SK108698A3

SK108698A3 - Process for producing fermentable wort

Info

Publication number: SK108698A3
Application number: SK1086-98A
Authority: SK
Inventors: Marie-Paule Laroye; Jerome Souppe
Original assignee: Gist Brocades Nv
Priority date: 1996-02-12
Filing date: 1997-02-12
Publication date: 1999-04-13
Also published as: EA001075B1; PL328304A1; HUP9901003A2; CN1064398C; CA2245856A1; CN1211275A; CZ250398A3; WO1997029179A1; AP9801316A0; HUP9901003A3; EE9800240A; KR19990082497A; JP2000504571A; YU33998A; CN1285396A; BG102684A; HK1018625A1; BR9707404A; AU1873197A; EA199800711A1

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka úpravy fermentovatelného sladu z obilných zŕn, najmä z nesladových obilných zŕn. Takisto sa vynález týka sladu vyrobeného týmto postupom. Vynález sa ďalej týka fermentácie sladov získaných podlá vynálezu v priemysle výroby alkoholu, v liehovarníckom priemysle alebo pri varení piva.

Doterajší stav techniky

Pivo sa vyrába fermentáciou buď sladových alebo nesladových zŕn. V druhom prípade sa zrná skvapalňujú a scukorňujú pomocou obvyklých prídavných enzýmov, pričom sa získava slad, ktorý obsahuje fermentovatelné cukry a aminokyseliny alebo iné formy dusíka (celkovo počítaného ako FAN - Freely Available Nitrogen - volne dostupný dusík), ktorý je nevyhnutný na fermentáciu kvasinkami.

Napríklad MacFadden a ďalší (MacFadden, D.P. and Clayton, M. Brewing and Bewerage Industries International (1989), 1, 77-81) navrhujú pri varení piva pridať enzýmy z nesladového čiroku, ako- napr. alfa-amylázu,' proteázu, beta-glukanázu, cellulázu, hubovú alfa-amylázu, amyloglukozidázu a ďalšie. MacFadden a ďalší tiež pri fermentácii odporúčajú, ak je použitý nesladový čirok, pridať pre kvasinky živné látky.

Bajomo a ďalší (M.F. and Young, T.W., J. Inst Brew. (1992) 98, 515-523; Bajomo M.F. and Young, T.W., J. Inst.

Brew. (1994) 100, 79-84, 3) hovorí o varení piva zo 100% nesladových čirokových zŕn napriek faktu, že hladina FAN prítomná v slade nesladového ciroku (51 mg/1) je oveľa nižšia ako je hodnota základu na fermentáciu sladu pripraveného zo sladového jačmeňa.

V medzinárodnej patentovej prihláške WO 92/20777 je popísaný postup výroby etanolu, ktorý zahŕňa skvapalnenie celej nesladovej kukurice alebo všeobecného ciroku pomocou amylázy, nasleduje scukornatenie rmutu pomocou glukoamylázy a kyslej hubovej proteázy. Postup zahŕňa krok pridávania proteázy počas fermentácie ako aj počas scukorňovania. Hodnota pH prostredia fermentácie je v rozsahu 4-5, čím sa mieni, že hubové exo-peptidázy nie sú aktívne (Labbe, J.P., Rebeyrotte, P. Biochémie (1974) 56, 839-844, Lehman, K. und Uhlig, H.. Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. (1969) 350, 99104). Nevýhodou vyššie uvedeného postupu je, že pri týchto podmienkach prítomné hubové proteázy vykazujú len endoproteolýzu, čím sa vytvárajú najmä oligopeptidy a málo voľných aminokyselín.

K celkovému prehľadu oblasti techniky je treba zmieniť správu Palmera (G.H. Cereal Science and Technology. In: Cereal Science and Technology. (1989) ed. Aberdeen University Press, Aberdeen, Scotland, 61-242).

Podstata vynálezu

Tento vynález zahŕňa postup na získanie sladu z nesladových obilných zŕn s neočakávateľne dobrými vlastnosťami sladu, ako je napr. vysoké množstvo dosiahnuteľného dusíka (tu počítaného ako FAN), dobrá filtrovateľnosť a výťažok získaného sladu. Postup môže byť tiež použitý na výrobu sladov zo sladových obilnín, ale konkrétne je výhodný na výrobu sladov z nesladových zŕn, ako je napr. nesladový čirok, alebo zmes nesladového ciroku a kukurice. Uvádzané výhody sú tiež v existencii sladov, ktoré sú vyrobené zo sladových obilnín (ako je sladový jačmeň) v kombinácii s nesladovými obilninami (ako je kukurica, ryža alebo čirok), ktoré sú nazývané ako zmesová várka.

Vynález teda poskytuje postup výroby fermentovatelného sladu z obilných zŕn a zahŕňa kroky:

(a) skvapalnenie obilného materiálu s prídavkom spolupôsobiacej α-amylázy a/alebo endoproteázy na získanie skvapalneného rmutu, (b) scukornatenie uvedeného skvapalneného rmutu v prítomnosti a-amylázy, (c) filtráciu kvapalného a scukornateného rmutu na získanie fermentovatelného sladu, kde aspoň jeden z vyššie uvedených krokov (a) a (b) sa uskutočňuje v prítomnosti enzýmu s exo-peptidickou aktivitou. Vhodné enzýmy s exo-peptidickou aktivitou sú exopeptidázy, napr. hubové aminopeptidázy, ale aj teplotné stabilné karboxy-peptidázy. Konkrétne výhodné podlá vynálezu sú aminopeptidázy endogénne k hubám Aspergillus, konkrétnejšie k hubám A. niger, A. oryzae, A. sojae.

Pre postup sú konkrétne vhodné obilné zrná, ktoré sú tvorené z aspoň 20 % nesladovou obilninou, výhodne z viacej ako 50 % nesladovou obilninou, čo sú napríklad čirokové

- 4 obilné zrná doplnené nesladovými klasmi kukurice, ryžou alebo inými nesladovými obilninami. Je zistené, že podlá vynálezu je veími výhodné, ak prebieha skvapalňovanie obilných zŕn v prítomnosti exopeptidázý.

