HUT74928A

HUT74928A - Drink and a method of preparing it

Info

Publication number: HUT74928A
Application number: HU9601228A
Authority: HU
Inventors: Lene Molskov Bech; Thorkild Beenfeldt; Klaus Breddam; Robert Leah; Marianne Muldbjerg; Steen Bech Sorensen; Pia Vaag
Original assignee: Carlsberg As
Priority date: 1993-11-08
Filing date: 1994-11-08
Publication date: 1997-03-28
Also published as: AU8104894A; PL314262A1; JPH09505997A; BR9408008A; US5993865A; BG62351B1; FI961937A; ES2103626T3; WO1995013359A1; AU685530B2; HU9601228D0; DE69403092D1; NO961845D0; EP0728188A1; CZ290031B6; RO112763B1; EP0728188B1; JP3501808B2; CZ129296A3; CA2175908A1

Description

A találmány tárgya protein- és/vagy peptidtartalmú ital, amely gabona-LTP-t és/vagy a találmányban meghatározott gabona-LTP homológokat és/vagy gabona-LTP-ből és/vagy homológjaiból 3 és 7 közötti pH-értéknél, vízben végzett melegítéssel, forralással és/vagy cefrézéssel izolálható módosított gabona-LTP frakciót tartalmaz. A találmány további tárgya eljárás az említett ital előállítására, valamint habképző adalékanyag alkalmazása.

L' C <><.Λ —X

V

83738-1802-GI

	O4'Zz '		·♦ ·· .··. :···: / .· : : .··. /λ - ............/ ·Λ-
t .	/	KÖZZÉTÉTELI	ί·
	/	PÉLDÁNY
1	Képviselő:		Α
	^t)ANUBIA Szabadalmi	és Védjegy Iroda Kft.	ι¹·

ITAL ÉS ELJÁRÁS ELŐÁLLÍTÁSÁRA

Carlsberg A/S, Koppenhága, DK

Feltalálók:

BECH Lene Molskov, Smorum,

SORENSEN Steen Bech, Solrod Strand,

VAAG Pia, Lyngby,

MULDBJERG Marianne, Koppenhága,

BEENFELDT Thorkild, Glostrup,

LEAH Róbert, Birkerod,

BREDDAM Klaus, Glostrup,

Dánia

A bejelentés napja: 1994. 11. 08.

Elsőbbsége: 1993. 11. 08. (1266/93) DK

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/DK94/00420

A nemzetközi közzététel száma: WO95/13359

83738-1802-GI/gcs

‘ ITAL ÉS ELJÁRÁS ELŐÁLLÍTÁSÁRA

M

A találmány tárgya habzó ital, mint például sör, továbbá eljárás habzó ital előállítására, valamint eljárás habképző adalék alkalmazására.

Az italok fontos szerepet játszanak mindennapi életünkben, nemcsak mint nélkülözhetetlen folyadék- és tápanyagforrások, hanem mint serkentőszerek is. A jó minőségű italok esetében az iz mellett a szerkezeti tulajdonságok, mint pl. a viszkozitás és a habzási sajátság is lényeges.

Napjainkban számos habzó ital található a piacon, például a sörök, tejes turmixok és néhány alkoholmentes ital. Ennek ellenére szükség van új habzó italokra és az ismert habzó italok minőségének javítására.

A kutatók sok kísérletet végeztek a sörben lévő habképző szerek vizsgálatára és izolálására, illetve a sör habzóképességének javítására.

Több, mint 50 éve ismert, hogy a sör habzása prcteintartalmának köszönhető (ami egy átlagos sörben kb.

3-4 mg/ml koncentrációban van jelen), és a szabad lipidek és detergens gyökök károsak a sör habjának stabilitására.

Szásos kutató foglalkozott annak kiderítésével, hogy a hab stabilizálásában mely proteinjellegű komponens játszik

83738—1802—GI

···· szerepet (Anderson. F.B. és Harris, G. , Nitrogenous constituents of brewing materials, XII. Foam-stabilizing substances in beer, J. Inst. Brew., 69. 383-388, 1963; Asano, K. és Hashimoto, N., Isolation and characteriztion of foaming proteins of beer, J. Am. Soc. Brew. Chem., 38. 129-137, 1980; Bishop, L.R., Haze- and foam-formlng substances in beer, J. Inst. Brew., 81. 444-449, 1975;

Slack, P.T. és Bamforth, C.W. The fractiation of polypeptides from barley and beer by hydrophobic interaction chromatography: The influence of their hydrophobicity on foam stability, J. Inst. Brew., 89. 397-401, 1983), de nem sikerült egyértelmű választ adni erre a kérdésre. A sörben a hab szempontjából lényeges proteinként több, különböző molekulatömeg-tartományba eső proteint vetettek fel (Asano, K. és Hashimoto, N. ld. fentebb; Hollemans és Tonies, The role of specific proteins in beer foam, Proc. Eur. Brew. Conv., 22nd Congress, Zürich, 561-568. old., 1989; Yokoi, S. Maeda, K. Xiao, R. Kamada, K. és Kamimura, Μ. , Characterization of beer proteins responsible fór the foam of beer, Proc. Eur. Brew. Conv. 22nd Congress, Zürich, 503-412. old., 1989).

A sör proteinjeinek molekulatömeg-tartománya a kisméretű polipeptidektől a 150000 D feletti molekulatömegű proteinekig terjed, azonban a legfeljebb 100000 D molekulatömegű sör - proteinekről bizonyosodott be, hogy pozitív hatást gyakorolnak a sör habjának stabil miközben kisméretű (különösen az

5000 D alatti

molekulatömeggel rendelkező) polipeptidekről úgy tartják, hogy negatív hatást gyakorolnak a habra (Dalé, C.J. és Young, T.W., Low molecular welght nltrogenous components and their influence on the stability of beer foam, J. Inat. Brew., SS, 123-127, 1992; Whitear, A. L. , Basic factors that determine foam stability, The Institute of Brewlng, Australia and New Zealand Section, Proc. 15th Conv., New Zealand, 67-75. old., 1978). Sharpé és mtsi. kutatásai (Rapid methods of measuring the foam-active nltrogenous componenst of worts and beers, Proc. Eur. Brew. Conv., 18th. Congress Copenhagen, 607-614. old., 1981) azt mutatták, hogy a sör habjának stabilitása összefüggésben van a nagy és kis molekulatömegű polipeptidek arányával. A specifikus proteinek jelentőségét mérlegelve

Yokoi és mtsi. (ld.

fentebb) megállapították, hogy a hab stabilitásában a protein

Z (egy 40 kD-os árpa albumin) Játszotta a legfontosabb szerepet. Ez ellentétes Hollemans és Tonies protein Z specifikus, rögzített antitestekkel végzett teljes és szelektív eltávolítása csak kis hatást gyakorolt a hab stabilitására.

Kimutatták, hogy élesztőből származó nagy molekulatömegű (elsősorban szénhidrát természetű) komponensek szintén nagy koncentrációban vannak jelen a sör habjában (Hejgaard,

J. és Sorensen, S.B., Characterization of a protein-rich beer fraction by two dimensional immunoéléctrophoretic techniques, Compt. Rend. Trav. Láb. Carlsberg, 4Ώ, 187-203, • « ·

1975: Mohán, S.B., Smith, L., Kemp, W. és Lyddiatt, A., An immunchemical analysis of beer foam, J. Inst. Brew., 98. 187-192, 1992).

A felsorolt következtetésekre a sör-proteinek frakcionálása és a különböző frakciók stabil habot létrehozó képessége alapján jutottak. A kutatások egyike sem irányult a sör habja minőségének javítására.

A hab minőségét illetően két lényeges tényezőt kell figyelembe venni: a hab kialakításának, és a hab stabilizálásának képességét.

Meglepő módon felfedeztük, hogy a gabona-LTP (Cereal-LTP) elnevezésű proteincsoport rendelkezik azzal a képességgel, hogy italokban habot hozzon létre.

Ilyenformán, találmányunk az 1. igénypontban jellemzett proteineket és/vagy peptideket tartalmazó italra vonatkozik.

A gabona-LTP lipidszállító proteinek (Lipid Transfer Protein) elnevezésű, gabonafélékből származó proteineket jelent. Az I. táblázatban több ilyen gabona-LTP és egyéb növényi LTP-k szekvenciáját mutatjuk be. E proteinek részletesebb leírását Id. Molina és mtsi., An immunochemical analysis of beer foam, J. Inst. Brew., 98. 187-192 (1992).

A növényi lipidszállító proteinek aminoeav-szekvenciáinak

w '0

N

Ό Ű Φ ‘<Ö ι—I

ÍŰ to 'Λ <ü

CLTP: VLTCGQVTGALAPCLGYLSRQVNVPVPLTCCNVVRGLNNAARTTLDKRTACGC-LKQTANAVTGLNLNAAAGLPARCGVNIPYKISPTTDCNRW

Q	z	co	co	co	co	co			X	co	co
cl.		E-	<	<	<	<	id	£	P	CL.	CL.
co	ω	co	co	co	co	co	co	ω	co	co	co
LH	M	LH	LH	LH	LH	LH	LH	>-4	>	LH	LH
6-	E-	E-	E-	<	E-	<	CL.	p.	a.	id	<
>	>	>·	>	ί-		>	LH		u.	>	>
p.	cu	a.	9-	α,	a.	9<	X	z	o	CL.	a.
E>		LH	>	. Ί	5>		LH	M		LH	LH
χ	z	CO	co	E	co	co	Q	>	Sd	χ	X
		>	>		>	>	S·	>	LH		5-
§	8	8	8	8	8	8	8	8	ö	U	8
id		id	id	az	az	X		id	<	>	X
10	CL.	co	co	o	co	CO	£	><		CO	o
CL.	CL.	CL.	CL.	CL,	CL.	CL.	CL.	cl.	CL.	Q.	CL.
LH	LH	LH	LH	LH	LH	LH	J	J	LH	►H
CO	co	co	co	CO	o	o	CO	co	id	e	o í
<	5	3	3	co <	í		co <	co <	co •J	í
	x	X	X	id	az			<	u,	id	id
	Q	e	e	o	a	o	Q	o	8	X	o
í	ω	<	<	<	<	-c	o	ω	•j	>
X	X	X	X	X	X	id	az	id	Q	X
	j			lJ	I	1	LH	LH	LH	LH	LH
X		c	o	o	\|	1	E-	X	ü	o	o
□X	£	co	id	CO	1	1	cl.	Cd	J	id	id
LH	lh	>	LH	>	>	J	(x.	>«	co	LH	LH
o	O	e	o	az	<	o	E	az	id	<	<
az	<5	<	a	co	O	e		<.	co	X	*y
<	<	<	<	<	<		<	<	co	<
1—1	t—<	<	<	í	>	<í	<	<		<	<
O	o	X	z	co	CO	co	<	E-	1	co	CO
	χ	S2	52	id	id	id	2	id	id	^c	id
vJ	u t	u 1	u	J co o	.J	LH	LH	>	U1	U) «	J
o	1 ω	1 o	1 o	1	ó	1 CJ	CJ	1 o	1	1 o

	«—(
&	Cm E-	&
		.J
m

&

« az

CO rH .H <N δ δ < m υ ΟΙ l l E£

J co • · • · · · ·

A táblázatban használt rövidítések Jelentése:

BLTP:	árpaszemekből származó LTP;
WLTP:	búzából származó LTP;
MLTP:	kukoricából származó LTP;
RiLTP:	rizsszemekből származó LTP;
RaLTP:	Indián finger kölesből (ragi) származó LTP;
Cwl8:	árpalevélből származó LTP;
Cw21:	árpalevélből származó LTP;
CB-A:	ricinusból származó LTP;
CB-B:	ricinusból származó LTP;
CB-C:	ricinusból származó LTP;
TLTP:	paradicsomból származó LTP;
SLTP:	spenótból származó LTP;
CLTP:	répából származó LTP;

A homológ elnevezés olyan 50-110 aminosavas, elsősorban

80-100 aminosavas proteinekre vonatkozik, amelyek szekvenciája a gabona-LTP szekvenciájával legalább 60 %-os, előnyösen 80 %-os vagy nagyobb mértékű homológiát mutat.

