CN114144509A - 无醇饮料的生产 - Google Patents

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CN114144509A CN202080051248.4A CN202080051248A CN114144509A CN 114144509 A CN114144509 A CN 114144509A CN 202080051248 A CN202080051248 A CN 202080051248A CN 114144509 A CN114144509 A CN 114144509A
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Abstract

本发明涉及生产醇减少的发酵饮料的方法，以及所得到的醇减少的发酵饮料。本发明还涉及不能将葡萄糖、麦芽糖和/或麦芽三糖完全转化为乙醇的发酵酵母用于生产醇减少的发酵饮料的用途。

Description

无醇饮料的生产
领域：本发明涉及生产包括无醇的啤酒产品在内的醇减少的啤酒产品的方法，并涉及所得到的啤酒。本发明尤其涉及特定酵母菌株用于生产这种醇减少的啤酒产品的用途。
1发明背景
发酵影响可发酵糖转化为乙醇，并且还导致形成各种新的风味化合物，其中包括酯。同时，啤酒的发酵去除了大部分的醛，从而防止了所得啤酒的麦芽汁风味。发酵后，可以过滤和/或储存啤酒，以便优化外观和味道。
与啤酒的醇含量有关的健康问题和对交通安全的提高的认识已经引起了对具有低或甚至零醇含量的啤酒的兴趣。目前，主要有两种制备低或零醇含量啤酒的技术：常规啤酒的脱醇，以及通过限制醇发酵制备啤酒。
啤酒的脱醇是在常规酿造的啤酒上进行的，并且被设计成去除乙醇，但是尽可能少地去除风味组分。脱醇可以通过例如常规啤酒的精馏，反渗透或透析来实现。然而，在啤酒脱醇时防止风味丧失是具有挑战性的。因此，脱醇啤酒的缺点是单调的风味，为了获得可接受的啤酒，必须通过人工添加风味和芳香化合物来校正该风味。然而，由于味道和气味由于多种化合物一起负责赋予味道而是复杂的，所以通常认为脱醇和随后人工调味的啤酒的味道没有常规啤酒的味道令人愉悦。
低醇或零醇啤酒也可以通过限制醇发酵来制备。限制醇发酵是一种在几乎没有或没有乙醇形成的条件下发酵麦芽汁的方法。一个重要的方法是冷接触发酵。当麦芽汁在低温下发酵时，酵母几乎不产生醇，尽管它确实产生一些风味组分如酯，即使每种酯的量可能与常规发酵获得的量不同。在低温下，酵母降解醛类的活性(其负责麦芽汁风味)降低。因此，使用冷接触方法(或另一种限制发酵方法)生产的低或零醇啤酒具有醛含量相对较高的缺点，这赋予低或零醇啤酒麦芽汁风味。此外，由于剩余的可发酵糖的存在，这种啤酒通常是相对甜的。
通常，啤酒(包括无醇啤酒)的味道是各种糖的量和类型，各种风味化合物(例如酯)的量和类型，以及各种麦芽汁醛风味剂的量和类型之间的精细平衡的结果。然而，少量基本水平的醛确实有助于啤酒味道，如US2012/0207909中所述。此外，其他盐和氨基化合物(例如肽和氨基酸)的量和类型也可影响味道。
现有的低或零醇啤酒通常缺乏可饮性。大多数人仅在一杯或两杯之后就对味道变得饱和了，这与饮用常规的含醇的啤酒形成对比。味道饱和通常是由过强的风味引起的，所述过强的风味是由高醛水平和高浓度的未发酵的麦芽糖引起的过强的麦芽汁风味引起的。此外，现有的啤酒通常是不平衡的。本发明提供了一种克服这些缺点的方法。
2发明概述
本发明提供了一种生产醇减少的发酵啤酒，优选无醇啤酒的方法，所述方法包括以下步骤：将发酵酵母添加到麦芽汁中以至少部分地发酵所述麦芽汁，从而保留存在于所述麦芽汁中的可发酵糖如蔗糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖和/或麦芽三糖的至少一部分，从所述麦芽汁中去除所述酵母，以及降低由此发酵的啤酒的醇含量，从而产生醇减少的发酵啤酒，诸如无醇啤酒。
发现如果所得产品中的甜/酸比增加，则如此生产的无醇啤酒的可饮性显著改善，而无需向所得产品中添加例如甜味剂如未发酵的麦芽汁或葡萄糖。
在一方面，保留存在于麦芽汁中，优选存在于起始麦芽汁中的蔗糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖和/或麦芽三糖的至少一部分是通过过早停止发酵并从麦芽汁中去除酵母来实现的。
根据本发明的生产包括无醇啤酒在内的醇减少的发酵啤酒的方法可以包括以下步骤：将发酵酵母添加到麦芽汁中以至少部分地发酵所述麦芽汁，由此所述发酵酵母不能将己糖如葡萄糖和/或果糖、二糖如蔗糖和/或麦芽糖，和/或三糖如麦芽三糖转化成乙醇，或不能将己糖优选葡萄糖和/或果糖，二糖如蔗糖和/或麦芽糖，和/或三糖如麦芽三糖完全转化成乙醇。
所述发酵酵母优选不能将至少三糖如麦芽三糖，优选麦芽三糖和己糖包括葡萄糖和果糖转化为乙醇，或不能将至少三糖如麦芽三糖，优选麦芽三糖和己糖包括葡萄糖和果糖完全转化为乙醇。据报道，由于发酵不完全，啤酒中残留的麦芽三糖会引起质量和经济问题(Dietvorst等人,2005.Yeast 22:775–788)。然而，现已令人惊奇地发现，与常规酿造酵母已用于相同的过程中并且全部或部分输入的麦芽三糖已被发酵成乙醇时相比，醇减少的啤酒产品，优选无醇的啤酒产品(在发酵过程中和/或发酵后已经减少了醇含量并且其中存在来自输入麦芽汁的麦芽三糖)，具有更多的‘主体’。所得的醇减少的啤酒产品，优选无醇的啤酒产品，与常规的高醇啤酒的感官特性更好地相匹配。
所述发酵酵母更优选不能将己糖诸如至少葡萄糖完全转化为乙醇，诸如或者另外不能将麦芽三糖转化为乙醇。由此得到的醇减少的啤酒产品，优选无醇的啤酒产品，与常规的高醇啤酒的感官特性更好地相匹配。
所述发酵酵母优选是狭义酵母属(Saccharomyces sensu stricto)复合体的酵母，更优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和/或真贝氏酵母(S.eubayanus)和/或其杂合体，例如巴氏酵母(S.pastorianus)(也称为卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis))。
所述发酵酵母优选具有降低的酚酸脱羧活性，优选不产生4-乙烯基愈创木酚。为此，所述发酵酵母优选包含突变，所述突变导致基因PAD1和FDC1中的至少一种失活，和/或编码参与酚酸，优选阿魏酸摄取或参与脱羧酚类化合物，优选4-乙烯基愈创木酚输出的蛋白质的基因失活。
所述发酵优选在6-25℃，优选8-15℃的温度下进行。
所述发酵啤酒产品的醇含量优选通过精馏降低。
所述醇减少的发酵啤酒产品优选是无醇啤酒，更优选是无醇的拉格啤酒、野生拉格啤酒(wild lager)、比尔森啤酒、淡色艾尔啤酒(pale ale)或赛松啤酒(saison)。
本发明还提供了通过本发明的任何一种方法生产的醇减少的发酵啤酒产品。所述醇减少的发酵啤酒产品优选地是无醇啤酒，更优选地是醇减少的或无醇的拉格啤酒、野生拉格啤酒、比尔森啤酒、淡色艾尔啤酒或赛松啤酒。
