ES2693776T3 - Endoproteasa específica de prolina inmovilizada - Google Patents

Endoproteasa específica de prolina inmovilizada Download PDF

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Abstract

Una endoproteasa específica de prolina inmovilizada, en donde la endoproteasa específica de prolina se inmoviliza reticulando a un vehículo de metacrilato funcionalizado con dimetileno.

Description

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DESCRIPCION
Endoproteasa especifica de prolina inmovilizada.
La presente invencion se refiere a endoproteasa especifica de prolina inmovilizada y un proceso para preparar cerveza en el que se usa la endoproteasa especifica de prolina inmovilizada.
Antecedentes
Las endoproteasas especificas de prolina son enzimas que pueden derivarse de bacterias y hongos, por ejemplo, endoproteasa especifica de prolina procedente de Aspergillus niger como se describe en el documento WO2002/046381. Las endoproteasas especificas de prolina son capaces de escindir una proteina en lugares donde la proteina contiene un residuo prolilo en su cadena. El documento WO2002/046381 describe que dicha endoproteasa especifica de prolina puede usarse para reducir la turbidez en una bebida tal como cerveza. La turbidez en la cerveza consiste principalmente en agregados de proteina-polifenol. Para reducir la turbidez, la endoproteasa especifica de prolina puede anadirse al mosto de cerveza, durante la fermentacion o durante una fase de estabilizacion de la cerveza.
El documento WO2005/027953 describe que la endoproteasa especifica de prolina redujo los niveles de gluten en la cerveza cuando se anadio endoproteasa especifica de prolina durante la maceracion o fermentacion de la cerveza.
Para ser capaces de reutilizar la endoproteasa especifica de prolina en por ejemplo un proceso de produccion de cerveza, se sugeria en el documento WO2003/104382 inmovilizar la enzima y minimizar el riesgo de que la enzima permanezca presente en el producto final.
La inmovilizacion de enzimas se conoce desde hace decadas (vease “Immobilization of Enzyme and Cells”, segunda edicion, editado por Jose M. Guisan, 2006, Humana Press Inc.). Los procedimientos mas comunes de inmovilizacion de enzimas son el acoplamiento covalente, atrapamiento, micro-encapsulado y reticulado.
Sin embargo, no se ha descrito una inmovilizacion adecuada para la endoproteasa especifica de prolina en la que la enzima permanezca activa en sustratos parcialmente o enteramente insolubles, tales como agregados de proteina- polifenol que forman turbidez en la cerveza, o gluten.
El objetivo de la presente invencion es una endoproteasa especifica de prolina inmovilizada que sea suficientemente activa en sustratos insolubles.
Compendio
La presente descripcion se refiere a una endoproteasa inmovilizada especifica de prolina inmovilizada mediante reticulado o un vehiculo que comprende metacrilato aminofuncionalizado que tiene un intervalo de tamano de particula de 100 a 400 pm. Sorprendentemente, se encontro que una endoproteasa especifica de prolina inmovilizada como se describe en la presente memoria no solo permanecio su actividad enzimatica en un sustrato grande tal como gluten, sino que tambien mostro una mayor actividad relativa a una menor temperatura en comparacion con la actividad relativa de la enzima libre a esta menor temperatura.
La presente descripcion tambien se refiere a un proceso para producir endoproteasa especifica de prolina inmovilizada, que comprende activar el grupo amino en un vehiculo de metacrilato funcionalizado con dimetileno con un agente de reticulado bifuncional, inmovilizar la endoproteasa especifica de prolina en el vehiculo de metacrilato amino-funcionalizado a una relacion enzima: vehiculo de 0,01 - 0,07 p/p, y producir la endoproteasa especifica de prolina inmovilizada.
La presente descripcion tambien se refiere a un proceso para producir cerveza, que comprende preparar un macerado, fermentar la cerveza, y estabilizar la cerveza, en el que la cerveza se incuba con endoproteasa especifica de prolina inmovilizada.
