CN106939292B - 一种清肺除霾骆驼乳酸饮料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种清肺除霾骆驼乳酸饮料及其制备方法和应用，通过从新疆阿克苏驴乳自然发酵酸奶中分离筛选出一株香味菌（Myroides sp.）L6和乳球菌（Lactococcus sp.）L122，利用分离出的两种菌种混合发酵，添加多种药食同源植物，采用保温浸提、榨汁破碎等一系列独特的制备工艺，制备的骆驼乳酸饮料白色中带淡棕色，奶香味浓郁，酸度、咸中等，有淡中药味，动物实验经动物实验验证，可以抵抗PM2.5诱导的肺部炎症，维持肺部的炎症因子不偏离正常水平。

Description

一种清肺除霾骆驼乳酸饮料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种骆驼乳酸饮料及其制备方法的技术领域。
技术背景
近年来，各地雾霾天气不断，雾霾中危害人类健康的主要是直径小于10微米的气溶胶粒子，它能直接进入并粘附在人体上下呼吸道和肺叶中，降低人体的免疫力，引起鼻炎、支气管炎等病症，长期处于这种环境还会诱发肺癌,雾霾天中的颗粒污染物不仅会引发心肌梗死，还会造成心肌缺血或损伤，当空气中污染物加重时，心血管病人的死亡率会增高。如何应对雾霾天气已经成为全球关注的焦点。
目前，用于预防治疗吸烟和雾霾等对人体健康造成慢性影响的食品、保健食品乃至药物都很多，例如，公开号为CN103583754B的中国专利，该专利公开了一种清咽除霾保健茶饮料，成分包括绿茶、山药、黑豆、西兰花、胡萝卜、玉米草、黑种草、白果、平菇、金银花、杭白菊、板蓝根、干姜、佛手、胖大海、紫苏、桔梗、栀子、甘草、余甘子、川贝母、牡丹皮、蜂蜜和水；公开号为CN 104286306 A的中国专利，该专利公开了一种无花果寄生排毒茶，成分包括无花果寄生、桔梗、广藿香、薄荷、玉竹、鱼腥草、芦根、乌梅、山药、薏苡仁和桃仁，有益效果；以上预防和治疗因雾霾天气而引起的呼吸系统疾病的药品或保健品的原料都是采用润肺、解毒功效的中药以及绿茶、花茶、五谷杂粮等食品，将多种中药材料混合在一起，风味不佳，无法作为一种饮品或饮料长期饮用，只能作为保健茶饮用，且制备工艺繁杂，成本也难以控制，不利于工业化生产。
驼乳中富含具有抗菌和保护活性的蛋白，这些蛋白在牛奶中没有被发现，驼乳中富含牛奶中所缺少的溶解酵素和乳铁传递蛋白，这两种蛋白在增强人体免疫系统和杀菌作用上具有重要的功能。此外，驼乳还具有清洁肺和肠道的作用，能够提高人体的免疫力，在非洲一些国家和地区，人们用驼乳治疗伤口和炎症。在印度，驼乳在沙漠地区被用来治疗水肿、哮喘黄疸和贫血等疾病。骆驼乳营养丰富，构成合理，非常接近人乳，具有多种生物活性，而且过敏原性很低，可作为对牛乳过敏的儿童的奶替代品，因此具有重要的开发利用价值。目前尚未有关于骆驼乳应用于清肺除霾的报道。
在现有驼乳加工工艺的基础上进行研究和开发，将骆驼乳与多种药食同源植物和非药食同源的草药进行复配，利用产品中的原料配比调节风味，从而提供一种口感佳且适合雾霾天饮用的骆驼乳饮料。
发明内容
针对国内骆驼乳酸饮料记载较少的现状，且现有清肺除霾食品普遍存在口感差、中药味重且制作成本高等问题，本发明提供一种清肺除霾骆驼乳酸饮料及其制备方法及其应用，通过从新疆阿克苏驴乳自然发酵酸奶中分离筛选出的一株香味菌(Myroides sp.)L6和乳球菌(Lactococcus sp.)L122，添加到骆驼乳中进行分段变温发酵，再与多种药食同源植物和非药食同源的草药进行复配，利用产品中的原料配比调节风味，采用保温浸提、榨汁破碎等一系列独特的制备工艺，有效的解决了现有清肺除霾食品感官品质差、制作工艺复杂的问题，制作出的骆驼乳酸饮料口感绵密、奶香醇郁，对于呼吸道雾霾侵害有缓解作用，对食品加工技术领域具有广泛的实用性。
本发明提供一种清肺除霾骆驼乳酸饮料，按照重量份数计，包括骆驼乳100-150份、木糖醇3-9份、恰玛古浸提液16-20份、库鲁木提浸提液16-20份、荸荠汁11-13份、白萝卜汁3-10份、乳球菌混合发酵剂3-5份、香味菌混合发酵剂1-3份、纯净水700-1100份。
本发明提供一种清肺除霾的骆驼乳酸饮料的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)制备发酵乳：新鲜采集的100-150份骆驼乳采用巴氏杀菌的方式进行灭菌处理，灭菌温度70℃-80℃，灭菌时间5s-10s，灭菌后迅速冷却至室温，加入3-9份木糖醇，接种3-5份乳球菌混合发酵剂，初期在40℃-41℃下发酵6h-8h,后期降温至33℃-35℃，接种1-3份香味菌混合发酵剂，在33℃-35℃条件下发酵1-1.5h，得到骆驼发酵乳。
(2)制备浸提液：将清洗后的恰玛古、库鲁木提切成小块，分别添加3倍体积的纯净水，缓慢加热，在90℃-100℃的条件下保温浸提，浸提时间为30min-40min，浸提次数为2-3次，多次浸提后过滤，得到恰玛古浸提液和库鲁木提浸提液,冷却至室温备用。
(3)制备荸荠汁和白萝卜汁：将清洗后的白萝卜和清洗去皮后的荸荠切成小块，分别加入2倍体积的纯净水榨汁破碎，经40目震荡筛过滤3次，在温度120℃的条件下超高温瞬时灭菌15s，得到荸荠汁和白萝卜汁，冷却至室温备用。
(4)混合：将上述步骤得到的骆驼发酵乳、16-20份恰玛古浸提液、16-20份库鲁木提浸提液、11-13份荸荠汁和3-10份白萝卜汁进行混和搅拌，经混和制得骆驼乳酸饮料。
本发明中，制备发酵乳步骤中的灭菌温度为75℃，灭菌时间为8s，初期时发酵温度为41℃，发酵时间为7h。
本发明中，制备浸提液步骤中的保温浸提温度为95℃，浸提时间为35min，浸提次数为3次。
本发明中，乳球菌混合发酵剂是由香味菌(Myroides sp.)L6和乳球菌(Lactococcus sp.)L122按照重量比以2：5的比例复合制得。
