock protein containing a non-benzoquinone geldanamycin glycoside and a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer disease, which contains a non-benzoquinone geldanamycin glycoside and a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a solubility of ansamycin glycosides comprising the step of preparing a glycoside by performing a sugar transfer reaction to a sugar transfer enzyme and the ansamycin compound represented by Formula 1 as a substrate. It provides a manufacturing method.
  • the present invention is a solubility comprising the step of preparing a glycoside by performing a sugar transfer reaction to a sugar transfer enzyme and a non-benzoquinone geldanamycin compound having an anamycin skeleton represented by the following formula (7) as a substrate.
  • a solubility comprising the step of preparing a glycoside by performing a sugar transfer reaction to a sugar transfer enzyme and a non-benzoquinone geldanamycin compound having an anamycin skeleton represented by the following formula (7) as a substrate
  • R 1 is as defined herein.
  • the present invention provides a non-benzoquinone geldanamycin glycoside represented by Formula 11 to Formula 15 obtained from the non-benzoquinone geldanamycin compound represented by Formula 7 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a thermal shock containing at least one non-benzoquinone geldanamycin glycoside of Formula 11 to Formula 15 obtained from the non-benzoquinone compound represented by Formula 7 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for inhibiting ATPase activity of a protein is provided.
  • the present invention is a cancer containing at least one non-benzoquinone geldanamycin glycoside of Formula 11 to Formula 15 obtained from the non-benzoquinone compound represented by Formula 7 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease.
  • the present invention by introducing a glucosyl group to the non-benzoquinone geldanamycin compound having an anamycin or an anamycin skeleton, solubility is increased, the bioavailability can be increased, and the activity of an anamycin-based compound, It can be usefully used as an antifungal, antiviral, immunosuppressive, degenerative neurological disease, anti-inflammatory or anticancer agent.
  • FIG. 1 is a diagram showing Ni-NTA agarose carrier chromatography of UDP-glycosyltransferase C used in Examples 1 to 4 of the present invention.
  • FIG. 2 shows Ni-NTA agarose carrier chromatography of UDP-glycosyltransferase E used in Examples 5-6 of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing the HPLC results of the sugar transfer enzyme used in Example 1, the reaction mixture, and the reaction mixture by mixing them
  • Example 4 is a diagram showing the HPLC results of the sugar transfer enzyme used in Example 2, the reaction mixture, and the reaction mixture obtained by mixing and reacting them
  • Example 5 is a diagram showing the HPLC results of the sugar transfer enzyme used in Example 3, the reaction mixture, and the reaction mixture obtained by mixing and reacting them
  • FIG. 6 is a diagram showing HPLC results of a sugar transfer enzyme, a reactive substance used in Example 4, and a reaction mixture obtained by mixing and reacting them.
  • Example 7 is a diagram showing the HPLC results of the sugar transfer enzyme used in Example 5, the reaction mixture, and the reaction mixture obtained by mixing and reacting them
  • Example 8 is a diagram showing the HPLC results of the sugar-transferase used in Example 6, the reaction mixture, and the reaction mixture obtained by reacting these mixtures.
  • FIG. 9 is a diagram showing LC / MS analysis data of a compound represented by Formula 11 of Example 7 of the present invention.
  • A LC / MS spectrum of purified compound
  • B MS measurement result of C
  • ) Compound structural formula
  • FIG. 10 is a diagram showing LC / MS analysis data of a compound represented by Chemical Formula 12 of Example 7 of the present invention (A): LC / MS spectrum of purified compound, B): MS measurement result of compound, C) : Compound structural formula).
  • FIG. 11 is a diagram showing LC / MS analysis data of compound represented by Chemical Formula 13 of Example 7 of the present invention (A): LC / MS spectrum of purified compound, B): MS measurement result of compound, C) : Compound structural formula).
  • FIG. 12 is a diagram showing LC / MS analysis data of a compound represented by Chemical Formula 14 of Example 8 of the present invention (A): LC / MS spectrum of purified compound, B): MS measurement result of compound, C) : Compound structural formula).
  • FIG. 13 is a diagram showing LC / MS analysis data of compound represented by Chemical Formula 15 of Example 9 of the present invention (A): LC / MS spectrum of purified compound, B): MS measurement result of compound, C) : Compound structural formula).
  • FIG. 14 is a diagram showing LC / MS results for the presence or absence of glycosylation of the compound represented by Chemical Formula 2 of the present invention (A): LC / MS spectrum of which glycoside was identified at 4.82 minutes, B): glycoside at 4.88 minutes LC / MS spectrum, C): MS measurement result of the glycoside identified in A), D) MS measurement result of the glycoside identified in B)).
  • FIG. 15 is a graph showing LC / MS results for the presence or absence of glycosylation of the compound represented by Formula 3 of the present invention (A): LC / MS spectrum of which glycoside was identified at 6.47 minutes, B): glycoside at 6.50 minutes LC / MS spectrum, C): MS measurement result of the glycoside identified in A), D) MS measurement result of the glycoside identified in B)).
  • FIG. 16 is a graph showing LC / MS results for the presence or absence of glycosylation of the compound represented by Chemical Formula 4 of the present invention (A): LC / MS spectrum where glycosides are identified at 3.97 minutes, 4.60 minutes, and 4.83 minutes, B) : MS measurement results of glycosides identified at 3.97 min in the spectrum, C) MS measurement results of glycosides identified at 4.60 min in the spectrum, A) Glycosides identified at 4.83 min in the spectrum, A) MS measurement results).
  • FIG. 17 is a diagram showing HPLC analysis data for comparing the solubility of the compound according to Example 2 of the present invention (A): a diagram showing the HPLC results of the reaction mixture, B): a diagram showing the HPLC results of the water layer, C ): A diagram showing the HPLC results of the organic layer).
  • FIG. 18 is a diagram showing HPLC analysis data for comparing the solubility of the compound according to Example 7 of the present invention (A): a diagram showing the HPLC results of the reaction mixture, B): a diagram showing the HPLC results of the water layer, C ): A diagram showing the HPLC results of the organic layer).
  • 19 is a view measuring the expression inhibitory effect of the heat shock protein of the compounds represented by the formula (8) and formula (11) of the present invention.
  • the present invention provides a method for preparing a glycoside with increased solubility obtained from a compound represented by Chemical Formula 1 by introducing a glycosyl group into a compound represented by Chemical Formula 1 by reacting an anamycin compound represented by Chemical Formula 1 with a sugar transfer enzyme as a substrate. to provide.
  • R is an unsubstituted or hydroxy group, Is a single bond or a double bond).
  • the present invention also provides a glycosyl group to a compound of formula 7 by performing a sugar transfer reaction between the isolated sugar transfer enzyme and a non-benzoquinone geldanamycin compound having an anamycin skeleton represented by formula 7 as a substrate. Introduced, there is provided a method for preparing a glycoside with increased solubility obtained from the compound of formula (7).
  • R 1 is an unsubstituted or hydroxy group, Is a single bond or a double bond).
  • the method for preparing a glycoside according to the present invention may further comprise the step of separating the sugar transferase.
  • the glycotransferase is a UDP-glycotransferase derived from E. coli Bacillus licheniformis.
  • the glycotransferase is obtained by overexpression in Escherichia coli by obtaining a glycotransferase gene derived from Bacillus licheniformis ( Bacillus licheniformis), and then over-expressed E. coli cells by ultrasonication and nickel-NTA (Nitrilotriacetic acid) affinity It can be used by separation using column chromatography.
  • a glycotransferase gene derived from Bacillus licheniformis ( Bacillus licheniformis)
  • nickel-NTA Nitrilotriacetic acid
  • the UDP-glycotransferase isolated from Bacillus licheniformis is a uridine diphosphate-glucosyltransferase C or UDP-glucosyltransferase E
  • the present invention is a uridine diphosphate-glucosyltransferase E.
  • In the invention can be used as a sugar transfer enzyme.
  • the sugar transfer reaction may be performed by adding the sugar transfer enzyme and UDP-glucose.
  • the sugar transfer enzyme may serve to transfer the glucosyl group of UDP-glucose to ansamycin or non-benzoquinone geldanamycin derivative.
  • the sugar transfer reaction may be carried out at 25-35 °C.
  • sugar transfer reaction may be performed for 10-20 hours.
  • the short reaction time may reduce the reaction conversion rate and the longer reaction time has a problem that the activity can be reduced because the stability of the enzyme is reduced.
  • the sugar transfer reaction may be carried out in an environment of pH 6.0-9.0.
  • ansamycin compound represented by the general formula (1) usable in the above production method is one selected from the group consisting of compounds represented by the following general formulas (2) to (5).
  • non-benzoquinone geldanamycin compound represented by the formula (7) which can be used in the above production method is one selected from the group consisting of compounds represented by the following formulas (8) to (10).
  • the present invention provides a non-benzoquinone geldanamycin glycoside represented by Formula 11 to Formula 15 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention is not only the non-benzoquinone geldanamycin glycoside represented by Formula 11 to Formula 15, but also a pharmaceutically acceptable salt thereof, possible solvates, hydrates, racemates, or stereoisomers that can be prepared therefrom. Include all of them.
  • the non-benzoquinone geldanamycin glycoside represented by Formula 11 to Formula 15 of the present invention may be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and the salt may be an acid formed by a pharmaceutically acceptable free acid.
  • Addition salts are useful. Acid addition salts include inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid or phosphorous acid and aliphatic mono and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, hydroxy alkanoates and alkanes. Obtained from non-toxic organic acids such as dioates, aromatic acids, aliphatic and aromatic sulfonic acids.
  • Such pharmaceutically toxic salts include sulfate, pyrosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, nitrate, phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, metaphosphate, pyrophosphate chloride, bromide and iodide Id, fluoride, acetate, propionate, decanoate, caprylate, acrylate, formate, isobutyrate, caprate, heptanoate, propiolate, oxalate, malonate, succinate, suverate , Sebacate, fumarate, maleate, butyne-1,4-dioate, hexane-1,6-dioate, benzoate, chlorobenzoate, methylbenzoate, dinitro benzoate, hydroxybenzoate, meth Oxybenzoate, phthalate, terephthalate, benzenesulfonate, toluenesulfon
  • the acid addition salt according to the present invention is dissolved in conventional methods, for example, the non-benzoquinone geldanamycin glycoside represented by the formulas (11) to (15) in an excess of an aqueous acid solution, and the salt is a water miscible organic solvent, for example.
  • the salt can be prepared by precipitation using methanol, ethanol, acetone or acetonitrile.
  • the same amount of the non-benzoquinone geldanamycin glycoside represented by the formulas (11) to (15) and the aqueous acid solution or alcohol may be heated, and then the mixture is evaporated to dryness or the precipitated salt may be produced by suction filtration.
  • Bases can also be used to make pharmaceutically acceptable metal salts.
