WO2007007487A1 - ビール又はビール様飲料の製造方法 - Google Patents

ビール又はビール様飲料の製造方法 Download PDF

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protein deamidase
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Hitoshi Amano
Shotaro Yamaguchi
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Amano Enzyme Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C5/00—Other raw materials for the preparation of beer
    • C12C5/004—Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C7/00—Preparation of wort
    • C12C7/04—Preparation or treatment of the mash

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing beer or beer-like beverage, and more particularly to a method for producing beer or beer-like beverage with improved aroma and taste.
  • Patent Document 5 discloses a method for improving foam retention by adding a plant protein degradation product having a molecular weight of 3,500 to 30,000 at the end or end of the main fermentation.
  • Patent Document 6 there is a method for producing a beer having a new flavor by adding a peptide having a molecular weight of 200 to 4,000 to a fermentation raw material liquid at a time before the initial stage of main fermentation. It is disclosed.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-78740
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 10-225287
  • Patent Document 3 Japanese Patent Publication No. 55-38109
  • Patent Document 4 Japanese Patent Publication No. 55-38110
  • Patent Document 5 Japanese Patent Publication No. 39-14490
  • Patent Document 6 JP-A-9-47276
  • Patent Document 7 Japanese Patent Laid-Open No. 2000-50887
  • Patent Document 8 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-218590
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a beer or a beer-like beverage having a rich and unique aroma and umami.
  • the present inventors have sought a new production method that provides a beer or beer-like beverage that has an aroma and a taste different from those obtained by conventional methods.
  • the aroma of beer or beer-like beverages can be improved using the action of protein deamidase.
  • the present invention provides the following production method and the following beer or beer-like beverage.
  • a method for producing beer or a beer-like beverage characterized in that a protein deamidase is allowed to act on at least a part of the raw material in the production process.
  • the deamidated peptide obtained by the action of protein deamidase and proteolytic enzyme is added in at least a part of the production process of beer or beer-like beverage, Manufacturing method.
  • a beer or beer-like beverage containing a deamidated protein obtained by the action of a protein deamidase and Z or a deamidated peptide.
  • Patent Document 7 Japanese Patent Laid-Open No. 2000-50887 (Patent Document 7), Japanese Patent Laid-Open No. 2001-218590 (Patent Document 8) discloses a method for improving the functionality of food proteins, that is, emulsifying properties, foam properties, and solubility, by protein deamidase.
  • Patent Document 8 discloses a method for improving the functionality of food proteins, that is, emulsifying properties, foam properties, and solubility, by protein deamidase.
  • Patent Document 8 discloses a method for improving the functionality of food proteins, that is, emulsifying properties, foam properties, and solubility, by protein deamidase.
  • Foods that act on protein deamidases are described in these documents as coffee ⁇ whitener, juice, dressing, mayonnaise, cream, tempura, hot cake, bread, crackers, biscuits, cookies, pizza , Pies, mineral absorption accelerators, amino acid seasonings (HAP, HVP), miso, soy sauce, isolated soy protein, concentrated soy protein, baby food, yogurt, ham's sausage, pudding-like food, beer or beer.
  • HAP amino acid seasonings
  • miso soy sauce
  • isolated soy protein concentrated soy protein
  • baby food yogurt
  • ham's sausage pudding-like food
  • beer or beer There is no mention of the use of protein deamidase in the manufacture of a beverage-like beverage.
  • those described in these documents as food proteins that act on protein deamidase are derived from milk, livestock meat, fish meat, wheat, soybeans, and eggs, and are used as ingredients for beer or beer-like beverages. No mention of barley protein.
  • protein deamidase is allowed to act on the raw material in the process of producing beer or beer-like beverage, thereby having a protein content and protein composition different from those of the conventional one.
  • a beer or beer-like beverage having a unique aroma and umami can be obtained.
  • the protein deamidase action can increase the solubility of proteins that are easily turbid. As a result, it is possible to prevent turbidity without causing deterioration in foam retention. The result is a beer or beer-like beverage with excellent foamability.
  • FIG. 1 is a result of analyzing wort obtained in Example 1 by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Lanes 1 to 9 correspond to additive-free, PG1, PG2, PG3, PG4, PG5, UM, PN, and UM + PN in Table 1, respectively, and lane M represents a molecular weight marker.
  • the production method of the present invention is characterized in that a protein deamidase is allowed to act on at least a part of the raw material in the production process. Typically, proteins are part of the manufacturing process.
  • protein deamidase is allowed to act on raw materials such as malt (main raw material) and auxiliary raw materials.
  • raw materials such as malt (main raw material) and auxiliary raw materials.
  • a protein and Z or peptide previously deamidated by the action of protein deamidase may be added.
  • protein deamidase may not be added directly in the production process.
  • the production process of beer or beer-like beverage means pulverized malt, or crushed malt and auxiliary material, or !, or hot water is added only to the auxiliary material and mixed in a sugar tank.
  • the process of obtaining wort by filtering the mash after the sugar koji, adding the hop to this wort and inoculating the yeast after boiling, removing the yeast after fermentation! The process up to aging in storage tanks.
  • Protein deamidase can be added in any of these steps (or multiple steps). When protein deamidase is added to the preparation process, the protein originally remaining in the beer koji derived from the malt or the auxiliary material in the raw material is deamidated and released into the wort by increasing the solubility.
  • the nitrogen-containing compounds necessary for yeast can be supplied sufficiently.
  • protein deamidase is added to the yeast fermentation process, proteins and peptides in the wort are deamidated and are easily assimilated by the yeast by the endogenous protease and peptidase of the yeast.
  • the metabolism of yeast during fermentation is active or changed, and the aroma component of beer is greatly enhanced or changed.
  • the auxiliary material in the present invention is a raw material other than malt and hops as defined by the Liquor Tax Law, for example, barley, wheat, rye, buckwheat, corn, rice, rye, potato, large It refers to vegetable raw materials such as beans, endu beans, and chickpeas, animal raw materials such as gelatin, or proteins and Z or peptides derived from these raw materials.
