KR19990082497A

KR19990082497A - 발효가능한 맥아즙의 제조방법

Info

Publication number: KR19990082497A
Application number: KR1019980706230A
Authority: KR
Inventors: 마리-뽈 라로예; 제롬 쑤뻬
Original assignee: 데 보어 빌렘 뢸프; 기스트-브로카데스 베.파우.
Priority date: 1996-02-12
Filing date: 1997-02-12
Publication date: 1999-11-25
Also published as: HK1018625A1; HUP9901003A3; BR9707404A; CZ250398A3; UY24458A1; PL328304A1; CN1285396A; HUP9901003A2; CA2245856A1; EE9800240A; CN1211275A; JP2000504571A; CN1064398C; YU33998A; BG102684A; SK108698A3; WO1997029179A1; EA001075B1; AU1873197A; EP0896613A1

Abstract

본 발명은 (a) α-아밀라제 및/또는 엔도프로테아제 활성의 도움으로 곡물 재료를 액화시켜 액화된 매시를 얻는 단계; (b) α-아밀라제의 존재하에서 상기 액화된 매시를 당화시키는 단계; (c) 액화시키고 당화시킨 매시를 여과하여 발효가능한 맥아즙을 얻는 단계로 이루어지고, 단계 (a) 및 (b)중 적어도 어느 한 단계를 엑소-펩티다제 활성을 갖는 효소의 존재하에서 시행하여 곡물로부터 발효가능한 맥아즙의 제조방법을 제공한다. 엑소-펩티다제 활성을 갖는 효소로서 유용한 것은 엑소펩티다제, 바람직하게는 균류 아미노-펩티다제와 같은 내열성 엑소펩티다제이고, 그 뿐만 아니라 내열성 카르복시-펩티다제도 유용하다. 본 발명에 따라 특히 바람직한 것은Aspergillus균류, 특히A. niger,A. oryzae또는A. sojae에 내생인 아미노-펩티다제이다.

Description

발효가능한 맥아즙의 제조방법

맥주는 맥아가 되는 곡물 또는 맥아가 되지 않는 곡물중 어느 하나를 발효시켜 제조한다. 후자의 경우에, 곡물은 시판용 효소의 도움으로 액화되고 당화되어 효모 발효에 필요한 발효가능한 당 및 아미노산 또는 질소의 다른 형태("자유롭게 이용가능한 질소"인 FAN으로 집합적으로 언급됨)를 함유하는 맥아즙을 얻는다.

예를들면, 맥퍼든등(MacFadden, D. P. and Clayton, M. Brewing and Beverage Industries International(1989), 1, 77-81)은 맥아가 되지 않는 수수로부터의 맥주 양조에서 알파-아밀라제, 프로테아제, 베타-글루카나제, 셀룰라제, 균류 알파-아밀라제, 아밀로글루코시다제등과 같은 효소 첨가를 제안하고 있다. 또한 맥퍼든등은 맥아가 되지 않는 수수를 사용할 때 발효를 위해 효모 식품을 가하는 것을 권하고 있다.

바조모등(M. F. and Young, T. W., J. Inst. Brew. (1992) 98, 515-523; Bajomo, M. F. and Young, T. W. J. Inst. Brew. (1994) 100, 79-84 3)은 맥아가 되지 않는 수수로부터 맥아즙에 존재하는 FAN의 수준(51mg/l)이, 맥아가 되는 보리로부터 제조한 맥아즙의 발효에 필수적인 것보다 훨씬 낮다는 사실에도 불구하고 100% 맥아가 되지 않는 수수 곡물로부터 맥주를 양조하는 것을 보고하고 있다.

국제특허공보, WO 92/20777에는 맥아가 되지 않는 완전 옥수수 또는 마일로(milo)의 아밀라제에 의한 곡물 액화, 글루코아밀라제 및 산 균류 프로테아제에 의한 매시(mash) 당화로 이루어지는 에탄올을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 당화 단계 뿐만 아니라 발효단계 동안에 가해지는 프로테아제를 제공한다. 발효 배지의 pH값은 균류 엑소-펩티다제가 활성을 나타내지 않는 것을 의미하는 4-5 범위내이다(Labbe, J. P., Rebeyrotte, P. Biochimie (1974) 56, 839-844, Lehman, K und Uhlig, H. Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. (1969) 350, 99-104). 따라서, 상기 방법의 단점은 이러한 조건하에서 사용된 균류 프로테아제가 내부 단백질 분해만을 수행하여 주로 올리고펩티드를 생성하고 유리 아미노산을 거의 생성하지 않는다는 것이다.

당해 분야의 일반 견해로는, 팔머(Palmer)의 의견이 언급되어야 한다(G. H. Cereal Science and Technology. In:Cereal Science and Technology. (1989) ed. Aberdeen University Press, Aberdeen, Scotland, 61-242).

발명의 개요

본 발명은 매우 자유롭게 이용가능한 질소(이하 FAN으로 언급함), 맥아즙의 양호한 여과성 및 수율과 같은 의외로 양호한 특성을 갖는 맥아가 되지 않는 곡물로부터 맥아즙을 제조하는 방법을 제공한다. 또한 이 방법은 맥아가 되는 곡물로부터 맥아즙의 제조에 사용될 수 있으나, 특히 맥아가 되지 않는 수수, 또는 맥아가 되지 않는 수수와 옥수수의 혼합물과 같은 맥아가 되지 않는 곡물로부터 맥아즙을 제조하는 것이 유리하다. 또한 이 이점은 맥아가 되지 않는 곡물(옥수수, 쌀 또는 수수등)과 조합한 맥아가 되는 곡물(맥아가 되는 보리등)로부터 제조된 맥아즙, 이른바 "혼합 양조"에 있다.

