ES2525873T3 - Método mejorado para la prevención o reducción del enturbiamiento en bebidas - Google Patents

Abstract

Método para la prevención o reducción del enturbiamiento en una bebida, en el que se añade a la bebida una endoproteasa específica de prolina y/o específica de hidroxiprolilo y/o específica de alanina, y en el que se añade una enzima auxiliar a la bebida, y en el que dicha enzima auxiliar da como resultado una reducción adicional del enturbiamiento que el nivel de reducción del enturbiamiento que es lograble con un tratamiento con Endo-Pro, Endo- Hidroxi-Pro y/o Endo-Ala solo

Description

Método mejorado para la prevención o reducción del enturbiamiento en bebidas

La invención se refiere a un método para la prevención o reducción del enturbiamiento en una bebida mediante la adición de una endoproteasa y una enzima auxiliar, y a nuevas bebidas obtenibles mediante el método de acuerdo 5 con la invención. Esta invención se refiere igualmente a nuevas endoproteasas.

El enturbiamiento es un fenómeno bien conocido en la industria de las bebidas. El enturbiamiento puede aparecer, por ejemplo, en cerveza, vino y zumo de frutas. La aparición de tal turbidez puede ocurrir en diferentes etapas durante el proceso de elaboración de cerveza. En “Enzymes in Food Processing”, editado por T. Nagodawithana y

G. Reed, 3ª edición, Academic Press Inc. San Diego, Capítulo V, páginas 448-449, se ha propuesto que el

10 enturbiamiento en la cerveza es el resultado de interacciones entre proteínas de la cerveza y procianidinas polifenólicas de la misma. Esto explica por qué el enturbiamiento de la cerveza se forma frecuentemente durante el enfriamiento de la cerveza. La cerveza se hace fermentar y luego madura, frecuentemente con enfriamiento. Para darle claridad, la cerveza se suele filtrar manteniendo el frío. A pesar de la filtración, la cerveza frecuentemente se pone turbia después de que se embotella y distribuye a los usuarios, y nuevamente se enfría antes de servirla.

15 Eventualmente, el enturbiamiento se forma incluso cuando no se enfría o ya no enfría más, y puede aparecer un sedimento. La formación de los enturbiamientos no es deseada ya que la opacidad debida a la formación del enturbiamiento se asemeja a la producida por la corrupción microbiana, lo cual es indeseado, especialmente en el caso de cervezas brillantes.

En “Industrial Enzymology” 2ª edición, capítulo 2.6, páginas 124-125, se describe que el enturbiamiento en la

20 cerveza puede ser el resultado de entrecruzamientos en las fracciones de hordeína de alto peso molecular de la malta, que contiene una proporción elevada de aminoácidos hidrófobos, que se combinan principalmente con polifenoles que consisten en protoantocianidinas y catequinas (flavanoides). Se ha descrito que pequeñas cantidades de hidratos de carbono y trazas de iones minerales están también involucradas en la formación del enturbiamiento, y también la oxidación, que se afirma que juega un papel importante en la polimerización de

25 polifenoles para producir enturbiamiento irreversible. Se ha propuesto que los polifenoles se combinan lentamente con proteínas para formar enturbiamiento cuando se enfrían, pero se redisuelven cuando se calientan. Eventualmente, sin embargo, a medida que los polifenoles se polimerizan y aumentan su tamaño, se hacen insolubles a temperatura ambiente, generando un enturbiamiento irreversible o permanente. El documento US5035902 describe el uso de enzimas para prevenir la formación de enturbiamiento en cerveza.

30 En otras publicaciones se ha propuesto que la formación de enturbiamiento en por ejemplo cerveza, vino y zumo de frutas, café y té es resultado de interacciones entre proteínas y polifenoles (K.J. Siebert y col., J. Agric. Food Chem. 44 (1996) 1997-2005 y K.J. Siebert y col., J. Agric. Food Chem. 44 (1996) 80-85, K.J. Siebert, J. Agric. Food Chem, 47 (1999) 353-362). Desde su descubrimiento por L. Wallerstein en 1911, se sabe que un método para la reducción de la formación de turbidez en frío en la cerveza consiste en añadir papaína a la misma. La papaína es un extracto

35 de papaya que tiene actividad proteolítica. En “Enzymes in Food Processing”, editado por T. Nagodawithana y G. Reed, 3ª edición, Academic Press Inc. San Diego, Capítulo V páginas 448-449, el efecto de la papaína se describe como superior al de cualquier otra enzima empleada para la prevención del enturbiamiento en frío de la cerveza. Sin embargo, el mecanismo exacto por el cual la papaína es más efectiva jamás ha sido determinado (“Enzymes in Food Processing”, editado por T. Nagodawithana y G. Reed, 3ª edición, Academic Press Inc. San Diego, Capítulo V

40 páginas 448-449).

Una desventaja del uso de la papaína es, sin embargo, que ésta tiene un efecto negativo sobre el espumado. Las proteínas son necesarias para generar una espuma estable en la cerveza. Mediante su actividad proteolítica, sin embargo, la papaína afecta de manera negativa a la estabilidad de la espuma.

La formación de turbidez en el vino se ha discutido, por ejemplo, en “Enzymes in Food Processing”, editado por T.

45 Nagodawithana y G. Reed, 3ª edición, Academic Press Inc. San Diego, Capítulo 16, página 425, donde se describe que las proteínas de la uva son las responsables de la formación del enturbiamiento durante el almacenamiento del vino. Si aparece precipitación en el vino tras su embotellado, éste se hace menos atractivo al consumidor, lo que afectará a las ventas. Para prevenir la precipitación, por ejemplo se utiliza bentonita. Aunque la bentonita y otros absorbentes son efectivos para eliminar las proteínas, no son selectivos y eliminan otros compuestos que sí son

50 deseados en el vino, lo cual frecuentemente afecta a las propiedades organolépticas del vino. Además, el uso de bentonita da como resultado una considerable pérdida de vino y la eliminación del desecho que contiene bentonita presenta dificultades.

Aunque el mecanismo no es bien comprendido, se cree que la adición de papaína hidroliza las proteínas en la cerveza en tal grado que el enturbiamiento de proteína-polifenol no se forma, o lo hace en una menor proporción. 55 Por la misma razón se emplea la bentonita en el vino: mediante la absorción de las proteínas, previene la formación de enturbiamiento de proteína-polifenol y de precipitados. Sin embargo, en vez de eliminar las proteínas, para reducir o prevenir la formación de enturbiamiento se pueden eliminar los polifenoles. Un ejemplo típico de un compuesto usado para eliminar los polifenoles de las bebidas es la polivinilpolipirrolidona (PVPP). Últimamente se ha reconocido que los polifenoles son unos antioxidantes importantes. Debido a todos los efectos beneficiosos

atribuidos a los antioxidantes, la opción de eliminar los polifenoles de las bebidas para prevenir la formación de enturbiamiento no es demasiado atractiva.

Puesto que todas las técnicas que se conocen para prevenir y eliminar el enturbiamiento tienen inconvenientes, existe todavía la necesidad de un método nuevo para la prevención o reducción del enturbiamiento en las bebidas.

5 Es un objeto de la presente invención poner a disposición un método para la prevención o reducción del enturbiamiento en una bebida.

Sorprendentemente, se ha encontrado que este objeto se logra proporcionando un método para la prevención o reducción del enturbiamiento en una bebida, en el que se añade a la bebida una endoproteasa específica de prolina y/o específica de hidroxiprolilo y/o específica de alanina, y en el que se añade a la bebida una enzima auxiliar, y en

10 el que dicha enzima auxiliar da como resultado una reducción adicional del enturbiamiento mayor que el nivel de reducción del enturbiamiento que es lograble con un tratamiento con Endo-Pro, Endo-Hidroxi-Pro y/o Endo-Ala solo.

En el marco de esta invención, el término “bebida” incluye las bebidas en todas las etapas de su preparación. Así, una bebida no es solamente una bebida lista para su consumo, sino también cualquier composición usada para preparar la misma. Por ejemplo, el mosto, como se usa en la preparación de cerveza, está dentro del término

15 “bebida” tal como se utiliza aquí. También, la adición durante la preparación de una bebida de una endoproteasa específica de prolilo a composiciones que no son o no son enteramente líquidas cae dentro del alcance del método de acuerdo con la invención. Una endoproteasa específica de prolilo añadida a una pasta de malta al inicio de la elaboración de la cerveza es un ejemplo de tal composición.

Una endoproteasa específica de prolilo (Endo-Pro) se define como una endoproteasa preferiblemente purificada que

20 corta proteínas o péptidos en lugares en los que la proteína o el péptido contiene, en su cadena, un resto de prolina. Preferentemente, en un método según la invención, se usa una endoproteasa específica de prolilo que corta proteínas o péptidos en sitios en los que la proteína o el péptido contiene un resto de prolina.

Los términos Endo-Pro, endoproteasa específica de prolilo, endoproteasa específica de prolina, endopeptidasa específica de prolina, y péptido con actividad específica de prolilo, o expresiones similares, se utilizan aquí

25 indistintamente.

Una endoproteasa específica de hidroxiprolilo (Endo-Hidroxi-Pro) se define como una endoproteasa preferiblemente purificada que corta proteínas o péptidos en sitios en los que la proteína o péptido contiene un resto de hidroxiprolilo en su cadena. Preferiblemente, en un método según la invención, se usa una endoproteasa específica de prolilo que corta proteínas o péptidos en lugares en los que la proteína o péptido contiene un resto de hidroxiprolilo.

30 Una endoproteasa específica de alanina (Endo-Ala) se define como una endoproteasa preferiblemente purificada que corta proteínas o péptidos en sitios en los que la proteína o péptido contiene un resto de alanina en su cadena. Preferiblemente, en un método según la invención, se usa una endoproteasa específica de alanina que corta proteínas o péptidos en sitios en los que la proteína o péptido contiene un resto de alanina.

Las endoproteasas que presentan actividad específica de prolilo son conocidas (E.C. 3.4.21.26). Sin embargo, el uso

35 de estas endoproteasas específicas de prolilo, o incluso endoproteasas específicas de hidroxiprolilo o endoproteasas específicas de alanina para la prevención o la reducción del enturbiamiento en las bebidas nunca se ha descrito o sugerido.

Aquí, las palabras péptido y proteína se emplean indistintamente. También, las palabras “enturbiamiento”, “nubosidad” y “turbidez” se usan indistintamente.

40 En un método incluso más preferido según la invención, se usa una endoproteasa específica de prolilo que corta restos de prolilo en su término C. Una endoproteasa específica de prolilo que corta restos de prolilo en su término NH2 se describe, por ejemplo, en una publicación en Nature del 15 de enero de 1998, Vol. 391, p. 301-304.

La reducción del enturbiamiento en una bebida se logra mediante tratamiento con una endoproteasa específica de prolilo y/o específica de hidroxiprolilo y/o específica de alanina, en combinación con una enzima auxiliar.

45 Tales enzimas auxiliares pueden ser endoproteasas o exoproteasas tales como tripeptidilpeptidasas y/o carboxipeptidasas y/o peptidil-dipeptidasas.

El objeto de este tratamiento es incrementar la solubilidad de los péptidos que permanecen después del tratamiento con Endo-Pro, Endo-Hidroxi-Pro y/o Endo-Ala, y/o para reducir además la interacción de los polipéptidos que quedan con los polifenoles.

50 Este objetivo se logra por cuanto se añade a la bebida una exoproteasa, tal como tripeptidilpeptidasa y/o carboxipeptidasa y/o peptidil-dipeptidasas, que es capaz de eliminar los restos de prolina carboxiterminales de los péptidos que permanecen después del tratamiento con Endo-Pro. Como alternativa, o en combinación con tal exopeptidasa, los péptidos que quedan después del tratamiento con Endo-Pro se pueden solubilizar adicionalmente mediante tratamiento con una endoproteasa. Son especialmente adecuadas para ese fin las enzimas que son

capaces de escindir enlaces peptídicos en la posición N-o C-terminal de restos de glicina, alanina, serina, asparagina y glutamina.

Se encontró que las carboxipeptidasas que tienen actividad frente a péptidos cromógenos sintéticos FA-Pro o FA Pro-Pro fueron muy útiles como enzimas auxiliares.

5 Las enzimas endo-proteolíticas auxiliares con especificidades como se mencionan anteriormente se pueden obtener comercialmente, o se pueden seleccionar como alternativa con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo con la ayuda de péptidos cromógenos sintéticos tales como

Z-A-A-A-pNA

en la que

10 pNA = paranitroanilida,

Z = benciloxicarbonilo,

A = aminoácido glicina, alanina, serina, asparaginas o glutamina.

Se encontró que las peptidil-dipeptidasas auxiliares que tienen actividad frente a péptidos cromógenos sintéticos tales como FA-Leu-Pro o FA-Phe-Pro en los que FA = furilacriloílo, son muy útiles.

15 El tratamiento con enzimas auxiliares preferiblemente no debería tener ningún efecto adverso sobre el sabor, textura

o sensación bucal de la bebida. Se prefiere que estas enzimas auxiliares tengan un óptimo de pH ácido o sean activas en condiciones ácidas, preferiblemente por debajo de, a o alrededor de 6,0, 5,0, 4,5 ó 4,0, o incluso más preferiblemente por debajo, a o alrededor de pH 3,0.

En la producción de la mayoría de las bebidas, se requiere especial atención cuando se añaden enzimas 20 proteolíticas (auxiliares), a fin de no destruir la capacidad de la bebida para formar espuma.

En un proceso de elaboración de cerveza convencional, los cereales se muelen y se machacan, y la pasta de malta resultante se filtra para dar el mosto. El mosto se hierve entonces para inactivar todas las actividades enzimáticas residuales, y se usa subsiguientemente para apoyar el crecimiento de la levadura. Después del crecimiento de la levadura y la filtración, la bebida se fermenta lentamente y se madura bajo refrigeración. Se ha descrito que en esta

25 etapa de fermentación lenta y maduración con refrigeración, se puede añadir papaína (Collupulina) a la bebida a fin de evitar la formación del enturbiamiento. Sin embargo, la papaína destruye la capacidad formadora de espuma de la cerveza.

El responsable de la espuma de la cerveza es una proteína denominada LTP1 (Proteína de Transferencia de Lípidos), una proteína de la cebada de 10 kDa con una estructura tridimensional muy robusta, de manera que las 30 proteasas normalmente presentes durante la etapa de formación de la pasta de malta no pueden hidrolizar esta molécula. Sin embargo, durante la etapa de ebullición del mosto, LTP1 se despliega de manera que es susceptible a la escisión enzimática. Para que sea activa en la formación de espuma, la LTP1 necesita un cierto tamaño mínimo. Se piensa ahora que la incubación con Collupulina durante la fermentación lenta y maduración bajo refrigeración (es decir, después de la ebullición del mosto) destruye LTP1, y de ese modo la capacidad formadora de espuma de la

35 cerveza.

El uso de una endoproteasa ácida, en particular Endo-Pro, Endo-Hidroxi-Pro y/o Endo-Ala, durante la formación de la pasta de malta o la etapa de fermentación lenta y maduración bajo refrigeración reduce la formación del enturbiamiento, pero no destruye o afecta seriamente a LTP1, y por lo tanto el uso de tales enzimas no tiene efectos negativos sobre la formación de la espuma.

40 Además, la eliminación de un resto de prolina carboxi-terminal de los péptidos que resultaron de la digestión con Endo-Pro dio como resultado una reducción adicional del enturbiamiento en la cerveza. A este respecto se obtuvieron resultados notablemente buenos cuando se usó una carboxipeptidasa específica de prolina aislada de Xanthomonas en combinación con Endo-Pro. También, a ese efecto se usó con éxito peptidil-dipeptidasa A (EC 3.4.15.1).

45 Las enzimas que coagulan la leche, como Fromase® son también muy adecuadas como enzima auxiliar en la reducción o prevención del enturbiamiento cuando se usan en combinación con Endo-Pro. Fromase® es muy adecuada para este fin, puesto que no afecta a LTP1 y de ese modo conserva la capacidad formadora de espuma de la cerveza.

Fromasa es un producto comercial (DSM Food Specialities) obtenido de Rhizomucor miehei que se usa en la

50 producción de quesos. Fromasa es una proteasa denominada aspártica (EC 3.4.23). Estas enzimas se caracterizan por óptimos de pH muy bajos y una franca preferencia por la escisión de enlaces peptídicos entre restos de aminoácidos hidrófobos voluminosos tales como Phe-Phe, Phe-Tyr y Leu-Tyr. Otras proteasas de ácido aspártico son pepsina, catepsina, y las diversas proteasas ácidas de diferentes hongos.

La reducción del enturbiamiento en el vino se logró mediante tratamiento adicional con enzimas auxiliares en combinación con hidrólisis con Endo-Pro, Endo-Hidroxi-Pro o Endo-Ala.

Se sabe que una proteína denominada quitinasa es la causa principal de los problemas del enturbiamiento en el vino. Esta quitinasa se origina de la vid y es rica en restos de glicina, alanina y serina. Puesto que el vino tiene un pH

5 muy bajo, se trató de hidrolizar esta quitinasa con una mezcla compleja de endoproteasas ácidas. La adición de concentraciones elevadas de un producto denominado AP 50.000 de Shin Nihon, Japón, no tuvo ningún efecto sobre la formación del enturbiamiento en el vino. Este hallazgo corresponde con las conclusiones de Ferreira et al. (Trends in Food Science & Technology 12 (2002) 230-239), que señala que todas las estrategias basadas en la proteolisis de proteínas del vino han demostrado ser fallidas en la práctica y son probablemente fútiles.

10 La incubación del vino (blanco y rojo) con una preparación enzimática se describe en el Ejemplo Comparativo 7. Se podría obtener una reducción adicional del enturbiamiento en el vino usando enzimas auxiliares tales como una exopeptidasa, que eliminó los restos de prolina carboxi-terminales, y/o una endoproteasa con especificidad por glicina.

Una ventaja adicional de usar Endo-Pro en el vino (o en cualquier otra bebida con un pH muy bajo) es que la Endo

15 Pro usada en los experimentos del Ejemplo Comparativo 7 es también capaz de escindir enlaces peptídicos después de restos de alanina, así como en restos de hidroxiprolina en condiciones ácidas (Ejemplo 13).

Para cuantificar la cantidad de enturbiamiento en una bebida, a menudo se usa un turbidímetro. En un turbidímetro se mide la cantidad de luz que se dispersa en un cierto ángulo predeterminado con respecto a la dirección del haz de luz incidente. Las medidas de turbidez son muy adecuadas para medir el enturbiamiento formado como resultado

20 de las interacciones proteína-polifenol.

Un polifenol se define como un compuesto que tiene una estructura química que contiene al menos dos anillos aromáticos sustituidos con al menos un grupo hidroxilo, o que tiene una estructura química que contiene al menos un anillo aromático sustituido con al menos dos grupos hidroxilo.

Ejemplos de polifenoles son los taninos y flavonoides, que incluyen por ejemplo catequinas, flavonoles, y 25 antocianinas.

Como es típico para las actividades enzimáticas, la actividad de las endoproteasas específicas de prolilo depende del pH. En una realización preferente del método según la invención, a la bebida se le añade una endoproteasa que tiene una actividad específica de prolilo máxima a un pH que corresponde al pH de la bebida a la cual se añade. Las bebidas preferentes son aquellas que contienen proteínas. En otra realización preferente, la bebida contiene

30 proteínas y polifenoles. Las bebidas preferidas son bebidas que tienen un valor de pH por debajo de 7.

El método de acuerdo con la invención se aplica ventajosamente a cerveza, vino y zumo de frutas. También se puede emplear ventajosamente con otras bebidas alcohólicas diferentes de la cerveza y el vino.

