RO112763B1 - Bautura si metoda de preparare a acesteia - Google Patents

Description

Prezenta invenție se referă la o băutură, și la metoda de preparare a acesteia.

Băuturile joacă un rol important în viața noastră zilnică, nu numai ca lichid 5 necesar și aliment nutritiv, ci ca stimulent, în afară de gust, proprietățile structurale cum ar fi vâscozitatea și proprietățile spumante sunt importante pentru băuturile de înaltă calitate. io

Astăzi este disponibil pe piață un număr mare de băuturi spumante, ca de exemplu berea, lapte spumos și alte băuturi nealcoolice. Cu toate acestea există și o necesitate pentru îmbunătățirea 15 calității băuturilor spumente deja cunoscute.

Au fost făcute o serie întreagă de eforturi pentru a investiga și izola agenții de formare a spumei în bere și pentru a 20 îmbunătăți calitățile spumante ale berii.

Se cunoaște de mai bine de 50 de ani că proprietățile spumante ale berii sunt guvernate de conținutul ei în proteină, care este în jur de 3-4 mg/ml într-o bere tipică, 2 5 și că lipidele libere și reziduurile detergente pot fi în detrimentul stabilității spumante a berii.

Numeroase investigeții (Anderson, F. B. & Harris, G.:Nitrogenous constituients of brewing materials. XII. Foam-stabilizing substances in beer. Constituienți azotici ai materialelor pentru fabricat bere. XII. Substanțe de stabilizare a spumei. J. Inst. Brew. 69: 383-388 (1963); Asano, K.& Hashimoto, N.'.lsolationand caracterization of foaming proteins of beer. Izolarea și caracterizarea proteinelor de spumare din bere Jv Am. Soc. Brew. Chem 38: 129-137 (1980); Bishop, L.R.: Haze- and foam-forming substances in beer, Substanțe de formare a ceții și spumei în bere, J.lnst. Brew. 81: 444-449 (1975];) au avut drept scop clarificarea problemei privind care din componentele proteinice din bere sunt implicate în stabilirea berii fără să conducă la un răspuns echivoc al acestei chestiuni. S-a sugerat că mai multe clase de greutăți moleculare ale proteinelor ar fi importante în formarea spumei ( Asano, K.& Hashimoto, N. :lsolationand caracterization of foaming proteins of beer.Izolarea și caracterizarea proteinelor de spumare din bere Jv Am. Soc. Brew. Chem 38: 129137 (1980); Hollemans, M. SToniers, A. R. J. M.:The role of specific proteins in beer foam. Rolul proteinelor specifice în spuma de bere Proc. Eur. Brow.Conv. Congresul al 22-lea, Zurich 1989, p. 561568.). Profilul greutăților moleculare al proteinelor din bere variază de la polipeptide mici până la aproximativ 150.000 Dalton și peste. în general, proteinele din bere având greutăți moleculare până la aproximativ 100.000 Dalton au fost găsite ca având un efect pozitiv asupra stabilității spumei de bere, în timp ce polipeptidele mici, în special polipeptidele având o greutate moleculară sub 5.000 Dalton, sunt considerate a avea un efect negativ asupra spumei [Skriver, K.,Leah, R., MullerWhintear, A. L.: Bazic factors thet determine foam stability. The Institute of Brewing. Factori de bază care determină stabilitatea spumei. Institutul de Fabricare a berii. Australia și Noua Zeelandă Section. Proc. a 15-a Conv. Noua Zeelandă 1978 p 67-75.).Mai mult decât atât, investigațiile făcute de Sharpe și alții (Sharpe, F.P.,Jacques, D., Bowsell, A.G & Whtear, A, L,:Rapid methods of measuring the foam-active nitrogenous componentrs of worts an beers. Metodă rapidă de măsurare a componenților azotici activi de spumare din mustul de bere și bere. Proc. Eur. Brew: Conv. Congresul al 18-lea, Copenhaga 1981, p. 607-614) au arătat că stabilitatea spumei în bere este în legătură cu aportul dintre polipeptidele cu greutate moleculară mare și polipeptide cu greutate moleclară mică. Luând în considerare importanța unor proteine specifice, Yokoi și alții (Yocoi, S., Maeda, K, Xiao, R.,Kamada, K. & Kamimura, M.: Characterization of beer proteins responsable for the foam of beer. Caracterizarea proteinelor din bere responsabile pentru producerea spumei în bere. Proc. Eur. Brew. Conv Congresul al 22-lea, zurich 1989, p. 503-512 ), au constatat că proteina Z, o albumină din orz cu greutate moleculară 40.000 Dalton, joacă cel mai important rol în stabilitatea

RO 112763 Bl spumei. Aceasta este contrar rezultatelot lui Holleman și Tonie (Hollemans, M. SToniers, A. R. J. M.:The role of specific proteins in beer foam. Rolul proteinelor specifice în spuma de bere Proc. Eur. Brow.Conv. Congresul al 22-lea, Zurich 1989, p. 561-568.) care au arătat că îndepărtarea completă și selectivă a acestei proteine din bere de către anticorpi imobilizați, specifici are doar un efect minor asupra stabilității spumei.

Componentele cu greutate moleculară mare în general drojdiile și în principal de natură carbohidrați, au fost de asemenea găsite a fi concentrate în spumă de bere (Hejgard, J. & Soresen, S. B.: Characterization of a protein-rich beerfraction by two-dimensional immunoelectrephorete techniques. Caracterizarea fracțiunii de bere bogată în proteine prin tehnici imunoelecroforetice bidimendionale. Comp. Rend. Trav. Lab. Carlsberg 40, 1975: p. 187-203).

Cele mai multe din concluziile menționete mai sus au fost stabilite prin fracționarea proteinelor din bere și determinarea abilităților diferitelor fracțiuni de a genera o spumă stabilă. Nici una din invenții nu a făcut nici un pas pentru a îmbunătăți calitatea spumei de bere.

Atunci când se discută despre calitatea spumei, se au în vedere doi parametri, respectiv abilitatea de a forma spumă și abilitatea de a stbiliza spuma formată.

S-a găsit, o grupă specială de proteine formulată ca Cereal-LTP, care are abilitatea de a forma spuma în băuturile spumante.

Cereal-LTP se referă la proteine sau lipide din cereale, clasificate ca proteine de transfer a lipidelor (Lipid Transfer Proteina - LTP ). Tabelul I arată secvența unui număr de asemenea Cereal-LTP și altor LTP din plante. Aceste proteine sunt descrise de Molina și alții ( Molina, A., Segura, A. & Garsia-CImedo, F.: Lipid Transfer proteins (nsLTP) from Barley and maize leaves are potent inhibitors of bacterial and fugal plant pathogens. Proteinele de transfer a lipidelor (nsLTPs) din orz și frunze de porumb sunt inhibitori puternici ai patogenilor de plante și fungi, FEBS Letters316: 1993, p 119-122).

Denumiții omologi ai proteinelor, cu 50-110 aminoacezi și în mod special și în mod special cu 80-100 aminoacizi, au cel puțin 60%, preferabil 80% sau mai mult din secvența homoloagă a Cereal-LTP.

în mod deosebit, raportul structural este important. Omologii proteinelor conțin ca urmare în mod preferabil cel puțin 6 grupări cisteinice, dar preferabil 8 grupări cisteinice pentru a forma 3 sau 4 punți bisulfitice.

Proteinele omoloage preferate sunt TLTP, SLTP, CLTP, CB-A, CB-B, CB-C.

BLTP este o proteină de bază în stratul aleuronic al germenilor de orz (Mundy, J.& Rogers, J. C.: Selective expresion of a probable anylase/protease inhibitor in barley aleurone cells. Expresia selectivă a inhibitorului amilază/protează probabil în celulele aleurone din orz. Comparison to the barley amylase/substilisin inhibitor. Comparație față de inhibitorul amilază/substilisin din orz. Planta 169: 51-63 1986. Ea are greutatea moleculară de 9.694 Dalton, cuprinzând 91 de rezidii de aminoacizi incluzând 8 cisteine (Svensson, B., Asano, K., Jonassen, I., Poulsen, F. M., Mundy, J & Svensen, I.: A 10 kD Barley seed protein homologous whit an alfa-amilase inhibitor from indian finger millet. Un omolog al proteinei din germeni de grâu cu greutatea moleculară de 10 kD cu un inhibitor alfa-amilază din degețelul de mei indian. Carsberg Res. Commun. 51: 4935DG 1986.).A fost determinată secvența aminoacidului (Svensson, B., Asano, K., Jonassen, I., Poulsen, F. M., Mundy, J & Svensen, I.: A 10 kD Barley seed protein homologous whit an alfa-amilase inhibitor from indian finger millet. Un omolog al proteinei din germeni de grâu cu greutatea moleculară de 10 kD cu un inhibitor alfaamilază din degețelul de mei indian. Carsberg Res. Commun. 51: 493-500 1986.]. Ea a fost donată și a fost determinată secvența nucleotidă a cDNA (Mundy,J.& Rogers, J. C.: Selective expresion of a probable anylase/protease inhibitor in barley aleurone cells. Expresia

RO 112763 Bl selectivă a inhibitorului amilază/protează probabil în celulele aleurone din orz. Comparison to the barley amylase/ substilisin inhibitor. Comparație față de inhibitorul amilază/substilisin din orz. Planta 169: 51-63 1986],

Problema pe care o rezolvă invenția este realizarea unei băuturi cu proprietăți de spumare îmbunătățite

Băutura, conform invenției, înlătură dezavantajele menționate prin aceea că băutura conține proteine și/sau peptide din cereale, clasificate ca proteine de transfer a lipidelor (Lipid Transfer ProteinsLTP, Cereal-LTP] și/sau omologi ai acestuia, definite ca proteine cu 50-110 aminoacizi, preferabil 8(3-100 aminoacizi, avînd cel puțin 60%, preferabil 80% sau mai mult din secvența omoloagă a CerealLTP, și sau o fracțiune modificată de Cereal-LTP obținută din Cereal-LTP și/sau omologi prin încălzire, fierbere și/sau terciuire a Cereal-LTP și/sau omologi, în apă la un pH cuprins între 3 și 7, astfel incit concentrația Cereal-LTP și/sau omologilor și/sau a fracțiunii Cereal-LTP modificată a acesteia să fie cel puțin 25 micrograme/ml și preferabil mai mult de 100 micrograme/ml, componenți cu rol de formare a spumei în băutură. Germenii de cereale-LTP sunt cei preferați.

Cereal-LTP preferat în mod deosebit este LTP din orz, din semințe din orz, denumiți în Tabelul I drept BLTP și de asemenea denumite LTP 1 în exemple.

Problema pe care o rezolvă, de asemenea invenția, este o metodă de realizare a unei băuturi cu proprietăți de spumare îmbunătățite.