따라서, 본 발명은 곡물로부터 발효가능한 맥아즙의 제조방법을 제공하고, 이것은:

(a) α-아밀라제 및/또는 엔도프로테아제 활성의 도움으로 곡물 재료를 액화시켜 액화된 매시를 얻는 단계;

(b) α-아밀라제의 존재하에서 상기 액화된 매시를 당화시키는 단계;

(c) 액화시키고 당화시킨 매시를 여과하여 발효가능한 맥아즙을 얻는 단계

로 이루어지고, 여기서 단계 (a)와 (b)중 적어도 한 단계는 엑소-펩티다제 활성을 가진 효소의 존재하에서 시행한다. 엑소 펩티다제 활성을 갖는 효소로서 유용한 것은 엑소펩티다제이고, 바람직하게는 균류 아미노-펩티다제와 같은 내열성 엑소펩티다제이고, 그 뿐만아니라 내열성 카르복시-펩티다제도 유용하다. 본 발명에 따라서 특히 바람직한 것은Aspergillus균류, 보다 특히A. niger,A. oryzae또는A. sojae에 내생인 아미노-펩티다제이다.

이 방법은 맥아가 되지 않는 옥수수속, 쌀 또는 다른 맥아가 되지 않는 곡물로 보충된 수수 곡물과 같은 적어도 20%의 맥아가 되지 않는 곡물, 바람직하게는 50%보다 많은 맥아가 되지 않는 곡물을 포함하는 곡물에 유용하다. 곡물의 액화동안에 엑소펩티다제가 존재하면 본 발명에 있어 매우 유리하다는 것을 알았다.

본 발명의 다른 양태에 있어서, 본 발명에 따른 방법으로 얻을 수 있는 발효가능한 맥아즙이 제공된다. 본 발명의 또 다른 양태는 맥주 양조방법에 관한 것이고, 여기서 발효가능한 맥아즙이 본 발명에 따라서 사용된다.

본 발명은 맥주와 같은 알코올 음료를 제조하는 방법을 더 제공하고 이것은 본 발명에 따른 방법을 사용하여 맥아즙을 제조하는 단계에 이어서 또는 이와 동시에 상기 맥아즙을 발효시켜 예를들면 맥주를 얻는 단계를 포함한다.

다른 구체예에 따라서, 글루텔린 및/또는 프롤라민의 많은 양을 함유하는 곡물로부터 자유롭게 이용가능한 질소를 효소학적으로 방출하기 위한 방법이 제공되고, 이것은 곡물 또는 이 곡물로부터 얻은 액화된 매시에 엔도프로테아제 및 엑소-펩티다제의 조합물을 가하는 단계를 포함한다.

알코올을 제조하는 방법은 알코올을 제조할 수 있는 효모의 존재하에서 본 발명에 따른 방법으로 얻은 FAN을 발효하는 단계를 포함한다.

본 발명은 다음 도면으로 예시된다.

본 발명은 곡물, 특히 맥아가 되지 않는 곡물로부터 발효가능한 맥아즙(wort)의 제조에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른 방법을 실행하여 얻은 맥아즙에 관한 것이다. 또한 본 발명은 알코올 제조, 증류 산업 또는 맥주 양조에서 본 발명에 따른 방법으로 얻은 맥아즙의 발효에 관한 것이다.

도 1은Aspergillus niger로부터 류신-아미노펩티다제의 pH 프로파일을 나타낸다.

도 2는Aspergillus niger로부터 페닐알라닌-아미노펩티다제의 pH 프로파일을 나타낸다.

도 3은 두 아미노펩티다제의 온도 프로파일을 나타낸다.

본 발명은 이하에서 더욱 상세하게 예시될 것이다.

곡물로부터 발효가능한 맥아즙을 제조하기 위한 방법이 제공되고, 사용조건하에서 엑소-펩티다제 활성을 갖는 적어도 한 단백질이 제공된다. 균류, 특히Aspergilli에 내생인 아미노펩티다제는 충분히 안정적이고 액화동안에 pH가 대략 5 내지 8의 범위에서 활성을 갖기 때문에 유용하다. 이 온도 및 pH에서, 카르복시펩티다제는 덜 유용하다. 당화 단계동안에 약간 더 산성인 조건이 액화동안보다 유효하고 카르복시-펩티다제가 이 단계에서 유리하게 사용될 수 있는데, 단 이들은 50-60℃, 바람직하게는 50-70℃의 온도범위에서 충분히 안정적이다.

본 발명에 따른 엑소펩티다제의 사용은 맥아즙의 자유롭게 이용가능한 질소(FAN)의 증가를 주도할 뿐만 아니라 엑소펩티다제를 사용하지 않은 방법과 비교하여 맥아즙의 여과성 및 수율의 개선도 주도한다.

본 발명에 따른 방법은 맥아가 되지 않는 곡물, 보다 특히 옥수수, 밀, 오트 또는 쌀과 같은 다른 곡물 재료로 임의로 보충된 맥아가 되지 않는 수수로부터 발효가능한 맥아즙을 제조하는데 특히 유리하다. 본 발명의 내용에서 곡물은 수수, 밀, 보리, 오트, 쌀 및 옥수수등을 포함한다.

또한 본 발명에 따른 엑소펩티다제의 사용은 혼합 양조의 경우에 유리하고, 여기서 대체로 맥아가 되지 않는 곡물 원료 뿐만 아니라 맥아가 되는 곡물 재료가 사용되고, (예를들면 맥아가 되는 곡물의 80%까지, 또는 90%까지를 갖고, 잔류물은 맥아가 되지 않는 곡물로 이루어짐), 엑소펩티다제가 관능 특성(맛 및/또는 향)에 대단한 영향을 끼친다는 것을 알았다. 이들 이점은 맥아가 되는 곡물 뿐만 아니라 맥아가 되지 않는 곡물, 또한 그 혼합물로부터 양조하는 것이 통상적이라는 것을 나타낸다.

