ES2316469T3 - Amenopeptidasa. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido aislado el cual tiene actividad aminopeptidasa, seleccionado a partir del grupo que consiste de: (a) un polipéptido el cual tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90% de identidad de la secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 1 a 663 de la ID SEC NO: 2 o un fragmento de la mismo, (b) un polipéptido el cual es codificado por un polinucleótido que hibrida bajo condiciones de alto rigor con (i) la secuencia de ácido nucleico de la ID SEC NO: 1 o (ii) una secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia de ácido nucleico de la ID SEC NO: 1, el polipéptido que tiene al menos una de las siguientes propiedades físico-químicas: (1) una actividad aminopeptidasa fenilalanina óptima a un pH en el rango entre 2 y 10, tal como entre 4 y 7, preferiblemente entre 4.5 y 6.5, óptimamente de 5 a 6; (2) un peso molecular (cuando está deglicosilada), de aproximadamente 72 kDa, y (3) un punto isoeléctrico de aproximadamente 5.6.
Description
Aminopeptidasa.
La presente invención se refiere a la
purificación de una aminopeptidasa a partir de un cultivo crudo
filtrado de una cepa Aspergillus niger, el aislamiento y
caracterización del gen que codifica la aminopeptidasa, la
expresión en exceso del gen de Aspergillus niger, la
caracterización de sus propiedades bioquímicas, y la aplicación de
la aminopeptidasa en la preparación de, por ejemplo, hidrolizados de
proteínas.
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Muchos productos alimenticios contienen agentes
saborizantes obtenidos por la hidrólisis de material proteínico.
Convencionalmente la hidrólisis es lograda mediante el uso de ácido
fuerte, seguido de neutralización. La hidrólisis ácida requiere el
uso de productos químicos agresivos y puede ser consumidora de
energía. Además, ésta frecuentemente conduce a la degradación
severa de los aminoácidos obtenidos durante la hidrólisis.
Las enzimas degradadoras de proteínas también
pueden ser utilizadas para la hidrólisis de proteínas porque son
menos contaminantes que los productos químicos fuertes, agresivos
usados en la hidrólisis ácida y también son capaces de trabajar
bajo condiciones leves, que impiden la racemización de los
aminoácidos. Típicamente el objetivo de la hidrólisis enzimática
del material proteínico es obtener un alto grado de hidrólisis,
usualmente mediante el uso de un coctel de enzimas proteolíticas
que actúan de manera no específica, tanto
endo-peptidasas como
exo-peptidasas. Las enzimas proteolíticas que actúan
de manera específicas no son usadas para este propósito debido a
que estas enzimas proporcionan un grado de hidrólisis inapropiado.
Por el contrario, cuando el objetivo es producir aminoácidos o
péptidos específicos a partir de un complejo de proteínas sin
destruir las propiedades físicas de las proteínas (tales como su
elasticidad, propiedades de formación de espuma o de textura) las
enzimas que actúan de manera específica son preferidas.
Muchos microorganismos son capaces de producir
endo- proteasas y exo-proteasas. En la industria
alimenticia, los Aspergilli han sido ampliamente usados desde hace
mucho tiempo y están, por lo tanto, de conformidad con las normas
de seguridad en muchos países de todo el mundo. Entre los
Aspergilli, Aspergillus niger es la especie más ampliamente
utilizada en la industria alimenticia. Aspergillus niger ha
sido usado como fuente de enzimas proteolíticas en el pasado. Por
ejemplo, WO 96/38549 describe la producción de un cultivo filtrado
a partir de una cepa de Aspergillus niger, donde el filtrado
exhibe actividad aminopeptidasa, y carece sustancialmente de
actividad endo-proteolítica. Sin embargo, la
actividad aminopeptidasa en el filtrado crudo fue relativamente
baja, y la fuente de la actividad enzimática nunca fue aislada o
específicamente identificada.
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La presente invención proporciona polipéptidos
aislados que tienen actividad aminopeptidasa, seleccionados a
partir de un grupo que consiste de:
(a) un polipéptido con una secuencia de
aminoácidos la cual tiene al menos 90% de identidad de la secuencia
de aminoácidos con los aminoácidos 1 a 663 de la ID SEC NO: 2;
(b) un polipéptido el cual es codificado por un
polinucleótido el cual hibrida bajos condiciones de alto rigor con
(i) la secuencia de ácido nucleico de la ID SEC NO: 1, o (ii) una
secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia de ácido
nucleico de la ID SEC NO: 1,
El polipéptido tiene al menos una de las
siguientes propiedades fisicoquímicas:
(1) una actividad fenilalanina aminopeptidasa
óptima a un pH en el rango desde 2 a 1, tal como desde 4 a 7,
preferiblemente desde 4.5 a 6.5, óptimamente desde 5 a 6;
(2) un peso molecular (deglicosilado), de
aproximadamente 72 kDa, y
(3) un punto isoeléctrico de aproximadamente
5.56.
Un polipéptido aislado de la invención puede
además estar caracterizado por una actividad fenilalanina
aminopeptidasa óptima a una temperatura que se encuentra en el
rango desde 35ºC hasta 70ºC.
La presente invención también proporciona un
polinucleótido aislado el cual codifica un polipéptido de la
invención y construcciones de ácidos nucleicos, vectores, y células
hospederas que comprenden tal polinucleótido, así como los métodos
para producir y usar el polipéptido.
La Fig. 1 muestra un cromatograma FPLC de una
muestra de fermentación, indicando las fracciones por separado que
tienen actividades aminoglucosidasa (AG) y aminopeptidasa (AP).
La Fig. 2 muestra un cromatograma FPLC del
concentrado A en una columna de intercambio aniónico.
La Fig. 3 muestra el análisis PAGE de la muestra
de fermentación (carril 1-2) y del concentrado B
(carril 3-40) y del concentrado B 4x (carril
5-6).
La Fig. 4 muestra la secuencia de ácido nucleico
del fragmento de PCR de 751 pb del gen que codifica la
aminopeptidasa aislada a partir de A. niger NRRL 3112,
correspondiente a las bases de 241-991 de la ID SEC
NO: 3.
La Fig. 5 muestra el mapa de restricción de pIM
4120. Los fragmentos del péptido secuenciados encontrados en el
traslado conceptual son encerrados en cuadros. SstI(pl): SstI
originarios del polienlazador de pGEM-T, B: BamHI,
K: KpnI, SstI (pl): SstI originario del polienlazador de
pGEM-T. La flecha indica el marco abierto de
lectura.
La Fig. 6 muestra la secuencia primaria del gen
que codifica la aminopeptidasa aislada de A. niger N400 (ID
SEC NO: 1).
La Fig. 7 muestra el mapa del plásmido de pIM
4121, pIM 4122 y pIM 4103. Los sitios para las enzimas de
restricción son indicados en el código de una letra: E: EcoRI; B:
BamHI; K: KpnI; X/S: sitio Xho clonado en un sitio SalI; P: PstI;
X: XhoI; H: HindIII; B(pl): BamHI sitio originario del
polienlazador del pUC 19. Las líneas de extremos romos pesados
representan porciones a utilizarse como sondas. Las flechas indican
los marcos abiertos de lectura. Los cuadros blancos representan
intrones.
La Fig. 8 muestra un Southern blot de
transformantes de aminopeptidasa. Los ADN genómicos digeridos con
HindIII de la cepa parental de A. niger NW 171 y 6
transformantes fueron analizados. Los números por encima de los
carriles representan A. niger NW 171 y los transformantes de
los mismos. Dos fragmentos de restricción que hibridan son
indicados, uno originario del gen endógeno de la aminopeptidasa y
uno originario a partir de integraciones (múltiples) de pIM 4103 en
el genoma. Las otras bandas son probablemente el resultado de
integraciones dispersas.
La Fig. 9 muestra un Nothern blot de la cepa
parental de A. niger NW171 y de los transformantes de la
misma que contienen el plásmido pIM 4103. Los números por encima de
los carriles representan A. niger NW 171 y los
transformantes del mismo. El Panel A muestra los resultados del
sondeo para la expresión de aminopeptidasa, mientras que el Panel B
muestra los controles de la carga de muestra interna que muestra la
igualdad de carga del ARN ribosomal.
La Fig. 10 muestra la dependencia del pH de la
hidrólisis de Phe-pNA catalizada por la
aminopeptidasa a 30ºC usando tampón de Mcllvaine.
La Fig. 11 muestra la dependencia del pH de la
hidrólisis de Leu-pNA catalizada por la
aminopeptidasa a 30ºC usando tampón de Mcllvaine.
La Fig. 12 muestra la estabilidad a la
temperatura de la aminopeptidasa. La actividad residual después de
pre incubación a varias temperaturas se calculó usando una muestra
la cual fue mantenida en hielo por 1 h como una referencia.
La Fig. 13 muestra la especificidad por el
sustrato de la actividad aminopeptidasa de la enzima purificada a
partir de extractos miceliares de A. niger a pH 5.2 y 7,2. El
% de actividad es relativo a la actividad hacia
Phe-pNA en caso de sustratos pNA y relativa a
Phe-\betaNA en caso de sustratos \betaNA.
La Fig. 14 muestra el análisis de
SDS-PAGE de las fracciones de los medios que
contienen aminopeptidasa, en los cuales CF representa el filtrado
del cultivo; CFE representa el extracto libre de células;
Z-CF representa la aminopeptidasa purificada a
parir del filtrado del cultivo, y Z-CFE representa
la aminopeptidasa purificada a partir de extractos libres de
células. La proteína aminopeptidasa se indica con una flecha.
La Fig. 15 muestra un análisis de Southern
"zooblot", en el cual una sonda de un fragmento
EcoRI-BamHI proveniente de A. niger N400
(CBS 120.49) fue hibridada con el ADN genómico de A. niger,
A. tubingensis, A. foetidus y A. carbonarius,
y lo cual indica la presencia de un gen para la aminopeptidasa
ortóloga en cada una de estas cepas de hongos.
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La presente invención proporciona un polipéptido
aislado el cual tiene actividad aminopeptidasa.
Un polipéptido de la invención puede estar en
una forma aislada. Tal y como se define en este documento, un
polipéptido aislado es un polipéptido recombinante o producido
endógenamente el cual está esencialmente libre de otros
polipéptidos no aminopeptidasa, y es típicamente al menos
aproximadamente 20% puro, preferiblemente al menos aproximadamente
40% puro, más preferiblemente al menos aproximadamente 60% puro, aún
más preferiblemente al menos aproximadamente 80% puro, aún más
preferiblemente aproximadamente 90% puro, y más preferiblemente
aproximadamente 95% puro, según lo determinado por
SDS-PAGE. El polipéptido puede ser aislado por
centrifugación y métodos cromatográficos, o cualquier otra técnica
conocida en el arte para obtener proteínas puras a partir de
soluciones crudas. Se entenderá que el polipéptido puede ser
mezclado con portadores o diluyentes los cuales no interfieran con
el propósito previsto del polipéptido, y aún así el polipéptido de
esta forma seguiría siendo considerado como aislado. Este
generalmente comprenderá el polipéptido en una preparación en la que
más del 20%, por ejemplo, más del 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95% o
99%, en peso de las proteínas en la preparación es un polipéptido
de la invención.
Preferiblemente, el polipéptido de la invención
se puede obtener a partir de un microorganismo el cual posee un gen
que codifica una enzima con actividad aminopeptidasa. Más
preferiblemente el microorganismo es fúngico, y óptimamente es un
hongo filamentoso. Organismos preferidos son, por tanto, del género
Aspergillus, tales como aquellos de la especie
Aspergillus niger.
"Actividad aminopeptidasa" es definida como
la capacidad para liberar aminoácidos o pequeños péptidos a partir
del amino-terminal de un (poli)péptido.
Preferiblemente la aminopeptidasa puede cortar entre dos aminoácidos
adyacentes. Los polipéptidos sustratos pueden o no ser sustituidos,
el amino-terminal puede o no ser acilado (es decir,
por acetilación). Preferiblemente la aminopeptidasa tiene una
preferencia por la liberación de un aminoácido aromático a partir
de la proteína sustrato, más preferiblemente, la fenilalanina es
liberada.
A los efectos de la presente invención, la
actividad aminopeptidasa es determinada mediante la medición de la
velocidad inicial de hidrólisis de la
L-fenilalanina-nitroanilida a 400
nm.
En una primera realización, la presente
invención proporciona un polipéptido aislado que tiene un secuencia
de aminoácidos la cual tiene un grado de identidad de la secuencia
de aminoácidos para los aminoácidos 1 a 663 de la ID SEC NO: 2 (es
decir, el polipéptido maduro) de al menos el 90%, aún más
preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, y más
preferiblemente, al menos aproximadamente el 97%, y el cual tiene
actividad aminopeptidasa.
A los efectos de la presente invención, el grado
de identidad entre dos o más secuencias de aminoácidos es
determinado por programa de búsqueda en bases de datos de proteínas
BLAST (Altschul y otros., 1997, Nucleic Acids Research 25:
3389-3402) con matriz Blosum 62 y un umbral esperado
de 10.
Un polipéptido de la invención puede comprender
la secuencia de aminoácidos establecida en la ID SEC NO: 2 o una
secuencia sustancialmente homóloga, o un fragmento de una u otra
secuencia que tenga actividad aminopeptidasa. En general, la
secuencia de aminoácidos de origen natural mostrada en la ID SEC NO:
2 es preferida.
El polipéptido de la invención también puede
comprender una variante de origen natural o especies homólogas al
polipéptido de la ID SEC NO: 2.
Una variante es un polipéptido que se produce en
forma natural en, por ejemplo, hongos, bacterias, levaduras o
células de plantas, teniendo la variante una actividad
aminopeptidasa y una secuencia sustancialmente similar a la
proteína de la ID SEC NO: 2. El término "variantes" se refiere
a polipéptidos que tienen el mismo carácter esencial o la
funcionalidad biológica básica de la aminopeptidasa de la ID SEC NO:
2, e incluye variantes alélicas. El carácter esencial de
aminopeptidasa de la ID SEC NO: 2 es que es una enzima capaz de
escindir el aminoácido amino-terminal de una
proteína o (poli)péptido.
Preferiblemente, una variante de polipéptido
tiene al menos el mismo nivel de actividad aminopeptidasa que el
polipéptido de la ID SEC NO: 2. Las variantes incluyen variantes
alélicas, ya sea de la misma cepa que el polipéptido de la ID SEC
NO: 2. o de una cepa diferente del mismo género o especie.
Similarmente, una especie homóloga de la
proteína inventiva es una proteína equivalente de secuencia similar
la cual es una aminopeptidasa y se produce naturalmente en otras
especies de Aspergillus.
Las variantes y las especies homólogas pueden
ser aisladas usando los procedimientos descritos en este documento
los cuales fueron usados para aislar el polipéptido de la ID SEC NO:
2 y la realización de tales procedimientos sobre una fuente celular
apropiada, por ejemplo, una célula bacteriana, de levadura, de hongo
o de planta. También es posible el uso de una sonda de la invención
para bibliotecas de sondas hechas a partir de levaduras, bacterias,
hongos o células de plantas, con el objetivo de obtener clones que
expresan variantes o especies homólogas del polipéptido de la ID
SEC NO: 2.
Estos clones pueden ser manipulados por las
técnicas convencionales para generar un polipéptido de la invención
el cual posteriormente puede ser producido por técnicas
recombinantes o sintéticas conocidas per se.
La secuencia del polipéptido de la ID SEC NO: 2
y de las variantes y especies homólogas, también pueden ser
modificadas para proporcionar los polipéptidos de la invención.
Sustituciones de aminoácidos pueden ser hechas, por ejemplo, desde
1, 2 ó 3 a 10, 20 ó 30 sustituciones. El mismo número de inserciones
y deleciones pueden también ser hechas. Estos cambios pueden ser
hechos fuera de las regiones críticas para la función del
polipéptido, tal como polipéptido modificado que retendrá su
actividad aminopeptidasa.
Los polipéptidos de la invención incluyen
fragmentos de los polipéptidos de longitud completa mencionados y
de las variantes de los mismos, tales como fragmentos de la
secuencia establecida en la ID SEC NO: 2. Tales fragmentos
típicamente retendrán la actividad como una aminopeptidasa.
Polipéptidos de la invención pueden, si es
necesario, ser producidos por vía sintética, aunque usualmente se
obtendrán por vía recombinante según es descrito debajo. Los
polipéptidos sintéticos pueden ser modificados, por ejemplo,
mediante la adición de residuos de histidina o una etiqueta T7 para
ayudar a su identificación o purificación, o mediante la adición de
una secuencia señal para promover su secreción a partir de una
célula.
Así, las variantes de secuencias pueden
comprender aquellas derivadas de cepas de Aspergillus
diferentes de la cepa a partir de la cual el polipéptido de la ID
SEC NO: 2 fue aislado. Las variantes pueden ser identificadas a
partir de otras cepas de Aspergillus mediante la búsqueda de
actividad aminopeptidasa y la clonación y secuenciación según lo
descrito en este documento. Las variantes pueden incluir la
deleción, modificación o adición de aminoácidos individuales o
grupos de aminoácidos en la secuencia de la proteína, mientras que
el péptido mantiene la funcionalidad biológica básica de la
aminopeptidasa de la ID SEC NO: 2.
Sustituciones de aminoácidos pueden ser hechas,
por ejemplo, de 1, 2 ó 3 a 10, 20 ó 30 sustituciones. El polipéptido
modificado generalmente retendrá la actividad como una
aminopeptidasa. Sustituciones conservadoras pueden ser hechas; esas
sustituciones son bien conocidas en el arte. Preferiblemente las
sustituciones no afectan el plegamiento o la actividad del
polipéptido.
Secuencias polipeptídicas más cortas están
dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, un péptido es
considerado que cae dentro del alcance de la invención en la medida
en que demuestra la funcionalidad biológica básica de la
aminopeptidasa de la ID SEC NO: 2. En particular, pero no
exclusivamente, este aspecto de la invención abarca la situación en
la cual la proteína es un fragmento de la secuencia completa de
proteínas.