Metoda de obținere a băuturii conform invenției este caracterizată prin particularitățile următoare: Cereal-LTP și/sau omologi ai acestuia, definite ca proteine cu 50-110 aminoacizi, preferabil 80-100 aminoacizi, avînd cel puțin 60%, preferabil 80% sau mai mult din secvența omoloagă a Cerel-LTP, și/sau o fracțiune de peptidă/proteină obținută din CerealLTP și 6 sau omologi prin încălzire, fierbere și/sau terciuire a Cereal-LTP și/sau omologi în apă la un PH cuprins între 3 și 7, se adaugă la băutură în mod continuu sau în una sau mai multe faze de fabricație, sub forma unui amestec care este parțial sau substanțial solubil.

în descrierea care urmează din prezenta invenție, termenul Cereal-LTP sau sub grupe ale acesteia, cum ar fi LTP-orz, denumește de asemenea omologă, așa cum a fost definit înainte, cu o secvență omoloagă de LTP menționată. Suplimentar, termenul Cereal-LTP sau subgrupe ale acestuia denumesc fracțiunea modificată Cereal-LTP, care poate fi obținută din LTP menționat sau omologi ai acestora prin încălzire, fierbere și/sau terciureLTP. Este preferabil ca cereai -LTP să fie complet denaturat, respectiv anumite structuri să fie prezente datorită abilității cisteinelor de a forma punți bisulfitice.

Atunci când Cereal-LTP este supus încălzirii, fierberii și/sau terciuirii așa cum este descris mai jos și așa cum este normal în procesul de fermantare a berii, el își menține practic întreaga să activitate primară, în timp ce structurile secundare și terțiare se modifică mai mult sau mai puțin și unele sau toate punțile bisulfitice se pot rearanja. în procesul de fermentație, aminoacidul metionină al LTP din orz este adesea oxidată. Inventatorii din această invenție au observat de asemenea formarea de LTP-dimeri și LTPoligomeri, probabil ca urmare a rearanjării a uneia sau a mai multe punți bisulfitice prezente în LTP. Așa cum este arătat mai departe, LTP poate fi de asemenea combinat cu alte componente prezente în stadiul de fierbere, de exemplu fragmente de hordeină, hamei și lipide.

co

>	z w	z z	=	X		z	X
h-4	>		>	>	1—<		>—(	>-1	t—<
CC	x	x	x	a:	X		·<	a
00	oo	oo	CO	©	CO	CO

RO 112763 Bl

CLTP: VLTCGQVTGA[^PCTGYLSRQVNVPVPLTCCNVVRGLNNAARTTWKRTAa;CMT;QTANAVTGLNLNAAAGLPARCGVNIPYKISPTTOCNRVV

►H	·-<	►H	»-<	>—1	Ϊ—<	►—1	©)	X	►H	»—<	X
00	CO	©	00	CO	o	o	©	00	X	O	o
<	a	<	<	co	<	«<ζ	00	00	co	-<
<	<			<	-c	<	c	<	x	-<	<
~7	z	z	z		CC	y	<	<	X	X	X
	Q	o	o	o	o	o	a	Q	Q	X	o
t-	ω	<.	·<	<	<	<	o	ω	2S	X	>-
ZL	z	z	z	z	—Ύ·	X	z	X	X	a	X
,_j		J	•o	J	t	1	f—(		►—<	h—<
Z	•z.	o	o	o	l	1	E-	X	o	o	o
X	z	co		00	1	1	cu	X	X	X	X
►—<	>-<	>	>-<	>	2-	X	Cu	>	00	t—<
o	©	o	o	CC	<	O	CC	X	X	·<	<
	CC	<	oc	00	O	O	<	<	00	X
<	<	<	<	<	<	<	<	<	ω		<
>—<	»—t	<		<	>	<	<	<	<	c	<
O	o		z		ω	00	<	E-	1	00	oo
X		52	?	z	z	X	2	X	X	X	X
X	J				z	»—(	>-H	>	X	X	X
1	1	1	1	00	1	1	1	l	1	1	i
o	o	O	O	©	CJ	o	ω	O	CJ		o

o	Oi	CC CC 2	o	Oi	X
CC	CC	CC	ce				X
a	Q	a	Q	o	Q	Q	Q
o	CO	<	<	<	-C	-c	<
©	Oi	E-	E->		E-	E-	co
co	00	E-	P	E-	00	00	E-
Oi <<		5	00 <	5		Oi <	X -<
o	Oi	•i		«<?		<

00	Cu	©	©	©	x C>
cu		cu	P-		1	X
00	2	ω	P	2	t	t
p	<	<	p	©	X	(
©	©	>	Q	Q	O	X
00	z	©	Lu	2	X	o
©	©	P	P	P		o

>	>	<	<	<	-E	<	X	X	<	X	X
2-	>-	>-	>	>	>-	>*	X	X	X	>-	>-
P	©	00	P	<	<	00	X	X	o	X	Q
p	P	1—1	d	X		►—<	♦—(	>	r*	d	»—<
U	c	O	D	O	o	o	o	o	y
°3	a		X	X	X	X	00	00		X	x>
2	2	o	o	o	co	<	00	MC	<	<
z	>		>	M		iJ	X	X	X	X	X
z	o	<	<	<		<	00	<	y	o	X
©	©	00	00	oo	00	00	co	X	V	<	co
§	p	<		00	00	00	X	X	a	E-	co
5-	>	s*·	>	>		>	.>		>	>

1

1 <

1 <

<

<

1 1 <

<

©

« ·

r—4

« «

•«

P-

X

&

X

£

a.

P

E-

CD

f—(

m

u

X

X

t-

E~

X

X

r-4

(N

1

1

1

t-

E-

X

X

X

X

Φ

3

a

6

_)

X

m

'—

X

S

X

X

©

©

u

ω

co

RO 112763 Bl

Notă la tabelul I

Spațiile libere (-] au fost intriduse pentru a arăta starea de omologi.

BLTP indică LTP din germeni de orz.

WLTP indică LTP din grâu. 5

MLTP indică LTP din porumb.

RiLTP indică LTP din germeni de orez.

RaLTP indică LTP din Indian degețel de mei (răgi], io

Cw18 indică LTP din frunze de orz. Cw21 indică LTP din frunze de orz. CB-A indică LTP din boabe de ricin. CB-B indică LTP din boabe de ricin CB-C indică LTP din boabe de ricin. TLTP indică LTP din tomate. SLTP indică LTP din spanac. CLTP indică LTP din morcov. Cereal-LTP modificate se poate obține preferențial prin încălzirea CerealLTP ordinară într-o soluție apoasă pe o perioadă de timp de până la 3 ore la o temperatură cuprinsă între 50-95°C sau prin fierbere la presiune atmosferică timp de 2 ore și/sau terciuirea ca o fază obișnuită de terciuireîn producerea berii.

în cele ce urmaeză, termenul “Cereal-LTP” denumește de asemenea omologi ai acestora sau Cereal-LTP modificat, precum și omologi modificați, în cazul în care nu este statuat altfel.

Băutura poate fi orice lichid băubil, cum ar fi o băutură pe bază de lapte, băuturi pe bază de fructe și bere.

întrucât o cantitate mică, respectiv 50 mg/l, este prezentă în sorturile de bere cunoscute, această practică anterioară este revendicată prin revendicarea de produs [de băutură).

Producția de bere sau procesul de fermentație așa cum este el cunoscut din practica anterioară este descris în detaliu în literatură. în general, procedele urmăresc fazele A) până la D).

A) Selectarea materiilor prime și prepararea Materile prime conțin:

Apă, hidrați de carbon și proteine (prezente în cereale cum sunt orzul, grâul, orezul, porumbul, sorgul); zahăr; siropuri; extracte de malț; enzime formate în timpul procesului de obținere a malțului din cereale [respectiv din orz sau grâu) sau din producerea microbiologică; componente de arome (malț prăjit, hamei și alte materiale din plante sau sucuri).

Materiile prime din cereale pot fi: Obținute sub formă de malț, măcinate; separate (pentru a genera componente cu aromă specifică și cu activitate enzimală).

B) Terciuirea și produceea mustului (de bere), ce cuprinde:

Extracție prin macerare controlată (ca temperatură și durată ) a materiilor prin pregătire fierberea și separarea mustului de bere din materialele insolubile.

C) Fermenterea mustului de bere

Fermentarea are loc după ce s-a adăugat o suspensie de drojdie la mustul de bere aerat. în timpul metabolismului drojdiei (fermentației în condiții contrilate de temperatură], mustul este convertit în bere ce conține ceva componente produse de drojdie cum este alcoolul și componente ce conțin arome. Această fază poate fi controlată de parametrii de proces: Temperatură și dozajul drojdiei precum și reproduceea drojdiei.

D) Limpezirea și finisarea

După depozitare și maturare, drojdia rămasă și sedimentele de proteină/tanin sunt filtrate, bioxidul de carbon, culoarea și alte adaosuri corective, cum sunt cele de stabilizare și componente ce conțin arome sunt implementate.

Este în general cunoscut febricanților de bere, că berea produsă numai din malț de orz sau malț de grâu generează spumă cu un potențial mai ridicat (abilitatea de a forma spumă) și cu o stabilitate mai bună decât berea fabricată cu adjuvanți.

Analiza conținutului de Cereal-LTP în berea fabricată conform practicii anterioare cu potențialul de spumare maxim cunoscut, a arătat că concentrația Cereal-LTP este cu mult mai mică decât 300 mg/l.

Calitatea spumei din bere depinde atît de procesul de fermentație, cât și de materiile prime utilizate. întrucât prezenta invenție se referă în mod esențial la

RO 112763 Bl materiile prime, conținutul de Cereal-LTP în bere, următorul față de importanța originii, este în general legată de CerealLTP în mustul de bere preparat în conformitate cu European Brewery Convention, metidă standard de terciuire, (EBC-Convenția Europeană a convenției de bere), denumit de asemenea must de congres. Pentru cerealele care nu sunt sub formă de malț, o procedură de extracție similară poate fi utilizată, dacă este necesar pentru includerea adăugării de nivele normale ale activității enzimale de fermentare.

Cereal-LTP este în prezent în mustul de bere dulce, pregătit pentru producerea berii, este LTP primar sau LTP 1 ușor modificat. Gradul de modificare depinde de procedeul în conformitate cu care el este fabricat. Când mustul de congres este fabricat în conformitate cu metodele de terciuire standard ale European Brewery Convention, aproximativ 90% din CerealLTP fiind prezent în mustul de congres este măsurat cu ELISA folosind anticorpi produși împotriva LTP 1 nemodificat, atunci când ELISA este efectuată în conformitate cu procedurile standard, așa cum este descris mai jos.

