JP2016522688A - 固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼ - Google Patents
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Abstract
本発明は固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼに関し、プロリン特異的エンドプロテアーゼはアミノジメチレンで官能基化されたメタクリレートを含む担体に固定化されており、担体は100〜400μmの粒径範囲を有する。本発明は、マッシュを調製するステップと、ビールを発酵させるステップと、ビールを安定化させるステップとを含むビールの製造方法にも関し、本方法において、ビールは固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートされる。【選択図】 なし
Description
本発明は、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼが使用されるビールの製造方法とに関する。
[背景]
プロリン特異的エンドプロテアーゼは細菌および真菌に由来し得る酵素であり、例えば、国際公開第2002/046381号パンフレットに開示されるアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼである。プロリン特異的エンドプロテアーゼは、タンパク質がその鎖中にプロリル残基を含有する場所で、タンパク質を切断することができる。国際公開第2002/046381号パンフレットは、このようなプロリン特異的エンドプロテアーゼがビールなどの飲料のヘイズを低減するために使用可能であることを開示している。ビールのヘイズは、主として、タンパク質−ポリフェノール凝集体からなる。ヘイズを低減するために、ビールの発酵中または安定化段階において、プロリン特異的エンドプロテアーゼを麦芽汁に添加することができる。
プロリン特異的エンドプロテアーゼは細菌および真菌に由来し得る酵素であり、例えば、国際公開第2002/046381号パンフレットに開示されるアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼである。プロリン特異的エンドプロテアーゼは、タンパク質がその鎖中にプロリル残基を含有する場所で、タンパク質を切断することができる。国際公開第2002/046381号パンフレットは、このようなプロリン特異的エンドプロテアーゼがビールなどの飲料のヘイズを低減するために使用可能であることを開示している。ビールのヘイズは、主として、タンパク質−ポリフェノール凝集体からなる。ヘイズを低減するために、ビールの発酵中または安定化段階において、プロリン特異的エンドプロテアーゼを麦芽汁に添加することができる。
国際公開第2005/027953号パンフレットは、ビールのマッシングまたは発酵中にプロリン特異的エンドプロテアーゼを添加すると、プロリン特異的エンドプロテアーゼがビール中のグルテンレベルを低減したことを開示している。
例えばビールの製造方法において、プロリン特異的エンドプロテアーゼの再利用を可能にするために、国際公開第2003/104382号パンフレットには、酵素を固定化し、最終製品中に酵素が存在したままであるリスクを最小限にすることが提案された。
酵素の固定化は数十年前から知られている(“Immobilization of Enzyme and Cells”,Second Edition,edited by Jose M.Guisan,2006,Humana Press Inc.を参照)。酵素固定化の最も一般的な手順は、共有結合、封入(entrapment)、マイクロカプセル化および架橋である。
しかしながら、ビール中のヘイズを形成するタンパク質−ポリフェノール凝集体またはグルテンなどの部分的または完全に不溶性の基質に対して、酵素が活性なままであるプロリン特異的エンドプロテアーゼの適切な固定化は開示されていない。
本発明の目的は、不溶性基質に対して十分に活性である固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼである。
[概要]
本開示は、100〜400μmの粒径範囲を有するアミノ官能基化メタクリレートを含む担体に固定化された、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼに関する。意外にも、本明細書に開示される固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼはグルテンなどの大きい基質に対するその酵素活性を残すだけでなく、より低い温度における遊離酵素の相対活性と比べて、このより低い温度においてより高い相対活性を示すことが分かった。
