CN1211275A - 生产可发酵谷汁的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了从谷物中生产可发酵谷汁的方法,由以下步骤组成:(a)在α－淀粉酶和/或内切蛋白酶活性作用下,将谷物液化成为液化谷浆;(b)在α－淀粉酶的存在下使所说的液化谷浆进行糖化;(c)将已液化和糖化的谷浆进行过滤,获得可发酵谷汁。上述步骤(a)、(b)至少其一是在具有外切蛋白酶活性的酶存在下进行的。可用的具有外肽酶活性的酶类有外肽酶,优选为热稳定的外肽酶,如真菌类氨肽酶,而热稳定的羧肽酶也是有用的。根据本发明,尤其优选的是曲霉菌特别是黑曲霉、米曲霉和豆曲霉的内源氨肽酶。

Description

生产可发酵谷汁的方法
                        发明领域
本发明涉及从谷物，特别是未发芽谷物中制备可发酵谷汁(wort)的方法。本发明还涉及按照本发明所述方法制得的谷汁。本发明又涉及按照本发明所述方法所制得的谷汁在酒精生产、蒸馏工业或啤酒酿造中的发酵反应。
                        背景技术
啤酒是利用发芽或未发芽谷物发酵而生产出来的。在后一种情形中，谷物在商用酶作用下发生液化和糖化，产生谷汁，其中含有酵母发酵所必需的可发酵糖类、氨基酸或其它形式氮(称为“可自由利用性氮”，Freely Available Nitrogen,FAN)。
例如，Macfadden等(Macfadden D.P.和Clayton M.,国际酿造与饮料工业(Brewing and Beverage Industries International)(1989年)，第1卷，77-81页)建议在利用未发芽高粱酿造啤酒时加入一些酶，如α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、真菌类α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶等等。MacFadden等还建议在使用未发芽高粱时加入酵母食物以进行发酵。
Bajomo等(Bajomo M.F.和Young T.W.，酿造学会杂志(J.Inst.Brew)，1992年，第88卷，515-523页；Bajomo M.F.和YoungT.W.，酿造学会杂志(J.Inst.Brew)，1994年，第100卷，79-843页)报道了利用100％未发芽高粱粒酿造啤酒的方法，尽管利用未发芽高粱制得的谷汁中，其FAN含量(51毫克/升)远低于利用发芽大麦所制得麦汁经发酵后的基本水平。
国际专利中请号WO 92/20777中描述了一种生产酒精的方法，它包括以下步骤：在淀粉酶作用下对未发芽完整谷物或牲畜饲料进行液化，在葡糖淀粉酶和酸性真菌蛋白酶作用下进行谷浆糖化。该方法要求在发酵过程和糖化过程中加入蛋白酶。发酵培养基的pH值在4-5之间，在此条件下，真菌类外肽酶是没有活性的(Labbe JP,Rebeyrotte P.，生物化学(Biochimie)(1974年)，第56卷，839-844页；Lehman K.和Uhlig H.,Hoppe Seyler’s Z.Physiol.Chem(1969年)，第350卷，99-104页)。因此，上述方法的一个缺点是，在其反应条件下，所用的真菌类蛋白酶只进行内切蛋白酶解，产物主要是寡肽，而游离氨基酸则很少。
为对本领域有一个一般的了解，可以参考Palmer的综述(Palmer G.H.，谷类科学与技术。“谷类科学与技术”(1989年)，阿贝丁大学出版社编辑，阿贝丁，苏格兰，61-242页)。
                        发明概要
本发明提供了一种利用未发芽谷物生产谷汁的方法。通过这种方法生产的谷汁，其性质非常优良，如富含可自由利用性氮(后面将用FAN表示)，谷汁的滤过性好，产量也高。这种方法也可用于发芽谷物的谷汁生产中，但它在用于未发芽谷物如未发芽高粱、未发芽高粱与玉米混合物的谷汁生产中优越性尤其突出。当进行“混合酿造”，即利用发芽谷物(如发芽大麦)与未发芽谷物(如玉米、稻米或高粱)的混合物生产谷汁时，这些优点仍然存在。
因此，本发明提供了利用谷物生产可发酵谷汁的方法，此方法包括以下几个步骤：
(a)在α-淀粉酶和/或内切蛋白酶活性作用下，将谷物液化形成液化谷浆(mash)；
(b)在α-淀粉酶作用下对所说的谷浆进行糖化；
(c)对已液化和糖化的谷浆进行过滤产生可发酵性谷汁。