Concentrația de Cereal-LTP în berea cunoscută este mai mică decât X și cu mult mai mică decât XI, unde X și XI indică nivelele ce se pot obține în berea fabricată din materiile prime care prin utilizarea metodei de terciuire standard EBC dau un must de congres având concentrația de Cereal-LTP corespunzând la 125 micrograme/ml și 150 micrograme/ml măsurată cu ajutorul ELISA folosind anticorpi dezvoltați împotriva LTP 1 nemodificat.

Termenul “firstwrot (“primul must”) reprezintă mustul obținut în prima fază de filtrare după faza de terciuire. Prima fază de filtrare este faza de filtrare obișnuită înainte de spălarea turtei de filtru.

Termenul de “sweet wrot” (“must dulce”) reprezintă mustul obținut după faza de filtrare finală, respectiv după ce turta de filtru a fost spălată cu apă. Mustul dulce este prin urmare un amestec din primul must și apa de spălare.

Termanul de “must de congres (“congress wrot) reprezintă un must fabricat în conformitate cu metoda de terciuire standard a Europeean Brewery Convention.

Termenul de “must” (“wrot”) reprezintă mustul final după terciuire, filtrare și fierbere.

La început, tot Cereal-LTP prezent în mustul de bere poate fi găsit în berea fabricată din aceasta. Un ml de must dă în mod normal 1 până la 2 ml de bere.

Aceasta înseamnă că un must cu concentrația Cereal-LTP de 125 micrograme/ml poate da o bere cu o concentrația Cereal-LTP de până la 1 25 microgram/ml.

Metodele de terciuire standard ale European Brewery Convention sunt descrise în detaliu în “ANALYTICA-EBC”, Ediția a 4-a, 1987, pag 59, publicată de Brauerei und Getranke-Rundschau, CH8047 Zurich, Elveția.

Băutura în prezenta invenție cuprinde în mod prefernțial cel puțin 25 micrograme/ml Cereal-LTP, în timp ce concentrația obțională de Cereal-LTP, și în mod special cereal-germeni-LTP, este de 100 micrograme/ml sau chiar mai mult.

Cereal-LTP poate fi recunoscută cu ajutorul structurii ei secvențiale.

Concentrația de Cereal-LTP poate fi măsurată prin utilizarea testului imunosorbent legat de enzimă (Enzime-Linked Immunosorbent Assay-ELISA) pentru Cereal-LTP. Asemenea ELISA Cereal-LTP nu este disponibil pe piață, dar poate fi produs urmărind tehnicile standard care cuprind fazele de:

a) producerea unui anticorp față de Cereal-LTP prin imunizarea unui animal, obținerea serului și purificarea anticorpului,

b) bioconservarea anticorpului, și

c) trasând o curbă standard LTP cu ajutorul unei proceduri ELISA competitive implicând un component care poate fi măsurat, de exemplu folosind un spectrofotometru.

Metodele ELISA ca atare sunt în general cunoscute persoanelor experimentate în acest domeniu și constituie una dintre cele mai obișnuite metode utilizate

RO 112763 Bl astăzi pentru a măsura componentele bioactive.

Informații generale privind testele ELISA pot fi găsite în P. Vaag: The Enzymelinked Imunosorbent Assay (ELISA)in the Beverage Industries. Test imunosorbent de legare a enzimelor (ELISA) din industriile de băuturi: Principii și practică. In Analysis of Nonalcoholic Beverages. Modern Methods of Plant Analysis. în analiza băuturilor nealcoolice. Metode moderne de analiză a instalațiilor. Voi.8 (Ed. Linskens, H. F. And Jacson, J. F. ), Springler-Verlag, Berlin 1988.

în mod preferențial, băutura din prezenta invenție conține de asemenea hordeină, glutelină, alte albumine cume ste proteina Z obtenabilă din bere și / sau componente din hamei și alte rășini cu gust amar din hamei. Aceste componente posedă un efect de stabilizare a spumei și un efect de formare a spumei sinergistice cu Cereal-LTP.

Băutura poate conține de asemenea hidrați de carbon, lipide și/sau acizi grași. Aceste componente îmbunătățesc gustul și structura băuturii.

Linele dintre componentele mai sus amintite, de exemplu hordeină, hamei și lipide, pot fi combinate cu LTP, dacă ele sunt supuse fierberii împreună. Proprietățile spumante ale Cereal-LTP modificat prin fierbere cu componente de hamei și/sau trigliceride sunt îmbunătățite.

Băutura poate conține de asemenea și alte componente în cantități mici, cum sunt stabilizatorii (algino-acizii, alginații, carrageean, gliceride, gumă arabică, pectină), agenți de îndulcire artificiali, agenți reprezentând arome, agenți de colorare, vitamine, minerale, substanțe prezervative (de conservare), agenți de generare a efervescenței, antioxidanți și enzime precum si enzime de degradare a hidranților de carbon.

Atunci când băutura din prezenta invenție este berea, conținutul de Cerel-LTP este preferabil mai mare decât 5% în greutate, în special mai mare decât 10% în greutate și mai preferabil mai mare decât 15% în greutate din conținutul total de proteine. Greutatea Cereal-LTP modi ficată este calculată ca fiind greutatea cantității corespunzătoare de Cereal-LTP nemodificată, respectiv greutatea altor componente legate la Cerel-LTP nu este inclusă.

Prezenta invenție că prinde de asemenea o metodă de producere a băuturii conținând proteine și/sau peptid. Această metodă este caracterizată prin aceea că, Cereal-LTP și/sau omologi ai acestuia, definite ca proteine cu 50-110 aminoacizi, preferabil 80-100 aminoacizi, avînd cel puțin 60%, preferabil 80% sau mai mult din secvența omoloagă a CerelLTP, și/sau o fracțiune de peptidă/proteină obținută din Cereal-LTP și 6 sau omologi prin încălzire, fierbere și/sau terciuire a Cereal-LTP și/sau omologi în apă la un PH cuprins între 3 și 7, se adaugă la băutură în mod continuu sau în una sau mai multe faze de fabricație, sub orice forma, cu asigurarea că este parțial sau substanțial solubil.

în practică ea poate fi adăugată sub formă de zaț sau material de cereale sfărâmate sau sub forma unui extract de materiale cerealiere.

Un asemenea extract poate fi obținut pe orice cale, de exemplu prin fierbere și/sau terciuirea cerealelor sau a materialelor cerealiere într-un lichid și, dacă se dorește, purificare prin filtrare și în mod obțional fracționarea filtratului. Lichidul poate conține de asemenea în mod preferențial hamei și/sau lipide, îndeosebi trigliceride. Extractul poate fi de asemenea uscat, de exemplu prin liofilizare sau prin uscare cu atomizare.

Cereal-LTP poate fi obținut, de exemplu, într-o formă modificată de bere, așa cum este descris mai departe în exemplele care urmează.

Cereal-LTP poate fi de asemenea obținut dintr-un microorganism, de exemplu o drojdie, un fung sau o bacterie conținând secvența DNA codificată pentru Cereal-LTP în genom. întrucât numărul secvențelor DNA codificate ale Cerel-LTP sunt cunoscute, o persoană experimentată în domeniu va fi capabilă să încorporeze o asemenea secvență DNA în genomul bacteriei, drojdiei sau fungului prin utilizarea tehnicilor

RO 112763 Bl cunoscute. Drojdia poate fi, de exemplu, Saccaromyces carlsbergensis sau cerevisae.

Cereal-LTP ar putea fi produs de exemplu de microorganismele producătoare de Cereal-LTP, în băutură, în timpul fazei de fermentare.

Dacă băutura nu este fermentată, Cereal-LTP este de prefereai să fie adăugat sub formă de extract solubil purificat.

Cereal-LTP poate fi adăugat de asemenea la băutura fermantată sub forma unui extract solubil purificat, dar cum producerea băuturilor fermentate cuprinde în mod obișnuit o fază de filtrare, s-ar putea să nu fie necesară purificarea extractului de Cereal-LTP.

Cereal-LTP poate fi adăugat în oricare din fazele de producere, toată odată, sau câte puțin, în mod continuu sau discontinuu.

Atunci când băutura este berea, Cereal-LTP ar putea fi adăugat, de exemplu, în faza de preparare a malțului sau a extractului de malț prin producerea malțului din germeni de cereale care sunt rafinate pentru a avea un conținut ridicat de LTP, de exemplu prin utilizarea transmisiei genetice.

Cereal-LTP poate fi de asemenea adăugat pe durata preparării mustului de ber, de exemplu sub formă de zaț sau material cerealier sfărâmat, în special germeni de drojdie care sunt adăugați înainte de faza de mărunțire.

Prezenta invențe include de asemenea utilizerea Cereal-LTP sub forma unui aditiv care formează spumă în băuturi.

Atunci când Cereal-LTP este utilizată în conformitate cu prezenta invenție, ea poate fi, preferabil, în combinație cu alte componente incluzând proteine, dar este preferabil ca Cereal-LTP să constituie cel puțin 15%, preferabil 25% în greutate din conținutul total de proteine. Greutatea Cereal-LTP modificată este calculată ca fiind greutatea cantității corespunzătoare de Cereal-LTP nemodificată, respectiv greutatea altor componente legate la Cereal-LTP nefiind astfel inclusă.

în continuare se prezintă exemplele de realizare a invenției, în legătură și cu figurile 1..12, care reprezintă:

Figura 1, un turn de spumare pentru 1,65 I de bere executat din sticlă de borosilicat.

Figura 2, filtrarea pe gel a spumei de la a treia flotație a berii lager pe Sephadex G-75 (5 cm x 87 cm, 17DD ml) echilibrată cu 50 nM acetat de amoniu, la un pH de 4,5.

Figura 3, dependența timpului de înjumătățire a spumei de concentrația HMW în apă conținând LMW în testele de spumare.

Figura 4, dependența timpului de înjumătățire a spumei de concentrația HMW în apă conținând 0,3 mg/ml LMW.

Figura 5,: A) electroforeza cu gel de SDS-poliacrilamidă a HMW, LMW și LTP 1-orz. (20% gel omogen, sistem Phast. Coomasie Blue R 350 colorat), M1 și M2 reprezintă indicatorii de greutate moleculară. B] Colorarea Western a HMW, LMW și LTP 1 -orz folosind anticorpi specifici împotriva LTP 1-orz.

Figura 6, cromatografia cu schimb de ioni a LMW pe S-Sepharose Fast Flow (5x7 xcm, 135ml) echilibrată cu acetat de sodiu 20 mM, pH 4,9 —gradient NaCI; — absorbanța la 280nm.

Figura 7, potențialul de spumare obținute prin teste de spumare efectuate pe apă distilată conținând concentrațiile crescătoare ale Bazinelor I, Bazinelor III sau LTP 1 .Concentrația proteinei dizolvate a fost calculată cu ajutorul analizei aminoacidului.

Figura 8, potențialele de spumare obținute din teste de spumare efectuate pe bere conținând concentrații crescătoare ale Bazinului I, Bazinului III sau LTP 1. Concentrația proteinei dizolvate a fost calculată cu ajutorul analizelor de aminoacizi.

