BG62351B1

BG62351B1 - Напитка и метод за получаването й

Info

Publication number: BG62351B1
Application number: BG100605A
Authority: BG
Inventors: Lene M. Bech; Steen B. Sorensen; Pia Vaag; Marianne Muldbjerg; Thorkild Beenfeldt; Robert Leah; Klaus Breddam
Original assignee: Carlsberg AS
Current assignee: Carlsberg AS
Priority date: 1993-11-08
Filing date: 1996-05-20
Publication date: 1999-09-30
Anticipated expiration: 2016-05-20
Also published as: DK0728188T3; BG100605A; JP3501808B2; WO1995013359A1; HUT74928A; DE69403092T2; RU2145974C1; HU9601228D0; PL314262A1; NZ275797A; DE69403092D1; RO112763B1; AU8104894A; FI961937A; DK126693D0; US5993865A; CA2175908A1; CZ129296A3; ATE152765T1; ES2103626T3

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до пенлива напитка, например бира, метод за получаването й и приложение на пенообразуваща добавка.

Предшестващо състояние на техниката

Напитките играят важна роля в нашето ежедневие, не само като необходима течност и източник на хранителни вещества ,но също и като стимулант. Освен вкуса, за висококачествените напитки са особено важни и някои структурни свойства като вискозитет и качества на пяната.

Понастоящем на пазара има много напитки, например бира, млечен шейк, както и някои сухи концентрати за приготвяне на напитки. Независимо от това, съществува необходимост от нови пенливи напитки, а също и от подобряване на качеството на известните вече пенливи напитки.

Положени са доста усилия за изследване и изолиране на образуващите пяната вещества в бирата и за подобряване пенливостта на бирата.

От повече от 50 години е известно, че качеството пенливост на бирата се определя от нейното протеиново съдържание, което е около 3-4 mg/ml в обикновената бира, и че свободните липиди и остатъците от детергенти могат да бъдат вредни за стабилността на бирената пяна.

Обект на много изследвания [1,2,4 и 17] е изясняване на това кои протеинови компоненти в бирата играят роля при стабилизирането на пяната. Предполага се, че важни за образуването пяната са няколко класа протеини, разделени по молекулното им тегло [2,11 и 20].

Молекулярният профил на протеините на бирата показва, че тази напитка включва от малки полипептиди до такива с тегло над 150 000 далтона. Установено е, че протеини с молекулни тегла до около 100 000 далтона оказват положителен ефект върху стабилизирането на пяната на бирата, докато за малките полипептиди, по-специално полипептиди с молекулно тегло под 5 000 далтона, се счита че имат отрицателен ефект върху пяната [6, 19]. Изследванията на Sharpe et al. [15] установяват, че стабилността на пяната е свързана със съотношението между полипептидите с високо и ниско молекулно тегло. Вземайки под внимание важността на специфичните протеини, Yokoi et al. [20] твърдят, че протеин Z, ечемичен албумини с тегло 40 000 далтона, играе най-важна роля за стабилността на пяната. Това е в противоречие с резултатите на Hollemans and Tonies (11), които показват, че пълното и селективно отстраняване на този протеин от бирата от специфични, имобилизирани антитела оказва само слаб ефект върху стабилността на пяната.

Установено е също, че в бирената пяна са концентрирани компоненти с високо молекулно тегло, произхождащи от дрожди и главно от усвояващите въглехидрати и дрожди [10, 12].

До повечето от изброените по-горе заключения е достигнато чрез фракциониране на протеините на бирата и определяне способността на различните фракции да образуват стабилна пяна. В нито едно от изследванията не е проведен какъвто и да е опит за подобряване качеството на бирената пяна.

Когато става въпрос за качеството на пяната, от особено значение са два параметъра, а именно способността за образуване на пяна и способността за стабилизиране на пяната.

Установено е, че една специална група протеини, наречени зърнени LTP, притежават способността да образуват пяна в напитките.

Поради това изобретението се отнася до напитка, съдържаща протеини и/или пептиди, които имат тези способности.

Зърнени LTP означава протеини или пептиди от зърнени култури, класифицирани като транспортиращи липидите протеини (Lipid Transfer Proteins). На таблица 1 е показана аминокиселинната последователност на някои такива зърнени LTP и други растителни LTP. По-подробно тези протеини са описани от Molina et al [13].

Хомолози означава протеини с 50-110 аминокиселини и по-специално 80-100 аминокиселини и с поне 60%, за предпочитане 80% или повече секвенционна хомоложност със зърнените LTP.

Особено важни са структурните взаимоотношения. Хомоложните протеини поради това включват поне 6 цистеинови групи и по специално 8 цистеинови групи за изграждане на 3 или 4 дисулфидни моста.

Предпочитани хомоложни протеини са TLTP, SLTP, CLTP, СВ-А, СВ-В и СВ-С.

Съгласно изобретението се предпочитат LTP от семена на зърнени култури.

Специално предпочитани зърнени LTP са ечемични LTP от семена на ечемик, на таблица 1 означени като BLTP и означава също като LTP1 в примерите.

BLTP е основен протеин, намиращ се в изобилие в алейроновия слой на ечемичното зърно (14,16). Той има молекулно тегло от 9.649 далтона, съдържа 91 аминокиселини остатъка, включително 8 цистеинови. Аминокиселинната му последователност е определена [18]. Тя е клонирана и така е определена нуклеотиднанта последователност на сДНК [14].

Терминът зърнени LTP или субгрупи от тях като ечемични LTP включва и техни хомолози, както са определени по-горе със секвенционна хомоложност спрямо отбелязаните LTP групи. Освен това терминът зърнени LTP или техни субгрупи означава модифицирани зърнени LTP фракции, които са получени от LTP или от техни хомолози чрез нагряване, варене и/или при майшуването. За предпочитане зърнените LTP не са денантурирани напълно, т.е. някои структури са останали бла годарение на способността на цистеините да образуват дисулфидни мостове.

Когато зърнени LTP се подлагат на нагряване, варене и/или майшуване, както е опи5 сано по-нататък, и като е характерно за процеса на варене на бирата, първичните им структури - аминокиселинните последователности, се запазват изцяло, докато вторичните и третични структури се променят повече или 10 по-малко и някои или всички дисулфидни мостове може да бъдат разместени. В процеса на варене на пивото аминокиселината метионин от ечемичените LTP 1 често се окислява. Авторите на изобретението са наблюдавали също и 15 образуване на LTP -димери и -олигомери, вероятно чрез пренареждане на един или няколко от дисулфидните мостове, намиращи се в LTP. Както е описано по-нататък, LTP може да се комбинира и с други компоненти на 20 пивото, присъстващи в етапа на варене, например хордеинови фрагменти, хмел и липиди.

Модифицираните зърнени LTP могат да бъдат получени чрез нагряване на обикновени зърнени LTP във воден разтвор за време до 3 25 h при t между 50 и 95°С или чрез варене при атмосферно налягане за време до 2 h и/ или при майшуването, проведено по обичайния в пивоварството начин.

ТАБЛИЦА 3

Линсирнюрпне па амщн» киселина ши е поел^сйз^елал·^!; }tu ₽wmu's.M-m липиу.

ELTP:

-LNCGQYDSKMKFCLrtV—QGGPGPSGECCNGVRDLHN5AQSSGCiRQTVCLC-LKGiA№lHtn.PNNAASlFSKCNVXVFYTlSPDIDCSRIY

(LTP1)

KLTP:	- IDCOHTOSL VRPCLSVV- - QGGPGPSGQCCDGVKNLIiNCARSQSiPCSACNC-LKCI ARG IHNLNEDNARS 1TPKCGVNLF У TISLXIDCSRV
ML тр:	ALSCCQVAS АГАРС13УА-КСС6ЕСГЗАСССЗСУЯ5СНМЛА1иГЛСЯг’ЛЛЖ- LKiAAACVSCLNAGb’AASIFSKCCVS IPYTISTSTDCSRVN
RiLTP:	- ITCGQVNSAVGPCLTYA- RG-G AGPSAACCSGVRSLKAAASITADRRTACSC- LKMAARG LKCLNAGXAASIPSKCGVSWY TISASIDCSRVS
RaLTP;	Al SCGQVSSAIGPCLAYA- RGAGAAPSASCQSGVRSLNMAHTTADRRAACKCSLKSAASRVSCLNACKASS J PGRCGVPLPYAIGAS LDCSRVNN
CuLB:	Al TCOQVSSALCPCAAYA- KGSGTSPSAGCCSGVKRLAGLAf<STM)KQATCnC- LKS VACAY—NACTVkAGJ PSRCCVSVPYTISASVDCSKIH
Cw21:	AlSCGQVSSALSPCISYA- RGNGAKPPAACCSGVKRLAGAACSTAOKQAACXC- IKSAAGGL-- -NAGKAACIPSMOGV SVPYAI SASVtXSKI R
CD-л:	-VDCGQVNSSLASCrPFL-TGGVASPSASCCACVQNLKTLArTSADrtHAACKC-j;K*AAA№-pTlKODAASaLPKXCCVDINIPISKTTNCVAiN
CB-D:	-VJiCOQVNKALSSCVPFL-TGFMTFSLTCCAGVMLLKRLAPTVmKRIACRC-VKTAAARYPMIREDAASSlPYKCGWINVPISKTWCHRIN
CB-C:	AVPCSTVDMKAAACVCFA- TCKDSKPSQACCTGLKLAQTVKTVDDKKAI CB.C-I.K- ASSKSt .G IKL2Bt.SK IPAACHI ΚνΟρ-ρνεΤΝΙΆΙΟίΤΙ H
TLTf:	ALTOGCVTAGLAPCLPYL-QGRGP—LGajCGGVKNLLGSAKmDP.mCTC-LKSAAHAIKGrDLNKAAGrPSYCKVXIPYKISPSTDCSTVQ
SLTP:	GITCGMVSSKLAPCIGYL-KGCP“-LGGOCCG<51KMHAAAATTPDHCTACNC-LXSAAHAIKGIXYGKAAGLFCMCGVmPYAISPSTA'CNAVH
Cltp:	VLTCGQVTCALArCLGYLSRQWiVPVPLTCCNVVRGLNNAARmtlKRTACOC-LKQTANAvrGLNLHAAAGLPAJlCGVMIPyKISP'tTDCKRVV