本開示は、100〜400μmの粒径範囲を有するアミノ官能基化メタクリレートを含む担体に固定化された、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼに関する。意外にも、本明細書に開示される固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼはグルテンなどの大きい基質に対するその酵素活性を残すだけでなく、より低い温度における遊離酵素の相対活性と比べて、このより低い温度においてより高い相対活性を示すことが分かった。
また本開示は、アミノ官能基化メタクリレート担体中のアミノ基を二官能性架橋剤により活性化するステップと、0.01〜0.07w/wの酵素:担体比でプロリン特異的エンドプロテアーゼをアミノ官能基化メタクリレート担体に固定化するステップと、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼを製造するステップとを含む、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼの製造方法にも関する。
また本開示は、マッシュを調製するステップと、ビールを発酵させるステップと、ビールを安定化させるステップとを含むビールの製造方法にも関し、本方法において、ビールは固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートされる。
[詳細な説明]
本明細書には、アミノ官能基化メタクリレートポリマーを含む担体に固定化された固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼが開示されている。好ましくは、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼは、100〜400μmの粒径範囲を有する。好ましくは、アミノ官能基化メタクリレートポリマーを含む担体は150〜350μmの粒径範囲を有し得る。好ましくは、メタクリレートポリマーは、ジメチレンによってアミノ官能基化されている。
本明細書には、アミノ官能基化メタクリレートポリマーを含む担体に固定化された固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼが開示されている。好ましくは、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼは、100〜400μmの粒径範囲を有する。好ましくは、アミノ官能基化メタクリレートポリマーを含む担体は150〜350μmの粒径範囲を有し得る。好ましくは、メタクリレートポリマーは、ジメチレンによってアミノ官能基化されている。
有利に、本明細書に開示される固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼは、1500〜2100Åの細孔径分布d50、例えば1600〜2000Åの細孔径分布d50を有する担体に固定化される。細孔径分布d50は当業者に既知の用語であり、累積分布の50%である細孔径の値であると定義される。
通常、プロリン特異的エンドプロテアーゼを固定化するためのアミノ官能基化メタクリレート担体は、40m2/gよりも大きい、例えば45m2/gよりも大きい、または50m2/gよりも大きい表面積を有する。プロリン特異的エンドプロテアーゼを固定化するためのメタクリレート担体は、通常、58〜70%、例えば60〜68%、または62〜66%の水分保持率を有する。水分保持率は、本明細書では、完全に水和した担体の重量と完全に乾燥した担体の重量との間の比率であると定義される。
意外にも、本明細書に開示される担体に固定化されたプロリン特異的エンドプロテアーゼは、大きい高分子および/またはタンパク質−ポリフェノール凝集基質、例えばヘイズ、例えばビールヘイズに対して活性なままであるだけでなく、グルテン、例えば大麦グルテンを加水分解することもできることが分かった。
本明細書に開示される担体に固定化されるプロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有する酵素は、タンパク質またはペプチドがその鎖中にプロリル残基を含有する場所で、ペプチドまたはタンパク質を切断することができる任意の適切な酵素であり得る。プロリン特異的エンドプロテアーゼは、フラボバクテリウム属(Flavobacterium)、スフィンゴモナス属(Sphingomonas)、アエロモナス属(Aeromonas)、キサントモナス属(Xanthomonas)、バクテロイデス属(Bacteroides)、アスペルギルス属(Aspergillus)またはペニシリウム属(Penicillium)などの細菌または真菌起源、例えば、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム(Flavobacterium meningosepticum)、スフィンゴモナス・カプスラタ(Sphingomonas capsulata)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)またはペニシリウム・クリゾゲナム(Penicillium chrysogenum)に由来し得る。本明細書に開示されるプロリン特異的エンドプロテアーゼは、酵素分類EC3.4.21.26に属する。プロリン特異的エンドプロテアーゼは、好ましくは、プロリン残基のカルボキシ末端側端部でペプチド結合を加水分解して、C末端プロリンを有するペプチドおよび/またはポリペプチド断片をもたらす酵素である。
