JP4713150B2 - 飲料中の濁り防止又は低減の改良方法 - Google Patents
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Description
しかし、パパイン利用の欠点は、パパインは泡に負の効果を及ぼすことである。ビール上に安定な泡を形成するためにはタンパク質が必要である。しかし、そのタンパク質分解活性によって、パパインは先端の泡安定性に逆効果を及ぼす。
本発明の目的は、飲料中の濁りの防止又は低減方法を提供することである。
用語Endo-Pro、プロリル特異的エンドプロテアーゼ、プロリン特異的エンドプロテアーゼ、プロリン特異的エンドペプチダーゼ及びプロリル特異的活性を有するペプチド又は同様の表現は、相互交換可能に用いられる。
用語ペプチド及びタンパク質は、本明細書では相互交換可能に用いられる。
また、用語“濁り(haze)”、“曇り(cloudiness)”及び“混濁(turbidity)”は、相互交換可能に使用される。
飲料中のさらなる濁り低減は、プロリル特異的及び/又はヒドロキシプロリル特異的及び/又はアラニン特異的エンドプロテアーゼを補助的酵素と併用して処理することで達成できる。
この目的は、トリペプチジルペプチダーゼ及び/又はカルボキシペプチダーゼ及び/又はペプチジル-ジペプチダーゼのようなエキソプロテアーゼを飲料に添加することで果たされ、Endo-Pro処理後に残存するペプチドからカルボキシ末端プロリン残基を除去することができる。代わりに、又は該エキソペプチダーゼと併用して、Endo-Pro処理後に残存するペプチドをさらにエンドプロテアーゼによる処理で可溶化することができる。当該目的には、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン及びグルタミン残基のN又C末端位のいすれかでペプチド結合を切断できる酵素が特に好適である。
上述したように特異性のある補助的Endo-タンパク質分解酵素は、商業的に入手可能であり、或いは代わりに技術的に公知の方法、例えば、下記式
Z-A-A-A-pNA
(式中、
pNA=パラニトロアニリン、
Z=ベンジルオキシカルボニル、
A=アミノ酸グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン又はグルタミン)
のような合成色素生産性ペプチドの助けによって選択することができる。
補助的酵素による処理は、好ましくは飲料の味、テクスチャー又は食感に逆効果を及ぼすべきでない。これら補助的酵素は、酸性のpH最適値を有し、或いは酸性、好ましくはpH6.0、5.0、4.5若しくは4.0以下又はほぼその程度、或いはさらに好ましくはpH3.0以下又はほぼその程度の条件下で活性であることが好ましい。
従来のビール醸造プロセスでは、穀物を粉砕かつマッシュにし、その結果のマッシュをろ過してウワートを得る。ウワートを煮沸してすべての残存酵素活性を不活性化し、引き続きそれを用いて酵母成長を維持する。酵母成長及びろ過後、ビールを貯蔵熟成する(lagered)。この貯蔵熟成段階で、濁り形成を防止するため飲料にパパイン(コルプリン(collupuline))を添加しうることが述べられている。しかし、パパインはビールの泡形成能力を殺す。
マッシュ又は貯蔵熟成段階時のどちらかで、酸性エンドプロテアーゼ、特にEndo-Pro、Endo-Hydroxy-Pro及び/又はEndo-Alaを使用すると、濁り形成を低減するが、LTP1を殺さず、或いはLTP1に重大には作用しないので、このような酵素の使用は、泡形成に負の効果を及ぼさない。
Fromase(登録商標)のような凝乳酵素もEndo-Proと併用すると、濁りの低減又は防止における補助的酵素として非常に好適である。Fromase(登録商標)は、LTP1に作用せず、ビールの泡形成能力を保護するので、この目的に好適である。
Fromase(登録商標)は、Rhizomucor mieheiから得られる、チーズ生産で使用される市販製品(DSM Food Specialities)である。Fromaseは、いわゆるアスパラギン酸プロテアーゼ(EC3.4.23)である。これら酵素は、非常に低いpH最適値と、Phe-Phe、Phe-Try及びLeu-Tryのような嵩高い疎水性アミノ酸残基間のペプチド結合の切断に対する率直な優先とを特徴とする。
キチナーゼと呼ばれるタンパク質がワイン中の濁り問題の主要な原因であることが分かっている。このキチナーゼはブドウ由来で、グリシン、アラニン及びセリン残基に富む。ワインは非常に低いpHを有するので、我々はこのキチナーゼを酸性エンドプロテアーゼの複合混合物で加水分解しようと試みた。日本国、Shin NihonのAP 50.000と呼ばれる製品を高濃度で添加しても、ワイン中の濁り形成に何ら効果を及ぼさなかった。この知見は、ワインタンパク質のタンパク質分解に基づくすべての戦略は、実用ではうまくいかないことが判り、おそらく徒労だろうと述べているFerreiraら(Trends in Food Science & Technology 12 (2002) 230-239)の結論と一致する。
ワイン中で(又は非常に低いpHを有する他のいずれの飲料中でも)Endo-Proを使用することのさらなる利点は、実施例7の実験で使用したEndo-Proが、酸性条件下でヒドロキシ-プロリン残基のところのみならず、アラニン残基後のペプチド結合も切断できることである(実施例13)。
ポリフェノールは、少なくとも1個のヒドロキシル基で置換された少なくとも2個の芳香環を含む化学構造を有する化合物、又は少なくとも2個のヒドロキシル基で置換された少なくとも1個の芳香環を含む化学構造を有する化合物として定義される。
ポリフェノールの例は、タンニン及びフラボノイドであり、例えば、カテキン、フラボノール及びアントシアニンが挙げられる。
本出願で使用する場合、用語“ビール”は、麦芽処理穀物から調製されるマッシュ、及び麦芽処理穀物と非麦芽処理穀物の混合物から調製されるすべてのマッシュのみならず、非麦芽処理穀物から調製されるマッシュから調製される少なくともビールを包含することを意図する。用語“ビール”は、添加物と共に調製されるビール、及びすべての可能なアルコール含量を有するビールをも包含する。
果実ジュースは、例えばレッドベリー、イチゴ、リンゴ、西洋ナシ、トマト、柑橘類果実、野菜等から得られるジュースでよい。
さらに好ましくは、少なくとも500ミリ単位のプロリル特異的エンドプロテアーゼを飲料に添加し、さらに好ましくは少なくとも1単位のプロリル特異的エンドプロテアーゼを添加する。
プロリル特異的エンドプロテアーゼ活性の最大量は特定できない。最大量は、例えば、濁り低減又は防止の所望量、飲料の組成、飲料のpH及びエンドプロテアーゼがその最大活性を有するpHによって決まる。
プロリル特異的エンドプロテアーゼは、飲料製造中の様々な段階で添加することができる。
果実ジュースの製造プロセスでは、好ましくは、解離又は脱凝膠の間にプロリル特異的エンドプロテアーゼを添加する。