iiLiki-m (·)« HiiBcgcu 91 ix’it.iAe «ιμιιλοΑικχγπι

HI РЧпНЗЧяВл I 1’1’ <jnl ГЧ<*М'Г*1С1П1 търпя

Wl.TP Ο 41Λ·ΐ.ΐβτ 1.11’ win пшгнмц.ч \1I.J 1’oni.TiafH 1.1'1’ <ч» >tape&iii(,i Iii I .TP 0 шлчлРл 1.11' om 1L1I.I (’ ссщттлвл Ι.Ί Ρ οιηψίνΐηιΉικ:»·· pa-’U Са It: очцлчлйл 1.1’1' oih sintm ил v’lcvuk Cw21 означала ΙΛΨοτ листа ita харлсй

Терминът “зърнени LTP” означава също техни хомолози или модифицирани зърнени LTP и модифицирани хомолози, доколкото не се твърди друго.

Напитката може да бъде която и да е течност за пиене, например напитка на основата на мляко или на основата на плодове и бира.

Тъй като малки количества, т.е. около 50 mg/ί, се съдържат в познати видове бира, това решение е отнесено към нивото на техниката и е изключено от обхвата на защита на претенция 1.

Получаването на бира или процесът на варене на бира, така както е известно от нивото на техниката, е описано в подробности в литературата - Malting and Brewing Science, Vol. I, D.E.Briggs, J.S. Hough, R.Stevens and T.W.Young. Chapman and Hall, London (1981) and Volume II, J.S.Hough, D.E. Briggs, R.Stevens and T.W.Young. Chapman and Hall (1982) описват много различни суровини и процеси. Найобщо процесите следват описаните по-долу етапи A-D.

A) Подбор на суровини и получаване.

Суровините включват:

Вода; въглехидрати и протеини, съдържащи се в зърнени храни като ечемик, пшеница, ориз, царевица, сорго); захар; сиропи; малцови екстракти; ензими, получени по време на малцуването на зърнените суровини (например ечемик и пшеница) или микробиологично продуцирани, компоненти на брашното - печен малц, хмел и други растителни материали или сокове.

Зърнените суровини могат да бъдат малуцвани, смлени сепарирани (за получаване на компоненти със специфичен вкус и ензимна активност).

B) Майшуване и получаване на пивна мъст.

Състои се в следното.

Екстрахиране чрез контролирано накисване (температура и време) на получените

Продължение на таблица 1 < Β.Λ- А <>«<).Ί<ι;ιβ.Ί Е.'П' от Ιί.-.σηχψαβί) тьрПЛ ' fi· Н u in.ei.ifi.-i LT! oni k.-u nvipwEhi ;ъркя < Ή- f J..T1’ orri knnnupvBu търпя

-1 Г отначпйя LTP (K'M ireui

SI H’ <1 I.TJ’om Сгцнок ( 1.11‘LIT «1)11 '.lupknBu суровини; варене и разделяне на пивната мъст от неразтворимите материали.

C) Ферментация на пивната мъст.

Ферментацията се осъществява след добавянето на дрождевата суспензия към охладена аерирана пивна мъст. Вследствие на контролираните температурни условия дрождевият метаболизъм (ферментацията) ще превърне пивната мъст в бира, включваща определени продуцирани от дрождите компоненти като алкохол и вкусови продукти. Този етап може да бъде контролиран чрез параметрите температура и количество на дрождите, както и чрез селекциониране на дрождите.

D) Осветляване и довършителни операции

След съхраняване и зреене останалите дрожди и протеинови/танинови утайки се филтрират и се включва въглероден двуокис и добавки, коригиращи цвета и други показатели, например стабилизиращи и ароматизиращи компоненти.

Основно правило за специалистите в пивоварството е, че бирата, получена само от малцов ечемик или малцова царевица, е с повисок потенциал по отношение на (пяната способност да образува пяна) и с по-добра стабилност на пяната отколкото бирата, варена с добавки.

Анализите за съдържанието на зърнени LTP в бира, получена по известните методи и имаща най-високия известен потенциал на пяната показват, че концентрацията на зърнени LTP е много по-ниска от 300 mg/1.

Качеството на бирената пяна зависи както от варилния процес, така и от вида на използваните суровини. Доколкото изобретението се отнася главно до суровините, съдържанието на зърнени LPT в бира, близка до оригиналната, се дължи най-вече на съдържанието на зърнени LTP в пивната мъст, получена съгласно стандартният метод за майшуване на ЕВС (Европейска Конвенция за пивоварство), наричан също “конгресен слад”. За малцувани зърнени суровини могат да се използват подобни методи на екстракция, ако е необходимо чрез допълнително включване на пивоварни ензими с нормални нива на ензимна активност.

Съдържащите се в известната сладка пивна мъст, предназначена за получаване на бира, зърнени LTP са основно LTP1 или слабо модифицирани LTP1. Степента на модификация зависи от метода, по който е получена пивната мъст. Когато конгресният слад е получен съгласно стандартния метод за майшуване, около 90% от съдържащите се в него зърнени LTP се измерват чрез ELISA с помощта на антитела, създадени срещу немодифицирани LTP1, докато ELISA се осъществява съгласно стандартни процедури, както е описано по-нататък.

Концентрацията на зърнени LTP в позната бира е по-ниска от X и много по-ниска от XI, където X и XI са стойностите, измерени за бира, получена от суровини, които чрез използването на стандартния метод за майшуване дават конгресен слад с концентрация на зърнени LTP, съответстваща на 125 pg/ml и 150 pg/ml, съответно на зърнени LTP, измерени с ELISA с помощта на антитела, създадени срещу немодифицирани LTP1.

Терминът “първа мъст” означава пивна мъст, получена в първия филтрационен етап след майшуването. Първият филтрационен етап обикновено е филтрацията преди промиването на филтърната утайка.

Терминът “сладка пивна мъст” означава мъстта, получена след крайния етап на филтрация, т.е. след като филтърната утайка е промита с вода.

Сладката пивна мъст следователно е смес от първата мъст и промивна вода.

С термина “конгресен слад” се означава пивна мъст, получена по стандартния метод на майшуване на ЕВС.

Терминът “пивна мъст” означава крайната мъст след майшуването, филтрирането и варенето.

Всички съдържащи се в пивната мъст зърнени LTP могат да бъдат намерени в бирата, получена от нея. От 1 ml пивна мъст обикновено се получават около 1 до 2 ml бира.

Това означава, че пивна мъст с концентрация на зърнени LTP 125 pg/ml може да даде бира с концентрация на зърнени LTP до 125 pg/ml.

Стандартният ЕВС метод на майшуване е описан детайлно в “AHALYTICA-EBC”, четвърто издание, 1987, стр. Е59,публ. от Brauerei und Getranke-Rundschau, CH-8047 Zurich, Switzerland.

Напитката съгласно изобретението включва за предпочитане поне 25 pg/ml зърнени LTP, докато стандартната концентрация на зърнени LTP и в частност на LTP от семена на зърнени култури е 100 pg/ml или повече.

Зърнените LTP могат да бъдат различени по тяхната секвенционна структура.

Концентрацията на зърнени LTP може да бъде измерена с помощта на ензимно свързан имуносорбентен анализ (ELISA) за зърнени LTP.

Такива тестове ELISA за зърнени LTP не могат да бъдат намерени на пазара, но могат да се получат по стандартната процедура, която включва следните етапи:

а) получаване на антитяло срещу зърнени LTP чрез имунизиране на животно, получаване на серум и пречистване на антитялото,

в) биотинилиране (маркиране с биотин) на антитялото, и

с) получаване на LTP стандартна крива по конкурентна ELISA процедура, включваща компонент, който може да бъде измерен чрез спектрофотометър.

Методите ELISA обикновено са познати на специалистите в областта и представляват едни от най-често използваните днес методи за изследване на билогичноактивни компоненти.

Информация относно ELISA анализа може да бъде намерена в литературния източник № 23.