  • the protein that is deamidated in advance by a protein deamidase is not particularly limited, and examples thereof include barley, wheat, rye, buckwheat, corn, rice, corn, potato, soybean , Food proteins derived from plant materials such as endou beans and chickpeas, and food proteins derived from animal materials such as gelatin.
  • the beer or beer-like beverage in the present invention is not limited to beer under the liquor tax law, and refers to all brewed liquors that are fermented using brewer's yeast such as V, so-called happoshu, and hybrids.
  • the protein deamidase used in the present invention directly acts on an amide group in a protein or peptide and has a deamidating action without being accompanied by cleavage or crosslinking of the protein or peptide.
  • Examples of any of those that can be used include the enzymes described in JP-A No. 2000-50887 and the enzymes described in JP-A No. 2001-218590.
  • protein deamidase peptide glutaminase such as peptide glutaminase I and peptide glutaminase II derived from Bacillus circulans described in Biochemistry, 10 ⁇ , 1222-1229 (1971), FEBS Letter, 302 ⁇ , 1 69-171 (1988), Physiologia Plantarum 96 ⁇ , 662-666 (1996), Agriculture 42 ⁇ Nr. 3/4, S.168-169 (1998)
  • protein deamidase such as protein deamidase.
  • the protein deamidase one prepared from a culture solution of a microorganism producing protein deamidase can be used.
  • the microorganism used for the preparation of the protein deamidase is not particularly limited, and is a microorganism that produces the enzyme in its culture solution.
  • Microorganisms belonging to the genus Empedobacter, the genus Sphingobacterium, the genus Aureobacterium, or the genus Myroides can be used.
  • No.9670 has the accession number FERM BP— 7351 (November 8, 2000) Based on the request for transfer, transferred from the domestic deposit of FERM P—17664 to the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (currently National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biodeposition Center, 305-8566 Ibaraki It is deposited in Tsukuba Sagahigashi Prefecture 1-chome 1-1 No. 1 center 6).
  • a protein deamidase can be obtained from the culture solution or cells of the microorganism. That is, it can be recovered from the culture solution if it is a secretory protein, and from the bacterial cells otherwise.
  • known protein separation and purification methods centrifugation, UF concentration, salting out, various chromatographies using ion exchange resin, etc.
  • the target enzyme can be obtained by centrifuging the culture solution to remove the cells and then combining salting-out, chromatography and the like.
  • the microbial cells When recovering the enzyme from the microbial cells, for example, the microbial cells can be crushed by pressure treatment, ultrasonic treatment, etc., and then separated and purified in the same manner as described above to obtain the target enzyme. It should be noted that the above-described series of steps (crushing, separating, and purifying the cells) may be performed after the culture fluid cells are collected in advance by filtration, centrifugation, or the like.
  • the amount of the protein deamidase added is not particularly limited as long as it is an amount necessary for deamidation of the protein, but usually 0.005 to 100 units, preferably 0.05 to 10 units, per ml of the raw material.
  • a protein deamidase and a proteolytic enzyme are used in combination. That is, in the production method of this embodiment, a protein deamidase and a proteolytic enzyme are allowed to act on at least a part of the raw material. For example, protein deamidase and proteolytic enzyme are added as part of the production process. Both enzymes need not be added simultaneously.
  • the step of adding the protein deamidase and the step of adding the proteolytic enzyme may be different. Thus, the order in which both enzymes are added at different timings is not particularly limited.
  • a peptide obtained by acting a proteolytic enzyme may be added during the production process.
  • a deamidized peptide (or deamidized protein) obtained by using a protein degrading enzyme and a protein deamidase in combination may be added during the production process.
  • proteolytic enzymes JP-A-2000-50887 for example, can be referred to for a method of acting in combination with a protein deamidase.
  • the proteolytic enzyme used in the present invention refers to an enzyme that catalyzes the hydrolysis of a peptide bond of a protein.
  • proteolytic enzymes include proteases derived from animals such as pepsin, trypsin and chymotrypsin, plant-derived proteases such as papain and bromelain, and proteases derived from various microorganisms. Use a combination of multiple types of proteolytic enzymes.
  • the treatment with protein deamidase is performed simultaneously with or continuously with conventionally used enzyme agents such as amylases, pullulanases, cellulases, hemicellulases, dalucanases, and protease 'peptidases. May be implemented. By using together with such other enzyme agents, fermentability and workability can be improved, and a darker beer or beer-like beverage can be produced.
  • enzyme agents such as amylases, pullulanases, cellulases, hemicellulases, dalucanases, and protease 'peptidases.
  • Chrysobacterium sp. No. 9670 (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center Accession No. FERM BP-7351) was cultured at 25 ° C for 40 hours in LB Base medium. Next, the cells were removed by centrifuging the culture solution at 4 ° C, 12000 rpm (22200 Xg) for 20 minutes, and the resulting supernatant was centrifuged using an ultrafiltration membrane (SEP-0013, manufactured by Asahi Kasei). ) And concentrated to about 25 times, and then freeze-dried to obtain a crude enzyme powder.
  • SEP-0013 ultrafiltration membrane
  • Cefacryl S-100 collected from protein deamidation active fractions, concentrated with an ultrafiltration membrane, and equilibrated with 10 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5) containing 0.6 M NaCl and 0.05% Tween 20 The column was applied and eluted with the same buffer. Measure enzyme activity of each fraction by the following method Then, the protein deamidation active fraction was collected and concentrated with an ultrafiltration membrane to obtain a protein deamidase solution.
  • the activity was measured by the following method using Z-Gln-Gly (wherein Z means benzyloxycarbonyl group) as a substrate and the method using casein as a substrate.
  • Z-Gln-Gly as a substrate
  • 13.5 units / ml casein as a substrate
  • Enzyme activity measurement method The enzyme activity was measured according to the following method using Z-Gln-Gly and casein as substrates.