En una segunda realización, la presente
invención proporciona un polipéptido aislado el cual tiene actividad
aminopeptidasa, y es codificado por polinucleótidos los cuales
hibridan o son capaces de hibridar bajo condiciones de alto rigor,
con (i) la secuencia de ácido nucleico de la ID SEC NO: 1 o (ii) con
un ácido nucleico complementario para la ID SEC NO: 1.
El término "capaz de hibridar" significa
que el polinucleótido objetivo de la invención puede hibridar con
el ácido nucleico usado como una sonda (por ejemplo, la secuencia
nucleotídica establecida en la SEQ. ID NO: 1, o un fragmento de la
misma, o el complemento de la ID SEC NO: 1) a un nivel
significativamente por encima del fondo. La invención también
incluye los polinucleótidos que codifican las aminopeptidasas de la
invención, así como las secuencias de nucleótidos que son
complementarias para los mismos. La secuencia nucleotídica puede
ser ARN o ADN, incluyendo ADN genómico, ADN sintético o ADNc.
Preferiblemente, la secuencia nucleotídica es ADN y es más
preferiblemente, una secuencia de ADN genómico. Típicamente, un
polinucleótido de la invención comprende una secuencia contigua de
nucleótidos que es capaz de hibridar bajo condiciones selectivas con
secuencias que codifica o el complemento de las secuencias que
codifica de la ID SEC NO: 1. Tales nucleótidos pueden ser
sintetizados de acuerdo a los métodos bien conocidos en el arte.
Un polinucleótido de la invención puede hibridar
con la secuencia de codificación o el complemento de la secuencia
de codificación de la ID SEC NO: 1 a un nivel significativamente por
encima del fondo. La hibridación de fondo puede ocurrir, por
ejemplo, debido a otros ADNc presentes en una biblioteca de ADNc. El
nivel de la señal generada por la interacción entre un
polinucleótido de la invención y la secuencia de codificación o el
complemento de la secuencia de codificación de la ID SEC NO: 1, es
típicamente al menos 10 veces, preferiblemente al menos 20 veces,
más preferiblemente al menos 50 veces, y aún más preferiblemente al
menos 100 veces, tan intensa como las interacciones entre otros
polinucleótidos y la secuencia de codificación de la ID SEC NO: 1.
La intensidad de la interacción puede medirse, por ejemplo,
mediante radiomarcaje de la sonda, por ejemplo con ^{32}P. La
hibridación selectiva puede típicamente ser lograda usando
condiciones de bajo rigor (cloruro de sodio 0.3M y citrato de sodio
0.03M, a aproximadamente 40ºC), rigor intermedio (por ejemplo,
cloruro de sodio 0.3M y citrato de sodio 0.03M, a aproximadamente
50ºC) o alto rigor (por ejemplo, cloruro de sodio 0.3M y citrato de
sodio 0.03M, a aproximadamente 60ºC).
Los polinucleótidos de la invención pueden
comprender ADN o ARN. Pueden ser de simple o doble cadena. Pueden
también ser polinucleótidos que incluyen dentro de ellos nucleótidos
sintéticos o modificados incluyendo los ácidos nucleicos
peptídicos. Un número de diferentes tipos de modificaciones para los
polinucleótidos son conocidos en el arte. Estas incluyen un
esqueleto de metilfosfonato y fósforotioato, y además cadenas de
acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. A
los efectos de la presente invención, debe ser entendido que los
polinucleótidos descritos en este documento pueden ser modificados
mediante cualquiera de los métodos disponibles en el
arte.
arte.
Debe entenderse que las personas expertas
pueden, usando las técnicas de rutina, hacer sustituciones de
nucleótidos que no afecten la secuencia del polipéptido codificado
por el polinucleótido de la invención, a fin de reflejar usaje de
codones de cualquier organismo hospedero particular en cual los
polipéptidos de la invención serán expresados.
La secuencia de codificación de la ID SEC NO: 1
puede ser modificada mediante sustituciones de nucleótidos, por
ejemplo, 1, 2 ó 3 a 10, 25, 50 ó 100 sustituciones. El
polinucleótido de la ID SEC NO: 1 puede alternativamente o
adicionalmente, ser modificado mediante una o más inserciones y/o
deleciones y/o mediante una extensión en uno o ambos extremos. El
polinucleótido modificado generalmente codifica un polipéptido que
tiene actividad aminopeptidasa. Sustituciones degeneradas pueden
ser hechas y/o sustituciones pueden ser hechas las cuales
resultarían en una sustitución de aminoácido conservadora cuando la
secuencia modificada es traducida, por ejemplo como se explica en
referencia a los polipéptidos más adelante.
Una secuencia nucleotídica la cual es capaz de
hibridar selectivamente bajo condiciones de alto rigor para el
complemento de la secuencia de ADN que codifica de la ID SEC NO: 1
está incluida en la invención y generalmente tendrá al menos 50% ó
60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al
menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia para la
secuencia de codificación de la ID SEC NO: 1 sobre una región de al
menos 60, preferiblemente al menos 100, más preferiblemente al menos
200 nucleótidos contiguos, o más preferiblemente a lo largo de toda
la longitud de la ID SEC NO: 1. Del mismo modo, un nucleótido el
cual codifica una aminopeptidasa activa y el cual es capaz de
selectivamente hibridar bajo condiciones de alto rigor para un
fragmento de un complemento de la secuencia de ADN que codifica de
la ID SEC NO: 1, también es comprendido por la invención. Un
fragmento C-terminal de la secuencia de ácido
nucleico de la ID SEC NO: 1, el cual es al menos 80% ó 90% idéntico
para 80, más preferiblemente 100 nucleótidos, más preferiblemente al
menos 90% idéntico para 200 nucleótidos, es comprendido por la
invención.
Cualquier combinación de los grados de identidad
y los tamaños mínimos mencionados, puede ser usada para definir los
polinucleótidos de la invención, con las combinaciones más rigurosas
(es decir, mayor identidad para mayores longitudes) siendo las
preferidas. Así, por ejemplo, un polinucleótido el cual es al menos
80% ó 90% idéntico para 60, preferiblemente 100 nucleótidos, forma
un aspecto de la invención, al igual que lo es un polinucleótido el
cual es al menos 90% idéntico para 200 nucleótidos.
El paquete UWGCG proporciona el programa la
BESTFIT el cual puede ser usado para calcular la identidad (por
ejemplo usado en su configuración por defecto).
Los algoritmos PILEUP y BLAST N pueden ser
usados para calcular la identidad o el alineamiento de las
secuencias (tal como la identificación de equivalentes o secuencias
correspondientes, por ejemplo en su configuración por defecto).
El software para realizar el análisis por BLAST
está a disposición del público a través del National Center for
Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Este
algoritmo consiste en identificar primero los pares de secuencias
de alto valor (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de
longitud W en la secuencia de búsqueda, que o son idénticas o
satisfacen algún umbral estimado como positivo de valor T, cuando
son alineadas con una palabra de la misma longitud en una base de
datos de secuencias. T es referido al umbral del valor de vecindad
de palabra. Estas coincidencias iniciales en la vencidad de palabra
actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP que
las contengan. Las coincidencias de palabras se extienden en ambas
direcciones a lo largo de cada secuencia hasta tanto el valor de
alineamiento acumulativo pueda ser incrementado. Las extensiones
de las palabras coincidentes se detiene en cada dirección cuando:
el valor de alineamiento acumulativo cae por la cantidad X a partir
de su máximo valor logrado; el valor acumulativo llega a ser
inferior o igual a cero debido a la acumulación de uno o más
residuos de alineamiento con valor negativo; o el final de
cualquiera de las dos secuencia es alcanzado. Los parámetros del
algoritmo BLAST, W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad
del alineamiento. El programa Blast usa por defecto una longitud de
palabra (W) de 11, los alineamientos de la matriz de puntuación
BLOSUM62 (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4, y una
comparación de ambas cadenas.
El algoritmo BLAST realiza un análisis
estadístico de la similaridad entre dos secuencias. Una medida de la
similaridad proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad
de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación
de la probabilidad mediante la cual la concordancia entre dos
secuencias nucleotídicas o de aminoácidos ocurriría al azar. Por
ejemplo, una secuencia es considerada similar a otra secuencia si la
probabilidad de la suma más pequeña en la comparación de la primera
secuencia con la segunda secuencia es menor que aproximadamente 1,
preferiblemente menos que aproximadamente 0.1, más preferiblemente
es menor que aproximadamente 0.01, y más preferiblemente es menor
que aproximadamente 0.001.
Los polinucleótidos de la invención incluyen y
pueden ser usados como cebadores, por ejemplo, como cebadores de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como cebadores para
reacciones de amplificación alternativas, o como sondas, por
ejemplo, marcadas con una etiqueta que se puede revelar por medios
convencionales, usando etiquetas radiactivas o no radiactivas, o
los polinucleótidos pueden ser clonados en vectores. Tales
cebadores, sondas y otros fragmentos serán al menos de 20, por
ejemplo, al menos de 25, 30 ó 40 nucleótidos de longitud. Ellos
típicamente serán de hasta 40, 50, 60, 70 100, 150, 200 ó 300
nucleótidos de longitud, o incluso hasta de unos pocos nucleótidos
(tales como 5 ó 10 nucleótidos) por debajo de la secuencia de
codificación de ID SEC NO: 1.
En general, los cebadores serán producidos por
vía sintética, involucrando la manufactura paso a paso de la
secuencia de ácidos nucleicos deseada, un nucleótido cada vez. Las
técnicas para lograr esto, usando protocolos automatizados están
fácilmente disponibles en el arte. Ejemplos de cebadores de la
invención son presentados en la Tabla 1 (ID SEC NOs:
4-10), y en la Tabla 3 (ID SEC Nos:
13-21, ID SEC NO: 6).
Los polinucleótidos más largos generalmente
serán producidos usando medios recombinantes, por ejemplo, usando
técnicas de clonación por PCR. Para ello será preciso hacer un par
de cebadores (típicamente de aproximadamente de
15-30 nucleótidos) para amplificar la región deseada
de la aminopeptidasa a ser clonada, poner en contacto los cebadores
con el ARNm, ADNc o ADN genómico obtenido a partir de una célula de
levadura, de bacteria, de planta, una célula procariótica o
fúngica, preferiblemente de una cepa de Aspergillus, realizar
una reacción en cadena de la polimerasa bajo las condiciones
apropiadas para la amplificación de la región deseada, aislar el
fragmento amplificado (por ejemplo, purificando la mezcla de
reacción en un gel de agarosa) y recuperando el ADN amplificado.
Los cebadores pueden ser diseñados de manera que contengan sitios de
reconocimiento por enzimas de restricción apropiadas, de manera que
el ADN amplificado puede ser clonado en un vector de
clonación
apropiado.
apropiado.
Tales técnicas pueden ser usadas para obtener la
totalidad o parte de los polinucleótidos que codifican las
secuencias de aminopeptidasa descritas en este documento. Intrones,
promotores y regiones trailer están dentro del alcance de la
invención, y pueden también ser obtenidas en una forma análoga (por
ejemplo, por vía recombinante, PCR o técnicas de clonación), a
partir de ADN genómico de hongos, levaduras, bacterias o células
procarióticas o de plantas.
Los polinucleótidos o cebadores pueden llevar
una etiqueta que se puede revelar. Etiquetas apropiadas incluyen
radioisótopos tales como ^{32}P o ^{35}S, etiquetas enzimáticas,
u otras etiquetas de proteínas, tal como la biotina. Tales
etiquetas pueden ser añadidas a los polinucleótidos o cebadores de
la invención, y pueden ser detectadas usando técnicas conocidas por
personas expertas en el arte.
Los polinucleótidos o cebadores (o fragmentos de
los mismos) etiquetados o no etiquetados, pueden ser usados en
pruebas basadas en ácido nucleico para detectar o secuenciar una
aminopeptidasa o una variante de la misma en una muestra fúngica.
Tales pruebas de detección generalmente comprenderán poner en
contacto una muestra fúngica que se sospechosa que contiene el ADN
de interés con una sonda que comprende un polinucleótido o primer
de la invención bajo condiciones de hibridación, y detectar
cualquier dúplex formado entre la sonda y el ácido nucleico de la
muestra. La detección puede ser lograda usando técnicas tales como
la PCR o mediante la inmovilización de la sonda en un soporte
sólido, eliminando cualquier ácido nucleico de la muestra que no se
hibridó con la sonda y, entonces detectando cualquier ácido nucleico
que haya hibridado con la sonda.
Alternativamente, la muestra de ácido nucleico
puede ser inmovilizada sobre un soporte sólido, la sonda hibridada
y la cantidad de sonda unida a tal soporte, después de la
eliminación de cualquier sonda no unida, detectada.
Las sondas de la invención pueden ser
convenientemente empacadas en la forma de un kit de prueba en un
recipiente apropiado. En tales kits la sonda puede ser unida a un
soporte sólido cuando el formato del ensayo para el cual kit está
diseñado requiere tal unión. El kit también puede contener reactivos
apropiados para el tratamiento de la muestra a ser ensayada,
hibridando la sonda al ácido nucleico en la muestra, reactivos de
control, instrucciones, etc. Las sondas y los polinucleótidos de la
invención pueden utilizarse también en microensayos.
Preferiblemente, el polinucleótido de la
invención se puede obtener a partir del mismo organismo que el
polipéptido, tal como un hongo, en particular, un hongo del género
Aspergillus.
Los polinucleótidos de la invención también
incluyen variantes de la secuencia de la ID SEC NO: 1, las cuales
codifican para un polipéptido que tiene actividad aminopeptidasa.
Las variantes pueden ser formadas mediante adiciones, sustituciones
y/o deleciones. Tales variantes de la secuencia de codificación de
la ID SEC NO: 1 pueden de esta manera codificar polipéptidos que
tienen la capacidad de eliminar los aminoácidos del extremo amino
terminal de un polipéptido.
Los polinucleótidos que no tienen el 100% de
identidad con la ID SEC NO: 1, pero caen dentro del alcance de la
invención, puede ser obtenidos de varias maneras. Así, las variantes
de secuencias de aminopeptidasa descritas en este documento pueden
obtenerse por ejemplo, mediante el sondeo de bibliotecas de ADN
genómico a partir de un rango de organismos, tales como aquellos
discutidos como fuentes de los polipéptidos de la invención.
Además, otros homólogos de aminopeptidasa de hongos, plantas o
procarióticos, pueden ser obtenidos y tales homólogos y fragmentos
de los mismos, en general, serán capaces de hibridar con la ID SEC
NO: 1. Estas secuencias pueden ser obtenidos mediante el sondeo de
librerías de ADNc o de ADN genómico proveniente de otras especies,
y sondeando tales bibliotecas con sondas que comprenden la totalidad
o parte de la ID SEC. NO:1 bajo condiciones del medio de alto rigor
(según lo descrito anteriormente). Las sondas de ácido nucleico que
comprenden la totalidad o parte de la ID SEC NO: 1, pueden ser
usadas para sondear ADNc o bibliotecas genómicas a partir de otras
especies, tales como las que son descritas como fuentes para los
polipéptidos de la invención.
Las especies homólogas también pueden ser
obtenidas usando PCR degenerada, la cual usa cebadores diseñados
para secuencias objetivo dentro de las variantes y homólogos, las
cuales codifican secuencias de aminoácidos conservadas. Los
cebadores pueden contener una o más posiciones degeneradas y se
usarán en condiciones de rigor más bajo que las usadas para la
clonación de secuencias con cebadores de secuencia simple, contra
las secuencias conocidas.
Alternativamente, tales polinucleótidos pueden
ser obtenidos por mutagénesis sitio dirigida de las secuencias de
aminopeptidasa o variantes de la misma. Esto puede ser útil cuando,
por ejemplo, cambios de codones silentes para las secuencias son
requeridos para optimizar las preferencias de codones para una
célula hospedera particular, en la cual las secuencias
polinucleotídicas están siendo expresadas. Otros cambios de
secuencias pueden ser hechos con el objetivo de introducir sitios
de reconocimiento de enzimas de restricción, o para alterar la
propiedad o la función de los polipéptidos codificados por los
polinucleótidos.
La invención incluye polinucleótidos de doble
cadena que comprenden un polinucleótido de la invención y su
complemento.
La presente invención también proporciona
polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de la invención
descritos anteriormente. Puesto que tales polinucleótidos serán
útiles como secuencias para la producción recombinante de los
polipéptidos de la invención, no es necesario para que ellos sean
capaces de hibridar con la secuencia de la ID SEC NO: 1, aunque
esto será generalmente deseable. De otra manera, tales
polinucleótidos pueden ser etiquetados, usados y hechos, según lo
descrito anteriormente si así se desea.
La invención también proporciona vectores que
comprenden un polinucleótido de la invención, incluyendo vectores
de clonación y expresión, y en otro aspecto, métodos de cultivar,
transformar o transfectar tales vectores en una célula hospedera
apropiada, por ejemplo bajo condiciones en las cuales la expresión
de un polipéptido de, o codificado por una secuencia de, la
invención se produce. Asimismo, se proporcionan las células
hospederas que comprenden un polinucleótido o vector de la
invención, donde el polinucleótido es heterólogo para el genoma de
la célula hospedera. El término "heterólogo", usualmente con
respecto a la célula hospedera, significa que el polinucleótido no
se encuentra naturalmente en el genoma de la célula hospedera o que
el polipéptido no es producido naturalmente por esa célula.
Preferiblemente, la célula hospedera es una célula de levadura, por
ejemplo, una célula de levadura del género Kluyveromyces o
Saccharomyces o una célula de hongos filamentosos, por
ejemplo del género
Aspergillus.
Aspergillus.
