CZ250398A3

CZ250398A3 - Způsob výroby fermentovatelné sladiny

Info

Publication number: CZ250398A3
Application number: CZ982503A
Authority: CZ
Inventors: Marie-Paule Laroye; Jerome Souppe
Original assignee: Gist-Brocades B. V.
Priority date: 1996-02-12
Filing date: 1997-02-12
Publication date: 1999-01-13
Also published as: HK1018625A1; AU1873197A; BG102684A; YU33998A; BR9707404A; CA2245856A1; KR19990082497A; HUP9901003A3; CN1211275A; SK108698A3; PL328304A1; CN1285396A; CN1064398C; UY24458A1; WO1997029179A1; JP2000504571A; HUP9901003A2; EP0896613A1; AP9801316A0; EA199800711A1

Description

Tento vynález se týká úpravy fermentovatelné sladiny z obilných zrn, zejména z nesladových obilných zrn. Rovněž se vynález týká sladiny vyrobené tímto postupem. Vynález se dále týká fermentace sladin získaných podle vynálezu v průmyslu výroby alkoholu, v 1ihovarnickém průmyslu nebo při vaření piva.

Dosavadn í stav Lechni ky

Pivo nes1adových a zcukerňují za pomoci se získává a aminokyseliny nebo jako FAN - Freely se vyrábí fermentací buď sladových nebo zrn. Ve druhém případě se zrna zkapalňujl obvyklých přídavných enzymů, přičemž která obsahuje fermentovatelné cukry jiné formy dusíku (celkově počítaného Available Nitrogen - volně dostupný sladina, dusík), který je nezbytný pro fermentaci kvasinkami.

Např. MacFadden a další (MacFadden, D.P. and Clayton,

M. Brewing and Bewerage Industries International (1989), 1, 77-81) navrhují při vaření piva přidat enzymy z nesladového čiroku , jako např. alfa-amylázu, proteázu, beta-glukanázu, cellulázu, houbovou alfa-amylázu, ’ amyloglukosidázu a další. MacFadden a další také při fermentaci doporučují, je-li použit nesladový čirok, přidat pro kvasinky živné látky.

Bajomo a další (M.F. and Young, T.W., J.Inst. Brew.(1992) 98, 515-523; Bajomo, M.F. and Young, T.W.J.

• · · · · · ·· · ·· ·· ··

Inst. Brev. (1994) 1OO, 79-84, 3) hovoří o vaření piva ze 100% nesledových čirokových zrn navzdory faktu, že hladina FAN přítomná ve sladině nesladového čiroku (51 mg/1) je o hodně nižší než je hodnota základu pro fermentací sladiny připravené ze sladového ječmene.

V mezinárodni patentové přihlášce WO 92/20777 je popsán postup výroby ethanolu, jenž zahrnuje zkapalnění celé nesladové kukuřice nebo obecného čiroku pomocí amylázy, následuje zcukernění rmutu pomocí glukoamylázy a kyselé houbové proteázy. Postup zahrnuje krok přidáváni proteázy během fermentace jakož i během zcukerňovánl. Hodnota pH prostředí fermentace je v rozsahu 4-5, čímž se mini, že houbové exo-peptidázy nejsou aktivní (Labbe, J.P. , Rebeyrotte, P. Biochemie (1974) 56, 839-844, Lehman, k. und Uhlig, H. Hoppe Seyler s 2. Physiol. Chem. (1969) 350, 99-104). Nevýhodou výše uvedeného postupu je, že za těchto podmínek přítomné houbové proteázy vykazují pouze endoproteolýzu, čímž se vytvářejí hlavně oligopeptidy a málo vo1ných am i nokyse1 i n.

K celkovému přehledu oblasti techniky je potřeba zmínit zprávu Palmera (G.H. Cereal Science and Technology. In’· Cereal Science and Technology. (1989) ed. Aberdeen University Press, Aberdeen, Scotland, 61-242).

Podstata vynálezu

Te_nt_O vynález zahrnuje postup na získání sladiny z nesladových obilných zrn s neočekáváte1ně dobrými vlastnosti sladiny, jako je např. vysoké množstvi dosažitelného dusíku (zde počítaného jako FAN), dobrá fi 1trovatelnost a výtěžek získané sladiny. Postup může být

také využit na výrobu sladin ze sladových obilnin, ale konkrétně je výhodný na výrobu sladin z nesladových zrn, jako je např. nesladový čirok, nebo směs nesladového čiroku a kukuřice. Uváděné výhody jsou také v existenci sladin, jež jsou vyrobeny ze sladových obilnin (jako je sladový ječmen) v kombinaci s nesladovými obilninami (jako je kukuřice, rýže nebo čirok), ješ jsou nazývány jako směsná várka.

Vynález tedy poskytuje postup výroby fermentovatelné sladiny z obilných zrn a zahrnuje kroky:

(a) zkapalnění obilného materiálu s přídavkem spolupůsobící cí-amylázy a/nebo endoproteázy k získání zkapalněného rmutu (b) zcukernění uvedeného zkapalněného rmutu v přítomnosti tf-amylázy, (c) filtraci kapalného a zcukerněného rmutu k získání fermentovatelné sladiny, kde alespoň jeden z výše uvedených kroků (a) a (b) se uskutečňuje v přítomnosti enzymu s exo-peptidickou aktivitou. Vhodnými enzymy s exo-peptidickou aktivitou jsou exopeptidázy, např. houbové aminopeptidázy, ale také teplotně stabilní karboxy-peptidázy. Konkrétně výhodné podle vynálezu jsou aminopeptidázy endogenní k houbám Aspergillus, konkrétněji k houbám A. niger, A. oryzae, A. sojae.

Pro postup jsou konkrétně vhodná obilná zrna, která jsou tvořena z alespoň 20 % nesladovou obilninou, výhodně z více jak 50 % nesladovou obilninou, což jsou např.

čiroková obilná zrna doplněná nesladovými klasy kukuřice, rýží nebo jinými - nesladovými obi lninam i . Je zjištěno, že podle vynálezu je velice výhodné, probíhá-li zkapalňování obilných zrn za přítomnosti exopeptidázy.

Podle další stránky vynálezu se poskytuje to to fermentovatelná sladina, která se získá postupem podle vynálezu. Ještě další stránkou vynálezu je postup vaření piva, vyznačující se tím, že se použije fermentovatelná sladina získaná podle vynálezu.