Figura 9, potențialele de spumare obținute din testele de spumare efectuate pe apă soluție conținînd concentrații crescătoare de LTP 1-orz singur sau în prezență de 0,4mg/ml bazin I. Concentrația proteinei dizolvate a fost calculată folosind analizele aminoacidului.

Figura 10, potențialele de spumare efectuată pe soluții apoase conținând

RO 112763 Bl concentrații crescătoare ale Bazinului III sau în prezență de 0,4 mg/ml din Bazinull. Concentrația proteinei dizolvate a fost calculată cu ajutorul anaizelor de aminoacizi.

Figura 11, filtrarea pe gel a bazinului III izolat din cea de a treia flotație a berii lager pe Sephadex G-50 echilibrat cu 20 mM NaAc, 0,1 M NaCI, pH 4,9.

Figura 12 A și Figura 12B ilustrează spectrele Ή RMN ale LTP 1 din germeni de orz si respectiv a spumei de bere LTP 1.

în prealabil, se prezintă etapele de producere a mustului, conform invenției:

PRODUCEREA MALȚULUI

Malțul utilizat în exemplele care urmează a fost produs ca malț lager (malț ușor].

Producerea mustului de bere folosind metoda de terciuire standard a European Brevery Convention

Măcinare g de malț se obțin prin măcinare și rezultă 50 g de făină care se transferă într-un pahar pentru terci.

Procesul de măcinare se efectuează pe o moară cu discuri de tipul Buhler-Miag având o distanță de 0,2 mm între discurile morii.

Terciuire

Baia de terciuire se menține la temperatura de 45 °C.

200 ml de apă distilată la o temperatură de aproximativ 46 °C se trece într-un pahar de laborator sub agitare cu o vergea de sticlă pentru a evita formarea de ghemotoace. Se asigură ca temperatura în pahar să fie exact 45 °C.

Paharul se plasează imediat în baia pentru terci și agitatorul se pune în mișcare. Temperatura se menține la 45 °C în pahar pe o durată de timp de exact 30 de minute. Temperatura din pahar apoi crește cu 1 grad pe minut timp de 25 de minute.

Când se atinge temperatura de 70°C, se adăugă o cantitate suplimentară de 100 ml de apă distilată. Temperatura se menține la 70°C timp de oră. Paharul se răcește, apoi, la temperatura camerei în 10-15 minute. Agitatorul se spală cu o cantitate mică de apă distilată, exteriorul paharului de laborator se usucă, iar conținutul paharului se ajustează la 450,0 g prin adăugare de apă distilată.

Filtrare

Conținutul paharului se agită cu grijă, cu o vergea de sticlă și se golește imediat și se completează printr-un filtru de hârtie.

Primii 100 ml din filtrat se returnează în pâlnia de filtrare.

Filtrarea se oprește atunci când turta de pe filtru pare uscată sau în cazul în care filtrarea a devenit extrem de înceată după 2 ore.

Proceduri analitice

Identificarea LTP 1-orz.

(Inhibarea LTP 1- din orz)

Electroforeza gelului de poliacrilamidă SDS se efectuează după fierbere timp de 15 minute cu ditiotreitol 10mM folosind un Pharmacia Past-System și 20% geluri omogene. Inhibarea pe nitroceluloză se efectuează în aparatul Phast-System la temperatura de 70°C timp de 30 de minute. După spălare cu apă, nitroceluloza se incubează timp de 30 de minute cu ser de vițel pentru a bloca legătura nespecifică și apoi se incubează peste noapte cu anticorpi LTP 1 specifici ( preparați așa cum s-a descris în exemplul 8). Sistemul de pată Promega Western AP ( Catalog nr. W 3930] se aplică apoi aplicat pentru a detecta legătura anticorp specifică. Un amestec de nitro tetrazoliu albastru și 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfat a fost utilizat ca substrat de dezvoltare a culorii pentru fosfatză alcalină.

(Secvențarea aminoacidului Nterminal]

Secvențarea aminoacidului N-terminal se efectuează pe un model Applied Biosystems 470 A de secvențiere în fază gaz, folosind programul asigurat de companie. Aminoacizii marcați cu feniltiohidantoin din aparat de secvențare se identifică on-line (în flux] de fază-inversă

RO 112763 Bl folosind un model Applied Biosystems 120 A de analizator cu feniltiohydantoin.

Compozițiile de aminoacizi se determină prin metodăa cu fenol/acid sulfuric (Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton,

J. K., Rebers, P. A. & Smith, F.: Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Metodă colorimetrică pentru determinarea zahărului și substanțelor înrudite. Anal. Chem. 28: 350-356 1956).

Determinarea conținutului de proteine.

Conținutul de proteine se determină din analizele de aminoacid sau prin metoda de legătură-colorată a lui Bradford (Bradford, M. M.:A rapid and sensitiv method for the quantitation of microgram quantitation of utilizing the principie of protein-dye binding. O metodă rapidă și sensibilă pentru cuantificarea cantităților de microorganisme de proteină utilizând principiul legării colorate a proteinei], Anal. Biochem. 72: 248-254 1976).

Testele de spumare

Un sistem de testare a spumei optico-electric (Haugsted, C. & Erdal, K.: Head hunting. Vânătoarea de capete. Proc. Eur. Brew. Conv., Congresul al 23-lea, lisabona 1991, P.449456.Haugsted, C., Pedersen, Μ B. & Erdal, K: An optoelectrical foam assay system.Sistem de testare a spumei opticoelectric. Montsschr. Brauwissenschaft43: 336-339, 1990) folosind analiza imaginii video digitale, utilizată pentru a măsura potențialul de spumare și timpii de înjumătățire a spumei cu o probă de 10 ml. Potențialul de spumare (P) este cantitatea de spumă în ml formată inițial pe 1 ml de probă. Timpul de înjumătățire a spumei (F) este timpul în secunde necesar ca coloana de spumă să coboare la jumătate din volumul inițial. Conținutul de spumă este potențialul de spumare multiplicat cu volumul în ml. Fracțiuni sau lipsa de fracțiuni obținute după cromatografie se dializează conta apei distilate în membrane de dializă Spectro por (marcă înregistrată] (tăiere 3.500

Dalton) înainte ca testele se spumare să fie efectuate sau liofilizate pentru a îndepărta acetatul de amoniu. Testele de spumare se realizează în quadruplicat.

Analizorul de stabilitate a spumei, System Carlsberg, (Hallgren, L., Rosental, I. And Raamussen, J. N.: Experiences whit a new foam stability analyse, System Carlsberg. Experiențe cu un nou analizor pentru stabilitatea spumei sistem Carlsberg. J. Am. Soc. Brew. Chem. 49: 68-86 1991) utilizat pentru testul de spumare a berii îmbuteliate conținând bioxid de carbon C0₂. Timpul de înjumătățire a spumei, se determină prin această metodă, și este timpul de înjumătățire în secunde pentru destrămarea spumei în bere în urma unei conversii complete a 150 g bere în spumă. Această destrămare a spumei este, după o întârziere inițială de aproximativ 30 secunde, un proces de ordin unu (Rassmussen, J, N.: Automated analysis of stability. Analiza automatăa stbilității spumei. Carlsberg Res. Commun, 46: 2536, 1981).

EXEMPLUL 1

Izolarea și purificarea Cereal-LTP din germeni de orz (LTP).

Procedura a)

LPT 1 din orz pur se izolează din 25 kg făină de orz (varietatea Alexis cultivată în Danemarca în 1992) prin extracție cu 250 I de apă la pH 6,5 timp de 2 ore. Amestecul se lasă peste noapte la temperatura de 2°C pentru a permite materialului insolubil să precipite. Supernatantul se concentrează prin ultrafiltrare până la 7I și s-a adăugat sulfatul de amoniu până la concentrație de 40% din saturație. După 2-3 ore la temperatulra de 2°C precipitatul se îndepărtează prin centrifugare, iar la supernatant se adaugă sulfat de amoniu până la 75% din concentrația de saturație. După 16 ore la temperatura de 2°C, suspensia rezultată este cantrifugată, obținându-se un precipitat care poate fi depozitat la temperatura de 2°C timp de

RO 112763 Bl mai multe săptămâni. 0 pătrime din precipitat se dizolvă în 5OO ml apă, încălzită la temperatura de 1OD°C și răcită imediat pe gheață. Soluția este centrifugată pentru a îndepărta orice precipitat și dializată pe membrană de dializă Spectro/por (marcă înregistrată] (tăiere 3500 Dalton] față de apă. După centrifugare, dializatul ajustat la un pH de 7,0 prin adăugare de hidrixid de sodiu (NaOH) se supune cromatografiei cu schimb de ioni pe o coloană de celuloză CM (5cm x 25cm, 500ml] echilibrată cu Na-fosfat 20 mM, pH 7,0. InhibareaWestern scoate în evidență LPT 1 din orz pentru a fi eluată de NaCI cu un gradient de la O la 0,1 M. Fracțiile conținând LPT 1 se combină, se dializează pe o membrenă Spectra/por (marcă înregistrată] față de apă și se introduc într-o coloană de S-Sepharose Fast Flow (5cm x 15cm, 300 ml) eliberată în 20 mM, pH 7,0. LTP 1 din orz este eluată prin aplicarea unui gradient de clorură de sodiu (NaCI) de la O până la 0,3 NaCI în aceeași soluție tampon. Fracțiunile conținând LTP 1 din orz așa după cum sunt găsite la Îmbibarea-Western, sunt cufundate, dializate față de apă distilată într-o membrană de dializă Spectro/por (marcă înregistrată) și liofilizată. Secvențarea aminoacidului N- terminal scoate în evidență secvența Leu-Asn-+-Gly-Val-AspSer- în care semnul plus denotă o poziție liberă corespunzătoare cisteinei găsită la această poziție în LTP 1 și arată că LTP 1 este pur.

Procedura b]

Este similară cu procedura a] cu excepția faptului că lipsește faza de încălzire.

Nu s-a observat nici o diferență în ceea ce privește proprietățile de spumare sau imunoreactivitate pentru LTP preparat în conformitate cu procedura a] și b).

EXEMPLUL 2

Purificarea LTP 1 din spuma de bere.

□ coloană de spumare continuă, executată din sticlă de borosilicat așa cum este arătat în figura 1. Spuma se produce din 15 I (sau din 1,65 I în care caz toate cantitățile de chimicale manționate în cele ce urmează se reduce cu coeficientul 9) de bere lager prin barbotare cu 450 ml/min gaz azot peste noapte. Gazul azot se saturează cu vapori de apă înainte de introducere în coloana de spumare. Spuma colectată la ieșire se descompune și se diluează până la volumul original al berii cu apă distilată și se reintroduce în coloana de spumare. Se efectuează a doua și a treia flotație așa cum s-a descris mai înainte, iar spuma colectată de la flotația a treia a berii lager se găsește că conține 35% din conținutul total de spumă din berea originală.