Los oligonucleótidos de la invención pueden ser
incorporados en un vector replicable recombinante, por ejemplo, un
vector de clonación o expresión. Tal vector puede ser usado para
replicar el ácido nucleico en una célula hospedera compatible. Así,
en una realización adicional, la invención proporciona un método de
hacer los polinucleótidos de la invención mediante la introducción
de un polinucleótido de la invención en un vector replicable,
introducir el vector en una célula hospedera compatible, y cultivar
la célula hospedera bajo condiciones las cuales propician la
replicación del vector. El vector puede ser recuperado a partir de
la célula hospedera. Células hospederas apropiadas son descritas
debajo en relación con los vectores de expresión.
El vector dentro del cual el casete de expresión
de la invención es insertado, puede ser cualquier vector que pueda
convenientemente ser sometido a procedimientos de ADN recombinante,
y la elección del vector frecuentemente dependerá de la célula
hospedera en la cual este será introducido. Así, el vector puede ser
un vector de replicación autónoma, es decir un vector el cual
existe como una entidad extra-cromosómica, cuya
réplica es independiente de la replicación cromosómica, tal como un
plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno el cual, cuando
es introducido en una célula hospedera, es integrado en el genoma de
la célula hospedera y se replica junto con el (los)
cromosoma(s) dentro del cual ha sido integrado.
Preferiblemente, cuando un polinucleótido de la
invención está en un vector, éste está operablemente ligado a una
secuencia reguladora la cual es capaz de proporcionar la expresión
de la secuencia de codificación por la célula hospedera, es decir,
el vector es un vector de expresión. El término "operablemente
ligado" se refiere a una yuxtaposición donde los componentes
descritos se encuentran en una relación que les permita funcionar a
su manera. Una secuencia reguladora tal como un promotor,
potenciador u otra señal de regulación de la expresión
"operablemente ligada" a una secuencia de codificación, está
posicionada de tal manera que la expresión de la secuencia de
codificación es lograda bajo condiciones compatibles con las de las
secuencias de control.
Los vectores pueden, por ejemplo en el caso del
plásmido, cósmido, virus o vectores de fagos, estar provistos de un
origen de replicación, opcionalmente, un promotor para la expresión
del polinucleótido y, opcionalmente, un potenciador y/o un
regulador del promotor. Una secuencia de terminación puede estar
presente, así como puede estarlo una secuencia de poliadenilación.
Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores
seleccionables, por ejemplo, un gen de resistencia a la ampicilina
en el caso de un plásmido bacteriano o un gen de resistencia a la
neomicina para un vector de mamíferos. Los vectores pueden ser
usados in vitro, por ejemplo para la producción de ARN, o
pueden ser usados para transfectar o transformar una célula
hospedera.
La secuencia de ADN que codifica el polipéptido
es preferiblemente introducida en un hospedero apropiado como parte
de una construcción de expresión en la cual la secuencia de ADN está
operablemente ligada a las señales de expresión las cuales son
capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ADN en las
células hospederas. Para la transformación del hospedero apropiado
con la construcción de expresión, los procedimientos de
transformación están disponibles los cuales son bien conocidos por
la persona experimentada. La construcción de expresión puede ser
usada para la transformación del hospedero como parte de un vector
que lleva un marcador seleccionable, o la construcción de expresión
es co-transformada como una molécula separada junto
con el vector portador de un marcador seleccionable. Los vectores
pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables.
Los marcadores seleccionables preferidos
incluyen, pero no se limitan a aquellos que complementan un defecto
en la célula hospedera o confieren resistencia a un fármaco. Ellos
incluyen, por ejemplo, genes marcadores versátiles que pueden ser
usados para la transformación de la mayoría de los hongos
filamentosos y levaduras, tales como genes de la acetamidasa o ADNc
(los genes amdD, niaD facA, o los ADNc de A. nidulans, A.
oryzae, o A. niger), o genes que proporcionan resistencia
a los antibióticos como los de resistencia a G418, higromicina,
bleomicina, kanamicina, fleomicina o al benomil (benA).
Alternativamente, marcadores de selección específicos pueden ser
usados, tales como marcadores auxotróficos los cuales requieren de
las cepas hospederas mutantes correspondientes: por ejemplo el URA3
(de S. cerevisiae o genes similares de otras levaduras),
pyrG o Pyra (de A. nidulans o A. niger), argB (de
A. nidulans o A. niger) o trpC. En una realización
preferida, el marcador de selección es eliminado de la célula
hospedera transformada después de la introducción de la
construcción de expresión a fin de obtener células hospederas
transformadas capaces de producir el polipéptido las cuales están
libres de los genes marcadores de la selección.
Otros marcadores incluyen la subunidad 9 de la
ATP sintetasa (oliC),
orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa
(pvrA), el gen de resistencia a G418 bacteriano (útil en levadura,
pero no en hongos filamentosos), el gen de resistencia a la
ampicilina (E. coli), el gen de resistencia a la neomicina
(Bacillus) y el gen uidA de E. coli, que codifica la
glucuronidasa (GUS). Los vectores pueden ser usados in vitro,
por ejemplo, para la producción de ARN o para transfectar o
transformar una célula hospedera.
Para la mayoría de hongos filamentosos y
levaduras, la construcción de expresión es preferiblemente integrada
en el genoma de la célula hospedera con el objetivo de obtener
transformantes estables. Sin embargo, para ciertas levaduras,
sistemas de vectores episomales apropiados están también disponibles
en los cuales la construcción de expresión puede ser incorporada
para un estable y alto nivel de expresión. Ejemplos de los mismos
incluyen vectores derivados a partir de los plásmidos de 2 \mum
CEN y pKD1 de Saccharomyces y Kluyveromyces,
respectivamente, o vectores que contiene una secuencia de AMA (por
ejemplo, AMA1 de Aspergillus). Cuando construcciones de
expresión se integren en los genomas de células hospederas, las
construcciones son, ya bien integradas al azar en los loci en el
genoma, o en los loci objetivos predeterminados usando recombinación
homóloga, en cuyo caso el loci objetivo preferiblemente comprende
un gen altamente expresado. Un gen altamente expresado es un gen
cuyo ARNm puede representar, al menos el 0.01% (p/p) del ARNm
celular total, por ejemplo bajo condiciones inducidas o,
alternativamente, un gen cuyo producto génico puede representar al
menos el 0.2% (p/p) de la proteína celular total, o, en el caso de
un producto génico secretado, puede ser secretado a un nivel de al
menos
0.05/1.
0.05/1.
Una construcción de expresión para una célula
hospedera dada, usualmente contendrá los siguientes elementos
operablemente ligados entre sí en orden consecutivo desde el extremo
5' hasta el extremo 3', relativo a la cadena de codificación de la
secuencia de codificación del polipéptido del primer aspecto: (1)
una secuencia promotora capaz de dirigir la transcripción de la
secuencia de ADN que codifica el polipéptido en la célula hospedera
dada, (2) preferiblemente, una región 5' no traducida (líder), (3)
opcionalmente, una secuencia señal capaz de dirigir la secreción
del polipéptido a partir de la célula hospedera dada en el medio de
cultivo, (4) la secuencia de ADN que codifica un polipéptido maduro
y preferiblemente de forma activa, y también preferiblemente (5)
una región de terminación de la transcripción (terminador) capaz de
terminar la transcripción corriente abajo a la secuencia de ADN que
codifica del polipéptido.
Corriente abajo a la secuencia de ADN que
codifica el polipéptido, la construcción de expresión contiene
preferiblemente una región 3' no traducida que contiene uno o más
sitios de terminación de la transcripción, también referido como
terminador. El origen del terminador es menos crítico. El terminador
puede por ejemplo ser nativo de la secuencia de ADN que codifica el
polipéptido. Sin embargo, preferiblemente un terminador de levadura
es usado en células hospederas de levadura y un terminador de
hongos filamentosos es usado en células hospederas de hongos
filamentosos. Más preferiblemente, el terminador es endógeno a la
célula hospedera en la que la secuencia de ADN que codifica el
polipéptido es expresada.
La expresión incrementada del polinucleótido que
codifica el polipéptido de la invención también puede ser lograda
mediante la selección de regiones reguladoras heterólogas, por
ejemplo las regiones promotora, la secuencia señal y el terminador,
las cuales sirven para aumentar la expresión y, si es deseado, los
niveles de secreción de la proteína de interés a partir del
hospedero de expresión seleccionado y/o para proporcionar el
control inducible de la expresión del polipéptido de la
invención.
Aparte del promotor nativo del gen que codifica
el polipéptido de la invención, otros promotores puedan ser usados
para la expresión directa del polipéptido de la invención. El
promotor puede ser seleccionado por su eficacia en dirigir la
expresión del polipéptido de la invención en el hospedero de
expresión deseado.
Promotores/potenciadores de la expresión y otras
señales de regulación, pueden ser seleccionados para ser
compatibles con la célula hospedera para cual el vector de expresión
se ha diseñado. Por ejemplo, promotores procarióticos pueden ser
usados, en particular los apropiadas para su uso en cepas de E.
coli. Cuando la expresión de los polipéptidos de la invención
es llevada a cabo en células de mamíferos, promotores de mamíferos
pueden ser usados. Los promotores específicos para tejidos, por
ejemplo promotores específicos de células como los hepatocitos,
también pueden ser usados. Los promotores virales también pueden ser
usados, por ejemplo, el largo terminal repetido del virus la
leucemia murina de Moloney (MMLV LTR), el promotor del virus del
sarcoma de Rous (RSV) LTR, el promotor SV40, el promotor del
citomegalovirus humano (CMV) IE, los promotores del virus del
herpes simplex o promotores de adenovirus.
Los promotores de levadura apropiados incluyen
los promotores GAL4 y ADH de S. cerevisiae y los promotores
nmt1 y adh de S. pombe. Los promotores de mamíferos incluyen
el promotor de la metalotioneína, que puede ser inducido en
respuesta a metales pesados como el cadmio. Promotores virales,
tales como el promotor del gran antígeno T de SV40 o promotores de
adenovirus también pueden ser usados. Todos estos promotores están
disponibles en el arte.
Los promotores de mamíferos, tales como los
promotores de la \beta-actina, también pueden ser
usados. Promotores para tejidos específicos, en particular,
promotores específicos para las células endoteliales o neuronales
(por ejemplo, los promotores DDAHI y DDAHII), son especialmente
preferidos. Promotores virales también pueden ser usados, por
ejemplo, el largo terminal repetido del virus de la leucemia murina
de Moloney (MMLV LTR), el promotor del virus del sarcoma de Rous
(RSV) LTR, el promotor SV40, el promotor del citomegalovirus humano
(CMV) IE, los promotores de adenovirus, los promotores del HSV
(tales como los promotores HSV IE), los promotores del VPH, en
particular la región reguladora del VPH corriente bajo del VPH
(URR). Los promotores virales están fácilmente disponibles en el
arte.
Una variedad de promotores que son capaces de
dirigir la transcripción en las células hospederas de la invención
pueden ser usados. Preferiblemente la secuencia promotora es
derivada a partir de un gen altamente expresado, según lo
anteriormente definido. Ejemplos de genes altamente expresados
preferidos a partir de los cuales son promotores preferiblemente
derivados y/o los cuales están comprendidos en loci objetivos
predeterminados preferidos para la integración de las
construcciones de expresión, incluyen pero no están limitados a
genes que codifican enzimas glicolíticas tales como
triosa-fosfato isomerasas (TPI),
gliceraldehído-fosfato deshidrogenasas (GAPDH),
fosfoglicerato quinasas (PGK), piruvato quinasas (PYK), alcohol
deshidrogenasas (ADH), así como genes que codifican amilasas,
glucoamilasas, proteasas, xilanasas, celobiohidrolasas,
R-galactosidasas, alcohol (metanol) oxidasas,
factores de elongación y proteínas ribosomales. Ejemplos específicos
de genes altamente expresados apropiados incluyen, por ejemplo, el
gen LAC4 de Kluyveromyces sp., los genes de la metanol
oxidasa (AOX y MOX) de Hansenula y Pichia,
respectivamente, los genes de la glucoamilasa (glaA) de A.
niger y A. awamori, el gen de la
TAKA-amilasa de A. oryzae, el gene gpdA de
A. nidulans y los genes de la celobiohidrolasa de T.
reesei.
Ejemplos de promotores fuertes constitutivos y/o
inducibles los cuales son preferidos para su uso en hospederos de
expresión fúngicos son los promotores que se pueden obtener a partir
de los genes fúngicos de la xilanasa (xinA), la fitasa, subunidad 9
de la ATP-sintetasa (oliC), la triosa fosfato
isomerasa (TPI), la alcohol deshidrogenasa (ADHA), la amilasa
(Amy), la amiloglucosidasa (AG- proveniente del gen glaA), la
acetamidasa (amdS) y la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GPD).
Ejemplos de promotores fuertes de levadura que
pueden ser usados incluyen aquellos que pueden obtenerse a partir
de los genes de la alcohol deshidrogenasa, lactasa, 3-
fosfoglicerato cinasa y triosafosfato isomerasa.
Ejemplos de promotores bacterianos fuertes que
pueden ser usados incluyen los promotores de la amilasa y SPo_{2},
así como los promotores provenientes de genes de proteasas
extracelulares.
Los promotores apropiados para las células de
las plantas que pueden ser usados incluyen los promotores de la
napalina sintetasa (nos), octopina sintetasa (ocs), manopina
sintetasa (mas), subunidad pequeña de la ribulosa (rubisco ssu),
histona, actina del arroz, faseolina, del virus del mosaico de la
coliflor (CMV) 35S y 19S y circovirus.
El vector puede incluir además secuencias
flanqueantes al polinucleótido que dan lugar al ARN el cual
comprende secuencias homólogas a las de las secuencias del genoma
eucariótico, preferiblemente secuencias del genoma de mamíferos, o
secuencias del genoma viral. Esto permitirá la introducción de los
polinucleótidos de la invención en el genoma de células
eucarióticas o viruses mediante recombinación homóloga. En
particular, un vector plasmídico que comprende el casete de
expresión, flanqueado por secuencias virales, puede ser usado para
preparar un vector viral apropiado para producir los
polinucleótidos de la invención en una célula de mamífero. Otros
Ejemplos de vectores virales apropiados incluyen los vectores
virales del herpes simplex y de retroviruses, incluyendo
lentiviruses, adenoviruses, viruses adeno-asociados
y viruses VPH (como el VPH-16 o
HPV-18). Las técnicas de transferencia génica
usando estos virus son conocidas por los expertos en el arte.
Vectores retrovirales, por ejemplo, pueden ser usados para integrar
establemente el polinucleótido que resultó al ARN antisentido en el
genoma hospedero. Los vectores adenovirales de replicación
defectuosa, por el contrario, siguen siendo episomales y, por lo
tanto, permiten la expresión transitoria.
El vector puede contener un polinucleótido de la
invención orientado en una dirección antisentido para la producción
de ARN antisentido. Esto puede ser usado para reducir, si es
deseado, los niveles de expresión del polipéptido.
En un aspecto adicional, la invención
proporciona un proceso para preparar un polipéptido de la invención,
el cual comprende cultivar una célula hospedera transformada o
transfectada con un vector de expresión como se ha descrito
anteriormente, bajo condiciones apropiadas para la expresión
mediante el vector de una secuencia de codificación que codifica
el polipéptido, y recuperar el polipéptido expresado. Los
polinucleótidos de la invención pueden ser incorporados en un
vector replicable recombinante, tal como un vector de expresión. El
vector puede ser usado para replicar el ácido nucleico de una célula
hospedera compatible. Así, en una realización adicional, la
invención proporciona un método de hacer un polinucleótido de la
invención mediante la introducción de un polinucleótido de la
invención en un vector replicable, introducir el vector en una
célula hospedera compatible, y cultivar la célula hospedera bajo
condiciones que propicien la replicación del vector. El vector
puede ser recuperado a partir de la célula hospedera. Células
hospederas apropiadas incluyen bacterias tales como E. coli,
levaduras, líneas celulares de mamíferos y otras líneas de células
eucarióticas, por ejemplo, células de insectos, como las células Sf9
y células de hongos (por ejemplo, filamentosos).
Preferiblemente el polipéptido es producido como
una proteína secretada en cuyo caso la secuencia de ADN que
codifica una forma madura del polipéptido en la construcción de
expresión, está operablemente ligada a una secuencia de ADN que
codifica una secuencia señal. En caso de que el gen que codifica la
proteína secretada tiene en la cepa de tipo salvaje una secuencia
señal, preferiblemente la secuencia señal será la nativa (homóloga)
a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Alternativamente
la secuencia señal es foránea (heteróloga) a la secuencia de ADN
que codifica el polipéptido, en cuyo caso la secuencia señal
preferiblemente es endógena a la célula hospedera en la que la
secuencia de ADN es expresada. Ejemplos de secuencias señales
apropiadas para células hospederas de levadura son las secuencias
señales derivadas de los genes MF\alpha de levadura.
Similarmente, una secuencia señal apropiada para células hospederas
de hongos filamentosos, es por ejemplo una secuencia señal derivada
a partir de un gen de amiloglucosidasa de hongos filamentosos (AG),
por ejemplo el gen glaA de A. niger. Esta secuencia señal
puede ser usada en combinación con el propio promotor de la
amiloglucosidasa (también llamado (gluco)amilasa), así como
en combinación con otros promotores. Una secuencia señal híbrida
también puede ser usada dentro del contexto de la presente
invención.
Secuencias líderes de la secreción heterólogas
preferidas son aquellas que se originan a partir del gen de la
amiloglucosidasa (AG) de hongos (glaA, ambas versiones de 18 y 24
aminoácidos por ejemplo, provenientes de Aspergillus), del
gen MF\alpha (levaduras, por ejemplo Saccharomyces y
Kluyveromyces) o el del gen de la
\alpha-amilasa (Bacillus).
Los vectores pueden ser transformados o
transfectados en una célula hospedera apropiada como se ha descrito
anteriormente, para la expresión de un polipéptido de la invención.
Este proceso puede comprender cultivar una célula hospedera
transformada con un vector de expresión como se ha descrito
anteriormente, bajo condiciones apropiadas para la expresión del
polipéptido, y, opcionalmente, recuperar el polipéptido
expresado.