El término “cerveza”, tal como se utiliza aquí, abarca al menos cerveza preparada a partir de pastas de malta de cereales no malteados, así como todas las pastas de malta de cereales malteados, y todas las pastas de maltas

35 preparadas a partir de una mezcla de cereales malteados y no malteados. El término “cerveza” también cubre a las cervezas preparadas con aditamentos, y cervezas con todos los contenidos posibles de alcohol.

Un zumo de frutas puede ser zumo obtenido a partir de, por ejemplo, bayas rojas, fresas, manzanas, peras, tomates, cítricos, vegetales, etc.

La cantidad de endoproteasa específica de prolina que se añade a la bebida puede variar dentro de amplios límites.

40 En una realización preferente del método según la invención, se añaden al menos 150 mili-unidades de actividad de endoproteasa específica de prolina por gramo de proteína, con lo que la actividad se determinó mediante medidas de actividad usando Z-Gly-Pro-pNA como sustrato, por gramo de proteína en la bebida.

Con más preferencia, se añaden al menos 500 mili-unidades de endoproteasa específica de prolina a la bebida, y muy preferiblemente, al menos 1 unidad de endoproteasa específica de prolina.

45 Una cantidad máxima de endoproteasa específica de prolina a añadir no se puede especificar. La cantidad máxima depende, por ejemplo, de la cantidad en que se desea reducir o prevenir el enturbiamiento, de la composición de la bebida, del pH de la bebida y del pH al cual la endoproteasa tiene su actividad máxima.

Una endoproteasa específica de prolilo se puede añadir en diferentes etapas durante la preparación de una bebida.

Durante el procedimiento de preparación de la cerveza, la endoproteasa específica de prolilo se añade

50 ventajosamente a la pasta de malta. Como alternativa, la endoproteasa específica de prolilo Endo-Pro se añade a una cerveza fermentada. La endoproteasa específica de prolilo se puede añadir ventajosamente a la etapa de formación de la pasta de malta o a la etapa de maduración en un procedimiento para la preparación de cerveza. Lo más preferido es la adición de la enzima al mosto después de la etapa de ebullición.

Durante la preparación de vino, la endoproteasa específica de prolilo se añade preferiblemente a un vino fermentado. La endoproteasa específica de prolilo se puede añadir ventajosamente tras la fermentación alcohólica o tras la fermentación maloláctica en un procedimiento para la producción de un vino. Sin embargo, la enzima también se puede añadir al zumo de uva transparente, es decir, antes de la fermentación alcohólica.

5 En un procedimiento para la preparación de un zumo de frutas, la endoproteasa específica de prolilo se añade preferiblemente durante la maceración o despectinización.

Puesto que la formación de enturbiamiento se produce a menudo en bebidas ácidas tales como por ejemplo la cerveza, el vino y el zumo de frutas, preferiblemente se usan endoproteasas específicas de prolilo que tienen una actividad específica de prolilo a un valor de pH por debajo de 7. Más preferible, en el método según la invención se

10 usan endoproteasas específicas de prolilo que tienen una actividad específica de prolilo máxima a un valor de pH por debajo de 7,0, o 6,0. Lo más preferido son endoproteasas con un óptimo de pH a o por debajo de pH 5,0.

Tal péptido puede tener actividad de endoproteasa específica de prolilo con un óptimo de pH alrededor de pH 5,0, o entre 4,0 y 5,0.

Un polipéptido aislado que tiene actividad de endoproteasa específica de prolina se puede seleccionar del grupo que 15 consiste en:

(a)

un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que posee al menos 40% de identidad de secuencia de aminoácido total con la SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7 o un fragmento de las mismas;

(b)

un polipéptido codificado por un polinucleótido que se hibrida con (i) la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2. SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6 o un fragmento de las mismas, la cual es al menos 80% o

20 90% idéntica a lo largo de 60, preferentemente a lo largo de 100 nucleótidos, más preferiblemente al menos 90% idéntica a lo largo de 200 nucleótidos, o (ii) una secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia de ácido nucleico de (i).

También se describe una molécula de ácido nucleico que codifica la endoproteasa específica de prolilo Endo-Pro.

También se describen polipéptidos purificados o aislados que tienen actividad de endoproteasa específica de prolilo.

25 Se prefieren endoproteasas específicas de prolilo purificadas que tienen una actividad máxima a valores de pH menores que 7.

La invención proporciona un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, o SEQ ID NO:7, o una secuencia de aminoácidos que se puede obtener mediante la expresión de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6 en un hospedante

30 apropiado. También se describe un péptido o polipéptido que comprende un equivalente funcional de los polipéptidos anteriores.

Los términos “péptido” y “oligopéptido” son considerados sinónimos (como se reconoce comúnmente), y cada término puede ser utilizado de manera indistinta, según lo requiera el contexto, para indicar una cadena de al menos dos aminoácidos acoplada mediante enlaces peptidílicos. La palabra “polipéptido” es utilizada aquí para cadenas

35 que contienen más de siete restos de aminoácidos. Todas las fórmulas de oligopéptidos y polipéptidos o secuencias aquí están escritas de izquierda a derecha y en la dirección desde el término amino al término carboxi. El código de una letra de aminoácidos usado aquí es comúnmente conocido en la técnica, y se puede encontrar en Sambrook y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

40 Por polipéptido o proteína “aislado” o “purificado” se entiende un polipéptido o proteína que se extrae de su ambiente nativo. Por ejemplo, los polipéptidos y proteínas generados de manera recombinante expresados en células hospedantes son considerados aislados para los propósitos de la invención, al igual que los polipéptidos nativos o recombinantes que han sido sustancialmente purificados mediante cualquier técnica adecuada tal como, por ejemplo, una etapa de ultrafiltración simple, para separar la enzima de la masa de células, o el método de

45 purificación en una única etapa descrito en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988).

El polipéptido descrito aquí puede ser recuperado y purificado a partir de cultivos celulares recombinantes por cualquiera de los métodos bien conocidos, que incluyen precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxilapatita y cromatografía con lectinas. Más

50 preferentemente, se emplea la cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) para la purificación.

Los polipéptidos descritos aquí incluyen productos purificados naturalmente, productos procedentes de procedimientos de síntesis química, y productos generados por técnicas de recombinación a partir de hospedantes procariotas o eucariotas, que incluyen, por ejemplo, células de bacterias, de levaduras, células de plantas superiores, de insectos y de mamíferos. Dependiendo del hospedante empleado en el procedimiento de producción 55 recombinante, los polipéptidos pueden estar glicosilados o no glicosilados. Además, los polipéptidos también pueden

incluir un resto de metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de procedimientos mediados por el hospedante.

Un polipéptido ventajoso es un polipéptido purificado o aislado que tiene actividad de Endo-Pro. Tal polipéptido purificado o aislado se puede obtener de un caldo de fermentación en el que se ha cultivado un organismo como se 5 describe aquí, tal como una cepa de A. niger que posee un polinucleótido. Una persona experta en la técnica sabrá cómo obtener enzima al menos parcialmente purificada a partir del sobrenadante de tal cultivo. En su forma más básica, las células productoras se separan del caldo de fermentación mediante centrifugación. El líquido resultante se filtra entonces usando un auxiliar de filtro, seguido de una etapa de ultrafiltración de manera que se obtiene una disolución enzimática que contiene 1 a 50 unidades de enzima por mililitro. En condiciones ideales, la enzima se

10 puede usar como tal, es decir, sin purificación adicional. Si se requiere, la caducidad de la enzima se puede mejorar secando por pulverización o estabilizando la enzima reduciendo la actividad de agua de la disolución enzimática, por ejemplo añadiendo un poliol y un conservante.

Un método particularmente ventajoso de purificación es el siguiente. Después de cultivar las células en un caldo de fermentación apropiado, éstas se separaron del sobrenadante de cultivo por centrifugación. El sobrenadante tenía 15 un aspecto turbio. Las partículas de mayor tamaño que quedan en el sobrenadante se eliminaron subsiguientemente mediante filtración con Dicalite al 0,5%, preferentemente Dicalite al 1,0%, con el fin de prevenir la obturación del filtro que se iba a emplear en la siguiente etapa. A continuación, se aplicó una filtración de reducción de gérmenes para disminuir la cantidad de ellos en la disolución. El filtrado todavía no estaba claro. Subsiguientemente se utilizó un filtro Millipore con un valor de corte de peso molecular de 10 kDalton para reducir además el contenido de agua,

20 sales y azúcares de la disolución. Se aplicó una presión de 1 bar al filtro. Los rendimientos obtenidos típicos estaban entre 50 y 92% referido a las unidades presentes en el caldo de fermentación frente a las unidades obtenidas en el ultra-filtrado purificado. Las concentraciones típicas de enzima en el ultra-filtrado da como resultado una actividad de endoproteasa específica de prolilo en el intervalo de 4 a 10 unidades por ml.

Igualmente, la purificación se llevó a cabo con uno cualquiera de los siguientes métodos:

25 Se realizó una purificación a escala de laboratorio utilizando el Akta Explorer sobre una columna Q-sefarosa FF de 24 ml (altura del lecho 12 cm / diámetro 1,6 cm). Se diluyeron 10 ml del concentrado UF 10 veces en un tampón A y se aplicaron a la columna. Las proteínas se eluyeron en un gradiente: 0 a 50% de B en 20 CV. El tampón A fue NaAc 20 mM a pH 5,1. El tampón B fue NaAc 20 mM + NaCl 1 M a pH 5,1. El caudal fue 5 ml/min.

La purificación se llevó a cabo utilizando el purificador Akta siguiendo la instrucción de trabajo W-0894.A sobre una

30 columna Q-sefarosa FF de 500 ml (altura del lecho 23,5 cm / diámetro 5 cm). Se diluyeron 200 ml del concentrado UF 10 veces en el tampón A y se aplicaron a la columna. Las proteínas se eluyeron en un gradiente: de 0 a 40% de B en 20 CV. El tampón A fue NaAc 20 mM pH 5,1. El tampón B fue NaAc 20 mM + NaCl 1 M pH 5,1. El caudal fue 10 ml/min. Las fracciones se recogieron manualmente.

El producto obtenido presentaba un único pico en HPSEC y aparecía como una única banda en SDS PAGE e IEF.

35 Se podía concluir así que la endoproteasa específica de prolilo se puede purificar hasta homogeneidad utilizando Qsefarosa FF. La pureza estimada fue alrededor de 90% y la actividad específica en Z-gly-Pro-pNA fue de al menos 0,094 U/mg.

Los polipéptidos descritos aquí pueden estar en forma aislada. Debe entenderse que el polipéptido puede estar mezclado con vehículos o diluyentes que no interferirán con el fin pretendido del polipéptido y aún así se consideran

40 como aislados. Un polipéptido descrito aquí también puede estar en una forma sustancialmente purificada, en cuyo caso generalmente comprenderá al polipéptido en una preparación en la cual más del 70%, por ejemplo más del 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de las proteínas en la preparación constituyen un polipéptido como se describe aquí.

Los polipéptidos descritos aquí pueden ser proporcionados en una forma tal que se encuentren fuera de su medio celular natural. Así, pueden estar sustancialmente aislados o purificados, tal como se discute más arriba, o en una

45 célula en la cual no se encuentran de forma natural, por ejemplo en una célula de otra especie de hongo, de animales, de plantas o bacterias.

Ventajosamente, en el método reivindicado aquí se emplean endoproteasas específicas de prolilo aisladas o purificadas.

Una endoproteasa específica de prolina aislada o purificada tiene preferentemente al menos 10 unidades de

50 actividad de endoproteasa específica de prolina por gramo de material proteico. Estas unidades deberían medirse utilizando el péptido sintético Z-Gly-Pro-pNA a 37 grados C y pH 5, tal como se describe en la sección de Métodos.

Las endoproteasas específicas de prolina se encuentran ampliamente en animales y plantas, pero su presencia en microorganismos parece ser limitada. Hasta la fecha, se han identificado endoproteasas específicas de prolina en especies de Aspergillus (documento EP 0 522 428), Flavobacterium (documento EP 0 967 285) y Aeromonas (J. 55 Biochem. 113, 790-796), Xanthomonas y Bacteroides. En contraste con las enzimas específicas de prolina de la mayoría de estos organismos que son activos a alrededor de pH 8, las enzimas según la invención son óptimamente activas a pH ácido, incluso algunas tienen un óptimo de pH a alrededor de 5 o inferior. Las endoproteasas

específicas de prolina se pueden aislar de una de las especies microbianas arriba mencionadas, particularmente de una especie de Aspergillus. Preferentemente, la endoproteasa específica de prolina Endo-Pro se aísla de una cepa de Aspergillus niger. Más preferiblemente, la endoproteasa específica de prolina se aísla de un hospedante de Aspergillus niger modificado genéticamente para sobreexpresar un gen que codifica una endoproteasa específica de 5 prolina, aunque otros hospedantes, tales como E. coli, son vectores de expresión adecuados. Por ejemplo, la clonación y la sobreproducción de la endoproteasa específica de prolina derivada de Flavobacterium en, entre otras,

E. coli ha hecho que ciertas endoproteasas específicas de prolina estén disponibles en una forma pura. Un ejemplo de tal constructo sobreproductor se proporciona en World Journal of Microbiology & Biotechnology, Vol 11, p. 209

212. Se utiliza preferentemente un hospedante de Aspergillus niger para producir un auto-constructo no

10 recombinante que utiliza promotores de A. niger para conducir la expresión de un gen que codifica una endoproteasa específica de prolina de A. niger.

Se describe aquí un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos con un grado total de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7 (es decir, el polipéptido) de al menos alrededor del 40%, preferentemente al menos alrededor del 50%, preferentemente al

15 menos alrededor del 60%, preferentemente al menos alrededor del 65%, preferentemente al menos alrededor del 70%, más preferentemente al menos alrededor del 80%, aún más preferentemente al menos alrededor del 90%, todavía más preferentemente al menos alrededor del 95%, y especialmente al menos alrededor del 97%, y que tiene actividad de endoproteasa específica de prolina.

Para los fines de la presente invención, el grado de identidad entre dos o más secuencias de aminoácidos se

20 determina por el programa de búsqueda de bases de datos de proteínas BLAST P (Altschul y col., 1997, Nucleic Acids Research 25: 3389-3402) con una matriz Blosum 62 y un umbral esperado de 10.

Un polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7, o una secuencia sustancialmente homóloga, o un fragmento de secuencia que tiene actividad de endoproteasa específica de prolina. En general, se prefieren las secuencias de aminoácidos naturales que se

25 presentan en SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7.

El polipéptido también puede comprender una variante de origen natural u homólogo de especie del polipéptido de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7.

Una variante es un polipéptido que ocurre naturalmente en, por ejemplo, células de hongos, bacterias, levaduras o plantas, teniendo la variante actividad de endoproteasa específica de prolina y una secuencia sustancialmente 30 similar a la proteína de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7. El término “variantes” se refiere a polipéptidos que tienen la misma característica esencial o funcionalidad biológica básica que las endoproteasas específicas de prolina de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7, e incluyen variantes alélicas. Preferentemente, un polipéptido variante tiene al menos el mismo nivel de actividad de endoproteasa específica de prolina que el polipéptido de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7. Las variantes incluyen las variantes alélicas de la misma

35 cepa que el polipéptido de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7, o bien de una cepa diferente del mismo género o especie.

De igual manera, un homólogo de especie de una proteína descrita aquí es una proteína equivalente de secuencia similar que es una endoproteasa específica de prolina y ocurre de forma natural en otras especies de Aspergillus.

Las variantes y homólogos de especie se pueden aislar utilizando los procedimientos descritos aquí que se

40 emplearon para aislar el polipéptido de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7 y llevando a cabo tales procedimientos sobre una fuente de células adecuada, por ejemplo células de bacterias, levaduras, hongos o plantas. También es posible utilizar una sonda para sondar librerías construidas a partir de células de levaduras, bacterias, hongos o plantas, a fin de obtener clones que expresen variantes u homólogos de especie del polipéptido de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7. Estos clones se pueden manipular mediante técnicas

45 convencionales para generar un polipéptido de la invención, que después se puede producir por técnicas recombinantes o sintéticas reconocidas per se.

La secuencia del polipéptido de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7 y las variantes y homólogos de especie también se pueden modificar para proporcionar otros polipéptidos. Se pueden realizar sustituciones de aminoácidos, por ejemplo de 1, 2 ó 3 a 10, 20 ó 30 sustituciones. También se puede realizar el mismo número de supresiones e

50 inserciones. Estos cambios se pueden llevar a cabo fuera de las regiones críticas para la función del polipéptido, con lo que un polipéptido así modificado mantendrá su actividad de endoproteasa específica de prolina.

Los polipéptidos adecuados para uso en la invención incluyen fragmentos de los polipéptidos de longitud completa arriba mencionados y de variantes de los mismos, incluyendo fragmentos de la secuencia expuesta en SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7. Tales fragmentos retendrán típicamente actividad como endoproteasa específica de

55 prolina. Los fragmentos pueden ser de al menos 50, 100 ó 200 aminoácidos de longitud, o pueden ser una cantidad corta de aminoácidos de la secuencia de longitud completa mostrada en SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7.

Los polipéptidos como se describen anteriormente se pueden producir, si es necesario, por medios sintéticos, si bien normalmente se obtendrán de manera recombinante como se describe más abajo. Los polipéptidos sintéticos se pueden modificar, por ejemplo, mediante adición de restos de histidina o de una etiqueta T7 para ayudar a su identificación o purificación, o mediante la adición de una secuencia señal para promover su secreción desde una

5 célula.

Así, las secuencias variantes pueden comprender aquellas derivadas de cepas de Aspergillus distintas de la cepa desde la cual se aisló el polipéptido de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7. Las variantes se pueden identificar a partir de otras cepas de Aspergillus buscando la actividad de endoproteasa específica de prolina y clonando y secuenciando tal como se describe aquí. Las variantes pueden incluir la supresión, modificación o

10 adición de un único aminoácido o grupos de aminoácidos dentro de la secuencia proteica, siempre que el péptido mantenga la funcionalidad biológica básica de endoproteasa específica de prolina de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7.

Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de aminoácidos desde 1, 2 ó 3 hasta 10, 20 ó 30 sustituciones. El polipéptido modificado generalmente retendrá la actividad como una endoproteasa específica de prolina. Se pueden

15 hacer sustituciones conservativas; tales sustituciones son bien conocidas en la técnica. Preferentemente, las sustituciones no afectan al plegamiento o a la actividad del polipéptido.

Las secuencias de polipéptidos más cortas son adecuadas para usar la invención. Por ejemplo, un péptido de al menos 50 aminoácidos o hasta 60, 70, 80, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud se considera adecuado en tanto demuestre la funcionalidad biológica básica de la endoproteasa específica de prolina de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5

20 o SEQ ID NO:7. En particular, pero no exclusivamente, tal proteína puede ser un fragmento de la secuencia proteica completa.

También se describe aquí un polipéptido aislado con actividad de endoproteasa específica de prolina y que es codificado por polinucleótidos que se hibridan o son capaces de hibridar en condiciones poco rigurosas, más preferentemente condiciones de rigurosidad media, y especialmente condiciones muy rigurosas, con (i) la secuencia 25 de ácido nucleico de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6 o un fragmento de ácido nucleico que comprende al menos la porción c-terminal de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6, pero que tiene menos del total o que tiene bases que difieren de las bases de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3

o SEQ ID NO:6; o (ii) con una hebra de ácido nucleico complementaria a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3

o SEQ ID NO:6.