Componentele conținute în spuma descompusă de la ultima flotație a fost separată în conformitate cu greutatea moleculară, prin filtrarea gelului Sephadex G-75 într-o coloană 5 cm x 87, 1700 ml echilibrată cu acetat de amuniu 50mM, pH 4,5. Filtrarea gelului din spuma descompusă de la a treia flotație pe Sephadex G-75 conduce la trei vârfuri de absorbanță la 280 nm (Figura 2). Două dintre fârfuri sunt denumite HMW și LMW, așa cum este indicat în figura 2. Fracțiunea HMW se compune din apriximativ 90% hidrași de carbon și 10% proteine, în timp ce fracțiunea LMW se compune din 90% din proteine și 10% hidrați de carbon. Al treilea vârf găsit conține compuși cu greutate moleculară mică, cum sunt aminoacizii, izohumulone și hidrați de carbon.

Compoziția aminoacidului din fracțiunea LMW și fracțiunile din adâncitură, este asemănătoare cu compoziția aminoacidului din proteina de transfer a lipidelor din orz binecunoscută (LTP) (Tabel II). Electroforeza gelului de poliacril amidă SDS a LMW scoate în evidență o pată de culoae cu coomasie Blue 350 acoperind greutăți moleculare din domeniul 6.000-18.000 Dalton (Figura 5). Totuși îmbibarea Western folosind anticorpi specifici împotriva LTP 1 din orz (greutatea moleculară

RO 112763 Bl

9700 Daltoni] ca fiind componentă majoră a LMW (Figura 5). Aceasta se confirmă la secvențarea aminoacidului N-terminal.

Compoziția aminoacidului din LMW indică valori prea ridicate ale Pro și Glx 5 dacă se compară cu cele ale LTP 1 din orz ( Tabelul II], după câte s-ar putea presupune datorită prezenței fragmentelor de hordeină și glutelină; pata găsită la colorarea cu argint după electroforeza io gelului de poliacrilamidă SDS ar putea constitui asemenea fragmente.

Fracțiunea de spumă LMW se liofilizează pentru a îndepărta acetatulde amoniu. LTP 1 se purifică din fracțiunea 15 LMW a spumei obținute din 15 I bere lager prin cromatografie cu schimb de ioni pe S-Sepharose Fast Flow (Figura 6], Fracțiunea LMW se aplică la o coloană 5 x 7 cm, 135 ml echilibrată cu acetat de 20 sodiu 20 mM, pH= 4,9, iar după spălare

LPT 1 este eluat într-un vîrf lărgit (Bazinele ll-IV, Figura 6] prin aplicarea unui gradient linear de clorură de sodiu (NaCI] de 00,3 M în aceeași soluție tampon. Fracțiunea de vîrf (pic] și cele trei gropi ale fracțiunilor conținând LTP 1, așa cum sunt determinete prin Îmbibare-Western, se dializează în apă distilată în membrane de dializă Spectro/por (marcă înregistrată] (tăiere 3500 Dalton] și se liofilizează.

Ultrafiltrare: DDS-GR 81 PP, Dow Filtration, Danemarca Spectro/por (marcă înregistrată): Spectrum Medical Industries, Inc., S.U.A.

C-celuloză: Whatman Biosystems Ltd., Angllia

S-Sepharose Fast Flow: Pharmacia, Suiedia

Sephadex G-75: Pharmacia, Suiedia

Tabel II

Bazine (gropi) de la analiza cromatografică S - Sepharose Fast Flow a LMW

		Bazin I	Bazin II	Bazin III	Bazin IV	LMW	LTP 1al
Asx	[% mol]	7,8	11,5	14,5	14,5	12,6	16,5
Thr	[% mol]	6,1	4,3	3,8	3,7	4,5	3,3
Ser	(% mol]	6,7	7,3	7,8	7,8	7,4	8,8
Glx	[% mol]	20,6	13,7	10,2	9,6	13,3	6,6
Pro	[% mol]	9,6	8,5	7,8	7,9	8,1	6,6
Gly	[% mol]	7,1	8,5	9,6	9,6	8,9	9,9
Ala	[% mol]	7,3	6,3	5,5	5,8	6,1	4,4
Cys	(% mol]	4,3	6,5	7,6	7,5	6,4	8,8
Val	(% mol]	6,8	6,9	6,4	6,1	6,6	6,6
Met	[% mol)	2,2	1,6	1,3	1,2	1,6	1,1
lle	[% mol]	3,7	4,6	5,1	5,0	4,7	6,6
Leu	[% mol]	7,8	7,8	7,4	7,2	7,5	6,6
Tyr	[% mol]	1,7	2,1	2,5	2,5	2,5	3,3
Phe	[% mol]	2,5	1,5	0,6	0,6	1,2	0
His	[% mol]	1,2	1,7	1,8	2,0	1,7	2,2
Lys	[% mol]	2,0	3,3	3,6	4,1	3,3	4,4

RO 112763 Bl

Continuare tabel

Arg	[% mol]	2,5	4,1	4,6	5,0	4,1	4,4
Proteine	[mg]	87	33	190	38	392
Hidrați de carbon	[mg]	24,0	1,3	□	0	25,6
Timp de injumătăț ire al spumeib)	[sec]	356	44	68	54	172
Potențial de spurcare	ml spumă/ ml probă	1,3	1,1	1,5	□ ,8	1,3
Conținut de spumă		378	73	685	63	1260

Notă la tabelul II

a] Valori din Svenson, B., Asano,

K., Janassen, I., Poulsen, F. M., Mundy, J & Svendsen, I.: A 10 kD Barley sees protein homologoua with an alpha-amilase inhibitor from indian finger millet. Un omolog al proteinei din germeni de orz cu greutate moleculară 10 kD cu un inhibitir alfa-amilază din degețelul de mei indian. Carlsberg Res. Commun. 51: 493-500, 1986).

b) Măsurată în soluție apoasă având A (280 nm) = 0,5.

Analizele de aminoacid după hidroliză acidă (Tabelul II) se efectuate asupra vârfului apărut și a celor trei bazine cuprinzând vârful larg, și se evidențiază faptul că fracțiunile din vârful apărut au compoziții de aminoacizi asemănătoare hordeinei și glutelinei având un conținut ridicat de Glx și Pro, în timp ce vârful larg eluatat în timpul gradientului de NaCI se consideră a fi LTP 1 destul de pur din analizele de aminoacid (Tabelul II) și secvențarea aminoacidului cu Nterminal, cu toate că electroforeza gelului de poliacrilamidă SDS a evidențiat încă urme de compuși de colorație Coomasie având greutăți moleculare în domeniul 6.000 - 18000 Dalton în cele trei bazine (porțiuni concave în cromatogramă) cuprinzând vârful eluat larg. Atât fracțiunea vârfului ascuțit conținând hordeină/glutelină (Bazinul I), cât și fracțiunile LTP 1 (Bazinele II -IV) produc spumă cu potențial bun în apă (Tabelulll), dar timpul de înjumătățire al spumei pentru fracțiunile LTP 1 este foarte scăzut, contrar fracțiunii de hordeină/glutelină care produce spumă cu timp de înjumătățire ridicat (Tabelul II). Calcularea conținutului de spumă în cele două bazine a evidențiat faptul că 95% din conținutul de spumă găsit în LMWeste prezent în cele patru bazine (Tabelul II).

Testul A, test pentru determinarea tipului de LTP

Fracționarea bazinului III

Bazinul III, obținut din bere așa cum este descris în exemplul 2, se fracționează în conformitate cu greuta

RO 112763 Bl tea moleculară, prin filtrarea gelului pe Sephadex G - 50 într-o coloană (2,6 cm x 67 cm, 330 ml) echilibrată cu 20 mM NaAc, 0,1 M NaCI, pH 4,9. Această separare duce la două vârfuri de absorbantă la 280 nm, bazinul A și bazinul B (figura 11). SDS-PAGE în condiții nereducătoare și îmbibarea Western (Western-bloting) folosind anticorpi specifici împotriva LTP 1 din orz evidențiază faptul că bazinul A este compus în principal din două forme dimerice ale LTP, dar se observă și forme multimerice mai mari. Prin contrast în bazinul B se va găsi numai LTP 1 monomeric.

Testul b test pentru determinarea tipului de LTP

Se înregistrează spectrul Ή RMN pentru LTP obținut din orz (exemplul 1 b) și LTP 1 obținut din spuma de bere, ia temperatura de 310 K (37°C) și pH 4,0.

Spectrele rezultate sunt arătate în figurile 1 2A și 12B.

Spectrele LTP 1 din germeni de orz (figura 12 A) a prezentat un spectru ’H RMN care este tipic pentru o proteină globulară unde cea mai mare parte a structurii secundare este alfahelix.

Aceasta se observă la majoritatea H“ având deplasări chimice sub 4,8 ppm. Mai mult decât atât dispersia semnalelor RMN este o indicație clară că o parte substanțială a proteinei este înfășurată și că ea are o structură secundară bine definită.

□ analiză detaliată a spectrului cu COSY (correlation spectroscopy spectroscopie de corelare), Tocsy (total correlation spectroscopy - spectroscopie de corelare totală) și NOESY (nuclear Overhauser spectroscopy spectroscopie nucleară Overhauser) au confirmat faptul că LTP 1 din germeni de orz este o proteină globulară cu o structură bine definită.

Spectrul (figura 12 B) al LTP a spumei de bere este tipic pentru proteine care sunt substanțial sau parțial neânfășurate, practic fără structuri secundare și terțiare. Se poate conclude că LTP 1 izolat din bere este mai mult sau mai puțin denaturat.

EXEMPLUL 3

Purificarea LTP din primul must de bere.

Primul must se obține dintr-o fabricație de bere lager de la fabrica de bere Carlsberg Brevery. Mustul este centrifugat într-o centrifugă Sorwell RC 3 timp de 30 de minute la o turație de 4.000 rotații/minut în scopul îndepărtării oricărui materii insolubil. Sulfatul de amoniu se adaugă la o concentrație finală de 85% și după 16 ore la temperatura de 4°C suspensia rezultată se centrifughează timp de 30 deminute la o turație de 4.000 rotații/minut. Precipitatul se dizolvă în 300 ml de apă și 2 x 60 ml se supune filtrării gelului folosind Sephadex G -75 într-o coloană (5 cm x 87 cm, 1700 ml) echilibrată cu acetat de amoniu 50 mM, pH 4,5. Modelul de eluție este similar celui obținut după filtrarea spumei descompuse (figura 2). Fracțiile LMW combinate, se liofilizează, (pentru a îndepărta acetatul de amoniu), dizolvate în apă, dializate și supuse cromatografiei pe S Sepharese Fast Flow (5x7 cm) echilibrată cu acetat de sodiu 20 mM, pH 4,9. LTP 1 este elutat prin aplicarea unui gradient linear de clorură de sodiu (NaCI) (O -0,3 M) în aceeași soluție tampon. Profilul eluției este similar cu cel arătat în figura 6 pentru fracționarea fracțiunii LMW izolată din spumă. Fracțiile constituind bazinul III

RO 112763 Bl se cufundă și se dializează în apă distilată într-o coloană de dializă Spectro/por (marcă înregistrată) (tăiere la 3.5OO Daltoni) și se liofilizează. Concentrația LTP ( modificat și nemodificat) se determină prin analiza amino acidului.