Különösen	lényeges a szerkezeti rokonság. A homológ
proteinek	előnyösen legalább hat ciszteint, előnyösen 8
ciszteint	tartalmaznak, miáltal a molekulában 3 vagy 4

diszulfid híd alakulhat ki.

Az előnyös homológ proteinek a TLTP, SLTP, CLTP, CB-A, CB-B és CB-C.

• · · ·

Találmányunkban a gabonamagvakból származó LTP az előnyös.

Különösen előnyös gabona-LTP az árpaszemekből származó árpa-LTP, melyet az I. táblázatban BLTP-vel, a példákban LTP1-gyei jelölünk.

A BLTP bázikus protein, amely az árpaszemek aleuron rétegében halmozódik fel (Mundy, J. és Rogers, J.C.,

Selective expression of a probable amylase/protease inhibitor in barley aleurone célIs: Comparison to the barley amylase/subtilisin inhibitor,

Plánta, 169.

51-63,

1986;

Skriver, K. és mtsi., Structure and expression of the barley lipid transfer protein gene

Ltpl, Plánt. Mól. Bioi., 18.

585-589, 1992). Ez a protein aminosavból áll (köztük 8 ciszteinből), molekulatömege 9694 D, (Svensson, B. és mtsi., A 10 kD barley seed protein homologous with an alfa-amylase inhibitor from indián finger millet, Carlsberg Rés. Commun., Ül, 493-500, 1986). A BLTP aminosav-szekvenciáját Svensson és mtsi. határozták meg (ld. fentebb). A BLTP-t klónozták, és meghatározták egy cDNS nukleotid-szekvenciáját (Mundy, J. és Rogers, J.C., ld. fentebb).

A találmány leírásában a gabona-LTP vagy alcsoportjai (mint pl. árpa-LTP) kifejezés, a fentebb meghatározott homológokra is vonatkozik, melyek szekvenciája homológ az említett LTP csoportéval. Ezenkívül, a gabona-LTP vagy alcsoportjai kifejezés az említett LTP-ből vagy homológjaiból melegítéssel, forralással és/vagy cefrézéssel kialakítható • · · ·

- 8 módosított gabona-LTP frakciókat is magában foglalja. A gabona-LTP előnyösen nem teljesen denaturált, vagyis a oisztein gyökök diszulfid-hidakat kialakító képessége miatt megfigyelhető bizonyos strukturáltság.

Amikor a gabona-LTP-t a későbbiekben leírtak szerint melegítésnek, forralásnak és/vagy cefrézésnek vetjük alá (ami a sörfőzésnél általános lépés), lényegében teljes primer szerkezetét megtartja, míg a szekunder és tercier szerkezete kisebb-nagyobb mértékben megváltozik, illetve a diszulfid-hidak közül néhány vagy mind átrendeződhet. A sörfőzés folyamán az árpa LTP1 metionin aminosava gyakran oxidálódik. Megfigyeltük, hogy LTP dimerek és LTP oligomerek is kialakulnak, feltehetően az LTP-ben lévő egy vagy több diszulfid-híd átrendeződése útján. Amint később leírjuk, az LTP a forralási lépés alatt egyéb komponensekkel (pl. hordein fragmensekkel, komlóval és lipidekkel) kombinálódhat.

A módosított gabona-LTP-t előnyösen a normális gabona-LTP vizes oldatban, 50-95 °C-on legfeljebb 3 óra hosszat végzett melegítéssel vagy légköri nyomáson legfeljebb két órás forralással és/vagy a sörgyártás cefrézési lépésével állítható elő.

A továbbiakban a gabona-LTP kifejezés, ha másképpen nem Jelezzük, magában foglalja a gabona-LTP homológjait, a módosított gabona-LTP-t és a módosított homológokat is.

• ·

- 9 A találmány szerinti ital bármilyen iható folyadék (például tej vagy gyümölcs alapú ital vagy sör) lehet.

Mivel az ismert sörökben a gabona-LTP kis mennyisége (kb. 50 mg/1) található, az 1. igénypontban erre nem igényeltünk oltalmat.

A sörgyártás (vagy ahogy korábbról ismert, a sörfőzés) részletes leírása megtalálható az idevonatkozó irodalomban, ld. pl. D.E. Briggs, J.S. Hough, R. Stevens és T.W. Young, Malting and Brewing Science, I. kötet, Chapman and Hall, London. 1981; és II. kötet. Chapman and Hall, London, 1982), melyekben nyersanyagok és eljárások számos variációját írják le. Az eljárás általában az alábbi A) - D) lépésekből áll.

A) A nyersanyagok kiválasztása és előkészítése

A nyersanyag vizet; szénhidrátokat és proteineket (melyek a gabonafélékben találhatók, pl. rozsban, búzában, rizsben, kukoricában, cirokban); cukrot; szirupokat; malátakivonatot, a gabonák (árpa és búza) malátázása során képződött vagy mikrobiológiai termeléssel előállított enzimeket; ízesítő anyagokat (pörkölt maláta, komló és egyéb növényi anyagok vagy levek) tartalmaz.

A gabona nyersanyagok lehetnek malátázottak, őröltek vagy elkülönítettek (a specifikus ízzel és enzimaktivitással rendelkező komponensek kialakítása érdekében).

• · · · · ··· · ··

- 10 B1 Cefrézés: sörcefre előállítása

Az előkészített nyersanyagok kontrollált hőmérsékleten és ideig végzett áztatásával történő extrakció, melynek során a cefrét forralják és elválasztják az oldhatatlan anyagoktól.

C) A cefre erjesztése

A hideg, levegőztetett cefréhez élesztőszuszpenziót adnak. A szabályozott hőmérsékleti feltételek mellett az élesztő anyagcsere (fermentáció) a cefrét sörré alakítja, amely élesztők által termelt komponenseket, például alkoholt és ízanyagokat tartalmaz. Ez a lépés a hőmérséklet szabályozásával, az élesztő adagolásával és tenyésztésével kontrollálható.

Dl. Derítés és utókezelés

Állás és érlelés után a megmaradt élesztőt és protein/tannin üledékeket leszűrik, és a sört szén-dioxiddal, színező és egyéb Javító adalékokkal, például stabilizálószerekkel és ízanyagokkal egészítik ki.

A sörkészítők	jól tudják, hogy a kizárólag malátázott
árpából vagy	malátázott búzából készített sör nagyobb
habzóképességű	és Jobb stabilitású habot képez, mint a
kiegészítőkkel	főzött sör.

• ·· ·

Korábban a legjobb habképző tulajdonságú sör gabona-LTP-tartalmának vizsgálatával kimutatták, hogy a gabona-LTP koncentrációja 300 mg/l-nél sokkal kevesebb volt.

A sörhab minősége a sörfőzési eljárástól és az alkalmazott nyersanyagoktól függ. A sör gabona-LTP tartalma legnagyobbrészt az EBC [európai sörgyártási egyezmény] standard cefrézési eljárása szerint előállított sörcefrében található gabona-LTP-vei függ össze. A nem malátázott gabonák esetében hasonló kivonási (exrakció) eljárás alkalmazható, szükség esetén normális szintű sörfözési enzimaktivitás hozzáadásának beiktatásával.

A sörgyártáshoz szánt, ismert édes sörcefrében gabona-LTP-ként elsősorban LTP1 vagy csekély mértékben módosított LTP1 van Jelen. A módosítás mértéke az előállítási eljárástól függ. Az EBC standard cefrézési eljárással előállított sörcefrében található gabona-LTP kb.

%-a kimutatható módosítatlan LTP1 elleni antitestek alkalmazásával végzett ELISA vizsgálattal (melyet a későbbiekben leírt standard eljárás szerint végzünk).

Ismert sörben a gabona-LTP koncentrációja kevesebb, mint X, és Jóval kevesebb, mint XI. X és XI az olyan nyersanyagokból főzött sörben található koncentrációkat Jelenti, amelyekből az EBC standard cefrézési eljárás alkalmazásával 125 /ug/ml-nek, illetve 150 /Ug/ml-nek megfelelő gabona-LTP koncentrációjú EBC standard sörcefre állítható elő (a ···· ·· • · · · · • ·· ··· · · • ·..· ...· ··:·

- 12 koncentrációt módosítatlan LTP1 elleni antitestek alkalmazásával végzett ELISA vizsgálattal határoztunk meg).

Az első sörcefre kifejezés a cefrézési lépés után végzett első szűrési lépésben kapott sörcefrére vonatkozik. Az első szűrési lépés a szúrőpogácsa (tömörített szűrési maradék) mosása előtti szűrési lépést jelenti.

Az édes sörcefre kifejezés az utolsó szűrési lépés után, vagyis a szűrőpogácsa vízzel végzett mosása után kapott sörcefrére vonatkozik. Ennek megfelelően, az édes sörcefre az első sörcefre és a mosáshoz alkalmazott víz elegye.

Az EBC standard sörcefre kifejezés az EBC standard cefrézési eljárás szerint előállított sörcefrére vonatkozik.

A sörcefre kifejezés a cefrézés, szűrés és forralás után kapott végső sörcefrét jelenti.

A sörcefrében jelenlévő lényegében valamennyi gabona-LTP megtalálható a sörcefréből készült sörben. 1 ml sörcefréből rendszerint 1-2 ml sört kapunk. Ez azt jelenti, hogy egy 125 /ug/ml gabona-LTP-koncentrációjú sörcefréből legfeljebb 125 /.jg/ml gabona-LTP-koncentrációjü sört nyerhetünk.

Az EBC standard cefrézési eljárását illetően ld. ANALYTICA-EBC, IV. kiadás, E59. old., Brauerei und GetrankeRundschau, CH-S047, Zürich, Svájc, 1978.

• · ·· ·

- 13 A találmány szerinti ital legalább 25 /Ug/ml gabona-LTP-t tartalmaz, de adott esetben a gabona LTP, és különösen a gabonaszem-LTP koncentrációja 100 ^ug/ml vagy több.

A gabona-LTP szekvenciális szerkezete alapján ismerhető fel.