本发明中，香味菌混合发酵剂是由香味菌(Myroides sp.)L6和乳球菌(Lactococcus sp.)L122按照重量比以3：1的比例复合制得。
本发明从新疆阿克苏驴乳自然发酵酸奶中取样，筛选出一批生长良好的微生物菌株，进行微生物菌种的培养、分离与筛选，从中优选得到编号为L6的菌株。菌株L6可在4℃-35℃生长良好，革兰氏染色为阴性，大约0.5–0.8×1.4–2.9μm，好氧，无运动性，最适生长温度34℃，可耐受含有0-5％NaCl的培养基上生长。在完全培养基上，菌落为淡红色，圆形，微突起，边缘规则，可产生令人愉悦的香味。菌体氧化酶和触酶为阳性，可胨化牛奶，可水解明胶、淀粉、酪蛋白，具有碱性磷酸酶，胰蛋白酶和脂肪酶活性，不产吲哚和H2S；对于葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖，阿拉伯糖，甘露糖、蔗糖发酵不产酸。可利用半乳糖、葡萄糖、糊精、阿拉伯糖确定，单甲基丁二酸，α-羟基丁酸、丁二酸、溴代丁二、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、glycyl-l-aspartic、甘氨酰-L-谷氨酸和脯氨酸作为单一碳源生长，通过上述该菌株L6的菌落形态、生理生化特性可知，菌株L6具有新菌种的特性。
通过提取菌株L6的总DNA，采用细菌16S rDNA PCR扩增通用引物，进行PCR扩增，PCR产物经切胶纯化，经测序。将实验菌株的所得序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，确定与实验菌株亲缘关系最近的种属。并结合EzTaxon中序列比对并调取相关模式菌株序列，以进行系统发育树分析标准模式菌序列，利用MEGA 5.0软件包采用邻接法(Neighbor-Joining method)进行聚类分析和系统进化树构建。菌株L6与模式菌株Myroides profundi D25T(EU204978)最大同源为97.1％，与同属其它菌株同源性均小于97.0％，表明该菌种L6具有典型鲜明的新菌种特性，暂命名为香味菌(Myroides sp.)。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期2017年1月17日，菌种保藏号为CGMCC No.13634，经微生物学鉴定为香味菌属新种，命名为香味菌(Myroides sp.)L6。
本发明通过从新疆阿克苏驴乳自然发酵酸奶中分离筛选得到菌株乳球菌(Lactococcus sp.)L122，经稀释后至乳酸细菌培养基平板上28℃恒温培养。当乳酸菌生长代谢出乳酸后，会使pH下降而使颜色由绿变为黄绿，挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，直至无杂菌落，从中优选出一株编号为L122的菌株。菌株L122可在10℃-41℃生长良好，革兰氏染色为阳性，球菌，大约0.77×0.77μm，好氧，无运动性。最适生长温度40℃，可耐受含有3％NaCl的培养基上生长，在24小时内达到pH值4.8。可利用半乳糖、乳糖、蜜二糖，棉子糖，蔗糖、甘露醇和淀粉产酸，利用核糖、木糖不产酸，亮氨酸氨基肽酶和酸性磷酸酶活性阳性，但不可利用β-葡萄糖醛酸酶，阿拉伯糖，N-acetyld-glucosamine，D-木糖，甘露醇，D-核糖，果糖，阿拉伯糖，熊果苷和氨基葡萄糖作为单一碳源同化。提取菌株L122的总DNA，采用细菌16S rDNA PCR扩增通用引物，进行PCR扩增，PCR产物经切胶纯化，测序。将实验菌株的所得序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，确定与实验菌株亲缘关系最近的种属。并结合EzTaxon中序列比对并调取相关模式菌株序列，以进行系统发育树分析标准模式菌序列，利用MEGA 5.0软件包采用邻接法进行聚类分析和系统进化树构建。菌株L122与模式菌株Lactococcus laudensis DSM 28961T(KJ394457)最大同源为97.1％，与同属其它菌株同源性均小于97.0％，表明该菌种L122具有典型鲜明的新菌种特性，暂命名为乳球菌(Lactococcus sp.)L122。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期2017年1月17日，菌种保藏号为CGMCC No.13633，经微生物学鉴定为乳球菌新种，命名为乳球菌(Lactococcus sp.)L122。
进一步，本申请提供清肺除霾的骆驼乳酸饮料在制备改善、预防和治疗因雾霾引起的一系列不适症状及其相关并发症的保健品中的应用。
通过实施本发明提供的技术方案，可以达到以下效果:
(1)本发明提供一种清肺除霾骆驼乳酸饮料及其制备方法，通过从新疆阿克苏驴乳自然发酵酸奶中分离筛选出的一株香味菌(Myroides sp.)L6和乳球菌(Lactococcussp.)L122，添加到骆驼乳中进行分段变温发酵，再与多种药食同源植物和非药食同源的草药进行复配，利用产品中的原料配比调节风味，采用保温浸提、榨汁破碎等一系列独特的制备工艺，有效的解决了现有清肺除霾食品感官品质差、制作工艺复杂的问题，制作出清肺除霾骆驼乳酸饮料口感绵密、奶香醇郁，对于呼吸道雾霾侵害有缓解作用，对食品加工技术领域具有广泛的实用性。
(2)本发明通过响应面法优化骆驼乳酸饮料的制备工艺，以及通过系列试验得出制备工艺的最佳参数，即初期时发酵温度为41℃、发酵时间为7h、浸提温度为95℃、浸提时间为35min。在此条件下，制备的骆驼乳酸饮料白色中带淡棕色，奶香味浓郁，酸度、咸中等，有淡中药味，感官评分最高达到98分。
