ITVI20090169A1 - Ceppo di lievito saccharomyces cerevisiae dbvpg24p, il suo uso per la produzione fermentativa di alimenti, particolarmente di vino prosecco, un relativo prodotto e un metodo per la selezione del ceppo - Google Patents

Description

CEPPO DI LIEVITO Saccharomyces cerevisiae DBVPG24P E IL SUO USO PER LA PRODUZIONE FERMENTATIVA DI ALIMENTI, PARTICOLARMENTE DI VINO PROSECCO.

DESCRIZIONE

Campo della tecnica

La presente invenzione riguarda un ceppo di lievito appartenente alla specie Saccharomyces cerevisiae. Inoltre, l’invenzione si riferisce all'uso del ceppo di lievito nella produzione fermentativa di alimenti e particolarmente nel processo di vinificazione, specialmente nella produzione del vino Prosecco.

Stato dell’arte

Sino alla fine del secolo XIX le fermentazioni dei mosti d’uva venivano condotte naturalmente, utilizzando le popolazioni miste di lieviti presenti in vigneto. Agli inizi del †̃900 si iniziò ad introdurre il concetto di lievito selezionato in campo enologico, con lo scopo di condurre una fermentazione dei mosti e dei vini con risultati prevedibili e programmabili. Per lievito selezionato o starter selezionato quindi, si intende un ceppo caratterizzato da proprietà fisiologiche, biochimiche ed enologiche ottimizzate in rapporto alle esigenze tecnologiche dei processi di fermentazione in purezza (Pretorius, 2000).

L'uso dei lieviti commerciali come starter ha rivoluzionato il mondo enologico. Il loro uso, infatti, assicura un pronto avvio della fermentazione perché la qualità e la quantità di lievito aggiunto in prefermentazione à ̈ accuratamente scelta; permette, un maggior controllo del processo fermentativo da parte dell'operatore che sceglie come condurre la fermentazione, senza che questa sia in balia dei lieviti naturali risiedenti nell’uva; riduce i problemi di arresto o rallentamento del processo che sono tipici delle fermentazioni spontanee; velocizza il processo fermentativo in modo ponderato; realizza validi rendimenti di trasformazione degli zuccheri in alcool, riducendo la possibilità che altri microrganismi si insedino nel vino danneggiandolo (per esempio batteri acetici); riduce o elimina caratteristiche organolettiche anomale; contribuisce alla standardizzazione di produzione di un determinato vino permettendogli di essere riconoscibile dal consumatore anno dopo anno (Fleet e Heard, 1993).

I primi lieviti sono stati selezionati con lo scopo di esaltare le caratteristiche tecnologiche (vigore fermentativo, alcoltolleranza), in modo da ottenere prodotti senza difetti. Oggi i lieviti di ultima generazione, sono selezionati sulla base di caratteristiche che possano migliorare la qualità dei vini attraverso l’espressione di precursori già presenti nei mosti e la produzione di metaboliti secondari (alcoli superiori, esteri, chetoni, aldeidi).

Potenzialmente l’uso dei lieviti selezionati può presentare anche degli svantaggi per nulla trascurabili, potrebbe condurre a una eccessiva standardizzazione con il risultato di ottenere una riduzione della biodiversità dei lieviti vinari associati all’ambiente di cantina. La prospettiva peggiore però sembra la perdita di biodiversità in vigneto, infatti, dopo la vendemmia in vigneto si ritrova circa il 73% dei lieviti commerciali che ci sono in cantina, questi vengono per il 94% disseminati dalle macchine per la raccolta dell’uva in un raggio che va da 10 a 200 m dalla cantina (Valero et al. 2005).

Inoltre, gli starter reperibili in commercio, pur possedendo caratteri di indubbia importanza enologica, proprio perché provengono da realtà vitivinicole estranee, non sono sempre capaci di sviluppare completamente i sapori e gli aromi tipici di un vino (Pretorius, 2000). Per ovviare a questi problemi, sia microbiologici che tecnologici, à ̈ opportuno introdurre l'uso di starter ecotipici. I ceppi ecotipici vengono utilizzati esclusivamente nella zona di isolamento e sono stati selezionati seguendo le caratteristiche di tipicità del prodotto locale. In realtà sono i lieviti che originariamente davano luogo alla fermentazione spontanea e contribuivano in questo modo a costruire le caratteristiche di tipicità del vino. In ogni zona pedoclimatica e forse in ogni singolo vigneto nel tempo si à ̈ insediato un complesso di ceppi di S. cerevisiae adattati ed evoluti per vivere in quel luogo, ma soprattutto responsabili dei caratteri organolettici specifici del vino prodotto localmente.

Quasi tutti i ceppi attualmente disponibili sono il frutto di selezioni clonali più o meno accurate. Esiste infatti un'oggettiva difficoltà nello stabilire quali siano le caratteristiche che devono possedere i lieviti per essere considerati enologicamente “buoni" e, in ogni caso, nel misurare i caratteri ed esprimere numericamente l'intensità con cui si presentano. I caratteri enologici importanti possono essere suddivisi in due gruppi: quelli di importanza tecnologica che influiscono sull’andamento dei processi fermentativi e quelli di qualità che influiscono sulle caratteristiche chimiche dei vini (Zambonelli, 2003). Prevalentemente la selezione avviene tramite l'isolamento di ceppi di lievito che vengono sottoposti a test di fermentazione. Questi test sono molto laboriosi e richiedono molto tempo e vengono spesso effettuati non soltanto su rappresentanti della specie desiderata (p. es. S. cerevisiae), ma anche su lieviti di altre specie non desiderate che si trovano fra i ceppi isolati. I test di fermentazione sono impegnativi per quanto riguarda tempo, personale e costi limitando così il numero di campioni che possono essere testati in tempi e con costi ragionevoli. Tanti campioni possono contenere lo stesso ceppo risultando in test doppi.

Fra i principali caratteri tecnologici si trova il potere fermentativo o alcoligeno che secondo Delfini à ̈ il grado alcolico massimo (inteso come etanolo %) prodotto da un lievito per fermentazione di un mosto contenente zucchero in eccesso (Delfini, 1995). L’alcol etilico principale prodotto dell’attività dei lieviti in condizioni di anossia, à ̈ il composto che esercita azione inibitrice su tutti i microrganismi. Poiché in enologia ai lieviti sono richieste prestazioni notevoli, si richiede ad esempio di produrre vini con elevato grado alcolico; anche la resistenza (alcoltolleranza) verso questo composto assume, evidentemente, una importanza fondamentale. I lieviti di mosti meridionali, a parità di specie, hanno potere alcoligeno in media più elevato di quelli provenienti da mosti settentrionali (Zambonelli et al., 2000).

Un ulteriore carattere tecnologico importante à ̈ il vigore fermentativo (o velocità di fermentazione) che esprime la capacità di dare origine a pronte e rapide fermentazioni in presenza anche di antisettici nelle dosi consentite dalla legge e a temperature comprese tra 20°C e 30°C. E’ stato individuato nel secondo giorno di fermentazione il momento in cui le differenze di comportamento sono più significative. Il pronto avvio del processo fermentativo à ̈ uno dei caratteri che lo starter deve possedere a prescindere dalla sua tipologia di impiego; per tale motivo deve essere ritenuto fondamentale nella selezione dei lieviti per la vinificazione.

Un ulteriore fattore molto importante à ̈ la resistenza all’anidride solforosa S02, cioà ̈ la capacità di mantenere inalterata o sufficientemente elevata la velocità di fermentazione in presenza delle dosi selettive di S02aggiunte ai mosti. E' importante selezionare i ceppi maggiormente resistenti a questo antisettico per evitare problematici avvìi nel processo fermentativo.

Un altro aspetto importante riguarda le modalità di sviluppo, cioà ̈ il comportamento delle cellule dei lieviti al termine del processo di gemmazione, si distingue fra sviluppo polverulento, flocculento oppure in aggregati. Lo sviluppo più comune in S. cerevisiae à ̈ quello polverulento, ma anche il migliore auspicabile in uno starter selezionato per la fermentazione primaria. La rapidità di sedimentazione à ̈ un ulteriore carattere positivo poiché agevola le successive operazioni di chiarificazione e filtrazione. La rapidità di sedimentazione può essere misurata attraverso il tempo di illimpidimento espresso in giorni.

I ceppi che intorbidano il vino in maniera più fastidiosa e persistente sono quelli schiumogeni. Il potere schiumogeno risulta dal fatto che in molti ceppi (20-30%) le cellule aderiscono alle bollicine di CO2 che vengono prodotte durante la fermentazione. Queste, arrivate alla superficie, anziché rompersi si fondono tra loro e aumentano il volume dando origine alle schiume che assumono colore grigio-bruno appunto per la presenza delle cellule. Per misurare questo parametro si valuta l’altezza della schiuma. L'assenza 0 la scarsa produzione di schiuma à ̈ carattere sicuramente positivo sia in fermentazioni primarie che in rifermentazione, perché riduce il volume occupato dal mosto. Altro aspetto à ̈ il potere filmogeno. Alcuni ceppi, alla fine della normale fermentazione alcolica, danno origine ad un velo sulla superficie del vino, dove lo sviluppo continua in condizioni ossidanti (fior). I ceppi fior ossidano l’alcol etilico e formano una serie di composti aromatici. L'adesività invece à ̈ la capacità delle cellule di lievito di crescere adese sulle superfici dei vasi vinari; risulta essere un carattere negativo perché complica l’igienizzazione delle vasche a fine lavorazione (Vincenzini et al. 2005).

I principali caratteri di qualità, cioà ̈ le caratteristiche relative alla produzione di sostanze importanti dal punto di vista organolettico, sono descritti di seguito. Il glicerolo, dopo l’etanolo e la CO2, à ̈ il composto prodotto in maggior quantità durante la fermentazione alcolica. Esso influenza notevolmente il “corpo del vino†, contribuisce ad impartire ai vini i caratteri di “pienezza" e di “dolcezza" (soglia di percezione 5,2 g/l). I Saccharomycas della vinificazione possono produrre dai 2 ai 10 g/l in funzione della specie e del ceppo di lievito. S. cerevisiae à ̈ il lievito che forma le minori quantità di glicerolo ed à ̈ questo il motivo principale del suo alto rendimento in etanolo. Il glicerolo à ̈ gradito alle più alte concentrazioni nei vini rossi ai quali conferisce la sensazione di “vecchio", non lo à ̈ per lo stesso motivo nel caso di vini che devono conservare la freschezza originale.

Questo composto, nella realtà, non à ̈ un prodotto secondario della fermentazione perché deriva direttamente dagli zuccheri e la sua entità di formazione, a parità di ceppo, à ̈ proporzionale alla loro concentrazione (Zambonelli et al. 2000).

Fra i prodotti secondari, un ruolo importantissimo, anche se tutto negativo, à ̈ svolto dall’acido acetico che deriva, in fermentazione, dalla degradazione degli zuccheri per ossidazione dell'acetaldeide (Ribéreau-Gayon, 2000). La capacità di produrre quantità più o meno elevate di acido acetico, oltre che di specie à ̈ carattere di ceppo, à ̈ ereditario e stabile.

Questo carattere viene attualmente definito col termine di purezza fermentativa, à ̈ espresso come rapporto tra l’acidità volatile formata e alcol etilico prodotto. I ceppi migliori risultano quelli che hanno il minor valore di purezza fermentativa. In linea di massima, per un vino di 10° alcolici, un valore di questo carattere inferiore a 0,3 g/l à ̈ già da considerarsi ottimo.