Dále se poskytuje postup na výrobu alkoholického nápoje, např. piva, jenž zahrnuje kroky k výrobě sladiny s použitím postupu podle vynálezu a následně, nebo simultánně, fermentaci uvedené sladiny, čímž se získá např. pivo.

Podle jiného provedení, se poskytuje postup k enzymaticky uvolni telnému volně dostupnému dusíku z obilnin, které obsahují vysoké množství glutelinu a/nebo prolaminu, jenž zahrnuje krok přídavku endoproteázy a exo-peptidázy k zrnům nebo ke zkapalněnému rmutu získaného z uvedených zrn.

Při dalším provedení se poskytuje postup výroby alkoholu, který zahrnuje krok fermentace FAN, získaného postupem podle vynálezu za přítomnosti kvasinek schopných vytvářet alkohol.

Přehled obrázků na výkrese

Vynález je objasněn na následujících obrázcích.

Obr.1 znázorňuj e ' diagram pH 1euc ih-am i nopepti dázy

Aspergi 21us niger

Obr.2 znázorňuje diagram pH fenylalanin-aminopeptidázy Aspergi 11us niger

Obr.3 znázorňuje teplotní diagram obou aminopeptidáz

Vynález bude objasněn dále podrobněji.

Postup poskytuje přípravu fermentovatelné sladiny z obilnin, za podmínky, že je přítomen alespoň jeden protein s exo-peptidickým účinkem. Vhodné jsou aminopeptidázy endogenní k houbám obzvláště k Aspergilli, jež jsou při pH 5 až 8 dostatečně stabilní a s dostatečnou aktivitou, což je během zkapalňování. a pH méně vhodné. Př i zkapa1ňuj i c i mu kroku asi oblast, kam pH klesne Kaboxypeptidázy jsou při této teplotě zcukerňujícím kroku převládá proti mírně kyselejší prostředí, a proto se zde s výhodou použije karboxy-peptidáza, která zajišťuje, že prostředí je dostatečně stabilní v rozmezí teplot 50 - 60 °C, výhodně při 50 - 70 °C.

<;

Přítomnost exopeptidáz podle tohoto vynálezu nevede pouze ke zvýšení ve sladině volně dostupného dusíku (FAN), ale také ke zlepšení fi 1trovatelnosti a výtěžku sladiny ve srovnání s postupem kde se exopeptidázy nepoužívají.

Předností postupu podle vynálezu je konkrétně příprava fermentovatelné sladiny z nesladových obilnin, konkrétněji nesladového čiroku, jenž je volitelně doplněn jiným obilným materiálem, např. kukuřicí, pšenicí, ovsem nebo rýží. Obilniny v kontextu tohoto vynálezu zahrnují čirok, pšenici, ječmen, oves, rýži a kukuřici a podobně.

Přítomnost exopeptidáz podle tohoto vynálezu je výhodná v případě tak směsných várek, kde se pravidelně používají sladové obilné suroviny jakož i nesladové obilné suroviny (např. které mají více než 80 %, nebo dokonce více než 90 % sladových obilnin, zůstatek tvoří nesladové

obilniny), jako bylo zjištěno, že exopeptidázy mají pozitivní vliv na organoleptické vlastnosti (tj. chuť a/nebo vůni). Předpokládá se, že tyto výhody jsou společné při vaření piva z nesledových jakož i sladových obilnin, jakož i při jejich vzájemných směsi.

Obilniny, u nichž je použití exopeptidáz konkrétně výhodné z hlediska FAN, fi 1trovatelnosti, výtěžku a organoleptických vlastností mají relativně vysoké podíly proteinů prolaminu a glutelinu. Mimo čiroku spadá do této kategorie také rýže (s asi 80 % glutelinu). Je-li použit čirok, měla by se věnovat pozornost vybraným odrůdám, které mají relativně nízký obsah polyfenolu.

Nehledě k přídavku exopeptidáz, se příprava sladiny např. pro vaření piva, může provádět obvyklými způsoby. Všeobecně příprava zahrnuje zkapalnění obilné suroviny k získání rmutu s následným zcukerněním rmutu a za obdržení sladiny. Důležitá je filtrace, má před fermentaci přednost.

Zkapalňující krok obvykle zahrnuje rozmělnění obilné suroviny k získání mouky s vhodnou velikostí částic, jež se hydratuje od asi 1 do asi 4, výhodně asi 3 díly vody a volitelně v závislosti na použité endoproteáze s od asi 50 do asi 300 ppm vápníku, výhodně s 200 ppm Ca²⁺. Ukazuje se, že enzymy Bacillus slearolhermophilus snižují závislost na vápníku. V tomto případě se žádná další doplnění iontů Ca²⁺ nevyžadují. Velikost částic rozmělněných obilnin by neměla překročit asi 3 mm: množství částic s velikostí větší jak 1,3 mm by nemělo být větší jak 3,5 %i menších částic než 0,25 mm by nemělo být více jak 1,5 %. Kromě toho mohou být přítomny enzymy jako cellulázy, p-glukanázy a nebo jiné enzymy odbourávající stěnu rostlinné buňky.

pH zkapalňujícího prostředí je obvykle upraveno na hodnotu mezi asi 5a 8, výhodně mesi asi 6a 7, což se zajišťuje např. pomocí hydroxidu vápenatého. Důležité je přidat d-amylázu, výhodně se přidá do zkapalňujícího prostředí termostabi lni cf-amyláza jakož i endoproteása v dávce, která je nezbytná pro alespoň částečné skapalněnl obilného škrobu, a pro alespoň částečné odbourání proteinu. Vhodná dávka oc-amylázy je od asi 0,5 do 2,0, výhodně asi 1 - 1,5 kg / Tunu, je-li použito B.A.T.S. V případě Brewers Protease 2000 je vhodná dávka proteásy vyšší než 0,5 kg/Tunu srn (kg/T), výhodně vyšší než 1 kg/T. V případě Panstimásy 400 by se měla použít dávka vyšší než 2 kg /T, výhodně vyšší než 5, nejvýhodněji vyšší než 10 kg/T.