FAN, 여과성, 수율 및 관능 특성의 관점에서 엑소펩티다제의 사용이 특히 유리한 곡물은 비교적 높은 프롤라민 및 글루텔린 단백질 단편을 갖는 것들이다. 수수 이외에 쌀(약 80%의 글루텔린)도 이 카테고리에 속한다. 수수가 사용될 때, 폴리페놀 함량이 비교적 낮은 품종이 선택되는 것을 주의해야 한다.

엑소펩티다제의 첨가와는 별도로, 맥아즙의 제조, 예를들면 맥주양조의 제조는 통상적으로 실행될 수 있다. 일반적으로, 곡물 원료를 액화시켜 매시를 얻고 그 다음에 매시를 당화시켜 맥아즙을 얻는 것을 포함한다. 발효전에 여과를 하는 것이 중요하다.

액화 단계는 통상 곡물 원료를 적당한 입경의 곡분으로 분쇄하고, 약 1 내지 4부, 바람직하게는 약 3부의 물과 임의로 사용된 엔도프로테아제에 의존하여 약 50 내지 약 300ppm의 칼슘, 바람직하게는 200ppm의 Ca²⁺로 수화시키는 것을 포함한다.Bacillus stearothermophilus유래 효소는 칼슘 의존성을 덜 나타낸다. 따라서, Ca²⁺를 보충하지 않는 것이 그 경우에 요구된다. 분쇄된 곡물의 입경은 약 3mm를 초과하지 않아야 하고; 3.5%이하는 1.3mm를 초과하지 않아야 하고; 1.5%이하는 0.25mm보다 작아야 한다. 이외에 사용될 수 있는 효소는 셀룰라제, β-글루카나제 및/또는 다른 식물세포벽 분해 효소이다.

액화 매질은 예를들면 수산화칼슘을 사용하여 pH가 통상 약 5 내지 8, 바람직하게는 약 6 내지 7로 조정된다. α-아밀라제, 바람직하게는 내열성의 α-아밀라제를 액화 매질에 가하는 것 뿐만 아니라 곡물 전분을 적어도 부분적으로 액화시키고 적어도 부분적으로 단백질을 감소시키는데 충분한 양으로 엔도프로테아제를 가하는 것도 중요하다. α-아밀라제의 적당한 사용량은 B.A.T.S가 사용될 때, 톤당 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 약 1-1.5kg이다. 프로테아제의 적당한 사용량은 Brewers 프로테아제 2000의 경우에 0.5kg/톤 곡물(kg/T)보다 많게, 바람직하게는 1kg/T보다 많다. 판스티마제 400인 경우에는 2kg/T보다 많게, 바람직하게는 5, 보다 바람직하게는 10kg/T보다 많게 사용되어야 한다.

액화 공정에 있어서, 많은 단계는 통상 상승 온도에서 실행하고: α-아밀라제 및 프로테아제를 첨가한 후에 충분히 액화가 될 때까지 혼합물을 약 40℃ 내지 65℃, 바람직하게는 약 45℃ 내지 55℃, 가장 바람직하게는 50℃의 온도로 유지한다. 요구되는 시간은 사용된 곡물 또는 곡물의 혼합물에 의존하지만, 통상 약 30분 내지 약 2시간이 충분하다. 따라서, 온도는 점차 상승하고 그 속도는 약 90-95℃일 때까지 임계적이지 않고 약 30분 내지 약 1시간동안 그 온도에서 방치한다. 다음에 혼합물을 당화가 일어나는 온도: 통상 약 50℃ 내지 약 70℃, 바람직하게는 약 55℃ 내지 65℃, 가장 바람직하게는 약 60℃로 냉각시킨다. 당화 단계에서는 사용된 효소의 내열성에 의존하여 70℃보다 약간 더 높은 온도가 가능해야 한다. 바람직한 온도에 도달했을 때, Brewers Fermex(α-아밀라제) 또는 Novamyl(재조합 β-아밀라제)과 같은 당화 효소를 통상 Brewers Fermex에 대해 약 400g/T 내지 약 1kg/T 범위의 양으로 가한다. 또한 글루코아밀라제도 자주 사용된다. 당화는 약 30분 내지 약 2시간동안 일어나고, 그 후에 온도를 특히 효소 및 원하지 않는 미생물을 불활성화하기 위해 약 75℃ 내지 약 85℃로 상승시키고, 매우 임계적이지 않은 시간인 약 10분동안 바람직한 상승 온도에서 유지한다.

다음에 이렇게 얻은 매시는 당해 분야에서 공지된 장치를 사용하여 여과하는데, Schleicher & Schuell 페이퍼 필터가 있는 깔때기로 만족스럽게 작업을 한다. 여과후에, 맥아즙을 사용 균주와 최종 목적에 의존한 조건하에서 적당한 효모로 발효시키고; 맥주양조 이외에, 생물연료로서 또는 알코올 음료로서 알코올 제조가 본 발명에 의해 구상된다. 적당한 균주 및 적당한 조건이 당업자에게 공지되어 있다.

맥아즙의 제조, 예를들면 맥주양조 동안에 엑소-펩티다제의 사용이 곡물원료의 액화단계동안에 특히 유리하다는 것을 알았다. 그러나, 엑소-펩티다제의 부재시와 비교하여 당화 단계동안에 엑소-펩티다제의 첨가는 보다 높은 FAN 수준, 맥아즙의 개선된 여과성 및 고수율과 같은 언급된 이점을 얻게 한다.

본 발명에 따른 방법은 pH 및 온도 조건이 균류 엑소-펩티다제를 활성시키는 상이 되어야 한다. 적당한 엑소-펩티다제는 일반적으로 균류, 보다 특히Aspergillus의 것에 내생인 것들이다.A. niger,A. sojae및A. oryzae를 포함하는Aspergillus종의 아미노펩티다제가 특히 유용하다는 것을 알았다.