За предпочитане напитката съгласно изобретението съдържа още хордеин, глутелин, други албумини като протеин Z, получаван от бира и/ или хмелови компоненти като хмелови изо-α киселини и други горчиви смоли на хмела. Тези компоненти имат стабилизиращ пяната ефект и синергичен ефект при образуване на пяната със зърнените LTP.

Напитката може също да съдържа въглехидрати, липиди и/или мастни киселини. Тези компоненти подобряват вкуса и консистенцията на напитката.

Някои от споменатите по-горе компоненти като хордеин, хмел и липиди могат да се комбинират с LTP, ако се варят заедно.

При модифициране на зърнените LTP чрез варене с хмелови компоненти и/или триглицерид, свойствата им за пенообразуване се подобряват.

Напитката може да съдържа в малки количества и други компоненти, като стабилизатори (алгинови киселини, алгинат, карагенан, глицериди, гумиарабика, пектин), изкуствени подсладители, ароматизатори, оцветители, витамини, минерали, консерванти, придаващи ефервесцентност средства, антиоксиданти и ензими, по-специално разграждащи протеините ензими и разграждащи въглехидратите ензими.

Когато напитката съгласно изобретението е бира, съдържанието на зърнени LTP в нея е за предпочитане повече от 5% тегл., по-специално повече от 10% тегл. и най-вече повече от 15% тегл. от общото протеиново съдържание. Теглото на модифицираните зърнени LTP се изчислява, като теглото на съответното количество немодифицирани зърнени LTP, т.е. теглото на други компоненти, свързани към зърнени LTP, се изключва.

Изобретението включва също и метод за получаване на напитка, съдържаща протеин и/ или пептид. Този метод е описан по-нататък и е включен в обхвата на претенция 11.

Зърнените LTP може да бъдат добавяни във всяка форма, при условие че е поне частично разтворима.

На практика те могат да бъдат добавяни под формата на смлян или натрошен зърнен материал или под формата на екстракт от зърнени суровини.

Такъв екстракт може да бъде получен по който и да е начин, например чрез варене и/ или майшуване на зърнени суровини или зърнени материали в течност и, по желание, пречистване чрез филтриране и в даден случай фракциониране на филтрата. Течността може да съдържа в зависимост от предпочитанието хмел и/или липиди, по-специално триглицериди. Екстрактът може също така да бъде изсушен, например чрез лиофилизация или пулверизационно сушене.

Зърнените LTP могат да бъдат получени и в модифицирана форма от бира, както е описано в примерите по-нататък.

Зърнените LTP могат също така да бъдат получени от микроорганизми, напр.дрожди, гъби или бактерии, съдържащи ДНК последо вателността, която кодира за зърнените LTP в генома си. Доколкото са известни множество ДНК последователности, кодиращи за зърнени LTP, специалистът в областта би бил способен да включи подобна ДНК последователност в генома на бактерии ,дрожди или гъби чрез използването на познати техники. Дрождите могат да бъдат напр. Saccharomyces calsbergensis или cerevisiae.

Зърнените LTP могат да бъдат получени например от продуциращи зърнени LTP микроорганизми в напитката по време на етапа на ферментация.

Ако напитката не е от получаваните чрез ферментация, зърнените LTP за предпочитане се добавят под формата на пречистен разтворим екстракт.

Естествено зърнените LTP могат да бъдат добавени към получена чрез ферментация напитка и под формата на пречистен разтворим екстракт, но тъй като производството на напитка чрез ферментация обикновено включва етап на филтриране, в него може да няма нужда да бъде пречистван зърненият LTP екстракт.

Зърнените LTP могат да бъдат добавяни на който и да е етап от получаването на напитката всички заедно или малко по малко непрекъснато или с прекъсвания.

Когато напитката е бира, зърнените LTP могат да бъдат добавени например в етапа на получаване на малц или малцов екстракт от зърното, което е пречистено до постигане на високо съдържание на LTP, например чрез използване на генетична трансмисия.

Зърнените LTP могат да бъдат добавяни също и по време на получаването на ливната мъст, например под формата на смлян или натрошен зърнен материал, в частност смлени семена, които се добавят преди етапа на майшуване.

Изобретението включва също приложение на зърнени LTP като пенообразуващи добавки в напитки.

Когато зърнените LTP се използват съгласно изобретението, те могат да бъдат комбинирани с други компоненти, включително протеини, но се предпочита зърнените LTP да се състоят от поне 15%, още по-добре 25% тегл. от общото протеиново съдържание. Теглото на модифицираните зърнени LTP, се изчислява като теглото на съответното количество немодифицирани зърнени LTP, т.е. тегло6 то на други компоненти, свързани към зърнените LTP се изключва.

Описание на приложените фигури

Фигура 1 показва кула за пяна за 1.65 1 бира, конструирана от боросиликатно стъкло.

Фигура 2 - резултатите от гел филтрация на разрушена пяна от третата флотация на лагерна бира върху Сефадекс G-75 в колона (5 cm х 87 cm, 1700 ml), еквилибрирана с 50 mM амониев ацетат, pH 4.5.

Фигура 3 - зависимостта на потенциала на пяната от концентрацията на LMW (нискомолекулни вещества) при анализ на пяната.

Фигура 4 - зависимостта на времето на полуживот на пяната от концентрацията на HMW (високомолекулни вещества) във вода, съдържаща 0.3 mg/ml LMW.

Фигура 5 - показва:

A) SDC- полиакриламидна гелелектрофореза на HMW, LMW и ечемични LTP1. (20% хомогенен гел. Phastsystem. Оцветяване с Сооmassie Blue R 350). Ml и M2 са маркери на молекулното тегло.

B) Разслояване по Westwm HMW, LMW и ечемичени LTP1 с помощта на специфични антитела срещу ечемични LTP1.

Фигура 6 е графика на резулатите, получени при йонообенна хроматография на LMW върху S-sepharose Fast Flow (5х 7 cm, 135 ml), еквилибрирана c 20 mM Na ацетат, pH 4.9.

Фигура 7 показва зависимостта на потенциалите на пяната от съдържанието на протеини. Резултатите са получени при анализ на пяна, осъществен върху дестилирана вода, съдържаща повишаващи се концентрации на Pool I, (ходеинови/глуте.инови фрагменти) Pool III (бирени LTP1) или LTP1, изолирани от ечемик. Концентрацията на разтворения протеин е изчислена чрез анализ на аминокиселините.

Фигура 8 - графика на зависимостта на потенциала на пяната от протеиновото съдържание, получена при анализ на пяна в бира, съдържаща повишаващи се концентрации на Pool I, Pool III или LTP1. Концентрацията на разтворения протеин е изчислена чрез аминокиселинен анализ.

Фигура 9 графично илюстрира резултатите за потенциала на пяната, получени при изследване на пяна във водни разтвори, съ държащи повишени концентрации от ечемични LTP самостоятелно или в присъствието на 0.4 mg/ml Pool I.

Концентрацията на разтворения протеин е изчислена чрез аминокиселинен анализ.

Фигура 10 графично показва резултатите за потенциала на пяната, получени при изследване на пяна във водни разтвори, съдържащи повишени концентрации на Pool III самостоятелно или в присъствието на 0.4 mg/ml Pooll.

Концентрацията на разтвореният протеин е изчислена чрез анализ на аминокиселините.

Фигура 11 показва резултатите от гелфилтрация на Pool III, изолиран при третата флотация на лагерна бира върху Sephadex G-50, еквилибрирана с 20 mM NaAc, 0.1 М NaCI, pH 4.9.

Фигури 12А и 12В показват Ή NMR спектъра на LTP 1 от ечемичени зърна и LTP 1 от бирена пяна.

Примери за изпълнение на изобретението

Получаване на малц

Използваният в следващите примери малц е получен като лагерен малц (светъл малц).

Получаване на конгресен слад с помощта на стандартен метод на майшуване

Смилане g малц се смила и 50 g от получения смлян малц се прехвърля в съда за разбъркване на мъстта.

Процесът на смилане се осъществява в дискова мелница на Buhler-Miag с разстояние 0.2 mm между дисковете.

Майшуване

Ваната за майшуване се темперира до около 45°С.

200 ml дестилирана вода с температура около 46°С се налива в бехерова чаша при разбъркване със стъклена пръчка за избягване на образуването на топчести бучици.

Установява се, че температурата на мъста е точно 45°С.

Съдът се поставя веднага във вана за майшуване и се включва бъркалката. Температурата на мъстта се поддържа 45°С точно 30 min. След това тази температура се повишава с 1°С на минута в продължение на 25 min.

След като се достигне температура 70°С, се добавят други 100 ml дестилирана вода с температура 70°С. Темпераутрата се поддържа 70°С

Ί в продължение на 1 h. Майшът се охлажда до стайна температура за 10-15 min. Бъркалката се промива с малко количество дестилирана вода, изсушава се извън съда за разбъркване и съдържанието му се довежда до 450.0 g чрез добавяне на дестилирана вода.

Филтриране

Съдържанието на съда за разбъркване старателно се разбърква със стъклена пръчка и веднага се изсипва цяло върху филтърна хартия.

Първите 100 ml от филтрата се връщат във филтрувалната тръбичка.

Филтрацията се спира, когато твърдият остатък върху филтъра изглежда сух, или в случай на бавно филтриране - след 2 h.