Během skapalňování obvykle určitý počet kroků probíhá při svýšené teplotě: po přídavku «x-amylázy a proteásy se směs udržuje při teplotě mesi asi 40 °C a 65 °C, výhodně mesi asi 45 a 55 °C a nejvýhodněji při 50 °C, dokud se nedosáhne nesbytného skapalnění. Čas dostatečný k proreagování sávisí na použité obilnině nebo směsi obilnin, ale obvykle trvá od asi 30 min. až do asi 2 hodin. Následně se teplota postupně svyšuje, rychlost zvyšování teploty není kritická až do teploty asi 90 - 95 °C a při této teplotě se směs nechá reagovat po dobu asi 30 min. do asi 1 hodiny. Poté se směs ochladí na teplotu zcukerňování: obvykle při teplotě asi 50 °C do asi 70 °C, výhodně mesi asi 55 °C a 65 °C, nejvýhodněji při asi 60 °C, Při zcukerňujícím kroku je v sávis1osti na teplotní stabi i i tě enzymů, možné použít mírně vyšší teplotu. Když se dosáhne potřebné teploty, přidají se zcukerňující enzymy, např. Brewers Fermex (ot-amyláza) nebo Novamyl (rekombinantní p-amyláza) v množství, které je obvykle v rozsahu od asi 400 g/T do asi

kg/T pro Brewers Fermex. Glukoamylázy se používají také často. Zcukerňující fáze trvá od asi 30 min do asi 2 hodin, načež teplota stoupá na asi 75 °C do asi 85 °C mezi jiným k inaktivaci enzymů a nechtěných organizmů, a udržuje se výhodně při zvýšené teplotě po dobu 10 min; délka doby není příliš kritická.

Tímto způsobem získaný rmut se následně filtruje na zařízení dobře známém ze stavu techniky; pomocí nálevky s vloženým filtračním papírem Schleicher x Schuell, jenž je pro tento účel dostačující. Po filtraci se sladina fermentuje vhodnými kvasinkami v závislosti na použitém kmenu a na konečném úmyslu; kromě toho vaření piva, výroba alkoholu s jeho využitím jako biopaliva nebo jako alkoholického nápoje se chápe jako samostatný vynález. Vhodné kmeny kvasinek a vhodné podmínky fermentace jsou dobře známé osobám obeznámeným se stavem techniky.

Bylo zjištěno, že aplikace exo-peptidázy během zkapalňujicího kroku obilné suroviny přípravy sladiny, např. při vaření piva je obzvláště výhodná. Avšak ve srovnání s tím, že exo-peptidáza není přítomná, vede její přídavek během zcukerňujícího kroku také k již zmíněným výhodám, jako jsou vyšší úrovně FAN, zlepšená fi 1trovatelnost a vyšší výtěžek sladiny.

Postup podle vynálezu bere do úvahy fázi, kde pH a teplota prostředí dovolují, aby byly houbové exo-peptidázy akt ivni. Jako vhodné exo-peptidázy jsou tyto endogenní houby obecně, konkrétněji jde o species ňspergillus. Je známo, že aminopeptidázy Aspergi 11us species, zahrnující A. niger, A. sojae a A. oryzae, jsou zde obzvláště vhodné.

• · · • ·· ft • · ·

Jak bude vyjasněno 2 výše uvedeného popisu přídavek enzymů, který demonstruje účinek exo-pepti dázy během zkapalňujícího a/nebo zcukerňujičího kroku přípravy sladiny, produkuje sladiny s dobrou fi 1trovatelností, vysokým výtěžkem a vysokou hodnotou FAN. To jej předurčuje využít k vaření piva, k výrobě alkoholických nápojů (lihovin) a k výrobě alkoholu (jako biopaliva) z obilnin s významným procentickým zastoupením nesladových obilnin, nebo dokonce výhradně z nesladových obilnin. Řešeni je velmi výhodné dále pro nápoje vařené v zemích, kde je omezen dovoz sladin, nebo kde je ekonomicky nevýhodný. Obzvláště jde o Afriku, kde se vyrábí pivo z (ze směsí) obilné suroviny, která zahrnuje velké procento čiroku.

Kromě toho je známo, že se zlepšily organoleptické vlastnosti (chuť a vůně) piv vyráběných ze sladiny, kde se při zkapalňujícím kroku nebo při zcukerňujícím kroku (nebo při obou) použily exo-peptidázy. Předpokládá se, že se této výhody docílí, jsou-li použity exo-peptidázy při výrobě piva ze sladových obilnin, tedy např. z tradičních sladin ječmene, nebo při výrobě piva ze směsných várek (t.j. kombinací sladových a nesladových obilnin).

Příklady provedení

A._Termostabi lni ot-amyláza (zkapalněni) ct- amyláza, použitá při zkapalňujícím kroků postupu podle vynálezu je obecně enzym, který štěpí oc-1,4 glukózo-glukózové vazby škrobu. Je vybrána z termostabi1nich <ť-amyláz. Velmi dobré výsledky se mohou dosáhnout pomocí cf-amylázy Bacillus 1 icheniformis, jenž je obchodně dostupná ··

- ΙΟ od Gist-Brocades pod obchodní značkou Brewers Amyl iq Thermo Stable <B.A.T.S.) .

B ._Endoprotežza (zkapalnění)

Endoproteáza, použitá při zkapalňujícím kroku postupu podle vynálezu je obecně enzym, který štěpí peptidické vazby a teplotě na počátku zkapalňujícího °C). Velmi dobrých výsledků se může neutrální proteázy Bacillus dostupná od Protease 2000.

proteinů při určitém pH kroku (pH 5-6; t° 45-55 dosáhnout pomoci anylol iquefaciens, jenž je obchodně

Gist-Brocades pod obchodní značkou Brewer s

Mohou se také použít enzymy SLrepLomyces fradiae, jenž jsou obchodně dostupné od Panštimase SARL pod obchodní značkou Panštimase 400.

C._Exo-peptidázy (zkapalněni a/nebo zcukerněni)

Exo-peptidázy, použité při zkapalňujícím kroku postupu podle vynálezu jsou obecně enzymy, které štěpí N-koncové vazby peptidů nebo proteinů. Velmi dobrých výsledků se může dosáhnout pomocí preparátů Aspergi1lus species. Dále se popisuje způsob získání aminopeptidáz z Aspergi1lus nigex.