Otro aspecto adicional de la invención
proporciona así células hospederas transformadas o transfectadas
con o que comprenden un polinucleótido o vector de la invención.
Preferiblemente el polinucleótido es llevado en un vector que
permite la replicación y expresión del polinucleótido. Las células
serán seleccionadas para ser compatibles con dicho vector y pueden,
por ejemplo, ser procarióticas (por ejemplo, bacterias) o
eucarióticas, de hongos, levaduras o células de plantas.
La invención abarca los procesos para la
producción de un polipéptido de la invención por vía de la expresión
recombinante de una secuencia de ADN que codifica el polipéptido. A
tal efecto, la secuencia de ADN de la invención puede ser utilizada
para la amplificación de genes y/o el intercambio de señales de
expresión, como promotores, secuencias señales de la secreción, con
el objetivo de permitir la producción económica del polipéptido en
una célula hospedera homóloga o heteróloga apropiada. Una célula
hospedera homóloga es aquí definida como una célula hospedera que
es de la misma especie o que es una variante dentro de la misma
especie que la especie a partir de la cual la secuencia de ADN es
derivada.
Las células hospedera apropiadas son
preferiblemente microorganismos procarióticos tales como las
bacterias, o más preferiblemente los organismos eucarióticos, por
ejemplo los hongos, tales como levaduras u hongos filamentosos, o
las células de plantas. En general, las células de levadura son
preferidas sobre las células de hongos filamentosos porque son más
fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas son o bien,
pobremente secretadas en levaduras, o en algunos casos no son
procesadas apropiadamente (por ejemplo, hiperglicosilación en
levadura). En estos casos, un organismo hospedero de hongo
filamentoso debe ser seleccionado.
Las bacterias del género Bacillus son muy
apropiadas como hospederos heterólogos debido a su capacidad de
secretar proteínas en el medio de cultivo. Otras bacterias
apropiadas como hospederos son las de los géneros de
Streptomyces y Pseudomonas. Una célula hospedera
preferida de levadura para la expresión de la secuencia de ADN que
codifica el polipéptido, es una del género Saccharomyces,
Kluyveromyces, Hansenula, Pichia,
Yarrowia, o Schizosaccharomyces. Más preferiblemente,
una célula hospedera de levadura es seleccionada a partir del grupo
que consiste de las especies Saccharomyces cerevisiae,
Kluyveromyces lactis (también conocida como Kluyveromyces
marxianus var. lactis), Hansenula polymorpha,
Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, y
Schizosaccharomyces pombe.
Las más preferidas para la expresión de la
secuencia de ADN que codifica el polipéptido, sin embargo, son las
células hospederas de los hongos filamentosos. Células hospederas de
hongos filamentosos preferidas son seleccionadas a partir del grupo
que consiste de los géneros Aspergillus, Trichoderma,
Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium,
Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora,
Sporotrichum, Thielavia, y Talaromyces. Más
preferiblemente una célula hospedera de hongos filamentosos es de la
especie Aspergillus oyzae, Aspergillus sojae o
Aspergillus nidulans o es de una especie proveniente del
Grupo de Aspergillus niger (según la definición de Raper y
Fennel, The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins
Company, Baltimore, pp 293-344,1965). Estas
incluyen, pero no están limitadas a Aspergillus niger,
Aspergillus awamori, Aspergillus tubigensis,
Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus,
Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus,
Aspergillus oryzae y Aspergillus ficuum, así como
también aquellos de las especies Trichoderma reesei,
Fusarium graminearum, Penicillium notatum,
Acremonium alabamense, Neurospora crassa,
Myceliophtora thermophilum, Sporotrichium
cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum y
Thielavia terrestris.
Ejemplos de hospederos de expresión preferidos
dentro del alcance de la presente invención son los hongos tales
como los de especie de Aspergillus (en particular los que son
descritas en el EP-A-184,438 y
EP-A-284,603) y los de la especie
de Trichoderma; bacterias tales como las de la especie de
Bacillus (en particular las que son descritas en el
EP-A-134,048 y
EP-A-253.455), especialmente
Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis,
Bacillus amiloliquefaciens, especies de Pseudomonas; y
levaduras tales como las de la especie de Kluyveromyces (en
particular las que son descritas en
EP-A-096.430, tales como
Kluyveromyces lactis y en
EP-A-301,670) y de la especie de
Saccharomyces, tal como Saccharomyces cerevisiae.
Células hospederas de acuerdo con la invención
incluyen las células de plantas, y la invención, por lo tanto, se
extiende a los organismos transgénicos, tales como plantas y sus
partes, que contienen una o más células de la invención. Las
células pueden expresar de forma heteróloga el polipéptido de la
invención o puede contener uno o varios de los polinucleótidos de
la invención. Las plantas transgénicas (o modificadas genéticamente)
pueden, por lo tanto, tener insertada (típicamente estable) en su
genoma, una secuencia que codifica los polipéptidos de la
invención. La transformación de las células de plantas se puede
realizar usando las técnicas conocidas, por ejemplo usando un
plásmido Ti o uno Ri de Agrobacterium tumefaciens. El
plásmido (o vector) puede contener de esta manera, las secuencias
necesarias para infectar una planta, y derivados de los plásmidos
Ti y/o Ri pueden ser empleados.
La célula hospedera puede producir en exceso el
polipéptido, y las técnicas para modificar la expresión en exceso,
son bien conocidas y pueden ser usadas en la invención. El hospedero
puede tener dos o más copias del polinucleótido.
Alternativamente, la infección directa de una
parte de una planta, como una hoja, tallo o raíz, puede ser
efectuada. En esta técnica la planta a ser infectada puede ser
herida, por ejemplo cortando la planta con una navaja, perforando
la planta con una aguja o frotando la planta con un abrasivo. La
herida es entonces inoculada con el Agrobacterium. La planta o la
parte de la planta pueden ser cultivadas en un medio de cultivo
apropiado y que se les permita desarrollar hasta convertirse en una
planta madura. La regeneración de las células transformadas en
plantas modificadas genéticamente se puede lograr mediante el uso de
técnicas conocidas, por ejemplo mediante la selección de brotes
transformados usando un antibiótico y mediante el
sub-cultivo de los brotes en un medio que contiene
los nutrientes apropiados, las hormonas vegetales y similares.
La invención también incluye células que han
sido modificados para expresar la aminopeptidasa o una variante de
la misma. Tales células incluyen líneas celulares eucarióticas
superiores transitorias o preferiblemente establemente modificadas,
tales como células de mamífero o células de insectos, células
eucarióticas inferiores, tales como células de levaduras y hongos
filamentosos o células procarióticas como células bacterianas.
También es posible que los polipéptidos de la
invención puedan ser transitoriamente expresados en una línea
celular o en una membrana, tal como por ejemplo en un sistema de
expresión de baculovirus. Esos sistemas, los cuales son adaptados
para expresar las proteínas de acuerdo con la invención, también se
incluyen dentro del alcance de la presente invención.
De acuerdo con la presente invención, la
producción del polipéptido de la invención puede ser efectuada
mediante el cultivo de hospederos de expresión microbianos, los
cuales han sido transformados con uno o más polinucleótidos de la
presente invención, en un medio de fermentación de nutrientes
convencional.
Las células hospederas recombinantes de acuerdo
con la invención pueden ser cultivadas mediante procedimientos
conocidos en el arte. Para cada combinación de un promotor y una
célula hospedera, las condiciones de cultivo están disponibles las
cuales conduzcan a la expresión de la secuencia de ADN que codifica
el polipéptido. Después de alcanzar la densidad celular deseada o
el título del polipéptido, el cultivo es cesado y el polipéptido se
recuperado usando los procedimientos conocidos.
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El medio de fermentación comprende un medio de
cultivo conocido que contiene una fuente de carbono (por ejemplo,
glucosa, maltosa, melazas, etc.), una fuente de nitrógeno (por
ejemplo, sulfato de amonio, nitrato de amonio, cloruro de amonio,
etc.), una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo, extracto de
levadura, extracto de malta, peptona, etc.) y fuentes de nutrientes
inorgánicos (por ejemplo, fosfato, magnesio, potasio, zinc, hierro,
etc.) Opcionalmente, un inductor (dependiendo de la construcción de
expresión utilizada) puede ser incluido o subsiguientemente
añadido.
La selección del medio apropiado puede basarse
en la elección del hospedero de expresión y/o en los requerimientos
regulatorios de la construcción de expresión. Los medios apropiados
son bien conocidos por los expertos en el arte. El medio puede, si
así se desea, contener componentes adicionales que favorezcan los
hospederos de expresión transformados sobre los otros
microorganismos contaminantes potencialmente.
La fermentación puede ser llevada a cabo durante
un período de 0.5-30 días. La fermentación puede ser
un proceso en lote, continuo o en lote alimentado, a una
temperatura apropiada en el rango de entre 0ºC y 45ºC y, por
ejemplo, a un pH de 2 a 10. Las condiciones de fermentación
preferidas incluyen una temperatura en el rango de entre 20ºC y
37ºC y/o un pH entre 3 y 9. Las condiciones apropiadas son
generalmente seleccionadas sobre la base de la elección del
hospedero de expresión y de la proteína a ser expresada.
Después de la fermentación, si es necesario, las
células pueden ser extraídas del caldo de fermentación mediante
centrifugación y filtración. Después que la fermentación se ha
detenido o después de la eliminación de las células, el polipéptido
de la invención puede entonces ser recuperado y, si así se desea,
purificado y aislado por medios convencionales. La aminopeptidasa
de la invención puede ser purificada a partir del micelio fúngico o
a partir del caldo de cultivo en el cual la aminopeptidasa es
liberada a partir de las células fúngicas cultivadas.
Intentos preliminares para purificar la
aminopeptidasa producida por la cepa Aspergillus niger 1108,
(depositada bajo número de acceso NRRL 3112 en la Agricultural
Research Service Culture Collection, del National Center for
Agricultural Utilization Research, Peoria, Illinois, denominada en
lo sucesivo cepa "NRRL 3112"), seguido por la determinación de
la secuencia de aminoácidos, repetidamente resultó en datos de
secuencia de aminoácidos de una amiloglucosidasa, aparentemente
formando una importante contaminación de la muestra de fermentación
original. Por lo tanto, procedimientos de concentración y
purificación altamente rigurosos fueron requeridos para aislar la
aminopeptidasa. Solamente datos de secuencia de aminoácidos de
amiloglucosidasa fueron obtenidos durante numerosos intentos
iniciales para aislar la aminopeptidasa lo largo de un período de
1.5 años. La extrema dificultad para aislar la aminopeptidasa
producida por A. niger NRRL 3112 se debe al hecho de que la
aminopeptidasa es una parte muy pequeña del total de proteína
secretada por estas células (alrededor de 0.01% por peso de la
proteína encontrada en el sobrenadante). Además se constató que esta
enzima es, de hecho, una enzima intracelular que está presente en
medio de cultivo en cantidades muy pequeñas. Incluso cuando una
secuencia de aminoácidos de la aminopeptidasa fue exitosamente
obtenida, las secuencias de falsos positivos también fueron
detectadas.
Después de una serie de arduos procedimientos de
aislamiento, la amiloglucosidasa de A. niger se encontró que
estaba presente en el sobrenadante de un cultivo de fermentación de
A. niger NRRL 3112. La contaminación de la enzima fue
detectada en al menos dos formas, proteínas de 55kD y 68 kD, ambas
de las cuales están cerca del peso molecular de aminopeptidasas
hongos conocidas. La separación de la contaminación de la proteína
de 68 kD usando cromatografía de intercambio aniónico fue muy
difícil, y requirió condiciones especiales para aislar la
aminopeptidasa, discutidas a continuación. Por lo tanto, sólo
después de numerosas y difíciles intentos infructuosos, el
polipéptido de la invención fue finalmente aislado a partir del
caldo de cultivo de A. niger NRRL 3112 para secuenciación y
caracterización.
En otra realización de la presente invención el
polipéptido aislado de la invención puede ser caracterizado por al
menos una de las siguientes propiedades fisicoquímicas:
- (1)
- una actividad fenilalanina aminopeptidasa óptima en un rango de pH 2 a 10. tal como de 5 a 8, preferiblemente de 5.5 a 7.5. óptimamente de 6 a 7;
- (2)
- una actividad fenilalanina aminopeptidasa óptima a un rango temperatura de 35ºC a 70ºC,
- (3)
- un peso molecular (cuando está deglicosilada), de aproximadamente 72 kDa, y
- (4)
- un punto isoeléctrico de aproximadamente 5.56.
En una realización preferida el polipéptido se
obtiene a partir de un hongo, más preferiblemente de un
Aspergillus, más preferiblemente aún de Aspergillus
niger.
Los polipéptidos de la invención pueden ser
modificados químicamente, por ejemplo modificados
post-traduccionalmente. Por ejemplo, pueden ser
glicosilados (una o más veces) o comprender residuos de aminoácidos
modificados. También pueden ser modificados mediante la adición de
residuos de histidina para ayudar a su purificación o mediante la
adición de una secuencia señal para promover la secreción de la
célula. El polipéptido puede tener extensiones amino- o carboxilo-
terminales, tal como un residuo de metionina
amino-terminal, un pequeño péptido enlazador de
hasta unos 20-25 residuos, o una pequeña extensión
que facilita la purificación, tal como un tracto
poli-histidina, un epítopo antigénico o un dominio
de unión.
Un polipéptido de la invención puede ser
etiquetado con una etiqueta que puede ser revelada. La etiqueta que
puede ser revelada puede ser cualquier etiqueta apropiada que
permita que el polipéptido pueda ser detectado. Etiquetas
apropiadas incluyen radioisótopos, por ejemplo ^{125}I, ^{35}S,
enzimas, anticuerpos, polinucleótidos y enlazadores, tal como la
biotina.
Los polipéptidos pueden ser modificados para que
incluyan aminoácidos no-naturales o para aumentar la
estabilidad del polipéptido. Cuando las proteínas o péptidos son
producidos por medios sintéticos, tales aminoácidos pueden ser
introducidos durante la producción. Las proteínas o péptidos también
pueden ser modificados siguiendo ya sea la producción sintética o
recombinante.
Los polipéptidos de la invención también pueden
ser producidos usando D-aminoácidos. En tales casos,
los aminoácidos serán ligados en secuencia inversa en la
orientación de C a N. Esto es convencional en el arte para producir
tales proteínas o péptidos.
Un número de modificaciones de las cadenas
laterales son conocidas en el arte y pueden ser hechas en las
cadenas laterales de las proteínas o péptidos de la presente
invención. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo,
modificaciones de los aminoácidos por alquilación reductiva mediante
reacción con un aldehído seguido por reducción con NaBH_{4},
amidinación con metilacetimidato o acilación con anhídrido
acético.
Las secuencias previstas por la presente
invención también pueden ser utilizadas como materiales de partida
para la construcción de enzimas de "segunda generación".
Peptidasas de "segunda generación" son las peptidasas,
alteradas por técnicas de mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis
sitio-dirigida), las cuales tienen propiedades que
difieren de las peptidasas de tipo salvaje o peptidasas
recombinantes, tales como los producidas por la presente invención.
Por ejemplo, su temperatura o pH óptimos, actividad específica,
afinidad por el sustrato o termoestabilidad pueden ser alterados a
fin de estar mejor adaptadas para su uso en un proceso
particular.
Los aminoácidos esenciales para la actividad de
las peptidasas de la invención, y, por tanto, sujetos
preferiblemente a sustitución, pueden ser identificados de acuerdo
con los procedimientos conocidos en el arte, tal como mutagénesis
sitio-dirigida o mutagénesis por barrido de alanina.
En esta última técnica se introducen mutaciones en cada residuo en
la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son probadas para
su actividad biológica (por ejemplo, la actividad aminopeptidasa)
para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para
la actividad de la molécula. Los sitios de interacción
enzima-sustrato también pueden ser determinados por
el análisis de estructura cristalina, determinada por técnicas como
la resonancia magnética nuclear, cristalografía o etiquetado
foto-afinidad.
El uso de células hospederas de levaduras y
hongos filamentosos se espera que facilite tales modificaciones
post-tradicionales (por ejemplo, procesamiento
proteolítico, miristilación, glicosilación, truncación, y
fosforilación de tirosina, serina o treonina) que puedan resultar
necesarias para conferir óptima actividad biológica en los
productos de expresión recombinante de la invención.
Los polipéptidos de la invención pueden estar en
una forma aislada. Debe entenderse que el polipéptido puede ser
mezclado con portadores o diluyentes que no interfieran con la
finalidad prevista del polipéptido, y aún ser considerados como
aislados. Un polipéptido de la invención también puede estar en una
forma sustancialmente purificada, en cuyo caso se comprenderá
generalmente el polipéptido en una preparación en la cual más del
70%, por ejemplo más del 80%, 90%, 95%, 98% ó 99% de las proteínas
en la preparación es un polipéptido de la invención.
Los polipéptidos de la invención pueden ser
proporcionados en una forma tal que se encuentren fuera de su
ambiente celular natural. Por lo tanto, pueden estar sustancialmente
aislados o purificados, como se ha mencionado anteriormente, o
estar en una célula en la que no se producen en la naturaleza, por
ejemplo, una célula de otras especies de hongos, animales, plantas
o bacterias.
La presente invención se refiere también a los
métodos para producir un mutante celular de una célula parental, el
cual comprende alterar o suprimir el ácido nucleico endógeno que
codifica la secuencia del polipéptido o una secuencia de control de
la misma, lo cual resulta en la célula mutante que produce menos
polipéptido que la célula parental.