Podía ďalšej stránky vynálezu sa poskytuje fermentovatelný slad, ktorý sa získa postupom podía vynálezu. Ešte ďalšou stránkou vynálezu je postup varenia piva, vyznačujúci sa tým, že sa použije fermentovatelný slad získaný podía vynálezu.

Ďalej sa poskytuje postup na výrobu alkoholického nápoja, napr. piva, ktorý zahŕňa kroky na výrobu sladu s použitím postupu podía vynálezu a nasledovne, alebo simultánne, fermentáciu uvedeného sladu, čím sa získa napr. pivo.

Podía iného vyhotovenia, sa poskytuje postup na získanie enzymaticky uvolnitelného volne dostupného dusíku z obilnín, ktoré obsahujú vysoké množstvá glutelínu a/alebo prolamínu, ktorý zahŕňa krok prídavku endoproteázy a exo-peptidázy k zrnám alebo k skvapalnenému rmutu získaného z uvedených zŕn.

Pri ďalšom vyhotovení sa poskytuje postup výroby alkoholu, ktorý zahŕňa krok fermentácie FAN, získaného postupom podía vynálezu v prítomnosti kvasiniek schopných vytvárať alkohol.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Vynález je objasnený na nasledujúcich obrázkoch.

Obr. 1 znázorňuje diagram pH leucin-aminopeptidázy Aspergillus niger.

Obr. 2	znázorňuje	diagram	pH fenylalanín-
aminopeptidázy	Aspergillus	niger.
Obr. 3	znázorňuj e	teplotný	diagram	obidvoch

aminopeptidáz.

Vynález bude objasnený ďalej podrobnejšie.

Postup poskytuje prípravu fermentovateľného sladu z obilnín, pod podmienkou, že je prítomný aspoň jeden proteín s exo-peptidickým účinkom. Vhodné sú amiriopeptidázy endogénne k hubám najmä k Aspergilli, ktoré sú pri pH 5 až 8 dostatočne stabilné a s dostatočnou aktivitou, čo je asi oblasť, kam pH klesne počas skvapalňovania. Karboxypeptidázy sú pri tejto teplote a pH menej vhodné. Pri scukorňujúcom kroku prevláda oproti skvapalňujúcemu kroku mierne kyslejšie prostredie, a preto sa tu s výhodou použije karboxy-peptidáza, ktorá zaisťuje, že prostredie je dostatočne stabilné v rozmedzí teplôt 50 - 60°C, výhodne pri 50 - 70°C.

Prítomnosť exopeptidáz podľa tohto vynálezu nevedie len ku zvýšeniu v slade volne dostupného dusíka (FAN), ale tiež k zlepšeniu filtrovateľnosti a výťažku sladu v porovnaní s postupom, kde sa exopeptidázy nepoužívajú.

i

Prednosťou postupu podía vynálezu je konkrétne príprava fermentovatelného sladu z nesladových obilnín, konkrétnejšie nesladového ciroku, ktorý je voliteľne doplnený iným obilným materiálom, napr. kukuricou, pšenicou, ovsom alebo ryžou. Obilniny v kontexte tohto vynálezu zahŕňajú cirok, pšenicu, jačmeň, ovos, ryžu a kukuricu a podobne.

Prítomnosť exopeptidáz podía tohto vynálezu je výhodná v prípade ako zmesových várok, kde sa pravidelne používajú sladové obilné suroviny ako aj nesladové obilné suroviny (napr. ktoré majú viacej ako 80 %, alebo dokonca viacej ako 90 % sladových obilnín, zvyšok tvoria nesladové obilniny), ako bolo zistené, že exopeptidázy majú pozitívny vplyv na organoleptické vlastnosti (t.j. na chuť a/alebo vôňu). Predpokladá sa, že tieto výhody sú spoločné pri varení piva z nesladových ako aj sladových obilnín, ako aj pri ich vzájomných zmesiach.

Obilniny, u ktorých je použitie exopeptidáz konkrétne výhodné z hladiska FAN, filtrovatelnosti, výťažku a organoleptických vlastností, majú relatívne vysoké podiely proteínov prolamínu a glutelínu. Okrem čiroku patrí do tejto kategórie tiež ryža (s asi 80 % glutelínu) . Ak je použitý čirok, mala by sa venovať pozornosť vybratým odrodám, ktoré majú relatívne nízky obsah polyfenolu.

Nehladiac na prídavok exopeptidáz, sa príprava sladu napr. na varenie piva, môže uskutočňovať obvyklými spôsobmi. Všeobecne príprava zahŕňa skvapalnenie obilnej suroviny na získanie rmutu s nasledovným scukornatením rmutu a pri získaní sladu. Dôležitá je filtrácia, má pred fermentáciou prednosť.

Skvapalňujúci krok zvyčajne zahŕňa rozdrvenie obilnej suroviny na získanie múky s vhodnou velkosťou častíc, ktorá sa hydratuje od asi 1 do asi 4, výhodne asi 3 dielmi vody a voliteľne v závislosti na použitej endoproteáze s od asi 50 do asi 300 ppm vápnika, výhodne s 200 ppm Ca²⁺. Ukazuje sa, že enzýmy Bacillus stearothermophilus znižujú závislosť na vápniku. V tomto prípade sa žiadne ďalšie doplnenia iónov Ca²⁺ nevyžadujú. Veľkosť častíc rozdrvených obilnín by nemala prekročiť asi 3 mm; množstvo častí s veľkosťou väčšou ako 1,3 mm by nemalo byť väčšie ako 3,5 %; menších častíc ako 0,25 mm by nemalo byť viacej ako 1,5 %. Okrem toho môžu byť prítomné enzýmy ako cellulázy, β-glukanázy a alebo iné enzýmy odbúravajúce stenu rastlinnej bunky.

pH skvapalňujúceho prostredia je obvykle upravené na hodnotu medzi asi 5 a 8, výhodne medzi asi 6 a 7, čo sa zaisťuje napr. pomocou hydroxidu vápenatého. Dôležité je pridať α-amylázu, výhodne sa pridá do skvapalňujúceho prostredia termostabilná α-amyláza ako aj endoproteáza v dávke, ktorá je nevyhnutná na aspoň čiastočné skvapalnenie obilného škrobu, a na aspoň čiastočné odbúranie proteínu. Vhodná dávka α-amylázy je od asi 0,5 do 2,0, výhodne asi 1-1,5 kg/Tonu, ak je použité B.A.T.S. V prípade Brewers Protease 2000 je vhodná dávka proteázy vyššia ako 0,5 kg/Tonu zŕn (kg/T), výhodne vyššia ako 1 kg/T. V prípade Panstimázy 400 by sa mala použiť dávka vyššia ako 2 kg/T, výhodne vyššia ako 5 kg/T, najvýhodnejšie vyššia ako 10 kg/T.