C.1 Stanoven1 enzymat i ckých akt i v i t

Aktivita exo-peptidázy je vysvětlena pomocí jednotky Leucin aminopeptidázy nebo jednotky Fenylalanin am i nopept i dázy:

jednotka Leu-AP je množství enzymu potřebného k vytvoření 1 pmolu p-nitroanilinu za minutu při pH 7,2 a při teplotě 20 °C z L-leucin-p-nitroani1idu χ jednotka Fenylalanin aminopeptidáza jednotka Phe-AP je množství enzymu potřebného k vytvoření 1 umolu p-nitroani1 inu za minutu při pH 7,2 a při teplotě

°C z L-fenylalanin-p-nilroani1idu.

C.l.l. - Fenylalanin-aminopeptidáza (Phe-AP)

V 7,5 mM HC1 byl rozpuštěn fenylalaninparanitroani1id s výslednou koncentrací 0,9 mM. 1 ml tohoto roztoku substrátu byl smísen s 1,5 ml O,1M roztokem fosfátového pufru o pH 7,2. V čase t=0, se k roztoku přidalo 0,5 ml enzymu a ponechalo se při teplotě 20 °C reagovat. Po 15 minutách byl přidán 1 ml IN HC1. S IN HC1 byl proveden slepý pokus, když kyselina byla přidána v čase t=o. Pro slepý pokus (ODsiepý) a pro vzorek (ODvzorek) byla stanovena optická hustota/absorbance při 400 nm. Aktivita byla spočítána následovně:

(ODvzorek “ ODsiepý) 4

A = ------------------------ x ---- Phe-AP/ml

9,8 x 15 0,5

C.1.2 - Leucin-aminopeptidáza (Leu-AP)

Leucinparanitroani1id byl rozpuštěn ve vodě s výslednou koncentrací 9 mM. 1 ml tohoto roztoku substrátu byl smísen s 1,5 ml fosfátového pufru o pH 7,2. V čase t=0 bylo k roztoku přidáno 0,5 ml enzymu a ponecháno reagovat při teplotě 20 °C. Po 15 min. byl přidán 1 ml IN HC1. S IN HC1 byl proveden slepý pokus, když kyselin byla přidána v čase t = 0. Pro slepý pokus (ODsiepý) a pro vzorek (ODvzorek) byla stanovena optická hustota/absorbance při 400 nm. Aktivita byla spočítána .následovně :

(ODvzorek ~ ODsiepý)

------------------------ _x

9,8 x 15

Leu-AP/ml 0, 5 fl· • · • 1 • flfl · • ·

C.1.3 - Endoproteáza(PU)

Tato aktivita se měří hydrolýzou kaseinu při pH 6,0, teplotě 40 °C po dobu 1 hod. 1 PU je množství enzymu potřebné k uvolnění ekvivalentu 1 pmolu tyrosinu za 1 minutu po sraženi zbylých proteinů pomocí kyseliny trichloroctové.

kvasnic, 4 g/ 1 g/1 síranu

C.2 - Tříděni kmenů Asper<g i 11 us niger

200 kmenů Aspergi 11us niger izolovaných z různých zdrojů nebo získaných ze souboru kultur, byly vypěstovány v živném prostředí , které obsahuje 15 g/1 mouky, 20 g/1 baktopeptonu, 7 g/1 kvasinkového extraktu z dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 hořeónatého, 0,5 g/1 chloridu vápenatého, 0,5 g/1 chloridu zinečnatého a při pH 4,8. Po 24 hod. předpěstování při 240 rpm a při teplotě 30 °C a po 96 hod. pěstování při 275 rpm a při teplotě 30 °C byla kapalina nad sedlinou jímána a vzorkována na leucin-, fenylalanina valin-aminopeptidázovou aktivitu, jak bylo popsáno výše. Několik kmenů Aspergi 11us niger vykázalo vysokou tvorbu potenciálů k alespoň jedné z těchto enzymových aktivit , jak ukazuje Tabulka 1 (každá hodnota je souborem hodnot ótyř samostatných výsledků):

Tabulka 1 • fl flfl ·'· • · flflflfl • fl fl flflfl • fl fl flflfl · · • · flflfl flfl flfl flfl

číslo	aktivity	am i nopept i dáz	v kapal ině	endopept i dáza
nad	sedl i nou
kmene	Leu-AP/1	Phe-AP/1	Val-AP/1	PU/ml
1053	25	170	32	0. 1
1085	23	135	48	0, 1
1103	37	285	40	0, 1
1108	60	435	29	0, 1
1444	40	192	50	0, 1
1497	25	105	75	0,1
1502	16		44	63	0, 1
========	=========	= = = =	==========	_{; = = = = = = = =: = = = =}	_{= = = = =: = = = =:=}: _{= =; = =}

Z výše uvedených kmenu, byly ze sbírky kultur získány kmeny 1108 a 1502 a byly uloženy pod vstupními čísly NRRL 3112 a respektive CBS 115.39. Kmen NRRL 3112 se použil na výrobu amylglukosidázy, cí-amylázy a glukoamylázy. Kmen CBS 115.39 byl použit na výrobu amylázy.

C.3 - Výroba exopeptidázy v laboratorním měřítku

Některé vytříděné kmeny, které jsou popsány v Přikladu 1 byly podrobeny fermentací v laboratornních fermentorech (10 litrů). Docílené výsledky s druhem 1502 jsou uvedeny v Příkladu.

• · ·· ♦· • · · · • · ·· * · * · · • · · ·♦ 99

Spory kmene Aspergi 11us niger No 1502 byly po 7-10 denní inkubaci při teplotě 30 °C zachyceny na PDA-deskách. Inokulační krok se provedl v protřepávané baňce při pH 4,8 a během 24 hod. s médiem tvořeným glukózou (20 g/l) a macerovanou kukuřicí (20 g/l). Hlavní fermentačni proces byl proveden dávkovačím postupem. Výživné preparáty byly následující: 100 g/l maltodextrinů, 40 g/l mouky ze sojových bobů, 40 g/l hydrolyžovaného kaseinu, 5 g/l macerované kukuřice, 2 g/l želatiny, 2 g/l dihydrogenfosforečnanu draselného, 1,3 g/l dusičnanu sodného, 1 g/l chloridu amonného, 0,01 g/l síranu železa a 0,5 g/l antipěnivého činidla.

Všechny výživné složky byly nejprve společně promíseny, kromě maltodextrinu. pH bylo upraveno na hodnotu

4,8 + 0,1. Fermentor byl poté sterilizován při teplotě 125 °C po dobu 40 min. Roztok maltodextrinu byl sterilizován odděleně a přidán do sterilního, ale ochlazeného fermentačního prostředí.