  • Activity measurement method Add 176 mM phosphate buffer (pH 6.5) 100 1 containing 10 mM Z-Gln-Gly, add enzyme solution 101, incubate at 37 ° C for 60 minutes, then 12% Triclo mouthpiece The reaction is stopped by adding 10 0 1 of acetic acid solution. After centrifugation (15000 rpm, 4 ° C, 5 minutes), the supernatant is measured with F-kit ammonia (Roche Diagnostics) as follows (Al). Separately, measure in the same manner using water instead of the enzyme solution (A2).
  • a concentrated solution of protein deamidase (60 U / ml) prepared by the method of Example 1 above is added to a raw material obtained by grinding 300 g of malt and mixing with 1050 ml of warm water at 48 ° C. A dredge process was performed. After completion of the sugar koji process, the mixture was filtered through filter paper to obtain wort. As a control, a non-enzyme-free cocoon was established and the same procedure was performed.
  • proteases and peptidases As for UMAMIZYM (Amano Enzym Co., Peptidase Power 70U / g) 60mg added group, Pupase Thease N (Amano Enzym Co., Ltd., protein digestion 150,000U / g) 60mg added group, UMAMI ZYM 60mg and Protease N60mg The same was done for Nada Ward.
  • Table 1 shows the results of quantification of the protein content in the obtained wort using a DC protein assembly kit (Bio-RAD). The protein content was determined by preparing a calibration curve using bovine serum albumin as a standard substance. The protein in the obtained wort was analyzed by SDS-polyacrylamide electrophoresis. SDS-polyacrylamide electrophoresis was performed using a Phast system 8-25% gel (Falmacia). The results are shown in Fig. 1.
  • the protein deamidase-supplemented protein showed a protein with a molecular weight of 30,000 to 40,000 (b in the figure) and SDS- It can be seen that high molecular weight protein (a in the figure) is eluted in the wort and does not enter the polyacrylamide gel, and the increase depends on the amount added! This protein with a molecular weight of 30,000 to 40,000 is presumed to be protein protein derived from barley.
  • the protein content in wort increased in the protease peptidase addition group (Table 1), but no increase in protein was observed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis ( Figure 1). Therefore, it can be seen that low-molecular-weight proteins, that is, peptides are increased in the protease 'peptidase group.
  • the amount of soluble protein in wort can be increased by the action of protein deamidase, and proteins that are not found in the case of ordinary production methods can be increased. could be eluted.
  • a sufficient amount of nitrogen-containing compound can be supplied to the yeast during the subsequent fermentation process. This activates the metabolism of yeast and enhances the aroma of beer.
  • amino acids and low molecular weight peptides that can be used by yeasts due to the action of malt proteases, protease agents added as needed, or yeast proteases themselves. Becomes easier to generate.