상기 설명으로부터 알 수 있는 바와같이, 맥아즙 제조에서 액화 및/또는 당화 단계동안에 엑소-펩티다제 활성을 나타내는 효소의 첨가는 양호한 여과성, 고수율 및 높은 FAN의 맥아즙을 제조한다. 이것은 맥주 양조, 알코올 음료(주) 제조 및 맥아가 되지 않는 곡물, 또는 전혀 맥아가 되지 않는 곡물의 현저한 백분율을 사용하여 알코올(생물연료) 제조에 더욱 효과적이다. 후자는 맥아의 수입이 제한되는 국가들에서 양조에 매우 유리하나 경제적으로는 덜 매력적이다. 특히 아프리카에서는 수수가 대부분을 차지하는 곡물 원료(의 혼합물)로부터 맥주가 제조된다.

더욱이, 엑소-펩티다제가 액화 단계 또는 당화 단계(또는 둘다)에서 사용된 맥아즙으로부터 제조된 맥주의 관능 특성(맛 및 향)이 개선된다는 것을 알았다. 이 이점은 엑소-펩티다제가 전통적인 보리 맥아, 또는 혼합된 맥주양조(즉, 맥아가 되는 그리고 맥아가 되지 않는 곡물의 조합물로부터)와 같은 맥아가 되는 곡물에서 제조된 맥주에 사용되는 것이 구상된다.

실험

A. 내열성의 α-아밀라제(액화)

일반적으로 본 발명에 따른 방법중 액화 단계에 사용된 α-아밀라제는 전분중 α-1,4-글루코스-글루코스 결합을 절단하는 효소이다. 이것은 내열성의 α-아밀라제중에서 선택된다. 상표명 Brewers Amyliq Thermo Stable(B.A.T.S)로 기스트-브로카데스로부터 시판되는Bacillus licheniformis로부터 α-아밀라제로 매우 양호한 결과를 얻을 수 있다.

B. 엔도 프로테아제(액화)

일반적으로 본 발명에 따른 방법중 액화 단계에 사용된 엔도프로테아제는 액화 단계의 개시에서 pH 및 온도 조건(pH 5-6; t℃ 45-55℃)하에서 단백질의 펩티드 결합을 절단하는 효소이다. 상표명 Brewer's 프로테아제 2000으로 기스트-브로카데스로부터 시판되는Bacillus amyloliquefaciens로부터 중성 프로테아제로 매우 양호한 결과를 얻을 수 있다. 또한Streptomyces fradiae로부터 단백질 분해 효소가 사용될 수 있고, 이것은 상표명 판스티마제 400으로 판스티마제 SARL로부터 시판된다.

C. 엑소-펩티다제(액화 및/또는 당화)

일반적으로 본 발명에 따른 방법중 액화 단계에 사용된 엑소-펩티다제는 펩티드 또는 단백질의 N-말단 결합을 절단하는 효소이다.Aspergillus종으로부터의 제조로 매우 양호한 결과를 얻을 수 있다.Aspergillus niger로부터 아미노펩티다제를 얻기 위한 방법을 하기한다.

C.1효소학적 활성의 측정

엑소-펩티다제 활성은 류신 아미노펩티다제 단위 또는 페닐알라닌 아미노펩티다제 단위로서 표현된다:

1 Leu-AP 단위는 L-류신-p-니트로아닐리드로부터 pH 7.2 및 20℃에서 분당 1μmol의 p-니트로아닐린을 제조하는데 요구되는 효소양이다

*페닐알라닌 아미노펩티다제 단위

1 Phe-AP 단위는 L-페닐알라닌-p-니트로아닐리드로부터 pH 7.2 및 20℃에서 분당 1μmol의 p-니트로아닐린을 제조하는데 요구되는 효소양이다.

C.1.1-페닐알라닌-아미노펩티다제(Phe-AP)

페닐알라닌 파라니트로아닐리드를 0.9mM의 농도에서 7.5mM HCl에 용해하였다. 이 기질 용액 1ml를 pH 7.2의 0.1M 포스페이트 완충액 1.5ml와 혼합하였다. t=0에서, 효소 0.5ml를 도입하고 20℃에서 반응물을 방치하였다. 1N HCl 1ml를 15분 후에 가하였다. 블랭크를 t=0에서 도입한 1N HCl로 조작하였다. 광학 밀도를 400nm에서 블랭크(OD_블랭크) 및 분석(OD_분석)에 대해 측정하였다. 활성을 다음과 같이 계산하였다:

C.1.2-류신-아미노펩티다제(Leu-AP)

류신 파라니트로아닐리드를 0.9mM의 농도에서 물에 용해하였다. 이 기질 용액 1ml를 pH 7.2의 0.1M 포스페이트 완충액 1.5ml와 혼합하였다. t=0에서, 효소 0.5ml를 도입하고 20℃에서 반응물을 방치하였다. 1N HCl 1ml를 15분 후에 가하였다. 블랭크를 t=0에서 도입한 1N HCl로 조작하였다. 광학 밀도를 400nm에서 블랭크(OD_블랭크) 및 분석(OD_분석)에 대해 측정하였다. 활성을 다음과 같이 계산하였다:

C.1.3-엔도프로테아제(PU)

이 활성을 1시간동안 pH 6.0, 40℃에서 카세인의 가수분해로 측정한다. 1 PU는 트리클로르아세트산으로 잔류 단백질을 침전시킨 후에 분당 1μmol 티로신의 대등물을 유리시키는데 요구되는 효소양이다.

C.2 Aspergillus niger 균주의 스크리닝

상이한 공급원으로부터 분리되고 또는 배양 수집물로부터 얻은 200Aspergillus niger균주를, 15g/l 포테이토 분말, 20g/l 박토펩톤, 7g/l 효모 추출물, 4g/l 인산이수소칼륨, 0.5g/l 황산마그네슘, 0.5g/l 염화칼슘, 0.5g/l 염화아연을 함유하는 배지에서 성장시켰다. pH는 4.8이었다. 240rpm 30℃에서 24시간 전배양하고 275rpm 30℃에서 배양한 후에 상청액을 수집하고 상기한 류신-, 페닐알라닌- 및 발린-아미노펩티다제 활성에 대해 분석하였다. 몇몇Aspergillus niger균주는, 표 1에 나타낸 바와같이(각각의 값은 4번의 각기 다른 결과로부터의 평균값이다), 이들 효소학적 활성중 적어도 한가지에 대해 고제조 퍼텐셜을 나타냈다.

