CN114829618A - 基因工程化的酵母细胞及其使用方法 - Google Patents

基因工程化的酵母细胞及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了重组表达编码突变体β‑裂合酶的基因的基因修饰的酵母细胞。还提供了产生发酵产物的方法和产生乙醇的方法。

Description

基因工程化的酵母细胞及其使用方法
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2019年10月17日提交的美国临时申请号62/916,529，和于2020年10月1日提交的美国临时申请号63/086,363的权益。这些引用的申请的每一个的全部内容通过引用并入本文。
政府支持
本发明是在国家科学基金会授予的编号1831242奖项的政府支持下进行的。政府享有本发明的某些权利。
技术领域
在过去的十年中，热带水果风味在美国和国际上的饮料市场上都变得越来越流行。参见Cannon等,J.Food Drug Anal.(2018)26:445-468；Watson,B.Early 2018BeerStyle Trends；Hahn等,Washington Post(2016):washingtonpost.com/lifestyle/food/pineapple-and-mango-in-the-pint-glass-so-hot-right-now/2016/05/22/73f6c52a-1dd2-11e6-b6e0-c53b7ef63b45_story.html。在啤酒行业，这种趋势通过其热带水果香气而有价值的调味啤酒花的使用急剧增加来举例证明。在葡萄酒行业中，热带风味基本香型(note)推动了白苏维浓(Sauvignon Blanc)和夏顿埃酒(Chardonnay)风格的流行，并且长期努力寻求进一步增加这些葡萄酒中的热带香气。参见Tominaga等,Flavour andFragrance Journal(1998)13,159–162；Swiegers等,Yeast(2007)24,561–574；Howell等,Appl.Environ.Microbiol.(2005)71,5420–5426；Santiago等,FEMS Yeast Res.(2015)15,fov034；Roland,A.等,Flavour and Fragrance Journal(2012)27,266–272；Jeffery等，Australian Journal of Chemistry(2016)69,1323。研究显示，多种不同的风味分子组合产生了大部分的水果风味。参见Cannon等,J.Food Drug Anal.(2018)26:445-468；Bartowsky等,Biology of Microorganisms on Grapes,in Must and in Wine,pp:209–231；Holt等,(FEMS Microbiol.Rev.2019)43:193-222。然而，许多研究也将白苏维浓葡萄酒的大部分热带风味和香气归因于存在三种特定的挥发性硫醇(thiol)分子并且某些种类的调味啤酒花是由于存在三种特定的挥发性硫醇分子。这些硫醇，3-巯基己-1-醇(3MH)、3-巯基乙酸己酯(3MHA)和4-甲基-4-巯基戊-2-酮(4MMP)在非常低的浓度下都可被人气味受体检测到，并且分别赋予葡萄柚/百香果、番石榴/醋栗和百香果/黑醋栗风味。参见Vanzo等,Sci.Rep.(2017):7；Roland等,Chem.Rev.(2012)111,7355–7376。
发明内容
本公开的方面提供了基因修饰的酵母细胞(修饰的细胞)，其包括编码具有β-裂合酶活性的酶的异源基因。在一些实施方式中，具有β-裂合酶活性的酶具有与SEQ ID NO:2陈述的序列至少90％序列同一性的序列。在一些实施方式中，具有β-裂合酶活性的酶不包括SEQ ID NO:1、6或7陈述的序列。在一些实施方式中，具有β-裂合酶活性的酶具有SEQ IDNO:2陈述的序列。在一些实施方式中，具有β-裂合酶活性的酶具有与SEQ ID NO:3-7的任一个陈述的序列至少90％序列同一性的序列。在一些实施方式中，具有β-裂合酶活性的酶具有SEQ ID NO:3-5的任一个陈述的序列。
在一些实施方式中，具有β-裂合酶活性的酶包括对应于SEQ ID NO:1的位置H463的位置处的取代突变。在一些实施方式中，对应于SEQ ID NO:1的位置H463的位置处的取代突变是苯丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、苏氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。
在一些实施方式中，酵母细胞是属酵母菌属(Saccharomyces)。在一些实施方式中，酵母细胞是物种酿酒酵母(S.cerevisiae)。在一些实施方式中，酵母细胞是酿酒酵母California Ale酵母菌株WLP001。在一些实施方式中，酵母细胞是物种巴斯德酵母(S.pastorianus)。