Descripcion detallada
Se describe en esta memoria una endoproteasa inmovilizada especifica de prolina inmovilizada por reticulado en un vehiculo que comprende polimero de metacrilato amino-funcionalizado. Preferiblemente la endoproteasa especifica de prolina inmovilizada tiene un intervalo de tamano de particula de 100 a 400 pm. Preferiblemente, el vehiculo que comprende polimero de metacrilato amino-funcionalizado puede tener un intervalo de tamano de particula de entre 150 a 350 pm. Preferiblemente, el polimero de metacrilato se ha amino-funcionalizado con dimetileno.
De forma ventajosa una endoproteasa especifica de prolina inmovilizada como se describe en la presente memoria esta inmovilizada en un vehiculo que tiene una distribucion^ de tamano de poro d50 de 1500 - 2100 A, por ejemplo, una distribucion de tamano de poro d50 de 1600 a 2000 A. La distribucion de tamano de poro d50 es un termino conocido para un experto en la tecnica, y se define como el valor del diametro de poro al 50% en la distribucion acumulativa.
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Normalmente, el vehiculo de metacrilato amino-funcionalizado para inmovilizar endoproteasa especifica de prolina tiene un area superficial mayor que 40 m2/g, tal como mayor que 45 m2/g, o mayor que 50 m2/g. El vehiculo de metacrilato para inmovilizar endoproteasa especifica de prolina normalmente tiene una retencion de humedad de 58 a 70%, tal como 60 a 68%, o 62 a 66%. La retencion de humedad se define en la presente memoria como la relacion entre el peso del vehiculo completamente hidratado y el peso del vehiculo completamente seco.
Sorprendentemente, se encontro que una endoproteasa especifica de prolina inmovilizada en un vehiculo como se describe en la presente memoria permanece no solo activa en sustratos agregados polimericos grandes y/o de proteina-polifenol tal como turbidez, por ejemplo, turbidez de cerveza, sino que fue capaz tambien de hidrolizar gluten, tal como gluten de cebada. Una enzima que tiene actividad endoproteasa especifica de prolina que esta inmovilizada en un vehiculo como se describe en la presente memoria puede ser cualquier enzima adecuada capaz de escindir un peptido o proteina en los lugares donde la proteina o peptido contiene un residuo prolilo en su cadena. Una endoproteasa especifica de prolina puede derivarse de un origen bacteriano o fungico, tal como del genero Flavobacterium, Sphingomonas, Aeromonas, Xanthomonas, Bacteroides, Aspergillus o Penicillium, por ejemplo, de Flavobacterium meningosepticum, Sphingomonas capsulata, Aspergillus niger o Penicillium chrysogenum. Una endoproteasa especifica de prolina como se describe en la presente memoria pertenece a la clasificacion enzimatica EC 3.4.21.26. Una endoproteasa especifica de prolina es preferiblemente una enzima que hidroliza un enlace peptidico en el extremo carboxi terminal de los residuos de prolina, dando por resultado un peptido y/o fragmento de polipeptido con una prolina C terminal.
La expresion inmovilizada se usa en la presente memoria para indicar que una enzima esta unida a un vehiculo, tal como un vehiculo de metacrilato. La inmovilizacion de una enzima puede conseguirse reticulando la enzima en o al vehiculo, que se conoce por un experto en la tecnica (vease “Immobilization of Enzyme and Cells”, Segunda edicion, editado por Jose M. Guisan, 2006, Humana Press Inc.).
La presente descripcion proporciona una endoproteasa especifica de prolina inmovilizada mediante reticulado a un vehiculo de metacrilato funcionalizado con dimetileno.
En una realizacion la presente descripcion se refiere a un proceso para producir endoproteasa especifica de prolina inmovilizada como se describe en la presente memoria, que comprende activar el grupo amino en un vehiculo de metacrilato amino-funcionalizado con un agente de reticulado bifuncional, inmovilizar la endoproteasa especifica de prolina en el vehiculo y producir la endoproteasa especifica de prolina inmovilizada.