上述步骤(a)、(b)至少其一是在具外肽酶活性的酶存在下进行的。具有外肽酶活性的可用酶类有外肽酶，优选热稳定的外肽酶如真菌类氨肽酶，热稳定的羧肽酶也较有效。根据本发明，最好使用曲霉菌类特别是黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)或豆曲霉(Aspergillus sojae)的内源氨肽酶。
当谷物中未发芽谷粒占至少20％特别是50％以上时，比如在高粱粒中掺入未发芽玉米、稻米或其它谷物时，这种方法非常有效。根据本发明，在谷粒的液化步骤中加入外肽酶是非常有益的。
本发明还提供了一种可发酵谷汁，它可按照本发明的方法获得。本发明也涉及一种酿造啤酒的方法，其中使用了本发明的可发酵谷汁。
本发明还提供了一种酿造酒精类饮料如啤酒等的方法，包括按照本发明的方法生产谷汁、随后或同时对所说的谷汁进行发酵，并由此获得如啤酒等若干步骤。
本发明还体现在提供了一种通过酶解方法，从富含谷蛋白和/或醇溶谷蛋白的谷物中产生可自由利用性氮的方法。此方法包括在谷粒或利用所说谷粒生产的液化谷浆中混合加入内切蛋白酶和外肽酶组合物这个步骤。
本发明提供了一种生产酒精的方法。此方法包括在一种能生产酒精的酵母存在下，对根据本发明方法制得的FAN进行发酵的步骤。
本发明可用下列附图加以说明。
                        附图描述
图1是来源于黑曲霉的亮氨酸氨肽酶的pH曲线。
图2是来源于黑曲霉的苯丙氨酸氨肽酶的pH曲线。
图3是两种氨肽酶的温度曲线。
下面对整个发明进行更详细的描述。
                    发明的详细描述
本发明提供了一种从谷物中生产可发酵谷汁的方法。在此方法的工作条件下，存在至少一种具有外肽酶活性的蛋白质。真菌特别是曲霉菌的内源氨肽酶可以作为上述方法的有效酶类，这是由于这些酶在pH5-8之间的环境中都具有足够的稳定性和活性，这恰是液化步骤中的pH范围。在这种温度和pH环境下，羧肽酶的应用价值就不大了。由于糖化步骤比液化步骤中的环境要稍酸一些，因此，只要羧肽酶在50-60℃最好是50-70℃范围内足够稳定，在糖化步骤中使用羧肽酶也具有一定优越性。
相比于未加外肽酶的方法，本发明中外肽酶的使用不仅可提高谷汁中可自由利用性氮(FAN)含量，还可以提高谷汁的可滤过性和产量。
通过未发芽谷物生产可发酵谷汁时，利用本发明的方法则优点很明显。当所用的是未发芽高粱时，这种优点尤其突出。并且该谷物中还可选择性地添加其它谷类，如玉米、小麦、燕麦或稻米。本发明所提及的谷类包括高粱、小麦、大麦、燕麦、稻米、玉米及其它类似物。
由于外肽酶能提高发酵物的感官特性(口感和/或气味)，因而在通常的既含发芽谷物又含未发芽粗谷物(比如发芽谷物可达80％甚至90％以上，其余为未发芽谷物)的混合酿造中，按照本发明的方法加入外肽酶也是颇具优越性的。已经证实，利用发芽谷物、未发芽谷物或它们的混合物酿造时，这些优点是很普遍的。
酿造时利用外肽酶能显著提高可自由利用性氮含量、滤过性、产率和感官特性的谷物都富含醇溶谷蛋白和谷蛋白组分。除高粱外，稻米也属于此类(其中谷蛋白含量约80％)。使用高粱时，应注意选用那些多酚含量相对较低的品种。
除加入外肽酶外，谷汁(比如为酿造啤酒用)的生产可按通常方法进行。一般说来，整个方法包括粗谷物的液化产生谷浆(mash)及随后的谷浆糖化产生谷汁几个步骤。在发酵前进行过滤是很重要的。
液化过程通常包括以下步骤，即先将粗谷物粉碎产生合适颗粒大小的面粉，然后加入一至四份优选是三份的水进行水化处理，最后根据所使用的内切蛋白酶需要，选择性地添加50至300ppm优选是200ppm的Ca2+。嗜热脂肪芽孢杆菌来源酶可能对Ca2+依赖性较小，因而在这种情况下不再补加Ca2+。经粉碎的谷物颗粒大小应不超过3毫米，超过1.3mm大小的颗粒应不多于3.5％，小于0.25mm的颗粒也不多于1.5％。另外可利用的酶类有：纤维素酶、β-葡聚糖酶和/或其它一些植物细胞壁降解酶。
液化培养基通常利用如氢氧化钙等物质调节pH至5-8优选是6-7之间。重要的是在液化培养基中加入量至少足以部分水解谷物淀粉的α-淀粉酶(最好是热稳定的α-淀粉酶)及量足以部分降解蛋白质的内切蛋白酶。使用B.A.T.S.时，其适宜用量约为0.5-2.0公斤/吨，优选为1-1.5公斤/吨。使用Brewers Protease 2000时，其酶用量要大于0.5公斤/吨谷物，优选用量为大于1公斤/吨。使用Panstimase 400时，其酶用量要大于2公斤/吨，优选为大于5公斤/吨，最优选为大于10公斤/吨。