  • the protein deamidase solution (60 U / ml) prepared by the method of Example 1 above is added to the raw material obtained by pulverizing 75 g of malt and 225 g of barley and mixing with 1050 ml of warm water at 48 ° C. The process was performed. After completion of the sugar koji process, the mixture was filtered through filter paper to obtain wort. As a control, an enzyme-free group was provided and the same procedure was performed. The test group to which protein deamidase and hammazyme were added simultaneously was also carried out in the same manner. Table 2 shows the results of quantification of the protein content in the obtained wort using a DC protein assembly kit (manufactured by Bio-RAD).
  • the protein content was determined by preparing a calibration curve using bovine serum albumin as a standard substance.
  • the protein in the obtained wort was analyzed by SDS-polyacrylamide electrophoresis.
  • SDS-polyacrylamide electrophoresis was performed using Phast system 8-25% gel (Falmacia).
  • the beer or beer-like beverage produced by the method of the present invention has a different composition of protein, peptide, and Z or amino acid content compared to beer produced by the conventional method. This gives a beer or beer-like beverage with a rich and unique aroma.
  • improvement in foamability can be expected by the action of protein deamidase.

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Abstract

　本発明は、芳醇で且つ独特の香気や旨味を有するビール又はビール様飲料の製造方法を提供する。製造過程において原料の少なくとも一部に蛋白質脱アミド酵素を作用させて、ビール又はビール様飲料を製造する。

Description

明 細 書
ビール又はビール様飲料の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、ビール又はビール様飲料の製造方法に関し、さらに詳しくは香気や旨 味などが改良されたビール又はビール様飲料を製造する方法に関するものである。 背景技術
[0002] 麦汁中の蛋白質やその分解産物であるペプチド、遊離アミノ酸含量及び組成は、 酵母の代謝に重大な影響を与え、その結果、ビールの品質上非常に重要な成分で ある高級アルコール，エステル，ジァセチル等の香気成分含量は大きく変化する。ま た、ビール及びビール様飲料においては、その泡立ち性、泡持ち性は極めて重要で ある。ビール及びビール様飲料の泡は、グラスに注いだ後の酸ィ匕を防ぎ、炭酸ガスを 逃さない役目を担っており、密度が高くこわれにくい泡が理想的であり、ビール中の 特定の蛋白質が関与していることが知られている。また、一般的に蛋白質は、食品中 の泡沫安定性に大きく寄与し、より高分子蛋白質、より高濃度、高い粘度蛋白質溶液 が安定な泡を形成すると言われている（例えば非特許文献 1を参照)。
[0003] 従来、麦汁中の蛋白質、ペプチド、アミノ酸の濃度、組成をコントロールすることは、 麦芽品質によるところが大きく殆んど不可能であった。近年、より濃醇なビール及びビ ール様飲料を製造するため、麦汁製造工程において酵素剤の使用が知られている 力 麦汁中の窒素含量を向上する目的ではもっぱらプロテアーゼ (蛋白質分解酵素 )が使用されている。
[0004] 例えば、ビール醸造用麦汁の製造工程においてプロテアーゼを添加することが提 案されているが（例えば特許文献 1及び 2を参照）、この方法は麦汁中の遊離アミノ酸 含量のみ向上させ、ビールの香味を改善することが目的である。また、大麦原料と共 にプロテアーゼを添加する麦汁製造工程が提案されて ヽるが（例えば特許文献 3及 び 4を参照）、この方法は大麦原料を用いることが目的である。また、ビールの醱酵、 貯蔵工程において、混濁原因となる蛋白質を分解する目的でパパインなどのプロテ ァーゼの使用が古くから知られている力 反面ビールの泡持ち性が低下することが知 られている。
一方、ビール又はビール様飲料の製造工程において、蛋白質分解物を添加する 方法が開示されている。特許文献 5では、分子量 3,500〜30,000の植物性蛋白質分 解物を主醱酵末期或いは終了時に添加して泡持ちを改善する方法が開示されてい る。特許文献 6においては、分子量 200〜4,000のペプチドを、主醱酵の初期以前の 時点で醱酵原料液に添加して、従来にな 、新し 、香味を有するビールを製造するす る方法が開示されている。
[0005] 特許文献 1 :特開平 6— 78740号公報
特許文献 2：特開平 10— 225287号公報
特許文献 3：特公昭 55— 38109号公報
特許文献 4：特公昭 55— 38110号公報
特許文献 5：特公昭 39 - 14490号公報
特許文献 6：特開平 9—47276号公報
特許文献 7：特開 2000 - 50887号公報
特許文献 8：特開 2001— 218590号公報
特干文献 1： Functionality of Proteins in Food., J.F. Zayas, ed., springer— Verlag B erlin Heidelberg 1997, p.272-274
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は、芳醇で且つ独特の香気や旨味を有するビール又はビール様飲料の製 造方法を提供することを目的とする。特に、従来のプロテアーゼ 'ぺプチダーゼ類の 添加、或いは通常の蛋白質やペプチドの添加では得られな力つた香気や旨味を有 するビール又はビール様飲料の製造方法を提供することを目的とする。また、泡持ち 性の向上したビール又はビール様飲料の製造方法を提供することを目的とする。 課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、従来の方法で得られるものとは異なる香気'旨味を有し、且つ芳醇 なビール又はビール様飲料を提供すベぐ新たな製造方法を模索した。その結果、 蛋白質脱アミド酵素の作用を利用してビール又はビール様飲料の香気等の改善を 図るという、これまでとは全く異なる観点力もの改質方法を見出すに至った。即ち、本 発明は以下の製造方法、及び以下のビール又はビール様飲料を提供する。