30 La expresión “capaz de hibridarse” significa que el polinucleótido diana se puede hibridar al ácido nucleico utilizado como una sonda (por ejemplo, la secuencia nucleotídica expuesta en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6 o un fragmento de las mismas, o el complemento de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6) a un nivel significativamente superior al de fondo. Esto también incluye a los polinucleótidos que codifican la endoproteasa específica de prolina, así como secuencias nucleotídicas complementarias a ellas. Las

35 secuencias nucleotídicas pueden ser ARN o ADN, incluyendo ADN genómico, ADN sintético o ADNc. Preferentemente, la secuencia nucleotídica es ADN, y especialmente es una secuencia de ADN genómico. Típicamente, tal polinucleótido comprende una secuencia contigua de nucleótidos que es capaz de hibridarse bajo condiciones selectivas a la secuencia codificante o la complementaria de la secuencia codificante de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6. Tales nucleótidos pueden ser sintetizados siguiendo métodos bien

40 conocidos en la técnica.

Tal polinucleótido puede hibridarse a la secuencia codificante o al complemento de la secuencia codificante de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6 a un nivel significativamente superior al de fondo. La hibridación de fondo puede ocurrir, por ejemplo, debido a otro ADNc presente en una librería de ADNc. El nivel de señales generadas por la interacción entre un polinucleótido de la invención y la secuencia codificante o 45 complemento de la secuencia codificante de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6 es, normalmente, al menos 10 veces, preferentemente al menos 20 veces, especialmente al menos 50 veces, y particularmente al menos 100 veces tan intenso como las interacciones entre otros polinucleótidos y la secuencia codificante de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6. La intensidad de la interacción puede medirse, por ejemplo, radiomarcando la sonda, por ejemplo con 32P. La hibridación selectiva puede llevarse a cabo

50 típicamente utilizando condiciones de baja rigurosidad (cloruro de sodio 0,3M y citrato de sodio 0,03M a alrededor de 40ºC), rigurosidad media (por ejemplo, cloruro de sodio 0,3M de y citrato de sodio 0,03M a alrededor de 50ºC) o de alta rigurosidad (por ejemplo, cloruro de sodio 0,3M y citrato de sodio 0,03M a alrededor de 60ºC).

Modificaciones

Los polinucleótidos pueden comprender ADN o ARN. Pueden ser de cadena simple o doble. También pueden ser

55 polinucleótidos que incluyen en su interior nucleótidos sintéticos o modificados, incluyendo ácidos nucleicos peptídicos. En la técnica se conoce una gran cantidad de diferentes tipos de modificaciones para los polinucleótidos. Éstas incluyen esqueletos de metilfosfonato y fosforotioato, y la adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3’ y/o 5’ de la molécula. Para los fines de la presente invención, deberá entenderse que los polinucleótidos descritos aquí pueden ser modificados por cualquier método disponible en la técnica.

Debe entenderse que los expertos en la técnica pueden, mediante técnicas habituales, hacer sustituciones de nucleótidos que no afecten a la secuencia polipeptídica codificada por los polinucleótidos descritos aquí para reflejar el uso de codones de cualquier organismo hospedante particular en el cual se expresan los polipéptidos.

La secuencia codificante de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6 puede ser modificada por 5 sustituciones de nucleótidos, por ejemplo de 1, 2 ó 3 a 10, 25, 50 ó 100 sustituciones. El polinucleótido de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6 puede ser modificado alternativa o adicionalmente mediante una

o mas inserciones y/o supresiones y/o por una extensión tanto en uno como en ambos extremos. El polinucleótido modificado generalmente codifica un polipéptido que tiene actividad de endoproteasa específica de prolina. Se pueden realizar sustituciones degenerativas y/o sustituciones que darían como resultado una sustitución de

10 aminoácidos conservativa cuando la secuencia modificada es traducida, por ejemplo como se discutirá con respecto a los polipéptidos posteriormente.

Homólogos

Una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridarse selectivamente con el complemento de la secuencia codificante de ADN de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6 tendrá generalmente al menos 50 15 ó 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia codificante de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6 a lo largo de una región de al menos 60, preferentemente de al menos 100, especialmente de al menos 200 nucleótidos contiguos, o en particular a lo largo de la longitud completa de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6. Asimismo, un nucleótido que codifica una endoproteasa específica de prolina activa y que es capaz de

20 hibridarse selectivamente a un fragmento de un complemento de la secuencia codificante de ADN de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6 también se puede usar en la invención. Un fragmento C-terminal de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6 que es al menos 80% o 90% idéntica a lo largo de 60, preferentemente a lo largo de 100 nucleótidos, especialmente al menos 90% idéntica a lo largo de 200 nucleótidos, es adecuado para uso en la invención.

25 Para definir polinucleótidos adecuados para uso en la invención, puede emplearse cualquier combinación de los grados de identidad y tamaños mínimos arriba mencionados, siendo preferentes las combinaciones más rigurosas (es decir, mayor identidad a lo largo de mayores longitudes). Así, por ejemplo, un polinucleótido que es al menos un 80% ó 90% idéntico a lo largo de 60, preferentemente a lo largo de 100 nucleótidos, se puede usar en la invención, de la misma manera que un polinucleótido que es al menos 90% idéntico a lo largo de 200 nucleótidos.

30 El paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede ser utilizado para calcular la identidad (por ejemplo utilizándolo en su forma establecida por defecto).

Los algoritmos PILEUP y BLAST N pueden ser utilizados para calcular identidades de secuencia o para alinear secuencias (tal como identificar equivalentes o secuencias correspondientes, por ejemplo en su forma establecida por defecto).

35 El software para realizar los análisis BLAST está a disposición del público a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica una primera identificación de los pares de secuencias con mayores posibilidades de acierto (HSPs) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia incógnita que empareja o satisface cierta puntuación umbral T de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de una base de datos. T se refiere al umbral de

40 puntuación de palabra vecina. Estos resultados de palabra vecina inicial actúan como una semilla para iniciar búsquedas y encontrar los HSPs que los contienen. Los resultados de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tan lejos como la puntuación de alineamientos acumulativa pueda incrementarse. Las extensiones para los resultados de la palabra en cada dirección son interrumpidas cuando: la puntuación de alineamientos acumulativa cae por debajo de la cantidad X desde su valor máximo hallado; la puntuación

45 acumulativa va a cero o por debajo, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos de puntuación negativa; o cuando se alcanza el final de la secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST, W, T y X, determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLAST utiliza por defecto una longitud de palabra (E) de 11, alineamientos de matriz de puntuación BLOSUM62 (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras.

50 El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias. Una medida de la similitud realizada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P.(N)), que da una indicación de la probabilidad de que pueda ocurrir por azar un emparejamiento entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos. Por ejemplo, una secuencia es considerada similar a otra secuencia si la probabilidad de suma más pequeña de la primera secuencia en comparación con la segunda secuencia es menor que alrededor de 1, preferentemente menor

55 que alrededor de 0,1, especialmente menor que alrededor de 0,01 y especialmente menor que alrededor de 0,001.

Cebadores y sondas

Los polinucleótidos descritos aquí incluyen y pueden ser utilizados como cebadores, por ejemplo como cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como cebadores para reacciones de amplificación alternativas, o

como sondas marcadas, por ejemplo, con un marcador revelador por medios convencionales utilizando marcadores radioactivos o no radioactivos, o el polinucleótido puede ser clonado en vectores. Tales cebadores, sondas y otros fragmentos deberán tener al menos 15, por ejemplo al menos 20, 25, 30 ó 40, nucleótidos de longitud. Podrán tener hasta 40, 50, 60, 70, 100, 150, 200 ó 300 nucleótidos de longitud, o incluso tener hasta unos pocos nucleótidos (tal

5 como 5 ó 10 nucleótidos) cortos de la secuencia codificante de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6.

En general, los cebadores pueden ser producidos sintéticamente, implicando una fabricación por etapas de a un nucleótido cada vez de la secuencia del ácido nucleico deseada. Las técnicas para llevar a cabo esto en protocolos automatizados están disponibles fácilmente en la técnica. Los polinucleótidos más largos se suelen producir por 10 medios recombinantes, por ejemplo técnicas de clonación por PCR. Esto implica la fabricación de un par de cebadores (normalmente de alrededor de 15-30 nucleótidos) para amplificar la región deseada de la endoproteasa específica de prolina a clonar, poniendo en contacto los cebadores con ARNm, ADNc o ADN genómico obtenido de una célula de levadura, bacterias, plantas, procariotas u hongos, preferentemente de una cepa de Aspergillus, realizando la reacción en cadena de la polimerasa bajo condiciones adecuadas para la amplificación de la región

15 deseada, aislando el fragmento amplificado (por ejemplo mediante purificación de la mezcla de reacción en gel de agarosa) y recuperando el ADN amplificado. Los cebadores pueden ser diseñados para contener sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados, de manera que el ADN amplificado pueda ser clonado dentro de un vector de clonación adecuado.

Tales técnicas pueden ser utilizadas para obtener todo o parte de los polinucleótidos que codifican las secuencias de

20 endoproteasas específicas de prolina descritas aquí. Los intrones, promotores y regiones remolque están dentro del alcance de la invención, y también pueden obtenerse de manera análoga (por ejemplo, por medios recombinantes, PCR o técnicas de clonación) comenzando con ADN genómico de hongos, levaduras, bacterias, células de plantas o procariotas.

Los polinucleótidos o cebadores pueden portar una marcador de revelado. Como marcadores adecuados se incluyen

25 radioisótopos como 32P o 35S, marcadores enzimáticos, u otros marcadores proteicos como biotina. Tales marcadores pueden añadirse a los polinucleótidos o cebadores y pueden ser detectados mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Los polinucleótidos o cebadores (o fragmentos de los mismos) marcados o sin marcar pueden ser utilizados en ensayos a base de ácidos nucleicos para detectar o secuenciar una endoproteasa específica de prolina o una variante de la misma en una muestra de hongo. Tales ensayos de

30 detección normalmente comprenden la puesta en contacto de una muestra de hongos sospechosa de contener el ADN de interés con una sonda que comprende un polinucleótido o un cebador de la invención bajo condiciones de hibridación, y detectar cualquier dúplex formado entre la sonda y el ácido nucleico en la muestra. La detección puede llevarse a cabo mediante técnicas tales como PCR, o por inmovilización de la sonda sobre un soporte sólido, eliminando cualquier ácido nucleico de la muestra que no se ha hibridado con la sonda, y luego detectando cualquier

35 ácido nucleico que sí lo haya hecho. Como alternativa, la muestra de ácido nucleico puede ser inmovilizada sobre un soporte sólido, la sonda se puede hibridar, y se detecta la cantidad de sonda unida a tal soporte después de eliminar cualquier sonda no unida.

Las sondas mencionadas pueden ser empaquetadas convenientemente como un kit de ensayo en un contenedor adecuado. En tales kits, la sonda puede estar unida a un soporte sólido donde el formato del ensayo para el cual el

40 kit ha sido diseñado requiere tal unión. El kit puede también contener los reactivos adecuados para tratar la muestra a ser ensayada, hibridando la sonda al ácido nucleico de la muestra, reactivos de control, instrucciones y similares. Las sondas y los polinucleótidos descritos aquí pueden también ser utilizados en micro-ensayos.

Preferentemente, los polinucleótidos descritos aquí se obtienen a partir de los mismos organismos que el polipéptido, tales como hongos, en particular hongos del género Aspergillus.

45 Los polinucleótidos adecuados para uso en la invención incluyen también variantes de la secuencia de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6 que codifica un polipéptido que tiene actividad de endoproteasa específica de prolina. Las variantes pueden estar formadas por adiciones, sustituciones y/o supresiones. Tales variantes de la secuencia codificante de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6 pueden de este modo codificar polipéptidos que tienen la capacidad de digerir una cadena de polipéptido del lado carboxi-terminal de

50 prolina.

Producción de polinucleótidos

Los polinucleótidos que no tienen un 100% de identidad con SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6 pueden obtenerse de varias maneras. Así, las variantes de la secuencia de endoproteasa específica de prolina descritas aquí pueden ser obtenidas, por ejemplo, sondando librerías de ADN genómico creadas a partir de un 55 conjunto de organismos, tales como los discutidos como fuentes de los polipéptidos de la invención. Además, se pueden obtener otros homólogos de hongos, plantas o procariotas de endoproteasas específicas de prolina, y tales homólogos y fragmentos de los mismos en general serán capaces de hibridarse a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6. Tales secuencias pueden obtenerse sondando librerías de ADNc o de ADN genómico de otras especies, y sondando tales librerías con sondas que comprenden todo o parte de SEQ ID NO:1 bajo

condiciones de baja, media o alta rigurosidad (como se describió anteriormente). Las sondas de ácidos nucleicos que comprenden la totalidad o parte de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6 pueden ser utilizadas para sondar librerías de ADNc o genómico de otras especies, tales como las descritas como fuentes para los polipéptidos para uso en la invención.

5 Los homólogos de especie también pueden obtenerse utilizando PCR degenerada, que emplea cebadores diseñados para seleccionar las secuencia dentro de las variantes y homólogos que codifican secuencias de aminoácidos conservadas. Los cebadores pueden contener una o más posiciones degeneradas, y podrán ser utilizados en condiciones de rigurosidad menores que aquellas utilizadas para las secuencias de clonación con cebadores de secuencia individuales contra secuencias conocidas.

10 Como alternativa, tales polinucleótidos se pueden obtener mediante mutagénesis dirigida al sitio de las secuencias de endoproteasas específicas de prolina o variantes de las mismas. Esto puede ser útil cuando, por ejemplo, se requieren cambios de codones silenciosos de la secuencia para optimizar preferencias de codones para una célula hospedante particular en la cual las secuencias de polinucleótidos están siendo expresada. Se pueden realizar otros cambios de secuencia con el fin de introducir sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, o para alterar las

15 propiedades o funciones de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos.

Se describen aquí polinucleótidos de cadena doble que comprenden un polinucleótido descrito aquí y su complemento.

También se describen aquí polinucleótidos que codifican a los polipéptidos descritos más arriba. Dado que tales polinucleótidos serán útiles como secuencias para la producción recombinante de polipéptidos adecuados para uso

20 en la invención, no es necesario que éstos sean capaces de hibridarse con la secuencia de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6, aunque esto es generalmente deseable. Por otra parte, tales polinucleótidos pueden ser marcados, utilizados y fabricados tal como se describió mas arriba, si se desea.

Polinucleótidos recombinantes

Los vectores pueden comprender un polinucleótido como se menciona anteriormente, incluyendo vectores de

25 clonación y expresión, y en otro aspecto, métodos de crecimiento, transformación o transfección de tales vectores dentro de una célula hospedante adecuada, por ejemplo bajo condiciones en las que ocurre la expresión de un polipéptido de, o es codificado por una secuencia como se describe anteriormente. También se proporcionan células hospedantes que comprenden un polinucleótido o vector en el que el polinucleótido es heterólogo al genoma de la célula hospedante. El término “heterólogo”, usualmente con repsecto a la célula hospedante, significa que el

30 polinucleótido no es de ocurrencia natural en el genoma de la célula hospedante, o que el polinucleótido no es producido naturalmente por esa célula. Preferentemente, la célula hospedante es una célula de levadura, por ejemplo una célula de levadura del género Kluyveromyces o Saccharomyces, o una célula de hongo filamentoso, por ejemplo del género Aspergillus.

Los polinucleótidos pueden ser incorporados en un vector recombinante replicable, por ejemplo en un vector de

35 clonación o expresión. El vector se puede utilizar para replicar el ácido nucleico en una célula hospedante compatible. Se describe aquí un método para obtener polinucleótidos mediante la introducción de un polinucleótido en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula hospedante compatible, y haciendo crecer la célula hospedante bajo condiciones que permitan la replicación del vector. El vector puede ser recuperado de la célula hospedante. Células hospedantes adecuadas se describen más abajo en relación con vectores de expresión.

40 Vectores

El vector en el cual se inserta el casete de expresión puede ser cualquier vector que pueda ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá frecuentemente de la célula hospedante en la cual éste será introducido. Así, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extra-cromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación

45 cromosómica, tal como un plásmido. Como alternativa, el vector puede ser aquel que, cuando es introducido en una célula hospedante, se integra en el genoma de ésta y se replica junto con el o los cromosomas en los que está integrado.

Preferentemente, cuando un polinucleótido está en un vector, éste está operativamente enlazado a una secuencia reguladora que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia codificante por la célula hospedante, es decir,

50 el vector es un vector de expresión. La expresión “operativamente enlazado” se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera pretendida. Una secuencia reguladora tal como un promotor, potenciador u otra señal de regulación de la expresión “operativamente enlazada” a una secuencia codificante está ubicado de manera que la expresión de la secuencia codificante se lleva a cabo bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

55 Los vectores pueden, por ejemplo en el caso de vectores de plásmidos, cósmidos, virus o fagos, ser proporcionados con un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión del polinucleótido, y opcionalmente un potenciador y/o un regulador del promotor. Puede estar presente una secuencia terminadora, como puede ser una

secuencia de poliadenilación. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo un gen de resistencia a ampicilina en caso de un plásmido bacteriano o un gen de resistencia a neomicina para un vector de mamífero. Los vectores pueden ser utilizados in vitro, por ejemplo para la producción de ARN, o pueden ser utilizados para transfectar o transformar una célula hospedante.

5 La secuencia de ADN que codifica el polipéptido se introduce preferentemente en un hospedante adecuado como parte de un constructo de expresión en la cual la secuencia de ADN está enlazada operativamente a señales de expresión que son capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ADN en las células hospedantes. Para la transformación del hospedante adecuado con el constructo de expresión, existen procedimientos de transformación bien conocidos por los expertos en la técnica. El constructo de expresión puede ser utilizado para la transformación

10 del hospedante como parte de un vector que lleva un marcador seleccionable, o el constructo de expresión es cotransformado como una molécula distinta junto con el vector que lleva un marcador seleccionable. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables.

Los marcadores seleccionables preferentes incluyen, pero no están limitados a, aquellos que complementan un defecto en la célula hospedante, o confieren resistencia a un fármaco. Incluyen, por ejemplo, genes marcadores 15 versátiles que pueden ser utilizados para la transformación de la mayoría de los hongos filamentosos y levaduras, tales como genes de acetamidasa o los ADNc (los genes amdS, niaD, facA o los ADNc de A. nidulans, A. oryzae, o

A. niger), o genes que proporcionan resistencia a antibióticos como resistencia a G418, higromicina, bleomicina, kanamicina, fleomicina o benomilo (benA). Como alternativa, se pueden utilizar marcadores de selección específicos tales como marcadores auxotróficos que requieren las correspondientes cepas hospedantes mutantes: por ejemplo

20 URA3 (de S. cerevisiae o genes análogos de otras levaduras), pyrG o pyrA (de A. nidulans o A. niger), argB (de A. nidulans o A. niger) o trpC. En una realización preferente, el marcador de selección se suprime de la célula hospedante transformada después de la introducción del constructo de expresión, para obtener así células hospedantes transformadas capaces de producir el polipéptido que están libre de los genes marcadores de selección.

25 Otros marcadores incluyen la subunidad 9 de ATP sintetasa (oliC), orotidina-5’-fosfato-decarboxilasa (pvrA), el gen de resistencia a G418 bacteriano (útil en levaduras pero no en hongos filamentosos), el gen de resistencia a ampicilina (E. coli), el gen de resistencia a neomicina (Bacillus) y el gen uidA de E. coli, que codifica glucuronidasa (GUS). Se pueden utilizar los vectores in vitro, por ejemplo para la producción de ARN, o para transfectar o transformar una célula hospedante.