在液化过程中，一系列步骤通常是在较高的温度下进行的：加入α-淀粉酶和蛋白酶后，在40-65℃，优选是45-55℃，最优选是50℃条件下将混合物保温直至充分液化。保温时间长短取决于所用的谷物或谷类混合物，通常30分钟到2小时就足够了。随后，混合物温度以不需太精确的速率逐渐升至90-95℃并在此温度下保温30分钟至1小时。接着，混合物温度降至糖化作用可允许范围，通常是50至70℃，优选是55-65℃，最优选是60℃。根据糖化过程中所使用的酶的热稳定性的具体情况，混合物温度也可降至稍高于70℃的范围。当温度降至适宜范围时，加入糖化酶如Brewers Fermex(α-淀粉酶)或Novamyl(重组β-淀粉酶)。Brewers Fermex的用量范围通常为400克/吨至1公斤/吨。葡糖淀粉酶也较常使用。糖化反应进行30分钟至2小时，随后将温度升至大约75-85℃范围，并在此温度下保温约10分钟以灭活酶及不需要的微生物。这一时间并非十分关键。
由此制得的谷浆利用本领域熟知设备进行过滤。使用带Schleicher和Schuell滤纸的漏斗能有效完成过滤工作。过滤后，谷汁中加入合适的酵母进行发酵，发酵反应条件取决于所使用的酵母菌株和发酵的最终目的。除酿造啤酒外，本发明还用于作为生物燃料或酒精类饮料的酒精生产中。本领域熟练技术人员熟知应使用何种酵母株，选用何种反应条件。
制备如酿造啤酒用的谷汁时，在谷物粗品的液化步骤中加入外肽酶是非常有用的。然而，在糖化步骤中，相比于不加外肽酶，外肽酶的加入同样具有上述优点，比如能提高谷汁的FAN含量、滤过性和产量。
根据本发明的方法，反应相的pH值和温度条件应能保证真菌类外肽酶的活性。合适的外肽酶一般是真菌内源酶，曲霉菌内源酶则更为有效。已经发现，一些曲霉菌包括黑曲霉、米曲霉和豆曲霉的内源氨肽酶是非常有用的。
上述叙述清楚表明，在谷汁制备过程中的液化和/或糖化步骤加入具外肽酶活性的酶类，能生产具良好滤过性、高产率及高FAN含量的谷汁。当酿造啤酒、生产酒精类饮料(酒类)和生产酒精(用作生物燃料)所用的谷物中未发芽谷物占绝大部分甚至全部时，这种方法尤其吸引人。在麦芽进口受限或费用较高的国家，采用未发芽谷物对酿酒者们将是非常有利的。特别是在非洲，酿造啤酒通常采用含有大量高粱的谷物粗品(混和物)。
另外，利用在液化或糖化步骤(或同时两个步骤)中使用外肽酶制备的谷汁生产出的啤酒，其感官特性(口感和气味)都有所提高。当使用发芽谷物如传统的大麦芽酿造啤酒或进行混合啤酒酿造(如利用发芽和未发芽谷类混和物)时，外肽酶的使用也明显具有上述优点。
实验A．热稳定α-淀粉酶(液化反应)
根据本发明的方法，在液化步骤中使用的α-淀粉酶是一种能切割淀粉中α-1,4葡葡糖苷键的酶。通常选用具热稳定性的α-淀粉酶。使用Gist-Brocades公司来自地衣芽孢杆菌的商标名为Brewers AmyliqThermo Stable(B.A.T.S)的商品酶能取得非常好的效果。B．内切蛋白酶(液化反应)
根据本发明的方法，在液化步骤中使用的内切蛋白酶通常是能在液化步骤初期的pH和温度条件下(pH5-6，温度范围45-55℃)切割蛋白质肽键的酶类。选用Gist-Brocades公司来自解淀粉芽孢杆菌的商标名为Brewer’s Protease 2000的中性蛋白酶商品能取得非常好的效果。也可使用来自弗氏链霉菌的蛋白水解酶，如Panstimase SARL公司商标名为Panstimase 400的商品。C．外肽酶(液化反应和/或糖化反应)
本发明方法的液化步骤中使用的外肽酶通常是一些能切割多肽或蛋白质的N-末端键的酶类。使用来自曲霉菌种的制品能取得非常好的效果。下面将公开一种从黑曲霉中制备氨肽酶的方法。C.1酶活性的测定
外肽酶活性用亮氨酸氨肽酶单位或苯丙氨酸氨肽酶单位表示：
1单位亮氨酸氨肽酶(Leu-AP)为在pH7.2、20℃条件下将L-亮氨酸对硝基苯胺以1微摩尔/分钟的速率生成对硝基苯胺所需的酶量；
*苯丙氨酸氨肽酶单位
1单位苯丙氨酸氨肽酶(Phe-AP)为在pH7.2、20℃条件下将L-苯丙氨酸对硝基苯胺以1微摩尔/分钟的速率生成对硝基苯胺所需的酶量。C.1.1．苯丙氨酸氨肽酶(Phe-AP)
将苯丙氨酸对硝基苯胺以0.9mM浓度溶解于7.5mM HCl中。将1ml上述溶液与1.5ml 0.1M磷酸缓冲液(pH7.2)混匀。再在上述混合液中加入0.5ml酶，置于20℃条件下反应，并将加酶时刻定为零时刻。反应15分钟后加入1ml 1N HCl。空白对照则在零时刻加入1N HCl。测定空白对照和实验组在400纳米的光密度值，分别用OD空白、OD实验组表示。按下述公式计算酶活性：
Figure A9719222300101
C.1.2．亮氨酸氨肽酶(Leu-AP)