固定化という文言は、本明細書では、酵素がメタクリレート担体などの担体に結合されることを示すために使用される。酵素の固定化は、当業者に知られている担体上におけるまたは担体に対する酵素の吸着、封入または架橋によって達成することができる。(“Immobilization of Enzyme and Cells”,Second Edition,edited by Jose M.Guisan,2006,Humana Press Incを参照)。
本開示は、架橋によってメタクリレート担体に固定化されたプロリン特異的エンドプロテアーゼを提供する。
一実施形態では、本開示は、アミノ官能基化メタクリレート担体中のアミノ基を二官能性架橋剤により活性化するステップと、プロリン特異的エンドプロテアーゼを担体に固定化するステップと、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼを製造するステップとを含む、本明細書に開示される固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼの製造方法に関する。
意外にも、本明細書に開示されるプロリン特異的エンドプロテアーゼを固定化するためのプロセスを用いると、遊離酵素の相対活性と比べて、より低い温度においてより高い相対活性を有する固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼが得られることが分かった。
メタクリレート担体は、例えばジメチレンまたはヘキサメチレンスペーサー、好ましくはジメチレンスペーサーによってアミノ官能基化され得る。
二官能性架橋剤によるアミノ官能基化メタクリレートのアミノ基の活性化は酵素の担体への固定化をもたらす。好ましくは、架橋剤はグルタルアルデヒドである。グルタルアルデヒドによるアミノ基の活性化は、当業者に知られている任意の適切な方法で実施され得る。
酵素を担体に固定化するためのプロセスの間、任意の適切な酵素:担体比、例えば0.01〜0.07w/wの酵素:担体比、または0.02〜0.06w/wの酵素:担体比、または0.03〜0.05w/wの酵素:担体比が適用され得る。本明細書に開示される固定化プロセスにおいて表示された酵素:担体比では、遊離酵素と同等の活性を有するメタクリレート担体上の固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼが得られることが分かった。
好ましくは、本明細書に開示されるプロリン特異的エンドプロテアーゼを固定化するためのプロセスは、10〜50℃、例えば15〜40℃の温度、例えば20〜30℃の温度で実施される。
本明細書に開示されるプロリン特異的エンドプロテアーゼを固定化するためのプロセスは、任意の適切なpH、例えば6〜8のpH、または6.5〜7.5のpHで実施され得る。pHを望ましいレベルに保持するために任意の緩衝液、例えば、20〜150mM、または40〜120mM、または60〜100mM、例えば70〜90mMの塩濃度を有する緩衝液が使用され得る。適切な緩衝液は、例えば、リン酸緩衝液であり得る。
本明細書に開示されるプロリン特異的エンドプロテアーゼを固定化するためのプロセスは、4〜48時間、例えば8〜36時間、または10〜24時間実施され得る。
一実施形態では、本開示は、本明細書に開示される固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼの、グルテン、例えば大麦グルテンを加水分解するための使用に関する。
グルテンは、小麦、ライ麦、大麦およびオート麦で見られるプロリンおよびグルタミンが豊富なタンパク質の群であり、グルテニンおよびプロラミンに細分することができる。グルテンのプロラミン画分だけが、グルテン不耐性の人々および/またはセリアック病を患っている人々にアレルギー反応を生じさせる。種々の穀類中のプロラミンは、一般に、小麦ではグリアジン、大麦ではホルデイン、ライ麦ではセカリン、およびオーツ麦ではアベニンと示される。本開示の目的のために、グリアジンという文言は、全ての異なる穀類のプロラミン画分を示すために使用することができる。
別の実施形態では、本開示は、マッシュを調製するステップと、ビールを発酵させるステップと、ビールを安定化させるステップとを含むビールの製造方法に関し、本方法において、ビールは本明細書に開示される固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートされる。
ビールは、本明細書では、ビールの製造方法の任意の段階における液体を示すために使用される。ビールは、消費の準備が整った液体であってもそうでなくてもよい。ビールという文言は麦芽汁またはグリーンビールも含む。