本発明は、約pH5.0、又は4.0〜5.0のpH最適値を有するプロリン特異的エンドプロテアーゼを有するようなペプチドを提供する。
(a)配列番号:4、配列番号:5、若しくは配列番号:7又はその断片と少なくとも40%の全アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b)(i)60個の、好ましくは100個のヌクレオチドに渡って少なくとも80%又は90%の同一性、さらに好ましくは200個のヌクレオチドに渡って少なくとも90%の同一性である配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3若しくは配列番号:6又はその断片の核酸配列、又は(ii)(i)の核酸配列に相補的な核酸配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;
から成る群から選択されるプロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有する単離したポリペプチドを提供する。
本発明は、プロリル特異的エンドプロテアーゼ活性を有する精製又は単離したポリペプチドにも関する。7未満のpH値で最大活性を有する精製したプロリル特異的エンドプロテアーゼが好ましい。
本発明は、配列番号:4、配列番号:5若しくは配列番号:7のアミノ酸配列、又は適切な宿主内で配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、若しくは配列番号:6のポリヌクレオチド配列を発現させることによって得られるアミノ酸配列を有する単離したポリペプチドを提供する。また、上記ポリペプチドの機能等価物を含むペプチド又はポリペプチドも本発明内に包含される。上記ポリペプチドは、集合的に用語“本発明のポリペプチド”に包含される。
24mlのQ-セファロース(sepharose)FFカラム(床高12cm/直径1.6cm)上Akta Explorerを用いて実験室規模の精製を行った。10mlのUF-濃縮物を緩衝液A中10倍に希釈し、カラムに適用した。勾配:20CV中0〜50%Bでタンパク質を溶出した。緩衝液Aは、20mM NaAc pH5.1だった。緩衝液Bは、20mM NaAc+1M NaCl pH5.1だった。流れは5ml/分だった。
500mlのQ-セファロース(sepharose)FFカラム(床高23.5cm/直径5cm)上で作業指示W-0894に従うAkta精製装置を用いて精製を行った。200mlのUF-濃縮物を緩衝液A中10倍に希釈し、カラムに適用した。勾配:20CV中0〜40%Bでタンパク質を溶出した。緩衝液Aは、20mM NaAc pH5.1だった。緩衝液Bは、20mM NaAc+1M NaCl pH5.1だった。流れは10ml/分だった。フラクションを手動で収集した。
得られた生成物は、HPSEC上で単一のピークを示し、SDS PAGE及びIEF中で単一バンドとして現れた。従って、プロリル特異的エンドプロテアーゼはQ-セファロースFFを用いて均質性に精製しうると結論した。推定純度は90%を超え、Z-gly-Pro-pNAに関する特異的活性は少なくとも0.094U/mgだった。
本発明のポリペプチドは、その天然の細胞環境外であるような形態で提供することができる。従って、それらは、上述したように、実質的に単離又は精製され、或いは天然には存在しない細胞、例えば他の真菌種、動物、植物又は細菌の細胞中でよい。
有利には、本発明の方法では単離又は精製したプロリル特異的エンドプロテアーゼを用いる。
本発明の単離又は精製したプロリル特異的エンドプロテアーゼは、好ましくはタンパク性物質1g当たり少なくとも10単位のプロリル特異的エンドプロテアーゼ活性を有する。これら単位は、方法セクションで述べたように、37℃かつpH5の合成ペプチドZ-Gly-Pro-pNAを用いて測定する。
本発明のポリペプチドは、配列番号:4、配列番号:5、若しくは配列番号:7のポリペプチドの天然に存在する変異体又は種相同体をも含みうる。
変異体は、例えば、真菌、細菌、酵母菌又は植物細胞内で天然に存在するポリペプチドであり、該変異体は、プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性及び配列番号:4、配列番号:5、若しくは配列番号:7のタンパク質と実質的に同様の配列を有する。用語“変異体”は、配列番号:4、配列番号:5、若しくは配列番号:7のプロリン特異的エンドプロテアーゼと同一の本質的特性又は基本的な生物学的機能性を有するポリペプチドを指し、かつ対立形質の変異体を包含する。好ましくは、変異体ポリペプチドは、配列番号:4、配列番号:5、若しくは配列番号:7のポリペプチドと少なくとも同レベルのプロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有する。変異体は、配列番号:4、配列番号:5、若しくは配列番号:7のポリペプチドと同株由来、又は同属若しくは同種の異なる株由来のどちらかの対立形質の変異体を包含する。
変異体及び種相同体は、配列番号:4、配列番号:5、若しくは配列番号:7のポリペプチドを単離するために使用した本明細書で述べる手順で単離することができ、かつ該手順は、適切な細胞源、例えば細菌、酵母菌、真菌又は植物細胞上で行った。本発明のプローブを用いて、酵母菌、細菌、真菌又は植物細胞から作られるライブラリーを探査し、配列番号:4、配列番号:5、若しくは配列番号:7のポリペプチドの変異体又は種相同体を発現するクローンを得ることもできる。これらクローンを従来技術で操作して本発明のポリペプチドを生じさせ、その後それ自体公知の組換え又は合成法で生産することができる。
本発明のポリペプチドは、必要ならば、合成手段によって生産できるが、通常、後述するように組換え的に生じさせる。合成ポリペプチドは、その同定又は精製を補助するめ、例えば、ヒスチジン残基又はTGタグの付加によって、或いは細胞からのその分泌を促すたものシグナル配列の付加によって修飾することができる。
より短いポリペプチド配列も本発明の範囲内である。例えば、長さが少なくとも50個のアミノ酸又は60、70、80、100、150若しくは200個までのアミノ酸のペプチドは、それが配列番号:4、配列番号:5、若しくは配列番号:7のプロリン特異的エンドプロテアーゼの基礎的な生物学的機能性を示す限り、本発明の範囲内に含まれるとみなす。特に、しかし排他的ではないが、本発明のこの局面は、タンパク質がその完全なタンパク質配列の断片である状況を包含する。
本発明のポリヌクレオチドは、DNA又はRNAを含みうる。それらは一本鎖又は二本鎖でよい。それらは、その中に、ペプチド核酸を含む合成又は修飾したヌクレオチドを包含するポリヌクレオチドでもよい。ポリヌクレオチドに対する多数の異なるタイプの修飾が技術的に知られている。これには、メチルホスホネート及びホスホロチオエート骨格、及び該分子の3'及び/又は5'末端におけるアクリジン又はポリリジン鎖の付加が挙げられる。本発明の目的では、本明細書で述べるポリヌクレオチドは、技術的に利用可能ないずれの方法によっても修飾しうることを理解すべきである。