30 Para la mayoría de los hongos filamentosos y levaduras, el constructo de expresión se integra, preferentemente, dentro del genoma de la célula hospedante para obtener transformantes estables. Sin embargo, para ciertas levaduras existen sistemas de vectores episomales adecuados en los cuales se incorpora el constructo de expresión para lograr expresión estable y de nivel elevado. Ejemplos de éstos incluyen vectores derivados de los plásmidos 2 m, CEN y pKD1, de Saccharomyces y Kluyveromyces, respectivamente, o vectores que contienen una secuencia

35 AMA (por ejemplo, AMA1 de Aspergillus). Cuando los constructos de expresión están integrados en los genomas de células hospedantes, los constructos se integran en loci aleatoriamente en el genoma, o bien en loci diana predeterminados mediante recombinación homóloga, en este caso los loci diana comprenden preferentemente un gen de altamente expresado. Un gen altamente expresado es un gen cuyo ARNm puede constituir hasta al menos 0,01% (p/p) del ARNm celular total, por ejemplo bajo condiciones inducidas. o, como alternativa, un gen cuyo

40 producto génico puede constituir hasta al menos 0,2% (p/p) de proteínas celulares totales, o, en caso de un producto génico secretado, éste puede ser segregado hasta un nivel de al menos 0,05 g/l.

Un constructo de expresión para una célula hospedante determinada contendrá usualmente los siguientes elementos enlazados operativamente unos con otros, en orden consecutivo desde el extremo 5’ al extremo 3’ con respecto a la cadena codificante de la secuencia que codifica el polipéptido del primer aspecto: (1) una secuencia 45 promotora capaz de dirigir la trascripción de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido en la célula hospedante dada, (2) preferentemente, una región 5’ no traducida (líder), (3) opcionalmente, una secuencia señal capaz de dirigir la secreción del polipéptido desde la célula hospedante dada al medio de cultivo, (4) la secuencia de ADN que codifica una forma madura y preferentemente activa del polipéptido, y preferentemente también (5) una región de finalización de la trascripción (terminadora) capaz de finalizar la trascripción en dirección 3’ de la secuencia de ADN

50 que codifica el polipéptido.

En dirección 3’ de la secuencia de ADN que codifica al polipéptido, el constructo de expresión contiene preferentemente una región 3’ no traducida con uno ó más sitios de finalización de la trascripción, también llamados terminadores. El origen del terminador es menos crítico. El terminador puede, por ejemplo, ser nativo a la secuencia de ADN que codifica al polipéptido. Sin embargo, preferentemente se utiliza un terminador de levadura en células

55 hospedantes de levadura, y un terminador de hongos filamentosos en células hospedantes de hongos filamentosos. Más preferentemente, el terminador es endógeno a la célula hospedante en la cual se expresa la secuencia de ADN que codifica el polipéptido.

También puede llevarse a cabo un incremento en la expresión del polinucleótido que codifica el polipéptido mediante la selección de regiones reguladoras heterólogas, por ejemplo, regiones promotoras, de secuencia señal y 60 terminadoras, que sirven para incrementar la expresión y, si se desea, los niveles de secreción de la proteína de

interés del hospedante de expresión elegido, y/o para proporcionar un control inducible de la expresión del polipéptido.

A parte del promotor nativo del gen que codifica el polipéptido, se pueden utilizar otros promotores para dirigir la expresión del polipéptido. El promotor puede ser elegido por su eficiencia en dirigir la expresión del polipéptido en el 5 hospedante de expresión deseado.

Los promotores/potenciadores y otras señales de regulación de la expresión pueden ser seleccionadas de forma que sean compatibles con la célula hospedante para la cual se diseña el vector de expresión. Por ejemplo, se pueden utilizar promotores procariotas, en particular aquellos adecuados para uso en cepas de E. coli. Cuando la expresión de los polipéptidos se realiza en células de mamífero, se pueden utilizar promotores de mamíferos. También se

10 pueden utilizar promotores específicos de tejidos, por ejemplo promotores específicos de hepatocitos. También se pueden utilizar promotores virales, por ejemplo repeticiones terminales largas del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV LTR), promotores LTR del virus del sarcoma de rous (RSV), el promotor SV40, el promotor IE del citomegalovirus humano (CMV), promotores del virus de herpes simple o promotores de adenovirus.

Los promotores de levaduras adecuados incluyen a los promotores de S. cerevisiae GAL4 y ADH, y los promotores

15 de S. pombe nmt1 y adh. Los promotores de mamíferos incluyen al promotor de metalotioneína que puede ser inducido en respuesta a metales pesados tales como cadmio. Promotores virales tales como el promotor del antígeno T grande de SV40 o promotores de adenovirus. Todos estos promotores están fácilmente disponibles en la técnica.

Se pueden utilizar promotores de mamíferos, tales como promotores de -actina. Son especialmente preferidos los

20 promotores específicos de tejidos, o los promotores específicos de células neuronales o endoteliales (por ejemplo los promotores DDAHI y DDAHII). También se pueden utilizar promotores virales, por ejemplo la repetición terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV LTR), el promotor LTR del virus de sarcoma de rous (RSV), el promotor SV40, el promotor IE del citomegalovirus humano (CMV), adenovirus, promotores HSV (tal como los promotores HSV IE), o promotores HPV, particularmente la región reguladora en dirección 3’ de HPV (URR). Los

25 promotores virales están fácilmente disponibles en la técnica.

Se puede utilizar una gran variedad de promotores que son capaces de dirigir la trascripción en células hospedantes. Preferentemente, la secuencia promotora deriva de un gen altamente expresado tal como ha sido previamente definido. Ejemplos de genes altamente expresados preferidos, a partir de los cuales derivan preferiblemente los promotores y/o que comprenden loci diana predeterminados preferidos para la integración de constructos de 30 expresión, incluyen, pero sin limitarse a ellos, genes que codifican enzimas glicolíticas tales como triosa-fosfato isomerasas (TPI), gliceraldehído-fosfato deshidrogenasas (GAPDH), fosfoglicerato cinasas (PGK), piruvato cinasas (PYK), alcohol deshidrogenasas (ADH), y también genes que codifican amilasas, glucoamilasas, proteasas, xilanasas, celobiohidrolasas, B-galactosidasas, alcohol (metanol) oxidasas, factores de elongación, y proteínas ribosómicas. Ejemplos específicos de genes altamente expresados adecuados se incluyen, por ejemplo, el gen

35 LAC4 de Kluyveromyces sp., los genes de metanol oxidasa (AOX y MOX) de Hansenula y Pichia, respectivamente, los genes de glucoamilasa (glaA) de A. niger y A. awamori, el gen de amilasa TAKA de A. oryzae, el gen gpdA de A. nidulans y los genes de celobiohidrolasa de T. reesei.

Ejemplos de promotores constitutivos y/o inducibles fuertes que se prefieren para uso en hospedantes de expresión fúngicos son aquellos que se obtienen a partir de los genes fúngicos para promotores de xilanasa (xlnA), fitasa,

40 subunidad 9 de ATP-sintetasa (oliC), triosa fosfato isomerasa (tpi), alcohol deshidrogenasa (AdhA), amilasa (amy), amiloglucosidasa (AG -del gen glaA), acetamidasa (amdS) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gpd).

Ejemplos de promotores de levadura fuertes que se pueden utilizar incluyen aquellos que se obtienen a partir de genes para alcohol deshidrogenasa, lactasa, 3-fosfoglicerato cinasa y triosa-fosfato isomerasa.

Ejemplos de promotores bacterianos fuertes que se pueden utilizar incluyen los promotores de amilasa y SPo2, y 45 también promotores de genes de proteasas extracelulares.

Los promotores adecuados para células vegetales que se pueden utilizar incluyen promotores de nopalina sintasa (nos), octopina sintasa (ocs), manopina sintasa (mas), subunidad pequeña de ribulosa (rubisco ssu), histona, actina de arroz, faseolina, virus del mosaico de la coliflor 35S y 19S (CVM) y circovirus. El vector puede además incluir secuencias que flanquean el polinucleótido, dando un ARN que comprende secuencias homólogas a aquellas 50 procedentes de secuencias genómicas eucariotas, preferentemente secuencias genómicas de mamíferos, o secuencias genómicas virales. Esto permitirá la introducción de los polinucleótidos dentro del genoma de células eucariotas o virus mediante recombinación homóloga. En particular, se puede utilizar un vector plasmídico que comprende el casete de expresión flanqueado por secuencias virales, para preparar un vector viral adecuado para suministrar los polinucleótidos de la invención a una célula de mamífero. Otros ejemplos de vectores virales 55 adecuados son vectores del virus del herpes simple, y de retrovirus, que incluyen lentivirus, adenovirus, virus adenoasociados y virus del HPV (tal como HPV-16 o HPV-18). Las técnicas de transferencia génica que utilizan estos virus son bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar vectores de retrovirus para integrar establemente el polinucleótido, dando lugar al ARN antisentido en el genoma del hospedante. Por el contrario, se

pueden utilizar vectores de adenovirus de replicación defectuosa que permanecen episomales, y por lo tanto permiten la expresión transitoria.

El vector puede contener un polinucleótido orientado en la dirección antisentido para proporcionar la producción de ARN antisentido. Esto se utiliza, si se desea, para reducir los niveles de expresión del polipéptido.

5 Células hospedantes y expresión

En un aspecto adicional, se describe un procedimiento para preparar un polipéptido, que comprende cultivar una célula hospedante transformada o transfectada con un vector de expresión como se describió anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión mediante el vector de una secuencia codificante que codifica el polipéptido, y recuperar el polipéptido expresado. Los polinucleótidos pueden incorporarse en un vector replicable 10 recombinante, tal como un vector de expresión. El vector puede ser utilizado para replicar al ácido nucleico en una célula hospedante compatible. Así, una realización adicional se refiere a método para generar un polinucleótido mediante la introducción de un polinucleótido en un vector replicable, introducir el vector en una célula hospedante compatible, y hacer crecer la célula hospedante en condiciones que permitan la replicación de dicho vector. El vector puede ser recuperado de la célula hospedante. Células hospedantes adecuadas incluyen bacterias como E. coli,

15 levaduras, estirpes celulares de mamíferos y otras estirpes celulares eucariotas, por ejemplo células de insectos tales como células Sf9, y células fúngicas (por ejemplo filamentosas).

Preferentemente, el polipéptido es producido como una proteína segregada, en cuyo caso la secuencia de ADN que codifica la forma madura del polipéptido en el constructo de expresión está operativamente enlazada a una secuencia de ADN que codifica una secuencia señal. En el caso de que el gen que codifica la proteína segregada 20 tenga en la cepa tipo salvaje una secuencia señal, preferentemente la secuencia señal utilizada será nativa (homóloga) a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Como alternativa, la secuencia señal es extraña (heteróloga) a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido, en cuyo caso la secuencia señal es preferentemente endógena a la célula hospedante en la que se expresa la secuencia de ADN. Ejemplos de secuencias señal adecuadas para células hospedantes de levaduras son las secuencias señal derivadas de genes MFalfa de

25 levaduras. De manera similar, una secuencia señal adecuada para células hospedantes de hongos filamentosos es, por ejemplo, una secuencia señal derivada de un gen de amiloglucosidasa (AG) de hongo filamentoso, por ejemplo el gen glaA de A. niger. Se puede utilizar esta secuencia señal en combinación con el propio promotor de la amiloglucosidasa (también denominado (gluco)amilasa), y también en combinación con otros promotores. También se pueden utilizar secuencias señal híbridas.

30 Las secuencias líder de secreción heterólogas preferidas son aquellas que se originan a partir del gen de amiloglucosidasa fúngico (AG) (glaA -ambas versiones de 18 y 24 aminoácidos, por ejemplo de Aspergillus), el gen de MFalfa (levaduras, por ejemplo Saccharomyces y Kluyveromyces) o el gen de alfa-amilasa (Bacillus).

Los vectores pueden ser transformados o transfectados en una célula hospedante adecuada como se describe más arriba, para proporcionar la expresión de un polipéptido. Este procedimiento puede comprender cultivar una célula

35 hospedante transformada con un vector de expresión como se describe más arriba, en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido, y opcionalmente recuperar el polipéptido expresado.

Un aspecto adicional se refiere a células hospedantes transformadas o transfectadas con o que comprenden un polinucleótido como se describe más arriba. Preferentemente, el polinucleótido es llevado en un vector que permite la replicación y la expresión del polinucleótido. Se elegirán células que son compatibles con dicho vector, y pueden

40 ser, por ejemplo, procariotas (por ejemplo bacterianas), u células fúngicas eucariotas, levaduras o vegetales.

También se describen procedimientos para la producción de un polipéptido por medio de la expresión recombinante de una secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Para este fin, la secuencia de ADN puede ser utilizada para amplificación génica y/o intercambio de señales de expresión, tales como promotores, secuencias señal de secreción, con el fin de permitir una producción económica del polipéptido en células hospedantes heterólogas u

45 homólogas adecuadas. Una célula hospedante homóloga se define aquí como una célula hospedante que es de la misma especie o que es una variante dentro de la misma especie que la especie a partir de la cual derivó la secuencia de ADN.

Células hospedantes adecuadas son, preferentemente, microorganismos procariotas como bacterias, o más preferentemente organismos eucariotas, por ejemplo hongos, tales como levaduras u hongos filamentosos, o células

50 de plantas. En general, se prefieren las células de levadura a las células de hongos filamentosos, debido a que las primeras son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas son escasamente segregadas a partir de levaduras, o en algunos casos no son procesadas adecuadamente (por eejmplo, hiperglicosilación en levaduras). En estos casos, se debería seleccionar un organismo hospedante fúngico filamentoso.

Las bacterias del género Bacillus son muy adecuadas como hospedantes heterólogos, debido a que son capaces de

55 segregar proteínas en el medio de cultivo. Otras bacterias adecuadas como hospedantes son las de los géneros Streptomyces y Pseudomonas. Una célula hospedante de levaduras preferida para la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido pertenece a los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia o Schizosaccharomyces. Más preferentemente, una célula hospedante de levadura se selecciona del grupo

que consiste en las especies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (también conocida como Kluveromyces marxianus var lactis), Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, y Schizosaccharomyces pombe.

Sin embargo, más preferidas para la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido son las células

5 hospedantes de hongos filamentosos. Las células hospedantes de hongos filamentosos preferidas se seleccionan del grupo que consiste en el género Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia y Talaromyces. Más preferiblemente, una célula hospedante de hongos filamentosos es de la especie Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, o pertenece a una especie del grupo Aspergillus niger (como la define Raper y Fennel, The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins

10 Company, Baltimore, p 293-344, 1965). Estas incluyen, pero sin limitación, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubigensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae y Aspergillus ficuum, y también las de la especie Trichoderma reesei, Fusarium graminearum, Penicillium chrysogenum, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliopthora thermophilum, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum y Thelavia terrestris.

15 Ejemplos de hospedantes de expresión preferidos son hongos tales como la especie Aspergillus (en particular los descritos en los documentos EP-A-184.438 y EP-A-284.603) y especie Trichoderma; bacterias tales como especie Bacillus (en particular las descritas en los documentos EP-A-134.048 y EP-A-253.455), especialmente Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, especie Pseudomonas; y levaduras tales como especie Kluyveromyces (en particular las descritas en el documento EP-A-096.430 tales como Kluyeveromyces lactis y en el

20 documento EP-A-301.670) y especie Saccharomyces, tal como Saccharomyces cerevisiae.

Las células hospedantes incluyen células vegetales, y la descripción aquí se extiende por lo tanto a organismos transgénicos, tales como plantas, o partes de las mismas, que contienen una o más de tales células. Las células pueden expresar heterólogamente el polipéptido como se describe aquí, o pueden contener heterólogamente uno o más de los polinucleótidos como se mencionan aquí. Las plantas transgénicas (o genéticamente modificadas)

25 pueden tener por lo tanto insertado (en forma estable) en su genoma una secuencia que codifica los polipéptidos. La transformación de células vegetales puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas, por ejemplo utilizando el plásmido Ti o Ri de Agrobacterium tumefaciens. El plásmido (o vector) puede contener así las secuencias necesarias para infectar una planta, y se pueden emplear derivados de los plásmidos Ti y/o Ri.

La célula hospedante puede sobreexpresar el polipéptido, y son bien conocidas las técnicas de ingeniería de 30 sobreexpresión. El hospedante puede tener así dos o más copias del polinucleótido.

Como alternativa, se puede efectuar la infección directa de una parte de la planta, tal como una hoja, raíz o el tallo. En esta técnica, la planta a ser infectada puede ser herida, por ejemplo cortándola con una navaja, punzándola con una aguja o raspándola con un abrasivo. La herida es inoculada luego con Agrobacterium. La planta o parte de la misma se puede hacer crecer en un medio de cultivo adecuado y permitir su desarrollo hasta una planta madura. La

35 regeneración de células transformadas en plantas modificadas genéticamente se puede realizar mediante técnicas conocidas, por ejemplo, seleccionando los vástagos transformados usando un antibiótico y subcultivando los vástagos en un medio que contiene los nutrientes apropiados, hormonas vegetales y similares.

Cultivo de células hospedantes y producción recombinante

También se describen células que han sido modificadas para expresar endoproteasas específicas de prolina, o una 40 variante de las mismas. Tales células incluyen estirpes celulares eucariotas superiores modificadas transitoriamente,

o preferentemente de forma estable, tales como células de mamífero o de insecto, células de eucariotas inferiores, tales como células de levaduras y hongos filamentosos, o células procariotas tales como células bacterianas.

Es también posible la expresión de los polipéptidos de forma transitoria en una estirpe celular o en una membrana, tal como por ejemplo en un sistema de expresión de baculovirus. Tales sistemas, que están adaptados para

45 expresar las proteínas según la invención, también están incluidos.

La producción del polipéptido como se describe aquí puede realizarse mediante el cultivo de hospedantes de expresión microbianos, que han sido transformados con uno o más polinucleótidos como se describen aquí, en un medio de fermentación nutriente convencional.

Las células hospedantes recombinantes pueden cultivarse utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Para

50 cada combinación de promotor y una célula hospedante, existen condiciones de cultivo que llevan a la expresión de la secuencia de ADN que codifica al polipéptido. Después de alcanzar la densidad celular deseada o título del polipéptido, el cultivo se detiene y el polipéptido se recupera mediante procedimientos bien conocidos.

El medio de fermentación puede comprender un medio de cultivo conocido que contienen una fuente de carbono (por ejemplo glucosa, maltosa, melaza, etc.), una fuente de nitrógeno (por ejemplo sulfato amónico, nitrato amónico, 55 cloruro amónico, etc.), una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo extracto de levadura, extracto de malta, peptona, etc.) y una fuente de nutrientes inorgánicos (por ejemplo fosfato, magnesio, potasio, zinc, hierro, etc.).

Opcionalmente, se puede incluir un inductor (dependiendo del constructo de expresión utilizado), o éste se puede añadir posteriormente.

La selección del medio apropiado se puede basar en la elección del hospedante de expresión y/o en los requisitos de regulación del constructo de expresión. Los medios adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica. 5 El medio puede contener, si se desea, otros componentes adicionales que favorecen a los hospedantes de expresión transformados sobre otros microorganismos potencialmente contaminantes.

La fermentación se puede llevar a cabo durante un período de 0,5 a 30 días. La fermentación puede ser en lotes, continua, o en lotes alimentados, a una temperatura adecuada en el intervalo entre 0ºC y 45ºC y, por ejemplo, a un pH de 2 a 10. Las condiciones de fermentación preferentes implican una temperatura en el intervalo entre 20ºC y

10 37ºC y/o un pH entre 3 y 9. Normalmente, las condiciones apropiadas se seleccionan en base a la elección del hospedante de expresión y de la proteína a ser expresada.