균주 번호	상청액에서의 아미노펩티다제 활성	엔도-펩티다제
균주 번호	Leu-AP/l	Phe-AP/l	Val-AP/l	PU/ml
1053	25	170	32	<0.1
1085	23	135	48	0.1
1103	37	285	40	0.1
1108	60	435	29	0.1
1444	40	192	50	0.1
1497	25	105	75	0.1
1502	16	44	63	0.1

상기 균주로부터, 균주 1108 및 1502는 배양 수집물로부터 얻었고 각각 수탁번호 NRRL 3112 및 CBS 115.39로 기탁하였다. 균주 NRRL 3112는 아밀로글루코시다제, α-아밀라제 및 글루코아밀라제의 제조에 사용되었다. 균주 CBS 115.39는 아밀라제의 제조에 사용되었다.

C.3 실험실 규모에서 엑소펩티다제의 제조

실시예 1에 기재된 스크리닝으로부터 몇몇 균주를 실험실 발효기(10리터)안에서 발효시켰다. 균주 1502로부터 얻은 결과를 본 실시예에 나타낸다.

Aspergillus niger균주번호 1502의 포자를 30℃에서 7-10일 배양한 후에 PDA-플레이트상에서 수집하였다. 24시간동안 pH 4.8에서 글루코스(20g/l) 및 콘스팁(20g/l)을 포함하는 배지의 진탕 플라스크상에서 접종단계를 수행하였다.

주된 발효를 배치 공정에 따라 수행하였다. 사용된 배양물은 다음과 같다: 100g/l 말토덱스트린, 40g/l 대두분, 40g/l 가수분해된 카세인, 5g/l 콘스팁, 2g/l 젤라틴, 2g/l 인산이수소칼륨, 1.3g/l 질산나트륨, 1g/l 염화암모늄, 0.01g/l 황산철 및 0.5g/l 기포방지제.

먼저 말토덱스트린을 제외한 모든 배양물을 함께 혼합하였다. pH를 4.8±0.1로 조정하였다. 다음에 발효기를 40분동안 125℃에서 살균하였다. 말토덱스트린 용액을 별도로 살균하고 살균한 발효기에 넣고 발효배지를 냉각시켰다.

상기한 배지 6리터가 충전된 실험실 발효기에서 주된 발효가 일어나고 접종 플라스크로 접종하였다. 교반 및 공기 공급을 조정하여 가능한한 높게 용존 산소농도를 유지하였다. 온도는 30℃로 유지하였다. 모든 배양물이 소비되었을 때, 즉 약 130시간이 지난 후에 발효를 정지시켰다.

발효 배양액을 여과하여 모든 미생물을 제거하였다. 아미노펩티다제 및 엔도프로테아제 활성을 다음 여액에서 측정하였다:

0.15 Leu-AP/ml

1.0 Phe-AP/ml

<0.05 Val-AP/ml

<0.1 PU/ml

다음에 UF 농축을 수행하여 안정화제인 액체 아미노펩티다제, 글리세롤(50%)을 제조하였다. '펩티다제 L2'로 명명되는 생성 용액은 다음 활성을 가졌다:

0.5 Leu-AP/ml

3.2 Phe-AP/ml

<0.05 Val-AP/ml

<0.1 PU/ml

이들 결과는 본 발명자들의 선택조건하에서 성장시킨 선택된Aspergillus niger균주가 실질적 양의 엔도프로테아제가 없어도 아미노펩티다제를 제조한다는 것을 나타낸다.

C.4 효소학적 활성의 pH 프로파일

Leu-AP 및 Phe-AP 활성은 pH 2.5 내지 9.0 범위에서 상이한 완충액을 사용하여 스크리닝하는 것만 제외하고 펩티다제 L2(실시예 2 참조)로부터 측정하였다.

Aspergillus niger로부터 류신-아미노펩티다제의 pH 프로파일을 도 1에 나타낸다.

Aspergillus niger로부터 페닐알라닌-아미노펩티다제의 pH 프로파일을 도 2에 나타낸다.

도면은 Leu-AP가 pH 5 내지 8.5 범위에서 활성이고, 반면에 다른Aspergillus종으로부터 아미노펩티다제와 유사한 Phe-AP가 pH 5.5 내지 9 범위에서 활성이라는 것을 나타내고 있다.

C.5 효소학적 활성의 온도 프로파일

Leu-AP 및 Phe-AP 활성을 5 내지 70℃의 온도에서 상이한 배양 온도를 사용하여 스크리닝을 한 것만 제외하고 펩티다제 L2로부터 측정하였다.

온도 프로파일은 도 3에 나타낸다.

결과는 각각의 효소가 상이한 최적의 온도, 즉 Leu-AP에 대해서는 50℃이고 Phe-AP에 대해서는 60℃임을 나타낸다.

Aspergillus niger의 배양으로부터 아미노펩티다제를 제조하는 방법을 기술한다. 이들 아미노펩티다제는 pH 6-8 범위와 50-60℃의 온도범위에서 최적의 활성을 갖는다; 더욱이, 이런 배양 조건하에서 검출가능하거나 실질적 양의 엔도프로테아제가 없어도 아미노펩티다제를 제조할 수 있다. 유리하게는 아미노펩티다제의 활성이 엑소프로테아제보다 바람직하게는 10배, 보다 바람직하게는 30배나 더 높다.