Počas skvapalňovania obyčajne určitý počet krokov prebieha pri zvýšenej teplote: po prídavku α-amylázy a proteázy sa zmes udržiava pri teplote medzi asi 40°C a

65°C, výhodne medzi asi 45 a 55°C a najvýhodnejšie pri 50°C, dokial sa nedosiahne nevyhnutné skvapalnenie. Čas dostačujúci na prereagovanie závisí od použitej obilniny alebo zmesi obilnín, ale obvykle trvá od asi 30 minút až do asi 2 hodín. Nasledovne sa teplota postupne zvyšuje, rýchlosť zvyšovania teploty nie je kritická až do teploty asi 90 - 95°C a pri tejto teplote sa zmes nechá reagovať od asi 30 minút do asi 1 hodiny. Potom sa zmes ochladí na teplotu scukorňovania: obyčajne pri teplote od asi 50°C do asi 70°C, výhodne medzi asi 55°C a 65°C, najvýhodnejšie pri asi 60°C. Pri scukorňujúcom kroku je v závislosti na teplotnej stabilite enzýmov, možné použiť mierne vyššiu teplotu. Keď sa dosiahne potrebná teplota, pridajú sa scukorňujúce enzýmy, napr. Brewers Fermex (α-amyláza) alebo Novamyl (rekombinantná β-amyláza) v množstve, ktoré je obvykle v rozsahu od asi 400 g/T do asi 1 kg/T pre Brewers Fermex. Glukoamylázy sa používajú tiež často. Scukorňujúca fáza trvá od asi 30 minút do asi 2 hodín, a potom teplota stúpa na od asi 75°C do asi 85°C medzi iným na inaktiváciu enzýmov a neželaných organizmov, a udržiava sa výhodne pri zvýšenej teplote 10 minút; dĺžka doby nie je príliš kritická.

Týmto spôsobom získaný rmut sa nasledovne filtruje na zariadení dobre známom zo stavu techniky; 'pomocou lievika s vloženým filtračným papierom Schleicher & Schuell, ktorý je na tento účel dostačujúci. Po filtrácii sa slad fermentuje vhodnými kvasinkami v závislosti od použitého kmeňa a od konečného úmyslu; okrem toho varenie piva, výroba alkoholu s jeho využitím ako biopaliva alebo ako alkoholického nápoja sa rozumie ako samostatný vynález.

Vhodné kmene kvasiniek a vhodné podmienky férmentácie sú dobre známe osobám oboznámeným so stavom techniky.

Bolo zistené, že aplikácia exo-peptidázy počas skvapalňujúceho kroku obilnej suroviny prípravy sladu, napr. pri varení piva je zvlášť výhodná. Avšak v porovnaní s tým, že exo-peptidáza nie je prítomná, vedie jej pridanie počas scukorňujúceho kroku tiež k už zmieneným výhodám, ako sú vyššie úrovne FAN, zlepšená filtrovatelnosť a vyšší výťažok sladu.

Postup podlá vynálezu berie do úvahy fázu, kde pH a teplota prostredia dovoľujú, aby boli hubové exo-peptidázy aktívne. Ako vhodné exo-peptidázy sú tieto endogénne huby všeobecne, konkrétnejšie ide o species Aspergillus. Je známe, že aminopeptidázy Aspergillus species, zahŕňajúce A. niger, A. sojae a A. oryzae, sú tu zvlášť vhodné.

Ako bude vyjasnené z vyššie uvedeného popisu prídavok enzýmov, ktorý demonštruje účinok exo-peptidázy počas skvapalňujúceho a/alebo scukorňujúceho kroku prípravy sledu, produkuje slady s dobrou filtrovatelnosťou, vysokým výťažkom a vysokou hodnotou FAN. To ho predurčuje využiť na varenie piva, na výrobu alkoholických nápojov (liehovín) a na výrobu alkoholu (ako biopaliva) z obilnín s významným percentuálnym zastúpením nesladových obilnín, alebo dokonca výhradne z nesladových obilnín. Riešenie je velmi výhodné ďalej pre nápoje varené v krajinách, kde je obmedzený dovoz sladu, alebo kde je ekonomicky nevýhodný. Ide najmä o Afriku, kde sa vyrába pivo z (zo zmesí) obilnej suroviny, ktorá zahŕňa velké percento čiroku.

Okrem toho je známe, že sa zlepšili organoleptické vlastnosti (chuť a vôňa) pív vyrábaných zo sladu, kde sa pri skvapalňujúcom kroku alebo pri scukorňujúcom kroku (alebo pri obidvoch) použili eXo-peptidázy. Predpokladá sa, že sa táto výhoda dosiahne, ak sú použité exo-peptidázy pri výrobe piva zo sladových obilnín, teda napr. z tradičných sladov jačmeňa, alebo pri výrobe piva zo zmesových várok (t.j. kombináciou sladových a nesladových obilnín).

Príklady vyhotovenia vynálezu

A. Termostabilná a-amyláza (skvapalnenie) α-amyláza, použitá pri skvapalňujúcom kroku postupu podía vynálezu je všeobecne enzým, ktorý štiepi a-1,4glukózo-glukózové väzby škrobu. Je ^! vybraná z termostabilných a-amyláz. Velmi dobré výsledky sa môžu dosiahnuť pomocou α-amylázy Bacillus licheniformis, ktorá je obchodne dostupná od Gist-Brocades pod obchodnou značkou Brewers Amyliq Thermo Stable (B.A.T.S.).