L'acidità volatile dei vini può essere di diversa origine e non deriva soltanto dall’attività dei lieviti; spesso anche il mosto ha già un contenuto di acido acetico rilevante quale conseguenza del marciume acido o dello sviluppo di batteri acetici sulle uve (Zambonelli, 2003). L’acetaldeide à ̈ il composto carbonico più importante che si forma durante la fermentazione e rappresenta più del 90% del contenuto totale di aldeidi nel vino. E’ un normale prodotto della fermentazione alcolica e il suo contenuto nel vino può variare notevolmente (10-300 mg/l); la valutazione del suo contenuto à ̈ usata come indicatore del grado di ossidazione di un vino. Un livello alto di acetaldeide à ̈ indesiderabile e vini contenenti 500 mg/l sono considerati non commerciabili. I vini bianchi hanno in generale un valore medio di 80 mg/l. Presente nel vino a livelli bassi conferisce un gradevole aroma di frutta, ma a concentrazioni già di 100-125 mg/l libera un odore pungente ed irritante. L'anidride solforosa induce la produzione di acetaldeide da parte dei lieviti e questo sembra essere correlato alla resistenza dei lieviti all’anidride stessa.

Il fattore principale che determina la maggiore variabilità di contenuto di acetaldeide à ̈ la specie di lievito. S. cerevisiae à ̈ tra i maggiori produttori della molecola (50-120 mg/l)(Vincenzini et al. 2005).

Gli alcoli superiori rappresentati prevalentemente sono: l'n-propanolo, l’isobutanolo, l'alcol amilico e l'alcol 2-fenil etilico. Questi composti derivano dal catabolismo degli aminoacidi corrispondenti presenti nel mosto, ma anche dal metabolismo del glucosio senza coinvolgimento degli aminoacidi precursori. Non c'à ̈, infatti, una relazione diretta tra le quantità di aminoacidi presenti nel mosto e quelle degli alcoli superiori nel vino. La produzione di questi composti à ̈ dovuta principalmente all’azione dei ceppi di lievito i quali possono fornire da 100 a 500 mg/l a seconda della composizione del mezzo, disponibilità di ossigeno, fonte azotata e concentrazione iniziale dello zucchero. La specie S. cerevisiae à ̈ la maggiore produttrice.

Piccole quantità di alcoli superiori contribuiscono positivamente alla qualità del vino, mentre quantità elevate conferiscono al prodotto qualità negative. Fa eccezione il 2-feniletanolo, che libera una fragranza di rosa ed in concentrazione anche elevata contribuisce positivamente all’aroma del vino (Vincenzini et al., 2005).

I composti solforati, dal punto di vista qualitativo, sono costituiti principalmente da idrogeno solforato (H2S) e anidride solforosa (S02), che derivano direttamente dalla riduzione dei solfati presenti nei mosti; sono sempre prodotti da S. cerevisiae, anche se in quantità differenti e variabili in funzione del ceppo.

Un’eccessiva concentrazione di H2S nei vini causa odori sgradevoli di uova marce e quindi la sua produzione da parte di colture selezionate deve essere sempre ai più bassi livelli.

La produzione di S02da parte dei lieviti, come sopra citato, presenta un’ampia variabilità. La capacità di stabilizzare i vini da parte dei ceppi di lievito à ̈ legata alla produzione di S02. Tuttavia, alcuni ceppi che producono quantità rilevanti di S02(100-120 mg/l), hanno anche la tendenza a produrre notevoli quantità di acetaldeide (per difendersi da tale antisettico). Il risultato, a fine fermentazione, à ̈ un'alta concentrazione di S02combinata, che può compromettere la qualità del vino. Durante le operazioni di selezione di uno starter vinario, quindi, la preferenza dovrebbe andare ai ceppi che producono bassi livelli di S02(massimo 10-20 mg/l) (Vincenzini et al. 2005).

Un altro aspetto concerne l’azione sull’acido malico. L’acido malico à ̈ uno dei principali acidi organici dei mosti e dei vini. Alcuni lieviti non-Saccharomyces sono in grado di consumarlo mediante la fermentazione maioalcolica. D'altro canto sono stati individuati ceppi di Saccharomyces, generalmente tra i criotolleranti, capaci anche di produrre l’acido malico durante il processo fermentativo (Fatichenti et al., 1981). Queste due diverse abilità (degradazione e produzione di acido malico) potrebbero essere utilizzate in funzione delle caratteristiche del mosto e della tipologia di vino che si vuole ottenere (Vincenzini et al. 2005).

L’attività esterasica posseduta dai lieviti à ̈ molto importante nel processo di vinificazione poiché ha un forte effetto sulle caratteristiche sensoriali del vino, producendo i principali e più importanti aromi di fermentazione. Durante lo sviluppo del lievito in un mosto si producono numerosi esteri ottenuti dall’unione di acido acetico o altri acidi grassi principalmente a catena media con etanolo o altri alcoli superiori presenti nel vino e prodotti anch'essi dal metabolismo dei lieviti. L’influenza sulla qualità del vino può essere negativa e non gradita soprattutto nel caso dell’acetato di etile che conferisce tipico profumo di aceto (o addirittura solvente). Altri invece sono molto desiderati come ad esempio l'estere etilcaproato soprattutto in quei vini caratterizzati da sentori di frutta bianca (p. es. il Prosecco).

Le attività enzimatiche extracellulari rappresentano una caratteristica importante dei lieviti tecnologici. I lieviti, infatti, riescono a modificare la composizione dei vini anche per via indiretta, cioà ̈ mediante la secrezione nel mezzo di enzimi idrolitici.

L’attività β-glicosidasica, in particolare, agisce su precursori aromatici glicosilati che caratterizzano le diverse varietà d’uva, liberando la molecola odorosa responsabile dell’aroma varietale. E’ noto da molto tempo che tali molecole (appartenenti alle classi dei terpeni, benzeni e norisoprenoidi) giocano un ruolo molto importante nel conferimento del gusto e del profumo dell'uva e dei vini e che questi composti sono presenti per la maggior parte sotto forma di complessi glicosidici inattivi dal punto di vista sensoriale. L’idrolisi dei complessi glicosidici e la conseguente liberazione dei monoterpeni può essere ottenuta con metodi fisici (temperatura), con metodi chimici (acidificazione) e con metodi biochimici (via enzimatica); gli ultimi risultano essere i più efficaci. Gli enzimi in questione, rappresentati dalla classe delle βglucosidasi, sono diffusi nel mondo vegetale e, in particolare, nella stessa uva (Gunata et all. 1985). In S. cerevisiae l’attività βglucosidasica à ̈ presente in un gruppo molto limitato di ceppi, mentre negli apiculati à ̈ assai frequente (Zambonelli, 2003).

La sostanza nutritiva più importante, poiché presente in quantità limitate e sicuramente non bilanciate rispetto alla fonte di carbonio, durante la vinificazione à ̈ l’azoto prontamente assimilabile; può essere presente in forma di ammonio o anche di aminoacidi. La concentrazione dell'azoto nell'uva diminuisce durante la maturazione deH’uva. Il mosto d’uva contiene spesso quantità non sufficienti di azoto prontamente assimilabile. In questo caso à ̈ necessario aggiungere azoto, p. es. in forma di diammonio fosfato, durante la fermentazione. Resti di questo ammonio in caso di sovradosaggio però creano problemi al vino pregiudicando la stabilità microbiologica dello stesso. Un'elevata produzione di H2S e un rallentamento della fermentazione sono spesso un risultato di mancanza d’azoto. In mancanza di ammonio, aminoacidi già stoccati possono essere decomposti dal lievito risultando nella formazione di alcoli superiori non desiderati (Ribéreau-Gayon et al. 2000).

Il documento EP 1 482 029 A1 descrive due ceppi di Saccharomyces cerevisiae ecotipici isolati in Spagna. Sono descritte in esso particolari caratteristiche favorevoli, come una buona resa zucchero/etanoio e particolari aromi fruttati e freschi, il documento non descrive invece l'analisi chimica di particolari componenti chimici. Un metodo per selezionare ceppi idonei alla vinificazione à ̈ stato descritto, per esempio, nella tesi di dottorato di Elena De Bortoli “Aspetti microbiologici legati alle produzioni enologiche dei territori delle DOC di Conegliano, settembre 2008†, eseguita aH’Università di Padova.

Descrizione dell’invenzione

Scopo dell’invenzione à ̈ fornire un ceppo di lievito della specie Saccharomyces cerevisiae ecotipico della zona DOC di Conegliano e Valdobbiadene (Regione Veneto - Italia) che à ̈ dotato di caratteristiche tecnologiche ed enologiche che consentono una buona fermentazione del mosto ottenuto soprattutto con l’uva Prosecco permettendo la produzione di un vino gradevole. Un ulteriore scopo à ̈ fornire un ceppo che produce alcoli superiori in quantità basse e che contemporaneamente presenta un’elevata produzione di aromi che conferiscono al vino Prosecco i tipici sentori di frutta bianca e agrumi. Uno scopo particolarmente importante dell’invenzione à ̈ fornire un ceppo di lievito della specie Saccharomyces cerevisiae utilizzabile nella fermentazione anche di mosti a basso contenuto di azoto prontamente assimilabile, e utilizzabile preferibilmente senza l'aggiunta di azoto prontamente assimilabile.

Gli scopi suddetti vengono raggiunti dal ceppo di lievito come caratterizzato nella rivendicazione 1.

Il ceppo di lievito Saccharomyces cerevisiae secondo l'invenzione dispone di ottime caratteristiche enologiche, sia tecnologiche come anche chimiche, ed à ̈ ecotipico nella zona DOC di Conegliano e Valdobbiadene. Il ceppo à ̈ stato identificato con la sigla P301.9 ed à ̈ stato depositato secondo il Trattato di Budapest il 26/05/2009 presso la "Industriai Yeasts Collection" DBVPG a Perugia con il numero di deposito 24P e il numero di protocollo PROT. 521/P/2009. Una caratteristica fondamentale del ceppo selezionato à ̈ di rappresentare un ottimo compromesso tra caratteristiche tecnologiche ed aspetti di tipicità legati al vino Prosecco.

Il ceppo isolato e selezionato à ̈ sorprendentemente caratterizzato da un fabbisogno in azoto assimilabile molto basso. Questo fatto lo rende universalmente utilizzabile anche in mosti a basso contenuto d’azoto prontamente assimilabile. Vantaggiosamente, la vinificazione effettuata con l’aggiunta di inoculi di questo lievito non richiede l'aggiunta di azoto assimilabile oppure soltanto basse concentrazioni. Finora le schede tecniche che accompagnano i ceppi enologici presenti sul mercato non contengono informazioni che riguardano la richiesta in azoto, trascurando un fatto molto importante per le caratteristiche tecnologiche del ceppo. In realtà à ̈ di fondamentale importanza in quanto a seconda delle necessità in azoto abbiamo comportamenti fermentativi completamente diversi a parità di concentrazioni di questo elemento. Questo si riflette nelle capacità fermentative e nella quantità di prodotti secondari. E' chiaro che più bassa à ̈ la necessità in azoto maggiore à ̈ la versatilità del ceppo e la possibilità di adattarsi a condizioni diverse. Questa attitudine à ̈ stata misurata in condizioni di laboratorio su mosto sintetico e il risultato ottenuto espresso in azoto disponibile per litro utilizzato à ̈ quello necessario per passare, al massimo della velocità fermentativa (0,7 g r<1>h<'1>) da 5g a 75 g di CO2 prodotta. In questi condizioni la richiesta in azoto pari a 49 mg/l à ̈ stata di gran lunga inferiore rispetto a quella di altri ceppi commerciali. Le condizioni sperimentali in cui à ̈ stata condotta la prova hanno permesso di determinare un valore paragonabile, indipendente da composizioni particolari di mosti naturali. La bassa richiesta in azoto rendono il ceppo secondo l’invenzione estremamente versatile e ne garantiscono buone e costanti performance di fermentazione, anche in mosti che contengano concentrazioni di azoto prontamente assimilabile molto diverse.