Hlavní fermentace byla provedena v laboratorním fermentoru, který byl vyplněn 6 1 média popsaného výše a které bylo naočkováno pomocí očkovací nádoby. K udržení co nejvyšši možné koncentrace rozpuštěného kyslíku, byl upraven přívod vzduchu a míchání. Teplota byla udržována na 30 °C. Když byly všechny živiny spotřebovány, byla fermentace zastavena, t.j. po asi 130 hod.

,, Fermentovanáživná půda byla zfi 1 trována k odstranění veškerých mikroorganizmů. Ve filtrátu byla změřena aktivita aminopeptidázy a endoproteázy:

0,15 Leu-AP/ml

1,0 Phe-AP/ml

0,05 Val-AP/ml

0,1 PU/ml

K vytvoření kapalné aminopeptidázy pak byla provedena ultrafiltrace (UF), stabilizačním činidlem byl glycerol (50%). Takto se získal roztok, jenž byl nazván Peptidáza L2 měl následující aktivitu:

0,5 Leu-AP/ml

3,2 Phe-AP/ml

0,05 Val-AP/ml

O,1 PU/ml

Tyto výsledky ukazují, že vybraný kmen Aspergillus niger rostl při zde vybraných podmínkách a vytvářel aminopeptidázy bez nezbytného množství endoproteázy.

C.4 diagramy pH enzymatických aktivit

Aktivity Leu-AP a Phe-AP byly stanoveny pomocí peptidázy L2 (viz Příklad 2) za použití různých pufrů k udržení rozsahů pH od 2,5 do 9,0.

Diagram pH 1eucin-aminopeptidázy z Aspergi 11us niger znázorňuje Obr.l

Diagram pH fenylalanin-aminopeptidázy z Aspergillus niger znázorňuje Obr. 2

Z obrázků je zřejmé, že Leu-AP je aktivní v rozsahu pH od 5 do 8,5, zatímco Phe-AP je aktivní v rozsahu pH od 5,5 do 9 a je podobný aminopeptidázám z jiných species Asperg i llus, .... ......

C.5 Teplotní diagramy enzymatických aktivit

Aktivity Leu-AP a Phe-AP byly stanoveny pomocí peptidázy L2, ale za použití odlišných očkovacích teplot pro • ·» · · · · · · · >··· · ··· · · ·· « • · · · · · ···· • ··· « · · « « ··» · « • · ··· ··· »eě ee ··· ·· ·· β» udržení teplotního intervalu od 5 do 70 °C.

Teplotní diagramy jsou na Obr. 3.

Výsledky ukazují, že každý enzym má svou odlišnou optimální teplotu, což je teplota 50 °C pro Leu-AP a 60 °C pro Phe-AP. Dále se popisuje způsob výroby aminopeptidáz z kultury Aspergillus Tyto aminopeptidázy mají optimální aktivitu v rozsahu pH 6-8 a v rozsahu teplot 50-60 °C; kromě toho vlivem podmínek při pěstování se mohou aminopeptidázy vytvářet bez pozorovatelného nebo podstatného množství endoproteázy. Výhodná je vyšší aktivita aminopeptidázy než endoproteázy, výhodněji lOx vyšší, ještě výhodněji 30x vyšší.

D ._Maltogenní amyláza (zcukernění)

Amyláza, jenž je použita ve zcukerňujícím kroku postupu podle vynálezu je enzym, jenž štěpí v dextrinech nebo ve škrobu ct-1,4 glukozo-glukozové vazby s konečnými převládajícími produkty maltózou a/nebo glukózou. Velmi dobré výsledky se získají s ct-amylázou z Aspergillus oryzae obchodně dostupné od Gist-Brocades pod obchodní značkou Brewers fermex nebo s rekombinantní amyloliquefaciens obchodně dostupné značkou Novamyl.

β-amylázou z Bacillus od Novo pod obchodní

Příklad 1

Čirok (var. FAFA FARA) a kukuřičné klasy byly rozemlety podle -standardních technických podmínek týkajících se výroby piva. Jedna část zrn (60 % či roku + 40 % kukuřičných klasů) je podrobena hydrataci s 3 díly vody. Přidal se chlorid vápenatý, aby se zaručilo celkově 200 ppm Ca²⁺ iontů ve zkapalněném prostředí. Pomocí hydroxidu vápenatého bylo upraveno pH na 6,5. Přidalo se B.A.T.S.

• 0 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 «

0 0 0 0 00

0 0 0 000 0 0 0 0» 000

00 00 00 00 v dávce 1,5 kg na Tunu zrn. Přidaly se další proteolytické enzymy v množství, jež ukazuje Tabulka 2=

Tabulka 2

_ = = _ = — = = == =	-----= =---= = = = _ = = = = = = = = = = = -	======================
Zkouška č.	Enzymy	Dávka / T zrn
1	žádné	0
2	Brewers Protease 2000	1,2 kg
3	Brewers Protease 2000	1,2 kg
	Exo-peptidáza z A.sojae	73000 Leu-AP
4	Past i mase 400	10 kg
5	Past imase 400	10 kg
	Exo-peptidáza z A.sojae	73000 Leu-AP
~ ___—	_ _ _ _______________ _ _________ _	______________________

Směs se udržuje při teplotě 50 °C po dobu 1 hod. ; teplota se poté zvyšuje až na 95 °C (rychlost 1 °C/min.) a na této teplotě 95 °C se udržuje po dobu 45 min. Během 5 minut je potom zchlazena na teplotu 60 °C. Následoval přídavek Brewers Fermex (600g/T). Rmut se zcukerňuje po dobu 45 min při teplotě 60 °C. Teplota se následně zvyšovala až na 76 °C a na této teplotě se udržuje po dobu 10 minut. Rmut je poté nalit do nálevky obsahující filtrační papír Schleicher a Schuell. Následně byl měřen objem filtrované sladiny a stejně tak byla zjišťována její měrná hmotnost. Uvedené hodnoty dovolují spočítat extrakt a výtěžek sladiny. Pomocí činidla ninhydrinu s glycinem jako standardu byly změřeny aminokyseliny. Pro porovnání sladin mezi sebou byly ·· opraveny na ·· • · · · · • · · ·· • 1» ·«· · 9 • · · · ·· 99 získané koncentrace aminokyselin obsah (12° Plato).

stejný cukerný

Zjištěné údaje jsou uvedeny v Tabulce č. 3:

Tabulka 3

--a a--= = = = ;		==========
Zkouška č.	Filtrovaný objem (ml)	Výtěžek (%)


1	310	85, 4
2	370	86, 9
3	382	90, 2
4	365	86, 9
5	372	91,0
========——=	===================	aaessaaaaas

Am i nokyse1 i ny př i 12° Plato <mg/l)

26, 9 54, 7

119, 5 76, 2

102, 3

Získané výsledky ukazují, že použití endoproteázy v kombinaci s exo-peptidázou v postupu podle vynálezu umožňuje, aby se nezvyšovalo pouze množství aminokyselin ve sladině, ale také její výtěžek a fi 1trovate1nost.