B. Endoproteáza (skvapalnenie)

Endoproteáza, použitá pri skvapalňujúcom kroku postupu podía vynálezu je všeobecne enzým, ktorý štiepi peptidické väzby proteínov pri určitom pH a teplote na počiatku skvapalňovacieho kroku (pH 5-6; t° 45-55°C). Velmi dobré výsledky sa môžu dosiahnuť pomocou neutrálnej proteázy Bacillus amyloliquefaciens, ktorá je obchodne dostupná od Gist-Brocades pod obchodnou značkou Brewer's Protease 2000. Môžu sa tiež použiť enzýmy Streptomyces fradiae, ktoré sú obchodne dostupné od Panstimase SARL pod obchodnou značkou Panstimase 400.

C. Exo-peptidázy (skvapalnenie a/alebo scukornatenie)

Exo-peptidázy, použité pri skvapalňujúcom kroku postupu podlá vynálezu sú všeobecne enzýmy, ktoré štepia Nkoncové väzby peptidov alebo proteinov. Velmi dobré výsledky sa môžu dosiahnuť pomocou preparátov Aspergillus species. Ďalej sa popisuje spôsob získania aminopeptidáz z Aspergillus niger.

C.l. Stanovenie enzymatických aktivít

Aktivita exo-peptidázy je vysvetlená pomocou jednotky Leucín aminopeptidázy alebo jednotky Fenylalanín aminopeptidázy:

jednotka Leu-AP je množstvo enzýmu potrebného na vytvorenie 1 gmólu p-nitroanilínu za minútu pri pH 7,2 a pri teplote 20°C z L-leucín-p-nitroanilidu * jednotka Fenylalanín aminopeptidáza jednotka Phe-AP je množstvo enzýmu potrebného na vytvorenie 1 jrmólu p-nitroanilínu za minútu pri pH 7,2 a pri teplote 20°C z L-fenylalanín-p-nitroanilidu.

C.l.l - Fenylalanln-aminopeptidáza (Phe-AP)

V 7,5 mM HCl bol rozpustený fenylalanínparanitroanilid s výslednou koncentráciou 0,9 mM. 1 ml tohto roztoku substrátu bol zmiešaný s 1,5 ml O,1M roztokom fosfátového pufra s pH 7,2. V čase t = 0, sa k roztoku pridalo 0,5 ml enzýmu a ponechalo sa pri teplote 20°C reagovať. Po 15 minútach bol pridaný 1 ml IN HCl. S IN HCl bol uskutočnený slepý pokus, keď kyselina bola pridaná v čase t = 0. Pre slepý pokus (OD_si_epý) a pre vzorku (ODvzorka) bola stanovená optická hustota/absorbancia pri 400 nm. Aktivita bola spočítaná nasledovne:

(ODvzorka OD_siepý)

9,8 x 15

Phe-AP/ml 0, 5

C.1.2 - Leucín-aminopeptidáza (Leu-AP)

Leucínparanitroanilid bol rozpustený vo vode s výslednou koncentráciou 9 mM. 1 ml tohto roztoku substrátu bol zmiešaný s 1,5 ml fosfátového pufra s pH 7,2. V čase t = 0 bolo k roztoku pridané 0,5 ml enzýmu a ponechané reagovať pri teplote 20°C. Po 15 min. bol pridaný 1 ml IN HC1. S IN HC1 bol uskutočnený slepý pokus, keď kyselina bola pridaná v čase t = 0. Pre slepý pokus (OD_siepý) a pre vzorku (ODvzorka) bola stanovená optická hustota/absorbancia pri 400 nm. Aktivita bola spočítaná následovne:

(ODvzorka OD_sx_epý)

9,8 x 15

C. 1.3 - Endoproteáza (PU)

Leu-ÄP/ml 0, 5

Táto aktivita sa meria hydrolýzou kazeínu pri pH 6,0, teplote 40°C počas 1 hod. 1 PU je množstvo enzýmu, ktoré je potrebné na uvolnenie ekvivalentu 1 gmólu tyrozínu za 1 minútu po vyzrážaní zvyšných proteínov pomocou kyseliny trichloroctovej.

C.2 - Triedenie kmeňov Aspergillus niger '

200 kmeňov Aspergillus niger izolovaných z rôznych zdrojov alebo získaných zo súboru kultúr, boli vypestované v živnom prostredí, ktoré’ obsahuje 15 g/1 múky, 20 g/1 baktopeptónu , 7 g/1 kvasinkového extraktu z kvasníc, 4 g/1 dihydrogénfosforečnanu draselného, 0,5 g/1 síranu horečnatého, 0,5 g/1 chloridu vápenatého, 0,5 g/1 chloridu zinočnatého a pri pH 4,8. Po 24 hod. predpestovania pri 240 rpm a pri teplote 30°C a po 96 hod. pestovania pri 275 rpm a pri teplote 30°C bola kvapalina nad usadeninou odobratá a vzorkovaná na leucín-, fenylalanín-, a valinaminopeptidázovú aktivitu, ako bolo popísané vyššie. Niekoiko kmeňov Aspergillus niger vykázalo vysokú tvorbu potenciálov k aspoň jednej z týchto enzýmových aktivít, ako ukazuje Tabulka 1 (každá hodnota je súborom hodnôt štyroch samostatných výsledkov):

Tabuľka 1

číslo	aktivity aminopeptidáz v } usadeninou	cvapaline nad	endopeptidáza
kmeňa	Leu-AP/1	Phe-AP/1	Val-AP/1	PU/ml
1053	25	170	32	0,1
1085	23	135	' 48	0,1
1103	37	285	40	0,1
1108	60	435	29	0,1
1444	40	192	50	0,1
1497	25	105	75	0,1
1502	16	44	63	0,1

Z vyššie uvedených kmeňov, boli zo zbierky kultúr získané kmene 1108 a 1502 a boli uložené pod vstupnými číslami NRRL 3112 a respektíve CBS 115.39. Kmeň NRRL 3112 sa použil na výrobu amylglukozidázy, a-amylázy a glukoamylázy. Kmeň CBS 115.39 bol použitý na výrobu amylázy.

C.3 - Výroba exopeptidázy v laboratórnom merítku

Niektoré vytriedené kmene, ktoré sú popísané v Príklade 1 boli podrobené fermentácii v laboratórnych fermentoroch (10 litrov). Dosiahnuté výsledky s druhom 1502 sú uvedené v Príklade.