Test A, test privind abilitatea fracțiunilor HMW șiLMW de a spuma în apă

Fracțiunile HMW și LMW obținute din bere lager așa cum este descris în Exemplul 2, se testează în 5 ceea ce privește abilitatea lor de a spuma în apă. Rezultatele sunt cuprinse în Tabelul III.

Tabelul III

Potențialul de spumare (P) și timpul de înjumătățire al spumei (F) din amestecurile HMW și W în apă.

LMW	HMW (micrograme/ml)
(Micrograme/ml)	□	0,3	0,6	1,2	2,4
75 P (ml spumă/ml probă] F (sec)	0,56±0.04 199±15	0,63±0.04 251±67	0,68±0.03 236±26	0,69±0.06 300±3	0,75±0.05 313±71
150 P (ml spumă/ml probă] F(sec)	□,89±0.05 177±14	O,95±O.O3 251+27	0,97+0.03 309±30	1,04 ±0.03 276±8	1,09±0.05 293±37
300 P (ml spumă/ml probă) F (sec)	0,56±0.04 199±15	1,34±O.O9 251±18	1,04±0.01 251+29	1,41 ±0.05 290±39	1,47±0.06 290±29
600 P (ml spumă/ml probă) F (sec)	1,89+0.08 208+61	1,99±0.15 258+65	1,83±0.05 239±10	2,09±0.09 263±1O2	2,1O±O.O7 277±24

Acest rezultat arată faptul că concentrația fracției LMW are mare influiență asupra potențialului de spumare, independent de concentrația HMW. Acest fapt este ilustrat în continuare în figurile 3 și 4 utilizând valorile din tabelul III.

Test B, test asupra fracțiunilor de stabilizare a spumei din berile de tip lager fabricate cu diferite tipuri de orz.

LTP 1 se izolează din 5 tipuri de bere lager, care diferă în ceea ce privește potențialul de spumare. LTP se obține practic din 1,65 I de bere așa cum este descris în exemplul 2, utilizând doar separarea pe Mono S Sepharose Fast Flow.

Berile lager se fabrică din diferite varietăți de orz în conformitate cu cele ce urmează:

A : Blenhein

B : Caruso

C Grit

D : Eminant

Amestec: Amestec de varietăți necunoscute de orz.

Rezultatele sunt trecute în tabelul IV.

RO 112763 Bl

Tabelul IV

Investigații asupra fracțiunilor de stabilizare a spumei din berile de tip lager fabricate cu diferite tipuri de orz.

Malț		Amestec3’	A	B	C	D
Bere	Potențial de spumare (ml spumă/ml probă)	0,72	1,13	1,13	1,44	1,22
Timp de înjumătățire (sec)	181	200	189	158	179
Conținutul de spumă per I de bere	715	1130	1130	1440	1200
Flotația a-ll-a	Recuperarea proteinei (%)	32	21	32	30	31
Conținutul de spumă per I bere	240	490	360	670	520
HMW	Proteine (% g/g)	16	12	8	15	14
Hidrati de carbon (% /g)	84	88	92	85	86
LMV	Conținutul de spumă per I de bere	210	160	190	270	210
Proteine (% g/g]	86	76	71	76	85
Hidrati de carbon (% /g)	14	24	29	24	15
Mono Sb)	Fracția vârfului (% proteină)	25	10	40	8	8
Fracția eluată (% proteină]	75	90	60	92	92

a) Nu s-au utilizat fructe de hamei.

B] Rășină schimbătoare de ioni, Pharmacia, Suedia.

Test C test de spumare efectuate pe LTP 1 izolate din făină de orz

Testele de spumare se efectuează pe LTP 1 izolate din făină de orz așa cum este descrise îrj exemplul 1, procedura b) și pe bazinul I și Bazinul III obținute din berea tip lager așa cum este descris în exemplul 2.

Apa utilizată este apa distilată.

Berea utilizată este berea lager Carlsberg.

în fiecare test se utilizează 1 □ ml fie de apă fie de bere și Bazinele sau LTP se adăugă imediat, înainte ca spuma să fi fost generată așa cum este descris mai înainte.

Când concentrații de LTP 1, Bazin I sau Bazin III izolate se dizolvă în apă sau, respectiv, în bere, soluțiile indică un potențial crescut de spălare în testele de spumare (Figurile 7 și 8], cu toate că intensificarea potențialului de spumare este

RO 112763 Bl puțin pronunțată pentru soluțiile de bere (Fig.8) decât pentru soluțiile de apă (Fig. 7], posibil pentru componentele pozitive de spumare deja prezente în bere. La concentrații scăzute de proteină efectul adăugării fracțiunii LTP 1 în bere (Bazin III) este mai mare decât pentru fracțiunea conținând hordeină/glutelină fragmente (Bazin I). Adăugarea de LTP 1 izolat din făină de orz la bere conduce atât la un potențial crescut (Fig. 8] cât și la un timp de înjumătățire al spumei întrucîtva mai crescut. Mai mult decât atât, efectul asupra potențialului de spumare datorită concentrațiilor crescute de LTP 1 (Exemplul 5) este mai pronunțat pentru LTP 1 izolat din bere (Bazin) decât pentru LTP 1 izolat din orz (Fig.8). Recombinarea experimentelor, respectiv testele de spumare efectuate pe soluții de 0,4 mg7ml Bazin I în apă distilată cu concentrații crescute de Ltp 1 izolat fie din orz fie din bere (Bazin III) au susținut această observație, (Figura 9 și 10). Efectul LTP 1 din orz asupra potențialului de spumare în prezența Bazinului 1 este mai mic decât efectul unei concetrații similare a Bazinului

III.

Test D, test ELISA (pentru determinarea concentrația LTP1 ).

Producerea de anticorpi la LTP 1 din orz.

Doi iepuri se imunizează cu 100 micrograme de LTP 1 din orz (obținut din făină de orz de tipul Alexis așa cum este descris în Exemplul 1 procedura a] ) per imunizare în conformintate cu schema de imunizare standard utilizată de Dako, Glostrup, Danemarca.

Se obține 20 ml de ser de la fiecare animal la 54 de zile de la prima injecție și apoi la intervale lunare.

Se utilizează serul obținut de la prima sângerare a unui animal pe toată durata experimentelo descrise mai jos.

Purificarea anticorpilor

Anticorpi din clasa imunoglobulinei G (IgG) se purifică de alte componente ale serului prin afinitatea cromatografiei asupra Protein A-Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Suedia) în conformitate cu instrucțiunile fabricantului.

Anticorpii recunosc LTP 1 separați de anticorpii cu altă specificitate prin afinitate cromatografică pe o coloană mică preparați prin atașare covalentă a LTP 1 din orz la Sepharose. 64 mg LTP 1 din orz se dizolvă în 1 □ ml bicarbonat de sodiu (NaHCD₃) 0,1 m, 0,5M clorură de sodiu (NaCI) la pH 8,3 și se cuplează 2 g Sepharose 4B activată cu CNBr (Pharmacia, Suiedia) în conformitate cu instucțiunile fabricantului. Un ml de imunoabsorbant se încarcă într-o coloană mică echilibrată cu fosfat de sodiu 10 mM, 150 mM clorură de sodiu, pH 7,3 (PBS₁₀). Fracțiunea IgG purificată prin cromatografie pe Protein A-Sepharose se aplică pe coloană, care se spală cu un tampon de echilibrare până când A₂₈₀ este 0,002. Legătura IgG este eluată cu acid formic 0,5 m, pH 2,0, se diluiază cu 4 voi 10 x PBS₁₀ iar pH se ajustează la 4,0 cu hidroxid de sodiu. în final proba este dializată în PBS₁₀ pe o membrană Specto/por (marcă înregistrată] (tăiere la 3.500) și biotinilată așa cum este descris mai jos.

Biotinilarea anticorpiulor

10mg anticorpi în 1 ml PBS₁₀ se amstecă cu 0,1 ml soluție tampon de carbonat de sodiu 1M pH 9,5. Anticorpii sunt apoi biotinilizați prin adăugare de 57 microlitri o,1 MBXNHS (biotinamino caproet N-hidrixisuccinimidaester dela Sigma, S.U.A., Cat No.B 26439 în IMSO (dimetilsulfoxid). Amestecul se lasă timp de o oră la temperatira camerei. După aceasta, BXNHS se îndepărtează, iar soluția tampon se modifică cu PBS₁₀ prin filtrarea gelului efectuată în conformitate cu instucțiunile fabricantului pe o mică coloană disponibilă Sephadex G-25 (PD-1 □ de la Pharmacia, Uppsala, Suedia) echilibrată cu PBS₁₀. Concentrația anticorpului în reagent se ajustează la 1 ml prin adăugare de PBS₁₀ la un volum total de 10 ml. După adăugarea a 100 mg BSA (bovine serum albumin - albumină din ser de bovină], reagentul se depozitează în alicoți la temperatura de -20°C.

RO 112763 Bl

Test E, testul Imunosorbeat al enzimei legate (Enzyme Linked Imunosorbeat Assay (ELISA) ] pentru LTP

LTP se determină cu ajutorul procedurii ELISA competitive.

Inițial, LTP din orz purificat se adsoarbe pe suprafața interioară a bazinelor de polistiren. Bazinele se aranjează în fâșii de 12, iar fâșiile se plasează în rame conținând fiecare 8 fâșii (Nune Imuno Module C12 Maxisorb de la Nune, Danemarca). 200 microlitri de soluție diluată de LTP 1 obținută așa cum este descris în Exemplul 1, procedura a) (100 mg/ml PBS₁₀ se adaugă la fiecare Bazin și se va inocuba la temperatura de 4°C, timp de 16-20 ore. După această incubare, locurile de legare, reziduale, de pe suprafața polistirenului se blochează prin incubare a 225 microlitri BSA/PEST (1 mg BSA/ml PBST), unde PBST este PBS₁₀ cu adăugarea a 0,05% Tween 20) în fiecare Bazin la 35°C timp de 1 oră. Bazinele se golesc și se spală de 6 ori manual potrivit benzilor de polistiren (Nune Imuno Wash 12 de la Nune, Danemarca) și se depozitează la -20 °C până la utilizare.