(3)将本发明提供一种清肺除霾骆驼乳酸饮料应用到动物实验中，实验结果表明暴露于PM2.5后会使小鼠肺部的炎症因子显著偏离正常水平，本发明提供的骆驼乳酸饮料可以抵抗PM2.5诱导的肺部炎症，维持肺部的炎症因子不偏离正常水平。本发明其他实施例制备的骆驼乳酸饮料具有相似的活性。
附图说明
图1显示为香味菌(Myroides sp.)L6的系统进化树。
图2显示为乳球菌(Lactococcus sp.)L122的系统进化树。
图3显示为发酵时间和发酵温度对骆驼乳酸饮料感官评分影响的等高线图。
图4显示为发酵时间和发酵温度对骆驼乳酸饮料感官评分影响的响应面图。
图5显示为浸提温度和发酵温度对骆驼乳酸饮料感官评分影响的等高线图。
图6显示为浸提温度和发酵温度对骆驼乳酸饮料感官评分影响的响应面图。
图7显示为发酵温度和浸提时间对骆驼乳酸饮料感官评分影响的等高线图。
图8显示为发酵温度和浸提时间对骆驼乳酸饮料感官评分影响的响应面图。
图9显示为发酵时间和浸提温度对骆驼乳酸饮料感官评分影响的等高线图。
图10显示为发酵时间和浸提温度对骆驼乳酸饮料骆驼乳酸饮料感官评分影响的响应面图。
图11显示为发酵时间和浸提时间对骆驼乳酸饮料感官评分影响的等高线图。
图12显示为发酵时间和浸提时间对骆驼乳酸饮料感官评分影响的响应面图。
图13显示为浸提温度和浸提时间对骆驼乳酸饮料感官评分影响的等高线图。
图14显示为浸提温度和浸提时间对骆驼乳酸饮料感官评分影响的响应面图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中使用的原料和试剂:骆驼乳(购自喀什地区骆驼养殖户)，咽炎片(产自山东中大千方制药有限公司)。
本发明中使用的仪器:分析天平(上海第二天平仪器厂)，电子天平(1509001)(德国GAMR公司)，高压灭菌器(YX280B)(上海三申医疗器械厂)，恒温水浴锅(上海金宏实验设备有限公司,DKB-501)。另外，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指m/m质量百分比，
本发明中使用的材料：
完全培养基包括蛋白胨10g、酵母膏5g、葡萄糖1g和KH2PO4 3g，pH为7.0。
乳酸细菌培养基(MRS)包括蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温801.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18.0g和蒸馏水1L，pH为6.2-6.6)
本发明中选用的所有试剂、原料和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：菌株L6香味菌(Myroides sp.)的筛选、分类及鉴定
(1)菌种的分离与鉴定
本发明所使用的菌株香味菌(Myroides sp.)L6通过从新疆阿克苏驴乳自然发酵酸奶中分离出一株菌株，经梯度稀释，稀释液加至完全培养基平板上并涂布，平板置28℃恒温培养。待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于平板，直至无杂菌落，从中优选出一株编号为L6的菌株。
提取菌株L6的总DNA，采用细菌16S rDNA PCR扩增通用引物，进行PCR扩增，PCR产物经切胶纯化，经测序，序列参见附后的基因序列表SEQUENCE LISTING。将实验菌株的所得序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，确定与实验菌株亲缘关系最近的种属。并结合EzTaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)中序列比对并调取相关模式菌株序列，以进行系统发育树分析标准模式菌序列，利用MEGA 5.0软件包采用邻接法(Neighbor-Joining method)进行聚类分析和系统进化树构建。由系统进化树可示，菌株L6与模式菌株Myroides profundi D25T(EU204978)最大同源为97.1％，两者主要差异见表1。与同属其它菌株同源性均小于97.0％，表明该菌种L6具有典型鲜明的新菌种特性，系统进化树见图1。菌株L6暂命名为香味菌(Myroides sp.)。
该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期2017年1月17日，菌种保藏号为CGMCCNo.13634。经微生物学鉴定为香味菌属新种，暂命名为香味菌(Myroides sp.)L6。
(2)生理生化特性
菌株L6可在4℃-35℃生长良好，革兰氏染色为阴性，大约0.5–0.8×1.4–2.9μm，好氧，无运动性，最适生长温度34℃，可耐受含有0-5％NaCl的培养基上生长。在完全培养基上，菌落为淡红色，圆形，微突起，边缘规则，可产生令人愉悦的香味。菌体氧化酶和触酶为阳性，可胨化牛奶，可水解明胶、淀粉、酪蛋白，具有碱性磷酸酶，胰蛋白酶和脂肪酶活性，不产吲哚和H2S；葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖，阿拉伯糖，甘露糖、蔗糖发酵不产酸。可利用半乳糖、葡萄糖、糊精、阿拉伯糖确定，单甲基丁二酸，α-羟基丁酸、丁二酸、溴代丁二、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、glycyl-l-aspartic、甘氨酰-L-谷氨酸和脯氨酸作为单一碳源生长。菌株L6与邻近模式菌株Myroides profundi D25T(EU204978)主要差异见表1，由此可知，该菌株L6具有新菌种的特性，参见常见前面申报专利对于新菌种的描述。
表1：菌株L6与邻近模式菌株主要差异
特性 L6 Myroides profundi D25<sup>T</sup>