Spóry kmeňa Aspergillus niger No 1502 boli po 7-10 dennej inkubácii pri teplote 30°C zachytené na PDAdoskách. Inokulačný krok sa uskutočnil v pretrepávanej banke pri pH 4,8 a počas 24 hod. s médiom, ktoré je tvorené glukózou (20 g/1) a macerovanou kukuricou (20 g/1). Hlavný fermentačný proces bol uskutočnený dávkovacím postupom. Výživné preparáty boli nasledujúce: 100 g/1 maltodextrínov, 40 g/1 múky zo sójových bobov, 40 g/1 hydrolyzovaného kazeínu, 5 g/1 macerovanej kukurice, 2 g/1 želatíny, 2 g/1 dihydrogénfosforečnanu draselného, 1,3 g/1 dusičnanu sodného, 1 g/1 chloridu amónneho, 0,01 g/1 síranu železa a 0,5 g/1 antipenivého činidla.

Všetky výživné zložky boli najskôr spoločne premiesené, okrem maltodextrínu. pH bolo upravené na hodnotu 4,8 + 0,1. Fermentor bol potom sterilizovaný pri teplote 125°C počas 40 min. Roztok maltodextrínu bol sterilizovaný oddelene a pridaný do sterilného, ale ochladeného fermentačného prostredia.

Hlavná fermentácia bola uskutočnená v laboratórnom fermentore, ktorý bol vyplnený 6 1 média popísaného vyššie, a ktoré bolo naočkované pomocou očkovacej nádoby. Na udržanie čo najvyššej možnej koncentrácie rozpusteného kyslíka, bol upravený prívod vzduchu a miešanie. Teplota bola udržovaná na 30°C. keď boli všetky živiny spotrebované, bola fermentácia zastavená, t.j. po asi 130 hod.

Fermentovaná živná pôda bola prefiltrovaná na odstránenie všetkých mikroorganizmov. Vo filtráte bola zmeraná aktivita aminopeptidázy a endoproteázy:

0,15 Leu-AP/ml

1,0 Phe-AP/ml

0,05 Val-AP/ml

0,1 PU/ml

Na vytvorenie kvapalnej aminopeptidázy potom bola uskutočnená ultrafiltrácia (UF), stabilizačným činidlom bol glycerol (50%). Tak sa získal roztok, ktorý bol nazvaný Peptidáza L2, a mal nasledujúcu aktivitu:

0,5 Leu-AP/ml

3,2 Phe-AP/ml

0,05 Val-AP/ml

0,1 PU/ml ,

Tieto výsledky ukazujú, že vybraný kmeň Aspergillus niger rástol pri tu vybraných podmienkach a vytváral aminopeptidázy bez nevyhnutného množstva endoproteázy.

- 16 C.4 - diagramy pH enzymatických aktivít

Aktivity Leu-AP a Phe-AP boli stanovené pomocou peptidázy L2 (viď Príklad 2) pri použití rôznych pufrov na udržanie rozsahov pH od 2,5' do 9,0.

Diagram pH leucín-aminopeptidázy z Aspergillus niger znázorňuje Obr. 1.

Diagram pH fenylalanín-aminopeptidázy z Aspergillus niger znázorňuje Obr. 2.

Z obrázkov je zrejmé, že Leu-AP je aktívny v rozsahu pH od 5 do 8,5, zatial čo Phe-AP je aktívny v rozsahu pH od

5,5 do 9 a je podobný aminopeptidázam z iných species Aspergillus.

C.5 - Teplotné diagramy enzymatických aktivít

Aktivity	Leu-AP	a Phe-AP boli	stanovené	pomocou
peptidázy L2,	ale pri	použití odlišných	očkovacích	teplôt
na udržanie teplotného	intervalu od 5 do	70°C.
Teplotné	diagramy	sú na Obr. 3.
Výsledky	ukazujú,	že každý enzým	má svoju	odlišnú

optimálnu teplotu, čo je teplota 50°C pre Leu-AP a 60°C pre Phe-AP. Ďalej sa popisuje spôsob výroby aminopeptidáz z kultúry Aspergillus. Tieto aminopeptidázy majú optimálnu aktivitu v rozsahu pH 6-8 a v rozsahu teplôt 50-60°C; okrem toho vplyvom podmienok pri pestovaní sa môžu aminopeptidázy vytvárať bez pozorovateľného alebo podstatného množstva endoproteázy. Výhodná je vyššia aktivita aminopeptidázy ako endoproteázy, výhodnejšie lOx vyššia, ešte výhodnejšie 30x vyššia.

D. Maltogénna amyláza (scukornatenie)

Amyláza, ktorá je použitá v scukorňujúcom kroku postupu podía vynálezu je enzým, ktorý štiepi v dextrínoch alebo v škrobe a-1,4 glukózo-glukózové väzby s koncovými prevládajúcimi produktmi maltózou a/alebo glukózou. Velmi dobré výsledky sa získajú s α-amylázou z Aspergillus oryzae obchodne dostupnej od Gist-Brocades pod obchodnou značkou Brewer's fermex alebo s rekombinantnou β-amylázou z Bacillus amyloliquefaciens obchodne dostupnej od Novo pod obchodnou značkou Novamyl.