当業者は、日常的な方法を用いて、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響しないヌクレオチド置換を生じさせ、本発明のポリペプチドが発現される予定のいずれの特定宿主生物のコドン使用法をも反映することができる。
配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3若しくは配列番号:6のDNAコーディング配列の補体に選択的にハイブリダイズできるヌクレオチド配列は本発明に包含され、かつ通常、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3若しくは配列番号:6の少なくとも60、好ましくは少なくとも100、さらに好ましくは200個の相接ヌクレオチドの領域にわたって、最も好ましくは全長にわたって、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3若しくは配列番号:6のコーディング配列に対して少なくとも50%若しくは60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。同様に、活性なプロリン特異的エンドプロテアーゼをコードし、かつ配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3若しくは配列番号:6のDNAコーディング配列の補体の断片に選択的にハイブリダイズできるヌクレオチドも本発明に包含される。好ましくは100ヌクレオチドにわたって少なくとも80%若しくは90%同一性である、さらに好ましくは200ヌクレオチドにわたって少なくとも90%同一性である、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3若しくは配列番号:6の核酸配列のC末端断片も本発明に包含される。
PILEUP及びBLAST Nアルゴリズムを用いても配列同一性を計算し、或いは配列を一列に並べることができる(例えば、そのデフォルトセッティングについて等価な配列又は対応する配列を同定するように)。
本発明のポリヌクレオチドはプライマーを包含し、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマーとして、二者択一的増幅反応用プライマーとして、又はプローブ、例えば放射性若しくは非放射性標識を用いる従来手段による暴露的標識で標識化したプローブとして使用でき、或いは該ポリヌクレオチドをベクター中にクローン化することができる。このようなプライマー、プローブ及び他の断片は、少なくとも15、例えば少なくとも20、25、30又は40ヌクレオチド長だろう。これらは、典型的に長さ40、50、60、70、100、150、200又は300個までのヌクレオチド長であり、或いは配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3若しくは配列番号:6のコーディング配列の数ヌクレオチド(5又は10ヌクレオチドのような)までの短さでさえある。
標識化又は非標識化ポリヌクレオチド又はプライマー(又はその断片)は、真菌試料中のプロリン特異的エンドプロテアーゼ若しくはその変異体を検出又は配列決定するための核酸ベース試験で使用できる。このような検出試験は、通常、ハイブリダイズ条件下で、問題のDNAを含有すると疑われる真菌試料を、本発明のポリヌクレオチド又はプライマーを含むプローブと接触させる工程、及び該プローブと試料中の核酸との間で形成されるいずれかの二重鎖を検出する工程を含む。検出は、PCRのような技法を用い、又は該プローブを固体支持体上に固定し、該プローブにハイブリダイズしない、試料中のいかなる核酸をも除去してから該プローブにハイブリダイズするいずれの核酸をも検出することによって達成できる。代わりに、試料核酸を固体支持体上に固定し、いかなる非結合プローブをも除去後、ハイブリダイズしたプローブと、該支持体に結合したプローブの量を検出してもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3若しくは配列番号:6の配列の変異体をも包含する。変異体は、付加、置換及び/又は欠失によって形成することができる。従って、このような配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3若しくは配列番号:6のコーディング配列の変異体は、プロリンのカルボキシ末端側でポリヌクレオチド鎖を消化する能力を有するポリヌクレオチドをコードしうる。
配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3若しくは配列番号:6と100%の同一性を持たないが、本発明の範囲内であるポリヌクレオチドは、多くの手段で得ることができる。従って、本明細書で述べるプロリン特異的エンドプロテアーゼ配列の変異体は、例えば、本発明のポリヌクレオチドの起源として述べた生物のような一連の生物から作製されるゲノムDNAライブラリーを探査することで得られる。さらに、プロリン特異的エンドプロテアーゼの他の真菌、植物又は原核生物相同体が得られ、かつこのような相同体及びその断片は、一般に配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3若しくは配列番号:6にハイブリダイズできるだろう。このような配列は、他の種由来のcDNAライブラリー又はゲノムDNAライブラリーを探査し、また低、中〜高厳密性(上述したような)条件下で配列番号:1の全部又は一部を含むプローブを有する該ライブラリーを探査することで得られる。配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3若しくは配列番号:6の全部又は一部を含む核酸プローブを用いて、本発明のポリペプチドの起源として述べた種のような他の種由来のcDNA又はゲノムライブラリーを探査することができる。
本発明は、上述した本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。このようなポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの組換え生産用配列として有用なので、それらは配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3若しくは配列番号:6の配列にハイブリダイズできる必要がないが、ハイブリダイズできることが一般的に望ましい。そうでなくても所望により上述したようにこのようなポリヌクレオチドを標識し、使用し、かつ製造することができる。