Sorprendentemente, se encontro que usar un proceso para inmovilizar la endoproteasa especifica de prolina como se describe en la presente memoria da por resultado una endoproteasa especifica de prolina inmovilizada que tiene una mayor actividad relativa a una menor temperatura en comparacion con la actividad relativa de la enzima libre.
El vehiculo de metacrilato puede estar amino funcionalizado con un espaciador de dimetileno.
La activacion del grupo amino en metacrilato amino-funcionalizado mediante un agente de reticulado bifuncional da por resultado la inmovilizacion de la enzima al vehiculo. Preferiblemente, el agente de reticulado es glutaraldehido. La activacion del grupo amino con glutaraldehido puede realizarse de cualquier forma adecuada que se conozca por un experto en la tecnica.
Durante el proceso para la inmovilizacion de la enzima al vehiculo, puede aplicarse cualquier relacion enzima: vehiculo adecuada tal como una relacion de 0,01 -0,07 p/p, o una relacion enzima: vehiculo de 0,02 a 0,06 p/p, o una relacion enzima: vehiculo de 0,03 a 0,05 p/p. Se encontro que a la relacion enzima: vehiculo indicada en un proceso para la inmovilizacion como se describe en la presente memoria se obtuvo una endoproteasa especifica de prolina inmovilizada en un vehiculo de metacrilato con actividad comparable como la enzima libre.
Preferiblemente, un proceso para inmovilizar endoproteasa especifica de prolina como se describe en la presente memoria se realiza a temperatura de 10 a 50°C, tal como entre 15 a 40°C, tal como a una temperatura de entre 20 y 30°C.
Un proceso para inmovilizar endoproteasa especifica de prolina como se describe en la presente memoria puede realizarse a cualquier pH adecuado, tal como un pH de entre 6 a 8, o un pH entre 6,5 y 7,5. Puede usarse cualquier tampon para mantener el pH a un nivel deseable, por ejemplo, un tampon que tiene una concentracion de sal de entre 20 y 150 mM, o entre 40 y 120 mM, o entre 60 y 100 mM, tal como entre 70 y 90 mM. Un tampon adecuado puede ser por ejemplo un tampon fosfato.
Un proceso para inmovilizar endoproteasa especifica de prolina como se describe en la presente memoria puede realizarse durante 4 a 48 h, tal como entre 8 y 36 h, o entre 10 y 24 h.
En una realizacion la presente descripcion se refiere al uso de una endoproteasa especifica de prolina inmovilizada como se describe en la presente memoria para la hidrolisis de gluten, tal como gluten de cebada.
El gluten es un grupo de proteinas ricas en prolina y glutamina que se encuentra en el trigo, centeno, cebada y avena, que puede subdividirse en gluteninas y prolaminas. Solo la fraccion de prolamina del gluten da lugar a
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reacciones alergicas a la gente intolerante al gluten, y/o a la gente que sufre de enfermedad celiaca. Las prolaminas en los diferentes cereales estan indicadas normalmente como gliadina en trigo, hordeina en la cebada, secalina en el centeno y avenina en las avenas. Para el proposito de la presente descripcion la expresion gliadina puede usarse para indicar la fraccion prolamina de todos los diferentes cereales.
En otra realizacion la presente descripcion se refiere a un proceso para producir cerveza que comprende preparar un macerado, fermentar la cerveza y estabilizar la cerveza, en el que la cerveza se incuba con una endoproteasa especifica de prolina inmovilizada como se describe en la presente memoria.
Cerveza se usa en la presente memoria para indicar un liquido durante cualquier etapa en el proceso de produccion de cerveza. La cerveza puede ser o no ser un liquido listo para el consumo. La expresion cerveza tambien comprende mosto de cerveza o cerveza verde.