本发明还提供了一种醇减少的发酵啤酒产品，优选无醇啤酒，更优选无醇拉格啤酒，其包含发酵前存在于起始麦芽汁中的可发酵糖蔗糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖和/或麦芽三糖中的至少一种。所述醇减少的发酵啤酒产品优选包含存在于起始麦芽汁中的基本上所有的己糖如果糖和葡萄糖，所有的三糖如麦芽三糖，或所有的三糖如麦芽三糖和所有的己糖如果糖和葡萄糖。
进一步优选的醇减少的发酵啤酒产品，优选无醇啤酒，更优选无醇拉格啤酒包含存在于起始麦芽汁中的所有葡萄糖，例如所有葡萄糖和麦芽三糖。
优选的醇减少的发酵饮料是其中不存在脱羧酚类化合物4-乙烯基愈创木酚的饮料。
本发明还提供了不能将蔗糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖和/或麦芽三糖完全转化为乙醇的发酵酵母用于生产醇减少的发酵啤酒产品，优选无醇啤酒，更优选无醇拉格啤酒的用途。所述发酵酵母优选是狭义酵母属复合体的酵母，更优选酿酒酵母、真贝氏酵母和/或其杂合体，例如巴氏酵母(也称为卡尔斯伯酵母)，优选不产生4-乙烯基愈创木酚的酿酒酵母、真贝氏酵母和/或其杂合体，例如巴氏酵母(也称为卡尔斯伯酵母)。
3附图说明
图1：阿魏酸脱羧成4-乙烯基愈创木酚(4-VG)。
图2：在Tecan Infinite Pro 200中测量的在96孔微量滴定板中测定的吸收光谱250-400nm。使细胞(真贝氏酵母CBS12357的UV诱变变体)在含有1mM阿魏酸的3ml合成麦芽汁中在24深孔板中生长。阿魏酸向4-VG的转化导致在300nm以上的吸收值强烈降低。线代表来自8个不同变体的光谱。作为一个实例，变体E2显示了指示阿魏酸转化强烈降低的光谱。
图3：阿魏酸(图3A)向4-VG(图3B)的转化。使细胞在含有1mM肉桂酸的3ml合成麦芽汁中在24深孔板中生长。将真贝氏酵母CBS1257的生长与单FDC1-PAD1敲除，双FDC1-PAD1敲除和CBS12357、HTSE-22、HTSE-23、HTSE-33、HTSE-37和HTSE-42的5个选择的UV诱变变体进行比较。通过HPLC测定阿魏酸(图3A)向4-VG(图3B)的转化。
图4：16°P全麦芽麦芽汁发酵过程中的糖和乙醇浓度。己糖葡萄糖和果糖不被己糖转运缺陷酵母IMX1812发酵。
4发明的详细描述
4.1定义
本文所用的术语“发酵的啤酒产品”是指通过对例如作物及其产品如谷物、大米、葡萄和其它水果、坚果和/或来自例如龙舌兰、丝兰和仙人掌的渗出物的发酵而生产的啤酒产品。
本文所用的术语“醇减少的发酵啤酒产品”是指与相应的正常饮料相比具有降低水平的乙醇的发酵啤酒。例如，醇减少的啤酒优选包含小于5体积％，例如0.5-1.2体积％的作为醇的乙醇。
本文所用的术语“无醇的发酵啤酒产品”是指其中不存在乙醇或其中存在小于0.03体积％的发酵啤酒产品。注意，无醇啤酒的最大百分比在各国之间可能不同。例如，无醇啤酒(alcohol-free beer)，也称为“非醇啤酒(non-alcoholic beer)”，在美国和一些欧洲国家中可以含有小于0.5体积％，但在英国中不超过0.05体积％。然而，本文所用的术语“无醇的发酵啤酒产品”是指其中不存在乙醇或其中存在小于0.03体积％的发酵啤酒产品。
本文所用的术语“发酵酵母”是指狭义酵母属复合体的酵母，优选酿酒酵母、真贝氏酵母和/或其杂合体，例如巴氏酵母(也称为卡尔斯伯酵母)。
本文所用的术语“狭义酵母属复合体”是指目前包含9种不同物种的亚家族：酿酒酵母、奇异酵母(S.paradoxus)、里约酵母(S.cariocanus)、葡萄汁酵母(S.uvarum)、粟酒裂殖酵母(S.mikatae)、库德里阿兹威酵母(S.kudriavzevii)、S.arboricola、真贝氏酵母和最近发现的S.Jurei(Hittinger,2013.Trends Genet 29:309-317；Naseeb等人,2017.IntJ Syst Evol Microbiol 67:2046–2052)。
本文所用的术语“麦芽三糖”是指由α-1,4糖苷键连接的三个葡萄糖分子组成的三糖。
本文所用的术语“酚酸的脱羧活性”是指转化成其脱羧形式的酚酸的量，优选酶促转化成其脱羧形式的酚酸的量。酶促转化优选由编码苯基丙烯酸脱羧酶(PAD1)和/或阿魏酸脱羧酶(FDC1)的基因编码的两种蛋白质中的至少一种或两种催化。已经表明，这两种基因之一的失活足以干扰酚酸的脱羧。酚酸的脱羧活性，即转化成其脱羧形式的酚酸的量可以通过本领域已知的任何方法测定。例如，阿魏酸和4-VG在200至400nm显示出它们的光吸收光谱的强差异。阿魏酸显示300nm以上的高吸收值，而转化成4-VG导致300nm以上的吸收值降低。该差异可用于估计阿魏酸向4-VG的转化能力，作为酚酸的脱羧活性的估计。例如，可以通过离心(例如在4℃下以2500xg 5分钟)收集例如在阿魏酸存在下在合成麦芽汁中生长的微量滴定板培养物的上清液，转移至微量滴定板，并且可以测定96孔微量滴定板的250nm至400nm的吸收光谱。作为另一个实例，脱羧活性可以通过在底物，即酚酸如阿魏酸或肉桂酸存在下孵育酵母细胞或酵母细胞培养物，并通过质谱或高效液相色谱(HPLC)测定酚酸向其脱羧形式的转化来测定。
本文所用的术语“降低的酚酸脱羧活性”是指酵母脱羧活性的百分比。酚酸的转化可以例如在预定时间段内测定，并与对照酵母细胞或酵母细胞培养物中的酚酸在相同时间段内的转化相比较。作为另一个实例，脱羧活性可以通过测定在存在肉桂酸的情况下培养的酵母细胞的增殖和在不存在肉桂酸的情况下培养的酵母细胞的增殖的比率以更间接的方式测定。由于肉桂酸比其脱羧形式的苯乙烯对酵母细胞更具毒性，与参照相比，在存在肉桂酸的情况下酵母细胞或酵母细胞培养物中酵母细胞的增殖降低意味着脱羧活性降低。例如，可以通过测定在存在肉桂酸的情况下培养的酵母细胞的增殖比率来测定降低百分比。或者，可以测定在存在或不存在肉桂酸的情况下酵母细胞的增殖，并且可以测定在存在肉桂酸的情况下培养的酵母细胞的增殖和在不存在肉桂酸的情况下培养的酵母细胞的增殖的比率作为脱羧活性的量度。作为参照，常规用于发酵过程的正常酵母菌株，例如用于啤酒发酵的Heineken-A酵母和/或Heineken-D酵母，可以用作确定降低的酚酸脱羧活性的参照。与常规用于指定发酵方法的正常酵母菌株相比，所述降低优选为至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少99％。这意味着具有降低的酚酸脱羧活性的酵母具有的脱羧活性是所述参照的脱羧活性的至多40％，更优选至多30％，更优选至多25％，更优选至多20％，更优选至多15％，更优选至多10％，更优选至多5％，最优选是所述参照的脱羧活性的至多1％。
本文所用的术语“突变”是指酵母基因组DNA的改变，包括但不限于点突变、一个或多个核苷酸的插入或缺失、一个或多个核苷酸的取代、移码突变和单链或双链DNA断裂，例如染色体断裂或亚端粒断裂，以及以上的任何组合。
本文所用的术语“基因”是指确保由基因编码的产物表达的任何和所有顺式作用基因组序列，包括增强子和启动子序列，外显子和内含子序列。所述产物可以是RNA分子，例如mRNA分子，和/或蛋白质。