La construcción de cepas que han reducido la
actividad aminopeptidasa puede ser convenientemente realizada por
la modificación o inactivación de una secuencia de ácido nucleico
necesaria para la expresión de la aminopeptidasa en la célula. La
secuencia de ácido nucleico a ser modificada o inactivada puede ser,
por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica el
polipéptido o una parte del mismo esencial para que muestre
actividad aminopeptidasa, o la secuencia de ácido nucleico puede
tener una función reguladora requerida para la expresión del
polipéptido a partir de la secuencia de codificación de la
secuencia de ácido nucleico. Un ejemplo de este tipo de secuencia
reguladora o de control puede ser una secuencia promotora o una
parte funcional de la misma, por ejemplo, una parte la cual es
suficiente para afectar la expresión del polipéptido. Otras
secuencias de control para su posible modificación incluyen, pero
no se limitan a, una secuencia líder, una secuencia de
poliadenilación, una secuencia de propéptido, una secuencia señal,
y una secuencia de terminación.
La modificación o inactivación de la secuencia
de ácido nucleico pueden ser realizadas sometiendo la célula a
mutagénesis y seleccionando las células en las cuales la capacidad
de producción de la aminopeptidasa ha sido reducida o eliminada. La
mutagénesis, la cual puede ser específica o al azar, puede ser
realizada, por ejemplo, mediante el uso de un agente mutagenizante
apropiado físico o químico, mediante el uso de un oligonucleótido
apropiado, o sometiendo la secuencia de ADN a mutagénesis por PCR.
Además, la mutagénesis puede ser realizada mediante el uso de
cualquier combinación de estos agentes mutagenizantes.
Ejemplos de un agente mutagenizante físico o
químico apropiado para el presente propósito incluyen la irradiación
ultravioleta (UV), hidroxilamina,
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso,
metano sulfonato de etilo (SME), bisulfito de sodio, ácido fórmico y
los análogos de nucleótidos.
Cuando tales agentes son usados, la mutagénesis
es típicamente realizada por la incubación de las células a ser
mutagenizadas en presencia del agente mutagenizante de elección bajo
condiciones apropiadas, y la selección de las células que presentan
reducida o ninguna expresión de la actividad aminopeptidasa.
La modificación o inactivación de la producción
de un polipéptido de la presente invención puede lograrse mediante
la introducción, sustitución o deleción de uno o más nucleótidos en
la secuencia del ácido nucleico que codifica el polipéptido o para
un elemento regulador necesario para la transcripción o traducción
del misma. Por ejemplo, los nucleótidos pueden ser insertados o
eliminados a fin de dar lugar a la introducción de un codón de
parada, la eliminación del codón de inicio, o un cambio del marco de
lectura abierta. Tal modificación o inactivación puede ser
realizada por mutagénesis sitio-dirigida o
mutagénesis por PCR, de conformidad con los métodos conocidos en el
arte.
Aunque, en principio, la modificación puede ser
realizada in vivo, por ejemplo, directamente sobre la célula
que expresa la secuencia de ácido nucleico a ser modificada, es
preferido que la modificación sea realizada in vitro como es
ejemplificado a continuación.
Un ejemplo de una manera conveniente para
inactivar o reducir la producción de la aminopeptidasa de una célula
hospedera de elección se basa en las técnicas de sustitución de
genes o interrupción de genes. Por ejemplo, en el método de
interrupción de genes, una secuencia de ácido nucleico
correspondiente al gen endógeno o al fragmento génico de interés,
es mutagenizado in vitro para producir una secuencia de ácido
nucleico defectuosa la cual es entonces transformada en la célula
hospedera para producir un gen defectuoso. Mediante recombinación
homóloga, el ácido nucleico defectuoso sustituye a la secuencia
génica endógena o al fragmento génico. Preferiblemente el gen o
fragmento génico defectuoso también codifica un marcador el cual
puede ser usado para seleccionar los transformantes en los cuales
el gen que codifica el polipéptido ha sido modificado o
destruido.
Alternativamente, la modificación o inactivación
de la secuencia del ácido nucleico que codifica un polipéptido de
la presente invención puede lograrse mediante técnicas
anti-sentido establecidas, usando una secuencia
nucleotídica complementaria a la secuencia que codifica el
polipéptido. Más específicamente, la producción del polipéptido por
una célula puede ser reducida o eliminada mediante la introducción
de una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia del
ácido nucleico que codifica el polipéptido. El polinucleótido
antisentido típicamente podrá entonces ser transcripto en la célula
y será capaz de hibridar con el ARNm que codifica la
aminopeptidasa. Bajo condiciones que permitan la complementariedad
de la secuencia del nucleótido antisentido hibridar con el ARNm, la
cantidad de aminopeptidasa producida en la célula será reducida o
eliminada.
Es preferido que la célula a ser modificada de
acuerdo con los métodos de la presente invención sea de origen
microbiano, por ejemplo, una cepa de hongos la cual es apropiada
para la producción de los productos proteicos deseados, ya sean
homólogos o heterólogos para la célula.
La presente invención además se refiere a una
célula mutante de una célula parental la cual comprende una
interrupción o deleción de la secuencia del ácido nucleico endógeno
que codifica el polipéptido o para una secuencia de control, lo
cual resulta en la célula mutante que produce menos polipéptido que
la célula parental.
Las células mutantes deficientes en el
polipéptido así creadas son especialmente útiles como células
hospederas para la expresión de polipéptidos homólogos y
heterólogos. Por lo tanto, la presente invención además se refiere
a los métodos para producir un polipéptido homólogo o heterólogo que
comprende (a) cultivar la célula mutante bajo condiciones propicias
para la producción del polipéptido, y (b) recuperar el polipéptido.
En el contexto actual, el término "polipéptido heterólogo" es
definido aquí como los polipéptidos los cuales no son nativos para
la célula hospedera, una proteína nativa en la cual se han
introducido modificaciones para alterar la secuencia nativa, o una
proteína nativa cuya expresión es cuantitativamente alterada como
resultado de una manipulación de la célula hospedera por técnicas
de recombinación del ADN.
En un aspecto aún adicional, la presente
invención proporciona un método para producir un producto proteico
esencialmente libre de actividad aminopeptidasa, mediante la
fermentación de una célula la cual produce un polipéptido
aminopeptidasa de la presente invención, así como el producto
proteico de interés. El método comprende adicionar una cantidad
efectiva de un agente capaz de inhibir la actividad aminopeptidasa
al caldo de fermentación, ya sea durante o después que la
fermentación ha sido completada, recuperar el producto de interés a
partir del caldo de fermentación, y, opcionalmente, someter el
producto recuperado a purificación adicional. Alternativamente,
después del cultivo, el caldo de cultivo resultante puede ser
sometido a un tratamiento de pH o temperatura a fin de reducir la
actividad aminopeptidasa sustancialmente, y permitir la recuperación
del producto a partir del caldo de cultivo. El tratamiento de pH o
temperatura combinados puede ser realizado sobre una preparación de
proteínas recuperadas a partir del caldo de cultivo.
Los métodos de la presente invención para
producir un producto esencialmente libre de aminopeptidasa son de
especial interés en la producción de polipéptidos eucarióticos, en
particular en la producción de proteínas fúngicas tales como las
enzimas. Las células deficientes en aminopeptidasa también pueden
ser usadas para expresar proteínas heterólogas de interés para la
industria alimenticia, o de interés farmacéutico.
Las proteínas alimenticias, en su tamaño
molecular nativo, tienen poca interacción con los receptores del
gusto y confieren poco gusto. Sin embargo, los productos de
degradación de las proteínas alimenticias, tales como péptidos y
aminoácidos liberados por hidrólisis, muestran distintos sabores,
como dulce, agrio y amargo. La eliminación de un único o de pares
de aminoácidos hidrofóbicos a partir de los extremos terminales de
una cadena peptídica, puede reducir los gustos indeseables
asociados a muchos hidrolizados de proteínas. Por ejemplo, las
leucina aminopeptidasas cortan la leucina, así como algunos otros
aminoácidos a partir de las cadenas peptídicas. También conocidas
son la valina y fenilalanina aminopeptidasas. Frecuentemente, las
endoproteasas, las cuales rompen las proteínas intactas, se
utilizan en conjunción con ciertas peptidasas para mejorar el sabor
de los alimentos. La aminopeptidasa de la invención tiene una gran
especificidad hacia la fenilalanina, y es ventajosa en este sentido
para mejorar los aromas relacionados con la fenilalanina en los
productos alimenticios.
Extractos enzimáticos que potencian el sabor de
los péptidos pueden ser añadidos a los alimentos durante su
producción. Por lo tanto, una aminopeptidasa de la invención, ya sea
sola o en combinación con una proteasa, puede ser usada para
producir un hidrolizado de proteínas, entre otras cosas. Después de
la fermentación o las reacciones de Maillard de este hidrolizado de
proteínas, el producto así obtenido puede ser utilizado por ejemplo
en composiciones saborizantes. Tales hidrolizados pueden ser
preparados en un modo de un solo paso, en el cual el sustrato y
todas las enzimas requeridas se mezclan al mismo tiempo.
Alternativamente, los componentes del sabor individuales de un
hidrolizado complejo pueden ser creados por separado y luego
mezclados juntos en una relación particular para formar un
saborizante de hidrolizado. Por ejemplo, la aminopeptidasa fúngica
de la invención puede ser usada en la degradación de la caseína para
formar un hidrolizado con sabor a queso para su uso en productos
con sabor a queso, tales como salsas, galletas, para untar,
aperitivos, etc. La división enzimática de algunas proteínas puede
crear hidrolizados con sabor a carne también. Las proteínas de la
soya son usadas comúnmente para este fin, aunque ellas típicamente
no pueden ser enzimáticamente hidrolizadas en el mismo grado en que
se puede lograr con la hidrólisis ácida. La aminopeptidasa fúngica
de la invención puede usarse en combinación con enzimas capaces de
degradar la porción de carbohidrato de un sustrato para formar los
productos de Maillard que contribuyen al sabor a carne del
hidrolizado. Tales hidrolizados con sabor a carne pueden ser usados
para potenciar el sabor de las sopas, salsas, comidas preparadas,
bocadillos y similares.
Una aminopeptidasa de la invención puede
utilizarse in situ para mejorar el sabor de diferentes
alimentos, incluidos los productos horneados y los quesos. Por
ejemplo, a partir de 1 a 100 unidades de
fenilalanina-aminopeptidasa pueden añadirse por
kilogramo de masa de pan para mejorar el sabor y el aroma del
producto final horneado. Preferiblemente, de 5 a 50 unidades de
aminopeptidasa son usadas. La aminopeptidasa añadida modifica las
proteínas solubles de la harina, tales como el gluten de trigo,
atacando pares de enlaces preferidos de tal forma que pequeños
péptidos y aminoácidos son liberados.
Similarmente, de 5 a 500 unidades de
fenilalanina-aminopeptidasa, preferiblemente de 15 a
250 unidades, pueden ser añadidas por cada 1000 litros de leche
para mejorar el gusto, sabor, aroma, textura y consistencia del
queso, lo que acelera la maduración. Tales mejoras in situ
son debidas a la liberación de aminoácidos libres mediante la
aminopeptidasa a partir de proteínas, tales como las caseínas,
dentro de la leche de quesería. Un importante beneficio del
tratamiento con aminopeptidasa de la leche de quesería es la
maduración acelerada del queso sin riesgo de la maduración
excesiva. Las aminopeptidasas pueden ser combinadas con quimosina,
proteasa neutra, cultivos lácteos iniciadores, para reducir los
efectos de la fluctuación de la calidad de la leche, tales como la
producción de sabores amargos, con lo que se mejora el sabor del
queso curado. Por ejemplo, la aminopeptidasa de la invención puede
ser utilizada en este sentido para mejorar el sabor a frutas de
quesos camembert durante la maduración. El uso de aminopeptidasas
en la producción de queso es además analizado en WO 96/38549.
La aminopeptidasa aislada de la invención tiene
una muy marcada preferencia por cortar la fenilalanina de las
cadenas peptídicas, como es evidenciado en la Figura 13. Esta
excepcional fortaleza, que no es característica de, por ejemplo,
filtrados fúngicos crudos conocidos anteriormente, puede ser
utilizada en aplicaciones dirigidas a la fenilalanina. Por lo
tanto, la enzima aislada de la invención es útil en la preparación
de hidrolizados de proteínas que tienen bajas concentraciones de
fenilalanina. Los hidrolizados de proteínas tratados con una
endoproteasa y la fenilalanina aminopeptidasa aislada de la
invención, pueden ser procesados por ejemplo en un modo, tal como
con carbón, con el objetivo de eliminar específicamente pequeños
compuestos hidrofóbicos que contienen fenilalanina. Tales
hidrolizados bajos en fenilalanina producidos de acuerdo con la
invención, pueden ser utilizados en composiciones seguras para el
consumo
por fenilcetonúricos, quienes carecen de suficiente fenilalanina hidroxilasa para convertir la fenilalanina a tirosina.
por fenilcetonúricos, quienes carecen de suficiente fenilalanina hidroxilasa para convertir la fenilalanina a tirosina.
La invención es adicionalmente ilustrada
mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Materiales y métodos, para el ejemplo 1:
La actividad aminopeptidasa fue determinada por
espectrofotometría luego de la división de
L-fenilalanina con p-nitroanilida a
400 nm. La actividad fue medida a una concentración de sustrato 0.3
mM en 0.1 M de tampón NaPi a pH 7.2 y 25ºC.
La actividad amiloglucosidasa fue determinada
por la medición espectrofotométrica del
p-nitrofenol, formado por la hidrólisis del
p-nitrofenil
\alpha-D-glucopiranósido por la
acción de la amiloglucosidasa. La solución de ensayo contuvo el
sustrato a una concentración de 0.5 mm en 0.1 M de tampón acetato de
sodio, pH 4.4. Después de la incubación durante 15 minutos a 25ºC,
la reacción fue detenida con 5 volúmenes de una solución 0.25 M de
carbonato de sodio. La adsorbancia de la muestra fue medida a 402
nm.
Para localizar la actividad aminopeptidasa en un
gel PAGE nativo, inmediatamente después de la corrida del gel, éste
fue recubierto con una capa fina de solución de HCl 7.5 mM, que
contiene 0.9 mM L-fenilalanina
p-nitroanilida. Una mancha amarilla se formó en el
lugar de la aminopeptidasa en el gel. La mancha amarilla fue leída
inmediatamente después que la solución de
L-fenilalanina p-nitroanilida es
vertida sobre el gel, ya que la mancha amarilla rápidamente se
difundió desde su ubicación inicial.
El PAGE nativo fue realizado usando el
"Phastsystem^{TM}" (Pharmacia) y Phastgels 20% Homogeneous.
Los geles fueron corridos y las proteínas así separadas fueron
coloreadas con Azul de Coomassie Brillante siguiendo las
instrucciones del fabricante.
Las muestras de proteínas fueron desalinizadas
o trasferidas a otro tampón usando columnas PD10 de Pharmacia^{TM}
de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
La ultrafiltración fue realizada usando un
dispositivo de centrífuga Filtron^{TM} Microsep con una membrana
de polietersulfona Omega-10 kD modificada
(Filtro^{TM} Techn. Corp Northborough MA, E.U.A.). Las muestras
fueron centrifugadas a 7500 x g máximo con un rotor de ángulo
fijo.
La cromatografía se llevó a cabo en un sistema
FPLC Pharmacia^{TM} (2 * bombas P-500, un monitor
LKB-2141 UV a 280/260 nm y un colector de fracción
Frac-200). Una columna Pharmacia^{TM} Mono Q HR
5/5 fue utilizada a un flujo de 1 ml/min. La columna fue
equilibrada con 20 mM Tris/HCl pH 7.5 (tampón A). Después de la
aplicación de la muestra, la columna fue lavada con cinco volúmenes
de lecho de tampón A. La actividad aminopeptidasa fue eluída usando
un gradiente lineal de NaCl 0-250 mM en 25 volúmenes
de lecho de tampón A.
La electroforesis fue realizada usando el
Biorad^{TM} Protean II celular con un gel de separación de
poliacrilamida al 15% y gel de poliacrilamida de apilamiento al
5%.
El gel de separación fue hecho mezclando de 20
ml 30% (p/v) de acrilamida/0.8% (p/v) de
N,N-metilenbisacrilamida, 20 ml de 9% (p/v)
Tris.HCl (pH 8.8), 200 \mul de 10% (p/v) persulfato de amonio y 20
\mul de
N,N,N',N'-tetrametilen-etilendiamina
(TEMED). El gel de apilamiento fue hecho mezclando 2.22 ml 30%
(p/v) de acrilamida/0.8% (p/v) de
N,N'-metilenbisacrilamida, 6.67 ml 3% (p/v) de
Tris.HCl pH 6.8, 4.4 ml Milli Q, 100 \mul 10% (p/v) de persulfato
de amonio y 10 \mul de TEMED. La composición del tampón de
electroforesis fue de 1.0 g de Tris y 4.8 g de glicina por litro.
Las muestras fueron mezcladas con ¼ de volumen de tampón de muestra
(6% (p/v) Tris.HCl (pH 6.8), 50% (v/v) de glicerol, 0.01 (p/v) de
azul de bromofenol). La muestra fue aplicada sobre gel preparativo
con 20 pocillos (20 \mul por pocillo). La electroforesis fue
realizada a 200 V y 60 mA. Los procedimientos de decoloración se
realizaron de acuerdo a las instrucciones publicadas por
Pharmacia^{TM}.
La purificación exitosa de una aminopeptidasa a
partir del sobrenadante de A. niger NRRL 3112 se llevó a
cabo como sigue:
A. niger NRRL 3112 fue cultivado en un
medio que contiene 15 g/l de harina de papa, 20 g/l de bactopeptona,
7 g/l de extracto de levadura, 4 g/l de dihidrogenfosfato de
potasio, 0.5 g/l de sulfato de magnesio, 0.5 g/l de cloruro de
calcio, 0.5 g/l de cloruro de zinc, el pH fue de 4.8. Después de 24
horas de precultivo en una incubadora a 240 rpm y 30ºC, y 96 horas
de cultivo a 275 rpm a 30ºC, el sobrenadante fue recolectado.