Príklad 1

Čirok (var. FAFA FARA) a kukuričné klasy boli rozomleté podía štandardných technických podmienok týkajúcich sa výroby piva. Jedna časť zŕn (60 % čiroku + 40 % kukuričných klasov) je podrobená hydratácii s 3 dielmi vody. Pridal sa chlorid vápenatý, aby sa zaručilo celkovo 200 ppm Ca²⁺ iónov v skvapalnenom prostredí. Pomocou hydroxidu vápenatého bolo upravené pH na 6,5. Pridalo sa B.A.T. S. v dávke 1,5 kg na Tonu zŕn. Pridali sa ďalšie proteolytické enzýmy v množstve, ako ukazuje Tabuľka 2:

Tabuľka 2

Skúška č.	Enzýmy	Dávka / T zŕn
1	žiadne	0
2	Brewers Protease 2000	1,2 kg
3	Brewers Protease 2000	1,2 kg
	Exo-peptidáza z A. sojae	73000 Leu-AP
4	Pastimase 400	10 kg
5	Pastimase 400	10 kg
	Exo-peptidáza z A. sojae	73000 Leu-AP

Zmes sa udržiava pri teplote 50°C počas 1 hodiny; teplota sa potom zvyšuje až na 95°C (rýchlosť l°C/min.) a na tejto teplote 95°C sa udržiava počas 45 minút. Počas 5 minút je potom ochladená na teplotu 60°C. Nasledoval prídavok Brewers Fermex (600 g/T). Rmut sa scukorňuje počas 45 minút pri teplote 60°C. Teplota sa nasledovne zvyšovala až na 76°C a na tejto teplote sa udržuje počas 10 minút. Rmut sa potom nalial do lievika, ktorý obsahoval filtračný papier Schleicher a Schuell. Potom bol meraný objem filtrovaného sladu a rovnako tak bola zisťovaná jeho merná hmotnosť. Uvedené hodnoty dovoľujú spočítať extrakt a výťažok sladu. Pomocou činidla ninhydrínu ' s glycínom ako štandardom, boli zmerané aminokyseliny. Na porovnanie sladov medzi sebou boli získané koncentrácie aminokyselín opravené na rovnaký cukorný obsah (12° Plato).

Zistené údaje sú uvedené v Tabuľke č. 3:

Tabulka 3

Skúška č.	Filtrovaný objem (ml)	Výťažok (%)	Aminokyseliny pri 12° Plato (mg/1)
1	310	85,4	26, 9
2	370	86,9	54,7
3	382	90,2	119, 5
4	365	86, 9	76,2
5	372	91,0	102,3

Získané výsledky ukazujú, že použitie endoproteázy v kombinácii s exo-peptidázou v postupe podľa vynálezu umožňuje, aby sa nezvyšovalo len množstvo aminokyselín v slade, ale aj jej výťažok a filtrovatelnosť.

Príklad 2

V tomto súbore skúšok boli testované tie isté varené nápoje ako v príklade 1, ale s použitím neutrálnej proteázy z Bacillus amyloliquefaciens (1,8 kg Brewers Protease 2000 na T zŕn) s rôznymi exo-peptidázami z Aspergillus species, ako uvádza Tabulka 4:.

Tabulka 4

Skúška č.	Používané exo-peptidázy
Biologický, pôvod	Leu-AP/T	Phe-AP/T
1	žiadny	0	0
2	Aspergillus sojae	73000	49000
3	Aspergillus oryzae	73000	53000
4	Aspergillus niger	25000	100000

Zistené údaje sú uvedené v Tabulke 5:

Tabulka 5

Skúška č.	Filtrovaný objem (ml)	Výťažok (%)	Aminokyseliny pri 12° Plato (mg/1)
1	340	86, 1	61, 4
2	400	90, 0	116, 0
3	385	87, 9	95,7
4	382	89, 8	99, 8

Všetky kombinácie endoproteázy + exo-peptidázy sa ukazujú lepšie ako endoproteáza samotná, nezávisle na biologickom pôvode exo-peptidázy. Okrem obsahu aminokyselín je pri tejto skúške lepšia filtrovatelnosť a výťažok.

Príklad 3

Na kontrolu použitelnosti získaných sladov na výrobu piva sa varil cirok a kukuričné klasy, ako popisuje Príklad 1; súčasne sa varí vzorka, v ktorej nie je obsiahnutý enzým, ale slad sa nahradzuje celkom čirokom, čo uvádza Tabuľka 6:

Tabulka 6:

Skúška č.	Enzýmy	Dávka
1	Slad	nahradzuje čirok
2	Brewers Protease 2000 Exo-peptidáza z A. sojae	1,8 kg/T 42000 Leu-AP/T
3	Brewers Protease 2000 Exo-peptidáza z A. oryzae	1,8 kg/T 40000 Leu-AP/T
4	Brewers Protease 2000 Exo-peptidáza z A. niger	1,8 kg/T 25000 Leu-AP/T

Zistené údaje sú uvedené v Tabulke 7:

Tabulka 7

Skúška č.	Filtrovaný objem (ml)	Výťažok (%)	Aminokyseliny pri 12° Plato (mg/1)
1	400	82,3	222, 0
2	395	89,5	127, 0
3	390	87, 9	109,0
4	375	91,1	113,1

Jednotlivé kompozície aminokyselín každého vareného nápoja boli stanovené metódou HPLC. Aminokyseliny sa klasifikujú podlá rýchlosti asimilácie na Saccharomyces sp.:

Skupina A: rýchla asimilácia

Skupina B: stredne rýchla asimilácia

Skupina C: pomalá asimilácia

Získané výsledky ukazuje Tabulka 8:

(Hodnoty N.B. v mg/1 sa nezhodujú so súhrnom hodnôt aminokyselín, ktoré uvádza Tabulka 6, pretože v uvádzanej Tabulke 7 bol použitý ako štandard glycín, zatial čo kalibrácia HPLC je celkom odlišná.)

Tabulka 8:

Am i nokyse1 i ny (mg/1)
Skúška	Č.
1	2	3	4
Skupina A			¹
Glu		36	38	30	39
Asp		53	29	26	29
Ser		143	65	51	56
Thr		54	28	21	22
Lys		95	65	45	47
Arg		133	114	87	74
Celkom	513	340	260	268

Skupina B
Val		102	36	32	28
Met		26	37	30	28
Leu		158	216	205	166
íle		75	41	42	28
His		58	26	16	15
Celkom	418	356	325	265

Skupina Gly		29	19	13	17
Phe		134	89	85	95
Tyr		107	67	58	57
Trp		55	11	11	12
Ala		97	80	66	73
Celkom¹	421	265	233	253

Každý zo sladov sa varil 45 minút; ku každému zo sladov sa sterilné pridala prevarená destilovaná voda, aby sa nastavil obsah cukru na hodnotu 12° Plato. Do sterilných nádobiek bolo aseptický odliate 350 ml z každého štandardizovaného sladu; každá nádobka bola naočkovaná pivovarskými kvasinkami (5 g/1). Fermentácia .prebiehala počas 8 dní pri teplote 11°C. Zrejmé zriedenie každého fermentovaného sladu sa stanovilo z hustoty po 8 dňoch fermentácie.