A gabona-LTP koncentrációja a gabona-LTP enzim-kötött immunszorbens vizsgálatával (ELISA) mérhető. Ilyen gabona-LTP ELISA a piacon nem áll rendelkezésre, de az alábbi standard technikával kialakítható, melynek során

a) egy állat immunizálásával gabona-LTP elleni antitestet állítunk elő, a termelt szérumot összegyűjtjük és tisztítjuk az antitestet;

b) biotiniláljuk az antitestet;

c) pl. spektrofotométerrel mérhető komponens alkalmazásával végzett kompetitív ELISA vizsgálattal LTP standard görbét készítünk.

Az ELISA eljárások, melyek a bioaktív komponensek mérésének egyik legáltalánosabban használt módszerét képezik, a szakemberek számára ismertek. Az ELISA. vizsgálatok általános leírását ld. P. Vaag, The Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) in the Beverage Industries: Principles and Practice. In Analysis of Nonalcoholic Beverages. Modern Methods of Plánt Analysis, 8. kötet (szerk.: Linskens, H.F. és Jackson,

J.F.), Springer-Verlag, Berlin, 1988).

A találmány szerinti ital előnyösen tartalmaz hordeint, «··· ·· ·· ··· · · • · ····

- 14 glutelint, egyéb albuminokat, mint pl. a sörből nyerhető protein Z-t és/vagy komló komponenseket, mint pl. a komló izo-alfa savakat és a komló egyéb keserű gyantáit. Ezek a komponensek habstabilizáló hatással és a gabona-LTP-vel szinergikus habképző hatással rendelkeznek.

A találmány szerinti ital tartalmazhat szénhidrátokat, lipideket és/vagy zsírsavakat is. Ezek a komponensek javítják az ital ízét és konzisztenciáját.

A fentebb említett komponensek némelyike (pl. a hordein, a komlókomponensek és a lipidek) az LTP-vel együtt forralva összekapcsolódhatnak vele. A komlókomponensekkel és/vagy trigliceriddel együttes forralással módosított gabona-LTP fokozott habképző tulajdonsággal rendelkezik.

A találmány szerinti ital kis mennyiségben további

összetevőket	is tartalmazhat, például stabilizátorokat
(alginsavak,	alginát, gliceridek, gumiarábikum, pektin),
mesterséges	édesítő, ízesítő szereket, színezékeket,
vitaminokat,	ásványi anyagokat, tartósítószereket,
effervescens	(pezsgést előidéző) szereket, antioxidánsokat

és enzimeket, elsősorban protein-lebontó és szénhidrát-lebontó enzimeket.

Abban az esetben, ha a találmány szerinti ital sör, gabona-LTP-tartalma (az összes proteintartalomra vonatkoztatva) előnyösen 5 (m/m) % feletti, előnyösebben 10 (m/m) % feletti, még előnyösebben 15 (m/m) % feletti. A módosított gabona-LTP tömegét a megfelelő mennyiségű módosítatlan gabona-LTP tömegeként számítjuk, vagyis a gabona-LTP-hez kapcsolódó többi komponens tömegét nem vesszük figyelembe.

A találmány további tárgya eljárás proteint és/vagy peptidet tartalmazó ital előállítására. Ezt az eljárást a 11. igénypontban jellemezzük.

- 15 A gabona-LTP-t bármilyen alakban hozzáadhatjuk az italhoz, feltéve, hogy legalább részben oldható.

A gyakorlatban a gabona-LTP-t őrölt vagy vagy gabonakivonat alakjában alkalmazzuk.

aprított gabona

Ilyen kivonat többféleképpen például a gabonák vagy alkotórészeik folyadékban végzett forralásával és/vagy cefrézésével, és kívánt tisztítással és adott esetben a szűrlet frakcionálásával.

A folyadék előnyösen komlót és/vagy lipideket, elsősorban triglicerideket tartalmazhat. A kivonatot száríthatjuk is, például liofilizálással vagy porlasztva szárítással.

A gabona-LTP módosított alakban, a példákban leírt módon, sörből is nyerhető.

A gabona-LTP mikroorganizmusokból, például genomjukban gabona-LTP-t kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó élesztőkből, gombákból vagy baktériumokból is előállítható. Mivel számos, • ·»· ··· · te· • · · ·· ··· ·

- 16 gabona-LTP-t kódoló DNS-szekvencia ismert, a szakemberek az ilyen DNS-szekvenciákat ismert technikák alkalmazásával baktériumok, élesztők vagy gombák genomjába építhetik. Élesztőként pl. Saccharomyces carlsbergensis vagy S. cerevisiae alkalmazható.

A gabona-LTP pl. az italban végzett fermentációs (erjesztési) lépésben gabona-LTP-t termelő mikroorganizmussal állítható elő. Ha az italt nem erjesztjük, a gabona-LTP-t előnyösen tisztított, oldható kivonat alakjában adjuk az italhoz.

A gabona-LTP természetesen tisztított, oldható kivonat alakjában is hozzáadható az erjesztett italhoz, de ilyen esetben — mivel az erjesztett italok előállítási eljárása rendszerint szűrési lépést is tartalmaz — a gabona-LTP kivonat tisztítására nincs szükség.

A gabona-LTP-t bármely előállítási lépésben hozzáadhatjuk az italhoz, akár egy adagban, akár (folyamatosan vagy szakaszosan) kis részletekben.

Abban az esetben, ha az ital sör, a gabona-LTP például a maláta vagy maláta kivonat előállítási lépésében adható az italhoz, oly módon, hogy a nagy LTP-tartalom elérése érdekében (például genetikai módszerekkel) javított gabonamagvakból készítünk malátát.

A gabona-LTP a sörcefre előállítása során is hozzáadható az italhoz, például őrölt vagy aprított gabonaanyag, elsősorban a cefrézési lépés előtt adagolt őrölt gabonaszemek formájában.

A találmány további tárgya a gabona-LTP alkalmazása italokban, habképző adalékanyagként. Erre az alkalmazásra a 21-23. igénypontokban kérünk oltalmat.

találmány szerinti alkalmazás esetén a gabona-LTP-t előnyösen egyéb komponensekkel (belértve a proteineket) együtt alkalmazzuk, de a gabona-LTP az összes proteintartalom legalább 15 (m/m) %-át, legelőnyösebben 25 (m/m) %-át teszi ki. A módosított gabona-LTP tömegét a megfelelő mennyiségű módosítatlan gabona-LTP tömegeként számítjuk, vagyis nem vesszük figyelembe a gabona-LTP-hez kötött egyéb komponensek tömegét.

A találmányt részletesebben a példákban írjuk le.

Az ábrák rövid leírása

Az 1 ábrán 1,65 liter sörhöz alkalmazott, boroszilikát üvegből készített habtorony látható.

A 2. ábrán világos sör harmadik flotálása után összeesett hab (50 mM ammónium-acetáttal [pH = 4,5] ekvilibrált) Sephadex G-75 oszlopon (5 x 87 cm, 1700 ml) végzett

• · · · · gélfiltrációjának eredményét mutatjuk be.

A 3. ábrán a habzóképesség LMW koncentrációjától való (habzási vizsgálatban mutatott) függőségét mutatjuk be.

A 4. ábrán a hab felezési idejének 0,3 mg/ml LMW-t tartalmazó vízben a HMW koncentrációjától való függőségét mutatjuk be.

Az 5/A ábrán a HMW, LMW és árpa-LTPl SDS-poliakril-amid gélelektroforézisének (20 %-os homogén gél, Phast-system, Coomassie Blue R 350 festés) eredményét mutatjuk be (Ml és M2: molekulatömeg markerek). Az 5/B ábrána HMW, LMW és árpa-LTPl árpa-LTPl elleni specifikus antitestek alkalmazásával végzett Western biot analízisének eredménye látható.

A 6. ábrán az LMW (20 mM Na-acetáttal [pH - 4,9] ekvilibrált) S-Sepharose Fást Flow (5x7 cm, 135 ml) végzett ioncserélő kromatográfiás vizsgálatának eredményét mutatjuk be. A szaggatott vonal a NaCl gradienst, a folytonos vonal a 280 nm-nél mért abszorbanciát Jelzi.

A 7. ábrán növekvő koncentrációjú I. frakcióelegyet (Pool

I), III. frakcióelegyet (Pool III) vagy LTPl-et tartalmazó vízzel végzett habzóképesség vizsgálat eredményei láthatók. Az oldott protein koncentrációját aminosav-analízis alapján számítottuk.

- 19 A 8. ábrán növekvő koncentrációjú I. frakcióelegyet (Pool

I), III. frakcióelegyet (Pool III) vagy LTPl-et tartalmazó sörrel végzett habzóképesség vizsgálat eredményei láthatók.

Az oldott protein koncentrációját aminosav-analízis alapján számítottuk.

A 9. ábrán növekvő koncentrációjú árpa LTPl-et (önmagában

vagy 0,4	mg/ml Pool I jelenlétében) tartalmazó vizes
oldatokkal	végzett habzóképesség vizsgálat eredményei
láthatók.	Az oldott protein koncentrációját aminosav-

-analízis alapján számítottuk.

A 10. ábrán növekvő koncentrációjú Pool Ill-at (önmagában

-analízis alapján számítottuk.

A 11. ábrán világos sör harmadik flotálásából izolált Pool III 20 mM Na-acetát és 0,1 M NaCl (pH = 4,9) elegyével ekvilibrált Sephadex G-50 oszlopon végzett gélfiltrációs analízisének eredményét mutatjuk be.

A 12/A és 12/B ábrán az árpaszem LTP1, illetve a sörhabból származó LTP1 ^ΧΗ NMR spektrumát mutatjuk be.

• · · · · · • ·· ··· · · ·· · ····· ·· ··· ·

- 20 A maláta előállítása

Az alábbi példákban alkalmazott malátát világos malátaként készítettük.

EBC standard sörcefre előállítása EBC standard cefrézési eljárással úrlés g malátát darálással megőrőltünk, és 50 g lisztet cefréző edénybe tettünk.

Az őrlést Bühler-Miag tárcsás darálóban végeztük, melyben a tárcsák közötti távolság 0,2 mm volt.

Cefrézés

A cefréző fürdő hőmérsékletét kb. 45 °C-ra állítottuk be.

A cefréző edénybe (a csomósodás elkerülése érdekében üvegpálcával végzett keverés mellett) 200 ml, kb. 46 °C-os desztillált vizet öntöttünk, ügyeltünk arra, hegy a cefre hőmérséklete pontosan 45 °C legyen.

Az edényt azonnal a cefréző fürdőbe helyeztük, és beindítottuk a keverőt. A cefrében a hőmérsékletet pontosan percig 45 ’C-on tartottuk, majd 25 percig, percentként 1 °C-kal növeltük.

• · • · · · • ·

- 21 Amikor a cefre hőmérséklete elérte a 70 ^eC-ot, további 100 ml, 70 ’C hőmérsékletű desztillált vizet adtunk hozzá. A hőmérsékletet egy órára 70 ’C-on tartottuk. Ezután a cefrét 10-15 perc alatt szobahőmérsékletre hűtöttük, a keverőt kevés desztillált vízzel lemostuk, az edény külső felületét megszárítottuk, és tartalmát — desztillált víz hozzáadásával — 450,0 g-ra állítottuk be.

Szűrés

A cefréző edény térfogatát üvegpálcával alaposan felkevertük, és közvetlenül ezután maradéktalanul szűrőpapírra öntöttük.

A szúrlet első 100 ml-ét visszaöntöttük a tölcsérbe.

