ES2238119B1 - Procedimiento de obtencion de la enzima endopoligalacturonasa mediante el cultivo de cepas microbianas recombinantes que sobreexpresan el gen epg2 de kluyveromyces marxianus. - Google Patents
Procedimiento de obtencion de la enzima endopoligalacturonasa mediante el cultivo de cepas microbianas recombinantes que sobreexpresan el gen epg2 de kluyveromyces marxianus. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de obtención de la enzima endopoligalacturonasa mediante el cultivo de cepas microbianas recombinantes que sobreexpresan el gen EPG2 de Kluyveromyces marxianus. Se describe la clonación y secuenciación del gen EPG2 así como la construcción de cepas de levaduras que producen y secretan la enzima endopoligalacturonasa en gran cantidad y de forma muy estable. La enzima producida puede ser utilizada en la depectinización de zumos de frutas, verduras y hortalizas, la maceración de vegetales y el aumento del rendimiento en jugo, la formulación de piensos animales y la degradación de residuos vegetales.
Description
Procedimiento de obtención de la enzima
endopoligalacturonasa mediante el cultivo de cepas microbianas
recombinantes que sobreexpresan el gen EPG2 de
Kluyveromyces marxianus.
La presente invención describe la identificación
y clonación en Escherichia coli del gen EPG2 de
Kluyveromyces marxianus que codifica la enzima
endopoligalacturonasa. Asimismo describe la sobreexpresión del gen
EPG2 en levaduras con el fin de obtener una cepa que produzca la
enzima endopoligalacturonasa en grandes cantidades.
Las pectinas son polisacáridos de plantas
formados por subunidades de ácido galacturónico unidas por enlaces
glucosídicos \alpha-1,4 y pueden estar
esterificadas en mayor o menor grado con grupos metilo. Las enzimas
capaces de degradar las pectinas se llaman pectinasas y se pueden
clasificar en dos grupos: pectin esterasas (en adelante PE) que
liberan los grupos metilo de la pectina y depolimerasas que cortan
los enlaces \alpha-1,4 e incluyen a las pectin
liasas (en adelante PL) y a las poligalacturonasas (en adelante
PG). Las PG se dividen a su vez en endopoligalacturonasas (en
adelante endoPG), que cortan en el interior de la molécula de
pectina y exopoligalacturonasas (en adelante exoPG), que liberan
unidades de ácido galacturónico en un extremo de la molécula
(Forgarty y Kelly: 1983. Pectic enzymes. Applied Science Publishers,
London pp 131-182; Rombouts y Pilnic. 1989. Pectic
enzymes. Academic Press, London pp 227-282).
Las enzimas pécticas han encontrado un gran
campo de aplicación en la industria alimentaria, sobre todo en el
procesado de vegetales. Las pectinas causan serios problemas en la
elaboración de diferentes bebidas de frutas, especialmente durante
la clarificación y filtración de los productos, debido a que saturan
y colmatan los filtros que se utilizan para llevar a cabo estos
procesos. Entre las aplicaciones industriales más importantes de
las pectinasas están la extracción y clarificación de zumos de
frutas, sobre todo zumo de manzana, mosto de uva y aceite de oliva.
Por otra parte, las pectinasas también pueden utilizarse, formando
mezclas con otras hidrolasas, en la formulación de piensos animales
y para la degradación de residuos vegetales (Blanco y col.
1999. FEMS Microbiol. Lett. 175: 1-9).
En la actualidad, la principal fuente de enzimas
pécticas para la industria es el hongo Aspergillus niger.
Los preparados comerciales obtenidos a partir de este hongo son una
mezcla de las distintas enzimas pécticas (endo-,
exo-PG, PL y PE), así como de otras enzimas
producidas por el microorganismo, que pueden tener efectos
indeseables sobre los productos tratados. Entre los efectos no
deseables es importante destacar los que se derivan de la acción de
las amilasas, las arabinofuranosidasas y sobre todo de las pectin
esterasas que liberan metanol al producto, compuesto altamente
tóxico.
Por otra parte, se ha comprobado que las enzimas
que tienen un mejor efecto sobre la depectinización, la reducción
de viscosidad y la clarificación de zumos vegetales son las endoPG.