Il ceppo presenta sorprendentemente una produzione bassissima di alcoli superiori (1-propanolo e 3-metil-1-butanolo) e l’assenza della produzione di 1-butanolo. Inoltre anche la concentrazione dell’etilacetato si à ̈ rivelata molto bassa. Il vino ottenuto con questo lievito à ̈ privo di odori di solvente pungenti. Il ceppo secondo l’invenzione ne produce meno del ceppo commerciale di controllo (Premium Prosecco, Enologica Vason srl, Località Nassar, Pedemonte, Verona, contenente un ceppo delia specie Saccharomyces cerevisiae) che à ̈ il più utilizzato nella zona del Prosecco ed à ̈ giudicato un buon ceppo enologico.

Un altro aspetto positivo riscontrato in questo lievito riguarda la produzione di composti aromatici. Il ceppo, infatti, produce in mosto di Prosecco inaspettatamente quantità elevate di etilcaproato (aroma di mela) in concentrazioni (> di 800 pg/l) superiori rispetto ad altri lieviti enologici. Il ceppo commerciale sopra menzionato e utilizzato attualmente per la produzione del Prosecco DOC non produce infatti l’etilcaproato responsabile del sentore di mela. Il ceppo P301.9 à ̈ quindi, per le sue qualità olfattive, nettamente superiore a ceppi attualmente disponibili. In più produce geraniolo (aroma di agrumi), e anche questo alcool terpenico non si trova in concentrazioni rilevabili nel vino prodotto con il ceppo commerciale attualmente valutato come miglior ceppo disponibile. Queste molecole conferiscono al Prosecco i tipici aromi desiderati. La buona attività beta-glucosidasica del ceppo sicuramente svolge un ruolo importante nello sviluppo degli aromi varietali che sono essenziali nel definire la tipicità come caratterizzante.

Il ceppo à ̈ stato caratterizzato e classificato tassonomicamente al livello di specie come appartenente alla specie Saccharomyces cerevisiae mediante analisi con enzimi di restrizione del tratto ITS (Internai Transcribed Spacer) del DN^ ribosomale utilizzando gli enzimi Hae III e Mae\, secondo un rfìetodo descritto in dettaglio nell’esempio 1 punto 1.7 e mediante sequenziamento della regione D1/D2 come descritto in dettaglio nell'esempio 2, punto 2.5. Le sequenze ITS e D1/D2 che caratterizzano il ceppo geneticamente sono rappresentate nella lista delle sequenze con i numeri di identificazione della sequenza SEQ ID Nos 19 (D1/D2) e 20 (ITS). Il lievito secondo l’invenzione ha le seguenti caratteristiche fisiologiche: sporifica su agar acetato, con aschi persistenti, contenenti da una a quattro spore di forma sferica. Non cresce in presenza di 10 mg/l di cicloesimide.

Altri aspetti positivi riscontrati in questo lievito sono stati osservati durante la crescita in mosto sintetico (vedi esempio 1). Il lievito oggetto di questo brevetto ha le caratteristiche enologiche di seguito riportate: glucosio consumato dopo 2 giorni (vigore fermentativo) 3,6 g; glucosio consumato dopo 7 giorni 15,1 g; glucosio consumato a fine fermentazione 18,3 g; 15 giorni di fermentazione, altezza massima della schiuma prodotta à ̈ di 18 mm; il tempo di illimpidimento à ̈ dì 14 giorni, l'adesività à ̈ di 2 mm.

Un altro aspetto positivo riscontrato in questo lievito riguarda la produzione di H2S che à ̈ modesta. Il potere alcoligeno à ̈ 16,4 %. Il ceppo à ̈ resistente ad una concentrazione di S02almeno di 50 mg/l e dimostra una buona attività beta-glucosidasica, soprattutto a pH 3,5 (situazione enologica). Sorprendentemente e molto vantaggiosamente il ceppo di lievito secondo l’invenzione ha un fabbisogno in azoto, nelle condizioni sperimentali testate sopra citate, inferiore a 50 mg/l. Il ceppo à ̈ stato caratterizzato geneticamente ed enologicamente.

L’esempio 2 descrive dettagliatamente la caratterizzazione genetica del ceppo, mentre l’esempio 3 descrive dettagliatamente le caratteristiche enologiche.

Preferibilmente il ceppo viene stoccato in forma essiccata, in forma liofilizzata o in forma di pasta. Queste forme lo rendono idoneo al trasporto e alla vendita. Il ceppo può essere stoccato anche a temperature basse oppure in forma congelata. Il ceppo essiccato può essere in forma di polvere o di pellets. La congelazione oppure la disidratazione avviene con metodi ben noti all’esperto.

Il ceppo secondo l'invenzione à ̈ adatto per essere utilizzato nella produzione di alimenti ottenuti mediante fermentazione alcolica. Alimenti producibili con questo lievito sono per esempio pane, prodotti a base di latte, sidro, birra, spumanti e vino. Sono però ipotizzabili anche altre bevande alcoliche ottenuti da fermentazione alcolica di altra frutta, cereali, come frumento o riso, o di patate utilizzando il ceppo proposto in questa invenzione.

In una variante esecutiva preferita dell’invenzione il ceppo viene utilizzato per la vinificazione per ottenere vini, p. es. vini rossi, vini rosé o vini bianchi. Producendo aromi gradevoli con una bassa produzione di alcoli superiori à ̈ particolarmente adatto per la produzione di vini.

Particolarmente preferito à ̈ il suo utilizzo nella produzione di vino Prosecco poiché produce gli aromi di mela e agrumi molto desiderati nel Prosecco.

Preferibilmente le uve Prosecco utilizzate per la produzione del vino Prosecco con il ceppo secondo l’invenzione sono prodotte nella zona DOC di Conegliano e Valdobbiadene in Italia.

il ceppo P301.9 può facilmente essere coltivato ed à ̈ quindi molto adatto a essere utilizzato per produrre biomassa anche in scala industriale con metodi standard noti. Preferibilmente la sua coltivazione avviene su un terreno YM contenente 3 g/l estratto di lievito, 3 g/l estratto di malto, 5 g/l peptone e 10 g/l glucosio. Preferibilmente, la crescita avviene alla temperatura di 25°C. Per verificare la presenza di cellule vive à ̈ possibile utilizzare il metodo della conta delle colonie su piastra Petri, utilizzando il terreno di crescita YM.

In una variante molto preferita dell’invenzione il vino viene ottenuto in un processo di fermentazione alcolica che utilizza il potere fermentativo del ceppo secondo l’invenzione, cioà ̈ tramite l’uso del ceppo secondo l’invenzione nella fermentazione di uva, senza l’aggiunta di azoto prontamente assimilabile. Il basso fabbisogno in azoto prontamente assimilabile lo rende particolarmente adatto a questo processo evitando così un eventuale sovradosaggio di fonti di azoto artificiali. Questo ceppo à ̈ quindi particolarmente adatto per fermentazioni in cui il mezzo di fermentazione à ̈ povero di azoto prontamente assimilabile.

Un vino Prosecco ottenuto con una fermentazione alcolica di mosto Prosecco per mezzo del ceppo secondo l'invenzione comporta tanti vantaggi, fra i quali concentrazioni elevate di etilcaproato (aroma di mela) e basse concentrazioni di alcoli superiori (assenza di odori pungenti). In più il contenuto bassissimo di etilacetato lo rende superiore a vini prodotti con altri lieviti. In più il ceppo secondo l’invenzione ha ottime qualità enologiche, sia chimiche come anche tecnologiche, rendendolo particolarmente adatto alla produzione di un buon vino Prosecco.

Vantaggiosamente, il Prosecco prodotto con il ceppo secondo l’invenzione contiene etilcaproato prodotto naturalmente dal ceppo in una concentrazione > 800 pg/l.

E’ possibile svolgere una vinificazione in modo ottimale introducendo il ceppo nella forma di inoculo preparato secondo le ricette descritte nell’esempio 1 , p. es. al punto 1.9, che riguarda la microviniflcazione. La selezione del ceppo avviene tramite un metodo sequenziale che combina in modo vantaggioso analisi tecnologiche, chimiche, olfattive, sensoriali e genetiche in un ordine particolare. Il metodo di selezione permette uno screening di una grande quantità di isolati di lievito (anche svariate centinaia) in tempi relativamente rapidi e in modo poco costoso. Il metodo riduce la probabilità che ceppi dello stesso tipo vengono sottoposti più volte alla stessa analisi. Ceppi di specie non adatti alla vinificazione, che hanno eventualmente capacità fermentative buone ma qualità aromatiche scarse, vengono eliminati in una fase iniziale della sequenza, questo grazie all’introduzione precoce di analisi olfattive e/o sensoriali durante la selezione. Il metodo riduce così anche il rischio che ceppi non presenti in quantità dominanti nelle zone di campionamento, come il ceppo secondo l'invenzione, siano trascurati durante la selezione. Il territorio di campionamento in cui à ̈ stato isolato il ceppo oggetto dell'invenzione costituisce la zona di produzione della DOC di Conegliano e Valdobbiadene, che si estende prevalentemente nella fascia collinare della provincia di Treviso (un insieme di colline con direzione est-ovest che raggiungono le Prealpi); solo verso Conegliano i vigneti sono piantati in zone più pianeggianti. La vite viene coltivata solo nella parte più soleggiata dei colli, ad un'altitudine compresa tra i 50 e i 500 metri sul livello del mare. Il ceppo à ̈ stato isolato da uve di Prosecco. I rilievi ampelografici hanno evidenziato l'esistenza di differenze significative relativamente a 22 caratteri fra i biotipi di Prosecco tondo e Prosecco lungo presenti nella zona DOC di Conegliano-Valdobbiadene. Il Prosecco lungo si differenzia dal Prosecco tondo essenzialmente per avere il germoglio un po' più peloso e più colorato, la foglia leggermente più grande, coriacea e con il seno peziolare meno chiuso, il grappolo leggermente più corto e l’acino di forma ellittica - corta anziché sferica. Altre differenze tra i due vitigni riguardano il peso medio del grappolo (Prosecco tondo 230 - 350 g, Prosecco lungo 280 - 360 g) e le dimensioni medie dell'acino (Prosecco tondo 1 ,89 - 2,20 cm di lunghezza e 1 ,00 -1,05 cm di larghezza, Prosecco lungo 2,07-3,06 cm di lunghezza e 1 ,11-1 ,15 cm di larghezza).