  • Alkali metal or alkaline earth metal salts are obtained, for example, by dissolving the compound in an excess of alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the non-dissolving compound salt, and evaporating and drying the filtrate. At this time, it is pharmaceutically suitable to prepare sodium, potassium or calcium salt as the metal salt.
  • the non-benzoquinone geldanamycin glycoside has the effect of increasing solubility (see Experimental Example 5) and increasing the thermal shock protein etipiase inhibitory activity (see Experimental Example 6).
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting ATPase activity of a heat shock protein containing a non-benzoquinone geldanamycin glycoside and a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the non-benzoquinone geldanamycin glycoside according to the present invention is 0.75 ⁇ M for the compound represented by Formula 11 of Example 7 with an ATPase inhibitory activity (IC 50 ) of the heat shock protein as Formula 14 of Example 8,
  • IC 50 an ATPase inhibitory activity of the heat shock protein
  • the ATPase inhibitory activity was superior to that of the conventional non-benzoquinone geldanamycin as 2.14 ⁇ M.
  • glycated compounds were found to exhibit similar ATPase inhibitory activity compared to the non-benzoquinone geldanamycin derivatives originally used as substrates (see Experimental Example 4).
  • the pharmaceutical composition may be used as an antibiotic, antifungal, antiviral, immunosuppressive, degenerative neurological disease treatment or anti-inflammatory by inhibiting the ATPase activity of the heat shock protein.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer disease, which contains a non-benzoquinone geldanamycin glycoside and a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Ratio according to the present invention azithromycin benzoquinone Zelda or glycoside is been determined that a low IC 50 value than that of the compound represented by the formula (8) known to have anti-cancer effect in a conventional as a comparative example in the breast cancer cell line, since the IC 50 value is excellent anticancer agent It can be usefully used in (see Experimental Example 7).
  • the cancer diseases include breast cancer, liver cancer, stomach cancer, colon cancer, bone cancer, pancreatic cancer, head or neck cancer, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, esophageal cancer, small intestine cancer, anal muscle cancer, colon cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vagina Carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, prostate cancer, bladder cancer, kidney cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma or central nervous system tumor.
  • glycosyltransferase genes from various organisms (Bacillus, pseudomonas, Anabena, etc.) corresponding to family 1 of ( WWW.CAZY.org ) in order to secure the gene of glycosyltransferase according to the present invention After selection and cloning into expression vectors, expression and activity were confirmed.
  • UDP-glycosyltransferase C (accession number, AAU40842) derived from Bacillus licheniformis was obtained.
  • the UDP-glycosyltransferase C gene was obtained by PCR from genomic DNA of Bacillus licheniformis.
  • the obtained gene was overexpressed in E coli after cloning the expression vector pET302 / NT-his.
  • the amount of overexpressed protein was more than 5% of the total E. coli protein amount and was obtained in stable water soluble form.
  • a histidine-labeled enzyme was expressed in a nickel-NTA affinity column in Escherichia coli expressing UDP-glycosyltransferase (BL-C), a sugar transfer enzyme derived from Bacillus licheniformis. Separation via chromatography. Protein overproduction was approximately 17 hours in 5 ml Luria-Bertani liquid medium containing E.
  • coli BL21 (DE3) with an overexpressing plasmid containing kanamycin and chloramphenicol at a concentration of 50 ⁇ g / ml. Incubated for It was diluted 1/60 using 30 ml of fresh LB medium and incubated for another 2-3 hours to give an optical density (OD) value of about 0.5-0.6 at 600 nm of UV spectrum. At this time, the resultant was placed on ice for 10 minutes and isopropyl ⁇ -D-thioglucopyranoside (IPTG) was added to a final concentration of 1 mM to induce overexpression and further incubated for 17 hours at 20 ° C. . E. coli cultures thus obtained were obtained by centrifugation (3500 rpm, 30 minutes), and then E.
  • IPTG isopropyl ⁇ -D-thioglucopyranoside
  • E. coli was added to 3 ml of buffer (100 mM Sodium phosphate solution (pH 7.4), 20 mM KCl, 6 mM MgCl 2 , 10 mM imidazole). Suspended. E. coli cells were ground using an ultrasonic mill, followed by centrifugation (15,000 rpm, 30 minutes), and the grinding solution was subjected to SDS-PAGE to confirm protein production. The ground supernatant was mixed with 0.5 ml of Ni-NTA resin in an empty column and gently shaken at 4 ° C. for 60 minutes, followed by 3 ml of wash buffer (100 mM Sodium phosphate solution, pH7.
  • buffer 100 mM Sodium phosphate solution (pH 7.4), 20 mM KCl, 6 mM MgCl 2 , 10 mM imidazole.
  • E. coli cells were ground using an ultrasonic mill, followed by centrifugation (15,000 rpm, 30 minutes), and the grinding
  • a compound having a benzene ring represented by the following formula (2) is used (17-dimethoxy-levastatin), and the sugar transfer enzyme is UDP- separated in step 1 Glycosyltransferase C was used.
  • the standard reaction solution is prepared to have a total of 20 ml, and the reaction solution composition is 50 mM Tris-Cl (pH) as follows. 8.0), a donor substrate (2 mM UDP-glucose), an acceptor substrate (0.5 mg / ml), 1 mM MgCl 2 , 5% DMSO, was configured to contain an enzyme solution. The reaction mixture was reacted at 30 ° C. for 16 hours and subjected to HPLC analysis.
  • UDP-glycosyltransferase E (accession number, AAU39773) was obtained by the same method as Step 1 of Example 1 (see FIG. 2).
  • a compound having a benzene ring represented by the following formula (2) is used (17-dimethoxy-levastatin), and the sugar transfer enzyme is UDP- separated in step 1 Glycosyltransferase E was used.
  • the standard reaction solution is prepared to have a total of 20 ml, and the reaction solution composition is 50 mM Tris-Cl (pH) as follows. 8.0), donor substrate (2 mM UDP-glucose), acceptor substrate (acceptor substrate) (0.5 mg / ml), 1 mM MgCl 2 , 5% DMSO, was configured to contain the enzyme solution. The reaction mixture was reacted at 30 ° C. for 16 hours and subjected to HPLC analysis.
  • 17-dimethoxy-reblastatin which is a compound represented by Formula 2 (Examples 1 and 5), which is a substrate, in the presence of UDP-glucose (glucosyl group molecular weight: 180) (Molecular weight: 518) and the molecular weight of the compound produced by the sugar transfer reaction of UDP-glucosyltransferase (BL-E and BL-C) were 680 ( m / z 679 [M ⁇ H] ⁇ , m / z 725 [ M + HCOOH] ⁇ , m / z 698 [M + H 2 O] + ) (see FIG. 14). From this, it can be seen that the hydroxyl group of 17-dimethoxy-levblastine, which is a compound represented by the formula (2), is glycosylated.
  • the molecular weight of 664 confirmed the molecular weight measurement result.
  • the molecular weight of the expected compound in which water was removed while adding the glucosyl group (glucosyl group molecular weight: 180) of the compound represented by Formula 3 according to the present invention was 664 ( m / z 663 [MH] ⁇ , m / z 709 [M + HCOOH] - ; m / z 682 [M + H 2 O] + ), since the molecular weight is the same as the calculated value and the measured value, it can be seen that an anamycin derivative is glycosylated.
  • ansamycin glycoside derived from the ansamycin derivative represented by Formula 3 may be characterized by mass fragmentation of ansamycin-based compound, that is, a carbamoyl moiety (CONH 2 molecular weight of 43) in MS 2 . Reduced molecular weight) was also confirmed (see FIG. 15).
  • the glycotransferase derived from Bacillus licheniformis can prepare ansamycin-based glycosides including geldanamycin in a simple process, such as antibiotics, antifungal agents, antiviral agents, immunosuppressants, It can be usefully used as a neurodegenerative agent, anti-inflammatory agent or anticancer agent.
  • preparative HPLC Waters Delta Prep 3000 system, Waters, USA; [YMC-Jsphere ODS-H80 250 ⁇ 10
  • the purified compound is ansamycin containing a glucosyl group
  • specific rotaion was measured using DIP-370 pollimeter (JASCO, Japan), and UV-1601 spectrophotometer ( Shimadzu, Japan) was used to measure the UV.
  • the compound was commissioned by the Korea Basic Science Institute, HRESI-MS was measured, and as a result, the compound represented by the following formula (6) was confirmed.
  • ansamycin derivative represented by the formula (4) is converted to an anamycin glycoside in which a glucosyl group is introduced into the hydroxyl group of the ansamycin derivative.
  • glycotransferase derived from Bacillus licheniformis can prepare ansamycin glycoside in a simple process, antibiotics, antifungal agents, antiviral agents, immunosuppressants, degenerative neuropathy agents, anti-inflammatory agents or It can be usefully used as an anticancer agent.
  • the compound represented by Formula 8 to Formula 10 was subjected to a sugar transfer reaction with a UDP-glycosyltransferase enzyme. After the reaction was terminated, the reaction solution was first extracted with ethyl acetate (EtOAc), and the water layer was dried in a freeze dryer for 24 hours, and then dissolved in a small amount of methanol.
  • EtOAc ethyl acetate
  • the non-benzoquinone geldanamycin derivatives represented by Formulas 8 to 10 are non-benzoquinone geldanamycin glycosides in which a glucosyl group is introduced into the hydroxy group of the non-benzoquinone geldanamycin derivative. It can be seen that the conversion to.
  • the glycotransferase derived from Bacillus licheniformis can prepare non-benzoquinone geldanamycin glycoside in a simple process, antibiotics, antifungal agents, antiviral agents, immunosuppressants, degenerative nerves It can be usefully used as a disease agent, anti-inflammatory agent or anticancer agent.
  • An anzamycin compound represented by Formula 4 was subjected to a sugar transfer reaction using an UDP-glycosyltransferase enzyme.
  • HPLC analysis of the degree of the compound moving to the water layer and the solvent layer by extracting the ansamycin compound and the glycosylated ansamycin compound present in the reaction mixture after completion of the reaction with an ethyl acetate (EtOAc) solvent It was confirmed by the method, and the results are shown in FIG.
  • the glycotransferase derived from Bacillus licheniformis is suitable for preparing ansamycin glycosides, and the resulting glycosides have excellent solubility, which is advantageous for medical use.
  • the glucosidase (glycosidase) is converted to the original active structure, it can be usefully used as an antibiotic, antifungal, antiviral, immunosuppressive, degenerative neuropathy, anti-inflammatory or anticancer.
  • the non-benzoquinone geldanamycin compound represented by Chemical Formula 8 was subjected to a sugar transfer reaction with a UDP-glycosyltransferase enzyme.
  • a UDP-glycosyltransferase enzyme e.g., UDP-glycosyltransferase enzyme
  • the non-benzoquinone geldanamycin compound and the glycosylated non-benzoquinone geldanamycin compound present in the reaction mixture after the reaction is terminated are extracted with an ethyl acetate (EtOAc) solvent to form a water layer and a solvent.