Аналитични процедури Идентифициране на ечемични LTP1 (Оцветяване по Western)

SDC поликриламидна гелелектрофореза се осъществява след варене за 15 min с 10 mM дитиотреитол, като се използват Pharmacia Phast-System и 20% хомогенни гелове. След това се осъществява разслояване върху нитроцелулоза в апарат Phast- System при 70°С за 30 min. След промиване с вода нитроцелулозата се инкубира за 30 min с телешки серум за блокиране на неспецифичното свързване и след това се инкубира за една нощ със специфични LTP1 антитела, получени съгласно пример 8. След това се прилага Promega Westwrn blot АР system (Каталожен № W 3930) за установяване на свързването на специфичните антитела. Смес от нитро блу тетразолиум и 5-бромо-4-хлоро3-индолилфосфат се използва като субстрат за развиване на цвета за алкална фосфатаза.

(Секвениране на N-крайни аминокиселини)

Секвенирането (установяване на аминокиселинната последователност) на N-крайни аминокиселини се осъществява на газофазен секвенатор Applied Biosystems модел 470А с помощта на програма, осигурена от компанията. Аминокиселините, белязани с фенилтиохидантоин от секвенатора се идентифицират on-line чрез обратно фазова високоефективна течна хроматография (HPLC) с помощта на фенилтиохидантоинов анализатор Appliead Biosystems, модел 120А.

Амино киселинният състав се определя върху LKB, модел Alpha Plus, анализатор на аминокиселини след хидролиза в 6 М НС1 при 110°С за 24 h във вакуумна среда.

Определяне на въглехидратното съдържание

Съдържанието на въглехидрати се определя по метода с фенол/сярна киселина (7).

Определяне на протеиновото съдържание

Съдържанието на протеини се определя чрез аминокиселинните анализи или по метода на свързване на багрило на Bradford (5).

Анализ на пяната

За измерване на потенциала на пяната и времето на нейния полуживот се използва оптико-електрична система за анализ на пяната (8,9) чрез анализ на дигителен видеообраз на проба от 10 ml. Потенциалът на пяната (Р) е количеството пяна в ml, образувана първоначално в 1 ml проба. Времето на полуживот на пяната (F) е времето в секунди, необходимо на стълба пяна да достигне половината от първоначалния си обем. Съдържанието на пяната е потенциала на пяната, умножен по обема в ml. Фракции или проби от фракции, получени след хроматография, се диализират срещу дестилирана вода в диализни мембрани Spectra/por(^R) (граница 3 500 Далтона) преди осъществяване на анализ на пяната или лиофилизирането й за отстраняване на амониевия ацетат. Анализът на пяната се провежда четирикратно.

Анализаторът за определяне стабилността на пяната, System Carlsberg (21), се използва за анализ на пяната на бутилирана бира, съдържаща СО_Г Времето за полуизтичането на пяната, определено по този метод, е полуживотьт (в секунди) за спадането на пяната в бирата след пълно превръщане на 150 g бира в пяна. Това спадане, след едно начално забавяне от 30 s, е процес от първи порядък (22).

Пример 1.

Изолиране и пречистване на зърнени LTP от семена на ечемик (LTP1)

Процедура а)

Чисти ечемични LTP се изолират от 25 kg ечемично брашно (сорт Alexis, отгледан в Дания през 1992) чрез екстракция с 250 1 вода при pH 6.5 за 2 h. Сместа се оставя една нощ при 2°С, което позволява на неразтворимите вещества да се утаят. Супернатантата се концентрира чрез ултрафилтрация до 7 1 и се добавя амониева сулфат до 40%-но насищане. След 2-3 h при 2°С преципитатът се отстра нява чрез центрофугиране и към супернатантата се добавя амониев сулфат при 75%-но насищане. След 16 h при 2°С получената суспензия се центрофугира, което води до получаване на преципитат, който би могъл да бъде съхраняван при 2°С в продължение на няколко седмици. Една четвърт от преципитата се разтваря в 500 ml вода, загрява се до 100°С и незабавно се охлажда върху лед. Разтворът се центрофугира за отстраняване на всяко преципитирано вещество и се диализира на диализана мембрана Spectra/por^R (граница 3 500 Далтона) срещу вода. След центрофугиране диализатът, чието pH е установено на 7.0 чрез добавяне на NaOH, се подлага на йонообменна хроматография на колона от СМ целулоза (5 cm х 25 cm, 500 ml), еквилибрирана с 20 mM Na- фосфат, pH 7.0. Разслояването по Western показва, че ечемичните LTP1 следва да бъдат елуирани с градиент NaCl от 0 до 0.1 М. Фракциите, съдържащи LTP1, се смесват, диализират на мембрана Spectra/pro^R срещу вода и се зареждат в колона S-Sepharose Fast Flow (5 cm х 15 cm, 300 ml), еквилибрирана в 20 mM Hepes, PH 7.0. Ечемичните LTP1 ce елуират чрез прилагане на градиент на NaCl от 0 до 0.3 М NaCl в същия буфер. Фракциите, съдържащи ечемични LTP1, което е установено чрез разслояване по Western, се отливат, диализират срещу дестилирана вода в Spectra/ por^R диализна мембрана и се лиофилизират. Секвенирането на N-крайните аминокиселини показва следната последователност Leu-Asn-*Cly-Gln- Vai- Asp-Ser-, където звездата означава празна позиция, съответстваща на цистеина, намерен в тази позиция в LTP1, която показва, че изолираните LTP1, са чисти.

Процедура Ь)

Аналогична е на процедура а) с изключение на това, че етапът на нагряване се прескача.

Не се наблюдава разлика в свойствата за пенообразуване или имунореактивността на LTP, получени съгласно процедура а) или Ь).

Пример 2.

Пречистване на LTP1 от бирена пяна Конструира се непрекъсната колона за пяна от боросиликатно стъкло, както е показано на фиг.1. Пяната се получава от 15 1 (или от 1.651, в който случай цялото количество химикали се редуцира с фактор 9) лагерна бира чрез разпръскване с 450 ml/min азотен газ за една нощ. Азотният газ се насища с водна пара преди въвеждане в колоната за пяна. Пяната, събрана на изхода, се разрушава и се разрежда до първоначалния обем на бирата с дестилирана вода и отново се връща в колоната за пяна. Втората и третата флотация се осъществяват, както е описано по-горе, и е установено, че пяната, събрана при третата флотация на лагерувала бира, съдържа 35% от общото количество пяна на изходната бира.

Компонентите, съдържащи се в разрушената пяна от последната флотация, се разделят по молекулно тегло чрез гелфилтрация върху Sephadex G-75 в колона (5 cm х 87 cm, 1700 ml), еквилибрирана с 50 тМ амониев ацетат, pH 4.5. Гелфилтрацията на разрушената пяна от третата флотация върху Sephadex G-75 води до получаване на три пика на абсорбция при 280 nm (фиг.2). Два от тях са наречени HMW - високо молекулно тегло, и LMW ниско молекулно тегло съответно, както е показано на фигура 2. HMW фракцията е съставена от около 90% въглехидрат и 10% протеин докато LMW-фракцията е съставена от 90% протеин и 10% въглехидрат. Установено е, че третият пик съдържа съединения с ниско молекулно тегло като аминокиселини, изохумулони (горчиво вещество на хмела) и въглехидрати.

Аминокиселинният състав на LMW фракцията и отделените фракции наподобяват аминокиселинния състав на добре познатия ечемичен липид, трансфериращ протеин (LTP1) (18) (Таблица II). SDS полиакриламидната гелелектрофореза на LMW показва петно от оцветяване с Coomassie Blue R 350, отговарящо на молекулни тегла в интервала 6 000- 18 000 Далтона (фиг.5). Разслояване по Westwrn с помощта на специфични антитела срещу ечемични LTP1 показва, че ечемични LTP1 (молекулно тегло 9 700 Далтона) са основният компонент на LMW (фиг.5). Това се потвърждава от секвенирането на N-крайните аминокиселини.

Аминокиселинният състав на LMW показва твърде високи стойности на Pro и Glx в сравнение с този на ечемичен LTP1 (18) (Табл.И), вероятно дължащо се на присъствието на хордеинови и глутелинови фрагменти; петното, получено със сребърно оцветяване след SDS полиакриамидна гелелектрофореза би могло да е от такива фрагменти.

Нискомолекулната (LMW) фракция пяна се подлага на лиофилизация за отстраняване на амониевия ацетат. LTP1 се пречиства от LMW фракцията, получена от 151 лагерувала бира чрез йонообменна хроматография върху 5 S- Sepharose Fast Flow (фиг.6). LMW фракцията се въвежда в колона (5 х 7 cm, 135 ml), еквилибрира се с 20 mM Na ацетат, pH 4.9 и след промиване LTP1 се елуира (проба ΙΙ-IV, фиг.6) чрез прилагане на линеарен градиент NaCKO0.3 М) в същия буфер. Пропусканата текуща фракция и трите проби от фракции, съдържащи LTP 1, както е установено чрез разслоява не по Western, се диализират срещу дестилирана вода в Spectra/por^R диализна мембрана (граница 3 500 Далтона) и се лиофилизират.