本文所用的术语另一基因的“参与转录控制的基因”是指编码调节该另一基因表达的转录调节剂或因子的基因。
本文所用的术语“失活基因”是指不能执行其正常功能的基因。例如，对于编码蛋白质的基因，“失活”是指该基因不翻译成蛋白质，编码无活性的蛋白质或编码活性降低的蛋白质。例如，所述失活可能是由于启动子序列的改变，使得启动子不能启动基因的转录，由于内含子的剪接位点的改变，该改变干扰转录的前mRNA的正确剪接，或者由于基因编码区的改变，使得编码的蛋白质的活性降低或甚至无活性。与非失活基因相比，所述失活优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少99％。
本文所用的术语“启动子”是指被认为是启动其转录所需的基因的调节区的基因组序列。它通常位于基因的5'部分。
本文所用的术语度Plato或°P是指在发酵之前在100克麦芽汁中的糖的量。10°P等于约10克糖。糖的百分比越高，越多的酵母可以代谢成醇。糖的量可以用红外技术，包括傅里叶变换红外技术，以及例如通过折射计测定。
4.2生产醇减少的发酵饮料的方法
自从长久以来，酵母被用于烘焙，酿造和蒸馏，例如用于面包生产以及啤酒和葡萄酒发酵。
约12°P的布鲁尔麦芽汁(Brewer’s wort)包含可发酵糖，包括麦芽糖(50-60％)、麦芽三糖(15-20％)和葡萄糖(10-15％)。本发明的方法确保在将发酵啤酒的醇含量降低至小于0.03体积％之后，存在于麦芽汁中的可发酵麦芽糖，包括二糖如蔗糖和/或麦芽糖，己糖如果糖和/或葡萄糖，和/或三糖如麦芽三糖的至少一部分保留在所得的发酵啤酒产品中。如上所述，发现如果所得产品中的甜/酸比增加，则所得无醇啤酒的可饮性显著改善，而不需要向所得产品中添加例如甜味剂如未发酵的麦芽汁或葡萄糖。
保留存在于麦芽汁中，优选存在于起始麦芽汁中的蔗糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖和/或麦芽三糖的至少一部分可以通过过早停止发酵并从麦芽汁中去除酵母来实现。通过过早停止发酵，确保存在于麦芽汁中的麦芽糖和麦芽三糖的至少一部分保留在所得的发酵啤酒产品中。优选的是，在某时停止发酵，在除了麦芽糖和麦芽三糖的至少一部分之外，麦芽汁中存在的初始己糖，例如葡萄糖和果糖的一部分，也保留在发酵啤酒产品中，优选无醇啤酒，更优选无醇拉格啤酒。
啤酒的甜度可以由以下公式表示：
0.7x[葡萄糖]+1.6x[果糖]+0.5x[麦芽糖]+1x[蔗糖]+0.3x[麦芽三糖]，在该公式中，蔗糖浓度([蔗糖])设定为1。
本领域技术人员知道，啤酒如拉格啤酒的完全发酵对于真贝氏酵母来说可能需要长达6周，优选对于其它酵母来说可能需要长达约2周，这取决于例如温度和酵母起始培养物。因此，过早停止发酵意味着发酵进行少于6周的时间，优选约7-14天的时间，例如约8天、9天、10天、11天、12天或13天。在发酵在较高温度下进行的情况下，例如在18℃以上，所述过早停止发酵是指发酵进行3-7天的时间，例如4天、5天和6天，这对于本领域技术人员是清楚的。
本发明的方法优选使用不能将存在于麦芽汁中的可发酵麦芽糖，例如葡萄糖、果糖、麦芽糖和/或麦芽三糖完全转化为乙醇的酵母。所述酵母优选是狭义酵母属复合体的天然存在的酵母，优选酿酒酵母、真贝氏酵母和/或其杂合体，例如巴氏酵母(也称为卡尔斯伯酵母)。
真贝氏酵母最初从巴塔哥尼亚西北部的假山毛榉(Nothofagus)树和Cyttariaharioti的子座中分离得到(Libkind等人，2011.Proc Natl Acad Sci108:14539-44)。随后还从位于北美(Peris等人，2014.Mol Ecol 23:2031-45)、亚洲(Bing等人，2014.Curr Biol24:R380-1)和大洋洲(Gayevskiy和Goddard,2016.Environ Microbiol 18:1137-47)的地方分离了真贝氏酵母菌株。巴塔哥尼亚的真贝氏酵母菌株CBS12357T的初始生理学表征揭示其在低于10℃的温度下比酿酒酵母生长快(Hebly等人，2015.FEMS Yeast Res 15:fov005)、显示出较差的絮凝(Krogerus等人，2015.J Ind Microbiol Biotechnol 42:769-78)并且消耗麦芽糖而不是麦芽三糖(Gibson等人，2013.Yeast 30:255–266)。Gibson等人，2017.FEMS Yeast Res 17:fox038；Hebly等人，2015.FEMS Yeast Res 15:fov005)。
所述酵母可在基因PAD1和FDC1中的至少一种，参与所述基因的至少一种的转录控制的基因，和/或编码参与酚酸，优选阿魏酸的摄取的蛋白质或参与脱羧酚类化合物，优选4-乙烯基愈创木酚的输出的蛋白质的基因，和/或参与所述基因的转录控制的基因中进一步包含一个或多个天然存在的突变，和/或由诱变引起的突变。
所述生产醇减少的发酵啤酒产品的方法包括提供在水溶液中，优选在水中的捣碎的谷粒，优选大麦，以释放麦芽糖。该麦芽制作步骤之后是在啤酒花的存在下煮沸所得的麦芽汁，并在冷却后发酵所得的煮沸的麦芽汁。当发酵完成时，可过滤啤酒并装瓶。
在发酵过程中，可发酵糖被转化成醇类，例如乙醇、CO2和风味化合物，例如酯，例如乙酸异戊酯。如本领域技术人员已知的，将影响所得产品的外观和味道的因素包括但不限于谷物的烘烤温度和烘烤时间、谷物的浸泡，发芽和窑烘的温度和时间、谷物的碾磨和捣碎的温度和时间、所得醪液的过滤(lautering)以产生麦芽汁、麦芽汁的煮沸温度和时间、添加的啤酒花的时机和量、使用的具体啤酒花、发酵的温度和时间、酵母的类型、机械过滤或添加过滤剂以去除酵母，以及最后，碳酸化和包装啤酒。可以在发酵之后但在过滤之前开始的调节步骤期间，给予酵母数天到数周的时间，以吸收与欠调节或“绿色”啤酒相关的常见异味，包括硫，黄油和绿苹果。
在本发明的方法中，发酵过程在正常温度下进行，优选2-35℃、6-25℃，更优选包括7-20、8-16或8-13℃。拉格啤酒发酵通常在7-13℃的温度下进行。令人惊讶地发现，在这些温度下，不能完全转化所有可发酵麦芽糖，例如蔗糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖和/或麦芽三糖的酵母，尤其是酿酒酵母、真贝氏酵母和/或其杂合体，例如巴氏酵母(也称为卡尔斯伯酵母)，导致在精馏所产生的乙醇后，所得到的产品的感官特性得到改善。
通过降低发酵过程的温度可以进一步提高所得产品中的甜/酸比。令人惊讶地发现，降低的温度导致存在于所得啤酒产品中的酸的量的减少。酸的量的减少导致所得产品的甜/酸比增加。
为了减少最终啤酒产品中的醇的量，将所得的醇浓度高于4体积％的啤酒产品进行物理过程，其包括例如精馏和/或透析，包括反渗透。