本発明は、クローニング及び発現ベクターを含め、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターをも提供し、別の局面では、例えば、本発明のポリヌクレオチドの発現が起こり、又は本発明の配列によってコードされる条件下で該ベクターを成長させ、形質転換し、又は適切な宿主細胞中に形質移入する方法が存在する。本発明のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞も提供され、該ポリヌクレオチドは宿主細胞のゲノムに非相同的である。通常宿主細胞について使用される用語“非相同的”は、該ポリヌクレオチドが該宿主細胞のゲノム中に天然には存在しないか、又は該ポリヌクレオチドは当該細胞によって天然には産生されないことを意味する。好ましくは、宿主細胞は酵母菌細胞、例えばクライベロミセス(Kluyveromyces)若しくはサッカロミセス(Saccharomyces)属の酵母菌細胞又は例えばアスペルギルス属の糸状真菌細胞である。
本発明の発現カセットを挿入するベクターは、組換えDNA手順に都合よく供給できるいずれのベクターでもよく、ベクターの選択は、それを導入する予定の宿主細胞によって決まる。従って、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち染色体外エンティティーとして存在し、プラスミドのようなその複製が染色体の複製と独立しているベクターでよい。代わりに、ベクターは、宿主細胞中に導入すると、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製するベクターでよい。
β-アクチンプロモーターのような哺乳類プロモーターが使用できる。組織特異的プロモーター、特に内皮又は神経細胞特異的プロモーター(例えば、DDAHI及びDDAHIIプロモーター)が特に好ましい。ウイルスプロモーター、例えばモロニーマウス白血病ウイルスロングターミナルリピート(MMLV LTR)、ラウス腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター、SV40プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)IEプロモーター、アデノウイルス、HSVプロモーター(HSV IEプロモーターのような)、又はHPVプロモーター、特にHPV上流調節領域(URR)も使用できる。ウイルスプロモーターは、技術的に容易に利用できる。
使用可能な強い酵母菌プロモーターの例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、3-ホスホグリセレートキナーゼ及びトリオースリン酸イソメラーゼ用の遺伝子から得られるプロモーターが挙げられる。
使用可能な強い細菌プロモーターの例としては、アミラーゼ及びSPo2プロモーター及び細胞外プロテアーゼ遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。
ベクターがアンチセンス方向に配向された本発明のポリヌクレオチドを含み、アンチセンスRNAの生産を準備することができる。所望により、これを用いてポリペプチドの発現レベルを減らすことができる。
さらなる局面では、本発明は、本発明のポリペプチドの製造方法であって、該ポリペプチドをコードするコーディング配列のベクターによる発現に好適な条件下で、上述したように発現ベクターで形質転換又は形質移入した宿主細胞を培養する工程と、発現したポリペプチドを回収する工程を含む方法を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、発現ベクターのような組換え複製可能ベクター中に組み込むことができる。ベクターを用いて、適合性宿主細胞中の核酸を複製することができる。従って、さらなる実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクター中に導入し、該ベクターを適合性宿主細胞中に導入し、かつ該ベクターの複製をもたらす条件下で該宿主細胞を成長させることによって、本発明のポリヌクレオチドを製造する方法を提供する。ベクターは宿主細胞から回収できる。好適な宿主細胞としては、大腸菌のような細菌、酵母菌、哺乳類細胞系及び他の真核生物細胞系、例えばSf9細胞ような昆虫細胞及び(例えば、糸状)真菌細胞が挙げられる。
従って、本発明のさらなる局面は、本発明のポリヌクレオチド若しくはベクターで形質転換又は形質移入した、或いはそれらを含む宿主細胞を提供する。好ましくは、該ポリヌクレオチドの複製と発現を可能にするベクターで該ポリヌクレオチドを運ぶ。前記ベクターと適合性の細胞を選択し、例えば、原核生物(例えば、細菌)、又は真核生物真菌、酵母菌又は植物細胞でよい。
代わりに、葉、根又は幹のような植物の一部の直接感染を果たすことができる。この技法では、例えばレーザーで植物を切断し、針で植物に穴を開け、又は研磨剤で植物をこすることによって、感染させる植物を傷つけることができる。その傷をアグロバクテリウムで接種する。植物又は植物の一部を適切な培地上で成長させて、成熟植物に発育させることができる。形質転換した細胞の遺伝的に変化した植物への再生は、公知の方法、例えば、形質転換した新芽を抗体で選択し、該新芽を適切な栄養物、植物ホルモン等を含有する培地上でサブ培養することによって達成することができる。
本発明は、プロリン特異的エンドプロテアーゼ又はその変異体を発現するように変化した細胞を包含する。このような細胞は、一時的、又は好ましくは安定的に変化した、哺乳類又は昆虫細胞のような高等真核生物細胞系、酵母菌及び糸状真菌細胞のような下等真核生物細胞、又は細菌細胞のような原核生物細胞を包含する。
本発明のポリペプチドでは、例えば、バキュロウィルス発現系内のように、細胞系内又は膜上で一時的に発現することもありうる。本発明のタンパク質を発現するように適合させたこのような系も本発明の範囲に包含される。
本発明の組換え宿主細胞は、技術的に公知の手順で培養しうる。プロモーターと宿主細胞の各組合せで、該ポリペプチドをコードするDNA配列の発現のためになる培養条件を利用できる。ポリペプチドの所望の細胞密度又は力価に到達後、培養をやめ、既知の手順でポリペプチドを回収する。
適切な培地は、発現宿主の選択に基づき、及び/又は発現構成物の調節要求に基づいて選択することができる。好適な培地は当業者に周知である。所望により、培地は混入の可能性がある他の微生物に加えて、形質転換した発現宿主に有利な添加成分を含有しうる。
発酵後、必要ならば、遠心分離又はろ過によって、細胞を発酵ブロスから除去する。発酵が停止した後、或いは細胞の除去後、本発明のポリペプチドを回収し、所望により、慣習的な手順で精製及び単離する。本発明のプロリン特異的エンドプロテアーゼは、真菌の菌糸体又は培養した真菌細胞によってプロリン特異的エンドプロテアーゼが遊離されている培養ブロスから単離することができる。
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、真菌から、さらに好ましくはアスペルギルスから、最も好ましくはアスペルギルス・ニガーから得られる。