Nella fase di campionamento il territorio della DOC Conegliano e Valdobbiadene à ̈ stato suddiviso in 37 microaree in cui sono stati effettuati i campionamenti dei grappoli. Da 11 delle 37 località sono stai ottenuti grappoli che dopo fermentazione hanno permesso di isolare lieviti di interesse tecnologico ( Saccharomyces sensu stricto).

II ceppo P301.9 proviene dalla località “Col de Roer†(nel comune di Valdobbiadene) in cui à ̈ stata riscontrata la biodiversità più alta (i 192 isolati provenienti da questa regione sono stati raggruppati in 12 profili genetici che corrispondono ad altrettanti ceppi). I lieviti Saccharomyces raccolti in questa località costituiscono 16,2% del totale degli isolati identificati come appartenenti a questo gruppo.

Breve descrizione delle figure

La fig. 1 mostra il cariotipo del ceppo di lievito P301.9 ottenuto mediante dell'elettroforesi pulsata;

la fig. 2 mostra l'analisi delle sequenze microsatelliti del ceppo P301.9;

la fig. 3 mostra il profilo di restrizione dei DNA mitocondriale del ceppo P301.9.

In particolare la fig. 1 mostra il risultato di un'elettroforesi eseguita con buffer TBE 0,5x a 9°C, 1 ,2 % di concentrazione agarosio, un gradiente di voltaggio di 5,1 V/m, una durata (run time) di 34 h con uno switch iniziale di 60 secondi e uno switch finale di 120 s. Il ceppo YPH755 Ã ̈ il marker di riferimento. L'elettroforesi viene descritta dettagliatamente nell'esempio 2, punto 2.1.

Nell’analisi rappresentato nella fig. 2 sono stati considerati i microsatelliti C4, C5, C8, C11 e SCYOR267C descritti in Legras et al. (2005). Ogni campione à ̈ stato analizzato in duplicato.

M rappresenta il marcatore di peso molecolare (miscela Marker III marker VI, Roche, Milano).

Significano:

Pozzetto 1 : ceppo P301.9 con micro satellite C4

Pozzetto 2: ceppo P301.9 con micro satellite C4

Pozzetto 3: ceppo P301.9 con micro satellite C5

Pozzetto 4: ceppo P301.9 con micro satellite C5

Pozzetto 5: ceppo P301.9 con micro satellite C8

Pozzetto 6: ceppo P301.9 con micro satellite C8

Pozzetto 7: ceppo P301.9 con micro satellite C11

Pozzetto 8: ceppo P301.9 con micro satellite C11

Pozzetto 9: ceppo P301.9 con micro satellite SCYOR267C Pozzetto 10: ceppo P301.9 con micro satellite SCYOR267C

Nella fig. 3, M Ã ̈ GeneRulerâ„¢ 1 kb DNA Ladder (Fermentas Life Sciences, Ontano, Canada).

Il genoma del ceppo P301.9 determina i profili elettroforetici ottenuti dalla digestione enzimatica del profilo di restrizione del DNA mitocondriale e dall’amplificazione delle sequenze microsatelliti rappresentati nella fig. 2. Le caratteristiche genetiche del ceppo sono state studiate mediante i metodi molecolari descritti nell’esempio 2 e nell’esempio 3.

Descrizione degli esempi esecutivi

ESEMPIO 1 - Fasi di isolamento e selezione del ceppo secondo l’invenzione

1.1 Campionamento

Il campionamento à ̈ stato effettuato raccogliendo singoli grappoli d’uva all’interno della zona DOC del Prosecco di Conegliano e Valdobbiadene nei giorni immediatamente precedenti la vendemmia. All’interno di ciascun vigneto, sono stati scelti i filari più lontani da strade ed edifici (fonti di possibili contaminazioni con microrganismi non autoctoni) e scelti grappoli bassi, vicini al terreno, maturi quanto più possibile e non infestati da muffe visibili.

La raccolta à ̈ stata effettuata evitando in ogni fase di toccare i grappoli con le mani e sterilizzando periodicamente le forbici, allo scopo di limitare il più possibile le contaminazioni.

Sono stati utilizzati sacchetti sterili da stomacher, ciascuno dei quali à ̈ stato riempito con circa 500 g di uva (corrispondenti a circa uno o due grappoli, a seconda delle dimensioni) e chiuso provvisoriamente per il trasporto al laboratorio, avvenuto all’interno di contenitori in polistirolo. Per ogni campione, al momento della raccolta, à ̈ stata compilata una scheda contenente informazioni sulla data di campionamento, nome dell’azienda, località, esposizione del vigneto, eventuali trattamenti antibotritici effettuati, età e varietà del vigneto. All’arrivo in laboratorio, ad ogni campione sono stati aggiunti 10 g di zuccheri (5 g di fruttosio e 5 g di glucosio) e 500 pi di anidride solforosa al 5% (v/v). Ciascun sacchetto à ̈ stato chiuso con un tappo di gommapiuma precedentemente sterilizzato, allo scopo di evitare l'aumento di pressione all’interno del sacchetto in seguito allo sviluppo di C02e mantenendo nel contempo l'ambiente interno isolato da quello esterno dal punto di vista microbiologico. Ogni grappolo à ̈ stato poi spremuto manualmente e lasciato fermentare spontaneamente (a temperatura ambiente) dalle 2 alle 3 settimane in presenza di bucce, raspo e vinaccioli. L'andamento della fermentazione à ̈ stato monitorato misurando il calo in peso per ogni sacchetto (indice della fermentazione degli zuccheri a C02) e stimando il grado alcolico prodotto secondo la formula proposta da Delfini: grado alcolico = calo in peso in % - 1,285.

1.2 Isolamento dei ceppi dai campioni

A fine fermentazione, da ciascun sacchetto sono stati prelevati 3 mi di prodotto, sono state effettuate 6 diluizioni seriali (1:10) in soluzione Ringe r e sono stati seminati 100 pi delle ultime tre diluizioni su mezzo di isolamento WL (4,0 g/l estratto di lievito, 5,0 g/l triptone, 50 g/l glucosio, 0,55 g/l idrogeno fosfato di potassio, 0,425 g/l cloruro di calcio, 0,125 g/l solfato di magnesio, 0,0025 g/l cloruro ferrico, 0,0025 g/l solfato di manganese, 0,022 g/l verde di bromocresolo, 15 g/l agar). Sono state isolate le colonie che hanno assunto una colorazione variabile dal crema al verde chiaro corrispondendo maggiormente a ceppi appartenenti al gruppo Saccharomyces in senso stretto ( sensu stricto). Sono state isolate 484 colonie.

1.3 Purificazione e conservazione degli isolati

Tutte le 484 colonie prelevate dalle piastre di isolamento sono state riseminate sul terreno di crescita YM (3 g/l estratto di lievito, 3 g/l estratto di malto, 5 g/l peptone, 10 g/l glucosio, 15 g/l agar). La procedura à ̈ stata ripetuta per garantire che ciascun isolato provenisse sicuramente da una colonia singola. La coltura pura ottenuta dopo l'ultimo passaggio su piastra à ̈ stata prelevata con una spatola sterile, e il materiale à ̈ stato inserito in provette tipo eppendorf da 0,5 mi contenenti una soluzione sterile di glicerolo al 20% in acqua (300 pi circa) e risospeso tramite agitazione vorticosa. Le provette contenenti i lieviti sono state stoccate a -20°C.

1.4 Identificazione dei lieviti appartenenti al gruppo Saccharomvces sensu stricto

Per confermare l’appartenenza al gruppo Saccharomyces sensu stricto e quindi escludere dal pool di lieviti raccolti gli individui appartenenti a generi diversi, e quindi non interessanti dal punto di vista enologico, à ̈ stato utilizzato un metodo di caratterizzazione genetica che prevede l'uso della tecnica PCR. La metodica ha permesso di discriminare questo gruppo di lieviti rispetto agli altri presenti in ambiente enologico sulla base di differenze nucleotidiche all’interno della regione di DNA codificante per l'RNA ribosomale (rDNA). Il tratto di DNA che porta le maggiori informazioni relative alle differenze tra le specie di lievito à ̈ la regione D1/D2 del DNA 26S, di cui sono disponibili nella banca nucleotidica pubblica GenBank informazioni relative alle caratteristiche di sequenza di moltissime specie di lieviti. E’ stato possibile perciò identificare due brevi tratti di DNA che, in base ad un allineamento multiplo delle sequenze (ClustalW) di questo tratto in un certo numero di lieviti di riferimento appartenenti a svariati generi, risultavano altamente conservati solo nel gruppo Saccharomyces sensu stricto. I due tratti di DNA sono stati utilizzati per costruire una coppia di primer di amplificazione specifici (SAC26F e SAC26R, rispettivi SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2).

Una seconda coppia di primer (SAC18F e SAC18R, rispettive SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4) à ̈ stata disegnata per avere un controllo interno di amplificazione: in questo caso à ̈ stata scelta una sequenza appartenente alla regione 18S del rDNA, altamente conservata in tutti i lieviti.

Di conseguenza i lieviti appartenenti al gruppo Saccharomyces sensu stricto davano luogo all’amplificazione di due frammenti di DNA (della lunghezza di 460 e 862 bp rispettivamente) mentre tutti gli altri producevano solamente il frammento di controllo (862 bp); i suddetti amplificati sono facilmente visualizzabili come bande distinte mediante elettroforesi su gel di agarosio.

II campione di DNA per l'amplificazione à ̈ stato preparato risospendendo con un puntale una singola colonia di lievito di 1-2 mm di diametro in 20 pi di acqua deionizzata sterile. Due microlitri della suddetta soluzione di lieviti sono stati usati direttamente nella miscela di amplificazione del DNA. La lisi delle cellule avviene durante il primo step del protocollo termico sotto riportato, mediante riscaldamento a 94°C per 5 minuti. Le prove di PCR sono state eseguite in volumi di reazione di 25 pi.

I componenti della miscela di reazione sono stati utilizzati alle concentrazioni finali riportati nella tabella 1.:

Tabella 1

Componente Concentrazione

Primer SAC26F 0,4 Î1⁄4Îœ

Primer SAC26R 0,4 Î1⁄4Îœ

Primer SAC18SF 2 pM

Primer SAC18SR 2 pM

dNTPs 50 pM (ciascuno)

Taq polimerasi 0,02 U/pl

Buffer 1X

DNA 2 pi sospensione cellulare

Le sequenze dei primer utilizzati sono riportati nel sequence listing allegato dove SAC26F con una lunghezza di 22 nt corrisponde a SEQ ID NO: 1, SAC26R con una lunghezza di 27 nt corrisponde a SEQ ID NO: 2, SAC 18F con una lunghezza di 23 nt corrisponde a SEQ ID NO: 3, mentre SAC18R con una lunghezza di 25 nt corrisponde a SEQ ID NO: 4.

protocollo termico utilizzato à ̈ riportato nella seguente tabella 2:

Tabella 2

Programma di amplificazione

Tempera-Ciclo durata

tura

Ciclol (1X) 94°C 5 min

Ciclo2

94°C 15 s

(35X)

54°C 30 s

72° C 90 s

|Ciclo3 (1 X) 72°C 5 min

jciclo4 (1 X) 4°C

(tra parentesi il numero di ripetizioni per ciascun ciclo riportato) La separazione di frammenti lineari di DNA amplificato à ̈ avvenuta mediante elettroforesi su gel di agarosio all’1 ,2%. Utilizzato successivamente all’analisi delle morfologie delle colonie sul mezzo il metodo ha permesso di fare una valutazione più precisa dell’appartenenza degli isolati al gruppo Saccharomyces sensu strido. Infatti, dei 484 isolati con morfologia tipica di Saccharomyces su WL, solo 308 sono stati identificati geneticamente come effettivamente appartenenti a quel gruppo tassonomico.