多数の異なるビールの製造方法があり、これらは当業者には既知である。通常、ビールの醸造方法は大麦などの穀類の製粉およびマッシングを含み、得られたマッシュはろ過され、麦芽汁が得られる。次に、麦芽汁は、全ての残留酵素活性を不活性化するために沸騰され、続いて、麦芽汁は酵母を播種される。本開示に従う方法におけるビールの発酵は、麦芽汁に酵母を播種し、麦芽汁中の酵母をインキュベートして、利用可能な糖をアルコールに発酵させることを含む。この発酵は、一次発酵とも呼ばれる。この一次発酵から得られる「グリーン」ビールはまだ、いくらかの沈降していない酵母と、比較的高レベルの望ましくないフレーバー成分、特にジアセチルおよびアセチルアルデヒドなどのジケトンとを含有している。
一次発酵の後に、二次発酵とも呼ばれる熟成段階が続く。本明細書に開示される方法におけるビールの発酵は、一次および二次発酵を含み得る。熟成段階は、ジケトンなどの望ましくないフレーバー成分をより良好な味成分に変換することが意図される。
熟成の後、ビールは安定化される。安定化段階はポリフェノール−タンパク質凝集体の形成を促進させることが意図され、その沈殿を可能にする。意外にも、ビールを本明細書に開示される固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートすると、ポリフェノール−タンパク質凝集体の形成が低減または防止されることが分かった。さらに、ビールを本明細書に開示される固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートすると、ビール中のグルテン(グリアジン)含量が低減されることが分かった。
従って、一実施形態では、本開示はビール中のグルテンを低減するための方法に関し、本方法は、ビールを固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートする(ここで、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼはビール中に存在するグルテンの少なくとも一部を加水分解する)ことと、ビール中のグルテンを低減することとを含む。従って、ビールの製造方法における固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼのインキュベートは、グルテンの加水分解を含む。
ビールを固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートすることは、ビールの製造方法における任意の適切な段階で実施され得る。好ましくは、ビールを固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートすることは、ビールが透明な液体である段階において実施される。例えば、ビールの製造方法は、安定化段階においてまたは安定化段階の後に、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼのインキュベートを含む。しかしながら、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼは、ビール醸造方法の任意の他の段階で添加され、ヘイズの形成を防止または低減し、そして/あるいはグルテンを無毒性断片に加水分解してもよい。本明細書で使用される場合、グルテンの無毒性断片への加水分解は、グルテンのグリアジン画分が加水分解されることを意味する。
好ましくは、ビールの製造方法における固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼのインキュベートは、−1〜20℃の温度、例えば0〜15℃の温度、または1〜10℃の温度、または2〜8℃の温度で実施される。意外にも、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼはグルテンを加水分解可能であり、これらの低い温度でビール中のヘイズを低減できることが分かった。
ビールを固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートすることは、バッチモードまたは連続モードで実施され得る。プロリン特異的エンドプロテアーゼのインキュベートが連続モードで実施される場合、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼをカラムに充填することができ、このカラムは、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼを保持し、ビールがカラム中を流れることを可能にする。適切なカラムは、カラムの上部および底部に篩を含むことができる。ビール中の不溶性材料の量に応じて、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼは流動床カラムまたは充填床カラムに充填され得る。このようなカラムの調製は当業者に知られている。好ましくは、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと接触させる際、ビールは透明な液体である。
安定化の後、ビールは、瓶、缶または樽にパッケージングすることができる。