本発明のポリペプチドを化学的に修飾、例えば、翻訳後修飾することができる。例えば、グリコシル化(1回以上)することができ、或いはアミノ酸残基の修飾を含む。ヒスチジン残基の添加によってポリペプチドを修飾し、その精製を助け、或いはシグナル配列の添加によって細胞からの分泌を促すことができる。ポリペプチドは、アミノ-末端メチオニン残基のようなアミノ-又はカルボキシル-末端の伸長、約20〜25個までの残基の小リンカーペプチド、又はポリ-ヒスチジン区域、抗原エピトープ又は結合ドメインのような精製を容易にする小さい伸長を有しうる。
ポリペプチドを修飾して天然には存在しないアミノ酸を含めることができ、或いは該ポリペプチドの安定性を高めることができる。タンパク質又はペプチドを合成手段で生産するとき、生産中にこのようなアミノ酸を導入することができる。タンパク質又はペプチドを修飾後、合成的又は組換え的に生産することもできる。
多数の側鎖修飾が技術的に知られており、本発明のタンパク質又はペプチドの側鎖に行うことができる。このような修飾としては、例えば、アルデヒドとの反応後、NaBH4で還元する還元的アルキル化、メチルアセトイミデートでアミジノ化(amidination)又は無水酢酸でアシル化によるアミノ酸の修飾が挙げられる。
本発明のポリペプチドは単離した形態でよい。ポリペプチドの意図した目的を妨げない担体又は希釈剤とポリペプチドを混合してよく、それでもまだ“単離した”とみなされることを理解すべきである。本発明のポリペプチドは、実質的に精製した形態でもよく、この場合、通常、製剤中に本ポリペプチドを含み、該製剤中の70%を超える、例えば、80%、90%、95%、98%又は99%を超えるタンパク質が本発明のポリペプチドである。
(材料)
プロリン特異的エンドプロテアーゼ(Endo-Pro)
2001年9月10日にアスペルギルス・ニガーG306をCBS(CBS109712)で寄託した。ニガーG306は、本発明のプロリル特異的エンドプロテアーゼをコードする遺伝子を含む。この生物から得られる遺伝子又はcDNAは、いずれのアスペルギルス・ニガー宿主内でも公知の方法を用いてクローン化かつ発現させることができる。
1)“Endo-Pro A”、プロリン特異的エンドプロテアーゼをビールとの実験で用いた。試料は、プロリン特異的エンドプロテアーゼの遺伝子コーディングを含むアスペルギルス・ニガー株の発酵後に得た発酵ブロスの限外ろ過後に得た限外ろ過濃縮物だった。方法セクションで述べたように決定したEndo-Pro A試料のプロリル特異的活性は5.06U/mlだった。タンパク質濃度は、90%より高純度のプロリル特異的エンドプロテアーゼの試料の特異的活性に基づいて50g/lと推定した。
2)“Endo-Pro B”、プロリン特異的エンドプロテアーゼをワインとの実験で用いた。試料は、カラム上で精製後に得、6.0U/mlの活性だった。
コルプリン(Collupulin)、DSMから商業的に入手可能な液体パパイン製剤をパパインとの実験で使用した。活性は5280 NF/mgである。1単位のNFは、カゼインの加水分解を触媒して、pH6.0で1時間当たり1μg当量の可溶性チロシンを生成するパパイン活性の量である。パパイン試料中のタンパク質濃度を測定すると119g/l(Lowry)だった。
ポリビニルポリピロリドン(PVPP)
PVPPは、名称“Polyclar AT”で商業的に入手可能な非水溶性PVPPを使用した。
ビールで行うすべての実験では、仏国、Lilleの“Les Trois Brasseurs”の麦芽ビール(ピルスナータイプ)を使用した。このビールのアルコール率は5.2%(v/v)で、pHは4.4だった。他の市販ビールに比べ、冷却時にこのビールで測定される混濁量が相対的に高いので、この特定ビールを選んだ。このビールはLowry法で測定した場合、0.9g/lのタンパク質濃度を有していた。
ソービニョン(Sauvignon)白ブドウから調製した白ワインをいかなるタンパク質除去処理もせずに使用した。ワイン調製時のアルコール発酵は、選択した酵母菌VL3(Lallemandから)で行った。このワインのぶどう酒醸造学的分析により以下の結果を得た:
糖(g/l) 1.1
エタノール vol% 12.97
全酸性度(g H2SO4/l) 4.14
揮発分酸性度(g H2SO4/l) 0.22
PH 3.46
遊離SO2(mg/l) 18
全SO2(mg/l) 96
グリセロール(g/l) 3
酒石酸(g/l) 3
リンゴ酸(g/l) 2.8
乳酸(g/l) 0.1
フォリン(Folin)のレベル 7
方法
酵素活性を決定するための分光光度法
プロリン特異的エンドプロテアーゼの活性を測定するため、40%ジオキサンを含有するpH5.0の0.1Mクエン酸/0.2Mリン酸2ナトリウム緩衝液中で調製したN-カルボベンゾキシ-グリシン-プロリン-p-ニトロアニリド(Z-Gly-Pro-pNA;分子量426.43;Bachem, Switserland)の2mM溶液の基質溶液を用いる。
1mLのpH5.0緩衝液に、250μlの基質溶液を添加後、100μlの酵素溶液(より大容量又は小容量の酵素溶液が緩衝溶液で補填されるだろう)。反応混合物を37℃でインキュベートし、pNAの遊離後、410nmにおける吸光度の増加を測定する。
1単位は、8,800M-1のモル吸光係数(E)を用い、上記反応条件下で1分に1μmolのpNAをZ-Gly-Pro-pNAから遊離させる酵素活性として定義される。
ザントモナス種由来のプロリン特異的カルボキシペプチダーゼの活性は、アミノ酸アナライザーを用いて合成ペプチドZ-Pro-Pro(Bachem, Switserland)から遊離されるプロリン残基の量を測定することによって測定した。1単位は、pH7.0及び37℃で1時間当たり1μmolのプロリンをZ-Pro-Proから遊離させる酵素の量である。
混濁又は濁りは、濁度計(“Tannometer”, Pfeuffer Gmbh, Kitzingen, Germany)で、操作説明書に即して測定した。冷たいビールでは、沈殿したポリフェノール-タンパク質複合体によって引き起こされる可逆的混濁が生じるうる。余分のアルコールの添加は、これら混濁の形成を加速する。“冷濁り試験”では、この現象を用いて存在するポリフェノール-タンパク質複合体を定量化する。Tannometerを較正するためホルマジン(formazine)標準溶液を記載どおりに調製した(Jean de Clerk,“Cours de Brasseries”第2版, Vol 2, 1963, pp.595-596, Universite de Louvain, Belgium)。ビールの濁り又は混濁単位は、European Brewery Conventionによって推奨されているような比濁分析の濁度単位であるECBを使用する。ビールについて述べられている冷濁り試験は、アルコールのないビール又はウワート(worts)でも実施できる(Tannometerの操作説明ガイドから適合させる)。この場合、試料中のアルコール含量が10%(v/v)に達するのに十分な量のエタノールも試料に加える。すべてのウワート試料にエタノールを加えて10%(v/v)に達したら、各試料を30分間-8℃に冷却する。こうして形成された濁り(濁度, EBC単位で)をその測定チャンバーも-8℃の濁度計で迅速に測定する。