Esta es la enzima que codifica el gen EPG2. En muchos casos
estas enzimas por sí solas son suficientes para obtener el efecto
deseado en el tratamiento del -producto. En otros casos, la
depectinización completa de ciertos sustratos solo se consigue
mediante la acción conjunta de varios tipos de enzimas en la
proporción correcta (Ceci y Lozano. 1998. Food Chem. 61:
237-241). Teniendo en cuenta lo expuesto, es de gran
interés para la industria contar con las distintas enzimas pécticas
por separado para poder utilizarlos solas (caso de las endoPG) o
bien en mezclas con la proporción adecuada de cada tipo de enzima,
según el sustrato sobre el que se vayan a utilizar.
La cepa obtenida mediante el procedimiento que
se describe a continuación muestra la actividad endoPG más alta
descrita hasta el momento en las cepas microbianas productoras de
endoPG. La cepa puede crecer en medios de cultivo económicos y
sintetiza la enzima de forma constitutiva, alcanzando el máximo de
actividad a las 24 horas de crecimiento, antes que en cualquier otra
cepa productora de esta enzima. Estos datos, unidos al hecho de que
la cepa es muy estable, ya que el/los gen/es están integrados en el
genoma de la misma, la convierten en una cepa apta para su
explotación industrial.
Para obtener una cepa microbiana hiperproductora
de la enzima endoPG, en primer lugar, el gen EPG2 se aisló a
partir de la cepa de CECT 1043 de K. marxianus y se clon en
Escherichia coli con el fin de secuenciarlo y facilitar su
manipulación. A continuación se postuló la posibilidad de
sobreexpresar dicho gen en un sistema heterólogo basado en levaduras
hospedadoras (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae o
Schizosaccharomyces pombe), que han dado buenos resultados para
la expresión de diferentes hidrolasas ya que pueden producir y
secretar de forma eficiente grandes cantidades de proteínas
recombinantes (Buckholz y Gleeson. 1991. Biotechnology 9:
1067-1072; Domínguez et al. 1998. Int.
Microbiol. 1:131-142). Con esta finalidad el gen
EPG2 se moviliza a un vector de expresión de levaduras que
es utilizado para transformar a éstas y convertirlas en cepas que
producen la enzima endoPG en gran cantidad.
En el siguiente ejemplo se detallan las
investigaciones que conducen a la obtención de cepas
hiperproductoras de endoPG.
El gen EPG2 de K marxianus fue
amplificado mediante PCR utilizando como molde el ADN de la cepa
CECT 1043 y los oligonucleótidos KM1 (Secuencia 1) y KMIREV
(Secuencia 2).
La extracción del ADN genómico de la cepa CECT
1043 se realizó según un protocolo convencional (Johnston. 1994.
Molecular Genetics of Yeast. Oxford University Press). El programa
utilizado para amplificación ha sido el siguiente:
El producto amplificado se visualizó mediante
electroforesis, se recuperó a partir del gel de agarosa (Sambrook y
col. 1989. Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press)
y se ligó al vector de clonación de E. coli
pCR®-Blunt-II-TOPO (Invitrogen)
utilizando el kit de clonación TOPO Cloning Kit (Invitrogen)
siguiendo las instrucciones del fabricante. La mezcla de ligación
se utilizó para transformar la cepa de E. coli TOP10
(Sambrook y col. 1989. Molecular cloning. Cold Spring Harbor
Laboratory Press) y los transformantes recombinantes se
seleccionaron en placas de LB (triptona 1%, extracto de levadura
0.5% y NaCl 0.5%) suplementado con canarnicina (50 \mug/mL). En
una de estas colonias se comprobó la presencia del plásmido
recombinante mediante PCR utilizando los dos oligonucleótidos y el
programa descritos anteriormente. El ADN plasmídico de esta colonia
se amplificó y se purificó utilizando el kit de extracción de
plásmidos de Quiagen. A este plásmido se le dio el nombre de
pSIVI30.
El fragmento de ADN clonado en el apartado 1 en
el vector pCR®-Blunt-II-TOPO fue
secuenciado utilizando el método de Sanger y col., 1997.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467. Se obtuvo
una secuencia de 1086 pares de bases (Secuencia 3) que fue
analizada usando las bases de datos del servidor de acceso público
BLAST del Centro Nacional de Biotecnología (NCBI, USA). La secuencia
muestra una alta homología con el gen 2EPG1 de K.
marxianus que tiene 1083 pares de bases y también codifica una
endoPG. La secuencia constituye un marco de lectura abierta (ORF)
de 362 aminoácidos, uno más que la proteína codificada por el gen
EPG1. El polipéptido deducido de la secuencia de bases
clonada se muestra en el código de aminoácidos de tres letras en la
Secuencia 4.