Hay muchos procesos diferentes para producir cerveza, que se conocen por un experto en la tecnica. Normalmente un proceso de produccion de cerveza comprende moler y macerar los cereales, tal como cebada, y el macerado resultante se filtra para dar mosto de cerveza. El mosto de cerveza se hierve entonces para inactivar todas las actividades enzimaticas residuales y posteriormente el mosto de cerveza se inocula con levadura. Fermentar la cerveza en un proceso segun a la presente descripcion comprende inocular el mosto de cerveza con levadura e incubar la levadura en el mosto de cerveza para fermentar los azucares disponibles en alcohol. Esta fermentacion se denomina tambien la fermentacion primaria. La cerveza “verde” que resulta de esta fermentacion primaria aun contiene algunas levaduras no depositada ademas de niveles relativamente altos de componentes aromaticos indeseables, notablemente dicetonas, tales como aldehido de diacetilo y acetilo.
La fermentacion primaria se sigue por una fase de maduracion, tambien denominada la fermentacion secundaria. Fermentar cerveza en un proceso como se describe en la presente memoria puede comprender una fermentacion primaria y secundaria. La fase de maduracion pretende convertir los componentes aromaticos indeseables tales como dicetonas en componentes de mejor sabor.
Despues de la maduracion, la cerveza se estabiliza. La fase de estabilizacion pretende promover la formacion de agregados de polifenol-proteina y permite su precipitacion. Sorprendentemente se encontro que cuando la cerveza se incubo con una endoproteasa especifica de prolina inmovilizada como se describe en la presente memoria la formacion de agregados de polifenol-proteina se redujo o evito. Ademas, se encontro que cuando la cerveza se incubo con una endoproteasa especifica de prolina inmovilizada como se describe en la presente memoria, el contenido en gluten (gliadina) en la cerveza se redujo.
Por consiguiente, en una realizacion la presente descripcion se refiere a un proceso para reducir el gluten en la cerveza, que comprende incubar cerveza con una endoproteasa especifica de prolina inmovilizada, en el que la endoproteasa especifica de prolina inmovilizada hidroliza al menos parte del gluten presente en la cerveza, y reduce el gluten en la cerveza. Por consiguiente, incubar endoproteasa especifica de prolina inmovilizada en un proceso para producir cerveza comprende hidrolizar gluten.
Incubar cerveza con una endoproteasa especifica de prolina inmovilizada puede realizarse en cualquier fase adecuada durante un proceso de produccion de cerveza. Preferiblemente, incubar cerveza con endoproteasa especifica de prolina inmovilizada se realiza durante una fase en la que la cerveza es un liquido claro. Por ejemplo, un proceso para producir cerveza comprende incubar endoproteasa especifica de prolina inmovilizada durante o despues de la fase de estabilizacion. Sin embargo, la endoproteasa especifica de prolina inmovilizada puede anadirse tambien durante cualquier otra fase en el proceso de elaboracion de cerveza y evitar o reducir la formacion de turbidez, y/o hidrolizar gluten en fragmentos no toxicos. Como se usa en la presente memoria, hidrolizar gluten en fragmentos no toxicos, significa que la fraccion de gliadina de gluten se hidroliza.
Preferiblemente, incubar una endoproteasa especifica de prolina inmovilizada en un proceso para producir cerveza se realiza a una temperatura de entre -1 y 20°C, tal como una temperatura de entre 0 y 15°C, o una temperatura de entre 1 y 10°C, o una temperatura de entre 2 y 8°C. Sorprendentemente, se encontro que la endoproteasa especifica de prolina inmovilizada fue capaz de hidrolizar gluten y reducir la turbidez en la cerveza a estas bajas temperaturas.
Incubar cerveza con una endoproteasa especifica de prolina inmovilizada puede realizarse en modo de lotes o en modo continuo. Cuando se incuba endoproteasa especifica de prolina se realiza en modo continuo, la endoproteasa especifica de prolina inmovilizada puede empaquetarse en una columna que retiene la endoproteasa especifica de prolina inmovilizada y permite a la cerveza fluir a traves de la columna. Una columna adecuada puede comprender una criba en la parte superior y en la parte inferior de la columna. Dependiendo de la cantidad de material insoluble en la cerveza, la endoproteasa especifica de prolina inmovilizada puede empaquetarse en una columna de lecho fluidizado o una columna de lecho empaquetado. La preparacion de dicha columna se conoce por un experto en la tecnica. Preferiblemente, la cerveza es un liquido claro cuando se pone en contacto con la endoproteasa especifica de prolina inmovilizada.