A szűrést akkor fejeztük be, amikor a szűrőpogácsa már száraznak tűnt, vagy — lassú szűrés esetén — két óra élteiével.

Analitikai eljárások

Az árpa-LTPl azonosítása (Western biot ana.lízis.1

Az SDS-poliakril-amid gélelektroforézist (SDS-PAGE) — a minta 15 percig 10 mM ditio-treitollal végzett forralása után — Pharmacia Phast-System és 20 %-os homogén gél alkalmazásával hajtottuk végre. A gélről Phast-System készülékben, 70 °C-on 30 percig nitrocellulóz membránra • · • · • · · · lenyomatot készítettünk. A nitrocellulózt vízzel mostuk, a nem specifikus kötődés gátálása érdekében 30 percig borjúszérummal inkubáltuk, majd egy éjszakán keresztül LTPl-specifikus antitestekkel inkubáltuk (az antitesteket a

8. példában leírtak szerint állítottuk elő). A specifikus antitestek kötődésének detektálásához Promega Western biot AP rendszert (katalógusszám: W3930) alkalmaztunk. A szín előhívásához az alkalikus foszfatázhoz szubsztrátként nitro blue tetrazolt használtunk.

(N-terminális aminosav-szekvenálás)

Az N-terminális aminosav-szekvenálást Applied Biosystems model 470A gázfázisú szekvenálókészülékkel végeztük, amelyhez a társaság által rendelkezésre bocsátott programot használtunk. A szekvenálókészülékből kapott fenil-tio-hidantoinnal Jelölt aminosavakat Applied Biosystems model 120A fenil-tio-hidantoin analizáló berendezés alkalmazásával közvetlenül reverz fázisú HPLC-vel azonosítottuk.

Az aminosav-összetételt 110 ’C-on 24 óráig vákuum csövekben 6M sósavban végzett hidrolízis után LKB model Alpha Plus aminosav analizáló készülékkel határoztuk meg.

A_ szénhidráttartalom meghatározása

A szénhidráttartalmat a fenol/kénsav módszerrel határoztuk meg (Dubois, M. Gilles, K.A., Hamilton, J.K., Rebers, P.A.

···

- 23 és Smith, F., Colorimetric method fór determination of sugars and related substances, Anal. Chem., 28. 350-356, 1956).

A proteintartalom meghatározása

A proteintartalmat az aminosav-analizisek alapján vagy Bradford festék-kötési eljárásával (Bradford, N.M., A rapid and sensitive method fór the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem. , 72. 248-254, 1976) határoztuk meg.

Habvizsgálat

A habzóképesség és a hab felezési idejének meghatározásához digitális videó képelemzés akalmazásával optoelektronikus habvizsgálati rendszert (Haugsted, C. és Erdal, K., Head hunting, Proc. Eur. Brew. Conv., 23rd. Congress. Lisbon 1991. 449-456. old.; Haugsted, C. , Pedersen, M.B. és Erdal,

K., An optoelectrical foam assay system. Monatsschr.

Brauwissenschaft 43, 336-339, 1990) használtunk. A vizsgálatokat 10 ml mintával végeztük. A habzóképesség (P; foam potential) a kialakult hab minta térfogatára (ml-ben) vonatkoztatott mennyisége (ml-ben) kezdetben. A hab felezési ideje (F) az az idő (másodpercben), amely alatt a haboszlop kezdeti térfogata felére csökken. A habtartalom a habzóképesség és a térfogat (ml-ben) szorzata. A kromatográfia után kapott frakciókat vagy egyesített • · frakciókat (pool-ok) a habvizsgálatok vagy az ammónium-acetát eltávolítása érdekében végzett liofilizálás előtt

Spectra/por^R dializáló membránokon (3500 D-os átengedés!

határ) desztillált vízzel szemben dializáltuk. A habvizsgálatokat négyszeres ismétléssel végeztük.

A C0₂-ot tartalmazó palackozott sörök habvizsgálatához habstabilitás analizálót (System Carlsberg) (Hallgren, L., Rosendal, I. és Rasmussen, J.N., Experiences with a new foam stability analyzer, System Carlsberg J. Am. Soc. Brew. Chem., 49, 78-86, 1991) alkalmaztunk. Az e módszerrel meghatározott hableülepedési felezési idő a hab sörré történő visszaalakulásának felezési idejét (másodpercben) Jelenti (150 g sör teljes felhabosítását követően). Ez a visszaalakulás (kb. 30 másodperces kezdeti lassulás után) lineáris folyamat (Rasmussen, J.N., Automated analysis of foam stability, Carlsberg Rés. Commun., 46, 25-36, 1981).

1. PÉLDA

Gabona-LTP izolálása és tisztítása árpaszemekből (LTP1) (a) eljárás kg árpalisztből (1992-ben, Dániában betakarított Alexis változat) tiszta árpa-LTPl-et izoláltunk, melynek során az árpalisztet 250 1 vízben 6,5-es pH-n 2 óra hosszat extraháltuk. Az elegyet 2 ’C-on egy éjszakára állni hagytuk, hogy elősegítsük az oldhatatlan anyagok kicsapódását. A • · · • · · ·· ·· · • · · · · · ···· · · · · ··· felülúszót ultraszűréssel 7 literre koncentráltuk, és 40 %-os telítettség eléréséig ammónium-szulfátot adtunk hozzá. 2 ’C-on 2-3 óra elteltével a csapadékot centrifugálással eltávolítottuk, és a felülúszóhoz 75 %-os telítettség eléréséig ammónium-szulfátot adtunk. 2 ’C-on 16 óra elteltével a kapott szuszpenziót centrifugáltuk, miáltal egy üledéket kaptunk, amely 2 ’C-on több hétig eltartható. Az üledék egynegyedét 500 ml vízben feloldottuk, 100 ’C-ra melegítettük, majd közvetlenül utána jégen lehűtöttük. Az oldatot a kicsapódott anyagok eltávolítása érdekében centrifugáltuk és Spectra/por^R dializáló membránon (3500 D-os átengedési határ) vízzel szemben dializáltuk. Centrifugálás után a dializátum pH-Ját NaOH hozzáadásával 7,0-ra állítottuk be, és 20 mM Na-foszfáttal (pH = 7,0) ekvilibrált CM cellulóz oszlopon (5 cm x 5 cm, 500 ml) ioncserélő kromatográfiát végeztünk. Western biot analízis alapján kimutattuk, hogy az LTP1 a 0 M és 0,1 M közötti NaCl gradienssel eluálódott. Az árpa-LTPl-et tartalmazó frakciókat összeöntöttük, Spectra/'por^R dializáló membránon vízzel szemben dializáltuk, és 20 mM HEPES pufferrel (pH = 7,0) ekvilibrált S-Sepharose Fást Flow oszlopra (5 cm x 5 cm, 300 ml) töltöttük. Az árpa-LTPl-et az ekvilibráló pufferben 0 M és 0,3 M közötti NaCl gradienssel eluáltuk. Az árpa-LTPl-et tartalmazó frakciókat (melyeket Western biot analízissel azonosítottunk) összeöntöttük, Spectra/por^Rdializáló membránon desztillált vízzel szemben dializáltuk, majd liofilizáltuk. A Leu-Asn-*-Gly-Gln-Val-Asp-Serszekvenciát (ahol a csillag üres helyet Jelöl, amely az • · • · ·· ·· ·· ···

- 26 LTPl-ben található clsztein-gyöknek felel meg) eredményező N-terminális aminosav-szekvenálás azt mutatta, hogy az izolált LTP1 tiszta.

í.b.) el.iárás

Ezt az eljárást az (a) eljáráshoz hasonlóan végeztük, azzal a különbséggel, hogy a melegítési lépést elhagytuk.

Az (a) és (b) eljárással készített LTP-k között sem a habzási, sem az immunreaktivitási tulajdonságban nem találtunk különbséget.

2. PÉLDA

LTP1 tisztítása sörhabból

Boroszilikát üvegből folytonos habtornyot készítettünk (ld.

1. ábra). 15 liter világos sörből (vagy 1,65 literből, mely esetben az alábbiakban említett vegyszerek mennyiségeit ^x/s hányadra csökkentettük), egy éjszakán keresztül, percenként 450 ml nitrogénngáz átbuborékoltatásával habot készítettünk. A nitrogéngázt a habtoronyba való bevezetés előtt vízgőzzel telítettük. A kifolyónál összegyűjtött habot hagytuk összeesni, majd desztillált vízzel a sör eredeti térfogatára hígítottuk, és újra visszaöntöttük a habtoronyba. A fentiek szerint második és harmadik flotálást is végeztünk, és a világos sör harmadik flotálása után összegyűjtött habról megállapítottuk, hogy az eredeti sör • · • · ·· ·· • · « ·· · · · ·· • · · · * ····· ··«· V · ·· ··· ·

- 27 habtártalmának 35 %-át tartalmazta.

Az utolsó flotálás után kapott összeesett habban lévő komponenseket 50 mM ammónium-acetáttal (pH = 4,5) ekvilibrált Sephadex G-75 oszlopon (5 cm x 87 cm, 1700 ml) végzett gélfiltrálással molekulatömegük szerint különítettük el. A Sephadex G-75 oszlopon végzett gélfiltrálás (280 nm-nél mért abszorbció alapján) három csúcsot eredményezett (2. ábra). A három csúcs közül kettőt (ld. 2. ábra) HMW-nek, illetve LMW-nek neveztünk el.

A HMW frakció kb. 90 % szénhidrátot és proteint és 10 % proteint, míg az LMW frakció kb. 90 % % szénhidrátot tartalmaz. A harmadik csúcs kis molekulatömegú vegyületeket, pl. aminosavakat, izohumulonokat és szénhidrátokat tartalmaz.

Az LMW frakció és az egyesített frakciók aminosav-összetétele a jól ismert árpa lipidszállító protein (LTP1) aminosav-összetételére emlékeztetett (Svensson, B. és mtsi., ld. fentebb) (II. táblázat). Az LMW frakció SDS poliakril-amid gélelektroforézisével, Coomassie Blue R 350 festékkel 6-18 kD tartományba eső foltot mutattunk ki (5. ábra). Árpa-LTPl elleni specifikus antitestek alkalmazásával végzett Western biot analízissel kimutattuk, hogy az árpa-LTPl (9,7 kD) képezi az LMW egyik fő komponensét. Ezt N-terminális aminosav-analízissel igazoltuk.

Az LMW aminosav-összetétele a Pro és Glx tekintetében túl nagy értékeket mutatott az árpa-LTPl-hez képest (Svensson, • · · ····· ·· ·· ··· ·

B. és mtsi.. ld. fentebb) (II. táblázat), ami feltehetőleg a hordein és glutelin fragmensek Jelenlétének köszönhető; az SDS-PAGE elektroforézis utáni ezüst-festéssel kimutatott folt ilyen fragmenSeket reprezentálhat.