[1] 製造過程において原料の少なくとも一部に蛋白質脱アミド酵素を作用させるこ とを特徴とする、ビール又はビール様飲料の製造方法。
[2] ビール又はビール様飲料の製造工程の少なくとも一部において、蛋白質脱アミ ド酵素を添加することを特徴とする、 [1]に記載の製造方法。
[3] 仕込み工程、発酵工程、又は熟成工程において蛋白質脱アミド酵素を添加す ることを特徴とする、 [2]に記載の製造方法。
[4] ビール又はビール様飲料の製造工程の少なくとも一部において、さらに蛋白質 分解酵素を添加することを特徴とする、 [2]又は [3]に記載の製造方法。
[5] ビール又はビール様飲料の製造工程の少なくとも一部において、蛋白質脱アミ ド酵素の作用で得られた脱アミド化蛋白質及び Z又は脱アミド化ペプチドを添加する ことを特徴とする、 [1]に記載の製造方法。
[6] ビール又はビール様飲料の製造工程の少なくとも一部において、蛋白質脱アミ ド酵素及び蛋白質分解酵素の作用で得られた脱アミド化ペプチドを添加することを 特徴とする、 [1]に記載の製造方法。
[7] 蛋白質脱アミド酵素力 クリセォバクテリゥム（Chryseobacterium)属、フラボバタ テリゥム（Flavobacterium)属、ェンぺドパクター（Empedobacter)属、スフインゴバクテ リウム（Sphingobacterium)属、ァゥレオバタテリゥム（Aureobacterium)属、又はミロイデ ス (Myroides)属由来の酵素である、 [ 1]〜 [6]の 、ずれかに記載の製造方法。
[8] 蛋白質脱アミド酵素がペプチドダルタミナーゼ又はプロテインデアミダーゼであ る、 [1]〜 [6]のいずれかに記載の製造方法。
[9] [1]〜 [8]の 、ずれかに記載の製造方法で製造されたビール又はビール様飲 料。
[10] 蛋白質脱アミド酵素の作用で得られた脱アミド化蛋白質及び Z又は脱アミド 化ペプチドを含有する、ビール又はビール様飲料。
尚、これまでに蛋白質脱アミド酵素を食品分野で利用した例はいくつか知られてい る。例えば、特開 2000— 50887号公報（特許文献 7)、特開 2001— 218590号公 報 (特許文献 8)には、蛋白質脱アミド酵素により、食品蛋白質の機能性、即ち乳化 性、泡沫特性、溶解性を向上する方法が開示されている力 いずれの文献中にもビ ール又はビール様飲料の製造を目的とした本酵素の利用方法、或 、は脱アミド化さ れた蛋白質及び/又はペプチドをビール又はビール様飲料の製造に用いる方法は 記載されていない。蛋白質脱アミド酵素を作用させる食品としてこれらの文献に記載 されるのは、コーヒ^ ~ ·ホワイトナー、ジュース、ドレッシング、マヨネーズ、クリーム、天 ぷら粉、ホットケーキ、パン、クラッカー、ビスケット、クッキー、ピザ、パイ、ミネラル吸 収促進剤、アミノ酸系調味料 (HAP、 HVP)、味噌、醤油、分離大豆蛋白、濃縮大豆 蛋白、乳児用食品、ヨーグルト、ハム'ソーセージ、プリン様食品であり、ビール又はビ ール様飲料の製造への蛋白質脱アミド酵素の利用につ 、ては一切記載されて 、な い。また、蛋白質脱アミド酵素を作用させる食品蛋白質としてこれらの文献中で記載 されているのは乳、畜肉、魚肉、小麦、大豆、卵由来のものであり、ビール又はビー ル様飲料の原料となる大麦蛋白質への言及はな 、。
発明の効果
[0009] 本発明の方法によれば、ビール又はビール様飲料の製造過程において原料に蛋 白質脱アミド酵素を作用させることによって、従来のものとは異なる蛋白質含量及び 蛋白質組成を有することで芳醇で且つ独特の香気 ·旨味を有するビール又はビール 様飲料が得られる。また、蛋白質脱アミド酵素の作用によって、混濁し易い蛋白質の 溶解性を高めることができる。これによつて泡持ち性の低下をともなうことなぐ混濁防 止を図ることができる。その結果、泡持ち性に優れたビール又はビール様飲料となる 図面の簡単な説明
[0010] [図 1]図 1は、実施例 1で得られた麦汁を SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析 した結果である。レーン 1〜9は、順に表 1の無添加、 PG1、 PG2、 PG3、 PG4、 PG5、 U M、 PN、 UM+PNに相当し、レーン Mは、分子量マーカーを示す。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 本発明の製造方法は、製造過程において原料の少なくとも一部に蛋白質脱アミド 酵素を作用させることを特徴とする。典型的には、製造工程の一部において蛋白質 脱アミド酵素を添加することによって、原料即ち麦芽 (主原料)や副原料などに対して 蛋白質脱アミド酵素を作用させる。一方、ビール又はビール様飲料の製造工程にお いて、蛋白質脱アミド酵素の作用によって予め脱アミド化された蛋白質及び Z又はべ プチドを添加することにしてもよい。このように本発明の製造方法では、蛋白質脱アミ ド酵素の作用を受けた原料が使用される限り、製造工程において蛋白質脱アミド酵 素が直接添加されなくてもょ 、。
[0012] 本発明にお 、てビール又はビール様飲料の製造工程とは、粉砕した麦芽、或いは 粉砕した麦芽及び副原料、或!、は副原料のみに温水を加えて糖ィヒ槽で混合する仕 込み工程から、糖ィ匕の終わったもろみを濾過により麦汁を得る工程、この麦汁にホッ プを加えて煮沸後酵母を接種して醱酵する工程、醱酵後酵母を除!ヽて貯蔵タンク等 で熟成させる工程までのことを言う。これらの中の!/ヽずれかの工程 (又は複数の工程） において蛋白質脱アミド酵素を添加することができる。蛋白質脱アミド酵素を仕込み 工程に添加する場合は、原料中の麦芽或いは副原料由来の、本来ビール粕に残存 する蛋白質が脱アミド化され溶解性が増すことによって、麦汁中に遊離する。或いは 、麦芽中のプロテア一ゼゃぺプチダーゼ、或いは別に添加されるプロテア一ゼ製剤 中の酵素との協同作用よつて分解されて生じたペプチドやアミノ酸が麦汁中に移行 する。これらの効果により、酵母に必要な含窒素化合物を十分に供給することが出来 る。或いはまた、酵母による醱酵工程に蛋白質脱アミド酵素を添加する場合は、麦汁 中の蛋白質やペプチドが脱アミド化され、酵母の内在性プロテアーゼ、ぺプチダー ゼによって酵母によって資化されやすくなる。この結果、発酵中の酵母の代謝が活発 ィ匕、或いは変化し、ビールの香気成分は大きく増強され、或いは変化する。さらにま た、熟成工程中に蛋白質脱アミド酵素を作用させることにより、混濁しやすい蛋白質 の溶解性を向上することにより、泡持ち性の低下を伴うことなぐ混濁防止を図ること が出来る。また酵母により資化されずに残ったペプチドやアミノ酸は増加し、蛋白質 脱アミド酵素を使用しな力つた場合に比べ、グルタミン酸含量が高くなる。従って、濃 醇で独特の香味、旨味を有するビール又はビール様飲料を製造することが出来る。
[0013] 本発明における副原料とは、酒税法で規定されて 、る麦芽とホップ以外の原料のこ とであり、例えば大麦、小麦、ライ麦、燕麦、トウモロコシ、米、こうりゃん、馬鈴薯、大 豆、エンドゥ豆、チックピーなどの植物性原料、ゼラチンなどの動物性原料或いはこ れら原料由来の蛋白質及び Z又はペプチドのことを指す。