精馏通常在减压下进行以实现挥发性乙醇在不导致其它成分如蛋白质和糖分解的温度下的沸腾。所述精馏优选在发酵之后在20-50℃的高温下，在减压下进行。已经描述了例如由Narziss等人，1993.Brauwelt 133:1806–1820,和Kern 1994.AlimentacionEquipos y Tecnologia 13:37–41的降低醇水平的真空精馏方法。其它合适的方法包括降膜精馏((Zufall和Wackerbauer,2000.Monatsschrift fuer Brauwissenschaft 53:124–137)。合适的大规模精馏系统可从例如KmX Chemical Corporation,New Church,Virginia,Pope Scientific,Inc.,Saukville,Wisconsin,M&L Engineering GmbH,Hofheim am Taunus,Germany,Centec,Maintal,Germany,和API Schmidt Bretten GmbH&Co.KG,Bretten,Germany获得。
降低发酵饮料的醇含量的透析包括使饮料通过半透膜(德国专利第2 145 298号和第2 413 236号)。优选的透析方法是将饮料分离成浓缩物和滤液的单一反渗透方法(比利时专利第717 847号、德国专利第2 323 094号、德国专利第2 339 206号)。其他变型包括反渗透(美国专利第4,317,217号)和全蒸发(欧洲专利申请332,738)。所用膜的阈值特征决定了哪些低分子量分子如盐、酯和醛与醇一起从发酵饮料中去除。此外，在该过程中施加的高压可引起分子变性，导致物理化学性质的改变，例如增加的浊度，絮凝等，以及感官性质的改变，例如改变的风味和味道。合适的大规模透析系统可从例如Alfa Laval,Lund,Sweden and Osmonics Inc.,Minnetonka,Minnesota获得。
4.3突变发酵酵母的方法
诱变可以使用本领域已知的任何方法进行，包括常规的随机诱变方法(如辐射和化学处理)和重组DNA技术(如定点诱变或靶向诱变)。因此，在一实施方案中，酵母细胞可以进行随机诱变，包括用UV照射、X射线照射、γ射线照射和诱变剂处理，或进行基因工程改造。
“随机诱变”是指这样的诱变技术，其中突变的确切位点是不可预测的，并且可以在酵母细胞或孢子的染色体中的任何地方发生。通常，这些方法包括使用化学试剂或辐射来诱导至少一种突变。使用易错PCR可以进一步实现随机诱变，其中PCR在DNA聚合酶的拷贝精度低的条件下进行，导致PCR产物中相对高的突变率。
“基因工程改造”是本领域众所周知的，是指使用生物技术方法改变酵母的基因组，从而引入酵母基因组DNA的改变，优选在预定位点并且预定改变，称为定点诱变。
定点诱变，可以使用寡核苷酸定向诱变在目的基因组DNA序列中产生定点突变来实现。靶向诱变是指在体内改变特定基因，导致针对特定位点的基因结构改变的诱变方法，如通过可编程RNA引导的核酸酶，如TALEN、CRISPR-Cas、锌指核酸酶或兆核酸酶技术。
在优选的实施方案中，诱变通过用辐射，如UV照射、X射线照射、γ射线照射或诱变剂，优选化学剂如NTG(N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍)或EMS(甲磺酸乙酯)处理酵母来进行。特别优选的诱变程序包括UV照射，例如10秒至3分钟，优选大约1-2分钟。优选的方法包括暴露于UV光(UVC-灯,36W,MSC-Advantage Biological Safety Cabinet,ThermoFisherScientific,Waltham,MA)80秒，导致1％的存活率。
不能将葡萄糖、麦芽糖和/或麦芽三糖完全转化为乙醇的发酵酵母可以通过诱变产生。例如，所述发酵酵母可以在一种或多种转运蛋白基因中具有改变，所述转运蛋白基因包括己糖转运蛋白，主要是葡萄糖和果糖转运蛋白，如HXT转运蛋白家族的成员，包括HXT1-HXT17、GAL2、AGT1、YDL247w和YJR160c(Wieczorke等人，1999.FEBS Lett 464:123–128)，优选所有21种转运蛋白；麦芽糖转运蛋白，例如MAL家族的麦芽糖-H+协同转运子的成员，包括MAL1、MAL2、MAL3、MAL4和MAL6、MAL11(AGT1)、MPH2和MPH3；和麦芽三糖转运蛋白，包括MAL转运蛋白家族的成员，例如MAL31、MPH2、MPH3、AGT1和MTY1，优选至少AGT1和/或MTY1中的改变，包括实际转运蛋白、上游γ-葡萄糖苷酶和/或下游转录激活因子中的一种或多种改变。这种转运蛋白基因及其调节剂的实例由例如Wijsman等人，2019(Wijsman等人，2019.FEMSYeast Res 19:10.1093)提供。
类似地，酵母中细胞表面葡萄糖传感器Rgt2和/或Snf3，和/或下游核转录因子Rgt1的改变可用于抑制编码葡萄糖转运蛋白的基因(Roy等人,2016.Mol Biol Cell 27:862-871)。本领域技术人员将理解，优选通过对编码葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖中的一种或多种的摄取、发酵和/或需氧降解中的关键酶的一个或多个基因的随机诱变而导致的改变，可产生不能将葡萄糖、麦芽糖和/或麦芽三糖完全转化为乙醇的发酵酵母。相关基因是已知的，随机诱变这些基因的方法也是已知的。
如本领域技术人员已知的，蔗糖是可以通过酵母的细胞外转化酶活性转化为葡萄糖和果糖的二糖。因此，抑制这种细胞外转化酶也可以产生能够至少部分发酵所述麦芽汁的酵母，从而保留存在于麦芽汁中的糖的至少一部分。
优选改变，优选通过随机诱变改变的其它基因是参与酚酸的脱羧活性，优选产生4-乙烯基愈创木酚，更优选将阿魏酸脱羧成4-乙烯基愈创木酚的基因。其中酚类化合物通常被认为是异味的发酵饮料包括啤酒，更优选选自拉格啤酒、野生拉格啤酒、比尔森啤酒、淡色艾尔啤酒(pale ale)和赛松啤酒的啤酒。
在啤酒中，一些酚类的异味直接源自麦芽汁，其它是酵母的酶促转化的结果，或由于氧和温度(例如在麦芽汁煮沸或在瓶中陈化期间)而导致的化学转化的结果。在啤酒发酵过程中，存在于麦芽汁中的阿魏酸通过酶促脱羧转化为酚类异味4-VG(图1)。最初认为仅涉及编码苯基丙烯酸脱羧酶的PAD1，但来自Mukai等人(Mukai等人,2010.J Bioscie Bioeng109:564-569)的结果表明PAD1和编码阿魏酸脱羧酶的FDC1对于脱羧是必需的。顶部发酵酵母通常含有PAD1和FDC1的活性组，而底部发酵酵母不能将酚酸转化成相应的酚类异味。
优选的发酵酵母在基因PAD1和FDC1中的至少一种，参与所述基因的至少一种的转录控制的基因，和/或编码参与酚酸，优选阿魏酸的摄取的蛋白质或参与脱羧酚类化合物，优选4-乙烯基愈创木酚的输出的蛋白质的基因，和/或参与所述基因的转录控制的基因中包含突变。
所述酚酸优选是可以由PAD1编码的蛋白质和/或由FDC1编码的蛋白质转化的酚酸，更优选选自阿魏酸、4-羟基苯甲酸酯、芥子酸、咖啡酸、肉桂酸、3,4-二羟基苯甲酸、阿魏酸、没食子酸、对香豆酸、4-甲氧基肉桂酸、对羟基苯甲酸、4-羟基苯甲醛、原儿茶酸、水杨酸、丁香酸、鞣酸和/或香草酸。特别优选的底物是阿魏酸，在本发明的方法中使用的优选的发酵酵母中，阿魏酸的摄取优选被降低或甚至被抑制。