Příklad 2

V tomto souboru zkoušek byly testovány tytéž vařené nápoje jako v příkladu 1, avšak s použitím neutrální proteázy z Bacillus aisylol iquefaciens <1,8 kg Brewers Protease 2000 na T zrn) s různými exo-peptidázami “z Aspergillus species, jak uvádí Tabulka 418

Tabulka 4 ·· * ·· · ·· ·« ·· t · 99 9 9 9 ··· ··· · · ·· » 9 99-9 9 9 9-9 99 9 · « • · · · · ··« ··· 999 99 99 99

--=--===_==	=-----=----===__====	= = = = = = = = = = = =::= = =	================
Zkouška č.	Používané exo-peptidázy
	Biologický původ	Leu-AP/T	Phe-AP/T
1	žádný	0	0
2	Aspergi 11us sojae	73000	49000
3	Aspergillus oryzae	73000	53000
4	Aspergi 11us niger	25000	100000
==========J		_{: = ss}_ _{= = = = = = = = =} _.

Zjištěné údaje jsou uvedeny v Tabulce 5:

Tabulka 5

------= = = = =	s=================s	========
Zkouška ó.	Filtrovaný objem (ml)	Výtěžek (%)
___________

1	340	86, 1
2	400	90, 0
3	385	87, 9
4	382	89, 8
===========	===================	·= = = = = = = =

Am i nokyse1 i ny př i Plato (mg/1)

61,4 116, O

95, 7 99, 8

12°

Všechny kombinace endoproteázy + exo-peptidázy se ukazují lepší než endoproteáza samotná, nezávisle na biologickém původu exo-peptidázy. Kromě obsahu aminokyselin . je Př i této zkoušce ___l epš í f i 1 trovatelnost a„výtěžek.

Příklad 3

Ke kontrole použitelnosti obdržených sladin k výrobě piva se vařil čirok a kukuřičné klasy, jak popisuje Příklad « ·· ·· ·· • to · · to · · · • toto · · to · toto toto ··· to to • toto · to · ··· to· ·· ··

1; současně se vaří vzorek, v němž není obsažen enzym, ale sladina se nahrazuje zcela čirokem, což uvádí Tabulka 6

Tabulka 6

Zkouška č.

Enzymy

Dávka

Sladina

Brewers Protease 2000 Exo-pept,idáza z A.sojae

Brewers Protease 2000 Exo-peptidáza z A.oryzae

Brewers Protease 2000 Exo-peptidáza z A. niger nahrazuje čirok 1,8 kg/T

42000 Leu-AP/T 1,8 kg/T

40000 Leu-AP/T 1,8 kg/T

25000 Leu-AP/T

Zjištěné údaje jsou uvedeny v Tabulce 7·

Tabulka 7

	——————————	⁼ — — — — — — — — — — — — — — — —	— — — — — — — _ _ =
	Zkouška č.	Filtrovaný objem	Výtěžek
í ·		(ml)	(%)
Λ.··:	==========	==================	==========
	1	400	82, 3
	2	395	89, 5
í 1»	3	390	87, 9
[·''	4	375	91,1
!	= = = = = = — = = = :	==================	= = = = = = = = = =

Aminokyseliny při 12° Plato (mg/1)

222, 0 127, 0 109, 0 113,1

... .₌ Jednotlivé kompozice aminokyselin každého vařeného nápoje byly stanoveny metodou HPLC. Aminokyseliny se klasifikují podle rychlosti asimilace na Saccharomyces sp. :

Skupina A: rychlá asimilace Skupina B = středně rychlá asimilace

4

44*

444 « 44 · ·

4 4

4 4 4

4 4

4 4 44 • 44

4

Skupina C: pomalá asimilace

Získané (Hodnoty N.B am i nokyse1 i n, Tabulce 7 byl HPLC j e zce1a výsledky ukazuje Tabulka 8'· v mg/1 se neshoduj i se souhrnem hodnot které uvádí Tabulka 6, protože v uváděné použit jako standard glycin, zatímco kalibrace odlišná.) ·· ·· • · · · • · ·· ··· · · • · · ·· ·· ·· • ·· ·· · · • · · • ··· · • · ··· ·· ·· ·«· ·« <?·

Tabulka 8

Am i nokyse1 i ny (mg/1)	Zkouška	II II II II 11 11 11 11 II 11 II II II II 11 II II II 11 11 II II >0
1	2	3	4
Skup i na A
Glu	36	38	30	39
Asp	53	29	26	29
Ser	143	65	51	56
Thr	54	28	21	22
Lys	95	65	45	47
Arg	133	114	87	74
Celkem	513	340	260	268

Skup i na B
Val	102	36	32	28
Met	26	37	30	28
Leu	158	216	205	166
Ile	75	41	42	28
His	58	26	16	15
Celkem	418	356	325	265

Skupina C Gly	29	19	13	17
Phe	134	89	85	95
Tyr	107	67	58	57
Trp	55	11	11	12
Ala	97	80	66	73
Celkem	421	265	233	253
===============		1= = = = = = = = = = =	1==========^	1 = = = = = = = =1 = = = =

Každá ze sladin se vařila po dobu 45 min: ke každé ze sladin se sterilně přidala převařená destilovaná voda, aby se nastavil obsah cukru na hodnotu 12° Plato. Do sterilních baněk bylo asepticky odlito 350 ml z každé standart izované sladiny; každá baňka byla naočkována pivovarskými kvasinkami (5 g/1 ) . Fermentace probíhala po dobu 8 dní při teplotě 11 °C. Zřejmé zředění každé fermentované sladiny se stanovilo • ·

z hustoty po 8 dnech fermentace.