  • EtOAc ethyl acetate
  • the glycotransferase derived from Bacillus licheniformis is suitable for preparing non-benzoquinone geldanamycin glycoside, and the resulting glycoside has excellent solubility, It is advantageous for medical use and is converted into the original active structure by glucosidase in the in vivo absorbent organ, so it can be usefully used as an antibiotic, antifungal agent, antiviral agent, immunosuppressive agent, degenerative neurological disease agent, anti-inflammatory agent or anticancer agent.
  • Hsp90 heat shock protein
  • E. coli was obtained by centrifugation (3500 rpm, 30 minutes), and then E. coli was suspended in 3 ml of buffer (100 mM Tris-HCl, 20 mM KCl, 6 mM MgCl 2 , imidazole 10 mM, pH7.4). It was. E. coli cells were ground using an ultrasonic mill, followed by centrifugation (15,000 rpm, 30 minutes), and the grinding solution was subjected to SDS-PAGE to confirm protein production. The ground supernatant was mixed with 0.5 ml of Ni-NTA resin in an empty column and gently shaken at 4 ° C. for 60 minutes, followed by 3 ml of wash buffer (100 mM Tris-HCl, 20 mM).
  • Step 2 Determination of ATPase Inhibitory Activity of Heat Shock Protein
  • the thermal shock protein (Hsp90) of the purified and purified yeast was measured by an already known method (B. Panaretou, C. Prodromou, SM Roe, R. O'Brien, JE Ladbury, PW Piper, LH Pearl). , EMBO J. 1998, 17 (16), 4829-4836 .; Rowlands, MG, Newbatt, YM, Prodromou, C., Pearl, LH, Workman, P. and Aherne, W. Anal.Biochem. 2004. 327,176- 183).
  • the protein was dialyzed in reaction buffer (100 mM Tris-HCl, 20 mM KCl, 6 mM MgCl 2 , pH 7.4) and used at a final concentration of 0.3 mg / ml, and the malachite green reaction solution was prepared by a known method (malachite).
  • green (0.0812%, w / v)
  • polyvinyl alcohol 2.32%, w / v; dissolves with difficulty and requires heating
  • ammonium molybdate 5.72%, w / v, in 6 M HCl
  • water in the ratio 2 : 1: 1: 2).
  • reaction buffer 100 mM Tris-HCl, 20 mM KCl, 6 mM MgCl 2 , pH 7.4
  • 10 ⁇ l of 2.5 mM ATP After shaking for 1 minute, the reaction solution was reacted for 3 hours at 37 °C, 80 ⁇ l of malachite
  • the reaction solution is added, and 10 ⁇ l of 34% sodium citrate is added thereto, and the reaction is stopped after 15 minutes at room temperature.
  • the reaction solution was measured for absorbance at a wavelength of 620 nm using a UV spectrum analyzer to calculate the ATPase inhibition IC 50 value. The results are shown in Table 2 below.
  • the non-benzoquinone geldanamycin glycoside according to the present invention is 0.75 ⁇ M for the compound represented by Formula 11 prepared in Example 7 with ATPase inhibitory activity (IC 50 ), in Example 8
  • IC 50 ATPase inhibitory activity
  • Example 8 In the case of the compound represented by Formula 14, 2.14 ⁇ M showed better ATPase inhibitory activity than the geldanamycin of Comparative Example 1, which is conventionally used as a therapeutic agent.
  • the non-benzoquinone geldanamycin glycoside compound according to the present invention exhibits similar ATPase inhibitory activity as compared to the compound originally used as a substrate.
  • the non-benzoquinone geldanamycin glycoside according to the present invention has an excellent effect of inhibiting the ATPase activity of the heat shock protein, and is useful as an anticancer agent, an antifungal agent, an antiviral agent, an immunosuppressive agent, a degenerative neuropathy agent, an anti-inflammatory agent, and the like. Can be used.
  • SK-Br3 cell line is an overexpression of ErbB2 (kinase, cancer kinase), a substrate protein of Hsp90 protein, and is widely used as an anti-cancer activity evaluation cell line for a conventional geldanamycin derivative.
  • the cancer cell lines were dispensed with 10 4 cancer cells per well into each 96-well plate, incubated at 5% CO 2 , 37 ° C. for 24 hours, and then in 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0.00001, the compound represented by the formula (11) obtained in Example 6 for each concentration of 0 ⁇ M and the compound represented by the formula (8) as a comparative example (Korean Patent Nos.
  • the ratio according to the present invention, but benzoquinone geldanamycin glycosides is found to be lower IC 50 value than that of the compound of formula (VI) that are known to have anticancer activity in conventional in breast cancer cell lines, IC 50 value Since this is excellent, it can be usefully used for anticancer drugs.
  • the cells were ultrasonically pulverized to obtain a pulverized product, and the pulverized product was quantified by BCA method.
  • About 50 ⁇ g of protein was loaded on SDS-PAGE and subjected to immunoblotting for ⁇ -actin with Her2, Akt, c-Raf and controls. The results are shown in FIG. 19.

Abstract

본 발명은 당전이 효소를 이용한 안사마이신 배당체 또는 안사마이신 골격을 갖는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체의 제조방법, 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체 및 이를 유효성분으로 함유하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 안사마이신 또는 안사마이신 골격을 갖는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 화합물에 글루코실기를 도입함으로써, 용해도가 상승하고, 생체 내 이용률을 높일 수 있으며, 안사마이신계 화합물의 활성을 유지하므로 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 면역억제제, 퇴행성 신경질환제, 항염증제 또는 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

당전이 효소를 이용한 안사마이신 배당체의 제조방법
본 발명은 당전이 효소를 이용한 안사마이신 배당체 또는 안사마이신 골격을 갖는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체의 제조방법, 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체 및 이를 유효성분으로 함유하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
생물전환 당전이 반응기술은 특별한 구조와 기능을 가진 의약용 배당체 라이브러리를 개발하기 위하여 글리코실기 전달 능력이 있는 효소(Glycosyltransferase)를 이용되고 있다. 이 기술은 탄수화물 공여체로부터 단당 이상의 탄수화물을 수용체(어글리콘 혹은 글리콘)의 free OH기에 전달하는 기술로, 이는 글리코믹스와 글리코제네틱스의 핵심 기반 기술이다. 또한 배당체의 구조 결정 및 기능성 연구 정보는 디자인된 구조와 기능의 소재를 효율적인 생물공학적 합성방법을 이용하여 가능하게 한다.
상기 글리코믹스(Glycomics)는 탄수화물의 구조와 생리 기능을 연구하는 분야로, 게놈의 산물인 단백질들의 기능과 관련된 자연적·인위적인 탄수화물의 기능과 특성을 활용하는 분야인 글리코제네틱스와 더불어 학문적으로는 식품과학, 의학, 당질생물학의 근간이 되고 차세대 생명, 생물 산업의 핵심 지식을 제공하며 중요한 기본 출발 물질을 제공하는 한편, 의약품 등 고도의 정밀 화학 물질을 생산할 수 있는 잠재력을 내포하고 있다.
화학합성 기술은 고온·고압의 반응 조건을 필요로 위험성이 높고 중금속 촉매와 유기용매의 사용으로 인한 공해가 발생할 수 있으며, 발효기술은 복잡한 대사체계로 유전공학기술 도입의 한계가 있고, 대규모 장치를 사용하는 산업이므로 중국 등과의 국제경쟁력에서 한계가 있다. 그러나 효소를 이용한 생물전환 공정 기술은 반응에 있어 고도의 정밀성, 특이성, 선택성을 지니고, 소규모의 장치로도 생산이 가능하고, 유전공학 기술의 적용이 가능하며, 환경친화적인 장점을 가지고 있는 High-Tech 산업이므로 화학공업을 대체할 기술로 발전이 기대되는 기술이다(비특허문헌 1).
당전이 효소는 단백질, 지방, 탄수화물 폴리머와 천연물과 같은 수용체(acceptor)에 활성화된 당 공여체(activated sugar donor)로부터 당 모핵(sugar moiety)을 전이하는 효소이다. 이 효소들은 당 공여체(sugar-donor)와 수용체(acceptor)에 따라 다양한 특이성을 나타내며 진핵세포와 원핵세포 모두에서 다양한 종류의 당전이 효소들이 발견된다.
CAZy 데이터베이스에 따르면 당전이 효소는 서열에 따라서 93개의 과(family)로 분류되고 15000종 이상이 알려져 있다.
이와 관련하여 종래에 루코노스톡 메센테로이드 B-512FMCM(Leuconostoc mesenteroides B-512FMCM)으로부터 얻어진 글루칸수크라제 효소를 이용한 당화 반응이 공지되어 있으며(특허문헌 1), 또한, 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) NRRL B-1299 균주로부터 얻어진 글루칸수크라아제와 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) NRRL B-512 균주로부터 얻어진 레반수크라아제를 이용한 당화 반응이 공지되어 있다(특허문헌 2).
안사마이신(ansamycin)계 항생제에는 젤다나마이신(geldanamycin), 허비마이신(herbimycin), 멕벡신(macbecin), 레브라스타틴(reblastatin), 리파마이신(rifamycin) 및 안사마이토신(ansamitocin) 등이 있는데 이들은 3-아미노-5-하이드록시벤조산(AHBA)을 최초 전구체로 이용하여 생합성 되는 폴리케타이드(polyketide) 골격을 가진 핸들 모양의 화학 구조를 포함한 화합물이다. 이런 부류의 화합물들의 생합성은 상기와 같이 AHBA를 출발 단위로 하여, 아세테이트, 프로피오네이트 및 글리콜레이트와 같은 골격연장 전구체의 연속적 부가에 의해 폴리케타이드 기본 골격을 형성한 후에, 기본골격을 수식하는 부가적인 반응을 거쳐서 생합성된다. 상기 화합물들은 1970년에서 2000년 사이에 항생제(비특허문헌 2), 항진균제(비특허문헌 3), 항바이러스제(비특허문헌 4), 면역억제제(비특허문헌 5), 퇴행성 신경질환제(비특허문헌 6), 항염증제(비특허문헌 7) 및 항암제로서 그 기능이 확인되었다(비특허문헌 8).
안사마이신계 화합물 중에서 벤조퀴논(benzoquinone) 구조의 허비마이신, 멕벡신, 레브라스타틴 및 젤다나마이신은 샤페론단백질(protein chaperone) 활성을 가진 열충격 단백질 90(Heat shock protein 90; Hsp90)을 억제하는 것으로 알려져 있고, 특히 젤다나마이신은 Hsp90 단백질의 아미노 말단의 ATP(adenosine triphosphate) 결합자리에 결합하여, 상기 Hsp 90이 안정화에 기여하는 여러 가지 암 발생 단백질의 기능을 억제함으로서 항암 활성을 나타내는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 9).