参与PAD1编码的蛋白质和/或FDC1编码的蛋白质的产物输出的蛋白质的实例是Pdr16/YNL231C、Pdr8/YLR266C、Pdr12/YPL058C、Pdr10/YOR328W、Pdr5/YOR153W、Pdr18/YNR070W、Pdr3/YBL005W、Pdr15/YDR406W、Pdr17/YNL264C和Pdr11/YIL013C。所述产物优选是脱羧的酚类化合物，更优选4-VG、4-乙烯基苯酚、4-乙基苯酚、愈创木酚和丁子香酚。特别优选的产物是4-VG。
5具体实施方式
实施例1
FDC1和PAD1缺失突变体的构建
为了证明Pad1和Fdc1在4-乙烯基愈创木酚(4-VG)形成中的作用，在真贝氏酵母菌株CBS12357中引入了缺失。由于编码这两种酶的基因是连续的，因此可以在一轮转化中进行两个基因的缺失。通过使用与PAD1-FDC1基因座的上游区和下游区具有增加的同源性的引物AmdSYM_FDC1_fw
(5’-CAATATTCGACACACCTATGCTGTAAAGTTTATAAAATATGTAAGTCATTAATTTGAGAACAAATACGCTGAACGAACCTTTTCAAAGAACTGTTAACAACAGCTGAAGCTTCGTACGC)和amdSYM_PAD1_rv(5’-GAATTGTTGACACATGGAATTCCAAATAAGTAGATACATATGACTACTAGCTTTATTCTCCATTGCCCGATAAACCTAGCAGAGCTCAATTGGTGAATGCATAGGCCACTAGTGGATCTG)，从载体pUG-amdSYM扩增amdSYM盒来构建PAD1-FDC1缺失盒(Solis-Escalante等人，2013.FEMSYeast Res 13:126-139)。
使用
Figure BDA0003470332810000141
热启动II高保真聚合酶(Thermo Scientific,Waltham,MA)根据制造商的说明书，使用HPLC纯化的定制合成的寡核苷酸引物(Sigma Aldrich,Zwijndrecht,The Netherlands)在Biometra TGradient热循环仪(Biometra,Gottingen,Germany)中进行PCR扩增。随后使用Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒(Zymo Research Corporation,Irvine,CA)从1％琼脂糖凝胶中分离缺失盒。按照Gietz和同事(Gietz and Schiestl,2007.NatureProt 2:31-34)的方案，用amdSYM盒转化指数生长的CBS12357。转化后，将细胞铺在合成培养基平板上，用乙酰胺作为唯一的氮源(Solis-Escalante等人，2013.FEMSYeast Res 13:126-139)。通过集落DNA分离(Looke等人，2011.Biotechniques 50:325-328)，随后使用DreamTaq PCR Master Mix(2×)(Thermo Fisher Scientific)，用结合amdSYM标志物内和FDC1-PAD1基因座外的引物KanA(5’-CGCACGTCAAGACTGTCAAG)、fw_repair_FDC1_DS(5’-GCGGCTGAACATATCTCCTG)和rv_checking_oligo_for_FDC1(5’-CGGCGAAATGCATGGATACG)进行PCR，证实了转化的集落具有代替PAD1/FDC1的amdSYM-盒。在单集落分离物的三次重新划线之后，将菌株储存为IMK747(MATa/MATαSepad1-Sefdc1Δ::amdS/SePAD1-SeFDC1)。
携带pad1-fdc1Δ::amdS/pad1-fdc1Δ::amdS突变的纯合子二倍体的构建通过IMK747的孢子形成和四分体解剖进行。通过离心(5分钟，3000xg)收集菌株IMK747的末期指数培养物的生物量，并用去矿物质水洗涤两次。随后将经洗涤的生物质在20℃下在轨道培养箱(Infors Multitron,Infors 509HT,Bottmingen,Switzerland)中以200rpm在20ml孢子形成培养基(2％乙酸钾，pH7)中孵育72小时。通过显微镜观察检查子囊的存在。将子囊壁用酵母裂解酶(Zymo Research,Irvine,CA)(5U/ml在1M山梨醇中的酵母裂解酶)在20℃下消化20分钟。使用显微操作器(Singer Instruments,Watchet,UK)分离一个四分体的四个孢子，并使其在具有乙酰胺作为唯一氮源的合成培养基平板上生长。通过如上所述的集落PCR证实显示生长的集落没有留下FDC1/PAD1的拷贝。在三次重新划线后，将集落储存为菌株IMK749(MATa/MATαSepad1Se-fdc1Δ::amdS/Sepad1-Sefdc1Δ::amdS)。与其亲本真贝氏酵母CBS12357一样，菌株IMK749是雌雄异体的，并且具有转换交配型，从而形成稳定的纯合子二倍体细胞的特性。IMK749通过如上所述使其形成孢子而被证实是二倍体菌株。
通过暴露于UV光的真贝氏酵母变体的产生
为了构建具有降低的将阿魏酸转化为4-VG的能力的真贝氏酵母，将真贝氏酵母暴露于UV光以诱导诱变。通过改变暴露于UV光的时间和强度来控制诱变的程度。理想地，UV光将导致相当大的具有单一突变的细胞群。这里，我们描述了暴露于UV光的真贝氏酵母CBS12357细胞的变体的分离和筛查，其导致1％的存活率。
使二倍体真贝氏酵母菌株CBS12357(Libkind等人，2011.PNAS 108:14539-14544)在YPD(10g/l Bacto酵母提取物，20g/l Bacto蛋白胨，20g/l葡萄糖)中生长直到早期稳定期。之后，通过离心(在4℃下1000xg，5分钟)收集细胞，并用去矿物质H2O洗涤。然后，将细胞在20℃下在孢子形成培养基(2％(w/v)乙酸钾，pH7)中孵育72小时。通过显微镜检查子囊孢子的存在。将孢子化的真贝氏酵母CBS12357细胞暴露于UV照射(UVC灯，36W,MSC-AdvantageBiological Safety Cabinet,Thermo Fisher Scientific)80秒导致1％的存活率。将经诱变的细胞以平均每个平板200个集落铺板。将细胞在黑暗中在室温下孵育5天。使用配备有Pickolo集落拾取器(Sci Robotics,Kfar Saba,Israel)的Tecan Freedom Evo 2000(Tecan,
Figure BDA0003470332810000161
Switzerland)对总共2000个单集落进行集落拾取，并将其排列在填充有200μl合成麦芽汁的96孔微量滴定板中。
为了筛查目的，使酵母在类似5倍稀释的麦芽汁的合成麦芽汁中生长，所述麦芽汁含有14.4g/l葡萄糖、2.3g/l果糖、85.9g/l麦芽糖、26.8g/l麦芽三糖、5g/l(NH4)2SO4、3g/lKH2PO4、0.5g/l MgSO4·7H2O、1ml/l微量元素溶液、1ml/l维生素溶液并补充有厌氧生长因子麦角固醇和Tween 80(分别为0.01g/l和0.42g/l)，如Verduyn等人(Verduyn等人,1992.Yeast 8:501-517)所述的。