Ултрафилтър: DDS-GR81PP, Dow Filtrations, Denmark

Spectra/por^R: Spectrum Medical Industries, Ins., USA

CM-cellulose: Whatman Biosystems Ltd., England

S- Sepharose Fast Flow: Pharmacia, Sweden

Sephadex G-75: Pharmacia, Sweden

Таблица II

Резултати от хроматография на нискомолекулни вещества (LMW) върху S-Sepharose Fast Flow

	Проба I	Проба II	Проба III	Проба IV	LMW	LTP1 a)
Asx (mol%)	7.8	11.5	14.3	14.5	12.6	16.5
Thr (mol %)	6.1	4.3	3.8	3.7	4.5	3.3
Ser (mol %)	6.7	7.3	7.8	7.8	7.4	8.8
Glx (mol %)	20.7	13.7	10.2	9.6	13.3	6.6
Pro (mol %)	9.6	8.5	7.8	7.9	8.1	6.6
Gly (mol %)	7.1	8.5	9.6	9.6	8.9	9.9
Ala (mol %)	7.3	6.3	5.5	5.8	6.1	4.4
1/2 Cys (mol %)	4.3	6.5	7.6	7.5	6.4	8.8
Vai (mol %)	6.8	6.9	6.4	6.1	6.6	6.6
Met (mol %)	2.2	1.6	1.3	1.2	1.6	1.1
He (mol %)	3.7	4.6	5.1	5.0	4.7	6.6
Leu (mol %)	7.8	7.8	7.4	7.2	7.5	6.6
Tyr (mol %)	1.7	2.1	2.5	2.5	2.3	3.3
Phe (mol %)	2.5	1.5	0.6	0.6	1.2	0
His (mol %)	1.2	1.7	1.8	2.0	1.7	2.2

Продължение

Lys (mol %) Arg (mol %)	2.0 2.5	3.3 4.1	3.6 4.6	4.1 5.0	3.3 4.1	4.4 4.4
Протеин (mg)	87	33	190	38	398
Въглехидрати (mg)	24	1.3 0	0	25.6
Полуживот на пяната (sec.)	365	44	68	54	172
Потенциал на пяната ^ь) ml пяна/ml проба	1.3	1.1	1.5	0.8	1.3
Съдържание на пяна	378	73	658	63	1260

a) Стойности по (18)

b) Измерено във водни разтвори с А(280 nm) = 0.5Таблица III

Аминокиселинните анализи след киселина хидролиза (Таблица II), направени на пробата, дала критичната амплитуда и трите проби, очертали широката амплитуда, показват, че критчните фракции са с аминокиселинен състав, наподобяващ този на хордеини и глутеини с високо съдържание на Glx и Pro, докато за фракциите от широката амплитуда, елуирани при NaCl градиент, при аминокиселинните анализи (таблица 2) и при секвенирането на N- крайните аминокиселини, се установява, че са твърде чист LTP1, макар SDS полиакриламидната гелелектрофореза все още да показва следи от оцветявани с Coomassie съединения с молекулни тегла в интервала 6 000 - 18 000 Далтона в трите проби, които очертават широката амплитуда на елуиране. Както съдържащите хордеин (глутелин критични фракции (Проба I), така и LTP 1 фракциите (проби II - IV) образуват пяна с добър потенциал във вода (таблица И), но полуживотьт на пяната за LTP1 фракциите е твърде нисък, докато хордеин/глутелиновата фракция образува пяна с висока стойност на полуживот (таблица II). Изчисляването на количеството пяна в четирите проби показва, че 95% от съдържащата се в LMW пяна присъства в четирите проби (таблица II).

Пример 2А

Фракциониране на проба III

Проба III, получена от лагерна бира, както е описано в пример 2, се подлага на фракциониране по молекулно тегло чрез гелфилтрация върху Sephadex G- 50 в колона (2.6 cm х 67 cm, 330 ml), еквилибрирана с 20 mM NaAc, 0.1 NaCl, pH 4.9. Това разделяне води до получаване на два пика, абсорбиращи при 280 пт, проба А и проба В (фиг. 11). SDS-PAGE при нередукционни условия и разслояване по Westwrn с помощта на специфични антитела срещу ечемични LTP1 показват, че проба А е съставена главно от димерни форми на LTP, но се наблюдават, и по-големи мултимерни форми. Обратно на нея, в проба В са намере45 ни само мономерни LTP1.

Пример 2В

Записва се Ή NMR спектъра на LTP1, получени от ечемик (Пример lb) и LTP, получен от бирена пяна. Спектърът е снет при 50 ЗЮК (37°С) и pH 4.0.

Получените в резултат спектри са показани на фигури 12А и 12В.

Спектърът (фиг.12А)на LTP 1 от ечемични зърна е типичен Ή NMR спектър на глобуларни протеини, където повечето от вторичните структури са а-хеликоидални.

Това се вижда от факта, че повечето от Н“ ядрата имат химичен пренос под 4.8 ррт. Нещо повече, дисперсията на NMR сигналите е отчетлива индикация, че съществена част от протеина е огънат и че той има добре дефинирана вторична структура.

Подробен анализ на COSY (корелакционна спектроскопия), TOCSY (тотална корелационна спектроскопия) и NOESY (ядрена оверхаузер спектроскопия) спектрите потвърждават факта, че LTP 1 от ечемичени зърна е глобуларен протеин с добре дефинирана структура.

Спектърът на LTP на бирената пяна (фиг.12В) е типичен за протеини, които са изцяло или частично огънати и по същество без вторична или третична структура, може да се заключи, че LTP1, изолиран от бира, е повече или по-малко денатуриран.

Пример 3. Пречистване на LTP1 от първа пивна мъст

Първата мъст е получена при производството на лагерна бира от пивоварна Карлсберг. Пивната мъст се центрофугира 30 min при 4 000 pm за отстраняване на неразтворимите вещества. Добавя се амониев сулфат до крайна концентрация 85 % и след 16 h при 4°С получената суспензия се центрофугира 30 min при 4

ТАБЛИЦА III

000 pm. Преципитатът се разтваря в 300 ml вода и 2 х 60 ml се подлагат на гелфилтрация със Sephadex G-75 в колона (5 cm х 87 cm, 1700 ml), еквилибрирана с 50 тМ амониев 5 ацетат, pH 4.5. Получените след елуирането образи са сходни с тези, получени при гелфилтрация на разрушена пяна (фиг.2). Комбинираните LMW фракции се лиофилизират (за отстраняване на амониевия ацетат), разтва10 рят се във вода, диализират се и се полагат на йонообменна хроматография върху S-Sepharose Fast Flow (5x7 cm), еквилибрирана c 20 mM Ма ацетат, pH 4.9. LTP1 се елуира c линеарен NaCl градиент (0-0.3 M) в същия буфер. 15 Елуационният профил е сходен с този, показан на фиг. 6, получен при фракциониране на LMW фракция, изолирана от пяна. Фракциите, съставящи проба III, се събират и диализират срещу дестилирана вода в Spectra/por^R диализ20 на мембрана (гранични 3 500 Далтона) и се лиофилизират. Концентрацията на LTP 1 (модифицирани и немодифицирани) се определя чрез аминокиселинен анализ.

Пример 4. Високомолекулните и ниско25 молекулните фракции HMW и LMW, получени от лагерна бира, както е описано в пример 2, се тестват за способността им да образуват пяна във вода.

Получените резултати са показани на 30 таблица III.

Потенциал на пяната (Р) и времето на полуживот на пяната (F) за смеси от HMW и LMW във вода

LMW

HMW (pg/ ml) (pg/ ml)

0. 3 0. 6

75 P (mi пяна/ml	0. 56 ±0.04	0.63+0.04	0. 68+0. 03
проба)
F(sec)	199 ±15	251 ± 67	236 ±26
150 P (ml пяна/ ml	0. 89 ±0.05	0. 95±0.03	0. 97 ±0. 03
проба)
F(sec)	177+14	251+27	309 + 30

Продължение

300 Р (ml пяна/ ml	1.34+0.02	1.34+0.09	1.40 ±0.01
проба)
F (sec)	185 + 32	251+18	251 ±29
600 Р (ml пяна / ml	1.89+0. 08	1. 99±0. 15	1.83 ±0.05
проба)
F(sec)	208 + 61	258 + 65	239 ± 10

LMW		HMW (pg/ ml)
		1. 2 2. 4
75 Р (ml пяна? ml проба)	0. 69 + 0. 06	0.75+0.05
F ( sec)	300 + 3	313+71
150 Р (ml пяна/' ml проба)	1. 04 + 0. 03	1. 09 ± 0. 05
F (sec)	276 + 8	293 + 37
300 P(ml пяна / ml проба)	1.41 ±0.05	1.47+0.06
F ( sec)	290 ±39	290 + 29
600 Р (ml пяна/ ml проба)	2. 01+0.09	2.10 + 0.07
F(sec)	263 +102	277 ±24

Резултатът показва, че концентрацията на LMW фракцията има голямо влияние върху потенциала на пяната, независимо от концентрацията на HMW. Това е показано на фиг.З и 4 с помощта на стойностите от таблица III.