将亮氨酸对硝基苯胺溶解于水中至终浓度9mM。取1ml上述溶液，加入1.5ml 0.1M磷酸缓冲液(pH7.2)，混匀，再在零时刻加入0.5ml酶，置于20℃条件下反应。15分钟后加入1ml 1N HCl。空白对照则在零时刻加入1N HCl。测定空白对照和实验组在400纳米的光密度值，分别用OD空白、OD实验组表示。按下述公式计算酶活性：C.1.3．内切蛋白酶(PU)
PU的活性是利用酪蛋白在pH6.0、40℃环境下处理1小时后的水解程度来测定的。1单位PU是指残余蛋白经三氯乙酸沉淀后、按1微摩尔/分钟速率产生酪氨酸所需酶量。C.2黑曲霉菌株的筛选
从不同来源分离到的或从培养物保藏中心获得的200个黑曲霉菌株置于培养基中培养。培养基组成为：土豆粉15克/升，细菌蛋白胨20克/升，酵母提取物7克/升，KH2PO4 4克/升，MgSO4 0.5克/升，CaCl20.5克/升，ZnCl2 0.5克/升，pH4.8。将霉菌于30℃以240转/分速率振荡预培养24小时，再于30℃以275转/分速率振荡培养96小时，然后收集上清，并按前面描述的方法测定亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸氨肽酶活性。如表1所示，一些黑曲霉菌株具有高水平生产至少其中一种酶活性的能力(表中每个数值都是4个独立实验的平均值)。
表1
菌株号                      上清中氨肽酶活性 内肽酶
Leu-AP/升 Phe-AP/升 Val-AP/升 PU/毫升
    1053     25     170     32     ＜0.1
    1085     23     135     48     0.1
    1103     37     285     40     0.1
    1108     60     435     29     0.1
    1444     40     192     50     0.1
    1497     25     105     75     0.1
    1502     16     44     63     0.1
上述菌株中，1108号和1502号是从一个培养物保藏中心获得的，其保藏号分别为NRRL 3112和CBS 115.39。NRRL 3112株已用于淀粉葡糖苷酶、α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的生产中。CBS115.39株已用于淀粉酶的生产工艺。C.3实验室规模生产外肽酶
实施例1中描述的一些筛选菌株已用于实验室发酵罐(10升)的发酵中。本例给出1502菌株的实验结果。
黑曲霉菌株No.1502于30℃保温7-10天后，收集其孢子于PDA盘中。24小时内将其接种于装有含20克/升葡萄糖和20克/升玉米糊培养基的摇瓶中。
主要发酵过程按批量进行。使用了下列营养物：100克/升麦芽糊精，40克/升大豆粉，40克/升水解酪蛋白，5克/升玉米糊(corn steep)，2克/升明胶，2克/升磷酸二氢钾，1.3克/升硝酸钠，1克/升氯化铵，0.01克/升硫酸铁和0.5克/升消泡剂。
除麦芽糊精外其余营养组分先混匀，并调节pH至4.8±0.1，然后将发酵罐于125℃灭菌40分钟，麦芽糊精溶液单独灭菌再加入至无菌并已冷却的发酵培养基中。
实验室发酵罐内加入6升上述培养基并接种至接种瓶中，进行发酵。调节搅拌和通气状况以尽量提高培养基中溶解氧气的浓度。将温度维持在30℃，当所有营养物已消耗完(即大约130小时)后，停止发酵。
发酵液过滤以除去所有的微生物，测定滤液中氨肽酶和内肽酶活性为：
0.15     Leu-AP/毫升
1.0      Phe-AP/毫升
＜0.05   Val-AP/毫升
＜0.1    PU/毫升随后进行超滤浓缩以制成液体氨肽酶，并加入甘油(50％)作酶稳定剂。由此获得的溶液称为Peptidase L2，它具有以下活性：
0.5      Leu-AP/毫升
3.2      Phe-AP/毫升
＜0.05   Val-AP/毫升
＜0.1    PU/毫升
这些结果表明，我们挑选的黑曲霉菌株在我们选择的条件下产生的氨肽酶，其内肽酶活性很低。C.4酶活性的pH曲线
Leu-AP和Phe-AP活性均利用Peptidase L2(见实施例2)来测定，但使用pH值由2.5至9.0的不同缓冲液进行测定。
图1是来源于黑曲霉的亮氨酸氨肽酶的pH曲线。
图2是来源于黑曲霉的苯丙氨酸氨肽酶的pH曲线。
图示表明亮氨酸氨肽酶的pH适宜范围为pH5-8.5，而苯丙氨酸氨肽酶则在pH5.5-9的范围内具有活性，与来源于其它曲霉菌种的氨肽酶类似。C.5酶活性的温度曲线