El sobrenadante que contiene el polipéptido con
actividad aminopeptidasa fue transferido a tampón Tris 10 mM a pH
7.5 sobre una columna PD10. El eluato de PD10 aún crudo (500
\mul), fue fraccionado por cromatografía de intercambio aniónico
en Mono Q para separar la actividad aminopeptidasa de la actividad
amiloglucosidasa. Las fracciones que contienen aminopeptidasa y
amiloglucosidasa (1 ml cada una) fueron identificadas usando los
ensayos de actividad descritos anteriormente. La actividad
amiloglucosidasa y aminopeptidasa eluyeron a NaCl 100 y 160 mM,
respectivamente, tal y como se muestra en el cromatograma de la
Figura 1.
Las fracciones de los picos que contienen
actividad aminopeptidasa (tres fracciones de 1 ml cada una) fueron
combinadas y concentradas por ultrafiltración. El factor de
concentración fue de aproximadamente 6, resultando en el
concentrado A.
Una muestra de 500 \mul del concentrado A,
diluida 1:12 fue analizada en una columna Mono QTM
(Pharmacia^{TM}). A partir del cromatograma mostrado en la Fig.
2, un pico muy pequeño es detectable en torno a los 160 mM de NaCl.
Sin embargo, la mayor parte de la proteína eluye a una concentración
de NaCl mucho más alta. No se observó proteína a 100 mM de NaCl, la
localización del pico de la amiloglucosidasa (AG).
El procedimiento de purificación anteriormente
mencionado (Mono Q) (que resulta en picos de fracciones de tres
fracciones de 1 ml cada una), combinadas y concentradas por
ultrafiltración), fueran aplicadas al resto del eluato de PD10, y
todos los concentrados A así obtenidos, fueron combinados con el
objetivo de obtener suficiente material para una mayor
purificación. Esta combinación de concentrados A fue adicionalmente
concentrada por ultrafiltración, entonces desalinizada sobre una
columna PD10 y, simultáneamente transferida a tampón Tris 10 mM a
pH 7.5, resultando en el concentrado B (aprox. 3.5 ml).
El concentrado B y el sobrenadante original de
la fermentación fueron sometidos a análisis nativo PAGE zimograma y
procedimientos para la evaluación de la actividad aminopeptidasa y
amiloglucosidasa.
El análisis del PAGE nativo representado en la
Fig. 3. muestra que la cromatografía de intercambio iónico
parcialmente purificó el sobrenadante de fermentación crudo,
indicado por la presencia de diferentes composiciones de muestras
de proteínas antes y después de la cromatografía Mono Q. La flecha
indica la localización donde la aminopeptidasa fue detectada en el
gel haciendo uso de zimografía. No fue visualmente detectable una
clara banda de una sola proteína en el sitio de la actividad
aminopeptidasa.
Es evidente que, incluso después de la
purificación, la aminopeptidasa es todavía una parte muy pequeña del
total de proteínas presentes en el caldo de fermentación. El
concentrado B comprendió solamente aproximadamente el 1% (sobre la
base del contenido total de proteína) de lo que posteriormente se
encontró ser la aminopeptidasa, mientras que el sobrenadante de la
fermentación contuvo aproximadamente 0.01% de aminopeptidasa.
La muestra de fermentación a partir de la cual
la purificación fue iniciada, contuvo 369 unidades de aminopeptidasa
y 62 unidades de amiloglucosidasa por ml, mientras que el
concentrado B mostró una actividad de 158 U/ml de aminopeptidasa y
1.2 U/ml de amiloglucosidasa, lo cual resultó a una actividad
relativa de enriquecimiento de un factor de 22 (158/369:1.2/62) de
amiloglucosidasa sobre aminopeptidasa.
La parte restante del concentrado B fue
concentrada adicionalmente 5 veces por ultrafiltración. El
ultrafiltrado fue mezclado con el tampón de la muestra. 400 \mul
de la mezcla fueron aplicados a un gel preparativo con 20 carriles
(20 \mul/carril) y sometidas a electroforesis durante 5½ horas.
Dos carriles fueron usados para un zimograma a partir del cual
parecía que la actividad aminopeptidasa había migrado
aproximadamente de 16-18 mm en el gel de
separación. Después de la tinción de los demás carriles sin tratar,
una banda localizada a aproximadamente 16-18 mm
desde el frente fue cortada del gel y sometida a procedimientos de
secuenciación de los aminoácidos internos estándares, realizados en
Eurosequence (Groningen, Países Bajos), según es descrito en
Rosenfeld y otros., 1992, Anal Biochem
203173-179. El resultado fue una aminopeptidasa de
A. niger NRRL 3112, parcialmente codificada por la secuencia
nucleotídica de la ID SEC NO: 3 (Fig. 4). Varios fragmentos de
péptidos de la aminopeptidasa de A. niger NRRL 3112 se
muestran en la Tabla 1, donde el fragmento peptídico 1 corresponde
a los aminoácidos 188-194 de la ID SEC NO: 2; y el
fragmento peptídico 2 corresponde a los aminoácidos
235-247 de la ID SEC NO: 2, que representa la
identidad de secuencia que finalmente se encontró entre las
aminopeptidasas de las cepas de A. niger NRRL 3112 y
N400.
El fragmento peptídico 3 de NRRL 3112 difiere
por un solo aminoácido a partir de los aminoácidos
5-20 de ID SEC NO: 2, sustituyendo una prolina por
alanina en el aminoácido en posición 7. El fragmento peptídico 4
corresponde a la ID SEC NO: 12, y se encontró que era un
contaminante, mostrando una vez más la dificultad en obtener una
aminopeptidasa aislada y purificada, a partir del caldo de cultivo
crudo.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,3cm* indica que el aminoácido no era el definitivo
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La construcción de la biblioteca genómica en el
fago lambda reemplazo del vector EMBL4 de Promega Biotech Inc
(Madison Wis) de Aspergillus niger cepa N400 (número de
acceso CBS 120.49, disponible en el Centraal Bureau voor
Schimmelcultivos (CBS), Países Bajos) fue realizado según lo
descrito por Harmsen y otros. (1990).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Ejemplo
3.1
Los detalles de las técnicas de clonación
molecular son descritos por Sambrook y otros, 1989 Molecular
Cloning, A Laboratory Manual 2^{da} edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Nueva York.
Las secuencias de aminoácidos que se muestra en
la Tabla 1 fueron usadas para sintetizar mezclas de cebadores de
oligonucleótidos degenerados. Los oligonucleótidos fueron
sintetizados por Isogen Bioscience, Baarn, Países Bajos.
Puesto que el orden de los fragmentos peptídicos
obtenidos en el marco abierto de lectura no se conocía, los
cebadores fueron diseñados en ambas direcciones, delantera e
inversa.
Las reacciones de PCR fueron realizadas usando
una cantidad igual de dos mezclas de oligonucleótidos, Taq
polimerasa (Life Technologies, Rockville, Md) y 10 ó 100 ng de ADN
genómico de Aspergillus niger NRRL 3112 (aislado de acuerdo
con el método de De Graaff y otros, 1988, Curr. Genet. 13:
315-321). La temperatura de desnaturalización fue
de 95ºC durante un minuto, la temperatura de apareamiento difirió
por reacción de PCR (véase la Tabla 1A) y fue un minuto y la
extensión de temperatura fue de 72ºC durante un minuto. 30 ciclos
fueron aplicados seguidos por 10 minutos de extensión a 72ºC.
La mezcla de reacción fue sometida a
electroforesis en gel de agarosa usando un gel de azarosa al 0.8% y
voltaje de 4,3 V/cm durante 2 horas.
\newpage
Todos los cebadores fueron probados en
combinación con el cebador 5 ó 6, ya que el fragmento a partir del
cual los cebadores se obtuvieron se pensaba que era una secuencia
N-terminal (véase la Tabla 1). La combinación de
cebadores sap-5 y sap-4 dio un
producto de unos 750 bp. Este producto fue recogido a partir del gel
usando una pipeta Pasteurs y eluído en H_{2}O estéril mediante
agitación durante 3 horas. Esta H_{2}O que contiene el fragmento
de PCR de aproximadamente 750 pb, fue usada en una nueva PCR usando
la combinación de cebadores sap-6 y
sap-4, con una temperatura de apareamiento de 54ºC.
Este PCR de nuevo resultó en un fragmento de aproximadamente 750
bp.
Este fragmento fue aislado a partir del gel,
usando un kit de purificación de ADN comercialmente disponible
(Gene clean^{TM}, Inc Bio101, La Jolla, E.U.A.).
Ejemplo
3.2
El fragmento de ADN aislado en el Ejemplo 3.1
fue clonado en el sistema pGEM-T Vector
comercialmente disponible (Promega Biotech Inc Madison Wis,
E.U.A.). Las mezclas de ligazón fueron transferidas a E. coli
DH5\alpha (Life TechnologiesTM, Rockville, MD, E.U.A.) y
plaquedas en placas de LB^{amp} (LB^{amp} que contiene 10 g/l
de NaCl, 10 g/l de Triptona, 5 g/l Extracto de Levadura y 50
\mug/ml de Ampicilina, las placas fueron solidificadas por
adición de 1.5% (p/v) de agar), con 0.1% (p/v) X-gal
(5-bromo-4-cloro-3-indoloil-PD-galactopiranósido)
y 5 mM IPTG
(isopropílico-PD-tiogalactopiranósido)
para la selección de transformantes que contiene un inserto
(Sambrook y otros., 1989).
Por ligazón, 5 transformantes fueron
seleccionados y cultivados durante la noche en 3 ml LB^{amp} a
37ºC, mientras estaban bajo agitación a 250 rpm.
El plásmido de ADN fue aislado a partir de los
cultivos mediante el método de lisis alcalina (<biblio>). El
plásmido 5, que contiene el fragmento de 750 pb se denominó pIM 4120
como se muestra en la Figura 5. El análisis de secuencias de pIM
4120 fue realizado usando el kit de secuenciación Thermosequenase
fluorescent labelled primer cycle (Amersham^{TM} Life Science) y
el ALF express (Pharmacia^{TM} Biotech). Esto resultó en una
secuencia de ácidos nucleicos de 751 pb de NRRL 3112,
correspondiente a las bases 241-991 de la ID SEC
NO: 3, en la cual ambas secuencias cebadoras SAP-4 y
SAP-6 pueden ser detectadas, según lo mostrado en
la Figura 4.
Las secuencias fueron analizadas con el software
de genes para PC (IntelliGenetics, Ginebra Suiza).
La secuencia de ácido nucleico completa de este
fragmento fue traducida en una supuesta secuencia de aminoácidos.
La Tabla 1 muestra las secuencias peptídicas de varios fragmentos de
la aminopeptidasa C (ApsC) del gen de Aspergillus niger
NRRL 3112, así como las secuencias de los cebadores degenerados
procedentes de esas secuencias peptídicas. El péptido 3 y el
péptido 2 a partir de los cuales los cebadores fueron diseñados,
pudieron ser identificados en los extremos amino terminal y
carboxilo terminal de la secuencia de aminoácidos inferida,
respectivamente (ver Fig. 5). Una tercera secuencia peptídica
(péptido 1, Tabla 1) mostró identidad completa para una región
interior de la secuencia de aminoácidos inferida.
Ejemplo
3.3
Usando los cebadores en el ADN genómico de A.
niger NRRL 3112, es evidente que el gen correspondiente a la
aminopeptidasa puede ser clonado a partir de la cepa NRRL 3112. El
gen equivalente también pueden ser clonado a partir de la cepa de
A. niger N400 (CBS 120.49).
El ADN genómico de A. niger N400 fue
aislado según el método de De Graaff y otros, (1988). El
análisis de membrana de Southern fue realizado usando alícuotas
individuales de 5 \mug de ADN genómico digerido con BamHI, EcoRI,
HindIII, SstI, SstII, y SalI, respectivamente. El ADN fue digerido
durante 17 h a 37ºC con 30 unidades de enzima. Después de la
digestión el ADN fue precipitado con etanol y después de disolver el
precipitado de ADN en 20 \mul de H_{2}O el ADN digerido fue
separado por electroforesis en gel, según es descrito en el ejemplo
3.1. Después de la separación, el ADN fue desnaturalizado por
métodos estándares (Sambrook y otros. 1989) y transferido a
una membrana de nitrocelulosa (Hybond-N,
Amersham^{TM}) siguiendo las recomendaciones del proveedor.
Después de la reticulación del ADN en los filtros mediante
tratamiento con UV por 2 min., los filtros fueron prehibridados en
tampón de hibridación (HB), que contiene 6xSSC (20xSSC que contiene
3 M de NaCl y 0.3 M de citrato de sodio), solución de 5xDenhardts
(solución de 100xDenhardts que contiene 20 g de ficol 400, 20 g
polivinilpirrolidona y 20 g de albúmina sérica bovina (fracción V)
por L) 0.5% Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) y 100 \mug/ml del ADN
de esperma de arenque desnaturalizado con calor, durante tres
horas.
pIM 4120 fue digerido con 10 unidades SstI y 10
unidades SstII por 2 horas a 37ºC. Después de la digestión, el ADN
fue sometido a electroforesis en gel según lo descrito en el ejemplo
3.1. El fragmento de aproximadamente 750 pb fue aislado a partir
del gel, según es descrito en el ejemplo 3.1 y fue purificado.
50 ng de ADN del fragmento de aproximadamente
750 pb de la cepa NRRL 3112, fueron etiquetados con
[\alpha-^{32}P]-dATP por
cebamiento de azar, según es descrito por Feinberg y Vogelstein,
(1983). Para eliminar el
[\alpha-^{32}P]-dATP no
incorporado, la mezcla de reacción fue fraccionada en una columna
Sephadex G25 equilibrada en TE pH 8 (10 mM Tris-HCl
pH 8 y 1 mM NaOH-EDTA pH 8). Las fracciones que
contiene el ADN radiactivamente etiquetado fueron desnaturalizadas
por incubación durante cinco minutos a 95ºC y mantenido como una
sola hebra mediante refrigeración rápidamente en hielo, antes de la
adición a HB. Después de 2 horas de prehibridación, la sonda
etiquetada fue agregada al tampón de hibridación. La hibridación
fue realizada a 65ºC durante 17 horas. Después de la hibridación,
las membranas se lavaron durante 30 minutos con 4 X SSC + 0.1% SDS,
seguido por un paso de lavado de 30 minutos en 2 X SSC + 0.1% SDS y
un último lavado de 30 minutos en 1 X SSC +0.1% SDS. Las membranas
lavadas fueron secadas y expuestas a -70ºC a una película
radiográfica en un casete de rayos X, usando tamices de incremento
regular (Amersham Life Sciences^{TM}). Las películas expuestas
fueron reveladas en un revelador automático. Una estimación de la
longitud de los fragmentos que hibridaron se muestra en la Tabla 2A,
incluyendo un fragmento EcoRI de 5.5 kb.
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- Los productos indicados con * son el resultado de una digestión parcial
\vskip1.000000\baselineskip
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Ejemplo
3.4
Para la selección de la biblioteca genómica de
A. niger N400, 2.4 x 10^{3} unidades formadoras de placa
(ufp) por placa fueron plaquedas en cinco placas Petri de 15 cm de
diámetro usando E-coli LE 392 (Promega
BiotechTM Inc, Madison, Wis E.U.A.) como placas de bacteria. El
medio LM (10 g/l triptona, 5 g/l extracto de levadura, 10 mM NaCl,
10 mM MgCl_{2}) más 1.5% (p/v) de agar o 0.6% (p/v) de agarosa,
fueron usados para el fondo y capa superior, respectivamente.
Después de la incubación de las placas Petri a
37ºC durante la noche, fueron preparados filtros duplicados
(Hybond-N, Amersham^{TM}) a partir de cada placa.
La reticulación, prehibridación, hibridación y lavado fueron
realizados según lo descrito en el ejemplo 3.3.
Nueve placas hibridantes fueron perforadas y
extraídas de la placa usando una pipeta Pasteur y los fagos fueron
eluídos a partir del tapón de agar en 500 \mul de tampón SM (0.1 M
NaCl, 0.008 M MgSO_{4}, 0.05 M Tris-HCl pH 8 y
0.01% (p/v) gelatina). Los stocks de los fagos obtenidos fueron
seleccionados usando el procedimiento descrito anteriormente con
filtros duplicados a partir de las placas que contienen cada una
50-100 ufp de los stocks de fagos.
Después de la purificación, los fagos fueron
propagados por plaqueado hasta la confluencia en las placas donde
fueron obtenidos. Los fagos fueron eluídos añadiendo 5 ml de tampón
SM en la parte superior del agar y agitando suavemente durante
cuatro horas. El tampón que contiene los fagos fue transferido a
tubos de microcentrífuga y centrifugados durante 5 minutos a
velocidad máxima en una microcentrífuga para eliminar las bacterias.
El sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo de microcentrífuga,
20 \mul de cloroformo fueron añadidos, y el número de ufp fue
determinado. Los stocks de los fagos contuvieron aproximadamente
5x10^{10} ufp/ml.
\newpage
Ejemplo
3.5
De la Tabla 2A es evidente que el fragmento
EcoRI de aproximadamente 5.5 kb es un fragmento adecuado para
clonar el gen de la aminopeptidasa de Aspergillus niger
N400.
A partir cada uno de los fagos aislados (fago
1.11, 2.11, 3.11, 4.11, 5.11, 6.11, 9.11, 10.11, 11.11), se aisló
el ADN de acuerdo con los métodos de Sambrook y otros, (1989). Cinco
microgramos de los ADN aislados fueron digeridos con EcoRI (30
unidades) durante 4 horas a 37ºC y luego sometidos a electroforesis
en gel según lo descrito anteriormente en el ejemplo 3.1. Después
de la separación, el ADN es desnaturalizado, transferido a una
membrana de nitrocelulosa, reticulado, prehibridado, hibridado y
lavado según lo descrito en el ejemplo 3.3. El fragmento SstI
-SstII de pIM4120 fue utilizado como una sonda, como en el ejemplo
3.3. Se encontraron seis fagos que contenían el fragmento EcoRI de
aproximadamente 5.5 kb, mientras que tres fagos desplegaron bandas
hibridación más pequeñas.