具有降低的产生4-VG的能力的菌株的筛查
预培养96孔微量滴定板在轨道培养箱(Infors Multitron)中在20℃下以250rpm孵育48小时。随后，通过将10μl的每种预培养物转移到填充有200μl合成麦芽汁或含有1mM阿魏酸的合成麦芽汁或含有1mM肉桂酸的合成麦芽汁的新鲜微量滴定板中，在三种不同的培养基中复制铺板微量滴定板。在100％乙醇中制备0.5M阿魏酸和0.5M肉桂酸的储备溶液。将参照菌株真贝氏酵母CBS12357加入到各微量滴定板中作为阳性对照。微量滴定板中的一列仅含有培养基作为孔间污染的对照。使经诱变的分离物在轨道培养箱(InforsMultitron)中在20℃下以250rpm生长3天。通过用Tecan Infinite 200测量660nm处的培养物光密度来估计生长。表现出降低的将肉桂酸转化为苯乙烯的能力的菌株对肉桂酸表现出更高的敏感性。然后通过测量在肉桂酸存在下测量的3天后的OD660nm与在肉桂酸不存在下测量的3天后的OD660nm的比率来估计生长抑制。亲本菌株CBS12357在有和没有肉桂酸的情况下在3天后显示50％至75％的OD660nm比率的变化。约10％的分离的经诱变的变体显示出的比率(5％至50％)低于所观察到的亲本菌株比率的变化，表明菌株被肉桂酸更多地抑制。
阿魏酸和4-VG显示出200至400nm的强的光吸收光谱差异。阿魏酸显示出高于300nm的高吸收值，而转化成4-VG将导致高于300nm的吸收值降低。该差异可用于估计在单个突变体中阿魏酸向4-VG的转化能力。在阿魏酸存在下在合成麦芽汁中生长的微量滴定板培养物的上清液通过在4℃以2500xg离心5分钟收集。上清液用Tecan Freedom Evo 2000(Tecan)转移到微量滴定板中。96孔微量滴定板的250nm至400nm的吸收光谱通过用TecanInfinite Pro 200在去矿物质水中稀释5倍来测定。阿魏酸浓度的转化伴随着吸光度的降低。阿魏酸向4-VG的低转化伴随着高于300nm的吸收值的增加，表明培养物根本没有活性，或者具体地在阿魏酸向4-VG的转化中培养物没有活性。
分离显示出以下特性的真贝氏酵母CBS12357变体，用于进一步的分析：在合成麦芽汁上正常生长，如通过在合成麦芽汁和补充有肉桂酸的合成麦芽汁上的生长之间的比率所确定的对肉桂酸的敏感性较高，和如通过在补充有阿魏酸的合成麦芽汁上生长后的吸收光谱所确定的阿魏酸的转化率较低。用30％(v/v)甘油补充早期静止期细胞，分成1ml等分试样，并储存在-80℃下直至进一步使用。
具有降低的产生4-VG能力的菌株的表征
筛选2000个真贝氏酵母CBS1237暴露于UV的变体产生28株酵母菌株，其具有潜在降低的将阿魏酸转化为4-VG的能力。在筛查中，所选择的变体显示出在未受干扰的合成麦芽汁上的生长，在补充有肉桂酸的合成麦芽汁上的生长与在合成麦芽汁上的生长相比为50％或更少，并且用补充有阿魏酸的合成麦芽汁在300nm以上的更高的吸光度值。
将选择的菌株在深孔板中在轨道培养箱(Infors Multitron)中在3ml合成麦芽汁，补充有1mM阿魏酸的合成麦芽汁和补充有1mM肉桂酸的合成麦芽汁中在20℃下以250rpm培养。评价28株菌株的生长，肉桂酸抑制和阿魏酸转化。作为示例性变体，E2显示出了指示强烈降低的阿魏酸转化的光谱(图2)。
从28株选择的菌株中，更详细地研究了5株的子集，并与亲本真贝氏酵母CBS1237和对照缺失菌株IMK747(MATa/MATαSepad1-Sefdc1Δ::amdS/SePAD1-SeFDC1)和IMK749(MATa/MATαSepad1-Sefdc1Δ::amdS/Sepad1-Sefdc1Δ::amdS)进行了比较。使细胞在含有1mM阿魏酸或1mM肉桂酸的合成麦芽汁中，在轨道培养箱(Infors Multitron)中，在20℃下以200rpm，在50ml Greiner管中，在20ml培养物中一式两份地生长。以规则的时间间隔取样并分析生长，阿魏酸消耗和4-VG产生(图3)。
使用在30℃下操作的Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6×5.0，3.5微米)，在214nm下测量阿魏酸、4-乙烯基愈创木酚和肉桂酸(Vos等人，2015.Microbial Cell Fact 14:133)。使用乙腈和含有1％乙腈的20mM KH2PO4(pH 2)的梯度作为洗脱剂，流速为ml·min-1，在6分钟内从0增加至10％的乙腈，接着增加至40％的乙腈直至23分钟。从23分钟至27分钟，使用含有1％乙腈的20mM KH2PO4作为洗脱剂。用于校准的阿魏酸，4-乙烯基愈创木酚和肉桂酸标准品获自Sigma Aldrich(Sigma-Aldrich,Zwijndrecht,The Netherlands)。
菌株IMK747(MATa/MATαSepad1-Sefdc1Δ::amdS/SePAD1-SeFDC1)和IMK749(MATa/MATαSepad1-Sefdc1Δ::amdS/Sepad1-Sefdc1Δ::amdS)在含有肉桂酸的合成麦芽汁中生长3天后分别显示出最终OD660nm降低25％和75％。所选择的变体中的三株显示出与亲本菌株CBS12357(MATa/MATαSePAD1-SeFDC1/SePAD1-SeFDC1)和IMK747(MATa/MATαSepad1-Sefdc1Δ::amdS/SePAD1-SeFDC1)相当的被肉桂酸的抑制，而所选择的变体中的两株，即HTSE-37和HTSE-42显示出与IMK749(MATa/MATαSepad1-Sefdc1Δ::amdS/Sepad1-Sefdc1Δ::amdS)相当的抑制。
选择的变体中的三株，即HTSE-22、HTSE-23和HTSE-33显示出与亲本菌株CBS12357相当的阿魏酸向4-VG的转化(图3)。单一的SeFDC1-ScPAD1敲除IMK747显示出约为亲本菌株CBS12357的一半的阿魏酸转化。在选择的变体的两株，即HTSE-37和HTSE-42中，与双FDC1-PAD1敲除IMK749相比，阿魏酸转化为4-VG的转化强烈降低或不存在。
4-VG阴性UV突变体HTSE-42的序列分析
如前所述制备菌株CBS12357和HTSE-42的基因组DNA(de Kok等人,2012.FEMSYeast Res 12:359-374)。构建CBS12357和HTSE-42的平均插入片段大小分别为413-bp和323-bp的文库，并以150-bp的读取长度进行配对末端测序。
分别为菌株CBS12357和HTSE-42产生了总共21,345,630和20,998,964个读取，占每株菌株超过3Gb的数据，代表了真贝氏酵母二倍体基因组的最小125倍的覆盖。使用Burrows-Wheeler比对工具(BWA)，将各菌株的序列读取映射到真贝氏酵母CBS12357(基因组PRJNA243390；Baker等人,2015.Mol Biol Evol 32:2818-2831)，并使用SAMtools进一步加工(Li和Durbin,2009.Bioinformatics 25:1754-1760；Li等人，2009.Bioinformatics25:2078-2079；Li和Durbin,2010.Bioinformatics 26:589-595)。