Después de la fermentación, si es necesario, las células pueden ser retiradas del caldo de fermentación mediante centrifugación o filtración. Después de que la fermentación se detiene o tras retirar las células, el polipéptido de la invención puede recuperarse entonces y, si se desea, purificarse y aislarse por medios convencionales. La

15 endoproteasa específica de prolina de la invención puede ser purificada a partir de micelio de hongo o a partir del caldo de cultivo en el cual se libera la endoproteasa específica de prolina por las células fúngicas cultivadas.

El polipéptido se obtiene a partir de hongos, especialmente a partir de Aspergillus, en particular a partir de Aspergillus niger.

Modificaciones

20 Los polipéptidos adecuados para uso en la invención pueden ser modificados químicamente, por ejemplo modificados post-traduccionalmente. Por ejemplo, se pueden glicosilar (una o más veces) o comprender restos de aminoácidos modificados. También pueden modificarse mediante adición de restos de histidina, para facilitar su purificación, o mediante la adición de una secuencia señal para promover la secreción desde la célula. Los polipéptidos pueden tener extensiones amino-o carboxiterminales, tales como un resto de metionina aminoterminal,

25 un péptido enlazador pequeño de hasta alrededor de 20-25 restos, o una pequeña extensión que facilite la purificación, como un tramo de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

Un polipéptido adecuado para uso en la invención puede estar marcado con un marcador revelador. El marcador revelador puede ser cualquier marcador adecuado que permita detectar el polipéptido. Los marcadores adecuados incluyen radioisótopos, por ejemplo 125I, 35S, enzimas, anticuerpos, polinucleótidos y enlazadores tales como biotina.

30 El polipéptido puede ser modificado para que incluya aminoácidos de origen no natural, o para incrementar su estabilidad. Cuando las proteínas o péptidos se producen por medios sintéticos, tales aminoácidos pueden ser introducidos durante la producción. Las proteínas o polipéptidos también se pueden modificar tras su producción sintética o recombinante.

Los polipéptidos también pueden producirse utilizando D-aminoácidos. En tales casos, los aminoácidos deberán

35 estar ligados en una secuencia inversa en orientación C a N. Esto es convencional en la técnica de producción de tales proteínas o polipéptidos.

En la técnica se conocen ciertas modificaciones de cadena lateral, y pueden ser realizadas a las cadenas laterales de las proteínas o los péptidos de la presente invención. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, modificaciones de aminoácidos mediante alquilación reductora por reacción con un aldehído, seguido de reducción con NaBH4,

40 amidinación con metilacitimidato o acilación con anhídrido acético.

Las secuencias descritas aquí también pueden utilizarse como materiales de partida para la construcción de enzimas de “segunda generación”. Las proteasas específicas de prolina de “segunda generación” son proteasas específicas de prolina alteradas mediante mutagénesis (por ejemplo mutagénesis dirigida al sitio), que poseen propiedades diferentes de las de la proteasa específica de prolina de tipo salvaje, o proteasas específicas de prolina

45 recombinantes. Por ejemplo, se puede alterar su temperatura u óptimo de pH, actividad específica, afinidad por el sustrato, o su estabilidad térmica para adaptarlas mejor para uso en un procedimiento particular.

Los aminoácidos esenciales para la actividad de la endoproteasa específica de prolina de la invención, y por lo tanto preferentemente sujetos a sustitución, pueden ser identificados siguiendo los procedimientos conocidos en la técnica, tal como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de barrrido de alanina. En esta última técnica, se

50 introducen mutaciones en cada resto en la molécula, y se evalúan las moléculas mutantes resultantes en busca de la actividad biológica (por ejemplo la actividad de endoproteasa específica de prolina) para identificar restos de aminoácidos críticos para la actividad de la molécula. También se pueden determinar los sitios de interacción enzima-sustrato mediante análisis de la estructura cristalina mediante técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, o marcaje de fotoafinidad.

Se espera que el uso de células hospedantes de levaduras y hongos filamentosos proporcione tales modificaciones post-traduccionales (por ejemplo procesamiento protolítico, miristilación, glicosilación, truncamiento, y fosforilación de tirosina, serina o treonina) según sea necesario para conferir una actividad biológica óptima a los productos de expresión recombinante de la invención.

5 Preparaciones

Los polipéptidos como se describen aquí pueden estar en forma aislada. Deberá entenderse que el polipéptido puede mezclarse con vehículos o diluyentes que no interferirán con el fin pretendido del polipéptido y aún así se considerarán aislados. Un polipéptido también puede estar en forma sustancialmente purificada, en cuyo caso comprenderá el polipéptido en una preparación en la cual más de 70%, por ejemplo más de 80%, 90%, 95%, 98% ó

10 99%, de las proteínas en la preparación es un polipéptido como se describe aquí.

Los polipéptidos se pueden proporcionar en una forma tal que están fuera de su medio celular natural. Así, pueden aislarse sustancialmente o purificarse, tal como se discute más arriba, o pueden presentarse en una célula en la que no se encuentran naturalmente, por ejemplo en una célula de otra especie de hongo, animales, plantas o bacterias. Además, los polipéptidos se pueden utilizar en una forma inmovilizada, de manera que se pueden tratar grandes

15 cantidades de líquidos que contienen proteína. Las formas para seleccionar materiales de soporte adecuados y los métodos de inmovilización adecuados se han descrito exhaustivamente en la bibliografía, por ejemplo en “immobilization of Enzymes and Cells" (ed. Gordon F. Bickerstaff; ISBN 0-89603-386-4).

La invención también se refiere al uso de una endoproteasa específica de prolilo en la preparación de una bebida en la que se usa una enzima auxiliar. Preferentemente una endoproteasa específica de prolilo se usa en la preparación 20 de cerveza, vino o zumo de frutas. Añadiendo una endoproteasa específica de prolilo en combinación con una enzima auxiliar en tal método según la invención, se consigue una reducción o se previene el enturbiamiento. Añadiendo estas endoproteasas específicas de prolilo en combinación con una enzima auxiliar se obtienen nuevas bebidas. De este modo, la invención también se refiere a bebidas obtenibles mediante el método según la invención. Estas bebidas incluyen, por ejemplo, cerveza, vino y zumo de frutas obtenibles mediante un método según la

25 invención.

Una ventaja de las bebidas obtenibles por el método según la invención es que éstas poseen un alto contenido de antioxidantes. Los polifenoles son antioxidantes. La cerveza se trata normalmente con un agente que elimina los polifenoles para prevenir la formación de enturbiamiento, y, como resultado, la cerveza obtenida tiene una baja actividad antioxidante. Este es el caso de otras bebidas tratadas con agentes que eliminan polifenoles. La cerveza

30 obtenible por el método según la invención tiene una mayor actividad antioxidante endógena. Dado que los antioxidantes son considerados como ingredientes que mejoran la salud, las bebidas obtenibles por el método según la invención pueden ser consideradas como bebidas más saludables que aquellas del mismo tipo preparadas con agentes que eliminan polifenoles, tales como PVPP.

Es otra ventaja del método según la invención el que prevenga la pérdida de péptidos hidrófobos durante la

35 fermentación y acondicionamiento de cervezas de densidad elevada. La extracción mejorada de polipéptidos hidrófobos durante la fase de maceración de la producción de cerveza da así como resultado mayores rendimientos y mejores estabilidades de la cabeza de la cerveza. (Brey et al; Journal of the Institute of Brewing, Vol. 108, nº 4, 424-433, 2002). Se sabe que las endoproteasas específicas de prolina reducen la hidrofobia de péptidos, mejorando de ese modo su solubilidad en agua y disminuyendo sus malos sabores amargos (documento WO 02/45523). De

40 hecho, se demuestran mayores niveles de proteína y estabilidades de la cabeza de la cerveza mejoradas al usar la enzima de Endo-Pro en el Ejemplo 15. El uso de endoproteasas específicas de prolina en combinación con las proteasas auxiliares especificadas en la presente solicitud es por lo tanto ventajoso.

Es aún otra ventaja del método según la invención que el color de los zumos de frutas obtenibles por el método no sea pálido o menos pálido que el color de zumos de frutas obtenido tras la eliminación de los polifenoles. Los vinos y

45 zumos de fruta obtenibles por el método según la invención tienen un aroma y un sabor mejorados en comparación con las bebidas obtenidas por un método en el que se utilizan compuestos de bentonita o similares, ya que la bentonita no sólo elimina las proteínas sino también los componentes que dan aroma y/o sabor.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

50 Materiales

Enzimas endoproteasas específicas de prolina (Endo-Pro’s)

Se depositó Aspergillus niger G306 en el CBS (CBS109712) el 10 de septiembre de 2001. A. Niger G306 contiene un gen que codifica una endoproteasa específica de prolilo. El gen o el ADNc obtenible de este organismo puede clonarse y expresarse en cualquier hospedante de Aspergillus niger utilizando métodos conocidos.

55 Se utilizaron las siguientes muestras:

1) En los experimentos con cerveza se empleó “Endo-pro A”, una endoproteasa de específica de prolina. La muestra era un concentrado de ultrafiltración obtenido tras ultrafiltración del caldo de fermentación obtenido tras la fermentación de una cepa de Aspergillus niger que comprende un gen que codifica una endoproteasa específica de prolina. La actividad específica de prolilo de la muestra Endo-pro A fue 5,06 U/ml, determinado

5 como se describe en Métodos. Se estimó que la concentración de la proteína fue 50 g/l, en base a la actividad específica de una muestra de endoproteasa específica de prolilo con una pureza superior al 90%.

2) En los experimentos con vino, se empleó “Endo-pro B”, una endoproteasa específica de prolina. La muestra fue obtenida tras la purificación sobre una columna, y tuvo una actividad de 6,0 U/ml.

Papaína

10 Collupulina, una preparación líquida de papaína disponible comercialmente de DSM, se empleó para los experimentos con papaína. La actividad es 5280 NF/mg. Una unidad NF es la cantidad de actividad de papaína que cataliza la hidrólisis de caseína para producir un microgramo equivalente de tirosina soluble por hora a pH de 6,0. Se midió la concentración de proteína en la muestra de papaína, que es 119 g/l (Lowry).

Polivinilpirrolidona (PVPP)

15 La PVPP utilizada fue una PVPP no soluble en agua disponible comercialmente bajo el nombre “Polyclar AT”.

Cerveza

En todos los experimentos realizados con cerveza se utilizó una cerveza de malta (tipo Pilsener) de “Les Trois Brasseurs”, Lille, Francia. El porcentaje de alcohol de esta cerveza fue 5,2% (v/v) y el pH de 4,4. Esta cerveza particular fue elegida por su cantidad relativamente elevada de turbidez medida en esta cerveza al enfriarla, en

20 comparación con otras cervezas disponibles comercialmente. La cerveza tenía una concentración proteica de 0,9 g/l, determinada por el método de Lowry.

Vino blanco

Se utilizó un vino blanco preparado a partir de uvas blancas Sauvignon sin ningún tratamiento de eliminación de proteínas. La fermentación alcohólica durante la preparación del vino se llevó a cabo con una levadura VL3 de

25 Lallemand seleccionada. El análisis enológico del vino dio los siguientes resultados:

Azúcares (g/l)

1,1

Etanol %vol

12,97

Acidez total (g de H2SO4/l)

4,14

Acidez volátil (g de H2SO4/l)

0,22

pH

3,46

SO2 libre (mg/l)

18

SO2 total (mg/l)

96

Glicerol (g/l)

3

Ácido tártrico (g/l)

3

Ácido málico (g/l)

2,8

Ácido láctico (g/l)

0,1

Nivel de Folin

7

Ejemplo 2

Métodos

Método espectrofotométrico para determinar actividades enzimáticas

30 Para medir la actividad de la endoproteasa específica de prolina, se usó una disolución sustrato de disolución 2 mM de N-carbobenzoxi-glicina-prolina-p-nitroanilida (Z-Gly-Pro-pNA; peso molecular 426,43; Bachem, Suiza) en un tampón de ácido cítrico 0,1 M /fosfato disódico 0,2 M, pH 5,0, que contiene un 40% de dioxano.

Se añaden 250 l de la disolución sustrato a 1 ml de tampón, pH 5,0, seguido de 100 l de la disolución de enzima (cantidades de volúmenes mayores o menores de disolución de enzima se deberían de compensar por la disolución tampón). La mezcla de reacción se incuba a 37ºC, y la liberación de pNA se sigue midiendo el incremento de la absorbancia a 410 nm.

5 Una unidad se define como la actividad enzimática que libera 1 mol de pNA a partir de Z-Gly-Pro-pNA en 1 minuto en las condiciones de reacción descritas usando un coeficiente de extinción molar (E) de 8,800 M-1 .

La actividad de la endoproteasa específica de glicina aislada de Flavourzyme 1000 L (NOVO, Dinamarca) se midió en el sustrato cromógeno sintético Z-Gly-Gly-pNA a pH 5,0 y 37 grados C usando procedimientos como se han descrito. Una unidad de endoproteasa específica de glicina se define como la cantidad de enzima que provoca la

10 liberación de 1 micromol de pNA de Z-Gly-Gly-pNA por minuto a pH 5,0 y 37 grados C.

La actividad de la carboxipeptidasa específica de prolina procedente de la especie Xanthomonas se midió midiendo la cantidad de restos de prolina liberados del péptido sintético Z-Pro-Pro (Bachem, Suiza) usando un analizador de aminoácidos.

Una unidad es la cantidad de enzima que provoca la liberación de 1 micromol de prolina a partir de Z-Pro-Pro por 15 hora a pH 7 y 37 grados C.

Medición del enturbiamiento en frío (ensayo de alcohol/baja temperatura de Lucien Chapon)

La turbidez o enturbiamiento se midió con un turbidímetro (“Tannometer”, Pfeuffer Gmbh, Kitzingen, Alemania), siguiendo las instrucciones operacionales. En cerveza fría puede ocurrir una turbidez reversible causada por complejos de polifenol-proteína precipitados. La adición de alcohol adicional acelera la formación de estas 20 turbideces. En el “ensayo de enturbiamiento por enfriamiento”, este fenómeno se usa para cuantificar los complejos de polifenol-proteína presentes. Para calibrar el Tannometer, se preparó una disolución estándar de formazina como se describe (Jean de Clerk, “Cours de Brasseries” 2ª edición, Vol. 2, 1963, p. 595-596, Université de Louvain, Bélgica). La unidad de enturbiamiento o turbidez de la cerveza es la EBC, que son unidades de turbidez nefelométricas recomendadas por la European Brewery Convention. Los ensayos de enturbiamiento en frío como se 25 describen para cerveza también se pueden realizar con cervezas o mostos libres de alcohol (adaptado de la Guía de Instrucciones de Operación del Tannometer). En estos casos, también se añade etanol a las muestras en una cantidad suficiente para alcanzar un contenido de alcohol de 10% (v/v) en las muestras. El etanol se añadió a las muestras de mosto hasta alcanzar 10% (v/v), después de lo cual cada muestra se enfrió hasta -8ºC durante 30 minutos. Después, el enturbiamiento formado (turbidez, en unidades EBC) se midió rápidamente en el turbidímetro,

30 cuyas cámaras de medida también se mantenían a -8ºC.

Medidas de “enturbiamiento en caliente” según la European Brewery Convention

El “ensayo enturbiamiento en caliente” es un protocolo para medir el enturbiamiento de la cerveza según se recomienda por la European Brewery Convention con el número 9.30. Se ha demostrado que el almacenamiento de la cerveza a temperaturas elevadas durante períodos de tiempo relativamente cortos dará como resultado un nivel

35 de enturbiamiento similar al encontrado en la misma cerveza después de un almacenamiento prolongado a temperatura ambiente. Este ensayo de “enturbiamiento en caliente” se lleva a cabo enfriando la cerveza toda la noche en el baño de enfriamiento a 0ºC y leyendo la turbidez inicial en la mañana. Después, la cerveza se coloca en un baño a 60ºC durante 48 h sin agitación. Finalmente, la cerveza se enfría y se mantiene a 0ºC toda la noche antes de una medición final de la turbidez a 0ºC.

40 Ensayos de enturbiamiento en caliente para vino y zumos de frutas

Como describe K. J. Siebert (K.J. Siebert y col., J Agric. Food Chem. 44 (1996)), el enturbiamiento en bebidas como vino o zumos de frutas puede ser inducido por un ensayo de calentamiento. La cantidad de enturbiamiento formada es función principalmente de los niveles de proteínas activas del enturbiamiento y de los polifenoles en la bebida. En el ensayo de calentamiento, la turbidez de las muestras (por ejemplo del vino o zumo de frutas) se midió con un

45 turbidímetro antes y después de calentarlas a 80ºC durante 30 minutos. Antes de medir la turbidez, la muestra calentada se enfrió en agua fría hasta alcanzar una temperatura de 22-25ºC. En los ensayos con vino (véase el Ejemplo 7), la calibración del turbidímetro se realizó con disoluciones patrón de NTU-formazina; para los ensayos con zumos de frutas (véase el Ejemplo 8), la disolución patrón de turbidez NTU se adquirió de Reagecon, Irlanda. NTU = unidades de turbidez nefelométricas.

50 Experimentos de control

1.

Se realizó un experimento en blanco en el que no se añadió proteína exógena durante la incubación.

2.

Se realizó un experimento en el que la cerveza utilizada había sido tratada con una gran cantidad de PVPP (1000 g/hl) antes de la incubación. Este experimento permitió determinar la cantidad promedio de enturbiamiento inducido por el ensayo de enturbiamiento por enfriamiento, que es debido al precipitado de polifenol-proteína,

debido a que la PVPP elimina los polifenoles de la cerveza y, de esta manera, interfiere con la formación de enturbiamiento.

3. Se realizaron experimentos en los que se añadieron proteínas exógenas (endoproteasa específica de prolilo o papaína, respectivamente) a cerveza enfriada hasta 0ºC después de una incubación a 40ºC durante 1 hora. La

5 incubación a 0ºC se realizó durante 15 minutos antes de la medición del enturbiamiento. Dado que la enzima y la papaína no son activas a 0ºC, o apenas lo son, estos experimentos permiten discriminar entre el efecto de la actividad enzimática y los efectos de proteínas no enzimáticas.

Análisis de LC/MS

Se usó HPLC usando una bomba P4000 (Thermoquest™, Breda, Países Bajos) equipada con un espectrómetro de

10 masas de trampa de iones LCQ (Thermoquest™, Breda, Países Bajos) para la caracterización de los tres péptidos sintéticos, que se separaron usando una columna de 150 * 1 mm PEPMAP C18 300A (LC Packings, Ámsterdam, Países Bajos) en combinación con un gradiente de ácido fórmico al 0,1% en agua Milli Q (Millipore, Bedford, MA, USA; Disolución A) y ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo (Disolución B) para elución. La información detallada sobre los péptidos individuales se obtuvo usando el algoritmo de MS/MS “dependiente del barrido”, que es un

15 algoritmo característico para un espectrómetro de masas de trampa de iones. La especificidad de la endoproteasa por hidroxiprolina y por alanina se comprobó comparando las secuencias peptídicas experimentales de los diferentes péptidos, obtenidas con MS/MS, con la información de secuencia teórica.