El fragmento EcoRI de 5.5 kb proveniente del
fago 3.11 que hibrida con al fragmento de 751 pb, fue seleccionado
para la clonación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
20 \mug del ADN del fago 3.11 fueron digeridos
por un período de cuatro horas con 50 unidades de EcoRI a 37ºC. Los
fragmentos se separaron por electroforesis en gel y se recuperaron a
partir del gel, según lo descrito en el ejemplo 3.1.
El fragmento EcoRI de 5.5 kb fue ligado en el
vector pUC19 (Life TechnologiesT "Rockville", MD, E.U.A.
(publicado en Gene 33103-119,1985)) cortado con
EcoRI. La ligazón fue realizada durante la noche a 16ºC con T4
DNA-ligasa (Life Technologies, Rockville, Md),
resultando en el pIM 4121, mostrado en la Figura 7. La
transformación de E. coli DH5\alpha y el aislamiento de
ADN del plásmido de los transformantes fue realizada según lo
descrito en el ejemplo 3.2.
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Ejemplo
5
Ejemplo
5.1
La estructura primaria del gen, y la región no
traducida 5' y 3', la región de codificación del gen y la región
de terminación fueron determinadas mediante secuenciación de los
fragmentos relevantes de pIM 4121. Puesto que pIM 4121 no contiene
suficiente secuencia promotora, un fragmento superpuesto fue clonado
que contenía más secuencia corriente arriba. Por lo tanto, un nuevo
análisis genómico por Southern fue realizada según lo descrito en
el ejemplo 3.3 usando las enzimas de restricción XhoI, SstII, PstI,
KpnI, HincII, BglII y BamHI. Un fragmento
EcoRI-KpnI de 339 pb de pIM 4121 (Figura 7, sonda 1)
fue usado como una sonda (etiquetada según lo descrito en el
ejemplo 3.3). Los resultados se muestran en la Tabla 2B. El
fragmento XhoI de aproximadamente 1.8 kb (en los adelante
denominado el fragmento XhoI de 1.8 kb) parcialmente superpuesto al
fragmento EcoRI de 5.5 pb de pIM 4121 en el extremo 5', se aisló a
partir del fago 3.11. Este fragmento XhoI de 1.8 kb que tiene una
región promotora adicional de 260 pb, fue clonado en pUC19 digerido
con SalI (SalI y XhoI tiene extremos compatibles), según lo
descrito en el ejemplo 4 resultando en pIM 4122. Para completar la
estructura primaria, los fragmentos de pIM 4121 y de pIM 4122
fueron secuenciados. Para ello, el pIM 4121 y el pIM 4122 (Figura
7) fueron subclonados adicionalmente mediante técnicas estándares de
manipulación del ADN (Sambrook y otros, 1989). Fragmentos de
restricción fueron aislados según lo descrito en el ejemplo 3.1 y
clonados en pUC19 (Yannisch y Perron y otros, 1985) según lo
descrito en el ejemplo 4. El plásmido pUC19 está comercialmente
disponible a través de Life Technologies^{TM} (Rockville,
MD.).
La secuencia completa del gen fue determinada
para ambas cadenas, desde el sitio XhoI corriente arriba del sitio
HindIII corriente abajo del gen (Figura 7). La secuenciación fue
realizada según lo descrito en el ejemplo 3.2.
Ejemplo
5.2
La secuencia obtenida fue un fragmento
XhoI-HindIII de 3922 pb, que incluye un fragmento de
731 pb de la región 5' no traducida, un fragmento 1091 pb de la
región no traducida (incluido el codón de parada) y un fragmento de
2100 pb que codifica la aminopeptidasa de Aspergillus niger
N400.
El marco abierto de lectura es interrumpido con
2 secuencias intermedias. La localización exacta de estas
secuencias intermedias fue determinada por PCR con Transcriptasa
Reversa (RT-PCR). A. niger N402 (descrito en
Bos y otros, 1988, Curr. Genet. 14: 437-443) fue
seleccionado para una mayor caracterización de la aminopeptidasa
A. niger. La región de la aminopeptidasa de A. niger
N402 es idéntica a la de A. niger N400. De este modo, A.
niger N402 fue cultivado en medio de cultivo (GM que contiene
por litro 4.0 g de NH_{4}Cl, 1.5 g de KH_{2}PO_{4}, 0.5 g de
KCl, 0.5 g de MgS0_{4}*7H_{2}O, oligoelementos de acuerdo con
Vishniac y Santer (1957) 2% de glucosa, 0.1% de extracto de
levadura, 50 mM de ácido ftálico pH 5.5) durante 17 horas. El
micelio fue recolectado por filtración y molido. El reactivo de
Trizol (Life Technologies^{TM}, Rockville, Md) fue usado según lo
recomendado por el fabricante para aislar el ARN total proveniente
del micelio molido.
La RT-PCR fue realizada usando
el kit Enhanced Avian RT-PCRT (Sigma^{TM}, St
Louis E.U.A.) siguiendo las recomendaciones del proveedor.
La primera cadena del DNAc fue generada con
cebadores RT (Tabla 3) y fue empleada en varias amplificaciones
utilizando varias combinaciones de cebadores delanteros e inversos
(Tabla 3). Los productos resultantes de la PCR fueron sometidos a
electroforesis en gel y extraídos a partir del gel, según lo
descrito en el ejemplo 3.1. Los productos fueron clonados en
pGEM-T y secuenciados, según lo descrito en el
ejemplo 3.2. La secuencia de DNAc obtenida fue idéntica a la
secuencia genómica de A. niger N400 desde 520 pb a 2908 pb,
con la excepción de dos secuencias intermedias de 60 y 51 pb.
La estructura primaria del ORF de la
aminopeptidasa de A. niger N400 y de las secuencias corriente
arriba y corriente abajo son mostradas en la Figura 6 (ID SEC NO:
1). El polipéptido derivado de la secuencia de codificación es de
663 residuos de aminoácidos de longitud (ID SEC NO: 2). Este
polipéptido tiene un peso molecular previsto de aproximadamente
72.5 kDa y un punto isoeléctrico calculado (IEP) de 5.56.
Ejemplo
5.3
Sobre la base de la secuencia genómica del gen
que codifica la aminopeptidasa de A. niger N400, dos
cebadores específicos: ApsC-11,
ApsC-12 (Tabla 3) fueron diseñados los cuales
fueron usados en una reacción de PCR usando ADN genómico de A.
niger NRRL 3112 según lo descrito en el ejemplo 3.1. Esto
resultó en un fragmento amplificado de aproximadamente 1260 pares
de bases el cual fue 98% idéntica a la secuencia de A. niger
N400. En una comparación entre la secuencia obtenida de A.
niger NRRL 3112 por PCR y la secuencia genómica de A.
niger N400 (Tabla 4), se encontraron 28 diferencias, incluyendo
varias mutaciones puntuales, 26 de las cuales no tuvo ningún efecto
sobre los aminoácidos codificados por las dos secuencias. Dos de
estas mutaciones puntuales resultaron en sustituciones de
aminoácidos. El cambio de una A a una T en la posición 951 en la
secuencia, resultó en la sustitución de un ácido glutámico en N400
con un ácido aspártico en NRRL 3112. La sustitución de una G por
una A en la posición 1052, resultó en el cambio de ácido glutámico
en N400 con una glicina en NRRL 3112 (Tabla 4).
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Ejemplo
5.4
La secuencia proteica de la aminopeptidasa según
es descrita en la ID SEC NO: 2 se comparó con las bases de datos
PIR, PIRNEW, PIRALERT, SWISSPROT, GENESEQPROT y YEASTPROT, usando el
programa BLASTP (Altschul y otros., 1997, Nucleic Acids
Research 25: 3389-3402). La matriz BLOSUM62 fue
usada para la búsqueda y el umbral esperado usado fue de 10. La
homología más significativa se encontró con una proteína hipotética
sir0825 de Synechocystis sp. (cepa PCC 6803, número S75772
PIR; ID SEC NO: 22). La identidad con esta proteína hipotética fue
de 35% a lo largo de 653 aminoácidos, tal y como se muestra en la
Tabla 5. Homología también se encontró con las proteínas
hipotéticas F01 F1.5 y F44B9.1 provenientes de Caenorhabditis
elegans (números de acceso PIR T15945, ID SEC NO: 23 y PIR
S44807, respectivamente). La identidad es de 30% a lo largo de 655
aminoácidos para F01F1. 5 y 28% a lo largo de 256 aminoácidos para
F44B9.1. Se encontró baja homología con las
acilaminoacil-peptidasas de diverso origen, lo que
sugiere que el péptido de la ID SEC NO: 2 tiene actividad
peptidasa.
Sorprendentemente, la secuencia de aminoácidos
en ID SEC NO: 2 no mostró una secuencia señal
amino-terminal claramente distinguible para la
secreción del polipéptido al medio extracelular, a pesar de que la
proteína secuenciada fue inicialmente aislada a partir del medio de
cultivo de A. niger NRRL 3112. Además, el péptido número 3
es casi idéntico a los aminoácidos 5 al 20 de la secuencia de ID SEC
NO: 2, lo que sugiere que no existe secuencia señal amino terminal
que pueda ser dividida que esté presente en esta proteína. Esto
sugiere que la proteína sale de la célula por un mecanismo
desconocido, que no incluye el procesamiento amino terminal de un
péptido señal.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Ejemplo
6
Ejemplo
6.1
Puesto que solamente existen pequeñas
diferencias entre las secuencias de aminoácidos de la aminopeptidasa
A. niger NRRL 3112 y la aminopeptidasa de A. niger
N400, la caracterización adicional de la actividad aminopeptidasa
de Aspergillus fue realizada usando la enzima codificada por
A. niger N400 como representante de los genes codificados
por varias subespecies de A. niger. Debido a que pIM 4121
carece de una secuencia promotora suficiente, el fragmento fue
extendido al extremo 5' con un fragmento XhoI-EcoRI
de aproximadamente 270 pb a partir del fragmento XhoI que se
superpone parcialmente. Con este fin, pIM 4121 fue digerido con
BamHI, sometido a electroforesis en gel según lo descrito en el
ejemplo 3.1 y el fragmento de aproximadamente 7 kb (que contiene el
vector y una parte del gen) fue recuperado según lo descrito en el
ejemplo 3.1. Este fragmento de 7 kb fue defosforilado usando
fosfatasa alcalina de intestino de ternera (ciap, Life Technologies,
Rockville, Md) de acuerdo con las instrucciones suministradas. Se
realizó entonces la extracción fenol/cloroformo para eliminar la
fosfatasa alcalina de intestino de ternera, y el fragmento de 7 kb
fue precipitado usando métodos estándares (Sambrook y otros,
1989), y disuelto en 5 \mul de H_{2}O. pIM 4122 fue digerido
con BamHI, sometido a electroforesis en gel (ejemplo, 3.1) y el
fragmento BamHI de aproximadamente 1.4 kb fue recuperado a partir
del gel (ejemplo 3.1). El fragmento BamHI de aproximadamente 1.4 kb
fue ligado con el fragmento BamHI de 7 kb. La ligazón se hizo según
lo descrito en el Ejemplo 4, la transformación y el aislamiento del
ADN plasmídico de los transformantes se realizaron según lo descrito
en el ejemplo 3.2. El plásmido resultante se denominó pIM 4103
(Figura 7), y fue depositado bajo número de acceso CBS 102481
(disponible en CBS (Centraal Bureau voor Schimmelcultivos), Países
Bajos).
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Ejemplo
6.2
Para una descripción publicada de A.
niger NW171, véase EJB, 1997, vol 247605-613,
disponible bajo petición en Wageningen University, Wageningen,
Países Bajos.
El plásmido pIM 4103 fue introducido en A.
niger por co-transformación de A. niger
NW 171 (fwnA6, pyrA6, nicA1, pepA::argB_{nid}\DeltaA,
pepB::argB_{nid}\DeltaB, pepE::argB_{nid}\DeltaE, (descrita
por van den Homberg y otros, 1997) usando como un marcador
selectivo de A. niger el gen pyrA, localizado en el plásmido
pGW635 (descrito por Goosen y otros, (1989)) y el plásmido
pIM 4103 como el plásmido co-transformante.
Los protoplastos fueron preparados a partir del
micelio en crecimiento de A. niger NW171 en medio mínimo
(por L: 6.0 g de NaNO_{3}, 1.5 g de KH_{2}PO_{4}, 0.5 g de
MgS0_{4}*7H_{2}O, 0.5 g de KCL, 1 ml de solución Visniac
(Visniac, W., Santer, M. (1957), pH 6.0) suplementado con 50 mM de
glucosa, 0.5% de extracto de levadura, 0.2% de casaminoácidos y 10
mM de uridina durante 20 horas a 30ºC. La preparación de
protoplastos de A. niger NW171 y el procedimiento de
transformación fue realizado según lo descrito por
Kursters-van Someren y otros, (1991) Current
Genetics, 20: 293-299, usando 1 \mug de pGW635 y
20 \mug de pIM 4103. Los transformantes fueron seleccionados por
su capacidad de crecer en ausencia de uridina.
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Ejemplo
6.3
El ADN genómico proveniente de una selección de
transformantes fue aislado según el método de De Graaff y
otros, (1988). 5 \mug de ADN fueron digeridos según lo
descrito en el ejemplo 3.3 usando HindIII. Después de la
electroforesis, el ADN desnaturalizado fue transferido a una
membrana de nitrocelulosa según lo descrito en el ejemplo 3.3. Las
membranas fueron reticuladas, y prehibridadas en HB (según lo
descrito en el ejemplo 3.3) durante 2 h e hibridada con el
fragmento KpnI-PstI de 845 pb etiquetado con
[\alpha-^{32}P]-dATP (Figura 7,
sonda 2) en HB (etiquetado, según es descrito por ejemplo 3.3) a
65ºC. El lavado fue realizado según lo descrito en el ejemplo 3.3.
Los resultados son mostrados en la Figura 8.
El ARN fue aislado a partir de la misma
selección de transformantes, según lo descrito en el ejemplo 5.2.
10 \mug del ARN aislado fue desnaturalizado mediante glioxal
(Sambrook y otros, 1989) y separados por tamaño por
electroforesis en gel (1.6% de agarosa en 10 mM tampón fosfato pH 7)
a 8,3 V/cm durante 1.5 h. Después de la separación el ARN fue
transferido a una membrana de nitrocelulosa y prehibridado en HB,
según lo descrito en el ejemplo 3.3. El fragmento
KpnI-PstI de 845 pb etiquetado con
[\alpha-^{32}P]-dATP fue
desnaturalizado por calor y rápidamente refrigerado en hielo antes
de la adición de tampón para hibridación por Nothern (NHB (6xSSC,
5x solución de Denhardts, 0.5% de SDS, 10% de sulfato de dextrano y
50% formamida).
La hibridación fue realizada a 42ºC durante 17
horas, el lavado se realizó según lo descrito en el ejemplo 3.3.
Como se muestra en la Figura 9, el transformante 10 pareció tener el
mayor número de copias y los más altos niveles de ARNm para el gen
de interés. En lo sucesivo, el transformante 10 es llamado A.
niger NW171: pIM 4103-10.
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Ejemplo
7
Ejemplo
7.1
A 300 ml del filtrado del cultivo obtenido
mediante el cultivo de A. niger cepa NW171:: pIM
4103-10, en medio completo (CM), pH 6.0, que
contiene por litro 4.0 g de NH_{4}Cl, 1.5 g de KH2PO_{4}, 0.5 g
de KCl, 0.5 g de MgSO_{4}*7H_{2}O, 1 g de extracto de levadura,
2 g de peptona de carne (peptona 100, Gibco BRL), 1 g de peptona
140 (Gibco BRL), 0.3 g de ácidos ribonucleicos de levadura (Sigma),
2 ml de solución de vitaminas, oligoelementos de acuerdo con
Vishniac y Santer (1957) y 2% de glucosa por litro. La solución de
vitamina contuvo por cada 100 ml: 10 mg de tiamina, 100
mgriboflavina-5p, 10 mg de ácido
p-aminobenzoico, 100 mg de nicotinamida, 50 mg de
piridoxina-HCl, 10 mg de ácido pantoténico, y 2 mg
de biotina.
Un volumen de 300 ml del medio se inoculó con
106 esporas/ml y se incubó a 30ºC durante 7 días en un agitador
orbital establecido a 250 rpm. El fluido del cultivo fue recolectado
por filtración y el filtrado fue ajustado a pH 7. A 300 ml de
cultivo se le añadió (NH_{4})_{2}SO_{4} líquido al 60%
de saturación.
Después de la agitación durante 30 min la
proteína precipitada fue recuperada por centrifugación durante 15
min a 11,000xg. Al sobrenadante se le añadió
(NH_{4})_{2}SO_{4} a una concentración final de 90% de
saturación. Después de la agitación durante 30 min la proteína
precipitada fue recuperada por centrifugación durante 15 minutos a
11000 x g. El pellet resultante fue solubilizado en 20 ml de tampón
fosfato (PB) a pH 7.2, que fue preparado mediante la mezcla de 100
mM de Na_{2}HPO_{4} y 100 mM KH_{2}PO_{4} hasta que el pH
deseado fue obtenido. La solución resultante fue dializada contra 2
litros de trietanolamina (TEA) 10 mM pH 7. Todos los pasos de
diálisis se realizaron durante 2 horas, con la excepción de la
última etapa, que fue realizada durante 17 horas.
Después la solución de diálisis se aplicó a una
columna SourceQ de 15.5 ml (Pharmacia Biotech) equilibrada en TEA
20 mM, pH 7.0. La proteína unida se eluye usando un gradiente lineal
de 124 ml desde 0 hasta 0.4 M de NaCl en 20 mM TEA pH 7.0. La
actividad aminopeptidasa eluye a una concentración de NaCl entre 240
y 290 mm. Esto corresponde con las fracciones 15 y 16, las cuales
fueron combinadas y 5 veces diluidas en 20 mM de
Bis-Tris pH 6.5. La muestra resultante fue aplicada
a 1 ml de una columna Resource Q (Pharmacia biotech^{TM})
equilibrada en 20 mM Bis-Tris pH 6.5. La proteína
ligada se eluye usando un gradiente lineal de 20 ml desde 0 hasta
0.4 M de NaCl en 20 mM Bis-Tris pH 6.5. La actividad
aminopeptidasa eluyó a una concentración de NaCl entre 210 y 250
mm. Las fracciones de 2 ml fueron recolectadas.