Získané výsledky uvádí Tabulka 9:

Zkouška č.

Tabulka 9

Zřejmé zředění po 8 dnech (%)

82, O 81, O 80, 4 nestanoveno

V postupu podle vynálezu byla kombinace endoproteázy + exopeptidázy aplikována na čirok, vynález umožňuje vyrábět sladiny, které mají uspokojivou schopnost fermentovat pivo ve srovnání se sladinami získanými pomocí sladu.

Překvapivá kombinace endoproteázy z Bacillus amylol iquifaciens + exo-pept idázy z Aspergr i 11 us sojae poskytuje významné zlepšení ve skupině aminokyselin A + ve skupině B.

Příklad 4

Tento příklad uvádí výhody uměle přítomných exo-peptidáz při zkapalňujícím kroku spíše než při zcukerňujícím kroku v postupu podle vynálezu. Čirok a klasy kukuřice se vaří shodně, jak uvádí příklad Ϊ.Brewers Protease 2000 se přidala při zkapalňujicím kroku (1,8 kg/T) do všech vařených nápojů. Exo-pept idáza z Aspergri 2 2us sojae (40000 Leu-AP/T) se přidala buď při zkapalňujícím kroku (zkouška n° 1-2) nebo při zcukerňujícím kroku (zkouška n°

3-4) .

Získané výsledky uvádí Tabulka 10=

Tabulka 10

	===================
Zkouška č.	Filtrovaný objem	Výtěžek
	(mg/1)	(%)
1	380	89, 3
2	385	89,5
3	370	89, 4
4	370	89, 8
==========	===================

exopept idáz

Či rok Příklad 1.

Aminokyseliny při 12° Plato (mg/1)

115, 1

119,8 109, 1 112, O

Opakovanými identickými zkouškami byly stanoveny standardní odchylky filtrovaného objemu, výtěžku a obsahu aminokyselin. Získané hodnoty jsou 10 ml, 0,5 %, respektive 0,9 mg/1.

Výše uvedené výsledky ukazují, že vnesení exo-peptidáz ve zkapalňujícím kroku přináší významnou výhodu v produkci aminokyselin a zejména přispívá k fi 1trovatelnosti.

Přiklad 5

Uvedený příklad ilustruje vliv vzrůstajících dávek z A.oryzae ve vařených nápojích.

+ kukuřičné klasy se vaří shodně, jak uvádí Při zkapalňujícím kroku se přidaly Brewers

Protease 2000 a exopeptidáza (Tabulka 11).

Tabulka 11

--=-------= _	---= _ =----------=-----= = = = = = =	===================
Zkouška č.	Enzymy	Dávka


1	žádný	0
2	Brevers Protease 2000	1,0 kg/T
3	Brewers Protease 2000	1,0 kg/T
	Exopeptidáza z A. oryzae	62000 Leu-AP/T
4	Brewers Portease 2000	1,0 kg/T
	Exopept i dáza z A. oryzae	109000 Leu-AP/T
5	Brewers Protease 2000	1,0 kg/T
	Exopeptidáza z A. oryzae	155000 Leu-AP/T
6	Brewers Protease 2000	1,0 kg/T
	Exopeptidáza z A. oryzae	234000 Leu-AP/T
7	Brewers Protease 2000	1,0 kg/T
	Exopeptidáza z A. oryzae	313000 Leu-AP/T
= = = = = = = = = = = =	=============================	===================

Získané výsledky ukazuje Tabulka 12:

Tabulka 12

	===================	: = = = = = = = = = =
Zkouška č.	Filtrovaný objem (ml)	Výtěžek (%)

		: = = = = = = = = = =
1	188	88,4
2	275	88, 9
3	280	89, 1
4	280	89, 6
5	280	89, 7
6	280	90, 4
7	280	89, 5
==========		₌₌₌___₌_₌₌

Ami nokyse1 i ny př i Plato (mg/1)

39, 1 59, 8 81,5 90, 5 95, 3

1O1, O 114, O

12°

Z výše uvedeného vyplývá, že čím větší množství exopeptidázy, tím vyšší výtěžky a větší množství volných aminokyselin. Optimální hodnota konverzně-filtračního efektu se dosáhne dokonce při nižši úrovni exopeptidázy.

Příklad 6

Příklad ilustruje vliv vzrůstající dávky exopeptidáz z A. niger ve vařených nápojích.

Cirok a kukuřičné klasy se vaří shodně, jak uvádí Přiklad 1. Při zkapalňujícím kroku se přidaly Brewers Protease 2000 a exopeptidáza.

Tabulka 13

============	==============================
Zkouška č.	Enzymy	Dávka
============		==================
1	žádné	0
2	Brewers Protease 2000	1,0 kg/T
3	Brewers Protease 2000	1,0 kg/T
	Exopeptidáza z A. niger	51000 Phe-AP/T
4	Brewers Protease 2000	1,0 kg/T
	Exopeptidáza z A. niger	90000 Phe-AP/T
5	Brewers Protease 2000	1,0 kg/T
	Exopeptidáza z A. niger	127000 Phe-AP/T
============	= = = = = = =:=: = = = = = = = = =: = = = = = = = = = = =: = =(	==================

Výsledky ukazuje Tabulka 14=

Tabulka 14

Zkouška č.	Filtrovaný objem (ml)	Výtěžek (%)	Aminokyseliny při 12° Plato (mg/1)
1	188	88,4	39,1
2	240	88,6	60, 1
3	246	89,7	63,7
4	258	89, 5	64, 2
5	232	89, 7	65, 7
==========	^=================	= = = = = = = = = =!	i======================

Také zde je vidět, že óím větší množství exopeptidázy, tím jsou vyšší výtěžky a větší množství volných aminokyselin. Tyto výsledky ilustrují, že se exopeptidáza Ά. oryzae jeví o něco lepší, než exopept i dáza A niger.