[0014] 本発明において、予め蛋白質脱アミド酵素により脱アミド化される蛋白質は特に限 定されず、その例としては大麦、小麦、ライ麦、燕麦、トウモロコシ、米、こうりゃん、馬 鈴薯、大豆、エンドゥ豆、チックピーなどの植物性原料由来の食品蛋白質、ゼラチン などの動物性原料由来の食品蛋白質を挙げることができる。
[0015] 本発明におけるビール又はビール様飲料とは、酒税法上のビールに限定されず、 V、わゆる発泡酒、雑種などビール酵母を用いて醱酵させる醸造酒全般のことを 、う。
[0016] 本発明に使用される蛋白質脱アミド酵素とは、蛋白質やペプチド中のアミド基に直 接作用し、蛋白質やペプチドの切断や架橋を伴うことなぐ脱アミド化する作用を有 するものであればいかなるものでもよぐその例として、特開 2000— 50887号公報に 記載の酵素、特開 2001— 218590号公報に記載の酵素を挙げることができる。また 、蛋白質脱アミド酵素の他の例として、 Biochemistry, 10卷， 1222-1229 (1971)に記載 される、バチルス'サーキュランス（Bacillus circulans)由来のペプチドグルタミナーゼ I 及びペプチドグルタミナーゼ IIなどのペプチドグルタミナーゼ、 FEBS Letter, 302卷， 1 69-171 (1988), Physiologia Plantarum 96卷， 662-666 (1996), Nahrung 42卷 Nr. 3/ 4, S.168-169 (1998)に記載される植物由来のプロテインデアミダーゼ（Protein deami dase)などのプロテインデアミダーゼなどが挙げられる。
[0017] 蛋白質脱アミド酵素は、蛋白質脱アミド酵素を産生する微生物の培養液より調製し たものを用いることができる。蛋白質脱アミド酵素の調製に用いられる微生物は特に 限定されないが、その培養液中に当該酵素を産生する微生物であって、例えば、タリ セォノ クテリゥム (Chryseobacterium)属、フラボノ クテリゥム (Flavobacterium)属、ェ ンぺドパクター（Empedobacter)属、スフインゴバタテリゥム（Sphingobacterium)属、ァ ウレォバクテリゥム（Aureobacterium)属、又はミロイデス（Myroides)属に属する微生 物を用いることができる。特に、クリセォバクテリゥム（Chryseobacterium)属に属するク リセォバクテリゥム 'エスピー（Chryseobacterium sp.) No.9670を蛋白質脱アミド酵素 の調製に用いることが好ましい。クリセォバクテリゥム 'エスピー（Chryseobacterium s p.) No.9670は、受託番号 FERM BP— 7351 (2000年（平成 12年） 11月 8日付の 移管請求に基づき受託番号 FERM P— 17664の国内寄託から移管)で通商産業 省工業技術院生命工学工業技術研究所 (現在は独立行政法人産業技術総合研究 所 特許生物寄託センター、干 305-8566 茨城県つくば巿東 1丁目 1番 1号 中央第 6)に寄託されている。
[0018] 上記の微生物の培養液又は菌体より蛋白質脱アミド酵素を得ることができる。即ち 、分泌型蛋白質であれば培養液より、それ以外であれば菌体内より回収することがで きる。培養液から蛋白質脱アミド酵素を調製する方法は、公知の蛋白質分離、精製 方法 (遠心分離、 UF濃縮、塩析、イオン交換榭脂等を用いた各種クロマトグラフィー 等)を用いることができる。例えば、培養液を遠心分離して菌体を除去し、その後塩析 、クロマトグラフィー等を組み合わせて目的の酵素を得ることができる。菌体内から酵 素を回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などによって破砕した 後、上記と同様に分離、精製を行うことにより目的の酵素を取得することができる。尚 、ろ過、遠心処理などによって予め培養液力 菌体を回収した後、上記一連の工程（ 菌体の破砕、分離、精製)を行ってもよい。
[0019] 蛋白質脱アミド酵素の添加量は、蛋白質を脱アミドィ匕するに必要な量であれば特に 制限はないが、通常原料 lmlあたり 0.005〜100ユニット、好ましくは 0.05〜10ユニット 用いられる。
[0020] 本発明の一態様では蛋白質脱アミド酵素と蛋白質分解酵素が併用される。即ち、こ の態様の製造方法では、原料の少なくとも一部に対して蛋白質脱アミド酵素と蛋白 質分解酵素を作用させる。例えば、製造工程の一部において、蛋白質脱アミド酵素と 蛋白質分解酵素を添加する。両酵素の添カ卩は同時でなくてもよい。蛋白質脱アミド 酵素を添加する工程と、蛋白質分解酵素を添加する工程とが異なっていてもよい。こ のように両酵素を異なるタイミングで添加する場合の順序も特に限定されるものでは ない。
[0021] 製造工程において蛋白質分解酵素を直接添加するのではなぐ蛋白質分解酵素 を作用させて得られたペプチドを製造工程中に添加することにしてもよい。蛋白質分 解酵素と蛋白質脱アミド酵素を併用することによって得られた脱アミドィ匕ペプチド (又 は脱アミドィ匕蛋白質)を製造工程中に添加することにしてもよ 、。蛋白質分解酵素と 蛋白質脱アミド酵素を組み合わせて作用させる方法については例えば特開 2000— 50887号公報を参考にすることができる。
[0022] 本発明で使用される蛋白質分解酵素とは、蛋白質のペプチド結合の加水分解を触 媒する酵素をいう。蛋白質分解酵素の例として、ペプシン、トリプシン、キモトリブシン 等の動物由来のプロテアーゼ、パパイン、ブロメライン等の植物由来プロテアーゼ、 各種微生物由来のプロテアーゼを挙げることができる。複数種類の蛋白質分解酵素 を組み合わせて使用してもょ 、。
[0023] 蛋白質脱アミド酵素による処理は、従来力 用いられているアミラーゼ類、プルラナ ーゼ類、セルラーゼ類、へミセルラーゼ類、ダルカナーゼ類、プロテアーゼ 'ぺプチダ ーゼ類などの酵素剤と同時に或いは連続して実施しても良い。このような他の酵素剤 と共に用いることにより、醱酵性の向上、作業性の向上が図られ、より濃醇なビール 又はビール様飲料を製造することが出来る。
[0024] 次に、実施例により本発明をさら具体的に説明する。以下の実施例は本発明を具 体的に説明するものであり、これによつて本発明が限定されるものではない。
実施例 1
[0025] <蛋白質脱アミド酵素の調製 >
クリセォバクテリゥム ·エスピー No.9670 (独立行政法人産業技術総合研究所 特許 生物寄託センター受託番号 FERM BP-7351)を LB Base培地、 25°Cで 40時間培養し た。次に、培養液を 4°C、 12000 rpm(22200 X g)、 20分間の遠心分離により菌体を除 去し、得られた遠心上清を、限外濾過膜 (SEP-0013、旭化成製）により約 25倍に濃縮 後、凍結乾燥して粗酵素粉末を得た。これに、 2.0 M NaClを含む 10 mM燐酸ナトリ ゥム緩衝液 (PH6.5)に溶解し、不溶物を 4°C、 10000 rpm(12300 X g)、 15分間の遠心 分離により除いた後、得られた遠心上清を、 2.0 M NaClを含む 10 mM燐酸ナトリウム 緩衝液 (PH6.5)で平衡化したフエ-ルセファロース CL-6Bカラム (フアルマシア社製） に供し、 2.0 M力ら 0 Mの NaCl直線濃度勾配により吸着した蛋白質を溶離させた。