形态 杆状 梭形杆
温度范围 4-30℃ 8-42℃
NaCl浓度 0-5 0-8
pH范围 4-10 5-9
亚硝酸盐还原 - +
硝酸盐还原 + -
明胶水解 - +
脂肪酶 + +
单一碳源利用:
糊精 + -
L-阿拉伯糖 + +
吐温80 - -
吐温40 - -
丙酮酸甲酯 - -
組氨酸 - -
胸苷 - +
乙酸 + -
α-酮戊二酸 - +
羟丁酸 - -
实施例2：乳球菌(Lactococcus sp.)L122的筛选、分类及鉴定
(1)菌种的分离与鉴定
本发明所使用的菌株L122乳球菌(Lactococcus sp.)分离自新疆阿克苏驴乳自然发酵酸奶。用枪尖吸取0.5mL梯度稀释后，稀释液加至乳酸细菌培养基平板上并涂布，平板置28℃恒温培养。当乳酸菌生长代谢出乳酸后，会使pH下降而使颜色由绿变为黄绿，挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，直至无杂菌落，从中优选出一株编号为L122的菌株。
提取菌株L122的总DNA，采用细菌16S rDNA PCR扩增通用引物，进行PCR扩增，PCR产物经切胶纯化，经测序，序列参见附后的基因序列表SEQUENCE LISTING。将实验菌株的所得序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，确定与实验菌株亲缘关系最近的种属。并结合EzTaxon中序列比对并调取相关模式菌株序列，以进行系统发育树分析标准模式菌序列，利用MEGA 5.0软件包采用邻接法(Neighbor-Joining method)进行聚类分析和系统进化树构建，菌株L122与模式菌株Lactococcus laudensis DSM 28961T(KJ394457)最大同源为97.1％，与同属其它菌株同源性均小于97.0％，极可能为新种，系统进化树见图2，表明该菌种L6具有典型鲜明的新菌种特性，菌株L122暂命名为乳球菌(Lactococcus sp.)。
该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期2017年1月17日，菌种保藏号为CGMCCNo.13633。经微生物学鉴定为乳球菌潜在新种，菌株L122暂命名为乳球菌(Lactococcussp.)L122。
(2)生理生化特性
菌株L122可在10℃-41℃生长良好，革兰氏染色为阳性，球菌，大约0.77×0.77μm，好氧，无运动性。最适生长温度40℃，可耐受含有3％NaCl的培养基上生长。菌株显示了良好的牛奶酸化能力，在24小时内达到pH值4.8。可利用半乳糖、乳糖、蜜二糖，棉子糖，蔗糖、甘露醇和淀粉发酵产酸，而利用核糖、木糖发酵不产酸。亮氨酸氨基肽酶和酸性磷酸酶活性阳性，可产生蛋白酶和脂肪酶，但β-葡萄糖醛酸酶为阴性。牛奶胨化阳性，可利用葡萄糖，阿拉伯糖，n-acetyld-glucosamine，D-木糖，甘露醇，D-核糖，果糖，阿拉伯糖，环糊精，熊果苷和氨基葡萄糖，作为单一碳源生长，确定其为乳球菌新种，菌株L122与邻近模式菌株Lactococcus laudensis DSM 28961T(KJ394457)主要差异见表2。
表2：菌种L122与最邻近菌株代谢差异
Figure BDA0001270408420000141
实施例三：
本发明提供一种清肺除霾骆驼乳酸饮料，按照重量份数计，包括骆驼乳100-150份、木糖醇3-9份、恰玛古浸提液16-20份、库鲁木提浸提液16-20份、荸荠汁11-13份、白萝卜汁3-10份、乳球菌混合发酵剂3-5份、香味菌混合发酵剂1-3份、纯净水700-1100份。
一种清肺除霾骆驼乳酸饮料的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)制备发酵乳：新鲜采集的100-150份骆驼乳采用巴氏杀菌的方式进行灭菌处理，灭菌温度70℃-80℃，灭菌时间5s-10s，灭菌后迅速冷却至室温，加入3-9份木糖醇，接种3-5份乳球菌混合发酵剂，初期在40℃-41℃下发酵6h-8h,后期降温至33℃-35℃，接种1-3份香味菌混合发酵剂，在33℃-35℃条件下发酵1-1.5h，得到骆驼发酵乳。
(2)制备浸提液：将清洗后的恰玛古、库鲁木提切成小块，分别添加3倍体积的纯净水，缓慢加热，在90℃-100℃的条件下保温浸提，浸提时间为30min-40min，浸提次数为2-3次，多次浸提后过滤，得到恰玛古浸提液和库鲁木提浸提液,冷却至室温备用。
(3)制备荸荠汁和白萝卜汁：将清洗后的白萝卜和清洗去皮后的荸荠切成小块，分别加入2倍纯净水榨汁破碎，经40目震荡筛过滤3次，在温度120℃的条件下超高温瞬时灭菌15s，得到荸荠汁和白萝卜汁，冷却至室温备用。
(4)混合：将上述步骤得到的骆驼发酵乳、16-20份恰玛古浸提液、16-20份库鲁木提浸提液、11-13份荸荠汁和3-10份白萝卜汁进行混和搅拌，经混和制得骆驼乳酸饮料。
本实施例中，制备发酵乳步骤中的灭菌温度为75℃，灭菌时间为8s，初期时的发酵温度为41℃，发酵时间为7h。
本实施例中，制备浸提液步骤中的保温浸提温度为95℃，浸提时间为35min，浸提次数为3次。
本实施例中，乳球菌混合发酵剂是由香味菌(Myroides sp.)L6和乳球菌(Lactococcus sp.)L122按照重量比以2：5的比例复合制得。
本实施例中，香味菌混合发酵剂是由香味菌(Myroides sp.)L6和乳球菌(Lactococcus sp.)L122按照重量比以3：1的比例复合制得。
实施例四：