Ejemplo 3 -comparativo -

Efectos de la adición de una endoproteasa específica de prolilo sobre la formación de enturbiamiento en la cerveza

20 A una cerveza de malta decarbonatada (Les Trois Brasseurs), con un contenido de proteína de 0,9 g/l, se añadieron diversas cantidades de una enzima endoproteasa específica de prolilo (“Endo-Pro A”, véase Materiales). Se realizaron dos series de mediciones de enturbiamiento. En la primera serie, las composiciones de cerveza-Endo-Pro A se incubaron a 40ºC durante 1 hora antes del ensayo de enturbiamiento por enfriamiento. Después de la incubación a 40ºC, y justo antes del ensayo de enturbiamiento por enfriamiento, se añadió etanol a la composición

25 de cerveza-Endo-Pro A en cantidad suficiente para incrementar el contenido de alcohol hasta 6% (v/v). En una segunda serie, la cerveza sin Endo-Pro A se incubó a 40ºC durante 1 hora, y luego se enfrió hasta 0ºC. A 0ºC, se añadió Endo-Pro A y las composiciones resultantes se incubaron a 0ºC durante 15 minutos. Justo antes del ensayo de enturbiamiento por enfriamiento, se añadió etanol a la composición de cerveza-Endo-Pro A en cantidad suficiente para incrementar el contenido de alcohol hasta 6% (v/v).

30 Las cantidades de Endo-Pro A añadidas y el porcentaje de reducción de enturbiamiento con respecto al enturbiamiento medido cuando no se añadió Endo-Pro A se muestran en la Tabla 1. Las cantidades de Endo-Pro A añadidas abarcaban un amplio intervalo, desde menos de 1% de proteínas exógenas añadidas hasta más de 10%, con respecto a la cantidad de proteína presente en la cerveza.

Tabla 1. Efecto de la adición de una enzima endoproteasa específica de prolina a una cerveza sobre la cantidad de 35 enturbiamiento tras la incubación a 40ºC durante 1 hora

Ensayo

“Endo-Pro A” añadida Ensayo de enturbiamiento por enfriamiento (EBC) Reducción del enturbiamiento (%)

l/10 ml de cerveza

% de proteína exógena añadida*

1

0 0 141 0

2

0,45 0,25 116 17,7

3

0,9 0,5 101 28,4

4

1,8 1 87,4 38,0

5

3,6 2 81,1 42,5

6

5,4 3 69,0 51,1

7

9 5 61,3 56,5

8

18 10 48,5 65,6

9

36 20 39,9 71,7

10

54 30 33,4 76,3

* “% de proteína exógena añadida” refleja la cantidad de enzima Endo-Pro A añadida, expresada como un

Ensayo

“Endo-Pro A” añadida Ensayo de enturbiamiento por enfriamiento (EBC) Reducción del enturbiamiento (%)

l/10 ml de cerveza

% de proteína exógena añadida*

porcentaje de la cantidad total de proteína presentes en la cerveza antes de la adición de la enzima.

Tabla 2. Efecto de la enzima endoproteasa específica de prolilo a una ceverza sobre la cantidad de enturbiamiento después de la incubación a 0ºC durante 15 min

Ensayo

Endo-Pro A añadida Ensayo de enturbiamiento por enfriamiento (EBC) Reducción del enturbiamiento (%)

µl/10 ml de cerveza

% de proteína exógena añadida

1

0 0 141 0

2

0,45 0,25 141 0

3

0,9 0,5 141 0

4

1,8 1 143 -1,4

5

3,6 2 145 -2,8

6

5,4 3 138 2,1

7

9 5 138 2,1

8

18 10 130 7,8

9

36 20 126 10,6

10

54 30 120 14,9

5 La Tabla 1 ilustra claramente que se forma menos enturbiamiento al enfriar cuando se añade una endoproteasa específica de prolilo a la cerveza a una temperatura cuando la proteasa es activa antes del enfriamiento. La Tabla 2 muestra claramente que existe cierto efecto cuando se añade una endoproteasa específica de prolilo a la cerveza a una temperatura tan baja que la proteasa es poco o nada activa, pero el efecto es muy pequeño en comparación con el efecto observado cuando la proteasa se añade a una temperatura en la que está activa.

10 Ejemplo 4 -comparativo -

Efectos de la adición de Papaína sobre la formación de enturbiamiento en la cerveza

A una cerveza de malta descarbonatada (Les Trois Brasseur), con un contenido de proteína de 0,9 g/l, se añadieron diversas cantidades de papaína (de 0 a 100 g/hl). Se realizaron dos series de medidas de enturbiamiento bajo enfriamiento. Para la primera serie, las composiciones de cerveza-papaína se incubaron a 40ºC durante 1 hora

15 antes del ensayo de enturbiamiento por enfriamiento. Anteriormente a la medición del enturbiamiento, se añadió etanol a las muestras incubadas hasta alcanzar 6% de alcohol (v/v). En la segunda serie, las muestras de cerveza se incubaron a 40ºC durante 1 hora y a continuación se enfriaron hasta 0ºC. Entonces se añadió papaína y las muestras se incubaron a 0ºC durante 15 minutos. Las cantidades de papaína añadidas y el porcentaje de reducción del enturbiamiento con respecto al enturbiamiento medido cuando no se añadió papaína se muestran en la Tabla 3.

20 TABLA 3. Efecto de papaína sobre la cantidad de enturbiamiento formado en la cerveza después de la incubación a 40ºC durante 1 hora

Ensayo

Papaína añadida Ensayo de enturbiamiento por enfriamiento (EBC) Reducción del enturbiamiento (%)

g/hl cerveza

% de proteína exógena añadida

1

0 0 143 0

2

0,2 0,03 140 2,1

3

0,5 0,07 133 7,0

Ensayo

Papaína añadida Ensayo de enturbiamiento por enfriamiento (EBC) Reducción del enturbiamiento (%)

g/hl cerveza

% de proteína exógena añadida

4

1 0:13 119 16,8

5

2 0,26 94,1 34,2

6

3(1) 0,40 91,6 35,9

7

5 0,66 83,8 41,4

8

8

1,06 82,4 42,4

9

10 1,32 84,0 41,3

10

100 13,22 81,6 42,9

(1) 3 g/hl es la dosis máxima recomendada

Tabla 4. Efecto de la papaína sobre la cantidad de enturbiamiento después de la incubación a 0ºC durante 15 min

Ensayo

Papaína añadida Ensayo de enturbiamiento por enfriamiento (EBC) Reducción del enturbiamiento (%)

g/hl cerveza

% de proteína exógena añadida

1

0 0 143 0

2

0,2 0,03 139 2,8

3

0,5 0,07 136 4,9

4

1 0,13 135 5,6

5

2 0,26 134 6,3

6

3 0,40 132 7,7

7

5 0,66 136 4,9

8

8

1,06 130 9,1

9

10 1,32 122 14,7

10

100 13,22 138 3,5

Los resultados en la Tabla 3 ilustran el efecto de la papaína sobre la cantidad de enturbiamiento formado en la

5 cerveza con el enfriamiento. Se aprecia claramente que el efecto de la papaína sobre el enturbiamiento se nivela cuando se añade papaína en una cantidad de 3 g/hl o más. Aparentemente, no es posible conseguir la misma cantidad de reducción de enturbiamiento con papaína que con la endoproteasa específica de prolilo.

Ejemplo 5 -comparativo -

Efectos de la adición de PVPP sobre la formación de enturbiamiento en la cerveza

10 Tanto en los experimentos de cerveza con endoproteasas específicas de prolilo como en los experimentos de cerveza con papaína, se realizaron experimentos de control mediante la adición de una gran cantidad de PVPP (1000 g/hl) a la cerveza antes de la incubación. Después de 15 min de mezclamiento, se eliminó la PVPP mediante filtración (no se añadieron enzimas endoproteasas específicas de prolilo ni papaína). En ambos controles, casi no se formó enturbiamiento durante el ensayo de enturbiamiento por enfriamiento. Puesto que es sabido que la PVPP

15 elimina los polifenoles de las bebidas, estos experimentos de control indican que los polifenoles toman parte en la formación de enturbiamiento en la cerveza. Para medir el efecto de PVPP sobre la estabilidad frente al enturbiamiento de la cerveza, se añadieron diferentes cantidades de PVPP a una cerveza descarbonatada y se eliminaron por filtración después de 15 min de mezclamiento. Antes de añadir la PVPP, la cerveza se incubó durante 1 h a 40ºC.

La Tabla 5 muestra el efecto de la adición de diversas cantidades de PVPP sobre la cantidad de enturbiamiento presente en la cerveza al enfriar. No se añadió Endo-Pro A ni papaína.

Tabla 5. Efecto de PVPP sobre la cantidad de enturbiamiento presente en la cerveza al enfriar

PVPP añadida (g/hl)

Ensayo de enturbiamiento por enfriamiento (EBC) Reducción del enturbiamiento (%)

0

133

0

10

131 1,5

20

115 13,5

30(1)

103 22,6

50

65,2 51,0

80

48,4 63,6

100

42,1 68,3

500

17,2 87,1

1000

9,5 92,9

30 g/hl dosis máxima usada en fábricas de cerveza

5 En la Tabla 3 se muestra que la adición de 3 g de papaína/hl a la cerveza (que es la dosis máxima recomendada en la industria cervecera) después de la incubación a 40ºC durante 1 hora induce una disminución del enturbiamiento de casi 36%. En el caso de la adición de la endoproteasa específica de prolilo, la adición de 1% (con respecto a la cantidad de proteína en la cerveza) de endoproteasa específica de prolilo después de la incubación a 40ºC durante 1 hora induce una disminución del enturbiamiento de la cerveza por enfriamiento de 38% (véase la Tabla 1). En

10 fábricas de cerveza, la PVPP se suele añadir en una cantidad que no excede 30 g/hl. Dado que la PVPP reduce el enturbiamiento en alrededor de 20% cuando se añade en tal cantidad, esto permite concluir que tanto papaína como las enzimas endoproteasas específicas de prolilo son mejores inhibidores del enturbiamiento que PVPP.

Ejemplo 6 -comparativo -

Adición de Endo-Pro A sobre una pasta de malta de 100%, y reducción del enturbiamiento en un mosto de malta del 15 100%

El objetivo fue determinar si la adición de Endo-Pro A a una pasta de malta de 100% podría dar como resultado una reducción del enturbiamiento en el mosto de malta final.

Cada ensayo de maceración comienza con el mezclamiento de 25 g de malta molida con 100 ml de agua. Después, la pasta de malta se calienta hasta 50ºC y, tras añadir una cantidad de “Endo-Pro A”, la pasta de malta es tratada

20 siguiendo un procedimiento de calentamiento por etapas hasta cuatro temperaturas cada vez más altas. La Tabla 6 muestra el perfil de temperaturas de la maceración. Durante toda la maceración, la pasta de malta se agitó a 200 rpm. Al final de la maceración, la pasta de malta se mantiene a temperatura ambiente y se añade agua para compensar la evaporación de agua. A continuación, la pasta de malta se filtra en papel para separar el mosto (líquido) del sólido.

25 Tabla 6. Perfil de temperatura de la pasta de malta

Etapa

Temperatura Tiempo

1

50ºC 30 min

incremento de temperatura

1ºC/min 13 min

2

63ºC 30 min

incremento de temperatura

1ºC/min 10 min

3

72ºC 30 min

incremento de temperatura

1ºC/min 4 min

Etapa

Temperatura Tiempo

4

77ºC 10 min

Se añadieron a las pastas de malta 0, 200 y 500 l de Endo-Pro A, respectivamente. Se realizó un experimento de control en el que se utilizaron 500 l de Endo-Pro A, que se desactivó por calentamiento hasta 90ºC durante 15 min. La turbidez o enturbiamiento del mosto se midió a temperatura ambiente y después de un ensayo de enturbiamiento

5 por enfriamiento. Los ensayos de enturbiamiento por enfriamiento del mosto se llevaron a cabo como se describe en el ensayo de alcohol/temperatura baja de Chapon (Ensayo de enturbiamiento por enfriamiento – Instrucciones de Operación de Pfeuffer) añadiendo etanol hasta alcanzar 10% (v/v) en la muestra, como recomienda Chapon para cervezas libres de alcohol.

Tabla 7: Efecto de la adición de endoproteasa específica de prolilo hasta 100% de pastas de malta sobre la cantidad

10 de enturbiamiento formado en los mostos de malta del 100% resultantes (después del ensayo de enturbiamiento por enfriamiento)

Ensayo

Endo-Pro A añadida en la pasta (l) Turbidez inicial del mosto (EBC(1)) Turbidez del mosto después del ensayo de enturbiamiento por enfriamiento (EBC) Enturbiamiento inducido por el ensayo de enturbiamiento por enfriamiento (ΔEBC) Efecto de la reducción del enturbiamiento por Endo-Pro A (%)

1

0 10 158,5 148,5 0

2

200 15,9 59,2 43,3 70,8

3

500 22,5 49,1 26,6 82,1

4

500 (desactivada) 12,1 160,5 148,4 0,1

EBC: unidades de turbidez nefelométricas recomendadas por la European Brewery Convention

Los resultados en la Tabla 7 indican claramente que cuando se añade una endoproteasa específica de prolilo a una pasta de malta, el mosto resultante es mucho menos turbio al enfriarlo que un mosto preparado sin la adición de

15 endoproteasa específica de prolilo.

Para estudiar el efecto de la Endo-Pro A, se llevó a cabo un ensayo de enturbiamiento por enfriamiento sobre el mosto de malta. Se observó que la adición de una endoproteasa específica de prolilo disminuye el enturbiamiento por enfriamiento del mosto. Se observó una disminución del enturbiamiento formado en el ensayo del enturbiamiento por enfriamiento incluso con pequeñas cantidades de enzima endoproteasa específica de prolijo añadida. Cuando la

20 enzima se desactiva antes de añadirla en la pasta de malta, el efecto de estabilización desaparece completamente, es decir, la cantidad de enturbiamiento formado ya no sigue disminuyendo. La disminución del enturbiamiento inducida por la adición de una enzima específica de prolilo es muy importante. En el Ejemplo, se logró una reducción del enturbiamiento de hasta 82%.

Con el fin de comparar los efectos de la adición de una enzima endoproteasa específica de prolilo en los mostos de

25 malta y en los mostos de cebada, se llevaron a cabo experimentos en los que se añadieron diferentes cantidades de Endo-Pro A a pastas de cebada. El pH fue respectivamente 5,6 en mostos de malta y 6,1 en mostos de cebada. Los resultados obtenidos con mostos de cebada en los ensayos de enturbiamiento por enfriamiento mostraron que, tal como se observó previamente para los mostos de malta, el tratamiento de pastas de cebada con una endoproteasa específica de prolilo induce una reducción importante del enturbiamiento por enfriamiento de mostos de cebada.

30 Tanto las pastas de malta como de cebada tratadas con una endoproteasa específica de prolilo dieron como resultado mostos muy estabilizados, pero el efecto era más acusado en los mostos de malta que en los de cebada. Efectivamente, la adición en la pasta de 200 l de Endo-Pro A induce una reducción del enturbiamiento de alrededor del 59% en mostos de cebada y de más de 70% en los de malta. Los ensayos realizados con 500l de Endo-Pro A incrementaron la reducción del enturbiamiento hasta 82% en los mostos de malta, y no mejoraron la reducción del

35 enturbiamiento en los mostos de cebada en comparación con el experimento con 200 l de Endo-Pro A. Sorprendentemente, la adición de Endo-Pro A a pastas de cebada dio como resultado mostos filtrados transparentes, mientras que los mostos no tratados con Endo-Pro dieron como resultado mostos filtrados turbios (las filtraciones de la pasta de cebada se realizaron a temperatura ambiente, y la turbidez de los mostos fue medida a temperatura ambiente sin adición de etanol). Ese efecto es observado con cualquiera de las cantidades de

40 endoproteasa específica de prolilo añadidas a pastas de cebada.

Ejemplo 7 -comparativo -

Reducción del enturbiamiento en vino

Se añadieron diferentes dosis (0, 30, 60, 150 l) de una endoproteasa específica de prolilo (Endo-Pro B) con una actividad específica de 6,0 U/ml a matraces que contenían 500 ml de vino blanco (vino como se describe en

5 “Materiales”), y se incubó a temperatura ambiente (22-25ºC) durante 19 días en atmósfera de nitrógeno. Se midió la estabilidad del enturbiamiento del vino después de 0, 6, 8, 12 y 19 días utilizando el ensayo por calentamiento como se describe en “Métodos”.

Los resultados de los experimentos se muestran en la Tabla 8. En la Tabla 8, la turbidez o enturbiamiento del vino es expresada en unidades de turbidez nefelométricas (NTU), NTU = turbidez en NTU medida en muestras de vino

10 después del calentamiento -turbidez en NTU medida en muestras de vino antes de calentarlas. La cantidad de bentonita requerida para estabilizar las proteínas del vino se calculó según la fórmula: (1,48 x  NTU) + 2. Como es sabido, es necesaria una menor cantidad de bentonita para prevenir la formación de enturbiamiento en el vino cuando éste es menos susceptible a la formación de enturbiamiento.

Tabla 8. Efecto de la adición de una enzima endoproteasa específica de prolilo a un vino blanco sobre la cantidad de 15 enturbiamiento formado después de calentar el vino

Tiempo de incubación

Endo-Pro añadida (l/500 ml) Turbidez antes del calentamiento (NTU) Turbidez después del calentamiento (NTU) Δ NTU Cantidad de bentonita requerida (g/hl) Reducción del enturbiamiento (%) Disminución de la cantidad de bentonita requerida (%)

0

0 µl (Control) 36,8 74,5 38 58

6 días

0 µl (Control) 25,8 63,8 38 58 0 0

30 µl

20,2 53,5 33 51 13 12

60 µl

21,6 56 34 53 11 9

150 µl

20,5 43,3 23 37 39 36

8 días

0 µl (Control) 26,4 68 42 64 0 0

30 µl

31,4 60,2 29 45 31 30

60 µl

29,6 56,2 27 41 36 36

150 µl

25,1 48,4 23 36 45 44

12 días

0 µl (Control) 24,4 50,1 26 40 0 0

30 µl

23 36,9 14 23 46 43

60 µl

23 36,6 14 23 46 43

150 µl

23,9 37,9 14 23 46 43

19 días

0 µl (Control) 6,5 23,2 17 26 0 0

30 µl

5,8 11,2 5 10 71 62

60 µl

7 11,1 4 8 76 69

150 µl

8,5 13,7 5 10 71 62

Los resultados en la Tabla 8 muestran que la adición de una endoproteasa específica de prolilo al vino blanco antes del calentamiento reduce el enturbiamiento formado en el vino después del calentamiento. El efecto se observó después de 6 días de incubación a temperatura ambiente. Efectivamente, la disminución del enturbiamiento alcanzó

20 39% con 150 l de la Endo-Pro B, y alrededor de 12% con 30 l o 60 l de Endo-Pro B. Después de 12 días y con cualquier cantidad de endoproteasa específica de prolilo usada, la reducción del enturbiamiento alcanzó 46% y superó 70% después de 19 días. Por lo tanto, está claro que una endoproteasa específica de prolilo puede ser utilizada para evitar o reducir en gran medida la cantidad de bentonita requerida para estabilizar el vino frente a la formación de enturbiamiento.

Ejemplo 8 -comparativo -

Reducción del enturbiamiento en zumo de fresas

Se preparó un zumo de fresas de la forma siguiente: las fresas fueron descongeladas y machacadas, y posteriormente blanqueadas (calentadas) a 90ºC a fin de destruir todas las enzimas endógenas tales como las 5 polifenol oxidasas, y para desnaturalizar las proteínas. Las fresas machacadas se enfriaron después hasta 50ºC, se maceraron durante 30 minutos a 50ºC con 600 g/l de Rapidase BE super (un producto enzimático comercial de DSM, Francia) y se prensaron en una prensa neumática. Con el fin de eliminar las proteínas desnaturalizadas, la mezcla resultante fue centrifugada a una velocidad de 8000 rpm y se filtró. El zumo de fresas se recogió. El ensayo de alcohol acidificado fue negativo, lo que confirma que el zumo estaba libre de pectina. El valor del pH del zumo fue

10 de 3,3.