この“熱濁り試験”は、European Brewery Conventionによって番号9.30で推奨されているビールの濁り測定手順である。比較的短期間の高温におけるビールの貯蔵の結果、長期間室温で貯蔵後の同じビールで見られるのと同様の濁りレベルとなる。この“熱濁り”試験は、ビールを一晩中0℃の冷浴で冷やし、その朝の初期濁度を読むことによって実施する。次に、ビールを60℃の浴内に48時間、撹拌せずに置く。最後に、ビールを冷やし、一晩中0℃で保持後、0℃で最終的な濁度を測定する。
K.J. Siebert(K.J. Siebertら, J. Agric. Food Chem. 44 (1996))によって述べられているように、ワイン又は果実ジュースのような飲料中の濁りは、加熱試験で誘導しうる。形成される濁りの量は、主に飲料中の濁り活性タンパク質とポリフェノールのレベルの関数である。加熱試験では、30分間80℃で加熱する前後に試料(例えば、ワイン又は果実ジュース)の濁度を濁度計で測定する。濁度の測定前、加熱した試料を、温度が22〜25℃になるまで冷却水下で冷やす。ワインの試験では(実施例7参照)、NTU-ホルマジン標準溶液で濁度計の較正を行い、果実ジュースの試験では(実施例8参照)、NTU濁度標準溶液は、Reagecon, Irelandから購入した。NTU=比濁分析濁度単位(nephelometric turbidity units)。
1.インキュベーション時に外因性タンパク質を添加しないブランク実験を行った。 2.インキュベーション前に大量のPVPP(1000g/hl)で処理したビールを用いた実験を行った。この実験は、ポリフェノール-タンパク質沈殿に起因する冷濁り試験によって誘導される濁りの平均量の測定を可能にした。PVPPはビールからポリフェノールを除去するので、濁りの形成を妨げるからである。
3.40℃で1時間インキュベーション後に0℃に冷却したビールに外因性タンパク質(それぞれプロリル特異的エンドプロテアーゼ又はパパイン)を添加する実験を行った。濁り測定前に0℃で15分間インキュベーションを行った。酵素及びパパインは、0℃で全く又はほとんど活性でないので、この実験は、酵素活性効果と非酵素的タンパク質効果の区別を可能にした。
3種の合成ペプチドの特徴づけには、LCQイオントラップ質量分析計(ThermoquestTM, Breda, the Netherlands)を備えたP4000ポンプを用いるHPLC(ThermoquesTM, Breda, the Netherlands)を使用し、これらペプチドは、溶出用にMilli Q水中の0.1%ギ酸(Millipore, Bedford, MA, USA;溶液A)とアセトニトリル中の0.1%ギ酸(溶液B)の勾配を組み合わせて150×1mmのPEPMAP C18 300A(LC Packings, Amsterdam, The Netherlands)カラムを用いて分離した。
個々のペプチドに関する詳細な情報は、イオントラップ質量分析計の特徴的なアルゴリズムである“スキャン依存性”MS/MSアルゴリズムを用いて得た。ヒドロキシプロリン及びアラニンのエンドプロテアーゼ特異性は、MS/MSで得た、理論的な配列情報を有する種々のペプチドの実験的ペプチド配列の比較によってチェックした。
プロリル特異的エンドプロテアーゼ添加のビール中の濁り形成に及ぼす効果
脱炭酸した麦芽ビール(Les Trois Brasseurs)、タンパク質含量:0.9g/lに、いろいろな量のプロリル特異的エンドプロテアーゼ酵素(“Endo-Pro A”原料セクション参照)を添加した。2系列の濁り測定を行った。第1系列では、ビール-Endo-Pro A組成物を40℃で1時間インキュベート後、冷濁り試験を行った。40℃でインキュベーション後、かつ冷濁り試験の直前に、アルコール含量を6%(v/v)に高めるのに十分な量のエタノールをビール-Endo-Pro A組成物に添加した。第2系列では、Endo-Pro Aのないビールを40℃で1時間インキュベートしてから0℃に冷却した。0℃で、Endo-Pro Aを添加し、結果の組成物を0℃で15分間インキュベートした。冷濁り試験の直前に、アルコール含量を6%(v/v)に高めるのに十分な量のエタノールをビール-Endo-Pro A組成物に添加した。
添加したEndo-Pro Aの量と、Endo-Pro Aを添加しない場合に測定される濁りに対する濁り低減のパーセンテージを下表1に示す。添加したEndo-Pro Aの量は、ビール中に存在するタンパク質の量に対して、1%未満の外因性添加タンパク質から10%を超える量まで広範にカバーした。
ビール中の濁り形成に及ぼすパパイン添加の効果
脱炭酸した麦芽ビール(Les Trois Brasseur)、タンパク質含量:0.9g/lに、いろいろな量のパパイン(0〜100g/hl)を添加した。2系列の冷濁り測定を行った。第1系列では、冷濁り試験前にビール-パパイン組成物を40℃で1時間インキュベートした。インキュベートした試料にエタノールを加えて6%アルコール(v/v/)にした後、濁り測定を行った。第2系列では、ビール試料を40℃で1時間インキュベートし、引き続き0℃に冷却した。次に、パパインを添加し、試料を0℃で15分間インキュベートした。添加したパパインの量と、パパインを添加しない場合に測定される濁りに対する濁り低減のパーセンテージを下表3に示す。
ビール中の濁り形成に及ぼすPVPP添加の効果
ビール-プロリル特異的エンドプロテアーゼ実験とビール-パパイン実験の両実験において、インキュベーション前に大量のPVPP(1000g/hl)を添加して対照実験を行った。15分のミキシング後、PVPPをろ過で除去した(プロリル特異的エンドプロテアーゼ酵素又はパパインは添加せず)。両対照で、冷濁り試験中にはほとんど濁りが形成されなかった。PVPPはポリフェノールを飲料から除去することが知られているので、これら対照実験はポリフェノールがビール中の濁り形成に関与することを示している。ビール濁り安定性に及ぼすPVPPの効果を測定するため、異なる量のPVPPを脱炭酸したビールに添加し、15分のミキシング後にろ過で除去した。PVPPを添加前にビールを1時間40℃でインキュベートした。
下表5は、いろいろな量のPVPP添加の冷却時にビール中に存在する濁りの量に及ぼす効果を示す。Endo-Pro A又はパパインは添加しなかった。
100%麦芽マッシュ上へのEndo-Pro Aの添加と100%麦芽ウワートの濁り低減
この目的は、Endo-Pro Aを100%麦芽マッシュに添加した場合、最終的な麦芽ウワート中の濁りを低減できるかどうかを決定することだった。