Leu-AP和Phe-AP活性均利用Peptidase L2来测定，但使用由5-70℃范围内的不同保温温度条件。
温度曲线如图3所示。结果表明两种酶有不同的最适温度，其中Leu-AP的最适温度为50℃，而Phe-AP则为60℃。
本文公开了一种从黑曲霉培养物中生产氨肽酶的方法。这些氨肽酶的适宜pH范围为pH6-8，适宜温度范围为50-60℃。此外，利用这种方法制备的氨肽酶，其中内肽酶含量很低甚至检测不到。这种方法生产的氨肽酶的一个优点是，其氨肽酶活性要比外切蛋白酶活性高，优选达10倍以上，最优选是30倍以上。D．麦芽糖淀粉酶(糖化作用)
本发明方法中糖化步骤使用的淀粉酶是能切割糊精或淀粉内α-1,4葡葡糖苷键产生以麦芽糖和/或葡萄糖为主要产物的一种酶。使用Gist-Brocades公司来源于米曲霉的商标为Brewers’Fermex的商品α-淀粉酶或Novo公司来源于解淀粉芽孢杆菌的商标为Novamyl的商品重组β-淀粉酶均能取得很好的效果。
实施例1
按生产啤酒的传统要求粉碎高粱(FAFA FARA品种)和玉米芯，按每份谷物(含60％高粱和40％玉米芯)加入3份水的比例进行水化处理。加入氯化钙至液化培养基中Ca2+浓度为200ppm，再用Ca(OH)2调节pH至6.5。按每吨谷物1.5公斤的酶量加入B.A.T.S，按表2剂量加入其它蛋白水解酶：
表2
测试号     酶类     每吨谷物的酶用量
    1     无     0
    2  Brewers Protease 2000     1.2kg
    3  Brewers Protease 2000豆曲霉来源的外肽酶     1.2kg73000 Leu-AP
    4     Panstimase 400     10kg
    5     Panstimase 400豆曲霉来源的外肽酶     10kg73000 Leu-AP
混合物于50℃保温1小时，接着升温至95℃(升温速率为1℃/分钟)，并在95℃下保温45分钟。然后在5分钟内将温度降至60℃，再按600克/吨剂量加入Brewers Fermex，并将谷浆于60℃糖化45分钟。将温度升至76℃，并在此温度下保温10分钟。将谷浆倒入装有Schleicher和Schuell滤纸的漏斗内，测定滤过谷汁体积和比重以计算抽提率和产率。以甘氨酸作标准，通过茚三酮试剂测定其中氨基酸含量。测得的氨基酸含量值进行校正以能与同一糖度的谷汁(12°Plato)相比较。
结果如表3所示：
表3
测试号 过滤体积(毫升)     产率(％) 12°Plato时的氨基酸含量(毫克/升)
    1     310     85.4     26.9
    2     370     86.9     54.7
    3     382     90.2     119.5
    4     365     86.9     76.2
    5     372     91.0     102.3
这些结果表明：根据本发明，在方法中混合加入内切蛋白酶和外肽酶能提高谷汁的氨基酸含量、产量和滤过率。
实施例2
在实验中使用与实施例1相同的酿造品进行，但按表4采用来自解淀粉芽孢杆菌的中性蛋白酶(每吨谷物使用1.8公斤Brewers Protease2000)及来自不同曲霉菌株的外肽酶组合：
表4
    测试号                            所使用的外肽酶
    生物来源 Leu-AP/吨 Phe-AP/吨
    1     无     0     0
    2     豆曲霉     73000     49000
    3     米曲霉     73000     53000
    4     黑曲霉     25000     100000
结果如表5所示：
表5
测试号 过滤体积(毫升)     产率(％) 12°Plato时的氨基酸含量(毫克/升)
    1     340     86.1     61.4
    2     400     90.0     116.0
    3     385     87.9     95.7
    4     382     89.8     99.8
不论所用的外肽酶为何种生物来源，所有组合的内切蛋白酶与外肽酶均比单独使用内切蛋白酶效果要更好，即氨基酸含量、产量和滤过性都有所提高。
实施例3
按实施例1的方法对高粱和玉米芯进行酿造，以控制由此制得的用于啤酒生产的谷汁的性质。同时进行另外一种酿造，这种方法中不加入酶，但以麦芽完全代替高粱。如表6所示：
表6
测试号     酶类     剂量