別の実施形態では、本開示は、グルテンの加水分解のための固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼの使用に関する。好ましくは、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼは、ビールの製造方法において使用される。
[実施例]
[材料および方法]
[プロリン特異的エンドプロテアーゼ(EndoPro)]
アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)プロリン特異的エンドプロテアーゼ(EndoPro)は、当該技術分野において既知の方法によって、プロリン特異的エンドプロテアーゼ(GI:21725363;タンパク質受入番号:AX458699)をコードする遺伝子を含有するA.ニガー(niger)株を発酵させることにより作製した。アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)株の発酵後に得られた発酵ブロスをさらに限外ろ過に提出した。最終EndoProサンプルにおけるプロリル特異的活性は12.4PPU/mlであり、40%のジオキサンを含有する0.1Mのクエン酸/0.2Mのリン酸二ナトリウム緩衝液(pH4.6)中2mMのN−カルボベンゾキシ−グリシン−プロリン−p−ニトロアニリド(Z−Gly−Pro−pNA)を用いて決定された。
[材料および方法]
[プロリン特異的エンドプロテアーゼ(EndoPro)]
アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)プロリン特異的エンドプロテアーゼ(EndoPro)は、当該技術分野において既知の方法によって、プロリン特異的エンドプロテアーゼ(GI:21725363;タンパク質受入番号:AX458699)をコードする遺伝子を含有するA.ニガー(niger)株を発酵させることにより作製した。アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)株の発酵後に得られた発酵ブロスをさらに限外ろ過に提出した。最終EndoProサンプルにおけるプロリル特異的活性は12.4PPU/mlであり、40%のジオキサンを含有する0.1Mのクエン酸/0.2Mのリン酸二ナトリウム緩衝液(pH4.6)中2mMのN−カルボベンゾキシ−グリシン−プロリン−p−ニトロアニリド(Z−Gly−Pro−pNA)を用いて決定された。
1mlのこの緩衝液(pH4.6)に、250μlの基質溶液を添加した後、100μlの酵素溶液を添加した。反応混合物を37℃でインキュベートし、Tecan Genios分光光度計を用いて遊離pNAの放出を405nmにおいて分光光度的に測定した。活性は、プロリンプロテアーゼ単位(PPU)で表される。1PPUは、記載される検定条件下で1分間にZ−Gly−Pro−pNAから1μmolのpNAを放出させるために必要とされる酵素の量であると定義される。濃度を計算するために、10500M−1cm−1のモル吸光係数を使用した。
タンパク質濃度は、Kjeldahlを用いて決定された146mg/gであると推定した。
[酵素担体]
EndoProの固定化のためにPurolite ECR酵素担体を使用した。担体の主要な特性は表1に要約される。
EndoProの固定化のためにPurolite ECR酵素担体を使用した。担体の主要な特性は表1に要約される。
[全窒素の決定]
Kjeldahlを用いてサンプルの全窒素(N)を決定した(Bradstreet,Raymond B.“The Kjeldahl method for organic nitrogen.”(1965))。Mettler Tolodo HB43−S(ハロゲン)を用いる測定の前に固定化酵素を有するビーズを乾燥させた。6.25*Nの変換係数を用いてタンパク質を計算した。
Kjeldahlを用いてサンプルの全窒素(N)を決定した(Bradstreet,Raymond B.“The Kjeldahl method for organic nitrogen.”(1965))。Mettler Tolodo HB43−S(ハロゲン)を用いる測定の前に固定化酵素を有するビーズを乾燥させた。6.25*Nの変換係数を用いてタンパク質を計算した。
[麦芽汁中のグリアジン含量の決定]
グリアジン含量は、グルテン含量の尺度として決定した。麦芽汁中のグリアジンの分析的検出は、RIDASCREEN(登録商標)グリアジン競合的ELISAキット(R−Biopharm)を用い、製造業者の説明書に従って決定した。この方法はR5抗体(Mendez)に基づいており、Codex Alimentarius(CODEX STAN 118−1979)によって推奨される。定量限界はグリアジン5ppm(=グルテン10ppm)である。
グリアジン含量は、グルテン含量の尺度として決定した。麦芽汁中のグリアジンの分析的検出は、RIDASCREEN(登録商標)グリアジン競合的ELISAキット(R−Biopharm)を用い、製造業者の説明書に従って決定した。この方法はR5抗体(Mendez)に基づいており、Codex Alimentarius(CODEX STAN 118−1979)によって推奨される。定量限界はグリアジン5ppm(=グルテン10ppm)である。