D. 말토제닉 아밀라제(당화)

본 발명에 따른 방법중 당화단계에서 사용된 아밀라제는 덱스트린 또는 전분에서 α-1,4-글루코스-글루코스 결합을 절단하여 주 생성물로서 말토스 및/또는 글루코스를 얻는 효소이다. 매우 양호한 결과는 상표명 Brewers' Fermex로 기스트-브로카데스로부터 시판되는Aspergillus oryzae로부터의 α-아밀라제 또는 상표명 Novamyl로 노보로부터 시판되는Bacillus amyloliquefaciens로부터의 재조합 β-아밀라제로 얻을 수 있다.

실시예 1

수수(var. FAFA FARA) 및 옥수수분을 맥주 제조를 위해 표준 명세서에 따라 분쇄한다. 곡물(60% 수수＋40% 옥수수분) 1부를 물 3부로 수화한다. 액화배지에서 총 200ppm Ca²⁺을 보장하기 위해 염화칼슘을 가한다. pH를 수산화칼슘으로 6.5로 조정한다. B.A.T.S.를 곡물 톤당 1.5kg의 양으로 가한다. 다른 단백질분해 효소를 표 2에 나타낸 양으로 가한다:

시험번호	효소	곡물 톤당 사용량
1	없음	0
2	Brewers 프로테아제 2000	1.2kg
3	Brewers 프로테아제 2000A.sojae로부터의 엑소-펩티다제	1.2kg73000 Leu-AP
4	판스티마제 400	10kg
5	판스티마제 400A.sojae로부터의 엑소-펩티다제	10kg73000 Leu-AP

혼합물을 1시간동안 50℃에서 유지하고; 다음에 온도를 95℃로 상승시키고(속도 1℃/분) 45분동안 95℃에서 유지한다. 다음에 5분내에 60℃로 냉각시킨다. 다음에 Brewers Fermex를 가한다(600g/T). 다음에 매시를 45분동안 60℃에서 당화시킨다. 다음에 온도를 76℃로 상승시키고 10분동안 그 온도에서 유지한다. 매시를 Schleicher 및 Schuell 페이퍼 필터를 함유하는 깔때기에 붓는다. 다음에 충전된 맥아즙의 부피를 측정하고 그 비중을 측정한다. 이것으로 추출물 및 수율을 계산한다. 아미노산을 표준으로서 글리신을 사용하는 닌히드린 시약으로 측정한다. 얻은 아미노산 농도를 동일한 당 함량(12°플레이토)에서 맥아즙간의 비교를 위해 보정한다.

결과는 표 3에 나타낸다:

시험번호	충전 부피(ml)	수율(%)	12°플레이토에서의 아미노산(mg/l)
1	310	85.4	26.9
2	370	86.9	54.7
3	382	90.2	119.5
4	365	86.9	76.2
5	372	91.0	102.3

이들 결과는 본 발명에 따른 방법에서 엑소-펩티다제와 조합한 엔도프로테아제 사용이 맥아즙에서의 아미노산의 양 뿐만 아니라 수율 및 여과성도 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 2

실시예 1과 동일한 양조를 그 계열에서,Bacillus amyloliquefaciens로부터 중성 프로테아제(곡물 톤당 1.8kg Brewers 프로테아제 2000)와 표 4에 나타내는 바와 같은Aspergillus종으로부터 상이한 엑소-펩티다제를 조합하는 것만 제외하고 시행한다:

시험번호	엑소-펩티다제 포함
시험번호	생물학적 기원	Leu-AP/T	Phe-AP/T
1	없음	0	0
2	Aspergillus sojae	73000	49000
3	Aspergillus oryzae	73000	53000
4	Aspergillus niger	25000	100000

결과는 표 5에 나타낸다:

시험번호	충전 부피(ml)	수율(%)	12°플레이토에서의 아미노산(mg/l)
1	340	86.1	61.4
2	400	90.0	116.0
3	385	87.9	95.7
4	382	89.8	99.8

엑소-펩티다제의 생물학적 기원이 어떤 것이더라도 엔도프로테아제＋엑소-펩티다제의 모든 조합물이 엔도프로테아제 단독보다 양호하게 수행된다. 또한 아미노산의 함량이외에 수율 및 여과성이 개선된다.

실시예 3

맥주 제조를 위해 얻은 맥아즙의 능력을 제어하기 위해, 수수 및 옥수수분을 실시예 1에서와 같이 양조하고; 이와 동시에 다른 양조는 맥아를 완전히 수수로 치환한 것만 제외하고 효소를 사용하지 않고 시행한다. 표 6 참조:

시험번호	효소	사용량
1	맥아	수수로 치환
2	Brewers 프로테아제 2000A.sojae로부터의 엑소-펩티다제	1.8kg/T42000 Leu-AP/T
3	Brewers 프로테아제 2000A.oryzae로부터의 엑소-펩티다제	1.8kg/T40000 Leu-AP/T
4	Brewers 프로테아제 2000A.niger로부터의 엑소-펩티다제	1.8kg/T25000 Leu-AP/T

결과는 표 7에 나타낸다:

시험번호	충전 부피(ml)	수율(%)	12°플레이토에서의 아미노산(mg/l)
1	400	82.3	222.0
2	395	89.5	127.0
3	390	87.9	109.0
4	375	91.1	113.1

각각의 양조중 상세한 아미노산 조성을 HPLC로 측정하였다. 아미노산을Saccharomyces sp.에 의한 동화율에 따라 분류한다:

A군: 빠른 동화

B군: 적당한 동화

C군: 느린 동화

결과는 표 8에 나타낸다:

(글리신을 표 7에서 표준으로 사용했기 때문에 mg/l의 N.B.값이 표 6에서의 전체 아미노산 값에 일치하지 않고 이것으로 HPLC 측정이 상당히 상이하다는 것을 알 수 있다.)