Despues de la estabilizacion la cerveza puede envasarse en una botella, lata o un barril. En otra realizacion la presente descripcion se refiere al uso de una endoproteasa especifica de prolina inmovilizada para la hidrolisis del
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gluten. Preferiblemente, la endoproteasa especifica de prolina inmovilizada se usa en un proceso para producir cerveza.
Figuras
Figura 1. Actividad de enzima de EndoPro inmovilizada en diferentes vehiculos determinada con sustrato Ac-AAP- pNA. La actividad de la enzima se determina como el aumento de absorbancia a 405 nm en el tiempo (DO 405 nm/min).
Figura 2. Reduccion de gliadina en el mosto de cerveza usando EndoPro inmovilizada y no inmovilizada.
Figura 3. Actividad relativa de EndoPro inmovilizada y no inmovilizada a 4°C en comparacion con la actividad a 40°C (temperatura optima).
Ejemplos
Materiales y metodos
Endoproteasa especifica de prolina (EndoPro)
Endoproteasa especifica de prolina de Aspergillus niger (EndoPro), se produjo fermentando una cepa de A. niger que contenia el gen que codifica la endoproteasa especifica de prolina (GI: 21725363; num. de acceso de proteina: AX458699) por metodos conocidos en la tecnica. El caldo de fermentacion obtenido despues de la fermentacion de una cepa de Aspergillus niger se sometio adicionalmente a ultrafiltracion. La actividad especifica de prolilo en la muestra de EndoPro final fue 12,4 PPU/ml, y se determino usando una N-carbobenzoxi-glicina-prolina-p-nitroanilida (Z-Gly-Pro-pNA) 2 mM en acido citrico 0,1 M/tampon de fosfato disodico 0,2 M pH 4,6, que contenia 40% de dioxano.
A 1 ml de este tampon a pH 4,6, se anadieron 250 gl de la disolucion de sustrato seguido por 100 gl de la disolucion de enzima. La mezcla de reaccion se incubo a 37°C y la liberacion de pNA liberada se midio de forma espectrofotometrica a 405 nm usando un espectrofotometro Tecan Genios. La actividad se expresa en Unidades de Proteasa de Prolina (PPU). Una PPU se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 gmol de pNA desde Z-Gly-Pro-pNA en 1 minuto bajo las condiciones de ensayo descritas. Para calcular las concentraciones se uso un coeficiente de extincion molar de 10500 M-1cm-1.
La concentracion de proteina se estimo que era 146 mg/g determinada usando el metodo Kjeldahl.
Vehiculos de enzima
Los vehiculos de enzima ECR Purolite se usaron para la inmovilizacion de EndoPro. Las propiedades principales de los vehiculos se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1. Propiedades del vehiculo Purolite®
Nombre del vehiculo
Retencion de humedad (%) Intervalo de tamano de particula (gm) Area superficial (m2/g) d50, Meso y ^ macrosporas (A) Espaciador
Purolite® ECR8310
58-62 150-300 >70 850-1200 dimetileno (C2)
Purolite® ECR8319
62-66 150-300 >50 1600-2000 dimetileno (C2)
Purolite® ECR8417
61-65 150-300 >50 1600-2200 hexametileno (C6)
Purolite® ECR8214
60-66 150-300 >60 1200-1800 epoxi
Determinacion de nitrogeno total de determinacion
El nitrogeno total (N) de la muestra se determino usando el metodo Kjeldahl (Bradstreet, Raymond B. "The Kjeldahl method for organic nitrogen." (1965). Las perlas con la enzima inmovilizada se secaron antes de la medida usando el Mettler Tolodo HB43-S (Halogen). La proteina se calculo usando un factor de conversion de 6,25*N.