一般に、グリアジン含量に係数2を乗じることによって、グリアジン含量はグルテンに変換され得る。しかしながら、原材料においてグルテンに関するグリアジン画分は異なり得るので、この値は絶対的ではない(Diaz−Amigo & Popping,Journal of AOAC International,Vol.95,No.2,2012)。
[ビール中のグリアジン含量の決定]
ビール中のグリアジンの分析的検出は、RIDA(登録商標)QUICKグリアジンキット(R−Biopharm)を用い、製造業者の説明書に従って決定した。この方法はR5抗体(Mendez)に基づいており、Codex Alimentarius(CODEX STAN 118−1979)によって推奨される。検出限界は、グリアジン2.5ppm(=グルテン5ppm)である。
ビール中のグリアジンの分析的検出は、RIDA(登録商標)QUICKグリアジンキット(R−Biopharm)を用い、製造業者の説明書に従って決定した。この方法はR5抗体(Mendez)に基づいており、Codex Alimentarius(CODEX STAN 118−1979)によって推奨される。検出限界は、グリアジン2.5ppm(=グルテン5ppm)である。
[実施例1.異なるPurolite(登録商標)担体におけるEndoProの固定化]
EndoProの固定化の前に、Purolite(登録商標)担体ECR8310、−8319および−8417を、0.02MのK−リン酸緩衝液(pH8.0)中2%のグルタルアルデヒド(v/v)により1時間予め活性化した後、同じ緩衝液により未反応グルタルアルデヒドを3回洗い流した。Purolite ECR8214担体は、活性化を必要としなかった。ECR8214ビーズは、同じ緩衝液により3回洗浄しただけで、そのまま使用した。最後に、ガラスフィルタを用いてビーズをろ過し、半乾燥ビーズを使用するまで貯蔵した。固定化のために、1/10(w/v)のビーズ/緩衝液比でビーズを緩衝液と混合し、表2に示されるような酵素負荷で可溶性EndoProをビーズ/緩衝液混合物に添加した。
EndoProの固定化の前に、Purolite(登録商標)担体ECR8310、−8319および−8417を、0.02MのK−リン酸緩衝液(pH8.0)中2%のグルタルアルデヒド(v/v)により1時間予め活性化した後、同じ緩衝液により未反応グルタルアルデヒドを3回洗い流した。Purolite ECR8214担体は、活性化を必要としなかった。ECR8214ビーズは、同じ緩衝液により3回洗浄しただけで、そのまま使用した。最後に、ガラスフィルタを用いてビーズをろ過し、半乾燥ビーズを使用するまで貯蔵した。固定化のために、1/10(w/v)のビーズ/緩衝液比でビーズを緩衝液と混合し、表2に示されるような酵素負荷で可溶性EndoProをビーズ/緩衝液混合物に添加した。
室温で連続して一晩振とうさせた後、0.1MのNaOAc(pH5.0)によりビーズを3回洗浄した。最後に、固定化EndoProを含有するビーズを同じ緩衝液中に懸濁させ、4℃で貯蔵した。
[実施例2.4つの異なるPurolite担体に固定化されたEndoProの酵素活性]
EndoPro活性は、アセタート−アラニン−アラニン−プロリン−p−ニトロアニリン(Ac−AAP−pNA)を基質として用いて、OD405nm/分として決定した。時間内に形成された遊離p−ニトロアニリン(pNA)の量はEndoPro活性の尺度であり、Tecan GENios分光光度計を用いて405nmにおいて分光光度的に決定した。
EndoPro活性は、アセタート−アラニン−アラニン−プロリン−p−ニトロアニリン(Ac−AAP−pNA)を基質として用いて、OD405nm/分として決定した。時間内に形成された遊離p−ニトロアニリン(pNA)の量はEndoPro活性の尺度であり、Tecan GENios分光光度計を用いて405nmにおいて分光光度的に決定した。
非固定化Endoproまたは4つのPurolite(登録商標)担体の1つに固定化された固定化Endoproを、マイクロタイタープレート内の0.1MのNaOAc(pH5.0)に添加した。0.1MのNaOAc(pH5.0)中の3mMのAc−AAP−pNA(最終濃度)ストックを添加する前に、酵素を40℃で5分間インキュベートした。動的測定を開始し、曲線の勾配から活性を計算した。酵素の活性は、基質Ac−AAP−pNAからの遊離pNAの結果として、時間内の405nmにおける吸光度の増大として決定される(OD405nm/分)。
図1は、Purolite(登録商標)担体ECR8310、−8319および−8417に固定化されたEndoproが活性を示したことを実証する。Purolite(登録商標)担体ECR8214に固定化されたEndoProについては、活性は検出されなかった。従って、この特定の調製物のさらなる研究は実施しなかった。