Az LMW-hab frakciót az ammóium-acetát eltávolítása érdekében liofilizáltuk. A 15 liter világos sörből kapott LMW-hab frakcióból S-Sepharose Fást Flow oszlopon végzett ioncserélő kromatográfiával LTPl-et tisztítottunk (6. ábra). Az LMW frakciót 20 mM Na-acetáttal (pH = 4,9) ekvilibrált oszlopra (5 x 7 cm, 135 ml) vittük, és mosás után az ekvilibráló pufferben 0-0,3 M NaCl gradiens felvitelével az LTP1 egy széles csúcsban (Pool II-IV, 6. ábra) eluálódott. Az átfolyt frakciót és (a Western biot analízis alapján) LTPl-et tartalmazó frakciók három elegyét (Pool II-IV) Spectra/por^Rdializáló membránon (3,5 kD-os átengedési határ) desztillált vízzel szemben dializáltuk és liofilizáltuk.

Ultrafilter: DDS-GR81PP, Dow Filtrations, Dánia; Spectra/por^R: Spectrum Medical Industries, Inc., USA; CM-cellulóz: Whatman Biosystems Ltd., Anglia;

S-Sepharose Fást Flow: Pharmacia, Svédország;

Sephadex G-75: Pharmacia, Svédország.

» · ·· ···· · • · ········ • · ·· · ···· ···· ·· ·· ··· ·

II. TÁBLÁZAT

Az LWW S-Sepharose Fást Flow kromatográfiásából származó egyesített frakciók (pool-ok)

	I. eg:	II. yesitett	III. frakció	IV.	LMW	LTP1®·
Asx	(mól %)		7,8	11,5	14,3	14,5	12,6	16,5
Thr	(mól %)		6,1	4,3	3,8	3,8	4,5	3,3
Ser	(mo1 %}		6,7	7,3	7,8	7,8	7,4	8,8
Glx	(mól %)	20,7	13,7	10,2	9,6	13,3	6,6
Pro	(mól %)		9,6	8,5	7,8	7,9	8,1	6,6
Gly	(mól %)		7,1	8,5	9,6	9,6	8,9	9,9
Alá	(mól %)		7,3	6,3	5,5	5,8	6,1	4,4
^X/2	Cys (mól	%)	4,3	6,5	7,6	7,5	6,4	8,8
Val	(mól %)		6,8	6,9	6,4	6,1	6,6	6,6
Met	(mól %)		2,2	1,6	1,3	1,2	1,6	1,1
Ile	(mo1 %)		3,7	4,6	5,1	5,0	4,7	6,6
Leu	(mól %)		7,8	7,8	7,4	7,2	7,5	6,6
rr» *	(mo1 %)		1,7	2,1	2,5	2,5	2,3	3,3
	(mo1 %)		2,5	1,5	0,6	0,6	1,2	0
Hi =	(mól %)		1,2	1,7	1,8	2,0	1,7	2,2
Lys	í mo1 %)		2,0	3,3	3,6	4,1	3,3	4,4
Ar =	(mól %)		2,5	4,1	4,6	5,0	4,1	4,4
V* ··“ ·	Lein. (mg)		87	33	190	38	392
Szénhidrát (mg)	24,0	1,3	0	0	25,6
	felezési	idő^to
	sodperc)		356	44	68	54	172

·· ·· ·· ···· · • ·· ·· ·· · • · · ·· ··· ·· • · ·· · ····· ···· ·· 4· ··· «

II. TÁBLÁZAT (folytatás)
	I. II. egyesített	III. frakció	IV.	LMW LTP1*
Habzóképesség¹»
(ml hab/ml minta)	1,3 1,1	1,5	0,8	1,3
Habtartalom	378 73	685	63	1260

“ Svensson és mtsi. (ld. fentebb) munkájából származó adatok ^to 280 nm-nél 0,5-es abszorbancia-értékkel rendelkező vizes oldatokkal mért értékek.

Az abszorpciós küszöb csúcs és a három, széles csúcsot képező pool savas hidrolízis után végzett aminosav-analízise (II. táblázat) kimutatta, hogy az abszorpciós küszöb csúcs frakciói a nagy Glx- és Pro-tartalommal rendelkező hordeinekre és glutelinekre emlékeztető aminosav-összetételt mutatnak, míg a NaCl gradienssel eluálódott széles csúcs az aminosav-analízis (II. táblázat) és az N-terminális aminosav-szekvenálás eredményei alapján sokkal inkább tiszta LTPl-nek tűnik, bár SDS-PAGE elektroforézissel ezekben a frakciókban is kimutathatók voltak 6-18 kD molekulatömeg-tartományba tartozó, Coomassie festődést mutató vegyületek. A hordein/glutelin tartalmú abszorpciós küszöb frakció (Pool I) és az LTP1 frakciók (Pool II-IV) vízben egyaránt jó habzóképességű habot hoztak létre (ld.

II. táblázat), de az LTP1 frakciók esetében a hab felezési ···· · ideje (a hordein/glutelin frakciókkal ellentétben) nagyon alacsony volt (II. táblázat). A négy frakcióélégyben a habtartalom számítása azt mutatta, hogy az LMW esetében tapasztalt habtartalom 95 %-a volt megfigyelhető bennük (II.

táblázat.)

- 31 2/A PÉLDA

A III. frakcióelegy (Pool III) frakcionálása

A 2. példában leírtak szerint világos sörből kapott III. frakcióelegyet (pool III) 0,1 M NaCl-ot tartalmazó 20 mM Na-acetáttal (pH - 4,9) ekvilibrált Sephadex G-50 oszlopon (2,6 c 67 cm, 330 ml) végzett gélfiltrálással molekulatömeg szerint frakcionáltuk. Ez az elválasztás 280 nm-nél mért abszorpció alapján két csúcsot (pool A és pool B) eredményezett (11. ábra).

Nem redukáló körülmények között végzett SDS-PAGE elektroforézissel és árpa-LTPl elleni specifikus antitestek alkalmazásával végzett Western biot analízissel kimutattuk, hogy A csúcs főleg dimer alakaú

LTP-ből állt, de nagyobb multimer alakok is jelen voltak, a

B csúcsot viszont kizárólag monomer LTP1 alkotta.

2/B PÉLDA

Elkészítettük az árpából izolált LTP1 (1. példa, (b) eljárás), illetve a sörhabból izolált LTP1 ^XH NMR spektrumát. Az ^XH NMR spektroszkópiát 310 K (37 ’C) hőmérsékleten, 4,0 pH-η végeztük. A kapott spektrumokat a ·· ·· ·· «··· · • ·· ·· ·· · • · · ·· ··· · · • · · · · · ··♦· ···· ·· ·· ··· ·

- 32 12/A és 12/Β ábrán mutatjuk be.

Az árpaszemből származó LTP spektruma (12/A ábra) a főleg alfa-hélix másodlagos szerkezetű globuláris proteinekre Jellemző ^XH NMR spektrumot mutat. Ezt a 4,8 ppm alatti kémiai eltolódással rendelkező alfa-H magok döntő többsége Jelzi. Ezenkívül, az NMR Jelek diszpergálódása egyértelműen arra utal, hogy a protein Jelentős része felgombolyodott (földed) szerkezetű, és Jól definiált másodlagos szerkezettel rendelkezik.

A COSY (korrelációs spektroszkópia),

TOCSY (teljes korrelációs spektroszkópia) és NOESY (nukleáris Overhauser spektroszkópia) spektrumok részletes analízise alapján bebizonyosodott, hogy a árpaszem LTP1 Jól definiált

A sörhabból származó LTP spektruma (12/B) olyan proteinekre Jellemző, amelyek lényegében vagy részben nincsenek felgombolyodva” , és gyakorlatilag nincs másodlagos és harmadlagos szerkezetük. Azt a következtetést vontuk le, hogy a sörből izolált LTP1 többé-kevésbé denaturált.

3. PÉLDA

LTP1 tisztítása az első sörcefréből

Világos sör előállításából első sörcefrét a Carlsberg sörfőzdéből kaptunk. A sörcefrét az oldhatatlan anyagok ···· · • ·· ·· · · · • · · ·· ··· · · • · ·· · ····· • · · · ·« ·· ··· ·

- 33 eltávolítása érdekében

Sorwall

RC3 centrifugával, percenkénti

4000-es fordulattal 30 percig centrifugáltuk. A felülúszóhoz %-os végkoncentrációban ammónium-szulfátot adtunk, és °C-on 16 óra elteltével a képződött szuszpenziót percenkénti 4000-es fordulattal 30 percig centrifugáltuk. Az üledéket 300 ml vízben feloldottuk, és 2 x 60 ml elegyet 50 mM ammónium-acetáttal (pH = 4,5) ekvilibrált Sephadex G-75 oszlopon (5 x 87 cm, 1700 ml) gélfiltrációs kromatográfiának vetettünk alá. Az elúciós mintázat hasonló volt az összeesett hab esetében kapott gélfiltrációs mintázatához (2. ábra). Az elegyített LMW frakciókat az ammónium-acetát eltávolítása érdekében liofilizáltuk, vízben feloldottuk, dializáltuk, majd 20 mM

Na-acetáttal (pH - 4,9) ekvilibrált S-Sepharose Fást Flow oszloponon (5x 7 cm) ioncserélő kromatográfiának vetettük alá. Az LTPl-et azonos pufferben 0-0,3 M NaCl gradienssel

eluáltuk. Az	elúciós profil hasonló volt a habból izolált
LMW frakció	frakcionálásakor kapott, 6. ábrán látható
profilhoz. A	pool Ill-at képező frakciókat elegyítettük,
Spectra/por^R	dializáló membránon (3,5 kD-os átengedés!

határ) desztillált vízzel szemben dializáltuk, majd liofilizáltuk. A módosított és módosítatlan LTP1 koncentrációját aminosav-analízissel határoztuk meg.

4. PÉLDA

A 2. példában leírtak szerint világos sörből kapott HMW és LMW frakciókat vízben mutatott habképzési tulajdonságukra teszteltük. Az eredményeket a III. táblázatban mutatjuk be.

·· · · ·

III. TÁBLÁZAT

A HMW és LMW vizes oldatainak habzási képessége (P) és a hab felezési ideje (F)

(ug/ml)	LMW	HMW (ug/ml)
0	0,3	0,6
75	P	(ml hab/ml minta)	0,56±0,04	0,63±0,04 0	,68+0,03
	F	(másodperc)	199 ± 15	251 ± 67 236 ± 26
150	P	(ml hab/ml minta)	0,89+0,05	0,95±0,03 0	,97±0,03
	F	(másodperc)	177 + 14	251 + 27 309 ± 30
300	P	(ml hab/ml minta)	1,34±0,02	1,34+0,09 1	,40±0,01
	F	(másodperc)	185 ± 32	251 + 18 251 + 29
600	P	(ml hab/ml minta)	1,89±0,08	l,99±0,15 1	,83+0,05
	F	(másodperc)	208 ± 61	258 ± 65 239 + 10
		LMW		HMW (ug/ml)
(ug/ml)		1,2	: 2	,4
75	P	(ml hab/ml minta)	0,69 ±	0,06 0,75	± 0,05
	F	(másodperc)	300 ±	3 313	+ 71
150	P	(ml hab/ml minta)	1,04 ±	0,03 1,09	± 0,05
	F	(másodperc)	276 ±	8 293	± 37
300	P	(ml hab/ml minta)	1,41 ±	0,05 1,47	± 0,06
	F	(másodperc)	290 ±	39 290	+ 29
600	P	(ml hab/ml minta)	2,01 ±	0,09 2,10	±0,07
	F	(másodperc)	263 ±	102 277	± 24

• · ··· · '

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az LMW frakció koncentrációja (függetlenül a HMW koncentrációjától) nagy hatást gyakorol a habzási képességre. Ezt a III. táblázat adatainak felhasználásával készített 3. és 4. ábrán is szemléltetjük.