[0026] 蛋白質脱アミド活性画分を集め、限外濾過膜で濃縮後、 0.6 M NaCl及び 0.05% T ween 20を含む 10 mM燐酸ナトリウム緩衝液 (pH6.5)で平衡化したセフアクリル S-100 カラムに供して、同緩衝液で溶離した。下記の方法により各画分の酵素活性を測定 し、蛋白質脱アミド活性画分を集め、限外濾過膜で濃縮し蛋白質脱アミド酵素溶液を 得た。
下記の Z-Gln-Gly (式中 Zは、ベンジルォキシカルボ-ル基を意味する）を基質とす る測定法とカゼインを基質とする測定法で活性を測定したところ 33.7単位/ ml (Z-Gln- Glyを基質)、 13.5単位/ ml (カゼインを基質)の酵素標品が得られた。
[0027] 酵素活性測定法：酵素活性の測定は以下の方法に従 、、基質として Z-Gln-Gly及 びカゼインを使用した。
活性測定方法： 10mM Z-Gln-Glyを含む 176mMリン酸緩衝液 (pH6.5) 100 1に酵素 溶液 10 1を添カ卩して、 37°C、 60分間インキュベートした後、 12%トリクロ口酢酸溶液 10 0 1を加えて反応を停止する。遠心分離（15000rpm、 4°C、 5分間）した後、上清につ いて以下のように F-kit ammonia (ロッシュ ·ダイァグノステイクス社製）を用いて測定す る (Al)。別に酵素溶液の代わりに水を用いて同様にして測定する (A2)。
[0028] F-kit ammonia 100 μ 1試薬 2に上清 10 μ 1と水 190 μ 1をカ卩ぇ室温で 5分間放置後 10 0 1を用いての 340nmの吸光度 (E1)を測定する。残りの 200 1に、 1.0 1の試薬 3 (グ ルタメートデヒドロゲナーゼ）を加えた後、更に 20分間室温に放置した後、 340nmの吸 光度 (E2)を測定する。
上記条件下で 1分間あたり: L molのアンモニアを遊離する酵素量を 1単位とし、以 下の式に従って求める。
u/ml= 1.76 X [A1(E1-E2)-A2(E1-E2)]
基質として 10mM Z-Gln-Glyに代えて 1%カゼイン（ハマーステンカゼイン、メルク社 製)を用いて同様にして活性を求め、蛋白質に結合するアミド基に作用することを確 認する。
実施例 2
[0029] <蛋白質脱アミド酵素の作用による麦汁中の蛋白質の変化（1) >
麦芽 300gを粉砕し、 48°Cの温水 1050mlと混合した原料に、上記実施例 1の方法で 調製した蛋白質脱アミド酵素の濃縮溶液 (60 U/ml)を添加し、インフュージョン法で 糖ィ匕工程を行った。糖ィ匕工程終了後、濾紙により濾過を行い麦汁を得た。対照として 酵素無添力卩区を設け、同様に行った。また比較としてプロテア一ゼ，ぺプチダーゼ類 として、ゥマミザィム（天野ェンザィム社製、ぺプチダーゼ力 70U/g) 60mg添加区、プ 口テアーゼ N (天野ェンザィム社製、蛋白消化力 150,000U/g) 60mg添加区、ゥマミ ザィム 60mg及びプロテアーゼ N60mg添力卩区も同様に行った。得られた麦汁中の蛋白 含量を、 DCプロテインアツセィキット（Bio- RAD社製）を用いて定量した結果を表 1に 示す。蛋白含量は、牛血清アルブミンを標準物質として検量線を作成して求めた。ま た、得られた麦汁中の蛋白質を SDS-ポリアクリルアミド電気泳動で分析した。 SDS-ポ リアクリルアミド電気泳動は、 Phast system 8- 25%ゲル（フアルマシア社製）を用いて 行った。その結果を図 1に示す。
[0030] [表 1]
Figure imgf000012_0001
[0031] 表 1より明らかなように、蛋白質脱アミド酵素添加により、麦汁中の蛋白質含量が増 加し、その増加は添加量に依存して 、ることが判る。
[0032] 一方、図 1より明らかなように、蛋白質脱アミド酵素添カ卩により、無添カ卩区では認めら れな 、分子量 3万〜 4万の蛋白質（図中 b)や、 SDS-ポリアクリルアミドゲルに入りきら な 、高分子の蛋白質（図中 a)が麦汁中に溶出してきており、その増加は添加量に依 存して!/、ることが判る。この分子量 3万〜 4万の蛋白質は大麦由来の蛋白質ホルディ ンと推定される。一方、プロテアーゼ 'ぺプチダーゼ類添加区では、麦汁中の蛋白質 含量は増加するが（表 1)、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動では、蛋白質の増加 は観察されなかった（図 1)。従って、プロテアーゼ 'ぺプチダーゼ類添加区では、低 分子の蛋白質、即ちペプチドが増加していることが判る。
[0033] 以上のように、蛋白質脱アミド酵素の作用によって麦汁中の可溶性蛋白質量を増 カロさせることができるとともに、通常の製造方法の場合には見られない蛋白質を麦汁 中に溶出させることができた。可溶ィ匕蛋白質量が増加することによって、後の発酵ェ 程にぉ 、て酵母に対して十分な量の含窒素化合物を供給することができる。これに よって、酵母の代謝が活性ィ匕し、ビールの香気が増強される。特に、脱アミド化されて 可溶ィ匕した蛋白質では、麦芽のプロテアーゼ、必要に応じて添加されるプロテア一 ゼ剤、或いは酵母自身のプロテアーゼの作用によって、酵母が利用可能なアミノ酸、 低分子ペプチドが生成し易くなる。その結果、酵母の代謝が影響を受け、香りや味に 影響する高級アルコール、エステル、ジァセチル等の生成量が増大又は変化し、独 特の香味、旨味を有するビールとなる。さらに、酵母によって資化されずに残存する ペプチドやアミノ酸の量も増加し、これによつて芳醇さが向上するとともに、独特の香 味、旨味が形成される。以上のように、ビールの芳醇さの向上、及び独特の香味、旨 味の形成に蛋白質脱アミド酵素の利用が有効であることが明らかとなった。
実施例 3
[0034] <蛋白質脱アミド酵素の作用による麦汁中の蛋白質の変化（2) >
麦芽 75g、大麦 225gを粉砕し、 48°Cの温水 1050mlと混合した原料に、上記実施例 1 の方法で調製した蛋白質脱アミド酵素溶液 (60 U/ml)を添加し、インフュージョン法 で糖ィ匕工程を行った。糖ィ匕工程終了後、濾紙により濾過を行い麦汁を得た。対照と して酵素無添加区を設け、同様に行った。また、蛋白質脱アミド酵素とゥマミザィムを 同時に添加した試験区も同様に行った。得られた麦汁中の蛋白含量を、 DCプロティ ンアツセィキット（Bio-RAD社製)を用いて定量した結果を表 2に示す。蛋白含量は、 牛血清アルブミンを標準物質として検量線を作成して求めた。また、得られた麦汁中 の蛋白質を SDS-ポリアクリルアミド電気泳動で分析した。 SDS-ポリアクリルアミド電気 泳動は、 Phast system 8- 25%ゲル（フアルマシア社製）を用いて行った。
[0035] [表 2] 試験区 添加酵素 添加量 麦汁中の蛋白質含量 （mg/mD 無添加 ― - 8.32
PG 1 蛋白質脱アミド化酵素 0.6 U 9.44
PG 2 蛋白質脱アミド化酵素 6.0 U 9.86
PG 3 蛋白質脱アミド化酵素 12.0 U 15.2
PG 4 蛋白質脱アミド化酵素 30.0 U 16.5.