Determinacion del contenido de gliadina en el mosto de cerveza
El contenido de gliadina se determino como una medida para el contenido de gluten. La deteccion analitica de gliadinas en el mosto de cerveza se determino con el kit ELISA competitivo con Gliadina RIDASCREEN® (R- Biopharm) segun las instrucciones del fabricante. Este metodo se basa en el anticuerpo R5 (Mendez), que se
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recomienda por el Codex Alimentarius (CODEX STAN 118-1979). El limite de cuantificacion es 5 ppm de gliadina (= 10 ppm de gluten).
Generalmente, el contenido de gliadina puede convertirse en gluten multiplicando el contenido de gliadina con un factor 2. Sin embargo, este valor no es absoluto ya que la fraccion de gliadina con respecto al gluten puede variar en la materia prima (Diaz-Amigo y Popping, Journal of AOAC International, Vol. 95, num. 2, 2012).
Determinacion del contenido de gliadina en cerveza
La deteccion analitica de gliadina en cerveza se determino con el kit de gliadina RIDA®QUICK (R-Biopharm) segun las instrucciones del fabricante. Este metodo se basa en el anticuerpo R5 (Mendez), que se recomienda por el Codex Alimentarius (CODEX STAN 118-1979). El limite de deteccion es 2,5 ppm de gliadina (= 5 ppm de gluten).
Ejemplo 1. Inmovilizacion de EndoPro en diferentes vehiculos Purolite®
Antes de la inmovilizacion de EndoPro, los vehiculos Purolite® ECR8310, -8319 y -8417 se pre-activaron con glutaraldehido al 2% (v/v) en tampon K-fosfato 0,02M, pH 8,0 durante 1 h, seguido por lavado 3 veces del glutaraldehido no reaccionado con el mismo tampon. El vehiculo ECR8214 Purolite no necesito ninguna activacion. Las perlas de ECR8214 solo se lavaron 3 veces con el mismo tampon y se usaron como tal. Finalmente, las perlas se filtraron usando un filtro de vidrio y las perlas semi-secas se almacenaron hasta el uso. Para la inmovilizacion, las perlas se mezclaron con tampon a una relacion perlas/tampon de 1:10 (p/v) y se anadio EndoPro soluble a la mezcla de perlas/tampon a una carga enzimatica como se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2. Condiciones de inmovilizacion. Se uso tampon de fosfato de potasio.
Nombre del vehiculo
Carga enzimatica (mg/g de vehiculo) Molaridad del tampon (mM) pH del tampon
Purolite® ECR8310
80 35 5,8
Purolite® ECR8319
50 84 7
Purolite® ECR8417
50 84 7
Purolite® ECR8214
21 35 5,8
Despues de agitacion continua toda la noche a temperatura ambiente, las perlas se lavaron 3 veces con NaOAc 0,1M, pH 5,0. Finalmente, las perlas que contienen EndoPro inmovilizada se suspendieron en el mismo tampon y se almacenaron a 4°C.
Ejemplo 2. Actividad enzimatica de EndoPro inmovilizada en 4 vehiculos Purolite diferentes
La actividad de EndoPro se determino como DO405 nm/min usando acetato-alanina-alanina-prolina-p-nitroanilina (Ac-AAP-pNA) como sustrato. La cantidad de p-nitroanilina (pNA) liberada formada en el tiempo es una medida de la actividad de EndoPro y se determino de forma espectrofotometrica a 405 nm usando un espectrofotometro Tecan GENios.
La EndoPro no inmovilizada o inmovilizada inmovilizada en uno de los 4 vehiculos Purolite® se anadio a NaOAc 0,1M, pH 5,0, en una placa de microvaloracion. Antes de la adicion de las reservas de Ac-APP-pNA 3 mM (concentracion final) en NaOAc 0,1M, pH 5,0, la enzima se incubo a 40°C durante 5 min. La medida cinetica se comenzo y la actividad se calculo a partir de la pendiente de la curva. La actividad de la enzima se determina como el aumento de absorbancia a 405 nm en el tiempo (DO 405 nm/min) como un resultado de pNA liberada desde el sustrato Ac-AAP-pNA.