5. PÉLDA öt különböző, habzóképességükben eltérő, világos sörből LTPl-et izoláltunk. Az LTP-t 1,65 liter sörből, lényegében a

2. példában leírtak szerint nyertük, azzal a különbséggel, hogy az S-Sepharose Fást Flow oszlopon végzett frakcionálás helyett csak Mono S oszlopon végeztük az elválasztást.

A világos söröket különböző árpaváltozatokból főztük, az alábbiak szerint:

A: Blenheim

B: Caruso

C: Grit

D: Eminant

Kevert: ismeretlen árpaváltozatok keveréke

Az eredményeket a IV. táblázatban mutatjuk be.

·* ···· ·

IV. TÁBLÁZAT

A különböző árpaváltozatokból főzött világos sörök habstabilizáló frakcióinak vizsgálata

Maláta	Keverék®·	A	B	C	D
Sör P (ml hab/ml minta)	0,72	1,13	1,13	1,44	1,20
F (másodperc)	181	200	189	258	179
Habtartalom/1 sör	715	1130	1130	1440	1200
2. flotálás
Protein-kinyerés (%)	32	21	32	30	31
Habtartalom/1 sör	240	490	360	670	520
HMW Protein (m/m %)	16	12	8	15	14
Szénhidrát (m/m %)	84	88	92	85	86
LMW Habtartalom/1 sör	210	160	190	270	210
Protein (m/m %)	86	76	71	76	85
Szénhidrát (m/m %)	14	24	29	24	15
Mono S^b Átfolyt frakció	25	10	40	8	8
(protein %)
Eluátum frakció	75	90	60	92	92
(protein %}

^& Komlót nem használtunk ^b Ioncserélő gyanta (Pharmacia, Svédország).

• · • · · ·· ··· ·· • · · · · · · · · ···· ·· ·· ··· ·

6. PÉLDA

Az 1. példa (b) eljárásában leírtak szerint árpalisztből izolált LTP1, illetve a 2. példában leírtak szerint világos sörből nyert I. és III. frakcióelegy alkalmazásával habzási vizsgálatokat végeztünk. A kísérletekhez desztillált vizet, illetve sörként Carlsber világos sört alkalmaztunk.

Mindegyik tesztben 10 ml vizet vagy sört alkalmaztunk, és a frakcióelegyeket (pool-ok), ill. az LTP-t közvetlenül a hab (fentebb leírtak szerinti) kialakítása után adagoltuk.

Ha az izolált LTP1, Pool

I vagy Pool III növekvő koncentrációit oldottuk vízben, illetve sörben, az oldatok a habzási vizsgálatokban egyre nagyobb habzási képességet mutattak (7. és

8. ábra), bár a söroIdátok esetében a habzási képesség fokozódása (8.

ábra) kevésbé volt kifejezett, mint a vizes oldatok esetében (7. ábra), feltehetően azért mert a sörben már eredetileg is Jelen voltak habképződés szempontjából pozitív komponensek.

Alacsony protein-koncentrációknál a sör LTP1 frakció (Pool

I) adagolásának hatása nagyobb volt, mint a hordein/glutelin frakciókat tartalmazó frakció (Pool I) esetében. Az árpalisztből izolált LTP1 a sörhöz hozzáadva növelte annak habzási képességét (8. ábra) és — csekély mértékben — a hab felezési idejét. Az LTP1 növekvő koncentrációinak habzóképességre gyakorolt hatása (5. példa) a sörből izolált LTP1 (Pool III) esetében kifejezettebb, mint az árpából

izolált LTP1 esetében (8. ábra). A desztillált vízben 0,4 mg/ml koncentrációjú I. frakcióélegyei, árpából vagy sörből izolált (III. frakcióelegy) LTP1 növekvő koncentrációjával végzett habvizsgálattal megerősítettük a fenti megfigyelést (9. és 10. ábra). Az I. frakcióelegy Jelenlétében az árpa-LTPl habzási képességre gyakorolt hatása kisebb volt, mint a hasonló koncentrációjú III. frakcióelegyé.

7. PÉLDA

Az LTPl-koncentráció meghatározása ELISA vizsgálattal

Árpa-LTPl elleni antitestek előállítása

Két nyulat standard immunizálási módszerrel (Dako, Glostrup, Dánia), immunizálásonként (az 1. példa (a) pontjában leírtak szerint Alexis árpalisztből izolált) árpa-TLPl 100 ug-jával immunizáltunk.

Az első injekció beadása után 54 nappal, majd havonként mindkét állatból 20-20 ml szérumot vettünk.

Az alábbiakban leírt kísérletek során az egyik állat első vérvételekor kapott szérumot alkalmaztuk.

Az antitestek tisztítása

Az immunglobulin G (IgG) osztályba tartozó antitesteket

Protein

A-Sepharose oszlopon (Pharmacia,

Uppsala, • · ·

- 39 Svédország), a gyártó útmutatásai szerint végzett affinitás kromatográfiával megtisztítottuk az egyéb szérumkomponensektől.

Az LTPl-et felismerő antitesteket egy kis oszlopon (melyet úgy készítettünk, hogy árpából származó LTPl-et kovalensen

Sepharose-hoz kapcsoltunk) elválasztottuk az egyéb specifitású antitestektől. 64 mg árpa-LTPl-et 0,1 M NaHCOa és 0,5 M NaCl elegyében (pH = 8,3) oldottunk, és 2 g CNBr-dal aktivált Sepharose 4B-hez (Pharmacia, Svédország) kapcsoltuk (a gyártó útmutatásai szerint). Az immunszorbens 1 ml-ét kisméretű oszlopba töltöttük és 10 mM Na-foszfát és 150 mM NaCl elegyével (pH = 7,3) (PBSio) ekvilibráltuk. A protein A-Sepharose oszlopon tisztított IgG frakciót felvittük az oszlopra, és az ekvilibráló pufferrel addig mostuk, amit az Α2βο érték el nem érte a 0,002-t. A kötött

IgG-t 4 térfogatnyi 10 x

PBSio pufferrel hígított

0,5 M hangyasavval (pH

4,0) eluáltuk, és a pH-t nátrium-hidroxiddal 4,0-re állítottuk be.

A mintát végül

Spectra/por^R membránon (3,5 kD átengedés!

határ)

PBSio pufferrel szemben dializáltuk, és az alábbiak szerint biotiniIáitűk.

Az antitestek biotinilálása ml PBSio pufferben 10 mg antitestet 0,1 ml 1 M nátrium-karbonát pufferrel (pH = 9,5) elegyítettünk. Az antiesteket ezután DMSO-ban (dimetil-szulfoxid) készített 57 • · • · · ·· ··· · · • · ·· · ····· ···· ·· ·· ··· ·

- 40 ul 0,1 M BXNHS [N-hidroxi-szukcinimid-(biotin-amido-kapronsav)-észter] (Sigma, USA, katalógusszám: 2643) eléggyel biotiniláltuk. Az elegyet szobahőmérsékleten egy órára állni hagytuk, majd az elreagálatlan BXNHS-t eltávolítottuk, és a puffért PBSio pufferrel ekvilibrált, kisméretű Sephadex G-25 oszlopon (PD-10, Pharmacia, Uppsala, Svédország), a gyártó útmutatásai szerint végzett gélfiltrálással PBSio-re cseréltük. A reagens antitest-koncentrációját PBSio hozzáadásával 1 mg/m-re állítottuk be (10 ml végtérfogatban). 100 mg szarvasmarha szérumalbumin (BSA) hozzáadása után a reagenst kis adagokban -20 °C-on tároltuk.

Enzim-kötött Immunszorbena Vizsgálat (ELISA) LTP meghatározásához

Az LTP mennyiségét kompetitív ELISA vizsgálattal határoztuk meg.

Tisztított árpa-LTP-t polisztiron üregek belső felületéhez adszorbeáltunk. Az üregeket 12-es csíkokban rendeztük el, és a csíkokat egyenként 8 csíkot tartalmazó keretbe helyeztük (Nunc Immuno Modulé C12 Maxisorb, Nunc, Dánia). Valamennyi üreghez az 1. példa (a) részében leírtak szerint nyert, hígított LTP1 oldat (100 ng/ml PBSio) 200 ul-ét adtuk, és 4 °C-on 16-20 órán át inkubáltunk. Az inkubálás után a polisztirol felületen megmaradt kötőhelyeket (az egyes üregek 37 ’C-on 1 óráig 225 ul BSA/PBST eleggyel [1 mg • ·

BSA/ml PBST, ahol a PBST 0,05 % Tween-20-at tartalmazó PBSio-et Jelent] végzett inkubálásával blokkoltuk. Az üregeket ezután kiürítettük, és a polisztirol csíkokhoz passzoló manuális mosóberendezés (Nunc Immuno Wash 12, Nunc, Dánia) alkalmazásával hatszor mostuk, majd felhasználásig -20 °C-on tároltuk.

A vizsgálat előtt az LTPl-et tartalmazó mintákat BSA/PBST elegyben hígítottuk, és az 1. példa (a) részében leírt módon, azonos pufferben standard LTP1 oldatokat készítettünk. Az oldatokhoz 100 ng/ml koncentrációban árpa-LTPl-specifikus biotinilált antitesteket adtunk. Az elegyek 200 ul-es részleteit 37 °C-on 1 órán keresztül az üregekben inkubáltuk. Valamennyi mintát vagy standardot háromszori ismétléssel vizsgáltuk. Inkubálás után az üregeket kiürítettük és a fentiek szerint mostuk.

A következő lépésben az üregekben 200 ul, BSA/PBST elegyben 250 ng/ml koncentrációjúra hígított sztreptavidin - torma peroxidáz konjugátumot (Sigma, USA, Kát. sz.: S 5512) inkubáltunk (20-22 ’C, 10 perc). Ezt követően az üregeket ismét kiürítettük és mostuk.

Végül mindegyik üreghez foszfát-citrát pufferben (pH - 5,0) 3,3',5,5'-tetrametil-benzidint (TMB, 100 ug/ml) és 0,015 % hidrogén-peroxidot adtunk, és 20-22 °C-on 10 percig inkubáltunk. Az enzimreakciót az üregekben egyenként 125 ul 4N HC1 hozzáadásával állítottuk le, és a 96 üregű kerethez

passzoló spektrofotométerben (Perkin-Elmer Lambda Reader) mértük az abszorbanciát (450 nm-nél).

Valamennyi vizsgálatsorozatban 8000-62,5 ng/ml koncentráció-tartományba eső árpa-LTPl standardokat alkalmaztunk. A abszorbanciát az LTP1 koncentrációja függvényében ábrázolva standard görbét készítettünk, és a mintákban az LTP1 koncentrációit e görbéhez viszonyítva számítottuk.

Az antitestek snecifitása

Az árpa-LTPl ellen fentiek szerint kialakított és tisztított antitesteket árpa- és maláta-kivonatok, sörélesztő és sör Western biot analíziséhez is felhasználtuk. Az LTPl-en és a módosított LTPl-en kívül más komponensekkel nem tapasztaltunk reakciót.