1.5 Caratterizzazione tecnologica degli isolati appartenenti al gruppo Saccharomyces sensu strido

Per valutare le caratteristiche di fermentazione ciascuno dei 308 lieviti raccolti à ̈ stato sottoposto a prove di fermentazione utilizzando mosto sintetico (0,1 g/l CaCÃŒ2, 0,1 g/l NaCI, 1 g/l KH2P04, 0,5 g/l MgS04-7H20, 3 g/l acido tartarico, 0,2 mg/l NaMo04-2 H20, 0,004 mg/l ZnS04-7H20, 0,5 mg/l H3BO3, 0,04 mg/l CuSC>4-5 H20, 0,1 mg/l KJ, 0,004 mg/l FeCI3-6HzO, 0,4 mg/l MnS04-H20, 400 pg/l piridossina cloridrato, 400 pg/l tiamina cloridrato, 2000 pg/l inosite, 20 pg/l biotina, 400 pg/l calcio pantotenato, 400 pg/l ammide nicotinica, 200 pg/l acido p-aminobenzoico, 0,3 g/l (NH4)2S04, 0,3 g/l (NHU^HPCU, 200 g/l glucosio, 2 g/l acido malico, 0,2 g/l idrolizzato acido di caseina, pH 3.2).

Per ciascun ceppo l’inoculo à ̈ stato preparato stemperando la patina ottenuta da una coltura cresciuta in terreno GPY (10 g/l estratto di lievito, 20 g/l peptone, 20 g/l glucosio, 20 g/l agar) in 10 mi di mosto sintetico fino al raggiungimento di una densità ottica a 620 nm (OD62O) di 1,5. Con questa procedura si ottiene una concentrazione finale nel mosto di circa 1,5 x 10<6>cellule/g. La OD62o à ̈ stata misurata con spettrofotometro Pharmacia mod ULtrospec 2000, utilizzando un’aliquota di 1 mi di coltura trasferita in apposita cuvetta.

La sospensione à ̈ stata inoculata in beuta contenente 90 mi di mosto sintetico ed incubata a 20°C.

Il calo in peso dovuto alla perdita di CO2 dalle beute allestite per prove di fermentazione à ̈ stato monitorato giornalmente, scegliendo come parametri di confronto tra i ceppi il calo in peso a 2 giorni, a 7 giorni e a fine fermentazione. Il calcolo della quantità di zucchero consumato à ̈ stato ottenuto mediante la formula seguente: calo peso in %<â– >1,285.

Per ciascun isolato cresciuto in mosto sintetico à ̈ stata valutata la capacità di produrre schiuma durante la fermentazione misurandone, giornalmente, l’altezza in mm.

E’ stato valutato, inoltre, il tempo di illimpidimento del mezzo come numero di giorni necessari per la sedimentazione dei lieviti a partire dal momento dell’inoculo.

Per ciascun isolato cresciuto in mosto sintetico à ̈ stata determinata la capacità delle cellule di crescere adese alle pareti della beuta. E' stata misurata l'altezza (in mm) dell'alone di crescita delle cellule dal fondo della beuta. La misura à ̈ stata eseguita a fine fermentazione. Infine, per la valutazione della produzione di idrogeno solforato, ciascun isolato à ̈ stato seminato su terreno Biggy agar in modo da ottenere crescita a colonia singola. Le piastre sono state incubate a 25°C per 4 giorni, trascorsi i quali si à ̈ valutata la colorazione delle colonie singole sviluppatesi. La quantità di idrogeno solforato à ̈ proporzionale all’intensità di colorazione, dovuta allo sviluppo di solfito di bismuto (marrone scuro se presente in quantità notevoli). Alla fine di ciascuna fermentazione, il fermentato à ̈ stato sottoposto a valutazione olfattiva per individuare la presenza di odori anomali.

1.6 Caratterizzazione genetica a livello di ceppo

Per ottenere una caratterizzazione ceppo-specifica degli isolati identificati come appartenenti al gruppo Saccharomyces sensu strido à ̈ stato scelto un metodo presente in letteratura (Querol et al., 1996) che prevede l'analisi di profili di restrizione del DNA mitocondriale mediante digestione enzimatica del DNA totale.

Per ciascuno dei 308 isolati à ̈ stata seguita la procedura seguente di estrazione del DNA. La patina ottenuta da una coltura cresciuta in piastra Petri contenente terreno YM per 48 h a 25°C à ̈ stata risospesa in 1 mi di acqua sterile e successivamente centrifugata a 14000 rpm per 3 minuti in una microcentrifuga Eppendorf.

Una volta rimosso il liquido, le cellule sono state risospese nuovamente in 500 mi di una soluzione contenente enzima litico ottenuto da Rhizoctonia solani (25 mg/ml in 1M sorbitolo, 0,1 M EDTA, pH 7.5). La sospensione à ̈ stata agitata con vortex brevemente. I campioni sono stati incubati a 45°C per due ore nelle quali sono stati periodicamente agitati per mantenere le cellule in sospensione. Alla fine dell'incubazione, i campioni sono stati centrifugati a 14000 rpm per 5 minuti ed à ̈ stato eliminato il surnatante.

Successivamente, le cellule sono state risospese in 500 mi di TE (50 mM Tris-HCI, 20 mM EDTA a pH 7.4) e sono stati aggiunti 50 pi di SDS (sodio dodecil solfato) 10%. I campioni sono stati incubati in bagno termostatico a 65°C per 30 minuti. Al termine sono stati aggiunti 200 Î1⁄4Ι di acetato di potassio 5 M e si sono lasciati i campioni in ghiaccio per 30 minuti. Le provette sono state centrifugate a 14000 rpm per 5 minuti e il surnatante trasferito in una provetta tipo Eppendorf da 1,5 mi. Dopo aver aggiunto 600 pi di isopropanolo freddo i campioni sono stati tenuti a temperatura ambiente per 5 minuti mescolando invertendo i tubi, e quindi centrifugati a 14000 rpm per 10 minuti. E’ stato eliminato il surnatante e aggiunti 500 pi di etanolo al 70%. Dopo centrifugazione a 14000 rpm per 5 minuti ed eliminazione del surnatante, il pellet à ̈ stato asciugato per 1 h a 37°C. I campioni sono stati risospesi in 50 Î1⁄4Ι di acqua sterile, a cui sono stati aggiunti 1 ,5 Î1⁄4Ι di RNasi (10 mg/ml) e lasciati a temperatura ambiente per 20 minuti. I campioni così ottenuti sono stati conservati a -20°C.

Le digestioni enzimatiche del DNA totale sono state eseguite in volumi di reazione di 15 pi contenenti 10 pi di DNA e 10 U di enzima H/<'>nfl. Le reazioni sono state condotte a 37°C per 2 ore. La separazione di frammenti lineari di DNA à ̈ stata ottenuta mediante elettroforesi su gel di agarosio aU'1%. Il confronto dei profili di restrizione à ̈ stato fatto utilizzando il software GelComparlI (Applied Maths, Belgio) che à ̈ in grado, mediante la costruzione di una matrice, di calcolare il livello di similarità tra profili ed esprimerlo graficamente attraverso un dendrogramma. Questa analisi, condotta sui 308 isolati, attribuiti precedentemente al gruppo Saccharomyces sensu strido mediante PCR, ha permesso raggrupparli in 38 ceppi diversi, caratterizzati ciascuno da un diverso profilo genetico, comune a tutti gli isolati appartenenti a quel gruppo.

Sulla base dei dati genetici e fisiologici raccolti à ̈ stato possibile eseguire una prima selezione dei lieviti raccolti che ha portato alla riduzione del numero di individui da 308 a 66.

I criteri di scelta, oltre alle migliori performance di fermentazione, sono stati anche il profilo genetico e la provenienza geografica dell’isolato in modo da ben rappresentare, anche nelle prove successive, la biodiversità microbica raccolta sia dal punto di vista genetico che della rappresentatività sul territorio.

1.7 Caratterizzazione a livello di specie

I 66 campioni scelti sono stati sottoposti ad un'ulteriore indagine genetica per determinare la specie di appartenenza tra quelle comprese nel gruppo Saccharomyces sensu strido. Anche in questo caso come in precedenza sono state considerate le informazioni associate alla regione di DNA codificante l’RNA ribosomale. In particolare à ̈ stato preso in considerazione il tratto di DNA compreso tra quelli codificanti le subunità 18S e 26S, codificante l’rRNA della subunità 5,8S e contenente le due zone adiacenti denominate ITS (Internai Transcribed Spacer), particolarmente interessante perché mostra un polimorfismo di sequenza molto più elevato di quello associato ai geni codificanti l'rRNA delle subunità 18S e 26S (Cai et al., 1996; James et al., 1996). Questa variabilità à ̈ estremamente alta, se si considerano organismi appartenenti a specie diverse, mentre scende drasticamente quando si considerano ceppi della spessa specie. Questo polimorfismo intra-specifico può essere messo in evidenza mediante amplificazione mediante PCR della regione ITS e successiva analisi del profilo di restrizione utilizzando enzimi opportuni (Esteve-Zarzoso et al., 1999). E' un metodo rapido, di facile esecuzione per l'identificazione dei lieviti, che ha il vantaggio di fornire informazioni relative non solo al ceppo da riconoscere ma anche al resto della popolazione microbica.

I campioni di DNA provenienti da ciascuno dei 66 ceppi sono stati preparati come descritto in precedenza e sottoposti ad amplificazione della regione ITS1-5.8S-ITS2 del rDNA.

I vari componenti della miscela di reazione sono stati utilizzati alle concentrazioni riportate nella seguente tabella 3:

Tabella 3

Componente Concentrazione

ITS1 2 Î1⁄4Îœ

ITS4 2 Î1⁄4Îœ

dNTPs 50 Î1⁄4Îœ (ciascuno)

Taq polimerasi 0,02 U/Î1⁄4Ι

Buffer 1X

2 Î1⁄4Ι di sospensione

DNA

cellulare

I primer utilizzati sono ITS1 con una lunghezza di 19 bp con SEQ ID NO: 5 e ITS4 con una lunghezza di 20 bp con SEQ ID NO: 6 ( White T. J. et al. 1990).

II protocollo termico utilizzato à ̈ riportato nella seguente tabella 4:

Tabella 4

Programma di amplificazione

temperatu

ciclo durata

ra

Ciclo 1 (1 X) 95 °C 5 min

Ciclo2 (35X)95 °C 30 s

53,5 °C 45 s

72°C 90 s

Ciclo3 (1X) 72°C 5 min

Ciclo4 (1X) 15°C

(tra parentesi il numero di ripetizioni per ciascun ciclo riportato) I prodotti di amplificazione della regione ITS1-5,8S-ITS2 del rDNA sono stati digeriti con gli enzimi Haelll e Mae\. Le digestioni sono state eseguite in volumi di reazione di 20 Î1⁄4Î contenenti 10 U di enzima e 10 pi di amplificato. Le reazioni sono state condotte a 37° C per 16h. I prodotti della digestione sono stati visualizzati su gel di agarosio all’1,5%.