Hsp90의 생리적 중요성 때문에 젤다나마이신의 화학합성 유도체인 17-알릴아미노-데메톡시젤다나마이신(17-allyamino- demethoxy geldanamycin, 17-AAG) 및 17-디메틸아미노에틸아미노-17-디메톡시젤다나마이신(17-(dimethylaminoethylamino)-17-demethoxygeldanamycin, 17-DMAG)과 같은 Hsp90 활성저해제가 항암제로서 개발되고 있다.
이와 관련하여 안사마이신계 화합물인 신규한 젤다나마이신 유도체 및 그 제조방법이 공지되어 있고(특허문헌 3), 17-알릴 아미노 젤다나마이신 및 기타 안사마이신에 대한 화학합성을 이용한 제조방법이 공지되어 있으나(특허문헌 4), 상기 벤조퀴논 형태의 젤다나마이신 유도체들의 임상 시험결과 높은 간독성 등의 문제점이 있다.
이에 상기 문제점을 해결하기 위해서 재조합 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변이주로부터 신규한 젤다나마이신 유도체 및 그 제조방법이 개발되었으나(특허문헌 5 및 6), 상기 젤다나마이신의 유도체 또한 낮은 용해도의 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 연구하던 중, 유사한 골격을 갖는 안사마이신 또는 비-벤조퀴논 형태의 젤다나마이신 화합물에 글루코실기를 도입하여 배당체를 제조하고, 이들 배당체들의 용해도가 상승하고, 생체 내 이용률을 높일 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 안사마이신 배당체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 안사마이신 골격을 갖는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 열충격 단백질의 에이티피아제(ATPase) 활성 저해용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 당전이 효소와, 기질로써 하기 화학식 1로 표시되는 안사마이신 화합물에 당전이 반응을 수행하여 이의 배당체를 제조하는 단계를 포함하는 용해도가 증가된 안사마이신 배당체의 제조방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2012008560-appb-I000001
(상기 화학식 1에서, R은 본 명세서에서 정의한 바와 같다).
또한, 본 발명은 당전이 효소와, 기질로써 하기 화학식 7로 표시되는, 안사마이신 골격을 갖는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 화합물에 당전이 반응을 수행하여 이의 배당체를 제조하는 단계를 포함하는 용해도가 증가된 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체의 제조방법을 제공한다.
[화학식 7]
Figure PCTKR2012008560-appb-I000002
(상기 화학식 7에서, R1은 본 명세서에서 정의한 바와 같다).
나아가, 본 발명은 상기 화학식 7로 표시되는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 화합물로부터 얻어지는 화학식 11 내지 화학식 15로 표시되는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 11]
Figure PCTKR2012008560-appb-I000003
[화학식 12]
Figure PCTKR2012008560-appb-I000004
[화학식 13]
Figure PCTKR2012008560-appb-I000005
[화학식 14]
Figure PCTKR2012008560-appb-I000006
[화학식 15]
Figure PCTKR2012008560-appb-I000007
나아가, 본 발명은 상기 화학식 7로 표시되는 비-벤조퀴논 화합물로부터 얻어지는 상기 화학식 11 내지 화학식 15 중 1 이상의 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 열충격 단백질의 에이티피아제(ATPase) 활성 저해용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 7로 표시되는 비-벤조퀴논 화합물로부터 얻어지는 상기 화학식 11 내지 화학식 15 중 1 이상의 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 안사마이신 또는 안사마이신 골격을 갖는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 화합물에 글루코실기를 도입함으로써, 용해도가 상승하고, 생체 내 이용률을 높일 수 있으며, 안사마이신계 화합물의 활성을 유지하므로 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 면역억제제, 퇴행성 신경질환제, 항염증제 또는 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1 내지 4에서 사용된 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C의 Ni-NTA 아가로스 담체 크로마토그래피를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예 5 내지 6에서 사용된 UDP-글리코실트랜스퍼라제 E의 Ni-NTA 아가로스 담체 크로마토그래피를 나타내는 도면이다.
*도 3은 실시예 1에서 사용된 당전이 효소, 반응기질, 및 이들을 혼합하여 반응시킨 반응혼합물의 HPLC 결과를 나타내는 도면이다
도 4는 실시예 2에서 사용된 당전이 효소, 반응기질, 및 이들을 혼합하여 반응시킨 반응혼합물의 HPLC 결과를 나타내는 도면이다
도 5는 실시예 3에서 사용된 당전이 효소, 반응기질, 및 이들을 혼합하여 반응시킨 반응혼합물의 HPLC 결과를 나타내는 도면이다
도 6은 실시예 4에서 사용된 당전이 효소, 반응기질, 및 이들을 혼합하여 반응시킨 반응혼합물의 HPLC 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 실시예 5에서 사용된 당전이 효소, 반응기질, 및 이들을 혼합하여 반응시킨 반응혼합물의 HPLC 결과를 나타내는 도면이다
도 8은 실시예 6에서 사용된 당전이 효소, 반응기질, 및 이들을 혼합하여 반응시킨 반응혼합물의 HPLC 결과를 나타내는 도면이다
도 9는 본 발명의 실시예 7의 화학식 11로 표시되는 화합물의 LC/MS 분석 데이터를 나타내는 도면이다.(A): 정제된 화합물의 LC/MS 스펙트럼, B): 화합물의 MS 측정결과, C): 화합물 구조식).
도 10은 본 발명의 실시예 7의 화학식 12로 표시되는 화합물의 LC/MS 분석 데이터를 나타내는 도면이다(A): 정제된 화합물의 LC/MS 스펙트럼, B): 화합물의 MS 측정결과, C): 화합물 구조식).
도 11은 본 발명의 실시예 7의 화학식 13으로 표시되는 화합물의 LC/MS 분석 데이터를 나타내는 도면이다(A): 정제된 화합물의 LC/MS 스펙트럼, B): 화합물의 MS 측정결과, C): 화합물 구조식).
도 12는 본 발명의 실시예 8의 화학식 14로 표시되는 화합물의 LC/MS 분석 데이터를 나타내는 도면이다(A): 정제된 화합물의 LC/MS 스펙트럼, B): 화합물의 MS 측정결과, C): 화합물 구조식).
도 13은 본 발명의 실시예 9의 화학식 15로 표시되는 화합물의 LC/MS 분석 데이터를 나타내는 도면이다(A): 정제된 화합물의 LC/MS 스펙트럼, B): 화합물의 MS 측정결과, C): 화합물 구조식).
도 14는 본 발명의 화학식 2로 표시되는 화합물의 당화 유무에 대한 LC/MS 결과를 나타내는 도면이다(A) : 4.82분에서 배당체가 확인된 LC/MS 스펙트럼, B) : 4.88분에서 배당체가 확인된 LC/MS 스펙트럼, C) : 상기 A)에서 확인된 배당체의 MS 측정 결과, D) : 상기 B)에서 확인된 배당체의 MS 측정 결과).
도 15는 본 발명의 화학식 3으로 표시되는 화합물의 당화 유무에 대한 LC/MS 결과를 나타내는 도면이다(A) : 6.47분에서 배당체가 확인된 LC/MS 스펙트럼, B) : 6.50분에서 배당체가 확인된 LC/MS 스펙트럼, C) : 상기 A)에서 확인된 배당체의 MS 측정 결과, D) : 상기 B)에서 확인된 배당체의 MS 측정 결과).
도 16은 본 발명의 화학식 4로 표시되는 화합물의 당화 유무에 대한 LC/MS 결과를 나타내는 도면이다(A) : 3.97분, 4.60분, 및 4.83분에서 배당체가 확인된 LC/MS 스펙트럼, B) : 상기 A) 스펙트럼에서 3.97분에 확인된 배당체의 MS 측정 결과, C) : 상기 A) 스펙트럼에서 4.60분에 확인된 배당체의 MS 측정 결과, D) : 상기 A) 스펙트럼에서 4.83분에 확인된 배당체의 MS 측정 결과).
도 17은 본 발명의 실시예 2에 따른 화합물의 용해도를 비교하기 위한 HPLC 분석 데이터를 나타내는 도면이다(A) : 반응 혼합물의 HPLC 결과를 나타내는 도면, B) : 물층의 HPLC 결과를 나타내는 도면, C) : 유기층의 HPLC 결과를 나타내는 도면).
도 18은 본 발명의 실시예 7에 따른 화합물의 용해도를 비교하기 위한 HPLC 분석 데이터를 나타내는 도면이다(A) : 반응 혼합물의 HPLC 결과를 나타내는 도면, B) : 물층의 HPLC 결과를 나타내는 도면, C) : 유기층의 HPLC 결과를 나타내는 도면).
도 19는 본 발명의 화학식 8 및 화학식 11로 표시되는 화합물의 열충격 단백질의 발현 저해 효과를 측정한 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 기질로써 하기 화학식 1로 표시되는 안사마이신 화합물을 당전이 효소와 당전이 반응시켜 하기 화학식 1의 화합물에 글리코실기가 도입된, 화학식 1의 화합물로부터 얻어지는 용해도가 증가된 배당체의 제조방법을 제공한다.
화학식 1
Figure PCTKR2012008560-appb-C000001
(상기 화학식 1에서, R은 비치환 또는 하이드록시기이고,
Figure PCTKR2012008560-appb-I000008
은 단일결합 또는 이중결합이다).
또한, 본 발명은 분리된 당전이 효소와, 기질로써 하기 화학식 7로 표시되는, 안사마이신 골격을 갖는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 화합물의 당전이 반응을 수행하여 하기 화학식 7의 화합물에 글리코실기가 도입된, 화학식 7의 화합물로부터 얻어지는 용해도가 증가된 배당체의 제조방법을 제공한다.
[화학식 7]
Figure PCTKR2012008560-appb-I000009
(상기 화학식 7에서, R1은 비치환 또는 하이드록시기이고,
Figure PCTKR2012008560-appb-I000010
은 단일결합 또는 이중결합이다).
본 발명에 따른 배당체의 제조방법은 당전이 효소를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 당전이 효소는 대장균 바실러스 리체포르미스(Bacillus licheniformis)로부터 유래한 UDP-당전이 효소이다.
구체적으로, 상기 당전이 효소는 바실러스 리체포르미스(Bacillus licheniformis)에서 유래한 당전이 효소 유전자를 확보하여 대장균에서 과발현시킨 후, 과발현된 대장균 균체를 초음파로 파쇄하고 니켈-NTA(Nitrilotriacetic acid) 친화성 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분리하여 사용할 수 있다.
상기 바실러스 리체포르미스(Bacillus licheniformis)로부터 분리된 UDP-당전이 효소는 UDP-글루코실트랜스퍼라제 C(uridine diphosphate-glucosyltransferase C) 또는 UDP-글루코실트랜스퍼라제 E(uridine diphosphate-glucosyltransferase E)이고, 본 발명에서 당전이 효소로 사용될 수 있다.