Získané výsledky uvádza Tabulka 9.

Tabulka 9

Skúška č.	Zrejmé zriedenie po 8 dňoch (%)
1	82, 0
2	81,0
3	80,4
4	nestanovené

V postupe podlá vynálezu bola kombinácia endoproteázy + exopeptidázy aplikovaná na čirok, vynález umožňuje vyrábať slady, ktoré majú uspokojivú schopnosť fermentovať pivo v porovnaní so sladmi získanými pomocou sladu.

Prekvapivá kombinácia endoproteázy z Bacillus amyloliquifaciens + exo-peptidázy z Aspergillus sojae poskytuje významné zlepšenie v skupine aminokyselín A + v skupine B.

Príklad 4

Tento príklad uvádza výhody umelo prítomných exopeptidáz pri skvapalňujúcom kroku skôr ako pri scukorňujúcom kroku v postupe podľa vynálezu. Čirok a klasy kukurice sa varia rovnako, ako uvádza Príklad 1. Brewers Protease 2000 sa pridala pri skvapalňujúcom kroku (1,8 kg/T) do všetkých varených nápojov. Exo-peptidáza z Aspergillus sojae (40000 Leu-AP/T) sa pridala buď pri skvapalňujúcom kroku (skúška n° 1-2) alebo pri scukorňujúcom kroku (skúška n° 3-4) .

Získané výsledky uvádza Tabuľka 10:

Tabulka 10

Skúška č.	Filtrovaný objem (mg/1)	Výťažok (%)	Aminokyseliny pri 12° Plato (mg/1)
1	380	89, 3	115,1
2	385	89, 5	119, 8
3	370	89, 4	109, 1
4	370	89, 8	112, 0

Opakovanými rovnakými . skúškami boli stanovené štandardné odchýlky filtrovaného objemu, výťažku a obsahu aminokyselín. Získané hodnoty sú 10 ml, 0,5 %, respektíve 0,9 mg/1.

Vyššie uvedené výsledky ukazujú, že vnesenie exopeptidáz v skvapalňujúcom kroku prináša významnú výhodu v produkcii aminokyselín a najmä prispieva k filtrovatelnosti.

- 25 Príklad 5

Uvedený príklad ilustruje vplyv rastúcich dávok exopeptidáz z A. oryzae vo varených nápojoch.

Cirok + kukuričné klasy sa varia rovnako ako uvádza Príklad 1. Pri skvapalňujúcom kroku sa pridali Brewers Protease 2000 a exopeptidáza (Tabulka 11).

Tabulka 11

Skúška č.	Enzýmy	Dávka
1	žiadny	0
2	Brewers Protease 2000	1,0 kg/T
3	Brewers Protease 2000 Exopeptidáza z A. oryzae	1,0 kg/T _; 62000 Leu-AP/T
4	Brewers Protease 2000 Exopeptidáza z A. oryzae	1,0 kg/T 109000 Leu-AP/T
5	Brewers Protease 2000 Exopeptidáza z A. oryzae	1,0 kg/T 155000 Leu-AP/T
6	Brewers Protease 2000 Exopeptidáza z A. oryzae	1,0 kg/T 234000 Leu-AP/T
7	Brewers Protease 2000 Exopeptidáza z A. oryzae	1,0 kg/T 313000 Leu-AP/T

Získané výsledky ukazuje Tabulka 12:

Tabuľka 12

Skúška č.	Filtrovaný objem (ml)	Výťažok (%)	Aminokyseliny pri 12° Plato (mg/1)
1	188	88, 4	39,1
2	275	88, 9	59, 8
3	280	89,1	81,5
4	280	89, 6	90,5
5	280	89, 7	95,3
6	280	90, 4	101,0
7	280	89,5	114,0

Z vyššie uvedeného vyplýva, ^;že čim väčšie množstvo exopeptidázy, tým vyššie výťažky a väčšie množstvá.volných aminokyselín. Optimálna hodnota konverzne-filtračného efektu sa dosiahne dokonca pri nižšej úrovni exopeptidázy.

Príklad 6

Príklad ilustruje vplyv rastúcej dávky exopeptidáz z A. niger vo varených nápojoch.

Čirok a kukuričné klasy sa varia rovnako, ako uvádza Príklad 1. Pri skvaplňujúcom kroku sa pridali Brewers Protease 2000 a exopeptidáza.

Tabuľka 13

Skúška č.	Enzýmy	Dávka
1	žiadne	0
2	Brewers Protease 2000	1,0 kg/T
3	Brewers Protease 2000 Exopeptidáza z A. niger	1,0 kg/T 51000 Phe-AP/T
4	Brewers Protease 2000 Exopeptidáza z A. niger	1,0 kg/T 90000 Phe-AP/T
5	Brewers Protease 2000 Exopeptidáza z A. niger	1,0 kg/T 127000 Phe-AP/T

Výsledky ukazuje Tabulka 14:

Tabulka 14

Skúška č.	Filtrovaný objem (ml)	Výťažok (%)	Aminokyseliny pri 12° Plato (mg/1)
1	188	88, 4	39,1
2	240	88, 6	60,1
3	246	89, 7	63, 7
4	258	89,5	64,2
5	232	- 89,7	65,7

Tiež tu je vidieť, že čím väčšie množstvo exopeptidázy, tým sú vyššie výťažky a väčšie množstvá voľných aminokyselín. Tieto výsledky ilustrujú,, že sa exopeptidáza A. oryzae ukazuje byť o niečo lepšia ako exopeptidáza A.niger.