아미노산(mg/l)	시험 번호
아미노산(mg/l)	1	2	3	4
A군Glu	36	38	30	39
Asp	53	29	26	29
Ser	143	65	51	56
Thr	54	28	21	22
Lys	95	65	45	47
Arg	133	114	87	74
합계	513	340	260	268
B군Val	102	36	32	28
Met	26	37	30	28
Leu	158	216	205	166
Ile	75	41	42	28
His	58	26	16	15
합계	418	356	325	265
C군Gly	29	19	13	17
Phe	134	89	85	95
Tyr	107	67	58	57
Trp	55	11	11	12
Ala	97	80	66	73
합계	421	265	233	253

각각의 맥아즙을 45분동안 비등하고; 비등 및 증류수를 무균으로 가하여 12° 플레이토에서 당 함량을 조정하였다. 각각의 표준화된 맥아즙 350ml를 살균 플라스크에 무균으로 붓고; Brewers' 효모를 각 플라스크에서 접종하였다(5g/l). 11℃에서 8일동안 발효시켰다. 8일동안 발효시킨 후에 각각 발효된 맥아즙의 외관 감소율을 밀도로부터 측정하였다.

결과는 표 9에 나타낸다:

시험번호	8일째의 외관 감소율(%)
1	82.0
2	81.0
3	80.4
4	측정불가

본 발명에 따른 방법에서 수수에 가한 엔도프로테아제＋엑소펩티다제의 조합물은, 맥아로 얻은 맥아즙과 비교할 때 맥주 발효에 충분한 능력이 있는 맥아즙을 제조하는 것을 가능하게 한다. 놀랍게도Bacillus amyloliquefaciens로부터의 엔도프로테아제＋Aspergillus sojae로부터의 엑소-펩티다제의 조합물로 A군＋B군 아미노산 함량의 중요한 개선을 얻는다.

실시예 4

본 실시예는 본 발명에 따른 방법중 당화 단계보다 액화 단계에서 엑소-펩티다제를 도입하는 이점을 나타낸다. 수수＋옥수수분을 실시예 1에 기재된 대로 양조한다. Brewers 프로테아제 2000을 모든 양조의 액화단계에서 가한다(1.8kg/T).Aspergillus sojae로부터의 엑소-펩티다제(40000 Leu-AP/T)를 액화단계(시험 n°1-2) 또는 당화단계(시험 n°3-4)중 어느 한 단계에서 가한다.

결과는 표 10에 나타낸다:

시험번호	충전 부피(ml)	수율(%)	12°플레이토에서의 아미노산(mg/l)
1	380	89.3	115.1
2	385	89.5	119.8
3	370	89.4	109.1
4	370	89.8	112.0

충전 부피, 수율 및 아미노산 함량에 대한 표준편차를 동일한 시험을 반복함으로써 측정하였다. 측정은 각각 10ml, 0.5% 및 0.9mg/l이다.

따라서, 상기 결과는 액화 단계에서의 엑소-펩티다제의 도입으로 주로 아미노산 제조 및 여과성에 대해서 현저하고 확실한 이점을 가져다 준다.

실시예 5

본 실시예는 양조에서A. oryzae로부터의 엑소펩티다제의 사용량증가의 효과를 예시하고 있다.

수수＋옥수수분을 실시예 1에 기재된 대로 양조한다. Brewers 프로테아제 2000 및 엑소펩티다제를 액화단계에서 가한다(표 11).

시험번호	효소	사용량
1	없음	0
2	Brewers 프로테아제 2000	1.0kg/T
3	Brewers 프로테아제 2000A.oryzae로부터의 엑소펩티다제	1.0kg/T62000 Leu-AP/T
4	Brewers 프로테아제 2000A.oryzae로부터의 엑소펩티다제	1.0kg/T109000 Leu-AP/T
5	Brewers 프로테아제 2000A.oryzae로부터의 엑소펩티다제	1.0kg/T155000 Leu-AP/T
6	Brewers 프로테아제 2000A.oryzae로부터의 엑소펩티다제	1.0kg/T234000 Leu-AP/T
7	Brewers 프로테아제 2000A.oryzae로부터의 엑소펩티다제	1.0kg/T313000 Leu-AP/T

결과는 표 12에 나타낸다:

시험번호	충전 부피(ml)	수율(%)	12°플레이토에서의 아미노산(mg/l)
1	188	88.4	39.1
2	275	88.9	59.8
3	280	89.1	81.5
4	280	89.6	90.5
5	280	89.7	95.3
6	280	90.4	101.0
7	280	89.5	114.0

엑소펩티다제가 많을수록, 수율도 높고 유리 아미노산의 양도 많아진다. 반대로 여과효과는 낮은 엑소펩티다제 수준에서조차 최적의 값에 도달한다.

실시예 6

본 실시예는 양조에서A.niger로부터의 엑소펩티다제의 사용량증가의 효과를 예시하고 있다.

수수＋옥수수분을 실시예 1에 기재된 대로 양조한다. Brewers 프로테아제 2000 및 엑소펩티다제를 액화 단계에서 가한다.

시험번호	효소	사용량
1	없음	0
2	Brewers 프로테아제 2000	1.0kg/T
3	Brewers 프로테아제 2000A.niger로부터의 엑소펩티다제	1.0kg/T51000 Phe-AP/T
4	Brewers 프로테아제 2000A.niger로부터의 엑소펩티다제	1.0kg/T90000 Phe-AP/T
5	Brewers 프로테아제 2000A.niger로부터의 엑소펩티다제	1.0kg/T127000 Phe-AP/T

결과는 표 14에 나타낸다:

시험번호	충전 부피(ml)	수율(%)	12°플레이토에서의 아미노산(mg/l)
1	188	88.4	39.1
2	240	88.6	60.1
3	246	89.7	63.7
4	258	89.5	64.2
5	232	89.7	65.7

또한 엑소펩티다제가 많을수록 수율도 높고 유리 아미노산의 양이 많아진다. 이들 결과는A.oryzae엑소펩티다제가A.niger엑소펩티다제보다 약간 더 양호하게 수행한다는 것을 나타낸다.

실시예 7

보리(var. PLAISANT)를 양조장에서 필터 압력으로 적당한 미분으로 분쇄하였다. 57g의 곡분을:

9mg B.A.T.S.