新鲜采集的100份骆驼乳采用巴氏杀菌的方式进行灭菌处理，灭菌温度70℃，灭菌时间5s，灭菌后迅速冷却至室温，加入3份木糖醇，接种3份乳球菌混合发酵剂，初期在40℃下发酵6h,后期降温至33℃，接种1份香味菌混合发酵剂，在33℃条件下发酵1h，得到骆驼发酵乳。将清洗后的恰玛古、库鲁木提切成小块，分别添加3倍纯净水，缓慢加热，在90℃的条件下保温浸提，浸提时间为30min，浸提次数为2，多次浸提后过滤，得到恰玛古浸提液和库鲁木提浸提液,冷却至室温备用。将清洗后的白萝卜和清洗去皮后的荸荠切成小块，分别加入2倍纯净水榨汁破碎，经40目震荡筛过滤3次，在温度120℃的条件下超高温瞬时灭菌15s，得到荸荠汁和白萝卜汁，冷却至室温备用。将上述步骤得到的骆驼发酵乳、16恰玛古浸提液、16库鲁木提浸提液、11荸荠汁和3白萝卜汁进行混和搅拌，经混和制得骆驼乳酸饮料。
实施例五：
新鲜采集的110份骆驼乳采用巴氏杀菌的方式进行灭菌处理，灭菌温度73℃，灭菌时间7s，灭菌后迅速冷却至室温，加入5份木糖醇，接种4份乳球菌混合发酵剂，初期在41℃下发酵7h,后期降温至33℃-35℃，接种2份香味菌混合发酵剂，在34℃条件下发酵1h，得到骆驼发酵乳。将清洗后的恰玛古、库鲁木提切成小块，分别添加3倍纯净水，缓慢加热，在92℃的条件下保温浸提，浸提时间为32min，浸提次数为2次，多次浸提后过滤，得到恰玛古浸提液和库鲁木提浸提液,冷却至室温备用。将清洗后的白萝卜和清洗去皮后的荸荠切成小块，分别加入2倍纯净水榨汁破碎，经40目震荡筛过滤3次，在温度120℃的条件下超高温瞬时灭菌15s，得到荸荠汁和白萝卜汁，冷却至室温备用。将上述步骤得到的骆驼发酵乳、18份恰玛古浸提液、18份库鲁木提浸提液、11份荸荠汁和6份白萝卜汁进行混和搅拌，经混和制得骆驼乳酸饮料。
实施例六：
新鲜采集的130份骆驼乳采用巴氏杀菌的方式进行灭菌处理，灭菌温度75℃，灭菌时间8s，灭菌后迅速冷却至室温，加入7份木糖醇，接种5份乳球菌混合发酵剂，初期在40℃下发酵7h,后期降温至35℃，接种2份香味菌混合发酵剂，在35℃条件下发酵1.5h，得到骆驼发酵乳。将清洗后的恰玛古、库鲁木提切成小块，分别添加3倍纯净水，缓慢加热，在92℃的条件下保温浸提，浸提时间为38min，浸提次数为3次，多次浸提后过滤，得到恰玛古浸提液和库鲁木提浸提液,冷却至室温备用。将清洗后的白萝卜和清洗去皮后的荸荠切成小块，分别加入2倍纯净水榨汁破碎，经40目震荡筛过滤3次，在温度120℃的条件下超高温瞬时灭菌15s，得到荸荠汁和白萝卜汁，冷却至室温备用。将上述步骤得到的骆驼发酵乳、19份恰玛古浸提液、17份库鲁木提浸提液、12份荸荠汁和5份白萝卜汁进行混和搅拌，经混和制得骆驼乳酸饮料。
实施例七：
新鲜采集的140份骆驼乳采用巴氏杀菌的方式进行灭菌处理，灭菌温度78℃，灭菌时间9s，灭菌后迅速冷却至室温，加入6份木糖醇，接种5份乳球菌混合发酵剂，初期在41℃下发酵6h,后期降温至33℃-35℃，接种3份香味菌混合发酵剂，在34℃条件下发酵1h，得到骆驼发酵乳。将清洗后的恰玛古、库鲁木提切成小块，分别添加3倍纯净水，缓慢加热，在98℃的条件下保温浸提，浸提时间为37min，浸提次数为3次，多次浸提后过滤，得到恰玛古浸提液和库鲁木提浸提液,冷却至室温备用。将清洗后的白萝卜和清洗去皮后的荸荠切成小块，分别加入2倍纯净水榨汁破碎，经40目震荡筛过滤3次，在温度120℃的条件下超高温瞬时灭菌15s，得到荸荠汁和白萝卜汁，冷却至室温备用。将上述步骤得到的骆驼发酵乳、19份恰玛古浸提液、17份库鲁木提浸提液、13份荸荠汁和9份白萝卜汁进行混和搅拌，经混和制得骆驼乳酸饮料。
实施例八：
新鲜采集的150份骆驼乳采用巴氏杀菌的方式进行灭菌处理，灭菌温度80℃，灭菌时间10s，灭菌后迅速冷却至室温，加入9份木糖醇，接种5份乳球菌混合发酵剂，初期在41℃下发酵8h,后期降温至35℃，接种3份香味菌混合发酵剂，在35℃条件下发酵1.5h，在41℃下发酵8h,得到骆驼发酵乳。将清洗后的恰玛古、库鲁木提切成小块，分别添加3倍纯净水，缓慢加热，在100℃的条件下保温浸提，浸提时间为40min，浸提次数为3次，多次浸提后过滤，得到恰玛古浸提液和库鲁木提浸提液,冷却至室温备用。将清洗后的白萝卜和清洗去皮后的荸荠切成小块，分别加入2倍纯净水榨汁破碎，经40目震荡筛过滤3次，在温度120℃的条件下超高温瞬时灭菌15s，得到荸荠汁和白萝卜汁，冷却至室温备用。将上述步骤得到的骆驼发酵乳、20份恰玛古浸提液、20份库鲁木提浸提液、13份荸荠汁和10份白萝卜汁进行混和搅拌，经混和制得骆驼乳酸饮料。
实施例九：清肺除霾的骆驼乳酸饮料制作工艺的优化试验
根据骆驼乳酸饮料的自身特性建立感官评分表，在上述实施例基础上，采用Box－Behnken试验设计，以骆驼乳酸饮料的感官评分为评价指标，考察原料初期的发酵温度、初期的发酵时间、浸提温度、浸提时间对骆驼乳酸饮料的感官评分的影响，并建立各因素与感官评分关系的响应面数学模型。
感官评分表见表3，响应面试验因素与水平表见表4。
表3：骆驼乳酸饮料感官评分表
Figure BDA0001270408420000201
表4：响应面试验因素与水平表
Figure BDA0001270408420000202
表5：响应面试验设计与结果
Figure BDA0001270408420000203
Figure BDA0001270408420000211
通过Design Expert8.0.6采用多元拟合的方法对表5的实验数据进行拟合，得到感官评分对发酵温度(A)，发酵时间(B)，浸提温度(C)，浸提时间(D)的二次多项回归模型为：感官评分＝+96.40+6.00A+2.25B+2.50C-2.25D+2.50AB-5.00AC-5.50AD+5.75BC+5.00BD+5.75CD-21.37A2-33.99B2-34.37C2-17.74D2，根据回归方程，作响应曲面图，考察所拟合的响应曲面的形状，分析发酵温度(A)，发酵时间(B)，浸提温度(C)，浸提时间(D)对骆驼乳酸饮料感官评分的影响，模型中各因素交互作用的响应面及其等高线参见附图3至附图14。