Пример 5. LTP1 е изолиран от 5 различни лагерни бири, различаващи се по потенциала на пяната. LTP е получен от 1.65 1 бира, както е описано в пример 2, само с по- 50 мощта на разделяне върху Mono S вместо върху S-Sepharose Fast Flow.

Лагерните бири са получени от различни ечемични сортове, а именно:

A: Blenheim

В: Caruso

С: Grit

D: Eminant

Смес: Смес от неизвестни сортове ече мик

Резултатите са показани в таблица IV.

Таблица IV

Изследване на стабилизиращи пяната фракции от лагерна бира, получена от различни сортове ечемик

Малц	Смес^а>	А	В	С	D
	Потенциал на пяната ml пяна/ml проба	0.72	1.13	1.13	1.44	1.20
Бира	Време на полуживот на пяната (sec)	181	200	189	258	179
Количество	пяна в 1 бира	715	1130	1130	1440	1200
	Възстановяване на протеините (%)	32	21	32	30	31
2-ра флотация	Количество пяна за 1 бира	240	490	360	670	520
HMW	Протеин тегл. % (w/w)	16	12	8	15	14
	Въглехидрати тегл.% (w/w/	84	88	92	85	86
	Количество пяна в 1 бира	210	160	190	270	210
LMW	Протеин тегл.% (w/w)	86	76	71	76	85
	Въглех. тегл. % (w/w)	14	24	29	24	15
Моно S^b)	Фракция при пускане (% от протеини)	25	10	40	8	8
	Елуирана фракция (% от протеини)	75	90	60	92	92

a) Хмел не е използван

b) Йонообменна смола, Pharmacia, Sweden

Пример 6. Анализите на пяната се прилагат на LTP1, изолирани от ечемично брашно, както е описано в пример 1, процедура в) и на проба I и проба III, получени от лагерна бира, както е описано в пример 2.

Използваната вода е дестилирана вода.

Използваната бира е лагерна бира Карле берг.

Във всеки тест се използват 10 ml вода или бира, към които се добавят пробите или LTP непосредствено преди образуването на пяната по описания по-рано начин.

При повишаване концентрациите на изолирания LTP1, проба I или проба III се разтварят във вода или съответно бира, като разтворите показват повишен потенциал на пяната при анализ (фигури 7 и 8), макар увеличението потенциала на пяната да е по-малко ясно изразен при разтворите с бира (фиг.8), отколкото при водните разтвори (фиг. 7), вероятно благодарение на позитивните компоненти на пяната, които вече се съдържат в бирата. При ниски протеинови концентрации ефектът при добавянето на бирената LTP1 фракция (проба III) е по-голям от този при фракцията, съдържаща хордеин/глутелинови фрагменти (проба I). Добавянето на LTP1, изолиран от ечемично брашно, към бирата, повишава както потенциала на пяната (фиг.8), така и времето на полуживот на пяната. Нещо повече, ефектът върху потенциала на бирата при повишени концентрации на LTP1, (Пример 5) е по-ясно изразен за LTP 1, изолиран от бира (проба III), отколкото за LTP1, изолиран от ечемик (фиг.8). Рекомбинационните експерименти, например анализ на пяната, осъществени на разтвори от 0.4 mg/ml проба I в дестилирана вода с повишени концентрации на LTP1, изолирани независимо дали от ечемик или от бира (проба III) потвърждават това наблюдение (фигури 9 и 10). Ефектът на ечемичени LTP1 върху потенциала на пяната в присъствие на проба I е по-малък от ефекта на сходна концентрация от проба III.

Пример 7.

ELISA тест (за определяне концентрацията на LTP1)

Получаване на антитела срещу ечемичени LTP1

Имунизират се два заека със 100 pg на имунизация ечемичени LTP1 (получени от брашно от ечемик сорт Алексис, както е описано в пример 1, процедура а) съгласно стан дартната имунизационна схема, използвана в Dako, Glostrup, Denmark.

От всяко животно са получени по 20 ml серум 54 дни след първото инжектиране и след това на месечни интервали.

Серумът, получен от първото взимане на кръв от едно животно, се използва по време на експериментите, описани по-долу.

Пречистване на антитела

Антитела от имуноглобулин, клас G (IgG), се пречистват от други серумни компоненти чрез афинитетна хроматография върху Протеин АSepharose (Pharmacia, Uppsala, Swden) съгласно инструкциите на производителя.

Антителата, разпознаващи LTP1, се разделят от антителата с други характеристики чрез афинитетна хроматография в малка колона, приготвена чрез ковалентно присъединяване на LTP1 от ечемик към Sepharose. 64 mg ечемичени LTP1 се разтварят в 10 ml 0.1 М NaHCO₃, 0.5 М NaCl при pH 8.3 и се свързват към 2 g активирана с CNBr Sepharose 4В (Pharmacia, Sweden) съгласно инструкциите на производителя. След това 1 ml от имуноадсорбента се напълва в малка колона и се еквилибрира с 10 тМ натриев фосфат, 150 mM NaCl, pH 7.3 (PBS₁₀). Имуноглобулиновата (IgG) фракция, пречистена чрез хроматография върху протеин A-Sepharose, се поставя в колона, която се промива с еквилибрационен буфер, докато стойността на А₂₈₀ достигане 0.002. Свързаният IgG се елуира с 0.05 М мравчена киселина, pH 2.0, разредена с 4 обема 10 х PBS₁₀ и pH се променя на 4.0 с NaOH. Накрая пробата се диализира срещу PBS₁₀ в мембрана Spectra/por^R(гранични размери 3 500 далтона) и се подлага на биотинилиране, както е описано по-долу.

Биотинилиране (маркиране с биотин) на антитела mg антитела в 1 ml PBS₁₀ се смесват с 0.1 ml натриево-карбонатен буфер с pH 9.5. След това антителата се биотинилират чрез добавяне на 57 μΐ 0.1 М BXNHS (биотинамидокапроатен N-хидроксисукцинимиден естер от Sygma USA, Cat. No В 2643) в DMSO (диметилсулфоксид) . Сместа се оставя 1 h на стайна температура. След това нереагиралият BXNHS се отстранява и буферът се променя до PBS₁₀ чрез гелфилтрация, осъществена съгласно инструкциите на производителя в малка колона с възможност за отвеждане на продукта Sephadex G-25 (PD-10, Pharmacia, Upsa la, Sweden), еквилибрирана c PBS_I0. Концентрацията на антителата в реагента се довежда до 1 mg/ml чрез добавяне на PBS_I0 до общ обем от 10 ml. След добавяне на 100 mg BSA (телешки серумен албумин), реагентът се съхранява в аликвоти при -20°С.

Ензимно свързано имуносорбентно изпитване (ELISA) за LTP

LTP се определя посредством конкурента ELISA процедура.

Отначало пречистеният ечемичен LTP се адсорбира към инертната повърхност на полистиренови ямки. Ямките са подредени в колони по 12, а редовете са поместени в рамки, всяка съдържаща 8 реда (Nunc Immuno Module Cl2 Maxisorb from Nunc, Denmrk). По 200 μΐ разреден разтвор на LTP1, получен, както е описано в пример 1, процедура а) (100 ng/ml PBS₁₀) се добавят към всяка ямка и се инкубират при 4°С 16-20 h. След това инкубиране останалите незаети места за свързване върху полистиреновата повърхност се блокират чрез инкубиране на 225 μΐ BSA/PBST (1 mg BSA/ml PBST, където PBST e PBS₁₀ c добавка на 0.05% Tween 20) във всяка ямка при 37°С, 1 h. След това ямките се изпразват и промиват шесткратно с PBST с уред за ръчно промиване и калибриране на полистиреновите участъци (Nunc Immuno Wash 12 from Nunc, Denmark) и се съхраняват при -20°С до използването им.

Преди анализирането им пробите, съдържащи LTP1, се разреждат подходящо в SA/PBST и стандартните разтвори, получени както е описано в пример 1, процедура а), се изготвят в същия буфер. Биотинилираните антитела, разпознаващи ечемичните LTP1, се добавят до крайна концентрация 100 ng/ml. По 200 μ! аликвоти от смесите се инкубират след това в ямките 1 h при 37°С. Всяка проба или контрола се анализира трикратно. След инкубиране ямките се изпразват и се промиват, както е описано по-рано.

В следващия етап по 200 μΐ аликвоти от стрептавидинов пероксидазен конюгат от хрян (Sygma, USA, Cat. No S 5512), разредени до 250 ng/ ml в BSA/PBST, се инкубират в ямките 10 min при 20-22°C. След това ямките отново се изпразват и се промиват.

Накрая по 200 μΐ субстратен разтвор, съдържащ 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ, 100 pg/ml) и 0.015% Н₂О₂ във фосфатно цитратен буфер, pH 5.0 се добавя във всяка ямка и се инкубира 10 min при 20-22°С. Ензимната реакция се спира чрез добавяне на 125 μΐ 4Ν НС1 към всяка ямка и абсорбцията на ямките при 450 пш се измерва в спектрофотометър, събиращ рамките с по 96 ямки. (Perkin-Elmer Lambda Reader).