상기 당전이 반응은 상기 당전이 효소와 UDP-글루코즈를 첨가하여 수행될 수 있다. 상기 당전이 효소는 UDP-글루코즈의 글루코실기를 안사마이신 또는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 유도체로 전이시키는 역할을 수행할 수 있다.
또한, 상기 당전이 반응은 25-35 ℃에서 수행될 수 있다.
상기 범위를 벗어나는 경우, 반응 전환율이 감소될 수 있는 문제점이 있다.
나아가, 상기 당전이 반응은 10-20시간 동안 수행될 수 있다.
상기 범위를 벗어나는 경우, 짧은 반응 시간은 반응 전환율이 감소될 수 있고 더 긴 반응 시간은 효소의 안정성이 감소되므로 활성이 감소될 수 있는 문제점이 있다.
또한, 상기 당전이 반응은 pH 6.0-9.0의 환경에서 수행될 수 있다.
상기 범위를 벗어나는 경우, 반응 전환율이 감소될 수 있는 문제점이 있다.
나아가, 상기 제조방법에서 사용가능한, 화학식 1로 표시되는 안사마이신 화합물은 하기 화학식 2 내지 화학식 5로 표시되는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종이다.
화학식 2
Figure PCTKR2012008560-appb-C000002
화학식 3
Figure PCTKR2012008560-appb-C000003
화학식 4
Figure PCTKR2012008560-appb-C000004
화학식 5
Figure PCTKR2012008560-appb-C000005
또한, 상기 제조방법에서 사용가능한, 화학식 7로 표시되는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 화합물은 하기 화학식 8 내지 화학식 10으로 표시되는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종이다.
화학식 8
Figure PCTKR2012008560-appb-C000006
화학식 9
Figure PCTKR2012008560-appb-C000007
화학식 10
Figure PCTKR2012008560-appb-C000008
나아가, 본 발명은 하기 화학식 11 내지 화학식 15로 표시되는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
화학식 11
Figure PCTKR2012008560-appb-C000009
화학식 12
Figure PCTKR2012008560-appb-C000010
화학식 13
Figure PCTKR2012008560-appb-C000011
화학식 14
Figure PCTKR2012008560-appb-C000012
화학식 15
Figure PCTKR2012008560-appb-C000013
본 발명은 상기 화학식 11 내지 화학식 15로 표시되는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체뿐만 아니라, 이의 약학적으로 허용되는 염, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 라세미체, 또는 입체이성질체를 모두 포함한다.
본 발명의 화학식 11 내지 화학식 15로 표시되는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 11 내지 화학식 15로 표시되는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체를 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다.
동량의 화학식 11 내지 화학식 15로 표시되는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체 및 산 수용액 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조하거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비 용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다.
상기 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체는 용해도가 증가하고(실험예 5 참조), 열충격 단백질 에이티피아제 저해 활성이 증가(실험예 6 참조)하는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 열충격 단백질의 에이티피아제(ATPase) 활성 저해용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체는 열충격 단백질의 에이티피아제(ATPase) 저해 활성(IC50)이 실시예 7의 화학식 11로 표시되는 화합물의 경우 0.75 μM, 실시예 8의 화학식 14로 표시되는 화합물의 경우 2.14 μM로서 종래 비-벤조퀴논 젤다나마이신보다 우수한 ATPase 저해활성을 나타내었다. 특히, 당화된 화합물이 원래 기질로 사용한 비-벤조퀴논 젤다나마이신 유도체에 비해 유사한 ATPase 저해활성을 나타내는 것으로 확인되었다(실험예 4 참조).
이에, 상기 약학적 조성물은 열충격 단백질의 에이티피아제(ATPase) 활성을 저해함으로서, 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 면역억제제, 퇴행성 신경 질환 치료제 또는 항염증제로 사용될 수 있다.
나아가, 본 발명은 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체는 유방암 세포주에서 비교예로 종래에 항암 효과가 있는 것으로 알려진 화학식 8으로 표시되는 화합물보다 IC50값이 낮은 것으로 확인되었으나, IC50값이 우수하므로 항암제에 유용하게 사용될 수 있다(실험예 7 참조).
상기 암 질환은 유방암, 간암, 위암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 또는 중추신경계 종양이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시한 것일 뿐, 이에 한정하지 않는다.
<실시예 1> 안사마이신계 배당체의 제조-1
단계 1: 당전이 효소의 분리
본 발명에 따른 글리코실트랜스퍼라제의 유전자를 확보하기 위하여 (WWW.CAZY.org)의 family 1 에 해당하는 다양한 생물(Bacillus, pseudomonas, Anabena 등) 유래의 약 20여 종의 글리코실트랜스퍼라제 유전자를 선별하여 발현벡터에 클로닝한 후, 발현과 활성을 확인하였다.
그 중, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 유래의 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C(accession number, AAU40842)를 확보하였다. 상기 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C의 유전자는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)의 제노믹 DNA로부터 PCR을 수행하여 확보하였다.
확보된 유전자는 발현 벡터인 pET302/NT-his의 클로닝한 후 E coli에서 과발현하였다. 과발현된 단백질의 양은 총 대장균 단백질 양의 5% 이상이었고 안정된 수용성 형태로 얻을 수 있었다. 바실러스 리체니포르미스(Bacilluslicheniformis)로부터 유래한 당전이 효소인 UDP-당전이효소(glycosyltransferase)(BL-C)를 발현하는 대장균에서 히스티딘이 표지된(His-tagged) 효소를 니켈-NTA 친화성 컬럼 크로마토그래피를 통해 분리하였다. 단백질의 과생산은 과발현 플라스미드(plasmid)를 가진 대장균 BL21 (DE3)을 50 ㎍/㎖ 농도의 카나마이신(kanamycin)과 클로람페니콜(chloramphenicol)을 포함하는 5 ㎖ LB(Luria-Bertani) 액체 배지에서 약 17시간 동안 배양하였다. 이를 30 ㎖의 새로운 LB 배지를 사용하여 1/60 희석하였고, 이를 2-3시간 더 배양하여 UV 스펙트럼 600 ㎚에서 OD(optical density)값이 약 0.5-0.6이 되도록 하였다. 이때 10분간 얼음에 두었다가 이소프로필 β-D-티오글루코피라노시드(isopropyl β-D-thioglucopyranoside, IPTG)를 최종 농도가 1 mM이 되도록 첨가하여 과발현을 유도하고 20 ℃에서 17시간을 더 배양하였다. 이렇게 배양된 대장균을 원심분리(3500 rpm, 30분)하여 수득한 후, 완충액(100 mM Sodium phosphate solution (pH7.4), 20 mM KCl, 6 mM MgCl2, 10 mM imidazole) 3 ㎖에 대장균을 현탁하였다. 초음파 분쇄기를 이용하여 대장균 세포를 분쇄한 후, 원심분리(15,000 rpm, 30분)하고 상기 분쇄액을 SDS-PAGE하여 단백질 생산을 확인하였다. 상기 분쇄 상층액은 빈 컬럼(column)에 0.5 ㎖의 Ni-NTA 레진(resin)과 섞어 4 ℃에서 60분간 부드럽게 흔들어 준 후, 3 ㎖의 세척 완충액(wash buffer; 100 mM Sodium phosphate solution (pH7.4), 20 mM KCl, 6 mM MgCl2, 20 mM imidazole)을 세 번 처리하고, 마지막으로 용출 완충액(Elution buffer; 100 mM Sodium phosphate solution (pH7.4), 20 mM KCl, 6 mM MgCl2, 250 mM imidazole)을 0.5 ㎖씩 다섯 번 처리한 후, 각각의 분획을 SDS-PAGE로 확인하여 당전이 효소가 분리되었음을 확인하였다(도 1 참조).
단계 2: 안사마이신계 화합물의 배당체 제조
상기 단계 1에서 분리된 당전이 효소의 기질로서, 하기 화학식 2로 표시되는 벤젠고리를 가진 화합물(17-디메톡시-레블라스타틴)을 사용하고, 당전이 효소는 상기 단계 1에서 분리된 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C를 사용하였다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2012008560-appb-I000011
먼저, 상기 단계 1에서 분리된 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C 효소액의 당전이 반응을 수행하기 위해 표준 반응액이 총 20 ㎖이 되도록 준비하고, 반응액 조성은 다음과 같이 50 mM Tris-Cl(pH 8.0), 공여 기질(donor substrate)(2 mM UDP-glucose), 수용 기질(acceptor substrate)(0.5 mg/ml), 1 mM MgCl2, 5% DMSO, 효소 용액이 포함되도록 조성하였다. 반응 혼합액은 30℃에서 16시간 반응시키고 HPLC 분석을 수행하였다.
이때, 컬럼은 조박스 이클립스(ZORBAX Eclipse) XDB-C18(4.6×150, 5 ㎛, Agilent)를 사용하였고, 이동상(mobile phase)으로는 0.01% (v/v) TFA(A 버퍼)와 아세토니트릴(B 버퍼)을 사용하였다. 유속은 1 ㎖/min을 사용하였고 흡광도 290 nm에서 반응의 진행을 측정하였다. 그 결과를 하기 도 3에 나타내었으며, 안사마이신 유도체에서 안사마이신 배당체로의 전환율은 65%로 확인되었다.
<실시예 2> 안사마이신계 배당체의 제조-2
상기 실시예 1의 단계 2에서 당전이 효소의 기질로서, 상기 화학식 2로 표시되는 벤젠고리를 가진 화합물(17-디메톡시-레블라스타틴) 대신에 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법을 수행하였다. 그 결과를 하기 도 4에 나타내었으며, 안사마이신 유도체에서 안사마이신 배당체로의 전환율은 45%로 확인되었다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2012008560-appb-I000012
<실시예 3> 안사마이신계 배당체의 제조-3
상기 실시예 1의 단계 2에서 당전이 효소의 기질로서, 상기 화학식 2로 표시되는 벤젠고리를 가진 화합물(17-디메톡시-레블라스타틴) 대신에 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법을 수행하였다. 그 결과를 하기 도 5에 나타내었으며, 안사마이신 유도체에서 안사마이신 배당체로의 전환율은 95%로 확인되었다.
[화학식 4]
Figure PCTKR2012008560-appb-I000013
<실시예 4> 안사마이신계 배당체의 제조-4
상기 실시예 1의 단계 2에서 당전이 효소의 기질로서, 상기 화학식 2로 표시되는 벤젠고리를 가진 화합물(17-디메톡시-레블라스타틴) 대신에 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법을 수행하였다. 그 결과를 하기 도 6에 나타내었으며, 안사마이신 유도체에서 안사마이신 배당체로의 전환율은 58%로 확인되었다.