Incubaciones de Endo-Pro A / zumo de fresas: Se añadieron diferentes volúmenes (0, 5, 10, 20 l) de Endo-Pro A (5,06 U/ml) a 100 ml del zumo de fresas y se incubó a 50ºC durante 60 min. Se realizaron dos experimentos de control, (i) en el primero se añadieron 20 l de Endo-Pro A desactivada (incubada 30 min a 80ºC), y (ii) un segundo control añadiendo 200 mg de PVPP a 20 ml de zumo de fresas previamente incubado 1 hora a 50ºC. Después de

15 haber sido mezclado durante 15 min a temperatura ambiente, la PVPP se eliminó por centrifugación.

Ensayo de calentamiento del zumo: se midió la turbidez del zumo antes y después de calentar las muestras de zumo de frutas a 80ºC durante 30 min. Antes de medir la turbidez, los zumos calientes se enfriaron en agua fría.

Las mediciones de turbidez se realizaron en un turbidímetro previamente calibrado con patrones de turbidez NTU de Reagecon (Irlanda).

20 Tabla 9: Efecto de la adición de endoproteasa específica de prolilo sobre el enturbiamiento en zumo de fresas

Ensayo

Endo-ProA añadida (l/100ml) Turbidez antes del calentamiento (NTU) Turbidez después del calentamiento (NTU) Δ NTU Efecto de reducción (%)

1

0 10,1 17,5 7,4 0

2

5 9,5 15,0 5,5 25,7

3

10 9,4 15,4 6,0 18,9

5

10 (desactivado) 10,2 16,9 6,7 9,4

6

PVPP 1,4 2,3 0,9

Los resultados en la Tabla 9 muestran que la adición de 5 l de Endo-Pro A en 100 ml de zumo de fresas disminuyó el enturbiamiento formado después del ensayo de calentamiento del zumo en 25,7%. La adición de 10 l de Endo-Pro A a 100 ml de zumo de fresas no mejoró el efecto de reducción del enturbiamiento en comparación con el

25 ensayo de 5 l. Posiblemente, la acción de la enzima es máxima con 5 l y con una mayor cantidad de enzima se obtiene una mayor precipitación de proteínas.

La enzima desactivada todavía redujo la cantidad de enturbiamiento formado; sin embargo, el efecto es mucho menos pronunciado. Después de añadir PVPP, apenas se observó enturbiamiento, pero el color de la muestra también desapareció. El hecho de que añadir PVPP disminuya la formación de enturbiamiento indica que también el

30 enturbiamiento del zumo de fresas es resultado, probablemente, de interacciones polifenol-proteína.

Ejemplo 9

Aislamiento de una carboxipeptidasa específica de prolina procedente de la especie Xanthomonas

Aunque muchos informes científicos describen exopeptidasas que son capaces de actuar sobre restos de prolina en los extremos carboxiterminales de las cadenas peptídicas, la velocidad de hidrólisis de estas carboxipeptidasas con 35 respecto a restos de prolina es muy baja. Además, la mayoría de estas carboxipeptidasas no son capaces de liberar los restos de prolina carboxiterminales de las secuencias de poliprolina. El documento US 5.693.503 describe la purificación de carboxipeptidasas de especie de Xanthomonas que muestran una actividad sorprendentemente elevada frente a la liberación de restos de prolina carboxiterminales, incluso de secuencias de poliprolina. Se ha aislado tal carboxipeptidasa de varias especies de Xanthomonas para ensayar su actividad a la hora de prevenir la

40 formación de enturbiamiento.

El aislamiento de la carboxipeptidasa deseada procedente de Xanthomonas demostró ser una tarea difícil, puesto que el método de purificación como se describe en el documento US 5.693.503 no tuvo éxito en nuestras manos y

se tuvo que desarrollar un protocolo de purificación completamente nuevo. De los muchos procedimientos ensayados, el siguiente protocolo produjo enzima sustancialmente purificada.

Partiendo de un litro de caldo, se cosecharon células mediante centrifugación, se lavaron una vez con agua y después se destruyeron mediante un tratamiento ultrasónico a 0 grados C. El desecho celular se eliminó mediante 5 una centrifugación a 20000 rpm durante 20 minutos, y el sobrenadante resultante se volvió a centrifugar en las mismas condiciones. Después, se añadió sulfato de amonio al sobrenadante, hasta alcanzar una saturación del 40%. Después de la centrifugación a baja velocidad, el sobrenadante se recogió y se añadió sulfato de amonio adicional hasta alcanzar una saturación del 80%. El precipitado recientemente formado se recogió mediante centrifugación a baja velocidad, se dializó a conciencia a pH 7,0, 4 grados C, y se aplicó a una columna de 10 bacitracina-Sefarosa equilibrada en 0,05 moles/litro de tris-HCl pH 8,0 (J. Appl. Biochem., 1983 p. 420-428). El material unido a la columna se eluyó usando el tampón de equilibrado suplementado con 1 mol/litro de NaCl y 10% (v/v) de isopropanol. Las fracciones que contienen la actividad enzimática buscada se identificaron mediante incubación con el sustrato sintético Z-Pro-Pro como se describe en la sección Materiales y Métodos. Las fracciones que contienen actividad se aplicaron entonces a una columna MonoQ equilibrada en 0,025 moles/litro de Tris-HCl pH

15 8,5. En estas condiciones, la enzima se unió a la columna y se eluyó usando un gradiente de concentración de NaCl. Las fracciones activas se reunieron, se dializaron y se volvieron a cromatografiar en una columna Mono Q como se describió. La actividad del concentrado final medida en Z-Pro-Pro a 37 grados C y pH 7,0 fue 0,5 unidades/ml y 0,09 unidades/ml a pH 5,5. La enzima conservó aprox. 50% de su actividad después de una incubación de 2-3 horas a 50 grados a pH 5,5. Esta preparación se ha usado en los ensayos descritos en el Ejemplo 11.

20 Sólo la enzima aislada de Xanthomonas campestris pv campestris mostró actividad en condiciones ácidas. Una carboxipeptidasa similar aislada de X. rubrilineans no mostró actividad a pH 5,5 y, por lo tanto, es menos adecuada para las aplicaciones anticipadas.

Ejemplo 10

Aislamiento de una endoproteasa que escinde glicina a partir de Aspergillus oryzae

25 Se ha identificado en extractos de papaya (endopeptidasa de glicilo, EC 3.4.22.25) una endoproteasa que puede escindir proteínas ricas en restos de glicina. Sin embargo, esta enzima tiene varias desventajas para la aplicación como se prevé, debido a su óptimo de pH relativamente elevado (casi neutro) y a los costes elevados si se produce en forma pura. Por lo tanto, la identificación de una enzima endoproteasa específica de glicina, estable a ácidos, en un microorganismo de grado potencialmente alimentario podría ofrecer muchas ventajas. Para este fin, se ha

30 identificado un número de preparaciones enzimáticas de grado alimentario comercialmente disponibles.

La identificación se llevó a cabo usando el péptido cromógeno sintético Z-Gly-Gly-pNA a pH 4,0 como sustrato. Se ensayaron seis diferentes preparaciones enzimáticas, y sólo Flavourzyme 1000 L (HPN 00011 de Aspergillus oryzae; NOVO, Dinamarca) mostró cierta actividad frente al sustrato sintético usado. Para aislar la enzima responsable de esta actividad, se hubo de ensayar un gran número de diferentes protocolos de purificación. El siguiente protocolo

35 demostró ser exitoso.

En primer lugar, el exceso de componentes de peso molecular pequeño presentes en el material de Flavourzyme se eliminó mediante una diálisis exhaustiva. Durante esta etapa de diálisis, la actividad específica de Gly cayó hasta aprox. 50% de su valor inicial. El líquido dializado resultante se lavó entonces adicionalmente y se concentró usando equipo de ultrafiltración Amicon PM-10. Al concentrado líquido resultante se añadió sulfato de amonio hasta 50% y, 40 tras la centrifugación, se añadió más sulfato de amonio al sobrenadante hasta alcanzar 75% del nivel de saturación. El precipitado obtenido entonces se recogió mediante centrifugación a baja velocidad, se dializó, y el líquido resultante se concentró nuevamente usando el equipo PM-10. El concentrado se aplicó en una columna de filtración en gel Sephadex G-100, y se reunieron las fracciones activas. La actividad en cada fracción se midió usando Z-GlyGly-pNA a pH 4,0 como se describe en la sección Materiales y Métodos. Las fracciones reunidas se sometieron 45 entonces a cromatografía de intercambio iónico en HITrap Q equilibrada en 0,05 moles/litro de acetato de sodio pH 5,0, y se eluyeron con el mismo tampón que contiene NaCl 1 M. Como antes, las fracciones activas se identificaron mediante incubación con Z-Gly-Gly-pNA, pero ahora a pH 5,0, se reunieron y se concentraron usando el equipo PM

10. El concentrado final, si se mide a pH 5,0, contenía 0,008 unidades/ml. Esta disolución se usó para llevar a cabo los experimentos como se describen en el Ejemplo 11.

50 Ejemplo 11

Estabilidad mejorada frente al enturbiamiento de mostos de malta 100% tratados con proteasas auxiliares seleccionadas

El presente Ejemplo demuestra que el efecto anti-enturbiamiento de Endo-ProA se puede mejorar adicionalmente combinando el tratamiento de Endo-ProA con proteasas auxiliares seleccionadas. Se ejemplifica que una

55 carboxipeptidasa específica de prolina procedente de Xanthomonas campestris (“CarboxyPro”) o una endoproteasa que escinde glicina procedente de Aspergillus oryzae (“EndoGly”) reduce significativamente la formación de enturbiamiento adicionalmente cuando se usa en combinación con Endo-ProA. El presente Ejemplo se centra en los efectos reductores del enturbiamiento en mostos de malta del 100%.

Para preparar mosto de malta, se mezclaron 50 g de malta molida con 200 ml de agua y se calentaron hasta 50ºC. Se añadió 0 ó 150 l del concentrado enzimático de Endo-Pro, y la pasta de malta se sometió a un protocolo de calentamiento por etapas como se especifica en la Tabla 10. Durante este procedimiento, la pasta de malta se agitó a 200 rpm. Al final, la pasta de malta se enfrió hasta la temperatura ambiente, y se añadió agua para compensar cualquier agua evaporada. Finalmente, la pasta de malta se filtró en papel para separar el mosto (líquido) de los sólidos. Los mostos así obtenidos se usaron para evaluar los efectos de las enzimas auxiliares usando el efecto de PVPP como referencia.

Tabla 10. Protocolo de temperatura de maceración

Etapa

Temperatura tiempo

1

50ºC 30 min

incremento de temperatura

1ºC/min 13 min

2

63ºC 30 min

incremento de temperatura

1ºC/min 10 min

3

72ºC 30 min

incremento de temperatura

1ºC/min 4 min

4

77ºC 10 min

10 Debido a su afinidad elevada por polifenol, PVPP se usa ampliamente en la industria para eliminar enturbiamientos de la cerveza provocados por agregados de polifenol-proteína. A fin de determinar si CarboxyPro o EndoGly pueden tener un efecto reductor del enturbiamiento como PVPP, se incubaron mostos no tratados con Endo-Pro con 100 l de CarboxyPro o 20 l de EndoGly durante 120 minutos a 50 grados C, después de lo cual se midieron las estabilidades resultantes frente al enturbiamiento según el procedimiento descrito en la sección Materiales y

15 Métodos. Como referencia, se incubó una pasta de malta no tratada con Endo-Pro con PVPP durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de la filtración, y después se midió. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla

11.

Tabla 11: Los efectos del enturbiamiento en frío de PVPP, CarboxyPro y EndoGly en un mosto de malta del 100% no tratado con Endo-Pro

Condiciones activas de enzima

Controles

ENSAYOS nº

1 2 3 4 5

Enzima añadida en la pasta

Endo-Pro (l)

0 0 0 0 0

Enzimas añadidas en el mosto

120 min a 50ºC

Carboxipeptidasa de prolina (l)

0 100 0 0 0

EndoGly (l)

0 0 20 0 0

Control de enturbiamiento del mosto

PVPP se mezcla 15 minutos antes de la filtración en papel

PVPP (Control -g/hl)

30 100

Medida del enturbiamiento

Ensayo de enturbiamiento por enfriamiento del mosto (EBC) Enturbiamiento inducido por el ensayo de enturbiamiento por

146 144 145 131 134 132,5 91,7 92,7 92,2 75,3 69,8 79,0 68,1 77,2 69,0

Condiciones activas de enzima

Controles

ENSAYOS nº

1 2 3 4 5

enfriamiento (promedio -EBC)

Reducción del enturbiamiento (%)

0,0 8,6 36,4 46,8 52,4

EBC: unidades nefelométricas de turbidez recomendadas por la European Brewery Convention

Según los resultados mostrados en la Tabla 11, las incubaciones con tanto CarboxyPro como EndoGly dan como resultado mostos que son menos turbios al enfriarlos. Sin embargo, los resultados también indican que la adición de PVPP tiene un efecto claramente superior.

5 Se llevó a cabo un experimento subsiguiente en el que se usó un mosto que se había tratado previamente con Endo-Pro en la etapa de formación de la pasta de malta. En este experimento, se añadieron proteasas auxiliares al mosto en cantidades de 0, 100 ó 500 microlitros de EndoGly o 0, 20 ó 100 microlitros de CarboxyPro por 10 mililitros de mosto. Todas las muestras se incubaron entonces durante 120 min. a 50ºC, después de lo cual se llevó a cabo el ensayo de enturbiamiento por enfriamiento. Los resultados obtenidos se proporcionan en la Tabla 12.

10 Tabla 12: Resultados del enturbiamiento en frío del mosto obtenidos tras la incubación de un mosto de malta del 100% tratado con Endo-Pro A seguido de la incubación con diversas cantidades de CarboxyPro o EndoGly.

Condiciones activas de enzima

ENSAYOS nº

1 2 3 4 5 6

Enzima añadida en la pasta

Endo-Pro (l)

0 150 150 150 150 150

Enzimas añadidas en el mosto

120 min a 50ºC

Carboxipeptidasa de prolina (l)

0 0 100 500 0 0

EndoGly (l)

0 0 0 0 20 100

Medida del enturbiamiento

Ensayo de enturbiamiento por enfriamiento del mosto (EBC)

168 79,2 68,8 58,8 63,0 40,1

168

80,6 70,0 57,7 64,8 36,0

Enturbiamiento inducido por el ensayo de enturbiamiento por enfriamiento (promedio -EBC)

168 79,9 69,4 58,3 63,9 38,1

Efecto de las enzimas sobre la reducción del enturbiamiento por enfriamiento (%)

0,0 52,4 58,7 65,3 62,0 77,4

Efecto de CarboxyPro o EndoGly sobre la reducción del enturbiamiento del mosto tratado con Endo-Pro (%)

0,0 13,1 27,1 20,0 52,4

EBC: unidades nefelométricas de turbidez recomendadas por la European Brewery Convention

Según los resultados mostrados en la Tabla 12, la combinación de un pretratamiento de Endo-Pro con CarboxyPro o EndoGly tiene efectos significativos sobre la estabilidad de un mosto frente al enturbiamiento. Dependiendo de la 15 concentración de las proteasas auxiliares, se pueden obtener efectos añadidos que son superiores a los obtenidos con PVPP en mosto no tratado con Endo-Pro (véase la Tabla 11).

Finalmente, se llevó a cabo un experimento para evaluar si los efectos enzimáticos observados son el resultado de

artefactos no enzimáticos o de la acción proteolítica específica. Para ese fin, se añadieron 100 l de CarboxyPro o 20 l de EndoGly a un mosto tratado con Endo-Pro. Para evitar todas las actividades enzimáticas de las enzimas auxiliares, el mosto que contiene estas enzimas se mantuvo a 0 grados C durante 15 minutos (es decir, comparable con el período de incubación usado para PVPP) antes de medir el enturbiamiento en frío del mosto formado. Como referencia, se usó mosto tratado con diversas cantidades de PVPP y después filtrado.

Tabla 13: Efectos de la incubación de mosto de malta del 100% tratado con Endo-Pro con CarboxyPro o EndoGly a 0 grados C, o PVPP a temperatura ambiente

Controles

ENSAYOS nº

1 2 3 4 5

Enzima añadida en la pasta

Endo-Pro (l)

150 150 150 150 150

Enzimas añadidas en el mosto

enzimas añadidas en una condición no activa (a 0ºC después de que el mosto tratado con Endo-Pro se incubó 120 min a 50ºC)

Carboxipeptidasa de prolina (l)

100 0 0 0 0

EndoGly (l)

0 20 0 0 0

Control de enturbiamiento del mosto

PVPP se mezcló 15 min con mosto tratado con Endo-Pro incubado previamente 120 min a 50ºC. La eliminación de la PVPP se lleva a cabo mediante filtración con papel

PVPP (Control -g/hl)

30 100 500

Medida del enturbiamiento

Ensayo de enturbiamiento por enfriamiento del mosto (EBC)

77,5 82,2 66,3 59,3 52,3

65,9

60,6 53,5

Enturbiamiento inducido por el ensayo de enturbiamiento por enfriamiento (promedio -EBC)

77,5 82,2 66,1 60,0 52,9

Efecto de las enzimas sobre la reducción del enturbiamiento por enfriamiento (%)

53,9 51,1 60,7 64,3 68,5

Reducción del enturbiamiento (%)

3,0 -2,9 17,3 25,0 33,8

EBC: unidades nefelométricas de turbidez recomendadas por la European Brewery Convention

Los datos presentados en la Tabla 13 muestran que tanto CarboxyPro como EndoGly, si se incuban a 0 grados, no

10 tienen ningún efecto, lo que implica que sus actividades son la causa directa para la estabilización frente al enturbiamiento observada en las Tablas 11 y 12. PVPP tiene solamente un efecto limitado (una reducción de enturbiamiento de apenas 17,3% frente a una reducción del enturbiamiento de 46,8% en las condiciones descritas en la Tabla 11). Esta observación vuelve a confirmar el impacto que una incubación con Endo-Pro tiene sobre la cantidad total de polifenol-proteína precipitable presente: al prevenir la formación de agregados de polifenol-proteína,

15 el uso de PVPP se ha convertido casi en superfluo.

Ejemplo 12

Endo-Pro A tiene también actividad de Endo-Hidroxi-Pro y Endo-Ala

Se investigó si Endo-Pro A tiene también especificidad de endoproteasa por hidroxiprolina y alanina. Por lo tanto, se sintetizaron tres péptidos sintéticos que cubren el término C de s1-caseína B, con algunas modificaciones. Los

péptidos fueron:  0139-59, SEKTTMPLW, el término C original de s1-caseína M = 1091,5  0139-60, SEKTTMJLW, siendo J hidroxiprolina M = 1107,5  0139-61, SEKTTMALW, sustituyendo prolina por alanina M = 1065,5

5 Para analizar tales mezclas peptídicas complejas, se usó el denominado MS/MS dependiente del barrido. Este método, en el que cada barrido consiste en tres segmentos, se define según lo siguiente:

1: análisis de barrido completo,

2: análisis de barrido de aumentos para la determinación del estado de la carga del ion más intenso en el intervalo de masas del barrido completo,

10 3: MS/MS del ion más intenso en el intervalo de masas del barrido completo, para obtener la información de secuencia de aminoácidos.