    1     麦芽     代替高粱
    2  Brewers Protease 2000豆曲霉来源的外肽酶     1.8公斤/吨42000 Leu-AP/吨
    3  Brewers Protease 2000米曲霉来源的外肽酶     1.8公斤/吨40000 Leu-AP/吨
    4  Brewers Protease 2000黑曲霉来源的外肽酶     1.8公斤/吨25000 Leu-AP/吨
结果如表7所示：
表7
测试号 过滤体积(毫升)     产率(％) 12°Plato时的氨基酸含量(毫克/升)
    1     400     82.3     222.0
    2     395     89.5     127.0
    3     390     87.9     109.0
    4     375     91.1     113.1
每个酿造组均通过HPLC法详细测定其氨基酸的组成。按酵母种的吸收速率对氨基酸进行分类：
A组：快速吸收
B组：中速吸收
C组：缓慢吸收
结果如表8所示：
(由于表7采用甘氨酸作为标准，而HPLC法的标准完全不同，因此本表中以毫克/升给出的NB值与表7中提供的总氨基酸含量是不相符合的)。
表8
氨基酸(毫克/升)                              测试号
    1     2     3     4
    A组
    Glu     36     38     30     39
    Asp     53     29     26     29
    Ser     143     65     51     56
    Thr     54     28     21     22
    Lys     95     65     45     47
    Arg     133     114     87     74
    总和     513     340     260     268
    B组
    Val     102     36     32     28
    Met     26     37     30     28
    Leu     158     216     205     166
    Ile     75     41     42     28
    His     58     26     16     15
    总和     418     356     325     265
    C组
    Gly     29     19     13     17
    Phe     134     89     85     95
    Tyr     107     67     58     57
    Trp     55     11     11     12
    Ala     97     80     66     73
    总和     421     265     233     253
每组谷汁均已煮沸45分钟，并按无菌方法加入经煮沸并蒸馏过的水以调节糖度为12°Plato。于不同的无菌锥形瓶中分别加入350ml经标准化后的谷汁，再加入酿造用酵母(5克/升)。于11℃发酵8天。发酵8天后通过密度测定每组发酵谷汁的表观衰减度(Apparent attenuation)。
结果如表9所示：
表9
    测试号     8天后的表观衰减度(％)
    1     82.0
    2     81.0
    3     80.4
    4     未测定
与通过麦芽产生的谷汁相比，根据本发明的方法，将内切蛋白酶与外肽酶组合加入至高粱能生产具有良好啤酒发酵能力的谷汁。令人惊奇的是，使用来自解淀粉芽孢杆菌的内切蛋白酶与来自豆曲霉的外肽酶组合能明显提高A组和B组氨基酸含量。
实施例4
本例表明，根据本发明在方法中的液化步骤加入外肽酶要比在糖化步骤中加入更具优越性。按实施例1的方法对高粱和玉米芯进行酿造，所有酿制组均在液化步骤加入Brewers Protease 2000(1.8公斤/吨)。得自豆曲霉的外肽酶则在液化步骤(测试号1、2)或糖化步骤(测试号3、4)加入(40000Leu-AP/吨)。结果如表10所示：
表10
测试号 过滤体积(毫克/升)     产率(％) 12°Plato时的氨基酸含量(毫克/升)
    1     380     89.3     115.1
    2     385     89.5     119.8