Az ELISA vizsgálatokban az antitestek felismerték az első sörcefréből származó LTPl-et vagy módosított LTPl-et, az árpából származó LTP-l-et azonban kevésbé. Az alacsonyabb reaktivitás a cefrézési, erjesztési és habképző folyamatok során bekövetkező módosításoknak köszönhető. Az aminosav-analízissel meghatározott koncentrációkkal (3. példa) összehasonlítva, az első sörcefréből származó LTPl-gyel mutatott reakció nagysága kb. 65 %-a volt az árpalisztből nyert LTPl-gyel (ld. 1. példa, a/ eljárás) mutatott reakció nagyságának. Az EBC standard sörcefréből származó LTPl-gyel vagy módosított LTPl-gyel mutatott • ·

- 43 reakció nagysága az árpalisztből nyert LTPl-gyel mutatott reakció nagyságának kb. 90 %-a volt. Mivel a standard görbét az árpalisztből izolált árpa-LTP alapján készítettük, az LTP1 vagy módosított LTP1 EBC standard sörcefrében lévő tényleges mennyiségét úgy határozhatjuk meg, hogy az árpa-LTPl standard görbe alapján becsült értéket 10/9-del szorozzuk.

8. PÉLDA

Az LTP adagolása a sörcefre előállítása alatt

A sörcefréhez a forralási lépés során hozzáadott LTP hatásának vizsgálatához modellt készítettünk. Az édes sörcefrét visszaáramlásos hűtőhöz csatlakoztatott gömbölyűaljú lombikban, melegítő burkolat alkalmazásával 90 percig forraltuk. Két típusú kísérletet végeztünk: a) a forralás megkezdésekor az 1. példa (a) részében leírtak szerint nyert tiszta árpa-LTPl-et (Alexis, Dánia, 1992) (0,5 mg/ml) és/vagy komlókivonatot (61 mg alfa-sav/1) adtunk a sörcefréhez: és b) a forralt vagy forralatlan sörcefréhez komlókivonattal (61 mg alfa-sav/1) vagy anélkül tiszta árpa-LTPl-et adtunk, de nem forraltuk.

• ·

- 44 V. TÁBLÁZAT

Hozzáadott Habzóképesség LTP nélkül	LTP hozzáadásával (0,5 mg/ml)	Habzóképesség
Édes sörcefre 0,37 + 0,01	Édes sörcefre	0,75 ± 0,05
Forralt sörcefre	Forralás előtt a	sörcefréhez
komló nélkül 0,91 + 0,06	adott LTP,	1,15 ± 0,02

komló nélkül

Komló nélkül forralt sörcefréhez

		adott LTP	1,24 ± 0,09
Komlóval	forralt	Forralás előtt a	sörcefréhez
sörcefre	1,68 ± 0,07	adott LTP,
		komlóval együtt	2,15 ± 0,02
		Komlóval forralt	sörcefréhez
		adott LTP,	1,93 ± 0,17

9. PÉLDA

A Carlsberg 50L Pilot Plánt sörgyárban 60 % világos maláta és 40 % kiegészítőanyag (kukoricadara) alkalmazásával nagy koncentrációjú LTPl-et tartalmazó sört készítettünk. A Carlsberg sörgyárak szabványa szerinti kukoricadarát alkalmaztunk: víztartalom: < 12,5 % szárazanyagtartalom: > 89 % zsírtartalom (száraz tömeg): < 1,0 % • · ···· • · · ♦ · · · * • · · ·· ··· · · • · · · · · ···· ···· ·· *· ··· ·

- 45 A kukoricadara Pfungstadter szitával végzett osztályozás

A sörgyárban a nyersanyagokat cefréztük és a sörcefrét 90 percig forraltuk (10 %-os párologtatással). A sörcefre forralásának megkezdése után 15 perccel a cefrézőüstbe nyeres LTP1 készítményt adtunk. Ezt a készítményt 1992-ben, Dániában betakarított Alexis árpaváltozatból készült 6 x 25 kg árpalisztből készítettük. Az árpalisztből készített kivonatot a fentebb leírtak szerint ultraszűréssel bekoncentráltuk és ammónium-szulfáttal kicsaptuk. A csapadékot 5 liter vízben feloldottuk, diafiltrációval 850 ml koncentrációra töményítettük, majd 100 ’C-ra felmelegítettük és közvetlenül utána Jégen lehűtöttük. Az oldatot Sorwall RC3 centrifugában 30 percig percenkénti 4000-es fordulattal centrifugáltuk. A felülúszóban az LTP1 koncentrációja (ELISA vizsgálat alapján)60 mg/ml volt. A cefrézőkádhoz 800 ml felülúszót adtunk. Az utolsó sörcefre

14,5 % Plató volt. A főzetet kúpos hengeres tartályokban Carlsberg sörélesztővel (Sacchromyces carlsbergensis) erjesztettük. A primer erjesztést 9 napig végeztük, majd az érés és a stabilizálás 10 napot vett igénybe. A sört végül leszűrtük és 10,6 % Plato-ra mérsékeltük.

A fentiek szerint készített sör, illetve az azonos körülmények között azonos nyersanyagokból, de LTP1 • · • · ·· · · · ·· • · · · ····· • · ·· ··· ·

- 46 hozzáadása nélkül főzött sör habzási képességét habstabilitás vizsgálóval (System Carlsberg) mértük. A nagy LTPl-koncentrációJú sör habjának felezési ideje a hozzáadott LTP1 nélküli sör 93 másodpercéről 113 másodpercre nőtt.

10. PÉLDA

Az LTP1 mennyisége az EBC standard sörcefrében (módosított és módosítatlan LTP1 mennyiségének összege)

Számos különböző, a sörgyártásban általánosan alkalmazott árpaváltozatból készítettünk malátát. Az árpaváltozatokat különböző területeken termesztették, illetve különböző években takarították be.

A malátát a világos sör előállításához fentebb leírtak szerint készítettük. A malátamintákból az EBC standard sörcefrét a fentebb leírt EBC standard cefrézési eljárással készítettük.

Az EBC standard sörcefrében az LTP1 mennyiségét (módosított és módosítatlan LTP1 összege) a fentebb leírt ELISA vizsgálattal határoztuk meg. összesen 82 sörcefre mintát (melyek 41 malátamintának felelnek meg) vizsgáltunk.

Az ELISA vizsgálatot a 7. példában leírtak szerint végeztük, és az LTP1 koncentrációját az árpa-LTPl standard görbéjének alkalmazásával (vagyis a korrekciós faktorai való szorzás nélkül) határoztuk meg.

• · ·

- 47 Az eredményeket az V. táblázatban soroljuk fel. Mindegyik érték két független EBC standard sörcefre átlagát Jelenti.

V. TÁBLÁZAT

Árpaváltozat Származási Betakarítás LTP mennyisége az EBC ország éve standard sörcefrében

Trlumph	Franciaország		65 mg/1
Ariéi			70 mg/1
ismeretlen	Ausztrália'		85 mg/1
ismeretlen	Németország	7	108 mg/1
Alexis	Egyesült Királyság 1992	66 mg/1
Triumph	Franciaország	1992	76 mg/1
Ariéi	Dánia	1992	82 mg/1
ismeretlen	Ausztrália	7	99 mg/1
ismeretlen	Ausztrália	7	96 mg/1
ismeretlen	Ausztrália	7	78 mg/1
ismeretlen	Anglia	7	118 mg/1
Natasha	Franciaország	1992	118 mg/1
Halcyon	Franciaország	1992	78 mg/1
BL.IIIs	7	1991	92 mg/1
Natasha	Franciaország	1992	104 mg/1
Natasha	Franciaország	1992	102 mg/1
Halcyon	Dánia	1992	109 mg/1
Caruso	Franciaország	1993	120 mg/1
Senor	Dánia	1993	70 mg/1
Alexis-81	Dánia	1993	82 mg/1

• · • · • · · ·· ··· ·· • · · · · ····· ···· · · ·· ··· ·

- 48 V. TÁBLÁZAT (folytatás)

Jessica	Dánia	1993	93	mg/1
Chariot	Dánia	1993	79	mg/1
Goldie	Dánia	1993	84	mg/1
Loke	Dánia	1993	81	mg/1
Maud	Dánia	1993	110	mg/1
ismeretlen	India	1993	121	mg/1
ismeretlen	India	1993	103	mg/1
ismeretlen	Anglia	9	110	mg/1
ismeretlen	Skócia	9	117	mg/1
ismeretlen	9	9	140	mg/1
Lenka	Dánia	1992	87	mg/1
Lenka	Dánia	1992	98	mg/1
ismeretlen	9	1993	61	mg/1
Natasha	Franciaország	1992	76	mg/1
Halcyon	Dánia	1992	69	mg/1
Alexis	Anglia	1992	75	mg/1
ismeretlen	Dánia	1992	100	mg/1
ismeretlen	Anglia	1992	99	mg/1
ismeretlen	Anglia	1992	93	mg/1
Alexis	Dánia	1992	92	mg/1
Alexis	Dánia	1992	91	mg/1
ismeretlen	Anglia	1992	102	mg/1
Alexis	Dánia	1993	67	mg/1

• · · · ·

- 49 V. TÁBLÁZAT (folytatás) • · · ·· ··· ·· • ·· · ·····

Árpaváltozat	Származási Betakarítás	LTP mennyisége az EBC standard sörcefrében
ország	éve
Triumph	Franc iaország	1992	90 mg/1

11. PÉLDA

Gabona-LTP izolálása és tisztítása búzalisztből kg búzalisztből 270 liter vízzel, 7,8-es pH-η, négy órán keresztül végzett extrakcióval tiszta búza-LTPl-et izoláltunk. Az elegyet — az oldhatatlan anyagok kicsapódásának elősegítése érdekében — egy éjszakán keresztül 4 ’C-on állni hagytuk. 195 liter felülúszót ultraszűréssel 6,9 literre koncentráltunk, és a maradék lisztet centrifugálással eltávolítottuk. 80 %-os telítettség eléréséig armónium-szulfátot adtunk a felülúszóhoz, és a kapott szuszpenziót 4 ’C-on 16 óra elteltével centrifugáltuk. Az üledék egynegyedét 400 ml vízben feloldottuk. és Spectra/por^R dializáló membránon (3,5 kD átengedési határ) vízzel szemben dializáltuk. A dializátumot (1 liter) centrifugáltuk, pH-Ját 6,5-re állítottuk, és 20 mM Mes pufferrel (pH = 6,5) ekvilibrált S-Sepharose Fást Flow oszlop (5 cm x 5 cm, 300 ml) alkalmazásával ioncserélő kromatográfiának vetettük alá. A búza-LTPl-et az ekvilibráló pufferben MaCl gradiens (0-0,1 M) alkalmazásával eluáltuk.