Los tres péptidos se disolvieron en ácido fórmico al 0,1% a una concentración de 75-100 g/l, y se comprobaron para determinar su pureza en el modo LC/MS y en el modo LC/MS/MS usando elución por gradientes. Los tres péptidos se pudieron identificar por sus moléculas protonadas y doblemente protonadas en el modo LC/MS y en el

15 modo LC/MS/MS mediante la cobertura total de la secuencia de aminoácidos.

Los péptidos sintéticos tratados con Endo-ProA se diluyeron 50 veces antes del análisis. Para el análisis mediante LC/MS de los péptidos formados después del tratamiento, el gradiente se ha de adaptar ligeramente. Si de hecho Endo-ProA tiene especificidad específica de prolina e hidroxiprolina, los péptidos se deberían de escindir en las siguientes partes:

20 SEKTTMP y LW, con molécula protonada a m/z 793,4 y 318,1, respectivamente.

SEKTTMJ y LW, con moléculas protonadas a m/z 809,4, y 318,1, respectivamente.

Ambas masas peptídicas predichas se pudieron observar de hecho en los cromatogramas de iones de los péptidos tratados con Endo-Pro, y se comprobó en el modo LC/MS/MS que tienen la secuencia de aminoácidos correcta.

El tercer péptido sintético también mostró el mismo patrón observando m/z 767,4 de SEKTTMA y m/z 318,1 de LW

25 en el cromatograma de iones. Endo-Pro escinde preferentemente C-terminal en P, J y A, pero también péptidos que son 1, 2 ó 3 aminoácidos más cortos también se pudieron observar e identificar inequívocamente con LC/MS/MS. Sin embargo, estos porcentajes estuvieron todos por debajo de 6%.

En la tabla 14 se da un resumen de lo anterior.

Tabla 14: Péptido formado para los tres péptidos sintéticos después del tratamiento con Endo-Pro A. Las secuencias 30 de aminoácidos se comprobaron mediante su molécula protonada y la característica de MS/MS.

péptido formado

intensidad normalizada SEKTTMPLW SEKTTMJLW SEKTTMALW

SEKT

0,43 0,33

SEKTT

0,00 0,37 0,33

SEKTTM

3,40 3,11 5,56

SEKTTMP

100,00

SEKTTMJ

100,00

SEKTTMA

100,00

Conclusión Ciertamente, Endo-Pro A puede escindir restos de hidroxiprolina y de alanina en su lado carboxiterminal, además de su preferencia por la escisión de prolina. 35 Ejemplo 13

Óptimo de pH para Endo-Pro

Las secuencias de ADN según SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 3 se expresaron en Aspergillus niger iso 502. Esto dio como resultado polipéptidos según SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 4, respectivamente. Estos polipéptidos se denominarán posteriormente como Endo-Pro RUS y Endo-Pro GAM, respectivamente. Se encontró que ambas

5 enzimas fueron mucho más semejantes, pero también se encontró que difieren en algunos aspectos biológicos. Endo-Pro RUS tuvo una mayor actividad específica, y se encontró que era en cierto modo más activa a la hora de eliminar el enturbiamiento en la cerveza.

1) Óptimo de pH de Endo-Pro

La actividad proteolítica de Endo-Pro’s se midió usando caseína marcada con resorrufina y la prescripción de Roche

10 (“Universal Protease Substrate”; nº de Catálogo 1 080 733). Mediante el tratamiento con proteasas, se liberan péptidos marcados con resorrufina que no se pueden precipitar con ácido tricloroacético. De manera que, cuanto más activa es la enzima Endo-Pro a una temperatura dada o un valor de pH, mayor es la absorción de luz a 574 nm en un intervalo de pH de 4,5 -4,8 -5,0 -5,5 -6,0 -7,0 -8,0. Para pH 7 y 8 se usaron tampones de 0,1 M de Tris/HCl. Para los pH más bajos, se usaron tampones de 0,1 M de Hac. Los tampones contenían CaCl2 0,02 M.

15 Las reacciones se llevaron a cabo durante 30 minutos a 37ºC, y los datos obtenidos se proporcionan en la Tabla 15. Endo-ProRUS (6 U/ml) y Endo-ProGAM (aprox. 4 U/ml) se diluyeron hasta 0,5 U/ml. Se añadió una muestra de 10 l a la mezcla de incubación, y el volumen se compensó con el tampón de incubación.

Según los resultados mostrados en la Tabla 15, el óptimo de pH de las enzimas es alrededor de pH 5,5. Sin embargo, más tarde se hizo evidente que la caseína usada marcada con resorrufina comenzó a precipitar a valores

20 de pH por debajo de 5,5, de manera que, por debajo de este pH, se obtienen resultados no fiables. Para corregir eso, se repitió el experimento en las diversas condiciones de pH mencionadas, pero usando Z-Gly-Pro-pNA en lugar de caseína marcada con resorrufina como sustrato cromógeno. Los datos obtenidos usando Z-Gly-Pro-pNA y una absorción de luz a 410 nm (véase el Ejemplo 2) mostraron un pico de actividad claro a alrededor de pH 4,5 para ambas enzimas Endo-Pro.

25 2) Estabilidad a la temperatura de enzimas Endo-Pro.

La estabilidad frente a la temperatura de ambas enzimas Endo-Pro se midió calentando las dos enzimas hasta temperaturas de 40 -50 -55 y 60ºC y a pH 5,0. Se tomaron muestras después de 0,5 – 1 – 2-5 y 20 horas, y las actividades de Endo-ProRUS y Endo-ProGAM se diluyeron hasta aprox. 0,5 U/ml. Después, se añadió una muestra de 10 l a la mezcla de incubación que contiene Z-Gly-Pro-pNA (véase el Ejemplo 2), y las actividades enzimáticas

30 residuales se midieron como se describe en el Ejemplo 2. En la referencia, el volumen de 10 microlitros se compensó con el tampón de incubación. La actividad que escinde Z-Gly-Pro-pNA de la enzima no calentada se usó como el valor de 100%.

A partir de los resultados mostrados en la Tabla 16, está claro que ambas enzimas Endo-Pro muestran excelentes estabilidades frente a la temperatura.

35 Tabla 15 – Óptimos de pH de enzimas Endo-Pro

pH

RUS GAM

E574

Rel. % E574 Rel. %

4,5

0,227 30,2 0,225 24,0

4,8

0,228 38,3 0,278 29,6

5,0

0,521 69,4 0,554 59,0

5,5

0,751 100,0 0,939 100,0

6,0

0,675 89,9 0,870 92,7

7,0

0,399 53,1 0,627 66,8

8,0

0,011 1,5 0,313 33,3

Tabla 16 – Estabilidades frente a la temperatura de enzimas Endo-Pro

t [horas]

RUS GAM

40ºC

50ºC 55ºC 60ºC 40ºC 50ºC 55ºC 60ºC

0

100 100 100 100 100 100 100 100

0,5

93 102 100 67 98 94 94 84

1

105 98 98 81 102 97 92 83

2

99 102 96 74 103 95 94 79

5

99 99 88 67 95 88 92 80

22

104 90 66 33 105 88 82 64

Ejemplo 14 – comparativo –

Reducción del enturbiamiento en las condiciones de fermentación y fermentación lenta y maduración con 5 refrigeración de la cerveza.

En los Ejemplos previos se demostró la eficacia de la prevención enzimática del enturbiamiento tanto a temperaturas ambiente (véase el Ejemplo 7) como a temperaturas elevadas. En el presente Ejemplo, se ilustra la versatilidad de este enfoque de Endo-Pro enzimático mostrando que las endoproteasas específicas de prolina también pueden prevenir eficazmente la formación de enturbiamiento en condiciones en las que tiene que ser activa en condiciones

10 que están muy lejos de las óptimas para la enzima. Para ese fin, se evaluó si la enzima Endo-Pro puede evitar la formación de enturbiamiento en cerveza si se añade antes de la fermentación de la cerveza (de manera que la enzima puede trabajar durante 10 días a 12 grados C) o si se añade antes de la fermentación lenta y maduración bajo refrigeración de la cerveza (de manera que la enzima puede trabajar durante 10 días a 4 grados C).

Para evaluar el efecto enzimático que previene el enturbiamiento durante la fermentación de la cerveza, se usó una

15 cerveza de malta del 100%, recientemente producida, que contiene aprox. 4% de etanol, que se había filtrado a través de membrana pero que no sufrió ningún tratamiento para eliminar los componentes formadores del enturbiamiento. Esta cerveza “no estabilizada” se descarbonató, después de lo cual se añadieron diversas concentraciones de enzima Endo-Pro (véase la Tabla 17). Esta mezcla se incubó entonces a 12ºC durante 10 días para imitar tan realistamente como sea posible la fermentación industrial de la cerveza.

20 Para evaluar el efecto enzimático que previene el enturbiamiento durante las condiciones de fermentación lenta y maduración bajo refrigeración, se usó exactamente el mismo material de partida en combinación con las mismas concentraciones de la enzima Endo-Pro, pero ahora la mezcla se incubó a 4 grados C durante 10 días.

En ambos experimentos se usó como referencia PVPP ((Polyclar AT/insoluble en agua) dosis de 20, 30 y 50 gramos por hectolitro de cerveza (agitado durante 15 min. a temperatura ambiente antes de una filtración con papel).

25 En ambos experimentos, también se incluyó papaína (Collupulina líquida de DSM; lote nº 010604, actividad final de 5480 NFU/mg), en dosis de 1, 2 y 3 gramos por hectolitro.

En todas las muestras, la formación de enturbiamiento se midió como se especifica en el Ejemplo 2.

Tabla 17: Prevención enzimática del enturbiamiento durante la fermentación

Cerveza de malta 100% descarbonatada, no estabilizada

Ensayo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Incubación

que imita a condiciones de las fermentaciones (12ºC durante 10 días)

Adiciones Endo-Pro (U/I de cerveza) Papaína (g/hl de cerveza) PVPP (g/hl de cerveza)

--- --- 0,5 -- 1 -- 2 -- 4 -- -1 - -2 - -3 - --20 --30 --50

Enturbiamiento

Ensayo de enturbiamiento por

170 173 35 30 24 23 95 102 101 124 120 105

enfriamiento (EBC)

173 173 44 31 22 23 95 102 97 128 121 108

Promedio

172 173 40 31 23 23 95 102 99 126 121 107

Efecto de reducción del

enturbiamiento por

- - 77 82 87 87 45 41 43 27 30 38

enfriamiento (%)

Efecto de enturbiamiento EBC 60º t=0

9 9 5 4 4 4 8 10 11 5 4 4

Efecto de enturbiamiento EBC 60º t=48H

55 56 29 27 27 38 58 63 74 24 19 13

Efecto de reducción del

enturbiamiento por

- - 48 52 52 31 -5 -13 -32 58 66 77

enfriamiento (%)

Tabla 18: Prevención enzimática del enturbiamiento durante la fermentación lenta y maduración bajo refrigeración

Cerveza de malta 100% descarbonatada, no estabilizada

Ensayo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Incubación

que imita a la fermentación lenta y maduración en frío de la cerveza (4ºC durante 10 días)

Adiciones Endo-Pro (U/I de cerveza) Papaína (g/hl de cerveza) PVPP (g/hl de cerveza)

--- --- 0,5 -- 1 -- 2 -- 4 -- -1 - -2 - -3 - --20 --30 --50

Enturbiamiento Ensayo de enturbiamiento por enfriamiento (EBC) Promedio Efecto de reducción del enturbiamiento por enfriamiento (%)

124 122 123 - 120 125 123 - 40 41 41 67 9 10 10 92 9 8 8 93 8 9 8 93 85 82 84 32 72 70 71 42 64 62 63 49 111 111 111 10 115 112 114 8 102 103 103 16

Efecto de enturbiamiento EBC 60º t=0 Efecto de enturbiamiento EBC 60º t=48H Efecto de reducción del enturbiamiento por enfriamiento (%)

6 43 - 6 42 - 3 14 67 3 13 71 4 12 71 3 17 60 6 27 36 6 26 40 6 27 37 3 19 55 3 14 67 3 7 84

A partir de los datos obtenidos, está claro que la eliminación enzimática del enturbiamiento se puede aplicar durante la fermentación así como durante la parte de fermentación lenta y maduración bajo refrigeración del procedimiento. Bastante sorprendentemente, el procedimiento enzimático con Endo-Pro inhibe el enturbiamiento en frío de la cerveza mejor que papaína o PVPP, y es tan bueno como la dosis actualmente usada de 30 gramos por hectolitro de PVPP para combatir la formación de enturbiamiento en caliente.

Ejemplo 15 – comparativo –

Reducción enzimática del enturbiamiento y su efecto sobre la estabilidad de la espuma de cerveza y los niveles de polifenol (antioxidante)

Una desventaja reivindicada de usar enzimas proteolíticas para reducir la formación de enturbiamiento en la cerveza

5 es su efecto negativo sobre la estabilidad de la espuma de la cerveza. Debido a la ruptura proteolítica excesiva, las proteínas del cereal no forman una espuma estable. En este Ejemplo, se demuestra que, probablemente como resultado de su elevada selectividad, la enzima Endo-Pro no tiene efecto adverso sobre la estabilidad de la espuma de la cerveza. Un efecto secundario importante de incubaciones con Endo-Pro es que las cervezas resultantes muestran mayores niveles de polifenol, y de este modo una mayor protección natural frente a la oxidación.

10 En este experimento, la cerveza se produjo en cuatro ensayos piloto diferentes, usando todos ellos malta del 100%. En dos ensayos piloto, la enzima Endo-Pro se añadió en dos concentraciones durante la etapa de formación de la pasta de malta. En los otros dos ensayos piloto, no se añadió enzima, pero estas cervezas se trataron con PVPP para imitar la eliminación convencional de compuestos formadores de enturbiamiento.

La cerveza se produjo usando el siguiente protocolo. Una infusión (6 kg de malta, 18 litros de agua) se obtiene para

15 cada ensayo. La maceración se lleva a cabo durante 20 minutos a 50ºC, 50ºC a 64ºC en 10 minutos, 64ºC durante 20 minutos, 64ºC a 74ºC en 8 minutos, y finalmente 74ºC durante 30 minutos. La filtración se llevó a cabo usando un filtro para la pasta de malta, y el lavado subsiguiente se realizó con agua caliente. La ebullición duró 90 minutos, después de lo cual se añadió lúpulo. Se usó levadura seca de fermentación baja (7,5 106 células/ml de mosto) para la primera fermentación, y la fermentación se llevó a cabo a 12ºC. El tiempo de fermentación depende de la

20 disminución de la densidad, pero tardó aprox. 10 días. La maduración de la cerveza tuvo lugar a 0ºC durante al menos 7 días. Finalmente, la cerveza se filtró a través de membrana y se embotelló.

Tabla 19: Estabilidad de la espuma de la cerveza y niveles de polifenol

Ensayo micropiloto

1 2 3 4

Enzima añadida: Endo-Pro (unidades/kg de malta)

0 0 33 67

Tratamiento con PVPP

no sí no no

Extracto aparente (ºPlato)

2,01 2,16 1,94 2,11

Extracto real (ºPlato)

3,85 4,02 3,87 3,96

Extracto original (ºPlato)

11,83 12,09 12,32 12,03

Alcohol (% v/v)

5,24 5,31 5,56 5,31

Atenuación aparente (%)

83,1 82,2 84,3 82,5

Proteína (g/100ml)

0,42 0,42 0,44 0,53

Polifenoles (mg/l)

192 129 168 184

Valor de retención de cabeza / Espuma

140 136 142 146

Extracto original, real y aparente: método EBC 9-4; Atenuación aparente; Alcohol : método EBC 9-4; Valor de retención de cabeza: método de Ross y Clark; Proteína total: método de Kjeldahl; Polifenol: método EBC 9-11.

Los resultados obtenidos indican claramente que el presente método de reducción enzimática del enturbiamiento no

25 tiene en absoluto efectos negativos sobre la espuma de la cerveza e incrementa el contenido total de polifenoles de la cerveza en comparación con cerveza estabilizada con PVPP. Esta última observación sugiere fuertemente una mayor capacidad antioxidante natural de las cervezas tratadas con la enzima Endo-Pro.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> DSM NV 30 <120> Método mejorado para la prevención o reducción del enturbiamiento en bebidas

<130>

<140>

<141>

<150>

<151>

<150> 5 <151>

<150>

<151>

<160> 7

<170> Patentln Ver. 2.1 10 <210> 1

<211> 1581

<212> ADN

<213> Aspergillus niger

<400> 1

<210> 2

<211> 3290

<212> ADN

<213> Aspergillus niger

<400> 2

<210> 3 <211>1581

<212> ADN

<213> Aspergillus niger

<400> 3

<210> 4

<211> 526

<212> PRT

<213> Aspergillus niger

<400> 4

<210> 5

<211> 526

<212> PRT

<213> Aspergillus niger

<400> 5

<210> 6

<211> 1551

<212> ADN

<213> Aspergillus niger

<400> 6

<210> 7

<211> 516

<212> PRT

<213> Aspergillus niger

<400> 7

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para la prevención o reducción del enturbiamiento en una bebida, en el que se añade a la bebida una endoproteasa específica de prolina y/o específica de hidroxiprolilo y/o específica de alanina, y en el que se añade una enzima auxiliar a la bebida, y en el que dicha enzima auxiliar da como resultado una reducción adicional del

   5 enturbiamiento que el nivel de reducción del enturbiamiento que es lograble con un tratamiento con Endo-Pro, EndoHidroxi-Pro y/o Endo-Ala solo.

2. 2.

   Método según la reivindicación 1, en el que la proteína auxiliar es exoproteasa o endoproteasa purificada.

3. 3.

   Método según la reivindicación 2, en el que la exoproteasa es una tripeptidilpeptidasa y/o carboxipeptidasa y/o peptidil-dipeptidasa.

   10 4. Método según la reivindicación 2, en el que la exoproteasa es una carboxipeptidasa específica de prolina.

4. 5.

   Método según la reivindicación 3, en el que dicha carboxipeptidasa tiene actividad frente a péptidos cromógenos sintéticos FA-Pro o FA-Pro-Pro, en los que FA = furilacriloílo.

5. 6.

   Método según la reivindicación 3, en el que la carboxipeptidasa específica de prolina es obtenible de Xanthomonas.

   15 7. Método según la reivindicación 3, en el que dicha peptidil-dipeptidasa tiene actividad frente a péptidos cromógenos tales como FA-Leu-Pro o FA-Phe-Pro, en el que FA = furilacriloílo.

6. 8.

   Método según la reivindicación 3, en el que dicha peptidil-dipeptidasa es peptidil-dipeptidasa A.

7. 9.

   Método según la reivindicación 2, en el que la endoproteasa es capaz de escindir enlaces peptídicos en la posición N o C terminal de restos de glicina, alanina, serina, asparagina y glutamina.

   20 10. Método según la reivindicación 2, en el que la endoproteasa es una endoproteasa específica de glicina, o una proteasa de ácido aspártico.

8. 11.

   Método según la reivindicación 10, en el que la proteasa aspártica es Fromase®.

9. 12.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dichas enzimas auxiliares tienen un óptimo de

   pH ácido, o son activas en condiciones ácidas, preferiblemente por debajo de, a o a alrededor de pH 6,0, 5,0, 4,5, 25 4,0, o incluso más preferido por debajo de, a o a alrededor de pH 3,0.

10. 13.

    Bebida obtenible mediante un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11.

11. 14.

    Bebida según la reivindicación 12, en el que la bebida es cerveza.

12. 15.

    Bebida según la reivindicación 12, en el que la bebida es vino.

13. 16. Bebida según la reivindicación 12, en el que la bebida es zumo de frutas. 30