înainte de analizare, probele ce conțin LTP 1 se diluiază în mod corespunzător cu BSA/PBST, iar soluțiile standard de LTP 1 obținute așa cum s-a descris în Exemplul 1 procedura a] se prepară în aceeași soluția tampon. Anticorpii biotinizați care recunosc LTP din orz se adăugă la o concentrație finală de 100 mg/ml. 200 microni de alicoți din amestecuri se incubează în bazine, timp de 1 oră la 37°C. Fiecare probă sau standard se analizează în triplicat. După incubare, Bazinele se golesc și se spală așa cum s-a descris mai înainte.

în faza următoare 200 microlitri de alicoți de peroxidază conjugată de streptavidin din hrean, (Sigma, U.S.A., Cat. No. S 5512 ) diluată până la 250 mg/ml în BSA/ PBST se incubează în bazine timp de 10 minute la 2O-22°C. După aceasta bazinele se golesc din nou și spălate.

în final, 200 microlitri de soluție substrat, conținând 3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidină (TMB, 100 micrograme/ml) și

0,015% apă oxigenată în tampon citrat fosfat, pH 5,0 se adaugă la fiecare bazin și se incubează timp de 10 minute la temperatura de 2O-22°C. Reacția enzimei se stopează prin adăugare de 125 microlitri de acid clorhidric 4 N la fiecare bazin, iar absorbanța bazinelor se măsoară la 450nm cu un spectrofotometru înzestrat cu rame de 96 sonde (Perkin-Elmer Lambda Reader).

Fiecare serie de analize include standarde din domeniul 8.000-62,5 mg LTP 1 din orz/ml. Se ridică o curbă standard prin trasarea absorbanței în raport cu logaritmul concentrației de LTP1, și toate concentrațiile de LTP 1 din probe se calculează în raport cu această curbă.

Specificitate anticorpilor

Anticorpii produși împotriva LTP 1 din orz și purificați în ceea ce privește afinitatea, așa cum s-a descris mai înainte, sunt folosiți în petele Western în extractele din orz și malț, mustul de bere și bere. Nu se observă nici o reacție cu alți componenți decât LTP 1 sau LTP 1 modificat.

în testele ELISA, fracțiunile LTP 1 și LTP 1 modificat, din primul must de bere și din spumă sunt recunoscute de anticorpi, dar într-o măsură mai mică decât LTP 1 din orz. Reactivitatea mai scăzută se datorește modificărilor care au avut loc în timpul terciuirii, fierberii mustului, fermentației și procesului de spumare. în comparație cu concentrațiile determinate prin analiza aminoacidului (Exemplul 2) reacția cu LTP 1 sau LTP 1 modificat din primul must de bere, este de aproximariv 65% din reacția cu LTP 1 obținută din făina de orz așa cum este descris în Exemplul 1, procedura a). Reacția cu LTP 1 sau LTP 1 modificat din mustul de congres a fost determinată a fi de aproximativ 90% din recția cu LTP 1 din făina de orz. întrucât curba standard se ridică pe baza LTP din orz (obținut așa cum este descris în exemplul 1, procedura a]), cantitatea reală de LTP 1 sau LTP 1 modificat în mustul de congres se poate determina prin multiplicarea cantității estimate pe baza curbei standard LTP 1 din orz cu 10/9.

RO 112763 Bl

EXEMPLUL 4

Adăugarea de LTP pe durata preparării mustului.

Pentru a investiga efectul adăugării de LTP în timpul fazei de fierbere a 5 mustului s-a stabilit un sistem modal. Mustul dulce este supus fierberii într-un balon cu fund rotund conectat la un răcitor de reflux timp de 90 de minute, folosind o manta de încălzire. Se efectuiază două io tipuri de experiențe:

aJLTP 1 din orz pur de tip Alexis (Danenarca, 1992, obținut așa cum este descris în Exemplul 1 procedura a], 0,5 mg/ml) și/sau extract de hamei (61 mg acid-alfa/litru] se adaugă atunci când se inițiază fierberea și b] LTP 1 dim must pur se adaugă la mustul de bere (fiert sau nefiert), cu sau fără extract de hamei (61 mg acid alfa /1 ml], dar nu a fost supus fierberii.

Tabelul V

Fără LPT adăugat	Potențial de spumare	Adăugare de LPT (0,5 mg/ml]	Potențial de spumare
Must dulce	0,37±0,01	Must dulce	0,75±0,05
Must fiert fără fructe de hamei	0,91+0,06	LPT adăugat la must înainte de fierbere	1,24±0,09
Must fiert cu fructe de hamei	1,68±0,07	LPT adăugat la must înainte de fierbere cu fructe de hamei	2,15±0,02
LPT adăugat la must înainte de fierbere cu fructe de hamei	1,93±0,17

EXEMPLUL 5 □ bere cu concentrație ridicată de LTP se produce într-o instalație pilot de 50 I la fabrica de bere din Carlsberg, utilizând 60 % malț de tip lager și 40 % substsnțe complementare (porumb mărunțit]. Grăunțele de porumb, în conformitate cu specificațiile fabricii de bere Carlsberg, sunt:

apă, % extract, în greutate uscat, % P grăsimi, în greutate uscat, %

Sortat prin sită de tipul Pfungetadter <12,5 >89% <1,0% >2 mm >1,27 mm <0,25 mm

0% < de 3,5% < de 5,0%

Procesul de terciuire a berii cuprinde o terciuire prin decocțiune și fierberea mustului de bere timp de 90 de minute cu 10% evaporare. 15 minute după inițierea fierberii mustului de bere, un preparat proaspăt de LTP 1 se adaugă la cazanul de fierbere a mustului. Acest preparat se extrage din 6x25 kg de făină de orez de tip Alexis, cultivat în Danemarca în 1992, concetrat prin ultrafiltrare și precipitat cu sulfat de amoniu așa cum a fost descris înainte. Precipitatul se dizolvă

RO 112763 Bl în 5 litri de apă, se diafiltrează până la 85Q ml, se înncălzește până la temperatură de 100°C și se răcește imediat pe gheață. Soluția se centrifugheză într-o centrifugă de tip Solwall RC 3 timp de 30 de minute 5 la o turație de 4.OOOrotații/min. Concentrația LTP 1 în supernatant, determinată prin testul ELISA, este de 60mg/ml, iar 800 se adăugă la cazanul de fierbere a mustului de bere. Mustul final io este de 14,5 Plato. Infuzia se fermentează cu drojdie Carlsberg (Saccharomyces carlsbergensis] în rezervoare cilindriceconice. Fermentația primară se va conduce timp de 9 zile iar maturarea și stabilizarea 15 va dura 10 zile. în final berea se filtrează și se dezinfectează până la 10,6 % Plato.

Abilitatea de spumare a acestei infuzii și a infuziei fabricate din aceleași materii prime în condiții identice, dar fără 20 adăugare de LTP 1, se analizează folosind un analizor de stabilitate a spumei, sistem Carsberg. Timpul de înjumătățire a spumei din berea cu conținut ridicat de LTP 1 a crescut până la 115 secunde, în 25 comparație cu 93 de secunde pentru berea fără adaos de LTP 1.

EXEMPLUL 6

Nivelele de LTP 1 (suma de LTP 1 modificată și nemodificată] în mustul de congres.

Malțul se obține dintr-un număr de varietăți de orz utilizat în mod obișnuit pentru fabricarea berii. Varietățile de orz au fost cultivate diferite localități și au fost recoltate în ani diferiți.

Mustul se prepară ca pentru a bere de tip lager.

Mustul de congres se produce din probe de malț prin utilizarea metodei de terciuire standard a European Brewery Convențion așa cum a fost descris aici mai înainte.

Nivelele de LTP 1 (suma de LTP 1 modificat și nemodificat] din probele de must de congres se determină cu ajutorul procedurii descrisă mai înainte. Se analizează un total de 82 probe de must, care corespund la 41 probe de malț.

ELISA se efectuează așa cum este descrisă în exemplul 7, iar concentrația LTP 1 se determină prin utilizarea curbei standard de achivalenți ai LTP 1 din orz, respectiv fără multiplicare cu factorul de corecție.

Rezultatele sunt indicate în Tabelul V. Fiecare valoare reprezintă media a două măsuri de congres separat.

Tabelul V

Varietatea de orez	Țara de origine	Anul recoltării	LPT în mustul de congres, mg/l
Triuph	Franța	65
Ariei		70
Necunoscută	Australia		85
Necunoscută	Germania	9	106
Alexis	Anglia	1992	66
Triuph	Franța	1992	76
Ariei	Danemarca	1992	82
Necunoscută	Australia	?	99
Necunoscută	Australia	9	96

RO 112763 Bl

42

Continuare tabel

Necunoscută	Australia	9	78
Necunoscută	Australia	9	118
Natasha	Franța	1992	118
Halyon	Franța	1992	78
Bl.llls	9	1992	92
Natasha	Franța	1992	104
Natasha	Franța	1992	102
Halayon	Danemarca	1992	109
Carusp	Franța	1993	120
Senor	Danemarca	1993	70
Alexis-81	Danemarca	1993	82
Jessica	Danemarca	1993	93
Chariot	Danemarca	1993	79
Goldie	Danemarca	1993	84
Loke	Danemarca	1993	81
Maud	Danemarca	1993	110
Necunoscută	India	1993	121
Necunoscută	India	1993	103
Necunoscută	Anglia	φ	110
Necunoscută	Scoția	φ	117
Necunoscută	9	9	140
Lenea	Danemarca	1992	87
Lenea	Danemarca	1992	98
Necunoscută	9	1993	61
Natasha	Franța	1992	76
Halcyon	Danemarca	1992	69
Alexis	Anglia	1992	75
Necunoscută	Danemarca	1992	100
Necunoscută	Anglia	1992	99
Necunoscută	Anglia	1992	93
*Alexis	Danemarca	1992	92
Alexis	Danemarca	1992	91
Necunoscută	Anglia	1992	102
Alexis	Danemarca	1992	67
Triuph		1992

RO 112763 Bl

EXEMPLUL 7 Izolarea și purificarea CerealLTP din făină de grâu

LTP din grâu se izolaează din 30 Kg de grâu prin extracție cu 2701 de apă la pH 7,8 timp de 4 ore. Amestecul se lasă 5 peste noapte la temperatura de 4°C pentru a pernițe materialului insolubil să precipite. Q cantitate de 195 I de supernatant se concentrează prin ultrafiltrare până la 6,9 I, iar făina reziduală se îndepărtează prin 10 centrifugare. Se adaugă sulfatul de amoniu până la 80% din concentrația de saturație și după 1 6 ore la temperatura de 4°C suspensia rezultată este centrifugată.□ pătrime din precipitat este dizolvat în 15 400ml de apă și dializat pe o membrană de dializă Spectra/por (marcă înregistrată) (tăiere la 3.500 Dalton) în apă. Dializatul este centrifugat, ajustat la un pH 6,5 și supus cromatografiei cu schimb de ioni, 20 folosind o coloană S-Sepharose Fast Flow (5cm X 15 cm, 300 ml) echilibrată în 20 mM Mes, pH 6,5. LTP 1 din grâu este eluat prin folosirea unui gradient de clorură de sodiu (O la 0,1 M) în aceeași soluție 25 tampon.