1.8 Caratterizzazione tecnologica deali isolati scelti in mosto di Prosecco

I 66 ceppi scelti sulla base delle fermentazioni in mosto sintetico sono stati saggiati ulteriormente mediante prove di crescita in beuta utilizzando questa volta mosto di Prosecco.

Per quest'analisi, i caratteri presi in considerazione sono stati il calo in peso a 2 giorni (vigore fermentativo) e a 7 giorni, la durata della fermentazione, l’altezza della schiuma prodotta e la velocità di illimpidimento del fermentato. L'inoculo à ̈ stato preparato stemperando la patina ottenuta da una coltura cresciuta in terreno GPY in 23 mi di soluzione di saccarosio al 18% fino al raggiungimento di una OD620 di 1,6 che corrisponde a circa 3,5 x 10<6>cellule/ml. La sospensione à ̈ stata centrifugata a 8000 rpm per 10 minuti, il pellet risospeso con 10 mi di mosto naturale ed inoculato in una beuta contenente 190 mi dello stesso mosto. La coltura à ̈ stata incubata a 25°C.

Alla fine di ciascuna fermentazione, il prodotto (200 mi circa di vino base) à ̈ stato trasferito in due bottiglie da 100 mi ciascuna, chiuse con tappo a corona e conservate a 10°C. I vini così ottenuti sono stati sottoposti a valutazione sensoriale da parte di un panel composto da 8 assaggiatori, di età compresa tra i 25 ed i 50 anni. Sono stati scelti assaggiatori esperti, tecnici del settore e conoscitori della tecnologia di produzione del Prosecco. I campioni sono stati presentati in forma anonima, il vino à ̈ stato servito a una temperatura di 10°C circa. La scheda di valutazione, appositamente redatta, chiedeva un giudizio espresso numericamente con una scala da 1 a 10, in relazione ai seguenti parametri: tipicità, presenza di eventuali difetti, presenza di note organolettiche gradevoli. Si chiedeva, inoltre, per i dieci campioni migliori, di esprimere anche un giudizio di preferenza, riordinando numericamente i campioni a cominciare da quello con le migliori caratteristiche.

1.9 Microvinificazioni

Le prove di microvinificazione sono state eseguite con lo scopo di valutare ulteriormente i 9 ceppi risultati migliori alla degustazione unitamente ad un controllo costituito da un ceppo di lievito commerciale (Premium Prosecco, Enologica Vason srl, contenente un ceppo di Saccharomyces cerevisiae).

I 10 lieviti previsti per la microvificazione sono stati coltivati in Malt agar (30 g/l estratto di malto, 5 g/l peptone vegetale 15 g/l agar, pH 5,4) modificato, utilizzando il peptone vegetale rispetto al tradizionale estratto proteico di carne, in vista di un impiego dei vini ottenuti per la degustazione. Da queste piastre à ̈ stata prelevata una certa quantità di lievito per inoculare 20 mi di una soluzione di saccarosio al 18% in modo da avere una OD6oo pari a 1 , corrispondente a circa 10<7>cell/ml. Quindici mi della sospensione cellulare così ottenuta sono stati aggiunti a 300 mi di mosto di prosecco (mosto della vendemmia 2004 conservato a -20°C) addizionato di 0,75 g/l di ammonio solfato al fine di favorire l’aumento della massa cellulare. Le beute sono state incubate a 25°C, senza agitazione. Una volta raggiunta nuovamente una OD6OO pari a 1 , si à ̈ trasferita la coltura in 3 I dello stesso mosto lasciando crescere il lievito nelle stesse condizioni fino ad un valore di assorbanza pari a 1. Al fine di stimare il tempo necessario per la preparazione delle colture e poter effettuare l'inoculo in damigiana di tutti i ceppi contemporaneamente, sono state eseguite delle prove preliminari mimando la procedura di preparazione fino all’avvio della fermentazione tumultuosa (ODeoo = 1 ) nella beuta da 300 mi. Questa prova ha permesso di variare il momento di preinoculo a seconda della velocità di crescita dei diversi ceppi. La concentrazione cellulare nelle beute finali ed il potenziale inoculo dovuto al mosto di partenza (non pastorizzato) à ̈ stato verificato tramite conta su piastre di YM. Ad ogni inoculo successivo à ̈ verificata la corrispondenza tra densità ottica e numero di unità formanti colonia (ufc) desiderato, ossia 10<6>cell/ml. Le prove di microvinificazione sono state condotte usando mosto di Prosecco conservato 15°C già solfitato (50 mg/l S02totale) e trasportato in bidoni da 100 I presso la cantina di lavorazione, dove à ̈ stato mantenuto a 10 °C in attesa dell’inoculo. Il mosto à ̈ stato suddiviso in 10 damigiane (volume contenitore 34 I) con 30 I ciascuno e portato a temperatura ambiente per circa 12 ore in modo da portare la temperatura a 16-18°C. L’inoculo à ̈ stato effettuato aggiungendo 3 I di coltura di lievito in 30 I di mosto. In concomitanza con l’inoculo à ̈ stato aggiunto attivante (ammonio fosfato 59,88%, tiamina cloridrato 0,6%, cellulosa 39,52%) alla concentrazione di 10 g/hl. Il giorno successivo aH’inoculo à ̈ stato effettuato un prelievo di materiale (100 mi) per le analisi chimiche. I campionamenti per queste analisi sono stati effettuati con cadenza giornaliera nel primo periodo di fermentazione e successivamente ogni 2-3 giorni. A due giorni dall'inoculo sono stati aggiunti nuovamente 10 g/hl di attivante. Alla fine della fermentazione alcolica (quando la concentrazione di zuccheri stimata con il metodo enzimatico à ̈ inferiore a 1 g/l) sono stati trasferiti a 12°C ed il giorno successivo sono stati travasati in contenitori da 28 litri. Dopo 5 giorni dal travaso sono stati aggiunti 6 g/l di metabisolfito di potassio. I ceppi che dopo 5 giorni dall'inoculo non avevano finito la fermentazione alcolica sono stati nuovamente addizionati di attivante alla dose di 5 g/hl. Nei casi in cui quest'ultima operazione non aveva portato ad esaurimento degli zuccheri, a 10 giorni dall'inoculo sono stati iniettati 5 g/l di ossigeno. Questa procedura à ̈ stata ripetuta a 15 giorni nei casi necessari. Dopo la fine della fermentazione il trattamento à ̈ stato uguale per tutti. Successivamente à ̈ stato effettuato un controllo della anidride solforosa, del pH e del rame e si à ̈ provveduto all’aggiunta di metabisolfito di potassio fino ad ottenere 0,8 g/l di anidride solforosa molecolare. Per tutti i campioni à ̈ stato effettuato un periodico rimescolamento delle fecce (ogni 10 giorni). A circa tre mesi dall'inoculo à ̈ stato effettuato il test di stabilità proteica ed à ̈ stata aggiunta bentonite in quantità diversa a seconda del tipo di lievito. Dopo 2 giorni il vino à ̈ stato travasato in contenitori da 25 I. Successivamente (dopo ulteriori 3 giorni) à ̈ stata effettuata una prefiltrazione per contropressione con filtri di porosità 10-5-3 pm, riducendo il volume a 20 I. Dopo circa un mese à ̈ stata controllata nuovamente la SO2e portata ad un valore di 1 ,2 mg/l. Il vino, previa filtrazione (filtri di porosità 2-1-0,65 pm), à ̈ stato imbottigliato e conservato a temperatura di 15°C.

Tutte le analisi condotte sui mosti, comprese quelle di monitoraggio delle microvinificazioni, sono state eseguite utilizzando lo strumento WineScanâ„¢ (FOSS). WineScan à ̈ uno spettrofotometro dedicato all’analisi delle matrici liquide ed à ̈ utilizzato prevalentemente per l’analisi di vini, mosti, birra e aceti balsamici. Lo strumento opera nel campo spettrale dell'infrarosso, impiegando come fascio di luce una sorgente IR e come sistema di misura delle lunghezze d'onda un particolare dispositivo ottico-elettronico chiamato interferometro, che sfrutta il principio dell’interferenza delle onde luminose, in grado di misurare le assorbanze alle varie lunghezze d’onda dei singoli componenti della matrice liquida.

Nel caso di analisi di mosti e vini lo strumento à ̈ dotato di rispettive curve di calibrazione in grado di interpretare in modo specifico i valori misurati.

Per verificare l’andamento delle fermentazioni i prelievi di mosto sono stati eseguiti ad intervalli di circa 2-3 giorni e sono stati determinati i principali parametri chimici: pH, grado zuccherino, grado alcolico, acidità volatile, concentrazione di acido malico, acido lattico, acido tartarico, acidità totale, glicerolo. Le microvinificazioni sono state bloccate quando la concentrazione di zuccheri à ̈ risultata inferiore a 1 g/l-I 10 vini ottenuti sono stati stabilizzati, filtrati e imbottigliati e conservati a temperatura ambiente. Successivamente sono stati sottoposti ad analisi sensoriale. Le valutazioni sono state effettuate con analogia alla procedura del profilo sensoriale (IS013299), svolto in un’unica replica per ognuna delle sessioni, utilizzando una scheda a punti strutturata nel seguente modo:

i descrittori (intensità di odore, intensità di aroma, dolce, salato, acido, amaro, gradevolezza, tipicità) sono stati valutati attraverso l’utilizzo di una scala continua da 0 a 10 punti, mentre le caratteristiche olfattive (acacia, glicine, rosa, mela verde, mela matura, pera, limone, altri agrumi, banana, ananas, pesca, albicocca, pane, lievito, miele, spezie) sono state rilevate mediante una scala discontinua a punti, che prevedeva tre intensità, assente, debole e medio-elevata, in corrispondenza a 0,5 e 10 punti.

Ogni giudice ha ricevuto i 10 campioni contraddistinti da un codice numerico a tre cifre, seguendo un piano di distribuzione bilanciato. Tra un campione ed il successivo si à ̈ consigliato ai giudici l’uso di acqua naturale e cracker non salati per neutralizzare le sensazioni residue.

I risultati delle valutazioni sono stati inseriti direttamente mediante scanner nel programma FIZZ (Biosystemes, Francia) che permette l'immediata elaborazione e lettura dell'esito della prova.

Per ognuno dei descrittori utilizzati sono state calcolate le medie derivate dai singoli giudizi degli assaggiatori. In questo modo à ̈ stato possibile ottenere una graduatoria che ha permesso la scelta dei 4 lieviti migliori.

1.10 Vinificazioni in cantina

I 4 ceppi più interessanti insieme ad un ceppo commerciale di controllo (Premium Prosecco, Enologica Vason srl, contenente un ceppo di Saccharomyces cerevisiae) sono stati prodotti “in pasta†secondo metodi standard noti a produttori specializzati nella preparazione di starter commerciali. L'inoculo à ̈ stato calibrato allo scopo di ottenere una concentrazione iniziale di lieviti di circa 10<6>cell/ml nelle vasche di fermentazione contenenti 50 hi di mosto di uve Prosecco. Le vinificazioni sono state condotte seguendo i protocolli aziendali.