使用Pilon(Walker等人,2015.Plos One 9:e112963)确定单核苷酸变异和插入缺失标记(indel)。使用IGV(http://software.broadinstitute.org/software/igv/)使Pilon结果文件.vcf可视化。尽管在HTSE-42序列中鉴定了143个变体位置，但是在靠近断裂的区域中鉴定了大部分，并且在参照CBS12357中也发现了这些部分。然而，向染色体XIII的右端粒观察到大的缺失。在HTSE-42中缺失了ca.27kb区域。该区域有基因SePAD1和SeFDC1。
用具有降低的产生4-VG的能力的真贝氏酵母菌株产生杂合体
通过单倍体营养型酿酒酵母和真贝氏酵母IMK749(具有基于PCR的PAD1/FDC1断裂形式的CBS12357)的孢子之间的群体交配(mass-mating)，产生具有降低的将阿魏酸转化为4-VG的能力的杂合体。如前所述制备孢子。如Hebly和同事所述(Hebly等人，2015.FEMSYeast Res 15:fov005)进行群体交配：将100μl酿酒酵母IMK439(MATαHIS3 TRP1 LEU2SUC2 MAL2-8 C ura3Δ::KanMX)的指数中期细胞悬浮液加入到真贝氏酵母孢子中，并在轨道培养箱(Infors Multitron)中在30℃下以200rpm孵育4小时，然后铺板在选择性平板上。根据Verduyn等人，1992.Yeast 8:501-517制备选择性平板，其中硫酸铵被谷氨酸替代，以防止对作为抗生素补充的G418的阻碍。将三个单集落重新划线三次，然后将集落储存。在储存和评价阿魏酸转化为4-VG的能力之前，使单集落分离物在合成麦芽汁上稳定约50代。所得的杂合体命名为HTSH-012、HTSH-013和HTSH-014(MATa/MATαSepad1-Sefdc1Δ::amdS/Scpad1-fdc1)。
以类似的方式，使单倍体营养型真贝氏酵母和真贝氏酵母HTSE-42(表现出减少的4-VG产生的CBS12357的UV诱变变体)的孢子进行群体交配。所得的杂合体命名为HTSH-009、HTSH-011和HTSH-012(MATa/MATαSepad1-Sefdc1Δ/Scpad1-Scfdc1)。
通过PCR和流式细胞术证实成功的杂交。使用对酿酒酵母(Scer F2:5’-GCGCTTTACATTCAGATCCCG AG和Scer R2:5’-TAAGTTGGTTGTCAGCAAGATTG)和真贝氏酵母(Seub F3:5’-GTCCCTGTACCAATTTAATATTGCGC和Seub R2:5’-TTTCACATCTCTTAGTCTTTTCCAGACG)具有特异性的引物，如所描述的那样(Pengelly和Wheals,2013.FEMS Yeast Res 13:156-161)，产生杂合体的酿酒酵母特异性条带和真贝氏酵母特异性条带。用SYTOX绿色核酸染料对细胞进行染色，如(Haase and Reed,2002.CellCycle 1:132-136)所描述。在装配有488nm激光器的流式细胞仪上(BD Accuri C6,BDBiosciences,Sparks,MD)分析染色的细胞。将杂合体与已知倍性的菌株比较(n,CEN.PK113-7D；2n,214CEN.PK122；3n,FRY153)(van den Broek等人，2015.Appl EnvironMicrobiol 81:6253-6267)。所有杂合体HTSH-009-HTSH014显示出类似于2N对照菌株的荧光强度峰，其与菌株Ura+G418+的生长要求组合证实了菌株的杂合体性质。
实施例2
材料&方法：
如实施例1中所提供的，用缺乏4-乙烯基愈创木酚(4VG)产生的真贝氏酵母生产基础啤酒。使用常规的全麦芽麦芽汁作为基础，不同之处在于在酿造过程中不掺入啤酒花并且在麦芽汁煮沸后不调节pH。麦芽汁的初始糖浓度通过Anton Paar Beer Alcolyzer在15.6°Plato下测定。酵母以1.0×107CFU/ml接种。发酵在8℃下加酵母(pitched)，并允许在1000升麦芽汁中自由升高至13℃。两周后，将发酵冷却至-1℃持续1天，然后在BMF过滤器上过滤啤酒。通过
Figure BDA0003470332810000201
脱醇系统(APISchmidt-Bretten GmbH&Co.KG,Bretten,Germany)，根据制造商条件，将经过滤的啤酒脱醇至醇含量按体积计小于0.03％的醇。用酿造水将所得啤酒标准化至5.3度Plato(°P)的重力，如使用经校准的折射计或比重计所测定的，并且使用啤酒花提取物，根据在因特网地址://analytica-ebc.com可获得的Analytica-EBC(2004)提供的标准分析，将苦味设定为16个欧洲苦味单位(EBU)。随后将啤酒瓶装并进行巴氏灭菌。通过超高效液相色谱(UPLC)(Waters Co)测定可发酵糖的浓度。
用超高效液相色谱(UPLC)测量糖含量。UPLC可以合适地在65℃的温度下进行。作为洗脱液，使用乙腈/水以75/25(v/v)比率的混合物。使用的检测器是折射率(RI)检测器。通过将样品的UPLC曲线与具有已知糖浓度的标准样品的校准曲线进行比较来测定样品的糖含量。
如下制备用于UPLC的样品。通过添加乙腈/水混合物(50/50-等体积份)将啤酒或麦芽汁的样品稀释5倍。如果存在CO2，则在稀释之前去除CO2(例如通过摇动或搅拌样品)。稀释后，过滤样品以获得澄清溶液。使用上述洗脱液在65℃下将经过滤的样品注入UPLC。
在Agilent 7820A上通过气相色谱使用以下设置测量酯和较高的醇含量：GerstelMPS顶空进样取样器(head-space sampler)，DBWaxETR柱(60m,ID 0.32mm,FD 1μm(Agilent))和火焰离子化检测器。
通过将70.0ml乙醇、0.600ml 4-庚酮和6.00ml 1-丁醇与蒸馏水混合至1000ml的总体积来制备内参溶液。通过添加乙醇或用蒸馏水稀释样品，将每个样品的乙醇含量设定在4.4％-5.6％的范围内。将5.0ml的体积转移到10ml GC小瓶中，加入40μl的内参溶液，并将小瓶加盖。通过与具有已知浓度的标准样品的校准曲线进行比较来量化结果。
结果：
为了生产0.0啤酒，使用利用不消耗所有可发酵糖的酵母的酿造方法，在该情况下是真贝氏酵母。此外，这种特定的酵母菌株不具有产生4VG的能力。以这种方式，与基于脱醇过程的常规0.0啤酒相比，可以生产“口感”更好的啤酒。用产生有醇啤酒的常规工艺条件进行常规的酿造过程。将有醇啤酒脱醇并将所得产物标准化至5.3°P和16EBU。在表1中，给出了这种新啤酒与脱醇的常规啤酒相比的一些特征。此外，通过品尝评价啤酒的口感。与常规脱醇啤酒相比，口感改善。
表1：新啤酒的特征
Figure BDA0003470332810000211
Figure BDA0003470332810000221