Fracțiile conținând componentul cu 10 hDa este identificat prin SDS-PAGE folosind un Phast-System de la Pharmacia, combinate și concentrate În vacuum la 30 temperatura de 35”C folosind un evaporator rotativ. Componenții din probele concentrate sunt separați prin filtrarea gelului pe Sephadex G-50 într-o coloană (2,5 cm x 67 cm, 330 ml] echilibrată cu acetat de sodiu, pH 4,9. Un vârf (peak) conținând o proteină cu 10 kDa este identificată prin SDS-PAGE, și secvența aminoacidului N-terminal, care evidențiază secvența 11 e-Asp-r-Gly-H is-Asp-Ser-Le u-Va I-, unde semnul +, denotă o poziție liberă care corespundeunei Cys găsită la această poziție în LTP 1 de grâu, confirmând că acest component este LTP 1 din grâu pur. Preparatul este dializat pe o memmbrană de dializă Spectra/por (marcă înregistrată) [tăiere la 3.500 Dalton] și liofilizat.

EXEMPLUL 8 Adăugarea de LTP din grâu în timpul preparării mustului de bere.

Efectul adăugării de LTP 1 din grâu în timpul fazei de fierbere a mustului se investighează folosind un sistem model descris în Exemolul 8. LTP din grâu pur (obținu așa cum este descris în exemplul 11 )(0,5 mg/ml) și/sau extract de hamei (61 mg a-acid/1) se adaugă atunci când se inițiază fierberea. Potențialele de spumare rezultate sunt arătate în Tabelul VI care urmează:

TABELUL VI

Fără adăugare de LPT	Potențial de spumare (ml/ml)	Adăugare de LPT (0,5 mg/ml)	Potențial spumare
Must fiert fără fructe de hamei	1,01 ±0,04	LPT adăugat la must înainte de fierbere fără fructe de hamei	076±0,07
Must fiert	1,65±0,05	LPT adăugat la must înainte de fierbere fără fructe de hamei	2,20±0,08

EXEMPLUL 9. Influiența fierberii asupra potențialului de spumare a LTP 1 din orz și din grâu.

LTP 1 din orz și din grâu (0,5 mg/ml) obținut așa cum este descris în exemplul 1 b și rspectiv Exemplul 11, este dizolvat în 20 mM Mes ((2-(N-morfolino)etan acid sulfonic], pH 5,5. Se adaugă 2%etanol (cu sau fără 2,5 mg/ml tri linelonă). Se adaugă extract de hamei la o concentrație finală de 61 mg alfa acid/l așa cum este indicat în tabelul VII și amestecul este supus fierberii timp de 90 de minute, așa cum este descris în exemplul 8. Măsurători privind spumarea se efectuiază după adăugarea fracției HMW (2,5 micrograme/ml) obținut așa cum este descris în exemplul 2.

RO 112763 Bl

TABELUL VII

	Fierberea	Aditivi	Potențial de spumare
LPT 1din orz	-	-	0,78+0,02
90 minute	-	0,61 ±0,03
90 minute	fructe de hamei	1,40+0,05
90 minute	fructe de hamei+trilineonlin	1,92±0,05
LPT1din grâu	-	-	0,80±0,04
90 minute	-	1,02±0,03
90 minute	fructe de hamei	1,85±0,06
90 minute	fructe de hamei+trilineonlin	1,83±0,07

Revendicări 15

Claims (19)

1. Revendicări 15

   1. Băutură, conținînd proteine și/sau peptide, caracterizată prin aceea că, conține unul sau mai mulți componenți de formare a spumei, respectivul 20 component de formare a spumei fiind priteine sau peptide din cereale clasificare ca priteine de transfer a lipidelor (Lipid Transfer Proteins-LTP, Cereal-LTP) și/sau omologi ai acestuia, definite ca proteine 25 cu 50-110 aminoacizi, preferabil 80-100 aminoacizi, avînd cel puțin 60%, preferabil 80% sau mai mult din secvența omoloagă a Cereal-LTP, și sau o fracțiune modificată de Cereal-LTP obținută din Cereal-LTP 30 și/sau omologi prin încălzire, fierbere și/sau terciuire a Cereal-LTP și/sau omologi, în apă la un pH cuprins între 3 și 7, astfel încît concentrația Cereal-LTP și/sau omologilor și/sau a fracțiunii Cereai- 3 5 LTP modificată a acesteia să fie cel puțin 25 micrograme/ml și preferabil mai mult de 100 micrograme/ml, cu condiția ca conținutil în Cereai -LTP din cereale și/sau omologi ai acestora, și/sau ai fracțiunii 40 Cereal-LTP modificată, să fie ce cel puțin X, preferabil cel puțin XI, unde X și XI reprezintă nivelurile ce se pot obține în berea fabricatădin materii prime, fără adăugarea suplimentară a materialelor ce 45 conțin LPT, materii prime care prin utilizarea metodei de trciuire, europian Brevery Convention (EBC), conduc la un must având o concentrație a Cereal-LTP care corespunde la 125pg/ml respectiv 150pg/ml de LTP 1 nemodificat.
2. 2. Băutură, în conformitate cu revendicarea 1, caracterizată prin aceea că, conține Cereal-LTP și/sau omologi ai acesteia și/sau o fracțiune de Cereal-LTP modificată, obținuți din orz.
3. 3. Băutură, în conformitate cu revendicarea 1, caracterizată prin aceea că, băutura este fermentată.
4. 4. Băutură, în conformitate cu revendicarea 1, caracterizată prin aceea că, conține suplimentar proteine de înmagazinare cereale cum este hordena și/sau gluteina sau fragmente ale acestora.
5. 5. Băutură, în conformitate cu revendicarea 1, caracterizată prin aceea că, conține suplimentar alte albumine, cum este proteina Z care se poate obține din bere.
6. 6. Băutură, în conformitate cu revendicarea 1, caracterizată prin aceea că, conține suplimentar hidrați de carbon.
7. 7. Băutură, în conformitate cu revendicarea 1, caracterizată prin aceea că, conține suplimentar lipide și/sau acizi grași.

   RO 112763 Bl
8. 8. Băutură, în conformitate cu revendicarea 1, caracterizată prin aceea că, că băutura este bere.
9. 9. Băutură, în conformitate cu revendicarea 1, caracterizat prin aceea că, conține suplimentar componente din hamei cum sunt izo-a acizi din hamei și alte rășini cu gust amar din hamei.
10. 10. Metodă pentru producerea băuturii, caracterizată prin aceea că, Cereal-LTP și/sau omologi ai acesteia, se adaugă la băutură în mod continuu sau în una sau mai multe faze de fabricație, definite ca proteine și/sau peptide din cereale cu 50-110 aminoacizi, preferabil 80-100 aminoacizi, avînd cel puțin 60%, preferabil 80% sau mai mult, omologi din secvența omoloagă a Cerel-LTP, și/sau o fracțiune de peptidă/proteină obținută din Cereal-LTP și 6 sau omologi prin încălzire, fierbere și/sau terciuire a CerealLTP și/sau omologi în apă la un pH cuprins între 3 și 7, până la o concentrație de cel puțin 25pg/ml și de preferat de peste 100pg/ml.
11. 11. Metodă pentru producerea băuturii, conform revendicării 10, caracterizată prin aceea că, în cazul în care pentru obținerea Cereal-LTP modificat, presupune o fază de terciuire, atunci Cereal-LTPși/sau omologi ai acestuia și/sau fracțiunea Cereal-LTP modificată a acestuia, se adăugă înaintea fazei de terciuire.
12. 12. Metodă pentru producerea băuturii, conform revendicării 10, caracterizată prin aceea că, în cazul în care pentru obținerea Cereal-LTP modificat, presupune o fază de fierbere, atunci Cereal-LTPși/sau omologi ai acestuia și/sau fracțiunea Cereal-LTP modificată a acestuia, se adăugă înaintea fazei de fierbere.
13. 13. Metodă pentru producerea băuturii, conform revendicării 10, caracterizată prin aceea că, Cereal-LTP este Cereal-LTP din orz.
14. 14. Metodă pentru producerea băuturii, conform revendicării 10, pentru cazul în care băutura este berea, și cuprinde următoarele faze:

    I) prepararea malțului sau a extractului de malț;

    II) prepararea mustului de bere;

    III] fermentarea mustului de bere;

    IV] limpezirea și finisarea berii;

    caracterizată prin aceea că, Ceral-LTP și/sau omologi ai acesteia, și/sau fracțiunea Cereal-LTP modificată a acesteia, se adaugă înainte sau în cursul oricărei faze de fabricație I],. .IV], dar de preferință în faza II] sau înaintea fazei II).
15. 15. Metodă pentru producerea băuturii, conform revendicării 10, caracterizată prin aceea că, Cereal-LTPși/sau omologi ai acesteia se adaugă sub forma unui aditiv parțial sau substanțial solubil.
16. 16. Metodă pentru producerea băuturii, conform revendicării 10, caracterizată prin aceea că, Ceral-LTP și/sau omologi ai acesteia, și/sau fracțiunea Cereal-LTP modificată a acesteia, se obține din germeni de orz purificat, pentru a avea un conținut mai ridicat de LTP, și în mod deosebit de LTP 1, prin utilizarea transmiterii genetice și că malțul este fabricat dintr-omaterie primă care cuprinde semințe din orz purificate.
17. 17. Metodă pentru producerea băuturii, conform revendicării 10, caracterizată prin aceea că, Ceral-LTP și/sau omologi ai acestuia, și/sau fracțiunea Cereal-LTP modificată a acestuia, sunt obținuți dintr-o drojdie cuprinzând codificarea secvenței AND pentru Cereal-LTP, în genom, în mod deosebit pentru LTP 1, iar drojdia este adăugată în faza de fabricație III],
18. 18. Metodă pentru producerea băuturii, conform revendicării 10, caracterizată prin aceea că, compusul Cereal-LTP și/sau omologi ai acestuia

    RO 112763 Bl și/sau o fracțiune de Cereal-LTP modificată, se prezintă sub formă de semințe sfărâmate, produse de semințegermeni sau un extract de semințe sau produse din semințe.
19. 19.Metodă pentru producerea băuturii, conform revendicării 10, carac terizată prin aceea că, fracțiunea CerealLTP modificată rezultă din Cereal-LTP, prin fierbere în apă împreună cu una sau mai multe din următoarele componente: hordeină, componente ale hameiului, și lipide, în mod deosebit trigliceride.