[実施例3.固定化EndoProを用いることによる麦芽汁からのグリアジンの除去]
Purolite(登録商標)担体ECR8310、−8319および−8417に固定化されたEndoproがグルテンに対して同様に活性であるかどうかを試験するために、15mlの反応管において、10mlの麦芽汁に0.05mgの酵素、固定化および遊離EndoPro(対照)をそれぞれ添加した(Research Brewery St.Johann,Train−St.Johann,Germany;Batch number:4/2013)。
Purolite(登録商標)担体ECR8310、−8319および−8417に固定化されたEndoproがグルテンに対して同様に活性であるかどうかを試験するために、15mlの反応管において、10mlの麦芽汁に0.05mgの酵素、固定化および遊離EndoPro(対照)をそれぞれ添加した(Research Brewery St.Johann,Train−St.Johann,Germany;Batch number:4/2013)。
混合物を室温で一晩振とうさせた。翌日、方法において記載されるプロセスにより麦芽汁中のグルテン含量を決定した。図2の結果は、麦芽汁中の残留グリアジン含量を示す。
本発明者らは、実施例1において記載されるプロセスに従ってPurolite(登録商標)ECR8319担体に固定化されたとき、固定化EndoProが大きいタンパク質基質に対して最良の活性を有することを見出した。比較して、異なる条件(pH8.2、モル濃度35mM、酵素負荷80mg/g担体)下で同じ担体に固定化されたとき、グルテンに対して約半分の活性しか得られなかった(データは示さず)。
[実施例4.40℃に対して4℃における固定化および遊離EndoProの相対活性]
40℃における活性と比べて、4℃の相対活性を決定するために、非固定化および固定化EndoPro Purolite(登録商標)ECR8319(上記のように固定化された調製物)酵素を、3mMのAc−AAP−pNAを含む全容積が1mlの0.1MのNaOAc(pH5.0)に添加した。温度調節ミキサー(Eppendorf)において反応混合物を900rpmで振とうさせた。上澄みサンプルを1分毎にとり、0.5MのHCl(サンプル/HCl比 50/1(v/v))により反応を停止した。405nmにおける吸光度は、Tecan GENios分光光度計を用いて測定した。4℃における傾斜(OD405nm/分)を、最適活性温度40℃における傾斜と比較した。固定化Endoproの絶対的な活性は、4℃および40℃においてそれぞれ0.53および1.85OD405nm/分であり、非固定化Endoproはそれぞれ0.06および0.65OD405nm/分であった。40℃の活性を100%に設定した。
40℃における活性と比べて、4℃の相対活性を決定するために、非固定化および固定化EndoPro Purolite(登録商標)ECR8319(上記のように固定化された調製物)酵素を、3mMのAc−AAP−pNAを含む全容積が1mlの0.1MのNaOAc(pH5.0)に添加した。温度調節ミキサー(Eppendorf)において反応混合物を900rpmで振とうさせた。上澄みサンプルを1分毎にとり、0.5MのHCl(サンプル/HCl比 50/1(v/v))により反応を停止した。405nmにおける吸光度は、Tecan GENios分光光度計を用いて測定した。4℃における傾斜(OD405nm/分)を、最適活性温度40℃における傾斜と比較した。固定化Endoproの絶対的な活性は、4℃および40℃においてそれぞれ0.53および1.85OD405nm/分であり、非固定化Endoproはそれぞれ0.06および0.65OD405nm/分であった。40℃の活性を100%に設定した。
図3は、4℃における固定化EndoProの相対活性が非固定化EndoProの相対活性よりも3倍高いことを示す。
[実施例5.4℃および15℃における固定化EndoProによるビール中のグリアジンの変換]
実施例1に記載される、Purolite(登録商標)ECR8319調製物に固定化された3つの異なる容積の固定化EndoPro(表3)を、ピペットで50mlのビールに入れた(Research Brewery St.Johann、Train−St.Johann,Germany;Batch number:42/2012)。ローラー−ミキサーにおいて、混合物を4℃および15℃でそれぞれインキュベートした。1mlのビールサンプルを、0.5、1、19および24時間後に取り出した。サンプル中の残留グリアジンは、方法において記載されるプロセスによって決定した。結果は表3に示され、ビール中のグリアジンの低減が示される。全体的に見て、固定化EndoProは、4℃の温度において、15℃と同一または同様の程度までビール中のグリアジンを分解することができる。24時間後、グリアジンは全てのサンプルで検出できない限界(LOD2.5ppm)まで分解された。より高い用投与量の固定化EndoPro(10ml)を用いることにより、グリアジンは、1時間のインキュベーション後でも、検出できない限界まで分解され得る。