    3     370     89.4     109.1
    4     370     89.8     112.0
通过重复试验测定了每组试验中滤过体积产率和氨基酸含量的标准偏差，估计值分别为10毫升、0.5％和0.9毫克/升。
总的说来，上述结果表明，在液化步骤中加入外肽酶主要能显著提高氨基酸产量和滤过率。
实施例5
此例描述了提高米曲霉来源的外肽酶用量对酿造的影响。
按实施例1的方法对高粱与玉米芯混合物进行酿造。在液化步骤中加入Brewers Protease 2000和外肽酶(表11)。
表11
测试号     酶类     酶用量
    1     无     0
    2     Brewers Protease 2000     1.0公斤/吨
    3     Brewers Protease 2000米曲霉来源的外肽酶     1.0公斤/吨62000 Leu-AP/吨
    4     Brewers Protease 2000米曲霉来源的外肽酶     1.0公斤/吨109000 Leu-AP/吨
    5     Brewers Protease 2000米曲霉来源的外肽酶     1.0公斤/吨155000 Leu-AP/吨
    6     Brewers Protease 2000米曲霉来源的外肽酶     1.0公斤/吨234000 Leu-AP/吨
    7     Brewers Protease 2000米曲霉来源的外肽酶     1.0公斤/吨313000 Leu-AP/吨
结果如表12所示：
表12
测试号 过滤体积(毫升)     产率(％) 12°Plato时的氨基酸含量(毫克/升)
    1     188     88.4     39.1
    2     275     88.9     59.8
    3     280     89.1     81.5
    4     280     89.6     90.5
    5     280     89.7     95.3
    6     280     90.4     101.0
    7     280     89.5     114.0
所用的外肽酶越多，产率和游离氨基酸的含量也越高。相反地，滤过率则在很低的外肽酶用量就已达到理想值。
实施例6
此例表示在酿造中提高黑曲霉来源的外肽酶用量产生的影响。
按实施例1的方法对高粱和玉米芯进行酿造。在液化步骤中加入Brewers Protease 2000和外肽酶。
表13
测试号     酶类     酶用量
    1     无     0
    2     Brewers Protease 2000     1.0公斤/吨
    3     Brewers Protease 2000黑曲霉来源的外肽酶     1.0公斤/吨51000 Phe-AP/吨
    4     Brewers Protease 2000黑曲霉来源的外肽酶     1.0公斤/吨90000 Phe-AP/吨
    5     Brewers Protease 2000黑曲霉来源的外肽酶     1.0公斤/吨127000 Phe-AP/吨
结果示于表14：
表14
测试号 过滤体积(毫升)     产率(％) 12°Plato时的氨基酸含量(毫克/升)
    1     188     88.4     39.1
    2     240     88.6     60.1
    3     246     89.7     63.7
    4     258     89.5     64.2
    5     232     89.7     65.7
结果也表明，使用的外肽酶越多，其产率和游离氨基酸水平也越高。结果还表明，使用米曲霉来源的外肽酶比黑曲霉来源的外肽酶效果要稍好一些。
实施例7
大麦(PLAISANT品种)在酿酒房中按合适的过滤压粉碎成细面粉。用300毫升含下述物质的水悬浮57克面粉，并于50℃保温1小时：
9毫克B.A.T.S
2毫克Filtrase L3000(+)(Gist-brocades公司的来源于解淀粉芽孢杆菌的β-糖原酶商品)
4毫克Brewers Protease 2000
以及相应剂量的豆曲霉来源的外肽酶。随后温度升至63℃(升温速率为1℃/分钟)，并于63℃保温30分钟。接着再将温度升至90℃(升温速率为1℃/分钟)，并于90℃保温20分钟。再将酿造物冷却至25℃并以7000g的速度离心15分钟。最后对上清中的可溶性蛋白和游离氨基酸的含量进行分析。