Anche in questo caso, per verificare l’andamento delle fermentazioni, i prelievi di mosto sono stati eseguiti ad intervalli di circa 2-3 giorni e sono stati determinati i principali parametri chimici: pH, grado zuccherino, grado alcolico, acidità volatile, concentrazione di acido malico, acido lattico, acido tartarico, acidità totale, glicerolo. Le vinificazioni sono state bloccate quando la concentrazione di zuccheri à ̈ risultata inferiore a 1 g/l. A fine fermentazione i 5 vini ottenuti sono stati stabilizzati, filtrati, imbottigliati e conservati a temperatura ambiente. Successivamente sono stati sottoposti ad analisi sensoriale seguendo la metodica sopra descritta. Anche in questo caso à ̈ stato possibile ottenere una graduatoria sulla base del grado di piacevolezza che ha permesso la scelta del lievito migliore.

ESEMPIO 2 - Caratterizzazione genetica del lievito

2.1 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) con sistema CHEF (Bio-Rad Laboratories )

La PFGE (Pulsed-Field Gel Eletrophoresis) à ̈ una tecnica laboriosa ma anche molto efficiente per individuare variabilità a livello di ceppo. Con questo particolare sistema di separazione mediante gel elettroforesi à ̈ possibile ottenere il cariotipo del ceppo di lievito poiché questo sistema, diversamente dall’elettroforesi tradizionale, in cui la direzione del campo elettrico à ̈ costante, prevede una variazione nel tempo della direzione del campo elettrico, grazie ad una sistema di elettrodi, permettendo la separazione di molecole di DNA di grandi dimensioni, quali sono appunto i cromosomi del lievito. Il protocollo di estrazione del DNA prevede la raccolta mediante centrifugazione della opportuna quantità di cellule a partire da una coltura overnight in terreno YM incubato a 28°C, in agitazione a 120 rpm. Le cellule quindi vengono lavate con 1 ,5 mi di acqua distillata fredda (5°C) e successivamente con 50 mM EDTA pH 8.0 freddo. Il pellet viene risospeso gentilmente in 0,9 mi di buffer SPG (10 mM NaH2P04 in 50% glicerolo) contenente 25 mg/ml di enzima litico da Rhizoctonia solarti ed incubato in bagno termostatato a 30°C per 2 ore agitando frequentemente e delicatamente. Successivamente gli sferoplasti (cellule di lievito private della parete) così ottenuti vengono incubati in termostato a 37°C per 5 min.

Quindi vengono prelevati 10ΟÎ1⁄4Ι della sospensione cellulare incubata con l’enzima litico, mescolati delicatamente con 120Î1⁄4Ι di 1,6% Low Melting Point Agarose (in tampone 0.5X TBE) a 42°C e quindi caricati nei pozzetti dell’apposito stampo. La sospensione veniva lasciata raffreddare a 0-4°C per 30 min, per permettere la solidificazione dell’agarosio. Successivamente i blocchetti di agarosio ottenuti per ciascuno stampo venivano prima incubati a 30°C per 4 ore in 3 mi di buffer LET (500 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 7.5) e poi lavati con 50 mM EDTA pH 8,0 freddo. Per la rimozione della componente proteica cellulare i blocchetti di agarosio venivano incubati overnight a 50°C in 1 ,5 mi di buffer NDS (500 mM EDTA, 500 mM Tris, 1% laurylsarcosine, pH 7.5) contenente 2 mg/ml di proteinasi K. Il trattamento proteolitico veniva concluso con tre lavaggi utilizzando una soluzione di 50 mM EDTA a pH 8,0 fredda. Prima del caricamento su gel i blocchetti venivano tagliati con un bisturi sterile in fettine dello spessore di 2-3 mm e conservati a 4°C in 500 mM EDTA a pH 9.0.

La separazione elettroforetica dei cromosomi avveniva su gel di agarosio (1.2%) in tampone 0.5X TBE alle seguenti condizioni di corsa: differenza di potenziale 5.1 V/cm, temperatura 9°C, durata della corsa 34 ore, con variazione del campo elettrico iniziale ogni 60 secondi e poi aumentata in modo continuo fino a 120 secondi alla fine della corsa. Il risultato à ̈ rappresentato nella fig. 1.

2.2 Analisi delle regioni microsatellite presenti nel genoma Questo metodo di indagine prevede di utilizzare la tecnica PCR mediante l’impiego di primer complementari a regioni di DNA note come microsatelliti, che sono delle piccole sequenze di DNA ripetute in tandem (da una a sei basi) che variano nel numero delle ripetizioni e possono essere localizzate anche all'interno di regioni genomiche codificanti (Legras et al., 2005). Sono estremamente variabili in lunghezza, come risultato di errori di replicazione del DNA, e perciò mostrano un certo grado di polimorfismo tra individui della stessa specie. Alcuni autori hanno proposto l'utilizzo di combinazioni di primer complementari a diversi loci di microsatelliti per caratterizzare S. cerevisiae. L’analisi del polimorfismo dei microsatelliti à ̈ un metodo altamente riproducibile perché per la loro amplificazione sono utilizzati primer specifici ed alte temperature di annealing. Il campione di DNA per l’amplificazione viene preparato mediante il metodo già descritto sopra nell’esempio 1, punto 1.6 ( Caratterizzazione genetica a livello di ceppo). Le prove di PCR sono state eseguite in volumi di reazione di 25 pi. I vari componenti della miscela di reazione sono stati utilizzati alle concentrazioni finali riportate nella seguente tabella 5:

Tabella 5

Componente Concentrazione

Primer F 0,5 Î1⁄4Îœ

Primer R 0,5 Î1⁄4Îœ

dNTPs 50 pM (ciascuno)

Taq polimerasi 0,04 U/pl

Buffer 1X

DNA 80 ng

Le sei coppie di primer utilizzate sono (sequenza 5'-3'): C4 F (SEQ ID NO: 7), C4 R (SEQ ID NO: 8), C5 F (SEQ ID NO: 9), C5 R (SEQ ID NO: 10), C8 F (SEQ ID NO: 11 ), C8 R (SEQ ID NO: 12), C11 F (SEQ ID NO: 13), C11 R (SEQ ID NO: 14), ScYOR267c F (SEQ ID NO: 15) e ScYOR267c R (SEQ ID NO: 16).

Il protocollo termico utilizzato à ̈ riportato nella seguente tabella 6:

Tabella 6

Programma di amplificazione

temperatu

ciclo durata

ra

Ciclo 1 (1X) 95 °C 4 min

Ciclo2 (34X)94 °C 30 s

53 °C 30 s

72°C 1 min

Ciclo3 (1X) 72°C 10 min

Ciclo4 (1X) 8°C

(tra parentesi il numero di ripetizioni per ciascun ciclo riportato) I prodotti deH’amplificazione sono stati separati su gel di agarosio alla concentrazione 2,5%. Il risultato à ̈ rappresentato nella fig. 2.

2.3 Analisi del DNA mitocondriale

Questo metodo prevede la determinazione del profilo di restrizione del DNA mitocondriale mediante digestione enzimatica del DNA totale. Le caratteristiche del metodo e la procedura sono state descritte in dettaglio nell’esempio 1.6 ( Caratterizzazione genetica a livello di ceppo). Il profilo del ceppo P309.1 à ̈ riportato nella fig. 3.

2.4 Sequenza del tratto ITS1-5.8S-ITS2 del rDNA

Tale frammento di DNA, situato nel tratto codificante la subunità 5,8S del RNA ribosomale (rDNA) e le due zone adiacenti, denominate Internai Transcribed Spacer (ITS1 e ITS2), à ̈ stato sequenziato mediante il metodo enzimatico dei di-desossinucleotidi (Sanger et al.

1997), con un sequenziatore automatico 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) utilizzando i seguenti primer:

ITS1 (lunghezza 19 bp, SEQ ID NO: 5) e ITS4 (lunghezza 20 bp, SEQ ID NO: 6). Il protocollo termico utilizzato e riportato in Tabella 4 al paragrafo 1.7 Caratterizzazione a livello di specie.

L’analisi della sequenza nucleotidica mediante comparazione con i dati presenti nella banca dati di sequenze pubblica GenBank, effettuata con il programma BLAST (Basic Locai Alignment Search Tool) ha evidenziato 100% di identità con quelle degli altri ceppi di Saccharomyces cerevisiae presenti nella banca. La sequenza ITS risultante presenta 608 nucleotidi ed à ̈ riportata nel sequence listing con il SEQ ID NO: 20.

2.5 Sequenza del tratto D1/D2 del rDNA

La regione genomica D1/D2, situata nel tratto iniziale del gene codificante la subunità grande (LS large subunit) viene utilizzata dalla tassonomia moderna per l’identificazione della specie o di gruppi di specie di lieviti, in quanto lieviti appartenenti al medesimo gruppo sono caratterizzati dalla stessa sequenza del tratto D1/D2. Il campione di DNA per l'amplificazione à ̈ stato preparato mediante il metodo descritto nell’esempio 1, punto 1.6 ( Caratterizzazione genetica a livello di ceppo). La sequenza della coppia di primer utilizzata à ̈ la seguente: NL-1 (SEQ ID NO: 17) e NL-4 (SEQ ID NO: 18). La sequenza D1/D2 risultante à ̈ composta da 507 nucleotidi ed à ̈ rappresentata nel sequence listing con il SEQ ID NO: 19.

Le reazioni di POR sono state eseguite in volumi di reazione di 25 pi. I componenti della miscela di reazione sono stati utilizzati alle concentrazioni finali riportate nella seguente tabella 7:

Tabella 7

Componente Concentrazione

Primer NL-1 1 Î1⁄4Îœ

Primer NL-4 1 Î1⁄4Îœ

dNTPs 0,05 mM

(ciascuno)

Taq 0,04 U/Î1⁄4Ι

poiimerasi

Buffer 10X 1X

DNA 80 ng/Î1⁄4Ι

Le condizioni di amplificazione sono rappresentate nella seguente tabella 8:

Tabella 8

Programma di amplificazione

Temperaciclo durata

tura

Ciclol (1X) 95 °C 3 min

Ciclo2 (24X)94 °C 30 s

52 °C 30 s

72°C 30 s

Ciclo3 (1X) 72°C 5 min

Ciclo4 ( 1 X) 8°C

(tra parentesi il numero di ripetizioni per ciascun ciclo riportato) L'analisi della sequenza nucleotidica mediante consultazione della banca dati GenBank effettuata mediante il programma BLAST (Basic Locai Alignment Search Tool) ha evidenziato 100% identità con quella di altri ceppi appartenenti alla specie Saccharomyces cerevisiae presenti nella banca.

ESEMPIO 3 - Caratteristiche enologiche

3.1 Crescita in mosto sintetico

Il lievito oggetto di questo brevetto ha le caratteristiche enologiche di seguito riportate. Alcune sono state determinate mediante crescita in mosto sintetico (le caratteristiche della prova sono state descritte nell’esempio 1 , punto 1.5).

A. Glucosio consumato dopo 2 giorni (vigore fermentativo)·. 3,6 g.

B. Glucosio consumato dopo 7 giorni: 15,1 g

C. Glucosio consumato a fine fermentazione: 18,3 g

D. Giorni di fermentazione: 15

E. Altezza massima della schiuma prodotta: 18 mm

F. Tempo di illimpidimento: 14 giorni

G. Adesività: 2 mm

3. 2 Produzione di idrogeno solforato

La produzione di idrogeno solforato à ̈ stata saggiata mediante crescita sul terreno Biggy agar. La colorazione delle colonie che ne risulta (marrone chiaro) ha evidenziato una modesta produzione di tale composto. L’analisi olfattiva ha evidenziato caratteristiche di gradevolezza del fermentato.