Puesto que el gen clonado tiene un aminoácido
más que el previamente descrito EPG1 (Scarcez, T. 1995.
Sometido a las bases de datos EMBL/GenBank/DDBJ), puede
considerarse un nuevo alelo de EPG1, al que se le ha dado el
nombre de EPG2. El aminoácido valina (posición 122) presente
en Epg2p y ausente en Epg1p es el que diferencia los dos alelos. El
análisis de la secuencia de aminoácidos muestra además que los
primeros 25 aminoácidos de Epg2p constituyen una secuencia señal,
el centro activo está localizado en la región conservada entre los
aminoácidos 218-230 y presenta dos sitios de
glicosilación en los aminoácidos 188 y 292. En la Figura 1 se
muestra un alineamiento de las proteínas Epg1p y Epg2p y se señalan
las diferencias entre ambas.
La endoPG codificada por el gen EPG2
muestra un 94.7% de identidad con la enzima codificada con el gen
EPG1 considerando toda la secuencia, un 59% con la endoPG de
Saccharomyces cerevisiae y un 52% con la de Aspergillus
niger.
Para la clonación y expresión del gen EPG2 en
P. pastoris se seleccionó el vector de expresión
pGAPZ\alphaA (Invitrogen). Este plásmido permite la clonación del
gen que se desea expresar, en fase con el péptido señal del factor
\alpha de Saccharomyces cerevisiae, lo que asegura en
muchos casos una excelente secreción al exterior de la proteína
producida por la levadura. Los genes clonados en este plásmido se
expresan bajo el control del promotor GAP lo que permite la
síntesis constitutiva de la proteína. Por otra parte, el plásmido
no se replica autónomamente y sólo puede transformar a las células
de la levadura P. pastoris mediante integración en el genoma
de la misma, por recombinación homóloga. Esta integración puede
producirse en varias copias. Como consecuencia se pueden obtener
cepas que sintetizan proteínas de manera muy estable (ya que el gen
integrado en el genoma no se pierde) y en gran cantidad (puesto que
el gen puede integrarse en varias copias por célula).
El primer paso para la clonación del gen
EPG2 en el vector pGAPZ\alphaA consistió en eliminar los
primeros 25 aminoácidos de la proteína que constituyen el péptido
señal nativo, con el fin de poder clonar la parte del gen que
codifica la proteína madura en fase con la secuencia señal del
factor \alpha de S. cerevisiae que va incluida en el
plásmido.
Para ello, el gen EPG2 fue amplificado de
nuevo mediante PCR utilizando como molde el ADN del plásmido
pSIVI30 que lleva clonado el gen EPG2 y los oligonucleótidos
KM2 (Secuencia 2) y KM1REV (Secuencia 5). El programa utilizado
para la amplificación fue el mismo que se describió en el apartado
1. El fragmento de ADN amplificado mediante estos oligonucleótidos
carece del trozo que corresponde al péptido señal nativo de la
enzima y posee las dianas para las enzimas de restricción
EcoRI (en el extremo 5') y XbaI (en el extremo 3').
Este fragmento se visualizó mediante electroforesis, se recuperó del
gel de agarosa y se digirió con las enzimas de restricción
EcoRI y XbaI (Sambrook y col. 1989. Molecular
cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Por otra parte el vector pGAPZ\alphaA fue
también amplificado y purificado utilizando el kit de purificación
de plásmidos de Quiagen. El vector purificado fue a continuación
digerido con las endonucleasas de restricción EcoRI y
XbaI y ligado al gen EPG2 (Sambrook y col.