[화학식 5]
Figure PCTKR2012008560-appb-I000014
<실시예 5> 안사마이신계 배당체의 제조-5
단계 1: 당전이 효소의 확보
상기 실시예 1의 단계 1과 동일한 방법을 수행하여 UDP-글리코실트랜스퍼라제 E(accession number, AAU39773)를 얻었다(도 2 참조).
단계 2: 안사마이신계 화합물의 배당체 제조-5
상기 단계 1에서 분리된 당전이 효소의 기질로서, 하기 화학식 2로 표시되는 벤젠고리를 가진 화합물(17-디메톡시-레블라스타틴)을 사용하고, 당전이 효소는 상기 단계 1에서 분리된 UDP-글리코실트랜스퍼라제 E를 사용하였다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2012008560-appb-I000015
먼저, 상기 단계 1에서 분리된 UDP-글리코실트랜스퍼라제 E 효소액의 당전이 반응을 수행하기 위해 표준 반응액이 총 20 ㎖이 되도록 준비하고, 반응액 조성은 다음과 같이 50 mM Tris-Cl(pH 8.0), 공여 기질(donor substrate)(2 mM UDP-glucose), 수용 기질(acceptor substrate)(0.5 mg/ml), 1 mM MgCl2, 5% DMSO, 효소 용액이 포함 되도록 조성하였다. 반응 혼합액은 30℃에서 16시간 반응시키고 HPLC 분석을 수행하였다.
이때, 컬럼은 조박스 이클립스(ZORBAX Eclipse) XDB-C18(4.6×150, 5 ㎛, Agilent)를 사용하였고, 이동상(mobile phase)으로는 0.01% (v/v) TFA(A 버퍼)와 아세토니트릴(B 버퍼)을 사용하였다. 유속은 1 ㎖/min을 사용하였고 흡광도 290 nm에서 반응의 진행을 측정하였다. 그 결과를 하기 도 7에 나타내었으며, 안사마이신 유도체에서 안사마이신 배당체로의 전환율은 72%로 확인되었다.
<실시예 6> 안사마이신 배당체의 제조-6
상기 실시예 5의 단계 2에서 당전이 효소의 기질로서, 화학식 2로 표시되는 벤젠고리를 가진 화합물(17-디메톡시-레블라스타틴) 대신에 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법을 수행하였다. 그 결과, 하기 도 8에 나타내었으며, 안사마이신 유도체에서 안사마이신 배당체로의 전환율은 22%로 확인되었다.
[화학식 4]
Figure PCTKR2012008560-appb-I000016
<실시예 7> 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체의 제조-1
상기 실시예 1의 단계 2에서 당전이 효소의 기질로서, 상기 화학식 2로 표시되는 벤젠고리를 가진 화합물(17-디메톡시-레블라스타틴) 대신에 하기 화학식 8로 표시되는 화합물을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법을 수행하였다. 그 결과, 비-벤조퀴논 젤다나마이신 유도체에서 백색 분말의 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체(화학식 11: 20 mg, 화학식 12: 6.7mg, 화학식 13: 6.2mg)를 얻었으며, 도 9 내지 도 11에 나타내었다.
[화학식 8]
Figure PCTKR2012008560-appb-I000017
<실시예 8> 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체의 제조-2
상기 실시예 1의 단계 2에서 당전이 효소의 기질로서, 상기 화학식 2로 표시되는 벤젠고리를 가진 화합물(17-디메톡시-레블라스타틴) 대신에 하기 화학식 9로 표시되는 화합물을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법을 수행하였다. 그 결과, 비-벤조퀴논 젤다나마이신 유도체에서 백색 분말의 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체(6.7 mg)를 얻었으며, 도 12에 나타내었다.
[화학식 9]
Figure PCTKR2012008560-appb-I000018
<실시예 9> 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체의 제조-3
상기 실시예 1의 단계 2에서 당전이 효소의 기질로서, 상기 화학식 2로 표시되는 벤젠고리를 가진 화합물(17-디메톡시-레블라스타틴) 대신에 하기 화학식 10으로 표시되는 화합물을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법을 수행하였다. 그 결과, 비-벤조퀴논 젤다나마이신 유도체에서 백색 분말의 비-벤조퀴논 젤다나마이신배당체(6.2 mg)를 얻었으며, 도 13에 나타내었다.
[화학식 10]
Figure PCTKR2012008560-appb-I000019
<실험예 1> LC/MS를 이용한 안사마이신계 배당체의 확인-1
본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 상기 실시예 1 내지 실시예 3 및 실시예 5 내지 실시예 6의 배당체 화합물들의 글루코실기와의 결합여부를 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
*먼저, 효소반응을 동결 건조한 후, 건조 파우더를 최소 용량의 물에 녹인 후 메탄올로 추출한 후 분석하였다. 이때 분석 방법으로는 LC/MS로 Finnigan LCQ Advantage Max 매스 스펙트로포토메터(Thermo사, 미국)를 사용하고, 상기 LC/MS 분석에서 UPD-글루코스(glucose)가 첨가된 예상 화합물의 분자량 피크가 관찰되는지를 Xcalibur software(version 1.3 SP2, Thermo Electron) 프로그램을 이용하여 확인하였다. 그 결과를 하기 도 14 내지 16에 나타내었다.
결과
도 14에 나타낸 바와 같이, UDP-글루코즈(글루코실기 분자량: 180) 존재 하에서, 기질인 화학식 2로 표시되는 화합물(실시예 1 및 실시예 5)인 17-디메톡시-레블라스틴(demethoxy-reblastatin)(분자량: 518)과 UDP-글루코실트랜스퍼라제(BL-E와 BL-C)의 당전이 반응으로 인해 생성된 화합물의 분자량은 680(m/z 679 [M-H]-, m/z 725 [M+HCOOH]-; m/z 698 [M+H2O]+)인 것을 확인할 수 있다(도 14 참조). 이로부터, 화학식 2로 표시되는 화합물인 17-디메톡시-레블라스틴의 하이드록시기가 당화된 것을 알 수 있다.
또한, 도 15에 나타낸 바와 같이, 화학식 3으로 표시되는 화합물(실시예 2)의 경우, 664의 분자량이 분자량 측정결과 확인되었다. 본 발명에 따른 화학식 3으로 표시되는 화합물의 글루코실기(글루코실기 분자량: 180)가 첨가되면서 물이 제거된 예상 화합물의 분자량은 664(m/z 663 [M-H]-, m/z 709 [M+HCOOH]-; m/z 682 [M+H2O]+)으로, 분자량이 계산값과 측정값이 동일하므로, 안사마이신계 유도체가 당화된 것을 알 수 있다. 또한, 화학식 3으로 표시되는 안사마이신계 유도체에서 유래된 안사마이신계 배당체는 안사마이신계 화합물의 특징적인 메스 프레그멘데이션(Mass fragmentation), 즉, MS2에서 카바모일 잔기(CONH2의 분자량: 43)가 줄어든 분자량도 확인하였다(도 15 참조).
나아가, 도 16에 나타낸 바와 같이, 화학식 4로 표시되는 화합물(실시예 3 및 실시예 6)의 경우, LC/MS 분석 결과 당화된 것으로 추정되는 피크(peak)가 3가지 발견되었다. 특히, 4.99분 위치의 피크로 당화된 분자량(분자량: 680)을 가진 화합물(m/z 679 [M-H]- m/z 725 [M+HCOOH]-), 4.58분 위치의 피크로 나타나는 당화된 분자량(분자량: 680)을 가진 화합물(m/z 725 [M+HCOOH]-), 및 3.87분 위치의 피크로 나타나는 당화된 분자량(분자량: 842)을 가진 화합물(m/z 887 [M+HCOOH]-)로 확인되었다. 이들 중, 3.87분 위치의 피크 화합물은 글루코실기가 두 개 결합한 것을 알 수 있다(도 16 참조).
따라서, 본 발명에 있어서 바실러스 리체포르미스(Bacillus licheniformis)로부터 유래된 당전이 효소는 젤다나마이신을 포함하는 안사마이신계 배당체를 간단한 공정으로 제조할 수 있으므로, 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 면역억제제, 퇴행성 신경질환제, 항염증제 또는 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.
<실험예 2> LC/MS를 이용한 안사마이신계 배당체의 확인-2
본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 안사마이신 배당체의 구조를 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
상기 화학식 4로 표시되는 화합물을 UDP-글리코실트랜스퍼라제 효소로 당전이 반응을 수행하였다. 반응이 종결된 후, 상기 반응액을 일차적으로 에틸아세테이트(EtOAc)로 추출하고, 물층을 냉동건조기에서 24시간 건조한 후, 소량의 메탄올에 녹인다. 이들 추출액과 메탄올 농축액을 MeCN:H2O(0.05 % TFA)=10:90 용매를 시작으로 10분마다 10%씩 단계적으로 MeCN을 증가시키며 분취 HPLC(Waters Delta Prep 3000 system, Waters사, 미국; [YMC-Jsphere ODS-H80 250 X 10 mm i.d., 3 ㎖/min])를 수행하여 백색 분말의 정제된 화합물(20 mg)을 얻었다. 상기 정제된 화합물이 글루코실기를 포함하는 안사마이신인 것을 확인하기 위하여, 먼저 DIP-370 폴러리메터(JASCO, 일본)를 이용하여 비선광도(specific rotaion)를 측정하였으며, UV-1601 스펙트로포토메터(Shimadzu, 일본)를 사용하여 UV를 측정하였다. 또한, 상기 화합물을 한국기초과학지원연구원에 의뢰하여 HRESI-MS를 측정하였으며, 그 결과, 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물을 확인하였다.
[화학식 6]
Figure PCTKR2012008560-appb-I000020
[α]18 D:+49.98(c, 0.10, MeOH);
UV(MeOH); λmax(log ε): 206(4.18), 256(3.54);
HRESI-MS(m/z): 703.3411[M+Na]+, 측정값 = 703.3412(C34H52N2O12).
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 화학식 4로 표시되는 안사마이신 유도체는 안사마이신 유도체의 하이드록시기에 글루코실기가 도입된 안사마이신 배당체로 전환되는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 있어서 바실러스 리체포르미스(Bacillus licheniformis)로부터 유래된 당전이 효소는 안사마이신 배당체를 간단한 공정으로 제조할 수 있으므로, 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 면역억제제, 퇴행성 신경질환제, 항염증제 또는 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.