各マッシュ工程試験は、25gの粉砕麦芽と100mlの水とのミキシングで開始する。次に、マッシュを50℃に加熱し、ある量の“Endo-Pro A”の添加後マッシュを4段階の逐次的高温に向けて段階的加熱手順で処理する。表6は、マッシュ工程温度プロフィルを示す。全マッシュ工程中、マッシュは200rpmで撹拌する。マッシュ工程の最後に、マッシュを室温に保ち、水を加えて水の蒸発を補填する。次いで、マッシュをろ紙上でろ過してウワート(液体)を固体から分離する。
Endo-Pro Aの効果を研究するため、冷濁り試験を麦芽ウワートについて行った。プロリル特異的エンドプロテアーゼの添加は麦芽ウワート冷濁りを低減することが観察された。冷濁り試験で形成された濁りの減少は、低量のプロリル特異的エンドプロテアーゼ酵素の添加でさえ観察された。この酵素をマッシュに添加する前に不活性化すると、安定化効果は完全に消失し、すなわち、形成される濁りの量はもはや減少しない。プロリル特異的エンドプロテアーゼ酵素の添加によって引き起こされる濁り低減は非常に重要である。実施例では、82%までの濁り低減が達成された。
ワイン中の濁り低減
異なる用量(0、30、60、150μl)の、6.0U/mlの比活性を有するプロリル特異的エンドプロテアーゼ(Endo-Pro B)を、500mlの白ワイン(“原料”セクションで述べたとおりのワイン)を含有するフラスコに添加し、室温(22〜25℃)で19日間窒素雰囲気下でインキュベートした。ワインの濁り安定性を0、6、8、12及び19日後に、“方法”セクションで述べたような加熱試験によって測定した。
イチゴジュース中の濁り低減
イチゴ果実ジュースは以下のように調製した:イチゴを解凍してつぶし、引き続き90℃でゆがき(加熱し)、ポリフェノールオキシダーゼのようなすべての内因性酵素を殺し、かつタンパク質を変性させた。つぶしたイチゴを50℃に冷まし、30分間50℃で、600g/tのRapidase BEスーパー(super)(DSMの市販酵素産物, France)と共にふやかし、エアプレス内で圧搾した。変性タンパク質を除去するため、結果の混合物を8000rpmの速度で遠心分離機にかけ、ろ過した。イチゴジュースを収集した。酸性アルコール試験は負であり、該ジュースにはペクチンがないことを確認した。該ジュースのpH値は3.3だった。
果実ジュース加熱試験:果実ジュース試料の80℃で30分間の加熱前後に該ジュースの濁度を測定した。濁度測定前、加熱したジュースを冷水で冷却した。
Reagecon(Ireland)のNTU濁度標準で予め較正した濁度計で濁度測定を行った。
不活性化酵素でも、形成される濁りの量を低減したが、効果は顕著に低かった。PVPPの添加後は、ほとんど何も濁りが観察されなかったが、試料の色も除去された。PVPP添加の結果が濁り形成を防止するという事実は、イチゴジュース中でも、濁りがおそらくポリフェノール-タンパク質相互作用の結果であることを示している。
ザントモナス種由来のプロリン特異的カルボキシペプチダーゼの単離
多くの科学の報告は、ペプチド鎖のカルボキシ末端でプロリン残基に作用しうるエキソペプチダーゼについて述べているが、これらカルボキシペプチダーゼのプロリン残基に向かう加水分解速度は非常に遅い。さらに、これらカルボキシペプチダーゼの多くは、ポリプロリン配列からカルボキシ末端プロリン残基を遊離できない。US 5,693,503は、驚くべきことに、ポリプロリン配列からでさえ、カルボキシ末端プロリン残基の遊離に向けて高い活性を示すザントモナス種由来のカルボキシペプチダーゼの精製について述べている。我々は、いくつかのザントモナス種からこのようなカルボキシペプチダーゼを単離してその濁り形成を防止する活性について試験した。
ザントモナス・カンペストリス(campestris) pv カンペストリスから単離した酵素だけが酸性条件下で活性を示した。X.ルブリリネアンス(rubrilineans)から単離した同様のカルボキシペプチダーゼは、pH5.5で活性を示さなかったので、期待した用途にはあまり適さない。
アスペルギルス・オリゼからのグリシン-切断エンドプロテアーゼの単離
グリシン残基中に富むタンパク質を切断できるエンドプロテアーゼは、パパイヤ抽出物中で同定されている(グリシルエンドプロテアーゼ, EC 3.4.22.25)。しかし、この酵素は、そのかなり高い(ほぼ中性)pH最適値と、純粋形態で生産するための高いコストのため、予想しているような用途にはいつかの欠点がある。従って、食品グレードの可能性のある微生物内における酸安定性のグリシン特異的エンドプロテアーゼ酵素の同定が多くの利点を与えるだろう。その目的のため、我々は多数の商業的に入手可能な食品グレードの酵素製剤をスクリーニングした。
選ばれた補助プロテアーゼで処理した100%麦芽ウワートの改良された濁り安定性
本実施例は、Endo-Proの抗-濁り効果が、Endo-ProA処理を選ばれた補助プロテアーゼと併用することでさらに改良できること実証する。本実施例は、ザントモナス・カンペストリス由来のプロリン特異的カルボキシペプチダーゼ(“CarboxyPro”)又はアスペルギルス・オリゼ由来のグリシン切断エンドプロテアーゼ(“EndoGly”)は、さらにEndo-ProAと併用すると、濁り形成を有意に低減することを例証する。本実施例は、100%麦芽ウワート中の濁り低減効果に焦点を当てる。
マッシュ段階にEndo-Proで前処理したウワートを用いる次の実験を行った。この実験では、10mlのウワート当たり補助プロテアーゼを0、100若しくは500μlの量のEndoGly、又は0、20若しくは100μlの量のCarboxyProをウワートに添加した。 全試料を120分間50℃でインキュベート後、冷濁り試験を行った。得られた結果を下表12に示す。
Endo-Pro Aは、Endo-Hydroxy-Pro及びEndo-Ala活性をも有する
Endo-Pro Aがヒドロシキプロリン及びアラニンに特異的な活性も有するかどうか調査した。従って、何らかの変化のあるαs1-カゼインBのC末端を包含する3種の合成ペプチドを合成した。これらペプチドは以下のとおりである:
・0139-59, SEKTTMPLW, αs1-カゼイン本来のC末端 M=1091.5
・0139-60, SEKTTMJLW, ヒドロキシプロリンであるJで M=1107.5
・0139-61, SEKTTMALW, プロリンの代わりにアラニンで M=1065.5
1:フルスキャン解析、
2:フルスキャン質量範囲内で最強の電荷状態の決定のためのズームスキャン解析
3:アミノ酸配列情報を得るためのフルスキャン質量範囲内の最強イオンのMS/MS。
SEKTTMP及びLW、それぞれm/z 793.4及び318.1のプロトン化分子で。
SEKTTMJ及びLW、それぞれm/z 809.4及び318.1のプロトン化分子で。
両予測ペプチド質量は、実際にEndo-Pro処理ペプチドのイオンクロマトグラム内で観察することができ、正確なアミノ酸配列を有するLC/MS/MS様式でチェックした。
上記概要を表14に示す。