实施例3
材料&方法：
酵母菌株
本实施例中使用的酿酒酵母菌株列于表2中，并由来自代尔夫特理工大学的工业微生物学部的Daran-Lapujade教授提供(Wijsman等人，2019.FEMS Yeast Res 19:10.1093)。将工作储备培养物在YPM培养基(10g.L-1Bacto酵母提取物，20g.L-1Bacto蛋白胨和20g.L-1麦芽糖)中培养直至指数中期，用无菌甘油[最终浓度30％(v/v)]完成，并以1mL等分试样储存在-80℃直至下一次接种。
表2.本实施例中使用的酵母菌株
Figure BDA0003470332810000222
培养基和生长条件
本研究中的标准生长条件为在设定为200rpm的Multitron Standard-孵育箱摇床(INFORS HT,Velp,The Netherlands)中在20℃下。在含有20mL YPM培养基的具有过滤器螺帽(Greiner Bio-One)的50mL
Figure BDA0003470332810000223
细胞反应器管中获得来自-80℃储备液的预培养物。过夜孵育后，将0.5ml培养物转移到50mL
Figure BDA0003470332810000224
管中的新鲜20ml YPM培养基中。两天后，使用OD 660nm为0.5的培养物接种在100ml隔瓶中的60ml经灭菌并过滤的麦芽汁(16度Plato(°P))。每天对培养物取样以分析糖、乙醇、表观提取物和OD。
分析方法
用DMA 35手持密度仪(Anton Paar,Graz,Austria)测量比重。
在配备有Bio-Rad HPX-87H离子交换柱(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)的Agilent1260HPLC(在60℃下操作，流动相为5mM H2SO4，流速为0.6mL min-1)上通过高效液相色谱分析来分析葡萄糖、果糖、麦芽糖、麦芽三糖和乙醇。使用Agilent折射率检测器以及Agilent 1260Infinity二极管阵列和多波长检测器进行检测。
结果：
为了生产缺少任何麦芽糖而己糖葡萄糖和果糖在发酵结束时仍然存在的0.0啤酒，用己糖转运缺陷酿酒酵母菌株(IMX1812)发酵全麦芽麦芽汁。由于己糖转运缺陷的酵母没有被报道在复合培养基中像麦芽汁一样发酵麦芽糖，因此将充分描述的用于工业应用的酿酒酵母模式菌株作为参照(CEN.PK2-1C；Entian and
Figure BDA0003470332810000231
2007.Yeast geneticstrain and plasmid collections.In:Stansfield I,Stark MJR(eds)Yeast GeneAnalysis vol.36,第2版.Amsterdam:Academic Press,Elsevier,629–66)。虽然参照表现为消耗所有可发酵糖(包括葡萄糖和果糖)的常规酿造酵母，但己糖转运缺陷酵母不发酵己糖，然而麦芽糖和蔗糖完全发酵(图4)。所得的发酵基质具有表3所示的组成。与常规方法相比，发酵基质具有高的麦芽三糖和己糖，因此具有高的甜/酸比和改善的口感，特别是在精馏以减少或去除醇之后。所得发酵基质的另一个优点是醇含量较少，这意味着需要较少的工作来精馏以减少或去除醇。
表3.使用己糖转运缺陷酵母的方法对比脱醇前的常规方法的发酵麦芽汁的特征
Figure BDA0003470332810000232

Claims (19)

1.生产醇减少的发酵啤酒，优选无醇啤酒的方法，所述方法包括以下步骤：
-将发酵酵母添加到麦芽汁中以至少部分地发酵所述麦芽汁，从而保留存在于所述麦芽汁中的葡萄糖、麦芽糖和/或麦芽三糖的至少一部分，
-任选地从所述麦芽汁中去除所述酵母，以及
-降低由此发酵的啤酒的醇含量，从而产生醇减少的发酵啤酒，优选无醇啤酒。
2.如权利要求1所述的方法，其中存在于所述麦芽汁中的葡萄糖、麦芽糖和/或麦芽三糖的至少一部分通过过早停止发酵而保留。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述发酵酵母不能将葡萄糖、麦芽糖和/或麦芽三糖完全转化为乙醇。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述发酵酵母不能将至少麦芽三糖完全转化为乙醇。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述发酵酵母不能将至少己糖，优选果糖和/或葡萄糖完全转化为乙醇。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、真贝氏酵母(S.eubayanus)和/或其杂合体，例如巴氏酵母(S.pastorianus)。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵酵母具有降低的酚酸脱羧活性，优选不产生4-乙烯基愈创木酚。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵酵母还包含突变，所述突变导致基因PAD1和FDC1中的至少一种失活，和/或编码参与酚酸，优选阿魏酸的摄取，或参与脱羧酚类化合物，优选4-乙烯基愈创木酚的输出的蛋白质的基因失活。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在6-25℃，优选在8-15℃下进行发酵。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过精馏降低发酵饮料的醇含量。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述醇减少的发酵啤酒是无醇啤酒，优选无醇拉格啤酒。
12.醇减少的发酵啤酒产品，其通过权利要求1-11中任一项所述的方法生产。
13.如权利要求12所述的醇减少的发酵啤酒产品，其是无醇啤酒，优选无醇拉格啤酒。
14.醇减少的发酵啤酒产品，优选无醇啤酒，更优选无醇拉格啤酒，其包含发酵前存在于起始麦芽汁中的葡萄糖、麦芽糖和/或麦芽三糖中的至少一种。
15.如权利要求14所述的醇减少的发酵啤酒产品，其包含存在于起始麦芽汁中的所有麦芽三糖。
16.如权利要求14所述的醇减少的发酵啤酒产品，其包含存在于起始麦芽汁中的所有葡萄糖。
17.如权利要求12-16中任一项所述的醇减少的发酵啤酒产品，其中不存在4-乙烯基愈创木酚。
18.发酵酵母用于生产醇减少的发酵啤酒产品，优选无醇啤酒，最优选无醇拉格啤酒的用途，所述发酵酵母选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、真贝氏酵母(S.eubayanus)和/或其杂合体，例如巴氏酵母(S.pastorianus)，其不能将葡萄糖、麦芽糖和/或麦芽三糖完全转化为乙醇。
19.如权利要求18所述的用途，其中所述发酵酵母不产生4-乙烯基愈创木酚。
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