Príklad 7

Jačmeň (var. PLAISANT) bol rozomletý na jemnú múku, ktorá bola upravená v pivovare na filtráciu kalolismi. Bolo suspendované 57 g múky pri teplote 50°C počas 1 hodiny v 3000 ml vody, ktorá obsahovala:

mg B.A.T.S .

mg filtrase L3000 (+) (β-glukanáza z Bacillus amyloliguiefaciens obchodne dostupnej od Gist-brocades) 4 mg Brewers Protease 2000 a relevantné množstvo exo-peptidázy z Aspergillus sojae. Teplota sa potom zvýšila až na 63°C (rýchlosť l°C/min.) a na tejto teplote bola udržiavaná počas 30 minút. Potom bola teplota zvýšená až na 90°C (rýchlosť l°C/min.) a udržiavaná na tejto teplote počas 20 minút. Varený nápoj je potom ochladený na 25°C a odstredený pri 7000g počas 15 minút. Kvapalina nad usadeninou sa nakoniec analyzuje na rozpustné proteíny a voľné aminokyseliny.

Výsledky uvádza Tabuľka 15:

Tabuľka 15

Skúška č.	Dávka exo-peptidázy (Leu-AP/T)	Aminokyseliny pri 12° Plato (mg/1)	Rozpustné proteíny (% suchej látky)
1	0	77, 9	4,21
2	25000	95, 3	4, 75
3	50000	118, 4	4, 99
4	100000	133,2	5, 42
5	200000	203, 6	6, 63
6	400000	295, 0	7, 55

Výsledky ukazujú, že exopeptidáza z Aspergillus sojae umožňuje dosiahnuť vo varenom nápoji z jačmeňa rovnakú hladinu volných aminokyselín, ako vo varenom nápoji zo sladu kde sa v priebehu skvapalňujúcich krokov aplikuje enzým.

Príklad 8

Jačmeň sa varil podlá Príkladu 7, ale exo-peptidáza z Aspergillus sojae bola nahradená exo-peptidázou z Aspergillus niger.

Výsledky uvádza Tabulka 16:

Tabulka 16

Skúška č.	Dávka exo-peptidázy (Leu-AP/T)	Aminokyseliny pri 12° Plato (mg/1)	Rozpustné pro- teíny (% suchej látky)
1	0	68,2	4,37
2	10000	69,8	4,20
3	50000	75,2	4,25
4	200000	78, 0	4,16
5	500000	89,1	4, 50
6	1000000	101,0	4,18

Aj keď sa exo-peptidáza z Aspergillus niger zdá byť menej účinná ako u Aspergillus sojae, umožňuje dokonca tiež dosiahnuť hodnoty 100 mg/1 aminokyselín v 12° Plato slade jačmeňa, čo je uspokojivá hodnota na fermentáciu piva.

Uloženie mikroorganizmov

Kmene používané na výrobu exopeptidáz sú uložené v Central Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat i 1, Baarn, The Nederlands pod' depozitnými číslami CBS 115.39 (verejná zbierka), CBS 209.96 (A.sojae (DS 8351); s dátumom uloženia: 12. februára 1996) a CBS 210.96 (A.oryzae (DS 23617); s dátumom uloženia: 12. februára 1996).

]>ΰ /c (f e -?<ľ

Claims

patentové nároky'

1. Postup výroby fermentovaného sladu, zahrňujúci kroky:

(a) skvapalnenie obilného materiálu s pomocným činidlom s α-amylázovou a/alebo endoproteázovou aktivitou na získanie skvapalneného rmutu, a (b) scukornatenie uvedeného skvapalneného rmutu v prítomnosti a-amylázy, (c) filtráciu skvapalneného a scukornateného rmutu na získanie fermentovatelného sladu, kde aspoň jeden z vyššie uvedených krokov (a) a (b) sa uskutočňuje v prítomnosti enzýmu, ktorý má exo-peptidázovú aktivitu.
2. Postup podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obilný materiál zahrňuje aspoň 20 % nesladovej

I obilniny.
3. Postup podlá nároku 2, vyznačujúci sa tým, že obilný materiál zahrňuje aspoň 20 % nesladového ciroku.
4. Postup podlá nároku 3, vyznačujúci sa tým, že obilný materiál zahrňuje aspoň 50 % nesladového čiroku.
5. Postup pódia ktoréhokolvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že exopeptidáza je prítomná počas skvapalnenia obilného materiálu.
6. Postup podľa vyznačujúci hubová exopeptidáza.

ktoréhokoľvek sa tým tým z nárokov 1 až že exopeptidáza

5, je
7. Postup podlá nároku 6, vyznačujúci sa t ý m , že huba je Aspergillus species.
8. Postup podľa nároku 7, vyznačujúci sa t ý m , že huba je Aspergillus sojae.
9. Postup podlá nároku 6, vyznačujú.c i sa tým, že exo-peptidáza je amino-peptidáza.
10. Postup podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že sa endopeptidáza získa z Bacillus amyloliquefanciens.
11. Postup varenia piva zahrňujúci kroky výroby sladu s použitím postupu podľa ktoréhokoľvek nároku 1 až 10 a fermentáciu uvedeného sladu na získanie piva.
12. Postup enzymatického uvolnenia voľne dostupného dusíka z obilnín s obsahom vysokého množstva glutelínu a/alebo prolamínu, ktorý zahrňuje krok pridania kombinácie endoproteázy a exo-peptidázy k zrnám alebo k skvapalnenému rmutu, získanému z uvedených zŕn.
13. Postup výroby alkoholu, alebo nápoja obsahujúceho alkohol, ktorý zahrňuje krok fermentácie sladu získaného postupom podlá nároku 1 v prítomnosti kvasiniek schopných vytvárať alkohol.
14. Použitie exopeptidázy v postupe výroby fermentovatelného sladu.
15. Použitie podľa nároku 14, vyznačuj úce sa tým, že uvedená exopeptidáza je hubová exopeptidázou.
16. Použitie podía nároku 14 alebo 15, vyznačujúce sa tým, že uvedená exopeptidáza je z huby vybranej zo skupiny pozostávajúcej z Aspergillus niger, Aspergillus oryzae alebo Aspergillus sojae.
17. Použitie podlá ktoréhokoľvek jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúce sa tým, že slad je vyrobený aspoň z čiastočne nesladového regionálneho materiálu.
18. Použitie podía ktoréhokoľvek jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúce sa tým, že slad je vyrobený z nesladového čiroku alebo z nesladového jačmeňa.
19. Použitie exopeptidáz na zlepšenie organoleptických vlastností piva.
20. Použitie exopeptidázý na zlepšenie filtrovatelnosti sladu.