PG 5 蛋白質脱アミド化酵素 60.0 U 16.7
PG + 蛋白質脱アミド化酵素 60.0 U 18.3
UM ゥマミザィム 60.0 mg
[0036] 表 2より明らかなように、蛋白質脱アミド酵素添カ卩により、麦汁中の蛋白質含量が増 加し、その増加は添加量に依存していることが判る。また、ゥマミザィムと併用すること により、さらに麦汁中の蛋白質含量が増加していることが判る。これらの麦汁の SDS- ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、実施例 2と同様、蛋白質脱アミド酵素添加に より、無添カ卩区では認められない分子量 3万〜 40万の蛋白質や、 SDS-ポリアクリルァ ミドゲルに入りきらない高分子の蛋白質が麦汁中に溶出してきており、その増加は添 加量に依存していることが判る。一方ゥマミザィムとの併用試験区では、麦汁中の蛋 白質含量が増加して 、るにも拘わらず、新たな蛋白質のバンドは検出されな力つた。 このことは、蛋白質脱アミド酵素により可溶化された蛋白質がゥマミザィムにより低分 子化されて SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動では検出できない分子量約 10,000 以下のペプチドやアミノ酸に分解されて 、ることを示す。
[0037] 以上のように、副原料を用いた場合においても、蛋白質脱アミド酵素の作用によつ て麦汁中の可溶性蛋白質量を増カロさせることができるとともに、通常の製造方法の場 合には見られない蛋白質を麦汁中に溶出させることができた。この結果から、ビール 様飲料の製造においても、芳醇さの向上、及び独特の香味、風味の形成に蛋白質 脱アミド酵素の利用が有効であることが明らかとなった。
一方、蛋白質脱アミド酵素と蛋白質分解酵素 (例えばゥマミザィム)を併用すること によって、麦汁中の可溶性蛋白質量がさらに増加するとともに、特に比較的低分子 量のペプチドやアミノ酸の含量が増加した。この結果から、これら二種類の酵素を併 用すれば、酵母が資化し易いと考えられる含窒化物化合物が一層増加するとともに 、酵母によって資化されずに残存するペプチドやアミノ酸の量も増加すると考えられ た。このことから、より芳醇で、独特の香味、旨味を有するビール又はビール様飲料を 製造するために、これら二種類の酵素の併用が有効であることが明らかとなった。 産業上の利用可能性
[0038] 本発明の方法で製造されるビール又はビール様飲料は、従来の方法で製造される ビール等と比較して、蛋白質、ペプチド、及び Z又はアミノ酸の含量'組成が異なる。 これによつて芳醇で独特の香気'旨味を有するビール又はビール様飲料となる。また 、本発明の方法で製造されるビール又はビール様飲料では、蛋白質脱アミド酵素の 作用によって泡持ち性の改善を期待できる。
[0039] この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものでは ない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々 の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その 全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims

請求の範囲
[1] 製造過程において原料の少なくとも一部に蛋白質脱アミド酵素を作用させることを 特徴とする、ビール又はビール様飲料の製造方法。
[2] ビール又はビール様飲料の製造工程の少なくとも一部において、蛋白質脱アミド酵 素を添加することを特徴とする、請求項 1に記載の製造方法。
[3] 仕込み工程、発酵工程、又は熟成工程において蛋白質脱アミド酵素を添加するこ とを特徴とする、請求項 2に記載の製造方法。
[4] ビール又はビール様飲料の製造工程の少なくとも一部において、さらに蛋白質分 解酵素を添加することを特徴とする、請求項 2又は 3に記載の製造方法。
[5] ビール又はビール様飲料の製造工程の少なくとも一部において、蛋白質脱アミド酵 素の作用で得られた脱アミドィ匕蛋白質及び Z又は脱アミドィ匕ペプチドを添加すること を特徴とする、請求項 1に記載の製造方法。
[6] ビール又はビール様飲料の製造工程の少なくとも一部において、蛋白質脱アミド酵 素及び蛋白質分解酵素の作用で得られた脱アミド化ペプチドを添加することを特徴 とする、請求項 1に記載の製造方法。
[7] 蛋白質脱アミド酵素力 クリセォバクテリゥム（Chryseobacterium)属、フラボバタテリ ゥム（Flavobacterium)属、ェンぺドパクター（Empedobacter)属、スフインゴバクテリウ ム（Sphingobacterium)属、ァゥレオバタテリゥム（Aureobacterium)属、又はミロイデス（
Myroides)属由来の酵素である、請求項 1〜6のいずれかに記載の製造方法。
[8] 蛋白質脱アミド酵素がペプチドダルタミナーゼ又はプロテインデアミダーゼである、 請求項 1〜6のいずれかに記載の製造方法。
[9] 請求項 1〜8のいずれかに記載の製造方法で製造されたビール又はビール様飲料
[10] 蛋白質脱アミド酵素の作用で得られた脱アミド化蛋白質及び Z又は脱アミド化ぺプ チドを含有する、ビール又はビール様飲料。
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