Příklad 7

Ječmen (var. PLAISANT) byl rozemlet na jemnou mouku, která byla upravena v pivovaru k filtraci kalolisy. Bylo suspendováno 57 g mouky při teplotě 50 °C po dobu 1 hod. ve 3000 ml vody, která obsahovala:

mg B.A.T.S.

mg Filtrase L3000 (+) (β-glukanáza z Bacillus aayloliguiefaciens obchodně dostupné od Gist-brocades) 4 mg Brewers Protease 2000 a relevantní množství exo-peptidázy z Aspergillus sojae. Teplota se poté zvýšila až na 63 °C (rychlost 1 °C/min.) a na této teplotě byla udržována po dobu 30 min. Potom byla teplota zvýšena až na 90 °C (rychlost 1 °C/min.) a udržována na této teplotě po dobu 20 min. Vařený nápoj je potom ochlazen na 25 °C a odstřeďován při 7OOOg po dobu 15 minut. Kapalina nad sedlinou se nakonec analyzuje na rozpustné proteiny a volné aminokyselin.

Výsledky uvádí Tabulka 15=

Tabulka 15


Zkouška č.	Dávka exo- -peptidázy (Leu-AP/T)	Am i nokyse1 i ny př i 12° Plato (mg/1)

		= = = =
1	0	77, 9
2	25000	95, 3
3	50000	118,4
4	1OOOOO	133, 2
5	200000	203, 6
. _ ...... 6	400000	„ ....... 295, 0
	==============	===================

(%

Rozpustné prote i ny suché látky)

4, 21 4, 75

4, 99

5, 42

6, 63 7,55 ..

Výsledky ukazují, že exopeptidáza z Aspergillus sojae umožňuje dosáhnout ve vařeném nápoji z ječmene stejné hladiny volných aminokyselin , jako ve vařeném nápoji ze sladu kde se během zkapalňujicích kroků aplikuje enzym.

Příklad 8

Ječmen se vařil podle Příkladu 7, ale exo-peptidáza z Aspergillus sojae byla nahrazena exo-pept idázou z Aspergϊ11us niger.

Výsledky udává Tabulka 16:

Tabulka 16

— — = = X z z - = =
Zkouška č.	Dávka exo-	Am i nokyse1 i ny př i
	-pept idázy	12° Plato (mg/1)
	(Leu-AP/T)
1	0	68, 2
2	10000	69,8
3	50000	75, 2
4	200000	78,0
5	500000	89, 1
6	1000000	101,0
= = = = = = = = = =:	===============	===================

Rozpustné prote i ny (% suché 1átky)

4, 37 4, 20 4, 25 4, 16 4, 50 4, 18

Ačkoliv se exo-peptidáza z AspergiíJus niger zdá být méně účinná než z Aspergillus sojae, umožňuje dokonce také dosáhnout hodnoty 100 mg/1 aminokyselin ve 12° Plato sladině ječmene, což je uspokojivá hodnota pro fermentaci piva.

Uloženi mikroorganizmů

Kmeny používané pro výrobu exopeptidáz jsou uloženy v Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, Baarn, The Nederlands pod depozitními čísly CBS 115.39 (veřejná sbírka), CBS 209.96 (A.sojae (DS 8351): s datem uložení: 12. února 1996) a CBS 210.96 (A.oryzae (DS 23617): s datem uložení: 12. února 1996).

Claims

1. Postup výroby fermentovate1né sladiny, zahrnující kroky· (a) zkapalnění obilného materiálu s pomocným činidlem s <aamylázovou a/nebo endoproteázovou aktivitou k získání zkapalněného rmutu, a (b) zcukernění uvedeného zkapalněného rmutu v přítomnosti oí- amylázy, (c) filtraci zkapalněného a zcukerněného rmutu k získání fermentovate1né sladiny, kde alespoň jeden z výše uvedených kroků (a) a (b) se provádí v přítomnosti enzymu majícího exo-peptidázovou aktivitu.

2. mat Postup podle •eriál zahrnuje nároku 1, alespoň 20 vyznačující se tím, še obilný % nesladové ob i 1n i ny. 3. Postup podle nároku 2, vyznačuj ící se tím, že ob i 1ný materiál zahrnuje alespoň 20 % nesladového čiroku. 4. Postup podle nároku 3, vyznačuj ící se tím. že ob i 1ný materiál zahrnuje alespoň 50 % nesladového čiroku.

5. Postup podle kteréhokoliv z nároků 1 aš 4, vyznačující se tím, še exopeptidáza je přítomna během zkapalnění obilného materiálu.

6. Postup podle kteréhokoliv z nároků 1 aš 5, vyznačující se tím, še exopeptidázou je houbová exopeptidáza.

7. Postup podle nároku 6, vyznačující se tím, že houbou je Aspergri 1 1 us species.

8. Postup podle nároku 7, vyznačující se tím, še houbou je »·

Aspergillus sojae.

9. Postup podle nároku 6, vyznačující se tím, še exo-peptidázou je amino-peptidáza.

10. Postup podle nároku 8, vyznačující se tím, še se endopeptidáza získá z Bacillus amyloliquefanciens.

11. Postup vaření piva zahrnující kroky výroby sladiny s použitím postupu podle kteréhokoliv nároku 1 až 10 a fermentaci uvedené sladiny k získání piva.

12. Postup enzymatického uvolnění volně dostupného dusíku z obilnin s obsahem vysokého množství glutelinu a/nebo prolaminu, zahrnující krok přidání kombinace endoproteázy a exo-peptidázy k zrnům nebo ke zkapalněnému rmutu, získaného z uvedených zrn.

13. Postup výroby alkoholu, nebo nápoje obsahujícího alkohol, zahrnující krok fermentace sladiny získané postupem podle nároku 1 v přítomnosti kvasinek schopných vytvářet alkohol.

14. Použití exopeptidázy v postupu výroby fermentovatelné sladiny.

15. Použití podle nároku 14, vyznačující se tím, exopeptidáza je houbovou exopeptidázou.

še uvedená

16. Použití podle nároku 14 uvedená exopeptidáza je sestávající z Aspergillus Aspergi11us sojae.

nebo 15, vyznačující se tím, že z houby vybrané ze skupiny niger, nebo Aspergillus oryzae

17. Použití podle kteréhokoliv jednoho z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že sladina je vyrobena alespoň z částečně nesladového regionálního materiálu.

18. Použití podle kteréhokoliv jednoho z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že sladina je vyrobena z nesladového čiroku nebo z nesladového ječmene.

19. Použití exopeptidáz ke zlepšení organoleptických vlastností piva.

20. Použití exopeptidázy ke zlepšení fi 1trovate1nosti sladiny.