2mg Filtrase L3000(＋)(기스트-브로카데스로부터 시판되는Bacillus amyloliquefaciens로부터의 β-글루카나제)

4mg Brewers 프로테아제 2000 및

Aspergillus.sojae로부터의 엑소-펩티다제의 적절한 양을 함유하는 물 300ml에서 1시간동안 50℃에서 현탁한다. 다음에 온도를 63℃로 상승시키고(속도 1℃/분) 30분동안 63℃에서 유지한다. 다음에 90℃로 상승시키고(속도 1℃/분) 20분동안 90℃에서 유지한다. 다음에 양조를 25℃로 냉각시키고 15분동안 7000g에서 원심분리한다. 최종적으로 상청액을 용해성 단백질 및 유리 아미노산에 대해 분석한다.

결과는 표 15에 나타낸다:

시험번호	엑소-펩티다제사용량(Leu-AP/T)	12°플레이토에서의 아미노산(mg/l)	용해성 단백질(건조물질 %)
1	0	77.9	4.21
2	25000	95.3	4.75
3	50000	118.4	4.99
4	100000	133.2	5.42
5	200000	203.6	6.63
6	400000	295.0	7.55

이들 결과는 액화 단계동안에 효소를 사용할 때,Aspergillus sojae로부터의 엑소-펩티다제가 유리 아미노산의 수준을 맥아 양조에서 도달된 것같이 높게 보리 양조에서 도달되게 할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 8

Aspergillus sojae로부터의 엑소-펩티다제를Aspergillus niger로부터의 엑소-펩티다제로 치환한 것만 제외하고 실시예 7에 기재된 대로 보리를 양조하였다.

결과는 표 16에 나타낸다:

시험번호	엑소-펩티다제 사용량(Leu-AP/T)	12°플레이토에서의아미노산(mg/l)	용해성 단백질(건조물질 %)
1	0	68.2	4.37
2	10000	69.8	4.20
3	50000	75.2	4.25
4	200000	78.0	4.16
5	500000	89.1	4.50
6	1000000	101.0	4.18

Aspergillus niger로부터의 엑소-펩티다제가Aspergillus sojae로부터의 것보다 덜 효과적이더라도 맥주 발효에서 만족스런 값이 되는 12°플레이토 보리 맥아즙중의 100mg/l 아미노산에 도달하는 것을 가능하게 한다.

미생물 기탁

엑소펩티다제의 제조에 사용된 균주를 기탁번호 CBS 115.39(공개 콜렉션), CBS 209.96(A. sojae(DS 8351):기탁일: 1996년 2월 12일) 및 CBS 210.96(A. oryzae(DS 23617); 기탁일: 1996년 2월 12일)로 네덜란드 바른 오오스터슈트라트 1에 있는 센트라알 뷰로우 보어 쉼멜컬쳐스에 기탁하였다.

Claims

발효가능한 맥아즙의 제조방법에 있어서,

(a) α-아밀라제 및/또는 엔도프로테아제 활성의 도움으로 곡물 재료를 액화시켜 액화된 매시를 얻는 단계,

(b) α-아밀라제의 존재하에서 상기 액화된 매시를 당화시키는 단계,

(c) 액화시키고 당화시킨 매시를 여과하여 발효가능한 맥아즙을 얻는 단계로 이루어지고, 단계 (a) 및 (b)중 적어도 어느 한 단계를 엑소-펩티다제 활성을 갖는 효소의 존재하에서 시행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서, 곡물 재료는 맥아가 되지 않는 곡물을 적어도 20% 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 2 항에 있어서, 곡물 재료는 맥아가 되지 않는 수수를 적어도 20% 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 3 항에 있어서, 곡물 재료는 맥아가 되지 않는 수수를 적어도 50% 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한항에 있어서, 엑소펩티다제가 곡물재료의 액화동안에 존재하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한항에 있어서, 엑소펩티다제는 균류 엑소펩티다제인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 6 항에 있어서, 균류는Aspergillus종인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 7 항에 있어서, 균류는Aspergillus sojae인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 6 항에 있어서, 엑소-펩티다제는 아미노-펩티다제인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 8 항에 있어서, 엔도프로테아제는Bacillus amyloliquefaciens로부터 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한항에 따른 방법을 사용하여 맥아즙을 제조하는 단계와 이 맥아즙을 발효시켜 맥주를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 맥주양조법.
엔도프로테아제 및 엑소-펩티다제의 조합물을 곡물 또는 이 곡물로부터 얻은 액화된 매시에 가하는 단계를 포함하는, 글루텔린 및/또는 프롤라민의 많은 양을 함유하는 곡물로부터 자유롭게 이용가능한 질소를 효소학적으로 방출하는 방법.
알코올을 제조할 수 있는 효모의 존재하에서 제 1 항의 방법에 따라 얻을 수 있는 맥아즙을 발효시키는 단계를 포함하는 알코올, 알코올 함유 음료의 제조방법.
발효가능한 맥아즙의 제조방법에서 엑소펩티다제의 사용.
제 14 항에 있어서, 상기 엑소펩티다제는 균류 엑소펩티다제인 것을 특징으로 하는 사용.
제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 상기 엑소펩티다제는Aspergillus niger,Aspergillus oryzae또는Aspergillus sojae로 이루어지는 군에서 선택된 균류인 것을 특징으로 하는 사용.
제 14 항 내지 제 16 항중 어느 한항에 있어서, 맥아즙은 적어도 부분적으로 맥아가 되지 않는 곡물 재료로 제조되는 것을 특징으로 하는 사용.
제 14 항 내지 제 17 항중 어느 한항에 있어서, 맥아즙은 맥아가 되지 않는 수수 또는 맥아가 되지 않는 보리로 제조되는 것을 특징으로 하는 사용.
맥주의 관능 특성을 개선하기 위한 엑소펩티다제의 사용.
맥아즙의 여과성을 개선하기 위한 엑소펩티다제의 사용.