<실험예 3> LC/MS를 이용한 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체의 확인
본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체의 구조를 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
상기 화학식 8 내지 화학식 10으로 표시되는 화합물을 UDP-글리코실트랜스퍼라제 효소로 당전이 반응을 수행하였다. 반응이 종결된 후, 상기 반응액을 일차적으로 에틸아세테이트(EtOAc)로 추출하고, 물층을 냉동건조기에서 24시간 건조한 후, 소량의 메탄올에 녹인다. 이들 추출액과 메탄올 농축액을 MeCN:H2O(0.05 % TFA)=10:90 용매를 시작으로 10분마다 10%씩 단계적으로 MeCN을 증가시키며 분취 HPLC(Waters Delta Prep 3000 system, Waters사, 미국; [YMC-Jsphere ODS-H80 250 X 10 mm i.d., 3 ㎖/min])를 수행하여 백색 분말의 정제된 화합물(20 mg)을 얻었다. 상기 정제된 화합물이 글루코실기를 포함하는 비-벤조퀴논 젤다나마이신인 것을 확인하기 위하여, 먼저 DIP-370 폴러리메터(JASCO, 일본)를 이용하여 비선광도(specific rotaion)를 측정하였으며, UV-1601 스펙트로포토메터(Shimadzu, 일본)를 사용하여 UV를 측정하였다. 또한, 상기 화합물을 한국기초과학지원연구원에 의뢰하여 HRESI-MS를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
표 1
유도체 배당체 분석 결과
실시예 7 화학식 8의 화합물 화학식 11의 화합물 [α]18 D:+49.98(c, 0.10, MeOH); UV(MeOH); λmax(log ε): 206(4.18), 256(3.54); HR-ESIMS(m/z): 703.3411[M+Na]+, 측정값 703.3412(C34H52N2O12)
실시예 7 화학식 8의 화합물 화학식 12의 화합물 [α]18 D: -6.46(c, 0.10, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε): 256(3.39), 204(4.09); HR-ESIMS(m/z): 865.3945[M+Na]+, 측정값; 865.3941(C40H62N2O17)
실시예 7 화학식 8의 화합물 화학식 13의 화합물 [α]18 D:-4.62(c, 0.10, MeOH); UV(MeOH) λmax(log ε): 259(3.37), 204(4.09); HR-ESIMS(m/z): 703.3411[M+Na]+, 측정값; 703.3412(C34H52N2O12)
실시예 8 화학식 9의 화합물 화학식 14의 화합물 [α]18 D:-3.24(c, 0.10, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε): 205(3.99), 251(3.33); HR-ESIMS(m/z): 687.3469[M+Na]+, 측정값; 687.3463(C34H52N2O11)
실시예 9 화학식 10의 화합물 화학식 15의 화합물 [α]18 D: +24.5(c, 0.10, MeOH); UV(MeOH) λmax(log ε): 206(4.68); HR-ESIMS(m/z) 703.3410[M+Na]+, 측정값; 703.3412(C34H52N2O12)
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 화학식 8 내지 10으로 표시되는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 유도체는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 유도체의 하이드록시기에 글루코실기가 도입된 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체로 전환되는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 있어서 바실러스 리체포르미스(Bacillus licheniformis)로부터 유래된 당전이 효소는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체를 간단한 공정으로 제조할 수 있으므로, 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 면역억제제, 퇴행성 신경질환제, 항염증제 또는 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.
<실험예 4> 안사마이신계 배당체의 용해도 평가
종래의 안사마이신 계열은 우수한 활성과 낮은 간독성을 가지고 있지만 낮은 용해도로 인해 활성평가의 문제점이 있었다. 이에, 본 발명에 따라 제조된 안사마이신 배당체의 용해도 측정을 위하여 하기 실험을 수행하였다.
상기 화학식 4로 표시되는 안사마이신 화합물을 UDP-글리코실트랜스퍼라제 효소로 당전이 반응을 수행하였다. 화합물의 용해도를 측정하기 위하여, 반응이 종결된 후 반응 혼합물 내에 존재하는 안사마이신 화합물과 당화된 안사마이신 화합물을 에틸아세테이트(EtOAc) 용매로 추출하여 물층과 용매층으로 이동하는 화합물의 정도를 HPLC 분석하는 방법으로 확인하였으며, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 완충용액에서 당화 반응액의 일부를 HPLC 측정한 결과, 본 발명에 따라 제조된 안사마이신 배당체 화합물은 당화 전의 기질로 사용한 화학식 4로 표시되는 안사마이신 화합물로부터 42.3%의 전환율을 나타내고 있으며, 상기 반응액을 에틸아세테이트(EtOAc) 용매로 추출한 용매층은 당화된 화합물의 피크가 상대적으로 극히 적은데 반하여, 추출 후, 물층에 대부분 존재하는 당화된 화합물 피크를 확인할 수 있다. 이로부터 기질로 사용한 안사마이신 화합물은 물에 용해되지 않는 반면, 당화된 화합물들은 물층에 잘 용해되는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 있어서 바실러스 리체포르미스(Bacillus licheniformis)로부터 유래된 당전이 효소는 안사마이신 배당체를 제조하기에 적합하며, 또한, 이로 인한 결과물인 배당체는 우수한 용해도로 가지므로, 의학적 사용에 유리하고, 생체내 흡수기관에서 글루코시다제(glycosidase)에 의해 원래 활성구조로 전환되므로 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 면역억제제, 퇴행성 신경질환제, 항염증제 또는 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.
<실험예 5> 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체의 용해도 평가
종래의 안사마이신 계열은 우수한 활성과 낮은 간독성을 가지고 있지만 낮은 용해도로 인해 활성평가의 문제점이 있었다. 이에, 본 발명에 따라 제조된 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체의 용해도 측정을 위하여 하기 실험을 수행하였다.
상기 화학식 8로 표시되는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 화합물을 UDP-글리코실트랜스퍼라제 효소로 당전이 반응을 수행하였다. 화합물의 용해도를 측정하기 위하여, 반응이 종결된 후 반응 혼합물 내에 존재하는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 화합물과 당화된 비-벤조퀴논 젤다나마이신 화합물을 에틸아세테이트(EtOAc) 용매로 추출하여 물층과 용매층으로 이동하는 화합물의 정도를 HPLC 분석하는 방법으로 확인하였으며, 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 완충용액에서 당화 반응액의 일부를 HPLC 측정한 결과, 본 발명에 따라 제조된 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체 화합물은 당화 전의 기질로 사용한 화학식 8로 표시되는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 화합물로부터 48.8%의 전환율을 나타내고 있으며, 상기 반응액을 에틸아세테이트(EtOAc) 용매로 추출한 용매층은 당화된 화합물의 피크가 상대적으로 극히 적은데 반하여, 추출 후, 물층에 대부분 존재하는 당화된 화합물 피크를 확인할 수 있다. 이로부터 기질로 사용한 비-벤조퀴논 젤다나마이신 화합물은 물에 용해되지 않는 반면, 당화된 화합물들은 물층에 잘 용해되는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 있어서 바실러스 리체포르미스(Bacillus licheniformis)로부터 유래된 당전이 효소는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체를 제조하기에 적합하며, 또한, 이로 인한 결과물인 배당체는 우수한 용해도로 가지므로, 의학적 사용에 유리하고, 생체내 흡수기관에서 글루코시다제(glycosidase)에 의해 원래 활성구조로 전환되므로 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 면역억제제, 퇴행성 신경질환제, 항염증제 또는 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.
<실험예 6> 열충격 단백질의 에이티피아제(ATPase) 저해 활성 측정
본 발명에 따른 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체의 ATPase 저해 활성 측정하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
단계 1: 열충격 단백질의 분리정제
먼저, 효모의 열충격 단백질(Hsp90)을 분리정제하기 위해 하기와 같이 수행하였다. Hsp90 단백질을 암호화하는 유전자를 클로닝하기 위해 NdeI 제한효소 부위를 도입한 5'-CAT ATG GCT AGT GAA ACT TTT GAA TTT CAA G-3'(정방향 프라이머) 및 SalI 제한효소 부위를 도입한 5'-GCT GAC ATC TAC CTC TTC CAT TTC GGT GTC AG-3'(역방향 프라이머)으로 중합반응 후 pET-28a(+) 벡터에 클로닝하였다. 상기 제작된 벡터를 대장균 로제타(Rosetta)(DE3)에 형질전환하여 발현시켰다.
단백질의 과생산은 과발현 플라스미드(plasmid)를 가진 대장균 Rosetta (DE3)을 50 ㎍/㎖ 농도의 카나마이신(kanamycin)과 클로람페니콜(chloramphenicol)을 포함하는 5 ㎖ LB(Luria-Bertani) 액체 배지에서 약 17시간 동안 배양하였다. 이를 30 ㎖의 새로운 LB 배지를 사용하여 1/60 희석하였고, 이를 2-3시간 더 배양하여 UV 스펙트럼 600 ㎚에서 OD(optical density)값이 약 0.5~0.6이 되도록 하였다. 이때 10분간 얼음에 두었다가 이소프로필 β-D-티오글루코피라노시드(isopropyl β-D-thioglucopyranoside, IPTG)를 최종 농도가 1 mM이 되도록 첨가하여 과발현을 유도하고 20 ℃에서 17시간을 더 배양하였다. 이렇게 배양된 대장균을 원심분리(3500 rpm, 30분)하여 수득한 후, 완충액(100 mM Tris-HCl, 20 mM KCl, 6 mM MgCl2, imidazole 10 mM, pH7.4) 3 ㎖에 대장균을 현탁하였다. 초음파 분쇄기를 이용하여 대장균 세포를 분쇄한 후, 원심분리(15,000 rpm, 30분)하고 상기 분쇄액을 SDS-PAGE하여 단백질 생산을 확인하였다. 상기 분쇄 상층액은 빈 컬럼(column)에 0.5 ㎖의 Ni-NTA 레진(resin)과 섞어 4 ℃에서 60분간 부드럽게 흔들어 준 후, 3 ㎖의 세척 완충액(wash buffer, 100 mM Tris-HCl, 20 mM KCl, 6 mM MgCl2, imidazole 20 mM, pH 7.4)을 세 번 처리하고, 마지막으로 용출 완충액(Elution buffer, 100 mM Tris-HCl, 20 mM KCl, 6 mM MgCl2, imidazole 250 mM, pH 7.4)을 0.5 ㎖씩 다섯 번 처리한 후, 각각의 분획을 SDS-PAGE로 확인하여 Hsp90 단백질이 분리되었음을 확인하였다.
단계 2: 열충격 단백질의 에이티피아제(ATPase) 저해 활성 반응 측정
상기에서 분리 정제된 효모의 열충격 단백질(Hsp90)을 이미 공지된 방법으로 그 ATPase 활성을 측정하였다(B. Panaretou, C. Prodromou, S. M. Roe, R. O'Brien, J. E. Ladbury, P. W. Piper, L. H. Pearl, EMBO J.1998,17(16),4829-4836.; Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P. and Aherne, W. Anal. Biochem. 2004. 327,176-183). 단백질을 반응 완충용액(100 mM Tris-HCl, 20 mM KCl, 6 mM MgCl2, pH 7.4)에 투석하여 최종농도 0.3 mg/㎖로 사용하였고, 말라카이트 그린 반응액은 공지된 방법으로 준비하였다(malachite green(0.0812%, w/v), polyvinyl alcohol(2.32%, w/v; dissolves with difficulty and requires heating), ammonium molybdate(5.72%, w/v, in 6 M HCl), and water in the ratio 2:1:1:2).