実施例1に記載される、Purolite(登録商標)ECR8319調製物に固定化された3つの異なる容積の固定化EndoPro(表3)を、ピペットで50mlのビールに入れた(Research Brewery St.Johann、Train−St.Johann,Germany;Batch number:42/2012)。ローラー−ミキサーにおいて、混合物を4℃および15℃でそれぞれインキュベートした。1mlのビールサンプルを、0.5、1、19および24時間後に取り出した。サンプル中の残留グリアジンは、方法において記載されるプロセスによって決定した。結果は表3に示され、ビール中のグリアジンの低減が示される。全体的に見て、固定化EndoProは、4℃の温度において、15℃と同一または同様の程度までビール中のグリアジンを分解することができる。24時間後、グリアジンは全てのサンプルで検出できない限界(LOD2.5ppm)まで分解された。より高い用投与量の固定化EndoPro(10ml)を用いることにより、グリアジンは、1時間のインキュベーション後でも、検出できない限界まで分解され得る。
[結論]
実施例1〜5に示される結果は、本発明に従う固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼが、グルテンなどの複雑な基質を変換可能であることを示す。
実施例1〜5に示される結果は、本発明に従う固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼが、グルテンなどの複雑な基質を変換可能であることを示す。
Claims (15)
- プロリン特異的エンドプロテアーゼが、ジメチレンで官能基化されたメタクリレートを含む担体に固定化された、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼ。
- 前記担体が100〜400μmの粒径範囲を有する、請求項1に記載の固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼ。
- 前記担体が1500〜2100Åの細孔径分布d50を有する、請求項1または2に記載の固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼ。
- プロリン特異的エンドプロテアーゼがアスペルギルス属(Aspergillus)、好ましくはアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)に由来する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼ。
- アミノ官能基化メタクリレート担体中のアミノ基を二官能性架橋剤により活性化するステップと、前記プロリン特異的エンドプロテアーゼを前記担体に固定化するステップと、前記固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼを製造するステップとを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼの製造方法。
- 前記プロリン特異的エンドプロテアーゼが、0.01〜0.07w/wの酵素:担体比で前記担体に固定化される、請求項5に記載の方法。
- 前記二官能性架橋剤がグルタルアルデヒドである、請求項5または6に記載の方法。
- 前記固定化ステップが10〜50℃の間の温度で実施される、請求項5〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固定化ステップが6〜8のpHで実施される、請求項5〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固定化ステップが4〜48時間の間で実施される、請求項5〜9のいずれか一項に記載の方法。
- a.マッシュを調製するステップと、
b.ビールを発酵させるステップと、
c.前記ビールを安定化させるステップと
を含むビールの製造方法であって、前記ビールが請求項1〜4のいずれか一項に記載の固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートされて、ビールが製造される方法。 - 固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼが、ビールを安定化させている間、または安定化させた後にインキュベートされる、請求項11に記載の方法。
- 前記インキュベーションが0〜20℃の間の温度で実施される、請求項11または12に記載の方法。
- 前記インキュベートステップがグルテンの加水分解を含む、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
- グルテンを無毒性断片に加水分解させるための、請求項1〜4のいずれか一項に記載の固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼの使用。
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