Box－Behnken试验优化出制备骆驼乳酸饮料的最佳工艺参数：发酵温度40℃、发酵时间7h、浸提温度95℃、浸提时间35min，在此条件下做验证试验，得到骆驼乳酸饮料感官评分最高为98分，与理论预测值相比，其相对误差约为0.51％，因此，基于Box－Behnken试验设计所得的最佳工艺参数准确可靠，具有实用价值。
通过响应面法优化骆驼乳酸饮料的制备工艺，以及通过系列试验得出制备工艺的最佳参数，即发酵温度为41℃、发酵时间为7h、浸提温度为95℃、浸提时间为35min。在此条件下，制备骆驼乳酸白色中带淡棕色，奶香味浓郁，酸度、咸中等，有淡中药味，感官评分最高达到98分。
实施例十：骆驼乳酸饮料对雾霾致肺部炎症的缓解效果验证实验
将上述实施例得到的骆驼乳酸饮料应用到动物实验中，评价本申请制备的骆驼乳酸饮料对于缓解雾霾致肺部炎症的效果，实验设计如下。
(1)PM2.5的采集和处理
在乌鲁木齐市中心选择高于十五层的建筑楼顶，要求周围无明显污染源，用ThermoAnderson G-2.5大流量采样器连续采集2016年10至2017年2月的大气PM2.5。将采有PM2.5的滤膜裁剪为1cm×3cm大小，浸入三蒸水中超声振荡30min×3次洗脱PM2.5，用12层纱布过滤振荡液，滤液冷冻真空干燥，低温保存备用。
(2)实验动物分组及染毒
选择40只Wistar大鼠，雌雄各半，4-6周龄，体重65-80g。在动物饲养室，分笼饲养，温度(21±1)℃，相对湿度40％～60％，自由进食、饮水，随机分为5组，每组8只，分别为空白对照组、模型对照组、骆驼乳酸饮料低剂量组、骆驼乳酸饮料中剂量组和骆驼乳酸饮料高剂量组。适应性饲养一周后，空白对照组和模型对照组每日灌胃生理盐水0.5ml/只，骆驼乳酸饮料低剂量组每日灌胃实施例三制备的骆驼乳酸饮料0.5ml/只，骆驼乳酸饮料中剂量组每日灌胃实施例三制备的骆驼乳酸饮料1.0ml/只，骆驼乳酸饮料高剂量组每日灌胃实施例三制备的骆驼乳酸饮料1.5ml/只。灌胃30天后，除空白对照组外，其他组分别进行PM2.5染毒，剂量为20mg/kg BW，对照组给予相同体积的生理盐水。以气管滴注的方式进行PM2.5染毒，滴注体积为2.5ml/kgBW，每周2次，连续暴露3个月。
(3)肺泡灌洗液的提取及处理
用止血钳夹闭左主支气管，暴露气管，剪一斜口，插入带有聚乙烯管的肺灌洗针头，结扎固定。缓慢注入0.5ml生理盐水，轻轻按揉胸部的同时缓慢抽出肺内的灌洗液，如此反复灌洗3次，得到支气管肺泡灌洗液(BALF)。灌洗液经4℃，1500r/min离心10min。上清液分装，保存于-80℃冰箱，采用双抗夹心酶联免疫法(ELISA)测定BALF中IL-6、IL-17、IL-10及TGF-β的含量。取下层细胞团，加入30μl PBS重悬细胞，取10μl细胞悬液用细胞计数板计数细胞总数。余下细胞悬液涂片，晾干后进行Giemsa染色，光镜下进行细胞分类计数，计数200个细胞，统计巨噬细胞，中性粒细胞和淋巴细胞百分比。
(5)统计方法
用SPSS19.0统计软件进行数据的录入和处理，实验结果用x±s表示，各组均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用最小显著差法(LSD)检验，检验水准α＝0.05。
(6)实验结果
细胞因子IL-6、IL-17、IL-10及TGF-β的含量比较结果表明见表6。
表6：细胞因子IL-6、IL-17、IL-10及TGF-β的含量比较
Figure BDA0001270408420000231
Figure BDA0001270408420000241
由表6可知，暴露于PM2.5后会使小鼠肺部的炎症因子显著偏离正常水平，本发明提供的骆驼乳酸饮料可以抵抗PM2.5诱导的肺部炎症，维持肺部的炎症因子不偏离正常水平。本发明其他实施例制备的骆驼乳酸饮料具有相似的活性。
综上所述，本发明通过从新疆阿克苏驴乳自然发酵酸奶中分离筛选出一株香味菌(Myroides sp.)L6和乳球菌(Lactococcus sp.)L122，利用分离出的两种菌种混合发酵，添加多种药食同源植物，采用保温浸提、榨汁破碎等一系列独特的制备工艺，提供一种清肺除霾骆驼乳酸饮料及其制备方法，有效的解决了现有清肺除霾食品感官品质差、制作工艺复杂的问题，制作出清肺除霾骆驼乳酸饮料口感绵密、奶香醇郁，对于呼吸道雾霾侵害有缓解作用，对食品加工技术领域具有广泛的实用性。
如上所述，即可较好地实现本发明,上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 天山牧歌投资管理有限公司
<120> 一种清肺除霾骆驼乳酸饮料及其制备方法和应用
<130> L6
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> L6
<220>
<221> L6
<222> (1)..(1422)
<400> 1
tggccctacg gaggctacac atgcaagtcg aggggtagaa ggagcttgct tctttgagac 60
cggcgcacgg gtgagtaacg cgtatgcaac ctaccttata caggggaata gcccgaagaa 120
attcggatta atgctccatg gtttaattga atggcatcat ttaattaata aagatttatc 180
ggtataagat gggcatgcgt atcattagct agttggtatg gtaacggcat accaaggcga 240
cgatgattag gggtcctgag agggagatcc cccacactgg tactgagaca cggaccagac 300