確かに、Endo-Pro Aは、そのプロリン切断に優先であることに加え、ヒドロキシプロリン及びアラニン残基をそのカルボキシ末端側で切断することができる。
Endo-ProのpH最適値
配列番号:1及び配列番号:3のDNA配列は、アスペルギルス・ニガーiso 502内で発現された。この結果、それぞれ配列番号:5及び配列番号:4のポリペプチドとなった。これらポリペプチドは、それぞれさらにEndo-Pro RUS及びEndo-Pro GAMとも呼ばれる。両酵素は非常に似ているが、いくつかの生物学的局面で異なることも分かった。Endo-Pro RUSは、より高い特異的活性を有し、かつビール中の濁り除去でいくらか活性が高いことが分かった。
レゾルフィン(resorufin)標識カゼインとRocheの処方(“Universal Protease Substrate”;カタログ番号1 080 733)を用いてEndo-Proのタンパク質分解活性を測定した。プロテアーゼとの処理によってレゾルフィン標識ペプチドは遊離され、トリクロロ酢酸で沈殿しえない。それで、与えられた温度又はpH値でEndo-Pro酵素の活性が高いほど、574nmでの光吸収が高い。pH4.5−4.8−5.0−5.5−6.0−7.0−8.0のpH範囲内で、pH7及び8では0.1M Tris/HCl緩衝液を用いた。より低いpHでは0.1M Hac緩衝液を用いた。緩衝液は、0.02MのCaCl2を含んでいた。
表15に示される結果によれば、酵素のpH最適値は約pH5.5である。しかし、その後になって、用いたレゾルフィン標識カゼインがpH5.5未満のpH値では沈殿し始めるので、このpH未満では信頼できない結果が得られることが明らかになった。それを補正するため、上述したが色素生産性基質としてレゾルフィン標識カゼインではなくZ-Gly-Pro-pNAを用いて種々のpH条件下で実験を繰り返した。Z-Gly-Pro-pNAを用いて得られたデータと、410nmでの光吸収は(実施例2参照)、両Endo-Pro酵素についてほぼpH4.5で明白な活性ピークを示した。
両Endo-Pro酵素をpH5.0で40−50−55及び60℃に加熱して両酵素の温度安定性を測定した。0.5−1−2−5及び20時間後に試料を取り、Endo-ProRUS及びEndo-ProGAMの活性を約0.5U/mLに希釈した。次いで、10μlの試料をZ-Gly-Pro-pNA(実施例2参照)を含有するインキュベーション混合物に添加し、実施例2で述べたように残留酵素活性を測定した。参考では10μlの量をインキュベーション緩衝液で補填した。非加熱酵素のZ-Gly-Pro-pNA切断活性を100%値として使用した。
下表16に示される結果から、両Endo-Pro酵素が優れた温度安定性を示すことは明白である。
ビール発酵及びラガーリング(lagering)条件下における濁り低減
前記実施例で、我々は室温(実施例7参照)と高温の両者における酵素の濁り阻害効力を示した。本実施例では、我々は、プロリン特異的エンドプロテアーゼが、該酵素にとってとうてい最適でない条件下で活性でなければならない条件下でも有効に濁り形成を防止できることを示すことによって、この酵素Endo-Proアプローチの多様性を示す。その目的のため、我々は、ビール発酵前に添加するか(酵素は10日間12℃で働きうるように)、又はビールのラガーリング前に添加(酵素は10日間4℃で働きうるように)した場合、Endo-Pro酵素はビール中の濁り形成を防止できるかをどうか試験した。
ラガーリング条件中の酵素的濁り防止効果を試験するため、同一の出発原料を同濃度のEndo-Pro酵素と組み合わせて使用するが、今回は混合物を10日間4℃でインキュベートした。
両実験で、参考として1ヘクトリットルのビール当たり20、30及び50グラム用量のPVPP(Polyclar AT/水不溶性)を使用した(15分間室温で撹拌後ペーパーろ過)。
両実験で、パパイン(液体DSM Collupulin;バッチ番号010604,5480 NFU/mgの最終活性)も1ヘクトリットル当たり1、2及び3グラムの用量で含めた。
全試料で、実施例2で記載したように濁り形成を測定した。
酵素的濁り低減及びそのビール泡安定性とポリフェノール(抗酸化剤)に及ぼす影響
タンパク質分解酵素を用いてビール中の濁り形成を低減することの主張されている欠点は、そのビール泡安定性に及ぼす負の効果である。過剰なタンパク質分解のため、穀物タンパク質が安定な泡を形成し損なう。この実施例では、我々は、おそらくその高い選択性の結果として、Endo-Pro酵素がビール泡安定性に逆効果を及ぼさないことを実証する。Endo-Proインキュベーションの重要な副作用は、結果のビールが、上昇したポリフェノールレベルを示し、ひいては酸化に対して高い天然の保護を示すことである。
Claims (13)
- 飲料中の濁りの防止又は低減方法であって、
(i)配列番号5に記載されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
(ii)配列番号5に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、かつプロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有するポリペプチド
からなるプロリン特異的エンドプロテアーゼを前記飲料に添加し、濁り形成をさらに低減又は防止するため、前記飲料にザントモナス・カンペストリスから得られるプロリン特異的カルボキシペプチダーゼ及び/又はアスペルギルス・オリゼから得られるグリシン特異的エンドプロテアーゼを添加する、方法。 - 前記プロリン特異的エンドプロテアーゼが7未満のpH値でエンドプロテアーゼ活性を有する、請求項1記載の方法。
- 前記飲料が、ビール、ワイン又は果実ジュースである、請求項1又は2記載の方法。
- 前記飲料がビールの製造で使用する液体である、請求項1又は2記載の方法。
- 前記プロリン特異的エンドプロテアーゼをマッシュに添加する、請求項4記載の方法。
- 前記プロリン特異的エンドプロテアーゼを、濁りが形成される前のビールに添加する、請求項4記載の方法。
- 前記プロリン特異的エンドプロテアーゼを、濁りが形成された後の発酵ビールに添加する、請求項4記載の方法。
- 前記プロリン特異的エンドプロテアーゼを、ワインの製造中に添加する、請求項1又は2記載の方法。
- 前記プロリン特異的エンドプロテアーゼを、発酵ワインに添加する、請求項8記載の方法。
- 前記プロリン特異的エンドプロテアーゼを、果実ジュースの製造中に添加する、請求項1又は2記載の方法。
- 前記プロリン特異的エンドプロテアーゼを、解離又は脱凝膠の間に添加する、請求項10記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項記載の方法で得られた飲料。
- 請求項1〜11のいずれか1項記載の方法で得られたビール、ワイン又は果実ジュース。
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