• · • · ·

- 50 Phast-System (Pharmacia) alkalmazásával végzett SDS-PAGE elektroforézissel 10 kD-os komponenst tartalmazó frakciókat azonosítottunk, ezeket elegyítettük, majd rotációs bepárló alkalmazásával 35 °C-on vákuum alatt bekoncentráltuk. A bekoncentrált mintában lévő komponenseket 0,1 M NaCl-ot tartalmazó 20 mM Na-acetáttal (pH = 4,9) ekvilibrált Sephadex G50 oszlopon (2,5 x 67 cm, 330 ml) végzett gélfiltrációval választottuk el. SDS-PAGE analízissel és N-terminális aminosav-szekvenálással 10 kD-os proteint tartalmazó csúcsot azonosítottunk. Az N-terminális aminosav-szekvenálás Ile-Asp-*-Gly-His-Val-Asp-Ser-Leu-Valszekvenciát eredményezett (melyben a csillag a búza-LTPl e helyén lévő cisztein-gyöknek megfelelő üres helyet Jelöl), ami azt bizonyítja, hogy ez a komponens tiszta bűza-LTPl volt. A készítményt Spectra/por^K dializáló membránon (3,5 kD átengedési határ) dializáltuk és liofilizáltuk.

12. PÉLDA

A búza-LTPl adagolása a sörcefre előállítása során

A sörcefréhez a forralási lépés során hozzáadott búza-LTPl hatásának vizsgálatához a 8. példában leírt modellt alkalmaztuk. A forralás megkezdésekor a cefréhez a 11. példában leírtak szerint izolált tiszta búza-LTP-t (0,5 mg/ml) és/vagy komlókivonatot (61 mg alfa-sav/liter) adtunk. Az eredményként kapott habzási képesség értékeket a VI. táblázatban mutatjuk be.

VI. TÁBLÁZAT
Hozzáadott Habzóképesség	LTP hozzáadásával (0,5 mg/ml)	Habzóképesség (ml/ml)
LTP nélkül	(ml/ml)
Komló nélkül	1,01 +_0,04	Komló nélküli forralás
forralt cefre		előtt adagolt LTP	1,76 + 0,07
Komlóval		Komlóval végzett :	forralás
forralt cefre	1,65 ± 0,05	előtt adagolt LTP	2,28 ± 0,08

13. PÉLDA

A forralás hatása az árpa- és búza-LTPl habzási képességére

Az 1. példa (b) részében, illetve a 11. példában leírtak szerint izolált árpa-, ill. búza-LTPl-et (0,5 mg/ml) 20 mM

2-(N-morfolino)-etánszulfonsavban (Mes) (pH = 5,5) oldottunk. Ultrahangos kezelés közben (2,5 mg/ml trilinoleinnel együtt vagy anélkül) 2 %-os etanolt adtunk az elegyhez. 61 mg alfa-sav/liter végkoncentrációban komlókivonatot adagoltunk (ld. VII. táblázat), és az elegyet a 8. példában leírtak szerint 90 percig forraltuk. A habzóképességet a 2. példában leírtak szerint kapott HMW frakció (2,5 ug/ml) hozzáadása után mértük.

• ·

- 52 VII. TÁBLÁZAT

LTP	Forralás	Adalékok	Habzóképesség
árpa-LTPl	-	-	0,78 + 0,02
	90 perc	-	0,61 ± 0,03
	90 perc	komlókivonat	1,40 ± 0,05
	90 perc	komlókivonat
		+ trilinolein	1,92 ± 0,05
búza-LTPl	-	-	0,80 ± 0,04
	90 perc	-	1,02 ± 0,03
	90 perc	komlókivonat	1,85 ± 0,06
		komlókivonat
		+ trilinolein	1,83 ± 0,07

• · · · · · ·

- 53 • · · ·· ·· · • · · ·· ··· ·· • · ·· · ···· ···· ·· ·· ··· ·

Szabadalmi igénypontok

Claims

1. Proteineket és/vagy peptideket tartalmazó ital, azzal Jellemezve, hogy gabona-LTP-t és/vagy 50-110 aminosavas, előnyösen 80-100 aminosavas, egy gabona-LTP-vel legalább 60 %-os, előnyösen 80 %-os szekvencia-homológiát mutató gabona-LTP homológokat és/vagy gabona-LTP-ből és/vagy homológjaiból 3 és 7 közötti pH-értéknél, vízben végzett melegítéssel, forralással és/vagy cefrézéssel izolálható módosított gabona-LTP frakciót tartalmaz, azzal a kikötéssel, hogy amennyiben az ital sör, a gabona-LTP és/vagy homológjai és/vagy a módosított gabona-LTP frakció koncentrác ióJ a

XI Jelentése az LTP-tartalmú anyagok hozzáadása nélküli nyersanyagból főzött sörből nyerhető koncentrác iók, mely nyersanyagbó1 az

EBC standard cefrézési eljárás alkalmazásával

125 /Ug/ml, illetve 150yUg/ml módosítatlan

LTPl-koncentrációnak megfelelő gabona-LTP-koncentrációval rendelkező EBC standard sörcefre készíthető.

2. Az 1. igénypont szerinti ital, azzal Jellemezve, hogy árpa-LTP-t és/vagy itt meghatározott homológjait és/vagy árpa-LTP-ből nyerhető módosított gabona-LTP frakciót tartalmaz.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti ital, azzal Jellemezve, hogy erjesztéssel állítjuk elő.

··· • · ····

4. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti ital, azzal Jellemezve, az italban a koncentráció legalább 25/Ug/ml, előnyösen több, mint 100 /Ug/ml.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti ital, azzal jellemezve, hogy a fentieken kívül gabonaeredetű tartalékproteineket is tartalmaz, például hordeint és/vagy glutelint vagy ezek fragmentjeit.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti ital, azzal jellemezve, hogy a fentieken kívül egyéb albuminokat is tartalmaz, mint például a sörből nyerhető protein Z-t.

7. Az Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti ital, azzal jellemezve, hogy a fentieken kívül szénhidrátokat is tartalmaz.

8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti ital, azzal jellemezve, hogy a fentieken kívül lipideket és/vagy zsírsavakat is tartalmaz.

9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti ital, azzal jellemezve, hogy sör.

10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti ital, azzal jellemezve, hogy a fentieken kívül komló komponenseket is tartalmaz, például komló izo-alfa-savakat és a komló más keserű gyantáit.

11. Eljárás protein- és/vagy peptidtartalmú ital előállítására, azzal Jellemezve, hogy az italhoz folyamatosan vagy egy vagy több előállítási lépésben gabona-LTP-t és/vagy 50-110 aminosavas, előnyösen 80-100 aminosavas, egy gabona-LTP-vei legalább 60 %-os, előnyösen 80 %-os szekvencia-homológiát mutató gabona-LTP homológokat és/vagy gabona-LTP-ből és/vagy homológjaiból 3 és 7 közötti pH-értéknél, vízben végzett melegítéssel, forralással és/vagy cefrézéssel izolálható módosított gabona-LTP frakciót adunk, azzal a kikötéssel, hogy amennyiben az ital sör, a hozzáadott gabona-LTP és/vagy homológjai és/vagy a módosított gabona-LTP frakció koncentrációja legalább X, előnyösen legalább XI, ahol X és XI Jelentése az LTP-tartalmú anyagok hozzáadása nélküli nyersanyagból főzött sörből nyerhető koncentrációk, mely nyersanyagból az EBC standard cefrézési eljárás alkalmazásával 125 ug/ml, illetve 150 ug/ml módosítatlan LTPl-koncentrációnak megfelelő gabona-LTP-koncentrációval rendelkező EBC standard sörcefre készíthető.

12. Egy 11. igénypont szerinti, cefrézési lépést magában foglaló eljárás, azzal Jellemezve, hogy a gabona-LTP-t és/vagy homológjait és/vagy a módosított gabona-LTP frakciót a cefrézési lépés előtt adagoljuk.

13. Egy 11. igénypont szerinti, cefrézési lépést magában foglaló eljárás, azzal Jellemezve, hogy a gabona-LTP-t és/vagy homológjait és/vagy a módosított gabona-LTP frakciót • · · ·· ··· · • · · · · · · • · · · ·· ·· ···

- 56 a forralást lépés előtt adagoljuk.

14. A 11-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal Jellemezve, hogy gabona-LTP-ként árpa-LTP-t alkalmazunk.

15. A 11-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gabona-LTP-t és/vagy homológjait és/vagy a módosított gabona-LTP frakciót részlegesen vagy lényegében oldható adalék formájában adagoljuk.

16. A 11-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gabona-LTP-t és/vagy homológjait és/vagy a módosított gabona-LTP frakciót legalább 25 ug/ml, előnyösen több, mint 100 ug/ml koncentrációban adagoljuk.

17. A 11-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, melyet sör előállításához alkalmazunk, és az eljárás során

i) malátát vagy malátakivonatot készítünk;

ii) sörcefrét készítünk;

iii) a sörcefrét erjesztjük; és iv) a sört derítjük, illetve utókezeljük;

azzal jellemezve, hogy a gabona-LTP-t és/vagy homológjait és/vagy a módosított gabona-LTP frakciót az (i), (ii), (iii) és (iv) lépések előtt vagy az egyik vagy több lépés végzése közben adagoljuk.

18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, • · ·· · · ·

- 57 hogy a gabona-LTP-t és/vagy homológjait és/vagy a módosított gabona-LTP frakciót az (ii) lépés végzése közben vagy elkezdése előtt adagoljuk.

19. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gabona-LTP-t és/vagy homológjait és/vagy a módosított gabona-LTP frakciót olyan árpából nyerjük, amelyet genetikai átvitel alkalmazásával úgy módosítottunk, hogy nagy LTP-, elsősorban nagy LTPl-tartalmú legyen, és a malátát az így módosított árpából származó árpaszemek képezte nyersanyagból készítjük.

20. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gabona-LTP-t és/vagy homológjait és/vagy a módosított gabona-LTP frakciót olyan élesztőből nyerjük, amely genomjában tartalmazza a gabona-LTP-t, elsősorban az LTPl-et, és ezt az élesztőt az (iii) lépésben adjuk a sörcefréhez.

21. Egy vegyület alkalmazása italban habképző adalékként, melynek során az említett vegyületként gabona-LTP-t és/vagy 50-110 aminosavas, előnyösen 80-100 acinosavas, egy gabona-LTP-vei legalább 60 %-os, előnyösen 80 %-os szekvencia-homológíát mutató gabona-LTP homológokat é=/vagy gabona-LTP-ből és/vagy homológjaiból 3 és 7 közötti pH-értéknél, vízben végzett melegítéssel, forralással és/vagy cefrézéssel izolálható módosított gabona-LTP frakciót alkalmazunk.

··

22. A 21. igénypont szerinti alkalmazás, melynek során a gabona-LTP-t és/vagy homológjait és/vagy a módosított gabona-LTP frakciót őrölt vagy aprított szemek vagy készítmények formájában, vagy a szemek vagy készítmények kivonataként alkalmazzuk.

23. A 21. igénypont szerinti alkalmazás, melynek során vízben a hordein, komló komponensek és lipidek, elsősorban trigliceridek közül egy vagy több komponenssel együtt végzett forralással kapott módosított gabona-LTP frakciót alkalmazunk.

A meghatalmazott:

Ρ 96 01228 <

KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY

74928

13/1

Zsugorított üvegszűrö

Vízzel telített nitrogéngáz

1. ábra

KÖZZÉTÉTELI

PÉLDÁNY

P 96 01228 13/2

E