*ATPase 저해 활성 측정을 위해 본 발명에 따른 실시예 7에서 제조된 화학식 11 및 실시예 8에서 제조된 화학식 14의 화합물과 비교예로서, 벤조퀴논 젤다나마이신 유도체인 비교예 1의 화합물, 비-벤조퀴논 젤다나마이신 유도체인 비교예 2의 화학식 8로 표시되는 화합물(대한민국 등록특허 제10-860502; WK-88-2) 및 비교예 3의 화학식 9로 표시되는 화합물(대한민국 등록특허 제10-860502; WK-88-1)을 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0.00001, 0 μM의 농도별로 준비하여 각각 1 ㎕씩 취하여 상기 단계 1에서 준비한 10 ㎕의 열충격 단백질(1 μM) 및 4 ㎕의 반응완충액(100 mM Tris-HCl, 20 mM KCl, 6 mM MgCl2, pH 7.4)에 첨가하고, 37 ℃에서 한 시간 동안 반응을 수행한 후, 여기에 10 ㎕의 2.5 mM ATP을 첨가한 후 1분간 흔들어 주고, 상기 반응액을 37 ℃에서 3시간 동안 반응시킨 후, 80 ㎕의 말라카이트 반응액을 첨가하고 10 ㎕ 의 34 % 구연산 나트륨을 첨가하여 상온에서 15분 방치한 후 반응을 정지시킨다. 다음으로, 문헌[EMBO J.1998,17(16),4829-4836; Anal. Biochem. 2004. 327,176-183.]에 기재된 방법과 동일하게, 이 반응액을 UV 스펙트럼 분석기를 이용하여 620 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 ATPase 저해 IC50 값을 산출하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
표 2
화합물 ATPase 저해 활성(IC50, μM±SD)
실시예 7 0.75±0.17
실시예 8 2.14±0.67
비교예 1 3.19±0.65
비교예 2 1.58±0.65
비교예 3 0.79±0.12
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체는 ATPase 저해활성(IC50)이 실시예 7에서 제조된 화학식 11로 표시되는 화합물의 경우 0.75 μM, 실시예 8에서 제조된 화학식 14로 표시되는 화합물의 경우 2.14 μM로서 종래에 치료제로 사용 중인 비교예 1의 젤다나마이신보다 우수한 ATPase 저해활성을 나타내었다. 특히, 본 발명에 따른 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체 화합물이 원래 기질로 사용한 화합물에 비해 유사한 ATPase 저해활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명에 따른 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체는 열충격 단백질의 ATPase 활성을 저해하는 효과가 우수하므로, 항암제뿐만 아니라 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 면역억제제, 퇴행성 신경질환 치료제, 항염증제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
<실험예 7> 항암 활성 평가
본 발명에 따른 화학식 11로 표시되는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체의 암세포에 대한 세포독성을 측정하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
암 세포주는 인간 유방암(SK-Br3)을 사용하였다. SK-Br3세포주는 Hsp90 단백질의 기질 단백질인 ErbB2(kinase, 암관련 인산화효소)가 과량 발현되는 세포주로 기존의 젤다나마이신 유도체에 대한 항암 활성 평가 세포주로 널리 이용되고 있다. 상기의 암 세포주들을 각각의 96-웰 플레이트(96-well plate)에 웰 당 104개의 암세포를 분주하고, 5 % CO2, 37 ℃에서 24시간 배양한 후, DMSO에 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0.00001, 0 μM 농도별로 실시예 6에서 얻은 화학식 11로 표시되는 화합물과 비교예로서 화학식 8로 표시되는 화합물(대한민국 등록특허 제10-860502; WK-88-2)을 첨가하여 각각 처리하였다. 이를 다시 동일 조건하에 72시간 동안 배양하고 나서, MTT 시약을 가하여 37 ℃에서 4시간 반응시켜 세포 내에 포마잔(formazan)을 형성하였다. 상기 포마잔을 녹여 흡광도를 측정하기 위하여 용해 완충액(lysis buffer)을 가하여 37 ℃에서 하루 동안 방치하고, UV 스펙트럼 분석기를 이용하여 570 ㎚/650 ㎚로 흡광도를 측정하고 IC50을 산출하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
표 3
화합물 유방암(SK-Br3)(IC50; μM)
실시예 6 19.0 μM
비교예 9.43 μM
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체는 유방암 세포주에서 종래에 항암 효과가 있는 것으로 알려져 있는 화학식 6의 화합물보다 IC50값이 낮은 것으로 확인되었으나, IC50값이 우수하므로 항암제에 유용하게 사용될 수 있다.
<실험예 8> Her2, Akt 와 c-Raf 단백질 발현 저해 평가
본 발명에 따른 화학식 11로 표시되는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체의 열충격 단백질(Hsp90)의 기질 단백질인 Her2(kinase, 암관련 인산화효소), Akt 및 c-Raf 발현 저해 효과를 측정하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.
Her2를 과발현시킨 유방암 암세포주인 SK-Br3을 5 % CO2, 37 ℃에서 24시간 배양한 후, 비교예로서 화학식 8로 표시되는 화합물(대한민국특허등록 제10-860502호, WK-88-2)과 실시예 7에서 제조된 화학식 11로 표시되는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체 화합물 1 μM을 DMSO에 녹여 농도별로 처리하였다. 이를 다시 동일한 시간으로 배양하고, 배양한 상기 세포주를 수거하여 용해 완충액(50 mM Tris Buffer pH7.6, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.1 % SDS, 1 %(v/v) 단백질 저해 혼합물(Sigma #P8340)) 처리를 수행한 후, 세포를 초음파 분쇄하여 분쇄물을 얻고, 상기 분쇄물을 BCA법으로 단백질 정량을 실시하였다. 약 50 ㎍의 단백질을 SDS-PAGE에 로딩하여 Her2, Akt, c-Raf 및 대조군으로 β-actin에 대한 면역블로팅(immunoblotting)을 실시하였다. 그 결과를 도 19에 나타내었다.

Claims (14)

  1. 기질로써 하기 화학식 1로 표시되는 안사마이신 화합물을 당전이 효소와 당전이 반응시켜 하기 화학식 1의 화합물에 글리코실기가 도입된, 화학식 1의 화합물로부터 얻어지는 용해도가 증가된 배당체의 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2012008560-appb-I000021
    (상기 화학식 1에서, R은 비치환 또는 하이드록시기이고,
    Figure PCTKR2012008560-appb-I000022
    은 단일결합 또는 이중결합이다).
  2. 분리된 당전이 효소와, 기질로써 하기 화학식 7로 표시되는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 유도체의 당전이 반응을 수행하여 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체를 제조하는 단계를 포함하는 용해도가 증가된 배당체의 제조방법.
    [화학식 7]
    Figure PCTKR2012008560-appb-I000023
    (상기 화학식 7에서, R1은 비치환 또는 하이드록시기이고,
    Figure PCTKR2012008560-appb-I000024
    은 단일결합 또는 이중결합이다).
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 당전이 효소는 바실러스 리체포르미스(Bacillus licheniformis)로부터 유래된 UDP-글루코실트랜스퍼라제 C(uridine diphosphate-glucosyltransferase C) 또는 UDP-글루코실트랜스퍼라제 E(uridine diphosphate-glucosyltransferase E)인 것을 특징으로 하는 용해도가 증가된 배당체의 제조방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 당전이 반응은 제1항의 당전이 효소와 UDP-글루코즈를 첨가하는 것을 특징으로 하는 용해도가 증가된 배당체의 제조방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 당전이 반응은 25-35 ℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 용해도가 증가된 배당체의 제조방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 당전이 반응은 pH 6.0-9.0의 환경에서 수행되는 것을 특징으로 하는 용해도가 증가된 배당체의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 안사마이신 화합물은 하기 화학식 2 내지 화학식 5로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 용해도가 증가된 배당체의 제조방법:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2012008560-appb-I000025
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2012008560-appb-I000026
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2012008560-appb-I000027
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2012008560-appb-I000028
    .
  8. 제1항에 있어서, 상기 화학식 7로 표시되는 안사마이신 화합물은 하기 화학식 8 내지 화학식 10으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 용해도가 증가된 배당체의 제조방법:
    [화학식 8]
    Figure PCTKR2012008560-appb-I000029
    [화학식 9]
    Figure PCTKR2012008560-appb-I000030
    [화학식 10]
    Figure PCTKR2012008560-appb-I000031
    .
  9. 하기 화학식 11 내지 화학식 15로 표시되는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 11]
    Figure PCTKR2012008560-appb-I000032
    [화학식 12]
    Figure PCTKR2012008560-appb-I000033
    [화학식 13]
    Figure PCTKR2012008560-appb-I000034
    [화학식 14]
    Figure PCTKR2012008560-appb-I000035
    [화학식 15]
    Figure PCTKR2012008560-appb-I000036
    .
  10. 제9항에 있어서, 상기 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체는 용해도가 증가하고, 열충격 단백질의 에이티피아제 저해 활성이 증가하는 것을 특징으로 하는 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  11. 제9항의 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 열충격 단백질의 에이티피아제(ATPase) 활성 저해용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 항암제, 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 면역억제제, 퇴행성 신경 질환 치료제 또는 항염증제로 사용되는 것을 특징으로 하는 열충격 단백질의 에이티피아제(ATPase) 활성 저해용 약학적 조성물.
  13. 제9항의 비-벤조퀴논 젤다나마이신 배당체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 암 질환은 유방암, 간암, 위암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 또는 중추신경계 종양인 것을 특징으로 하는 암 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2292271A2 (en) * 2001-10-10 2011-03-09 BioGeneriX AG Remodelling and glycoconjugation of an antibody

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2292271A2 (en) * 2001-10-10 2011-03-09 BioGeneriX AG Remodelling and glycoconjugation of an antibody

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WU, CHENG-ZHU ET AL.: 'New non-quinone geldanamycin analogs from genetically engineered Streptomyces hygroscopicus' THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS vol. 64, March 2011, pages 461 - 463 *
WU, CHENG-ZHU: 'Heat shock protein 90 inhibitors geldanamycin analogs from genetically engineered Streptomyces hygroscopicus' PH. D. THESIS September 2011, *
ZHAO, P. ET AL.: 'Amide N-glycosylation by Asm25, an N-glycosyltransferase of ansamitocins' CHEMISTRY & BIOLOGY vol. 15, 2008, pages 863 - 874 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140135123A (ko) * 2013-05-15 2014-11-25 한국생명공학연구원 신규한 에포싸일론 유도체 및 그의 용도
KR101638045B1 (ko) * 2013-05-15 2016-07-08 한국생명공학연구원 신규한 에포싸일론 유도체 및 그의 용도

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