Всяка серия анализи включва контроли в интервала 8 000-62.5 ng ечемичени LTPl/ml. Стандартната крива е получена на основата на зависимостта на абсорбцията от логаритъма на концентрацията на LTP 1 и всички концентрации на LTP1 в пробите се изчисляват съответно на тази крива.

Специфичност на антителата

Получените антитела срещу ечемичени LTP1, афинитетно пречистени, както е описано по-горе, се подлагат на разслояване по Western срещу ечемичени и пшеничени екстракти, пивна мъст и бира. Не са наблюдавани реакции с други компоненти освен LTP1 или модифицирани LTP1.

В ELISA анализите антителата разпознават LTP1 или модифицирани LTP1 от първата мъст и пяна, но в по-малка степен от LTP1 от ечемик. Ниската реактивност се дължи на модификациите, възникнали по време на майшуването, варенето на пивната мъст, ферментацията и образуването на пяната. В сравнение с концентрациите, определени чрез аминокиселинен анализ (пример 3), реакцията с LTP1 или модифицирани LTP1 от първата мъст представлява около 65% от реакцията с LTP1, получени от ечемично брашно, както е описано в пример 1, процедура а). Реакцията с LTP1 или модифицирани LTP1 от конгресен слад се определя като около 90% от реакцията с LTP 1, получени от ечемично брашно. Тъй като стандартната крива е получена на базата на ечемичени LTP (получени, както е описано в пример 1, процедура а), настоящото количество LTP1 или модифцирани LTP1 в конгресен слад може да бъде определено чрез мултиплициране на резултата от стандартната крива за ечемичени LTP1 с 10/9.

Пример 8.

Добавяне на LTP по време на получаването на пивната мъст.

За изследване на ефекта от добавяне на LTP по време на варенето на пивната мъст, се създава моделна система. Сладката пивна мъст се вари 90 min в колба с кръгло дъно, свързана към обратен хладник, като се изпол зва нагряващ кожух. Провеждат се два вида експерименти: а) чисти ечемични LTP1 от сорт Alexis (DK, 1992), получени, както е описано в пример 1, процедура а) (0.5 mg/ml и/или екстракт от хмел (61 mg α-киселина /1) се до бавят в началото на варенето и Ь) чисти ечемичени LTP1 се добавят към пивната мъст (варена или неварена със или без хмелов екстракт (61 mga-киселина /1), но не се подлагат 5 на варене.

Таблица V

Без добавени LTP	Потенциал на пяната	Добавяне на LTP (0.5 g/ml)	Потенциал на пяната
Сладка пивна	0.37 0.01	Сладка	0.75 0.05
мъст		пивна мъст
Пивна мъст,	0.91 0.96	БТР,доба-	1.15 0.02
варена без		вени към	1.15 0.02
хмел		мъстта преди ва-
		рене без хмел
		LTP,pa3TBO-	1.24 0.09
		рени в пивна мъст,
		варена без хмел
Пивна мъст,	1.68 0.07	ЕТР,добаве-	2.15 0.02
варена с хмел		ни към пивна мъст
		преди варенето с хмел
		LTP,разтворени в	1.93 0.17
		пивна мъст, варена с
		хмел

Пример 9. Бира с висока концентрация на LTP се получава в 50 L пилотна пивоварна инсталация Карлсберг с помощта на 60% лагерувала пивна мъст и 40% спомагателни материали (царевично едро смляно брашно). Царевичното брашно е подбрано съгласно спецификацията на пивоварна Карлсберг, и поспециално:

вода - %	<12.5
екстракт, сухо
вещество, %	>89%
мазнини,сухо
вещество, %	<1.0%
Сортиране със сито на
Pfungstadter	>2 mm 0	'%
	>1.2mm	<3.5%
	<0.2mm	<5.0%

Процесът на вареното на пиво включва декокционно майшуване и варене на пивната мъст 90 min с 10%-но изпаряване. 15 min след началото на варенето на мъста се добавя необработен препарат на LTP1 към казана със слад. Този препарат се екстрахира от 6 х 25 kg брашно от ечемик сорт Алексис, отгледан в Дания, 1992, концентрира се чрез ултрафилтрация и се преципитира с амонив сулфат, както е описано по-горе. Преципитатът се разтваря в 5L вода, диафилтрира се до 850 ml, нагрява се до 100°С и незабавно се охлажда върху лед. Разтворът се центрофугира в центрофуга на Сорвал RC3 30 min при 4000 rpm. Концентрацията на LTP1 в супернатантата, определена с ELISA, е 60 mg/ml, като се добавят 800 ml към казана със слада. Крайната пивна мъст е 14.4% Plato. Мъста ферментира с дрожди на Карлсберг (Sacharomyces carlsbergensis) в цилиндрични конични танкове. Първичната ферментация се провежда 9 дни и съзряването и стабилизирането продължава 10 дни.

Накрая бирата се филтрира и се довежда до 10.6% Plato.

Способността на тази бира да образува пяна, както и бирата, получена от същите суровини при идентични условия, но без доба5θ вяне на LTP1, се измерва с анализатор на стабилността на пяната, System Carlsberg. Времето на полуживот на пяната на бирата с високо съдържание на LTP1 се повишава до 113 S в сравнение с 93 S за бира без добавяне на LTP1. Пример 10.

Количества LTP 1 (сумата от модифицирани и немодифицирани LTP 1) в конгресен слад. 5 Малцът се приготвя от няколко различни сорта ечемик, които обикновено се използват в пивоварството. Сортовете ечемик са отглеждани в различни местности и са събрани през различни години. 10

Малцът се приготвя като за лагерна бира. Конгресният слад се изготвя от проби на малца с помощта на ЕВС стандартния метод на майшуване, както е описано по-горе.

Количествата LTP 1 (сумата от модифицирани и немодифицирани LTP1) в пробите конгресен слад се определят чрез ELISA процедурата, описана по-горе. Анализирани са общо 82 проби слад, които съответстват на 41 проби малц.

ELISA се провежда, както е описано в пример 7, и концентрацията на LTP1 се определя с помощта на стандартна крива като еквивалент на ечемичени LTP1, т.е. без мултиплициране с корекционния фактор.

Резултатите са изложени на таблица VI. Всяка стойност представлява средната стойност между два различни конгресни слада.

Таблица VI

Сорт ечемик	Страна на произхода	Година на събиране	LTP в конгресен слад mg/1
Триумф Ариел	Франция		65 70
неизвестен	Австралия		85
неизвестен	Германия	7	108
Алексис	Великобритания	1992	66
Триумф	Франция	1992	76
Ариел	Дания	1992	82
неизвестен	Австралия	7	99
неизвестен	Австралия	7	96
неизвестен	Австралия	7	78
неизвестен	Англия	7	118
Наташа	Франция	1992	118
Халцион	Франция	1992	78
BL.IIIs	7	1991	92
Наташа	Франция	1992	104
Наташа	Франция	1992	102
Халцион	Дания	1992	109
Карузо	Франция	1993	120
Сеньор	Дания	1993	70
Алексис-81	Дания	1993	82
Джесика	Дания	1993	93
Чариот	Дания	1993	79
Голди	Дания	1993	84
Локи	Дания	1993	81
Мауд	Дания	1993	110
неизвестен	Индия	1993	121
неизвестен	Англия	1993	103
неизвестен	Англия	7	110
неизвестен	Шотландия	7	113
неизвестен	7	7	140

Продължение

Ленка	Дания	1992	87
Ленка	Дания	1992	98
неизвестен	?	1993	61
Наташа	Франция	1992	76
Халцион	Дания	1992	69
Алексис	Англия	1992	75
неизвестен	Дания	1992	100
неизвестен	Англия	1992	99
неизвестен	Англия	1992	93
Алексис	Дания	1992	92
Алексис	Даня	1992	91
неизвестен	Англия	1992	102
Алексис	Дания	1993	67
Триумф	Франция	1992	90

Пример 11.

Изолиране и пречистване на зърнени LTP от пшеничено брашно

Чисти пшеничени LTP1 се изолират от 30 kg пшеничено брашно чрез екстракция с 270 1 вода при pH 7.8 за 4 h. Сместа се оставя за една нощ при 4°С, за да се позволи на неразтворимите вещества да преципитират. 195 1 от супернатантата се концентрира чрез ултрафилтрация до 6.9 1 и останалото брашно се отстранява чрез центрофугиране. Добавя се амониев сулфат до насищане 80% и след 16 h при 4°С получената суспензия се подлага на центрофугиране. Една четвърт тон преципитат се разтваря в 400 ml вода и се диализира в Spectra/por^R диализна мембрана (граничен размер 3 500 Далтона) срещу вода. Диализатът се центрофугира, неговото pH се довежда до 6.5 и се подлага на йонообменна хроматография в колона S-Sepharose Fast Flow (5 cm χ 15 cm, 300 ml), еквилибрирана в 20 mM Mes, pH6.5 Пшеничните LTP1 се елуират чрез добавяне на градиент от NaCl (0 до 0.1 М) в същия буфер.