3.3 Potere alcoliaeno

Il potere alcoligeno à ̈ stato valutato mediante crescita in mosto sintetico in cui à ̈ stata variata la concentrazione di glucosio (300 g/l). E' stato anche testato un ceppo commerciale di controllo (Premium Prosecco, Enologica Vason srl, contenente un ceppo di Saccharomyces cerevisiae) utilizzato da molti produttori che operano nella zona della DOC Prosecco di Conegliano e Valdobbiadene. Le prove sono state condotte in triplicato. Il potere alcoligeno del ceppo P301.9 à ̈ di 16,4 %, mentre il ceppo commerciale ha un potere alcoligeno di 16,1 %.

3.4 Resistenza all'anidride solforosa

La resistenza all’anidride solforosa à ̈ stata saggiata mediante crescita in beute contenenti terreno YPD a cui sono state aggiunte diverse concentrazioni di anidride solforosa. Le prove sono state condotte in triplicato. Il ceppo à ̈ risultato resistente ad una concentrazione almeno di 50 mg/l.

3. 5 Attività beta-qlucosidasica

Questa attività à ̈ legata alla capacità da parte del lievito di liberare gli aromi varietali presenti nel mosto che per la maggior parte sono presenti nella forma glicosilata e quindi inodore. E’ stato eseguito un metodo fluorimetrico basato sull’emissione di un segnale fluorescente da parte del substrato 4-metilumbelliferil β-D-glucopiranoside una volta che tale molecola viene scissa dall’enzima β-glucosidasi. L’attività à ̈ stata saggiata durante la crescita del ceppo in mosto sintetico (le prove sono state condotte in triplicato) ed à ̈ stata misurata a pH 5 e pH 3,5 (situazione enologica). Il ceppo ha dimostrato di possedere una buona attività soprattutto a pH 3,5.

3.5 Richiesta in azoto

Sono state eseguite delle fermentazioni in mosto sintetico in bioreattori da un litro per valutare la differente richiesta di azoto. E’ stato anche testato un ceppo commerciale di controllo (Premium Prosecco, Enologica Vason srl, contenente un ceppo di Saccharomyces cerevisiaa) di controllo utilizzato da molti produttori che operano nella zona della DOC Prosecco di Conegliano e Valdobbiadene. La fermentazioni à ̈ stata condotta mantenendo costante la velocità di fermentazione a 0,7 g l<†̃1>h<'1>mediante aggiunta di azoto aminoacidico a partire da 5 g I<'1>di CO2 rilasciata fino a 75 g Γ<1>di CO2. La fermentazione à ̈ stata monitorata misurando in modo automatico il calo in peso ogni venti minuti. Il ceppo P301.9 ha un fabbisogno in azoto di 49 mg/l, mentre quello commerciale ne mostra un fabbisogno superiore (79 mg/l).

3.6 Nanovinificazione (volume circa 200 mi)

Il ceppo à ̈ stato saggiato in laboratorio mediante l'allestimento di una vinificazione in beuta (nanovinificazione) come descritto nell’esempio 1 , punto 1.8 ( Caratterizzazione tecnologica degli isolati in mosto di Prosecco). Le caratteristiche chimiche del mosto utilizzato per la prova sono riportate nella seguente tabella 9:

Tabella 9

ACIDITÀ ACIDO

ZUCCHERI ACIDO PH TOTALE MALICO APA* (fl/l) TARTARICO (g/l)

(g/i) (fl/l) (mg/l)

138,5 3,2 7,0 4,2 1,8 264,5

<*>APA = azoto prontamente assimilabile

Le caratteristiche enologiche rilevate sono le seguenti:

A. Glucosio consumato dopo 2 giorni (vigore fermentativo): 4,6 g.

B. Glucosio consumato dopo 7 giorni: 17,4 g

C. Glucosio consumato a fine fermentazione: esaurito

D. Giorni di fermentazione: 14

E. Altezza massima della schiuma prodotta: 18 mm

F. Tempi di illimpidimento: 12 giorni

Alla valutazione sensoriale, condotta come descritto nell'esempio 1, punto 1.8 (Caratterizzazione tecnologica degli isolati in mosto di Prosecco) Ã ̈ stato segnalato quale ceppo in grado di rispettare le caratteristiche organolettiche del vino Prosecco.

3.7 Microvinificazione (volumi circa 30 litri)

Il ceppo accanto ad un controllo commerciale (Premium Prosecco, Enologica Vason srl, contenente un ceppo di Saccharomyces cerevisiae) à ̈ stato saggiato in prove di microvinificazione in mosto di Prosecco in damigiane i capacità 30 I, come descritto nell’esempio 1 , punto 1.9 ( Microvinificazioni ). Le caratteristiche chimiche del mosto utilizzato per la prova sono riportate nella seguente tabella 10: Tabella 10

ACIDITÀ ACIDO ACIDO

ZUCCHERI APA* SO2 totale PH TOTALE MALICO TARTARICO

(g/l)

(g/i) (g/i) (g/l) (mg/l) (mg/l)

152,7 3,2 6,9 3,2 3,7 206 50

*APA = azoto prontamente assimilabile

Le caratteristiche enologiche rilevate sono elencate nella seguente 5 tabella 11 :

Tabella 11

Parametro P301.9 Ceppo commerciale (Enologica Vason srl, Premium Prosecco, S. cerevisiae)

Giorni di fermentazione 7 6

Etanolo (%) 9,5 9,5

PH 3,2 3,2

Acidità totale (g/l) 7,7 7,6

Acido tartarico (g/l) 3,4 3,4

Acido malico (g/l) 2,9 3,0

Acidità volatile (g/l) 0,21 0,22

Glicerolo (g/l) 4,3 4,2

Sono state eseguite analisi gas-cromatografiche per la determinazione di composti aromatici contenuti nel vino ottenuto. I 0 risultati sono riportati nella seguente tabella 12:

Tabella 12

omposto (aroma) P301.9 Ceppo commerciale (Enologica Vason srl, Premium Prosecco, S.

cerevisiae) cetaldeide (mg/l, frutta matura) 49,7 53,4

-propanolo (mg/l, pungente) 15,3 55,5

- butanolo pg/l, pungente) assente 620

- metil-1-butanolo (mg/l, pungente) 132,1 218,5

-feniletanolo (mg/l, rosa) 22,4 18,2

tilacetato (mg/l, solvente) 38,0 82,4

tilcaproato (pg/l, mela) 850 assente

inalolo (pg /, agrumi, floreale) assente 210

eraniolo (pg/, rosa, agrumi) 60 assente

I vini prodotti sono stati sottoposi i ad analisi sensoriale come descritto nell'esempio 1, punto 1.9 ( Microvinificazioni ). Il vino prodotto con il ceppo P301.9 à ̈ dotato di elevata intensità aromatica (superiore a quella rilevata per altri lieviti sperimentali). Si à ̈ distinto rispetto a quello ottenuto con il lievito commerciale per l'equilibrio tra l’intensità aromatica e le caratteristiche degli attributi olfattivi. Sono state riscontrate inoltre buone caratteristiche di tipicità con sentori di acacia e glicine e in particolare mela verde, mela matura e agrumi.

3.8 Vinificazione in cantina

11 ceppo accanto ad un controllo commerciale (Premium Prosecco, Enologica Vason srl, contenente un ceppo di Saccharomyces cerevisiae) à ̈ stato saggiato in prove di vinificazione in mosto di Prosecco in vinificatori da 50 ettolitri, come descritto nell'esempio 1, punto 1.10 ( Vinificazioni ). La concentrazione del ceppo P301.9 nella pasta era pari a (5,97± 0,57)*10<9>UFC/ml mentre quella del lievito di controllo era a (8,60± 0,6)*10<9>UFC/ml. L’inoculo à ̈ stato per entrambi di 2,5<*>10<6>UFC/ml.

Le caratteristiche chimiche del mosto utilizzato per la prova sono riportate nella tabella 13 seguente:

Tabella 13

ACIDITÀ ACIDO ACIDO

ZUCCHERI S02

TOTALE MALICO TARTARICO APA*

pH totale (g/l)

(g/D (g/D (g/i) (mg/l)

(mg/l)

152,1 3,4 6,1 3,5 3,6 131 50

<*>APA = azoto prontamente assimilabile

La tabella 14 seguente riporta le caratteristiche enologiche rilevate per il ceppo commerciale e il ceppo secondo l'invenzione:

Tabella 14

Parametro P301.9 Ceppo commerciale (Enologica Vason srl, Premium Prosecco, S. cerevisiae)

Giorni di fermentazione 7 8

Etanolo (%) 10,1 9,8

PH 3,4 3,4

Acidità totale (g/l) 6,1 6,4

Acido tartarico (g/l) 2,9 2,9

Acido malico (g/l) 2,4 2,6

Acido lattico (g/l) 0,64 0,69

Acidità volatile (g/l) 0,15 0,31

Glicerolo (g/l) 4,7 4,7

I vini prodotti sono stati sottoposti ad analisi sensoriale come descritto in precedenza nell'esempio 1 , punto 1.9 ( Microvinificazioni ). Sono stati confermati i giudizi espressi nelle microvinificazioni.

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Il testo libero nella lista delle sequenze (sequence listino):

I SEQ ID NOs 1-18 riguardano primer con le rispettive sigle di denominazione.

Claims (8)

1. RIVENDICAZIONI 1) Un ceppo di Saccharomyces cerevisiae identificato come P301.9 e depositato presso la DBVPG con numero di deposito 24P e numero di protocollo 521/P/2009.
2. 2) Il ceppo identificato come P301.9 (DBVPG 24P) secondo la rivendicazione 1) caratterizzato dal fatto che il suo fabbisogno in azoto durante la fermentazione in mosto sintetico à ̈ inferiore a 50 mg/l azoto disponibile per litro utilizzato in cui il valore corrisponde a quello necessario per passare, al massimo della velocità fermentativa di 0,7 g Γ<1>h<'1>, da 5 g a 75 g di CO2 prodotta.
3. 3) Il ceppo identificato come P301.9 (DBVPG 24P) secondo la rivendicazione 1) o 2) in forma essiccata, in forma liofilizzata o in forma di pasta.
4. 4) L’uso del ceppo di Saccharomyces cerevisiae identificato come P301.9 (DBVPG 24P) secondo una delle rivendicazioni precedenti come inoculo nella produzione di alimenti ottenuti mediante fermentazione alcolica.
5. 5) L’uso secondo la rivendicazione 4) caratterizzato dal fatto che l'alimento à ̈ un vino e che la fermentazione alcolica à ̈ un processo di vinificazione.
6. 6) L’uso secondo la rivendicazione 5) caratterizzato dal fatto che il vino à ̈ un vino bianco prodotto da uve Prosecco.
7. 7) L’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 4) a 6) caratterizzato dal fatto che la vinificazione avviene senza l'aggiunta di azoto prontamente assimilabile.
8. 8) L'uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 6) a 7) caratterizzato dal fatto che il vino prodotto ha una concentrazione di etilcaproato naturalmente prodotta dal ceppo di > 800 pg/l. Per incarico.