结果如表15所示：
表15
测试号 外肽酶用量(Leu-AP/吨) 12°Plato时的氨基酸含量(毫克/升) 可溶性蛋白质(占干物质的百分比)
    1     0     77.9     4.21
    2     25000     95.3     4.75
    3     50000     118.4     4.99
    4     100000     133.2     5.42
    5     200000     203.6     6.63
    6     400000     295.0     7.55
结果表明，在大麦酿造的液化步骤中加入豆曲霉来源的外肽酶，能使其中游离氨基酸含量达到麦芽酿造中的水平。
实施例8
按实施例7中的方法酿造大麦，但此处以黑曲霉来源外肽酶代替实施例7中豆曲霉来源的外肽酶。结果如表16所示：
表16
测试号 外肽酶用量(Leu-AP/吨) 12°Plato时的氨基酸含量(毫克/升)     可溶性蛋白质(占干物质的百分比)
    1     0     68.2     4.37
    2     10000     69.8     4.20
    3     50000     75.2     4.25
    4     200000     78.0     4.16
    5     500000     89.1     4.50
    6     1000000     101.0     4.18
尽管黑曲霉来源的外肽酶似乎比豆曲霉来源的效果要差一些，但它也能使12°Plato时的大麦汁中的氨基酸含量达到100毫克/升，这在啤酒发酵中已很令人满意了。
微生物保藏
生产外肽酶所用的菌株已保存于荷兰真菌菌种保藏中心(CentraalBureau Voor Schimmelcutures,Oosterstraat 1,Baarn)，保存号分别为CBS 115.39(公开保藏中心)，CBS 209.96(豆曲霉(DS 8351)；保藏日期：1996年2月12日)和CBS 210.96(米曲霉(DS23617)；保藏日期：1996年2月12日)。

Claims (20)

1．一种生产可发酵谷汁的方法，包括以下步骤：
(a)在α-淀粉酶和/或内切蛋白酶活性作用下，将谷物液化产生液化谷浆；和
(b)在α-淀粉酶作用下使所说的液化谷浆进行糖化；
(c)将已液化和糖化的谷浆进行过滤，获得可发酵谷汁；
其中上述步骤(a)、(b)至少其一是在具有外肽酶活性的酶存在下进行的。
2．按照权利要求1所述的方法，其中所用的谷物至少含20％的未发芽谷物。
3．按照权利要求2所述的方法，其中所用的谷物至少含20％的未发芽高粱。
4．按照权利要求3所述的方法，其中所用的谷物至少含50％的未发芽高粱。
5．按照权利要求1-4中任一项所述的方法，在其中谷物的液化步骤使用了外肽酶。
6．按照权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所使用的外肽酶为真菌类外肽酶。
7．按照权利要求6所述的方法，其中所说的真菌是曲霉菌。
8．按照权利要求7所述的方法，其中所说的真菌为豆曲霉。
9．按照权利要求6所述的方法，其中所说的外肽酶为一种氨肽酶。
10．按照权利要求8所述的方法，其中所说的内切蛋白酶可以从解淀粉芽孢杆菌中获得。
11．一种酿造啤酒的方法，包括按照权利要求1-10中任一项所述的方法生产谷汁以及对所说谷汁进行发酵生产啤酒等步骤。
12．一种通过酶学方法、从富含谷蛋白和/或醇溶谷蛋白的谷物中释放可自由利用氮的方法，包括在谷物或利用所说谷物制得的液化谷浆中加入内切蛋白酶和外肽酶组合物的步骤。
13．一种生产酒精或含酒精饮料的方法，包括按照权利要求1所述的方法制得的谷汁在可生产酒精的酵母存在下进行发酵的步骤。
14．外肽酶在生产可发酵谷汁的方法中的应用。
15．按照权利要求14所述的应用，其中所说的外肽酶是一种真菌类外肽酶。
16．按照权利要求14或15所述的应用，其中所说的外肽酶来源于一种真菌，这种真菌选自由黑曲霉、米曲霉或豆曲霉组成的真菌组中。
17．按照前面任一项权利要求所述的应用，其中所用谷汁是从至少含部分未发芽谷物的材料中制得的。
18．按照前面任一项权利要求所述的应用，其中所用谷汁是从未发芽高粱或未发芽大麦中制得的。
19．外肽酶在提高啤酒的感官特性中的应用。
20．外肽酶在提高谷汁的滤过性中的应用。
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