1989. Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Con
la mezcla de ligación se transformó la cepa de E. coli TOP10
(Sambrook y col. 1989. Molecular cloning. Cold Spring Harbor
Laboratory Press), y los transformantes recombinantes se
seleccionaron en placas con medio LB (triptona 1%, extracto de
levadura 0.5% y NaCl 0.25%) suplementado con zeocina (25
\mug/mL), X-GAL (0.8 mg) e IPTG (5 \muL de
solución 0.8M). A partir de una de estas colonias recombinantes de
E. coli se amplificó y purificó el ADN plasmídico, se
denominó al nuevo plásmido pSIVI32, se digirió con la enzima de
restricción AvrII y se utilizó para transformar las células
de la levadura P. pastoris.
La transformación de la levadura silvestre P.
pastoris X33 (Invitrogen) se llevó a cabo mediante
electroporación siguiendo el protocolo descrito por Scorer y
col. 1994, Bio/Technology 12: 181-184. Los
transformantes se seleccionaron en medio YEPD (extracto de levadura
1%, peptona 2%, glucosa 2%) suplementado con zeocina (100
\mug/mL) ya que el plásmido pGAPZ\alphaA confiere resistencia a
este antibiótico.
A continuación se seleccionaron al azar 4
colonias resistentes a zeocina y mediante PCR, usando los
oligonucleótidos KM2 (Secuencia 2) y KMIREV (Secuencia 5) y el
programa de amplificación ya descrito en el apartado 1, se comprobó
que. portaban en su genoma el gen EPG2. Estas cuatro cepas
de P. pastoris denominadas SIVI30, SIVI31, SIVI32 y SIVI33
fueron utilizadas para probar su capacidad para producir la enzima
endoPG. En la Figura 2 se muestra el proceso de obtención de cepas
hiperproductoras de la enzima endopoligalacturonasa.
Las cuatro cepas de P. pastoris
seleccionadas que expresan el gen EPG2, se sembraron en
matraces de 1 L que contenían 100 mL de medio YEPD (extracto de
levadura 1%, peptona 2%, glucosa 2%) y se incubaron a 30ºC y 200 rpm
durante 72 horas. A lo largo de este tiempo se fueron tomando
muestras cada 6 horas en las que se determinó la actividad
enzimática. La actividad endoPG se valoró en los sobrenadantes de
los medios de cultivo utilizando el método de Somogyi (Somogyi.
1952. J. Biol. Chem. 159: 19-23) modificado por
Nelson (Nelson. 1957. Methods in Enzymology 3: 85–86). Los
sobrenadantes se centrifugaron, se filtraron a través de membranas
de 0.22 \mum y se dializaron en tampón
acético-acetato 50 mM pH 5 y se utilizaron para
determinar la actividad enzimática. Las reacciones enzimáticas
contenían 0.5 mL de enzima (sobrenadante centrifugado y dializado)
y 0.5 mL de sustrato (ácido poligalacturónico al 0.5% en tampón
acético-acetato 50 mM, pH 5). Se definió la unidad
enzimática como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1
\mumol de ácido galacturónico, o su equivalente en poder
reductor, en 1 min a 37ºC.
La máxima actividad enzimática se alcanzó en
todas las cepas al cabo de 24 h, sin embargo, la cantidad de enzima
producida variaba dependiendo de la cepa probada. Este dato es
consecuente con el hecho de que el número de copias del gen
integradas en el genoma de cada clon puede variar. En la Tabla 1 se
muestran los datos de la actividad enzimática máxima encontrados
para cada una de las cepas probadas: 3.6 U/mL para la cepa SIVI30,
3.7 U/mL para la cepa SIVI31, 5.3 U/mL para la cepa SIVI32 y 8 U/mL
para la cepa SIVI33 (CECT 11779).
| Cepas | Actividad enzimática (U/mL)* |
| Cepa X33 no transformada | 0 |
| SIVI30 | 3.6 |
| SIVI31 | 3.7 |
| SIVI32 | 5.3 |
| SIVI33 | 8 |
De las cuatro cepas se seleccionó, para su
explotación industrial, la cepa SIVI33 por ser la que produce la
mayor cantidad de enzima endoPG y se depositó en la Colección
Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Edificio
de Investigación, Campus de Burjasot, 46100 Burjasot (Valencia) con
la referencia CECT 11779. La producción de la enzima en esta cepa
es una característica muy estable ya que el/los gen/es que la
sintetizan están integrados en el genoma de la levadura y se
expresan sin necesidad de utilizar medios definidos o añadir
antibióticos para mantener la presión selectiva. En consecuencia,
la cepa puede crecer sin ningún problema en los medios económicos
que se utilizan para la producción industrial.