tcctacggga ggcagcagtg aggaatattg gtcaatggag gcaactctga accagccatg 360
ccgcgtgcag gatgacggtc ctatggattg taaactgctt ttgtacagga agaaacctcc 420
ctacgtgtag ggacttgacg gtactgtaag aataaggatc ggctaactcc gtgccagcag 480
ccgcggtaat acggaggatc cgagcgttat ccggaattat tgggtttaaa gggttcgtag 540
gcggtttgat aagtcagtgg tgaaatttct tagcttaact aagacacggc cattgatact 600
gttagacttg aatagtatgg aagtaactag aatatgtagt gtagcggtga aatgcttaga 660
tattacatgg aataccaatt gcgaaggcag gttactacgt acttattgac gctgatgaac 720
gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatggat 780
actagctgtt cggatttcgg tctgagtggc taagcgaaag tgataagtat cccacctggg 840
gagtacgttc gcaagaatga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900
catgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttaccag ggcttaaatg tagattgaca 960
gatttggaaa cagatttttc ttcggacaat ttacaaggtg ctgcatggtt gtcgtcagct 1020
cgtgccgtga ggtgtcaggt taagtcctat aacgagcgca acccctattg ttagttacca 1080
gcgcgttaag gcggggactc tagcaagact gccggtgcaa accgagagga aggtggggat 1140
gacgtcaaat catcacggcc cttacgtcct gggctacaca cgtgctacaa tggcaagtac 1200
agaaagcagc tacctggcaa caggatgcga atctcaaaag cttgtctcag ttcggatcgg 1260
agtctgcaac tcgactccgt gaagctggaa tcgctagtaa tcggatatca gccatgatcc 1320
ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcaa gccatggaag ctgggggtac 1380
ctgaagtcgg tgaccgcaag gagctgccta ggtaaagctg gc 1422
SEQUENCE LISTING
<110> 天山牧歌投资管理有限公司
<120> 一种清肺除霾骆驼乳酸饮料及其制备方法和应用
<130> L122
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1462
<212> DNA
<213> L122
<220>
<221> L122
<222> (1)..(1462)
<220>
<221> misc_feature
<222> (651)..(651)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
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ttgctctacc tttatgttga gtagagaacg ggtgagcaac gcgtgggtaa cctgccttat 120
agcgggggat aactattgga aacgatagct aataccgcat aacaatgtta gatgcatatt 180
taacatttgg gagtaccaat tggtacacta tgagatggac ccgcgttgta ttagctagtt 240
ggtagtgtaa tggactacca aggcgatgat acatagccga cctgagaggg tgatcggcca 300
cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga atcttcggca 360
atggacgaaa gtctgaccga gcaacgccgc gtgagtgaag aaggttttcg gatcgtgtca 420
ctctgttgtt agagaagaac gttgattaga gtggaaaatt aatcaagtcc cggtatctaa 480
ccagaaaggg acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt cccgagcgtt 540
gtccggattt attgggcgta aagcgagcgc aggtggttta ataagtctga tgtaaaaggc 600
agtggctcaa ccattgtgtg cattggaaac tgttagactt gagtggtcta naggagagtg 660
gaattccatg tgtagtcggt gaaatgcgta gatatatgga ggaacaccgg ttggcgaaag 720