La Figura 1 demuestra que la Endopro inmovilizada en vehiculos Purolite® ECR8310, -8319 y -8417 mostraron actividad. No se detecto actividad con la EndoPro inmovilizada en el vehiculo Purolite® ECR8214. Por lo tanto, no se realizo un estudio adicional de este preparado particular.
Ejemplo 3. Eliminacion de gliadina del mosto de cerveza usando EndoPro inmovilizada
Para probar si la EndoPro inmovilizada en vehiculos Purolite® ECR8310, -8319 y -8417 era activa tambien en gluten, se anadieron 0,05 mg de enzima, EndoPro inmovilizada y libre (control), respectivamente, a 10 ml de mosto de cerveza (Research Brewery St. Johann, Train-St. Johann, Alemania; numero de lote: 4/2013) en un tubo de reaccion de 15 ml.
Las mezclas se agitaron toda la noche a temperatura ambiente. Al dia siguiente, el contenido en gluten en el mosto de cerveza se determino mediante el proceso como se describe en los metodos. Los resultados en la Figura 2 muestran el contenido de gliadina residual en el mosto de cerveza.
5
10
15
20
25
30
35
Se encontro que la EndoPro inmovilizada tenia la mejor actividad hacia el sustrato de proteina grande cuando se inmoviliza en vehiculo Purolite® ECR8319 inmovilizado segun el proceso como se describe en el Ejemplo 1. En comparacion, cuando se inmoviliza en el mismo vehiculo bajo condiciones diferentes (pH 8,2, molaridad 35 mM, carga enzimatica 80 mg/g de vehiculo) solo se obtuvo aproximadamente la mitad de la actividad hacia el gluten (no se muestran datos).
Ejemplo 4. Actividad relativa de EndoPro inmovilizada y libre a 4°C en comparacion con 40°C
Para la determinacion de la actividad relativa a 4°C en comparacion con la actividad a 40°C la enzima EndoPro Purolite® ECR8319 no inmovilizada e inmovilizada (preparacion de inmovilizada como se describe anteriormente) se anadio a NaOAc 0,1M, pH 5,0 que comprende Ac-AAP-pNA 3 mM en un volumen total de 1 ml. Las mezclas de reaccion se agitaron a 900 rpm en un mezclador termo-regulado (Eppendorf). Se tomo una muestra de sobrenadante cada minuto y la reaccion se paro con HCl 0,5M (relacion muestra/HCl de 50/1 (v/v)). La absorbancia a 405 nm se midio usando el espectrofotometro Tecan GENios. Las pendientes (DO 405 nm/min) a 4°C se compararon con las pendientes a la temperatura de actividad optima de 40°C. La actividad absoluta de Endopro inmovilizada fue 0,53 y 1,85 DO 405 nm/min y de Endopro no inmovilizada 0,06 y 0,65 DO 405 nm/min a 4°C y 40°C, respectivamente. La actividad a 40°C se ajusto a 100%.
La Figura 3 muestra que la actividad relativa de EndoPro inmovilizada a 4°C es 3 veces mayor que la actividad relativa de la EndoPro no inmovilizada.