En todos los pasos, actividad aminopeptidasa fue
determinada por espectrofotometría (OD400) midiendo la liberación
de para-nitroanilida a partir de
fenilalanina-para-nitroanilida
(Phe-pNA, Sigma Chemical Co. San Luis) en una
mezcla de reacción que contiene 400 \mul, de 1 mm
Phe-pNA (disuelto en HCL 7.5 mM) y 600 \mul de 100
mM pH 7.2. La masa molecular de la aminopeptidasa y la pureza
fueron determinadas por SDS-PAGE según lo descrito
anteriormente (véase Laemmli, 1970) en un 10% de gel (Figura 14). La
aparente masa molecular fue de 72 kDa.
Ejemplo
7.2
La aminopeptidasa fue purificada a partir del
micelio mediante el cultivo de A. niger cepa NW171::pIM
4103-10 en CM (ejemplo 7.1) en frascos agitadores
por 48 horas. Después de de la recolección por filtración, 50 g del
micelio fueron cultivados y resuspendidos en 70 ml PB 100mM pH 7.2.
Después de la centrifugación a 10.000 xg durante 15 minutos, el
sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo. La proteína fue
precipitada trayendo al sobrenadante a una concentración de 60% de
saturación con NH_{4}SO_{4}. Después de la agitación durante 30
min, la proteína precipitada fue recuperada por centrifugación
durante 15 minutos a 11000 x g. El sobrenadante fue luego llevado a
una concentración de 90% de saturación con
(NH_{4})_{2}SO_{4}. Después de la agitación durante 30
min, el precipitado de proteínas fue recuperado por centrifugación
durante 15 minutos a 11000 x g. El precipitado fue solubilizado en
30 ml 200 mM pH 7.2 de PB. La solución resultante fue dializada
tres veces contra 2 L de 10mm trietanolamina (TEA) pH 7.0. Los dos
primeros pasos de diálisis se realizaron durante 2 h, mientras que
el paso final de diálisis fue realizado durante 17 hr. Después de la
diálisis, la mezcla de proteínas fue cargada en una columna de 15.5
ml SourceQT (Pharmacia biotech^{TM}), equilibrado en TEA 20 mM pH
7.0. La proteína unida fue eluída usando un gradiente lineal de 124
ml de NaCl 0-0.4 M en 20 mM TEA. La actividad
aminopeptidasa eluyó a una concentración de NaCl entre 240 y 290 mM.
Las fracciones de 5 ml fueron recolectadas, y las que tuvieron
actividad aminopeptidasa fueron combinadas. Las fracciones
combinadas fueron diluidas 10 veces con H_{2}O y cargadas en un 1
ml de una columna ResourceQ^{TM} (Pharmacia biotech^{TM})
equilibrada en TEA 20 mM pH 7.0. La proteína unida fue eluída
usando un gradiente lineal de 15 ml de 0-0.4 M NaCl
en 20 mM TEA, pH 7.0. La actividad aminopeptidasa eluyó a una
concentración de NaCl entre 240 y 290 mm. Las fracciones de 1 ml de
volumen fueron recogidas. Durante el proceso de purificación, la
actividad aminopeptidasa fue determinada según lo descrito
anteriormente. La masa molecular y la pureza de la aminopeptidasa
se visualizaron por SDS PAGE. La enzima obtenida fue al menos el 95%
pura, esencialmente formando una sola banda libre de otros
contaminantes detectables.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Ejemplo
8.1
La actividad aminopeptidasa fue medida usando
Phe-paranitroanilida (pNA, Sigma^{TM} Chemical
Co(St. Louis)) como sustrato. El tampón de Mcilvaine (100 mM
de ácido cítrico mezclado con 200 mM de Na_{2}HPO_{4} hasta que
el pH deseado es obtenido) se utilizó como tampón. El
Phe-pNA fue disuelto en 7.5 mM de HCl a una
concentración final de 2.5 mm. 10 \mul de la enzima purificada se
añadieron a 600 \mul de tampón y 400 \mul de
pI-Phe. La actividad fue medida por
espectrofotometría a 400 nm, midiendo el cambio de absorbancia por
minuto a 30ºC.
La actividad específica fue calculada usando la
siguiente fórmula:
El volumen de la cubeta fue de 1 ml.
\varepsilon sustrato es de 9.6 \mum/cm. Los resultados son
presentados en la Figura 10. El pH óptimo es de 5.
La actividad aminopeptidasa fue medida usando
Leu-paranitroanilida (pNAP, Sigma chemical co (St.
Louis)) como sustrato. El tampón de Mcllvaine (100 mM de ácido
cítrico mezclado con 200 mM Na_{2}HPO_{4} hasta que el pH
deseado es obtenido) se utilizó como tampón.
Phe-pNA fue disuelto en 7.5 mM
HCl en una concentración final de 1 mM. 10 \mul de la enzima
purificada se añadieron a 600 \mul tampón y 400 \mul de
Leu-pNA. La actividad fue medida por
espectrofotometría a 400 nm, midiendo el cambio de absorbancia por
minuto a 30ºC.
La actividad específica fue calculada usando la
fórmula siguiente:
El volumen de la cubeta fue de 1 ml.
\varepsilon sustrato es de 9.6 \mum/cm. Los resultados son
presentados en la Figura 11. El pH óptimo es entre 5 y 8.
Ejemplo
8.2
Tubos de microcentrífuga que contienen 100
\mum de 0.055 mg/ml de proteína en PB a pH 7.2 de la
aminopeptidasa purificada fueron preincubados en un baño de agua a
30ºC, 40ºC, 50ºC o 60ºC durante 60 minutos. Una muestra se mantuvo
en hielo durante 60 minutos como referencia. La actividad
aminopeptidasa fue medida según lo descrito en el ejemplo 8.1
usando pNA-Phe como sustrato y 100 mM tampón PB a pH
7.2 como tampón. La temperatura de la reacción fue de 30ºC.
\newpage
La actividad específica de la muestra
preincubada fue calculada de la siguiente manera:
Los resultados son mostrados en la Figura 12.
Después de una incubación durante 60 minutos a 50ºC, la actividad
fue del 90% de la actividad de la muestra de referencia. Después de
60 minutos a 60ºC, la actividad fue de aproximadamente el 25% de la
actividad de la muestra de referencia.
Ejemplo
8.3
Phe-para-nitroanilida
(PHE-ANP), Arg-pNA,
Ala-pNA, Met-pNA,
Leu-pNA, Pro-pNA,
Lys-pNA,
N-adetilalanina-pNA (NACA - ANP),
Trp-p-naftilamida
(Trp-\betaNA), Su-ARN,
Ser-ARN, ARN-Leu,
Phe-\betaNA se obtuvieron a partir de Sigma
chemical co (St. Louis).
Ile-pNA,
Glu-pNA, Val-pNA,
Gly-pNA, ASN-\betaNA,
Thr-\betaNA, Tyr-\betaNA se
obtuvieron a partir de Bachem (Suiza).
Todos los sustratos pNA fueron hechos en 7.5 mM
HCl a una concentración final de 2.5 mm. Todos los
\beta-NA sustratos fueron disueltos en metanol a
una concentración final de 10 mM. Para el sustrato
Asp-\betaNA 20 \muml de ácido acético se
añadió.
Cuando se usan los sustratos pNA, la actividad
aminopeptidasa fue medida según lo descrito en el ejemplo 8.1,
excepto que el ácido cítrico 20 mM a pH 5.2 o PB 100 mM a pH 7.2
fueron usados como tampón.
Cuando se usan los sustratos \mul, 10 \mul
de la enzima purificada fueron añadidos a 100 \mul del sustrato y
900 \mul de tampón. Cuando se utiliza Phe-, Leu-, Trp- o
Tyr-\betaNA a pH 7.2, 10 \mul de sustrato se
utilizaron en 990 \mul de tampón. La actividad fue medida en un
espectrofotómetro de fluorescencia Hitachi F-4500
usando una longitud de onda de excitación de 340 nm y una emisión de
longitud de onda de 455 nm. La actividad es presentada como la
actividad comparada con la actividad en Phe-pNA en
el caso sustratos pNA y comparada con la actividad en
Phe-\betaNA en caso de los sustratos
\betaNA.
Los resultados son mostrados en la Figura 13. El
sustrato óptimo para la prueba de aminopeptidasa a ambos pH fue
Phe-pNA y \betaNA-Phe. La
actividad en Tyr-\betaNA y
Trp-\betaNA fue de 72% y 27% en comparación con
la actividad observada con Phe-\betaNA a pH 5.2. A
pH 7.2 estas actividades fueron 53% y 22% respectivamente. Los
resultados puede ser expresados como una relación de la actividad
fenilalanina: tirosina: triptofano aminopeptidasa de
aproximadamente 1:0.53:0.22. De las actividades antes mencionadas se
puede concluir que la aminopeptidasa es una aminopeptidasa
específica para aromato.
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Ejemplo
9
El ADN Cromosómico fue aislado a partir de
Aspergillus niger N402, Aspergillus nidulans (ATCC
48756), Aspergillus tubingensis (CBS 126.52), Aspergillus
oryzae (ATCC 20386), Aspergillus sojae (ATCC 20387),
Aspergillus carbonarius (CBS 111.26) y Aspergillus
foetidus (CBS 103.14).
5 \mug de ADN fue digerido con HindIII. La
separación en un gel de agarosa, transferencia a una membrana de
nitrocelulosa, hibridación por Southern y etiquetado de una sonda,
fueron realizados según lo descrito anteriormente, usando una
temperatura de hibridación de 56ºC y un fragmento
EcoRI-BamHI de 1090 pb como sonda (vea la Figura 7,
sonda 3). El filtro fue lavado 1x20 minutos con 4xSSC + 0.5% SDS y
1x20 minutos con 2xSSC + 0.5% SDS.
Fragmentos de ADN hibridantes fueron
encontrados en el ADN cromosómico digerido de A. niger,
A. tubingensis, A. foetidus y A. carbonarius
(véase Figura 15). Esto indica la presencia de genes de
aminopeptidasa muy similares, homólogos en cada una de estas cepas
de Aspergillus.
Todas las publicaciones citadas en este
documento se incorporan mediante referencia.
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Ejemplo
10
Las aminopeptidasas aisladas de la invención
fueron probadas usando Ch-easy-model
(Smit, G., Braber, A., Spronsen, WA van, Berg, G. Van den y
Exterkate, FA (1995). Ch-easy-model
voor de bestudering van kaasrijping
[Ch-easy-model for studying cheese
ripening], Voedingsmiddelentechnologie, 28 (8):
19-21.). El CH-easy con
aminopeptidasa añadida (de acuerdo con la invención) fue comparada
con otros dos lotes, uno de ellos que es un control neutral
(solamente adición del cultivo de arranque, Direct Starter TM 31LT1
[DSM Food Specialties, Australia]) y uno con Accelerzyme® AP2000
añadida (DSM Síntesis, Seclin, Francia). Las adiciones se basaron en
la actividad enzimática y fueron las mismas para ambos lotes (60
APU/100g, con 1 Unidad de Proteasa Ácida que es la cantidad de
tirosina liberada luego de la precipitación con TCA de un sustrato
de hemoglobina a pH 3.5 medido a 280nm). Tras dos semanas de
maduración a 17ºC los lotes de
Ch-easy-model fueron evaluados
usando un panel de análisis sensorial entrenado profesionalmente.
El lote Ch-easy-model con adición de
la aminopeptidasa de la invención recibió puntuaciones similares a
las de los lotes con Accelerzyme® añadida. Especialmente
puntuaciones para al gusto y el sabor (envejecidos) generales
establecieron estos dos lotes aparte del control neutro. Una mejora
general fue así observada y ambos lotes Ch-easy
habían obtenido un gusto y sabor bien equilibrados en comparación
con el lote control neutro.
Bussink, H. J. D.; Buxton, F. P.;
Visser, J. (1991); Current Genetics 19:
467-474.
Feinberg, A. P. & Vogelstein
B. (1983); Anal. Biochem 132:
6-13.
Goosen, T., van Engelenburg, F.,
Debets, F., Swart, K., Bos, K. and van den
Broek, H. (1989); Mol. Gen. Genet. 219:
282-288.
De Graaff, L., Van den Broek, H.
and Visser, J. (1988); Curr. Genet. 13:
315-321.
Harmsen, J. A. M.; Kusters-van
Someren, M. A.; Visser, J. (1990); Current
Genetics 18: 161-166.
Laemmli, U. K. (1970);
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Sambrook J. Fritsch, E. F.,
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manual, 2da edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
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Vishniac W., Santer M.
(1957) The Thiobacilli, Bacteriol. Rev. 21,
195-213.
Yanisch-Perron, C.,
Viera, J. and Messing, J. (1985); Gene
33, 103-119.
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<110> DSM NV
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nueva Aminopeptidasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ApsC -EP2968
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3922
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger CBS
120.49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(3922)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen que codifica para una
aminopeptidasa clonada a partir de un fragmento de restricción
XhoI-HindIII del ADN genómico.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc-feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador delantero sintético
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<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 663
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger CBS
120.49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(663)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido de aminopeptidasa
derivado a partir de la secuencia que codifica para un fragmento
XhoI-HindIII del ADN genómico.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1260
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger NRRL
3112
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1260)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia genómica de la
aminopeptidasa de A. niger NRRL 3112
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador delantero sintético
SAP-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso sintético
SAP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador delantero sintético
SAP-3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso sintético
SAP-4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador delantero sintético
SAP-5; las bases en las posiciones 6 y 15 son
inopina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador delantero sintético
SAP-6; la base en la posición 12 es inosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador delantero sintético
SAP-7; la base en la posición 9 es inosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso sintético
SAP-8; la base en la posición 12 es inosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger NRRL
3112
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido contaminante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger CBS
120.49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador delantero sintético
(SAP-9)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger CBS
120.49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso sintético
(SAP-10)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger CBS
120.49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador delantero (APSC 11)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger CBS
120.49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso (APSC 12)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger CBS
120.49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de la reacción de la RT
(APSC 13)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger CBS
120.49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador anidado (APSC 17)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger CBS
120.49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador anidado (APSC 18)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger CBS
120.49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso (APSC 19)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de la reacción de la RT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 637
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Synechocystis sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 629
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Caenorhabditis elegans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
Claims (12)
1. Un polipéptido aislado el cual tiene
actividad aminopeptidasa, seleccionado a partir del grupo que
consiste de:
(a) un polipéptido el cual tiene una secuencia
de aminoácidos que tiene al menos el 90% de identidad de la
secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 1 a 663 de la ID SEC
NO: 2 o un fragmento de la mismo,
(b) un polipéptido el cual es codificado por un
polinucleótido que hibrida bajo condiciones de alto rigor con (i)
la secuencia de ácido nucleico de la ID SEC NO: 1 o (ii) una
secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia de ácido
nucleico de la ID SEC NO: 1,
el polipéptido que tiene al menos una de las
siguientes propiedades físico-químicas:
(1) una actividad aminopeptidasa fenilalanina
óptima a un pH en el rango entre 2 y 10, tal como entre 4 y 7,
preferiblemente entre 4.5 y 6.5, óptimamente de 5 a 6;
(2) un peso molecular (cuando está
deglicosilada), de aproximadamente 72 kDa, y
(3) un punto isoeléctrico de aproximadamente
5.6.
2. El polipéptido de la reivindicación 1, el
cual tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de
identidad con los aminoácidos 1 a 663 de la ID SEC NO: 2.
3. El polipéptido de la reivindicación 1, que
comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC NO: 2.
4. El polipéptido de la reivindicación 1, el
cual es obtenido a partir de un hongo, preferiblemente un
Aspergillus, más preferiblemente a partir de Aspergillus
niger, más preferiblemente a partir de Aspergillus niger
cepa N400 o cepa NRRL3112.
5. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de ácido nucleico la cual codifica el polipéptido de la
reivindicación 1, o la cual hibrida con la ID SEC NO: 1 bajo
condiciones de alto rigor.
6. Una construcción de ácido nucleico que
comprende el polinucleótido de la reivindicación 5 operablemente
ligado a una o más secuencias de control que dirigen la producción
del polipéptido en un hospedero de expresión apropiado.
7. Un vector de expresión recombinante que
comprende la construcción de ácido nucleico de la reivindicación
6.
8. Una célula hospedera recombinante que
comprende la construcción de ácido nucleico de la reivindicación 6
o el vector de la reivindicación 7.
9. Un método para producir el polipéptido de
cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que comprende
cultivar una cepa/célula hospedera recombinante de acuerdo con la
reivindicación 8, para producir un sobrenadante y/o células que
comprenden el polipéptido; y recuperar el polipéptido.
10. Uso del polipéptido de las reivindicaciones
1-4 o la célula de la reivindicación 8 en la
preparación de una masa para mejorar el sabor de un producto
horneado a partir de la masa.
11. Uso del polipéptido de las reivindicaciones
1-4 o la célula de la reivindicación 8 en la
preparación de un queso para mejorar el sabor del mismo.
12. Una composición de alimento que comprende el
polipéptido de las reivindicaciones 1-4 o la célula
de la reivindicación 8.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| ATE260973T1 (de) * | 1995-05-31 | 2004-03-15 | Dsm Ip Assets Bv | Herstellung der aminopeptidasen aus aspergillus niger |
| JP4128632B2 (ja) * | 1997-05-16 | 2008-07-30 | ノボザイムス，インコーポレイティド | アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドおよびそれをコードする核酸 |
-
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