Figura 1: Alineamiento de las proteínas
codificadas por los genes EPG1 y EPG2 de
Kluyveromyces marxianus. Se señalan en negrita los
aminoácidos que difieren entre las dos proteínas. El aminoácido que
diferencia los dos alelos está situado en la posición 122.
Figura 2: Esquema del proceso de obtención de la
cepa CECT 11779 de Pichia pastoris que produce la enzima
endoPG, mediante la expresión del plásmido pSIVI32 consistente en
el gen EPG2 de Kluyveromyces marxianus clonado en el
vector pGAPZ\alphaA de Pichia pastoris.
<110> Universidade de Santiago de
Compostela
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de obtención de la
enzima endopoligalacturonasa mediante el cultivo de cepas
microbianas recombinantes que sobreexpresan el gen EPG2 de
Kluyveromyces marxianus
\vskip0.400000\baselineskip
<130> EPG2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Kluyveromyces marxianus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)-(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético deducido a
partir de la secuencia de bases del gen EPG1 de Kluyveromyces
marxianus correspondiente al extremo amino terminal de la
proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaattcatgt tattcagcaa caccttattg at
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Kluyveromyces marxianus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético deducido a
partir de la secuencia de bases del gen EPG1 de Kluyveromyces
marxianus correspondiente al extremo carboxi terminal de la
proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctagattaa cagaaggctc cgctaccag
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1086
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Kluyveromyces marxianus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gene
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1086)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADN procedente de
Kluyveromyces marxianus correspondiente al gen
\text{EPG2}
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 362
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Kluyveromyces marxianus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Polipéptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(362)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos
correspondiente al precursor de la enzima endopoligalacturonasa
codificada por el gen EPG2 de Kluyveromyces marxianus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Kluyveromyces marxianus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleotido deducido a partir de
la secuencia de bases del gen EPG2 de Kluyveromyces
marxianus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaattcgaca gttgtacctt gagtggga
\hfill28
Claims (11)
1. Un procedimiento de obtención de la enzima
endopoligalacturonasa mediante el cultivo de cepas microbianas
recombinantes que sobreexpresan el gen EPG2 de
Kluyveromyces marxianus.
2. Una secuencia de ADN identificada como
Secuencia 3, según la reivindicación 1, caracterizada por
contener el gen EPG2 de Kluyveromyces marxianus.
3. Un polipéptido identificado como Secuencia 4,
caracterizado por estar codificado por la Secuencia 3, según
la reivindicación 2, y presentar actividad
endopoligalacturonasa.
4. Vectores bacterianos caracterizados
por consistir en plásmidos que portan la Secuencia 3 de ADN, según
la reivindicación 2, o fragmentos de la misma.
5. Vectores de levaduras caracterizados
por consistir en plásmidos que portan la Secuencia 3 de ADN, según
la reivindicación 2, o fragmentos de la misma.
6. Plásmido pSIVI30 caracterizado por
consistir en el plásmido pCR®
Blunt-II-TOPO de Escherichia
coli que contiene la Secuencia 3 de ADN, según la
reivindicación 2.
7. Plásmido pSIVI32 caracterizado por
consistir en el plásmido pGAPZ\alphaA de Pichia pastoris
que contiene un fragmento de la Secuencia 3 de ADN, según la
reivindicación 2, que codifica la proteína madura funcional.
8. Microorganismos recombinantes, según la
reivindicación 1, caracterizados por consistir en una
levadura hospedadora perteneciente a la especie Pichia pastoris,
Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe
transformada con los plásmidos de las reivindicaciones 5 ó 7.
9. Levadura recombinante depositada en la
Colección Española de Cultivos Tipo con el número de registro CECT
11779 caracterizada por consistir en la cepa X33 de
Pichia pastoris transformada con el plásmido de la
reivindicación 7.
10. La utilización de la cepa CECT 11779, según
la reivindicación 9, para producir la enzima
endopoligalacturonasa.
11. La utilización de la enzima
endopoligalacturonasa, según la reivindicación 10, para la
depectinización y clarificación de zumos de frutas, verduras y
hortalizas, la maceración de vegetales y el aumento del rendimiento
en la obtención de jugo, la formulación de piensos y la degradación
de residuos vegetales.
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