cggctcttgg actgtcactg acctgaggct cgaacagcct gggtagcaaa caggattaga 780
tcccctgtag tccatgccgc cttatcctat gaagtgctag ttcaatgggg gctatccagg 840
ctaattgacg cagctacgca ttaagcactc cgcctgggat tacgaccgca aggttgaact 900
caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagca gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaatt 960
cgaagaacct taccaggtct tgacatactc gtgctattcc tagagatagg ccgttccttc 1020
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aagtcccgca acgagcgcaa cccttattgt tagttgccat cattaagttg ggcactctag 1140
cgagactgcc ggtaataaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt 1200
atgacctggg ctacacacgt gctacaatcg ttggtacaac gagttcgcaa gtacagtgat 1260
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ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaatac ccaaagccgg tgagctaacc 1440
ttttaggagg cagccgtcta ag 1462

Claims (8)

1.一种香味菌（Myroides sp.）L6，其特征在于，所述的香味菌（Myroides sp.）L6的菌种保藏号为CGMCC No.13634。
2.一种乳球菌（Lactococcus sp.）L122，其特征在于，所述的乳球菌（Lactococcus sp.）L122的菌种保藏号为CGMCC No.13633。
3.一种清肺除霾骆驼乳酸饮料，其特征在于，按照重量份数计，包括骆驼乳100份-150份、木糖醇3份-9份、恰玛古浸提液16份-20份、库鲁木提浸提液16份-20份、荸荠汁11份-13份、白萝卜汁3份-10份、乳球菌混合发酵剂3份-5份、香味菌混合发酵剂1份-3份、纯净水700份-1100份；
所述的乳球菌混合发酵剂是由如权利要求1中所述的香味菌（Myroides sp.）L6和如权利要求2中所述的乳球菌（Lactococcus sp.）L122按照重量比以2：5的比例复合制得；
所述的香味菌混合发酵剂是由如权利要求1中所述的香味菌（Myroides sp.）L6和如权利要求2中所述的乳球菌（Lactococcus sp.）L122按照重量比以3：1的比例复合制得。
4.一种清肺除霾骆驼乳酸饮料的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）制备发酵乳：按重量份数计，新鲜采集的100份-150份骆驼乳采用巴氏杀菌的方式进行灭菌处理，灭菌温度70℃-80℃，灭菌时间5s-10s，灭菌后迅速冷却至室温，加入3份-9份木糖醇，接种3份-5份乳球菌混合发酵剂，初期在40℃-41℃下发酵6h-8h，后期降温至33℃-35℃，接种1份-3份香味菌混合发酵剂，在33℃-35℃条件下发酵1-1.5h，得到骆驼发酵乳，所述的乳球菌混合发酵剂是由如权利要求1中所述的香味菌（Myroides sp.）L6和如权利要求2中所述的乳球菌（Lactococcus sp.）L122按照重量比以2：5的比例复合制得，所述的香味菌混合发酵剂是由如权利要求1中所述的香味菌（Myroides sp.）L6和如权利要求2中所述的乳球菌（Lactococcus sp.）L122按照重量比以3：1的比例复合制得；
（2）制备浸提液：将清洗后的恰玛古、库鲁木提切成小块，分别添加3倍纯净水，缓慢加热，在90℃-100℃的条件下保温浸提，浸提时间为30min-40min，浸提次数为2-3次，多次浸提后过滤，得到恰玛古浸提液和库鲁木提浸提液，冷却至室温备用；
(3)制备荸荠汁和白萝卜汁：将清洗后的白萝卜和清洗去皮后的荸荠切成小块，分别加入2倍纯净水榨汁破碎，经40目震荡筛过滤3次，在温度120℃的条件下超高温瞬时灭菌15s，得到荸荠汁和白萝卜汁，冷却至室温备用；
（4）混合：将上述步骤得到的骆驼发酵乳、与按重量份数计，16份-20份恰玛古浸提液、16份-20份库鲁木提浸提液、11份-13份荸荠汁和3份-10份白萝卜汁进行混和搅拌，经混和制得骆驼乳酸饮料。
5.如权利要求4所述的一种清肺除霾骆驼乳酸饮料的制备方法，其特征在于，所述的制备发酵乳步骤中的灭菌温度为75℃，灭菌时间为8s，初期时发酵温度为41℃，发酵时间为7h。
6.如权利要求4所述的一种清肺除霾骆驼乳酸饮料的制备方法，其特征在于，制备浸提液步骤中的保温浸提温度为95℃，浸提时间为35min，浸提次数为3次。
7.如权利要求3所述的一种清肺除霾骆驼乳酸饮料或权利要求4所述的一种清肺除霾骆驼乳酸饮料的制备方法任意一项所述的一种清肺除霾骆驼乳酸饮料在制备清肺除霾药物中的应用。
8.如权利要求3所述的一种清肺除霾骆驼乳酸饮料或权利要求4所述的一种清肺除霾骆驼乳酸饮料的制备方法任意一项所述的一种清肺除霾骆驼乳酸饮料在制备清肺除霾食品饮料中的应用。
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