Фракциите, съдържащи компонент с размер 10 kDa, се идентифицират със SDS-PaGE с помощта на Fast-System, Pharmacia, събират се и се концентрират под вакуум при 35°С в ротационен изпарител. Компонентите в концентрираната проба се разделят с гелфилтриране върху Sephadex G50 в колона (2.5 cm х 67 cm, 330 ml), еквилибрирана с 20 mM NaAc, 0.1 М NaCl, pH 4.9. Пикът, получен от 10 kD протеин, се идентифицира чрез SDS-PAGE и секвениране на N-крайни аминокиселини, което показва следната последователност Ile-Asp-*-Gly-His- ValAsp-Ser-Leu-Val-, където звездичката означава празна позиция, съответства на Cys, намерен в тази позиция в пшенични LTP 1, потвърждавайки, че този компонент е чист пшеничен LTP1. Препаратът се диализира в Spectra/por^Rдиализна мембрана (граничен размер 3 500 Далтона) и се лиофилизира.

Пример 12.

Добавяне на пшеничени LTP1 по време на получаване на пивна мъст

Ефектът от добавянето на пшеничени

LTP1 по време на варенето на пивната мъст се изследва с помощта на моделната система, описана в пример 8. Чисти пшеничени LTP (получени, както е описано в пример 11) (0.5 45 mg/ml) и/или хмелов екстракт (61 mga-киселина/1) се добавят в началото на варенето. Полученият потенциал на пяната е показан в таблица VII.

Таблица VII

Без добавяне на LTP	Потенциал на пяната (ml/ml)	Добавяне на LTP (0.5 mg/ml)	Потенциал на пяната (ml/ml)
Пивна мъст,	1.01 0.04	LTP,добавени към	1.76	0.07
варена без хмел		пивна мъст преди варене без хмел
Пивна мъст,	1.65 0.05	LTP, добавен към	2.28	0.08
варена с		пивната мъст
хмел		преди варене
		с хмел

Пример 13. Влияние на варенето върху потенциала на пенообразуване на ечемичени и пшеничени LTP1.

Ечемичени или пшеничени LTP1 (0.5 mg/ml), получени както е описано в примери 1 b и 11, съответно, се разтварят в 20 mM Mes (2-(М-морфолино) етансулфонова киселина), pH 5.5. Добавят се 2% етанол (със или без 2.5 mg/ml трилинолеин) по време на обработка с ултразвук. Добавя се екстракт от хмел до крайна концентрация 61 mg α-киселини 1, както е описано в таблица VIII, и сместа се вари 90 min, както е описано в пример 8. Измерването на пяната се осъществява след добавяне на HMW (високомолекулна) фракция (2.5pg/ml), получена както е описано в пример 2.

Таблица VIII

	Варене	Добавки	Потенциал на пяната
Ечемичени	-	-	0.78 0.02
LTP1	90 min	-	0.61 0.03
	90 min	хмел	1.40 0.05
	90 min	хмел ⁺трилинеолин	1.92 0.05
Пшеничени	-	-	0.80 0.04
LTP1	90 min	-	1.02 0.03
	90 min	хмел	1.85 0.06
	90 min	хмел ⁺трилинеолин	1.83 0.07

Патентни претенции

Claims

Патентни претенции

1. Напитка, съдържаща протеини и/или пептиди, характеризираща се с това, че съдържа зърнени липид транспортиращи протеини (LTP) и/или техни хомолози,представляващи протеини с 50 - 110 аминокиселини, за предпочитане 80-100 аминокиселини, имащи поне 60%, за предпочитане 80% или повече секвенционна хомоложност със зърнените LTP, и/или модифицирани фракции на зърнени LTP, получени от зърнените LTP и/или хомолозите им чрез нагряване, варене и/или майшуване на зърнените LTP и/или хомолозите им във вода при pH между 3 и 7, като концентрацията на зърнените LTP и/или хомолозите им 45 и/или модифицираната зърнена LTP фракция е поне X, за предпочитане поне XI, когато напитката е бира, където X и XI са количествата, получавани при варенето на бирата само от суровините, без LTP-съдържащи мате50 риали, от които суровини по ЕВС метод на стандартно майшуване се получава конгресен слад с концентрация на зърнени LTP, съот ветстваща на 125 pg/ml, респективно на 150 pg/ml немодифициран LTP1.
2. Напитка съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че съдържа ечемичени LTP и/или техни хомолози, и/или модифицирани зърнени LTP фракции, получавани от ечемичени LTP.
3. Напитка съгласно претенция 1 или 2, характеризираща се с това, че напитката е ферментационна.
4. Напитка съгласно претенции 1,2 или

3, характеризираща се с това ,че концентрацията в напитката е поне 25 pg/ml и за предпочитане повече от 100 pg/ml.
5. Напитка съгласно претенции от 1 до

4, характеризираща се с това, че съдържа и зърнени протеини като хордеин и/или глутелин или техни фрагменти.
6. Напитка съгласно претенции от 1 до

5, характеризираща се с това, че съдържа и други албумини, като протеин Z, получаван от бира.
7. Напитка съгласно претенции от 1 до

6, характеризираща се с това, че съдържа и въглехидрати.
8. Напитка съгласно претенции от 1 до

7, характеризираща се с това, че съдържа и липиди и/или мастни киселини.
9. Напитка съгласно претенции от 1 до

8, характеризираща се с това, че напитката е бира.
10. Напитка съгласно претенции от 1 до

9, характеризираща се с това, че съдържа и хмелови компоненти като хмелови изо-α киселини и други горчиви смоли на хмела.
11. Метод за получаване на протеин/ пептид съдържаща напитка, характеризиращ се с това, че зърнени LTP и/ли техни хомолози, представляващи протеини с 50-110 аминокиселини, за предпочитане 80-100 аминокиселини с поне 60%, за предпочитане 80% или повече секвенционна хомоложност със зърнените LTP и/или пептид/ протеинова фракция, получавана чрез нагряване, варене и/ или майшуване на зърнени LTP и/или техни хомолози във вода при pH между 3 и 7, се добавят към напитката непрекъснато или на един или повече етапа от получаването й, като количеството на добавяните зърнени LTP и/или техни хомолози и/или техни модифицирани фракции е поне X, за предпочитане поне XI, когато напитката е бира, при което X и XI са количествата, получавани при варене на бира само от изходни суровини без добавяне на LTPсъдържащи материали, от които суровини по стандартния ЕВС метод на майшуване се получава конгресен слад с концентрация на зърнени LTP 125 pg/ml и съответно 150 pg/ml немодифицирани LTP1.
12. Метод съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че зърнените LTP и/ или техните хомолози и/ или техните модифицирани фракции се добавят преди етапа на майшуване.
13. Метод съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че зърнените LTP и/ или техните хомолози и/или техните модифицирани фракции се добавят преди етапа на варене.
14. Метод съгласно претенции от 11 до

13, характеризиращ се с това, че зърнените LTP са ечемичени LTP1.
15. Метод съгласно претенции от 11 до

14, характеризиращ се с това, че зърнените LTP и/или техните хомолози и/или техните модифицирани фракции се добавят под формата на частично или напълно разтворима добавка.
16. Метод съгласно претенции от 11 до

15, характеризиращ се с това, че зърнените LTP и/или техните хомолози и/или техните модифицирани фракции се добавят в количество поне 25 pg/ml, за предпочитане повече от 100 pg/ml.
17. Метод съгласно претенции от 11 до 16 за получаване на бира, включващ следните етапи:

а) получаване на малц или малцов екстракт,

б) получаване на пивна мъст

в) ферментация на пивната мъст

г) осветляване и окончателна обработка на бирата, характеризиращ се с това, че зърнени LTP и/или техни хомолози и/или техни модифицирани фракции се добавят преди или на един или повече от етапите а), б), в) и г).
18. Метод съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че зърнените LTP и/ или техните хомолози и/или техните модифицирани фракции се добавят по-специално на или преди етап б).
19. Метод съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че зърнените LTP и/ или техните хомолози и/или техните модифи цирани фракции са получени от ечемик, който е обработен, за да има високо съдържание на LTP, по-специално LTP1 посредством генетична трансмисия, а малцът е получен от семената на обработения ечемик.
20. Метод съгласно претенция 17, характеризиращ се с това ,че зърнените LTP и/или техните хомолози и/или техните модифицирани фракции се получават от дрожди, които имат ДНК последователността, кодираща за зърнени LTP и по-специално за LTP1 в генома, си като дрождите се добавят в етап в).
21. Приложение на съединение, съдържащо зърнени LTP и/или техни хомолози, представляващи протеини с 50-110 аминокиселини, за предпочитане 80-100 аминокиселини, с поне 60%, за предпочитане 80% или повече секвенционна хомоложност със зърнените LTP, и/или модифицирани зърнени LTP фракции, получени чрез нагряване, варене и/или майшуване на зърнените LTP и/или техните хомолози във вода при pH между 3 и 7, като пенообразуваща добавка за напитки.

5
22. Приложение съгласно претенция 21, където съединението включва зърнените LTP и/или техни хомолози и/или техни модифицирани фракции под формата на смлени или натрошени зърна или зърнени продукти или 10 екстракт от зърна и/или зърнени продукти.
23. Приложение съгласно претенция 21, където модифицираната зърнена LTP фракция е получена от зърнени LTP, варени във вода заедно с един или повече от следните 15 компоненти: хордеин, хмелови компоненти и липиди, по-специално триглицериди.