Ejemplo 5. Conversion de gliadina en cerveza mediante la EndoPro inmovilizada a 4 y 15°C
Tres volumenes diferentes (Tabla 3) de la EndoPro inmovilizada inmovilizada en preparacion de Purolite® ECR8319 como se describe en el Ejemplo 1, se pipetearon en 50 ml de cerveza (Research Brewery St. Johann, Train-St. Johann, Alemania; numero de lote: 42/2012). Las mezclas se incubaron a 4°C y 15°C, respectivamente, en un mezclador de rodillo. Se tomaron muestras de 1 ml de cerveza despues de 0,5, 1, 19 y 24 h. La gliadina residual en las muestras se determino por el proceso como se describe en los metodos. Los resultados se representan en la Tabla 3 y muestran la reduccion de gliadina en la cerveza. En general, la EndoPro inmovilizada es capaz de degradar la gliadina en cerveza a una temperatura de 4°C en el mismo grado o similar que a 15°C. Despues de 24 horas, la gliadina se degrado en todas las muestras a un limite indetectable (LOD 2,5 ppm). Usando mayores dosis de EndoPro inmovilizada (10 ml), la gliadina podria degradarse a un limite indetectable incluso despues de 1 hora de la incubacion.
Tabla 3. Eliminacion de gliadina dependiente de tiempo-, dosis- y temperatura de la cerveza mediante EndoPro inmovilizada. La concentracion de gliadina residual se indica como sigue: (+++) >>2,5 ppm de gliadina, (++) >2,5 ppm, (+) <2,5 ppm, (-)-sin gliadina.
4°C 15°C
Tiempo (h)
0,5 1 19 24 0,5 1 19 24
Enzima (ml)
0,25
+++ +++ + - +++ +++ - -
2,5
++ ++ - - ++ + - -
10
+ - - - - - - -
Conclusion
Los resultados mostrados en los Ejemplos 1 a 5 muestran que la endoproteasa especifica para prolina inmovilizada segun la presente invencion puede convertir un sustrato complejo tal como gluten.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    REIVINDICACIONES
    1. Una endoproteasa especifica de prolina inmovilizada, en donde la endoproteasa especifica de prolina se inmoviliza reticulando a un vehiculo de metacrilato funcionalizado con dimetileno.
  2. 2. La endoproteasa especifica de prolina inmovilizada segun la reivindicacion 1, en donde el vehiculo tiene un intervalo de tamano de particula de 100 a 400 pm.
  3. 3. La endoproteasa especifica de prolina inmovilizada segun la reivindicacion 1 o 2, en donde el vehiculo tiene una distribucion de tamano de poro d50 de 1500-2100 A.
  4. 4. La endoproteasa especifica de prolina inmovilizada segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la endoproteasa especifica de prolina es de Aspergillus, preferiblemente Aspergillus niger.
  5. 5. Un proceso para producir endoproteasa especifica de prolina inmovilizada segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende activar el grupo amino en un vehiculo de metacrilato funcionalizado con dimetileno, con un agente de reticulado bifuncional, e inmovilizar la endoproteasa especifica de prolina en el vehiculo.
  6. 6. El proceso segun la reivindicacion 5, en donde la endoproteasa especifica de prolina se inmoviliza en el vehiculo a una relacion enzima: vehiculo de 0,01 - 0,07 p/p.
  7. 7. El proceso segun la reivindicacion 5 o 6, en donde el agente de reticulado bifuncional es glutaraldehido.
  8. 8. El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde la inmovilizacion se realiza a una temperatura de entre 10 a 50°C.
  9. 9. El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde la inmovilizacion se realiza a un pH de 6 a 8.
  10. 10. El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en donde la inmovilizacion se realiza entre 4 a 48 horas.
  11. 11. Un proceso para producir cerveza que comprende las etapas de
    a. preparar un macerado,
    b. fermentar la cerveza, y
    c. estabilizar la cerveza,
    en donde la cerveza se incuba con la endoproteasa especifica de prolina inmovilizada segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  12. 12. El proceso segun la reivindicacion 11, en donde la endoproteasa especifica de prolina inmovilizada se incuba durante o despues de la estabilizacion de la cerveza.
  13. 13. El proceso segun la reivindicacion 11 o 12, en donde dicha incubacion se realiza a una temperatura de entre 0 y 20°C.
  14. 14. El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde dicha incubacion comprende la hidrolisis de gluten.
  15. 15. El uso de una endoproteasa especifica de prolina inmovilizada segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la hidrolisis de gluten en fragmentos no toxicos.
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