本公开的方面提供了产生发酵产物的方法，其包括，使本文所述的任何修饰的细胞与包括至少一种可发酵的糖的培养基接触，其中在至少第一发酵工艺期间进行接触，以产生发酵产物。在一些实施方式中，在至少一种糖源中提供了至少一种可发酵的糖。在一些实施方式中，可发酵的糖是葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和/或麦芽三糖。在一些实施方式中，至少一种糖源包括至少一种前体，比如植物衍生的前体或化学合成的前体。在一些实施方式中，至少一种前体包括半胱氨酸缀合的3-巯基己-1-醇(Cys 3-MH)、半胱氨酸缀合的4-甲基-4-巯基戊-2-酮(Cys 4MMP)、谷胱甘肽缀合的3-巯基己-1-醇(Glut-3-MH)和/或谷胱甘肽缀合的4-甲基-4-巯基戊烷2-酮(Glut 4MMP)。在一些实施方式中，方法进一步包括将一种或多种前体添加至培养基，其中前体包括3-巯基己烷-1-醇(Cys 3-MH)，半胱氨酸-缀合的4-甲基-4-巯基戊烷-2-酮(Cys 4MMP)、谷胱甘肽缀合的3-巯基己烷-1-醇(Glut-3-MH)和/或谷胱甘肽缀合的4-甲基-4-巯基戊-2-酮(Glut 4MMP)。
在一些实施方式中，与由不表达异源基因的对应细胞或表达具有β-裂合酶活性的野生型酶的对应细胞产生的发酵产物相比，发酵产物包括增加水平的至少一种挥发性硫醇。在一些实施方式中，至少一种挥发性硫醇包括3-巯基己-1-醇(3MH)、3-巯基乙酸己酯(3MHA)、4-甲基-4-巯基戊-2-酮(4MMP)或其组合。在一些实施方式中，发酵产物包括至少200ng/L 3-巯基己-1-醇(3MH)、3-巯基乙酸己酯(3MHA)和/或4-甲基-4-巯基戊-2-酮(4MMP)。
在一些实施方式中，与由不表达异源基因的对应细胞或表达具有β-裂合酶活性的野生型酶的对应细胞产生的发酵产物相比，发酵产物包括降低水平的至少一种不希望的产物。
在一些实施方式中，至少一种不希望的产物是吲哚。在一些实施方式中，发酵产物是发酵饮料。在一些实施方式中，发酵饮料是啤酒、葡萄酒、起泡酒(香槟)、清酒、蜂蜜酒、康普茶(kombucha)或苹果酒。在一些实施方式中，糖源包括麦芽汁、水果果汁、蜂蜜、大米淀粉或其组合。在一些实施方式中，水果果汁是葡萄汁或苹果果汁。
在一些实施方式中，糖源是麦芽汁，并且方法进一步包括产生培养基，其中产生培养基包括使多种谷物与水接触；并且煮沸或浸泡水和谷物以产生麦芽汁。在一些实施方式中，方法进一步包括将至少一种啤酒花种类添加至麦芽汁以产生加了啤酒花的麦芽汁。在一些实施方式中，方法进一步包括将至少一种啤酒花种类添加至培养基。在一些实施方式中，方法进一步包括至少一种另外的发酵工艺。在一些实施方式中，方法进一步包括使发酵产物碳酸化。
本公开的方面提供了通过本文所述的任何方法产生的发酵产物。在一些实施方式中，发酵产物包括至少200ng/L 3-巯基己-1-醇(3MH)、3-巯基乙酸己酯(3MHA)和/或4-甲基-4-巯基戊-2-酮(4MMP)。在一些实施方式中，发酵产物包括小于500μg/L吲哚。
本公开的方面提供了产生包括乙醇的组合物的方法，其包括使本文所述的任何修饰的细胞与包括至少一种可发酵的糖的培养基接触，其中在至少第一发酵工艺期间进行这种接触，以产生包括乙醇的组合物。在一些实施方式中，在至少一种糖源中提供了至少一种可发酵的糖。在一些实施方式中，可发酵的糖是葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和/或麦芽三糖。在一些实施方式中，至少一种糖源包括至少一种前体。在一些实施方式中，至少一种前体包括半胱氨酸缀合的3-巯基己-1-醇(Cys 3-MH)、半胱氨酸-缀合的4-甲基-4-巯基戊-2-酮(Cys 4MMP)、谷胱甘肽缀合的3-巯基己-1-醇(Glut-3-MH)和/或谷胱甘肽缀合的4-甲基-4-巯基戊2-酮(Glut 4MMP)。在一些实施方式中，方法进一步包括将一种或多种前体添加至培养基，其中前体包括3-巯基己-1-醇(Cys 3-MH)、半胱氨酸-缀合的4-甲基-4-巯基戊-2-酮(Cys4MMP)、谷胱甘肽缀合的3-巯基己-1-醇(Glut-3-MH)和/或谷胱甘肽缀合的4-甲基-4-巯基戊-2-酮(Glut 4MMP)。
在一些实施方式中，与包括由不表达异源基因的对应细胞或表达具有β-裂合酶活性的野生型酶的对应细胞产生的乙醇的组合物相比，包括乙醇的组合物进一步包括增加水平的至少一种挥发性硫醇。在一些实施方式中，至少一种挥发性硫醇包括3-巯基己-1-醇(3MH)、3-巯基乙酸己酯(3MHA)、4-甲基-4-巯基戊-2-酮(4MMP)或其组合。在一些实施方式中，包括乙醇的组合物进一步包括至少200ng/L 3-巯基己-1-醇(3MH)、3-巯基乙酸己酯(3MHA)和/或4-甲基-4-巯基戊-2-酮(4MMP)。
在一些实施方式中，与包括由不表达异源基因的对应细胞或表达具有β-裂合酶活性的野生型酶的对应细胞产生的乙醇的组合物相比，包括乙醇的组合物进一步包括减少水平的至少一种不希望的产物。在一些实施方式中，至少一种不希望的产物是吲哚。
在一些实施方式中，包括乙醇的组合物是发酵饮料。在一些实施方式中，发酵饮料是啤酒、葡萄酒、起泡酒(香槟)、清酒、蜂蜜酒、康普茶或苹果酒。在一些实施方式中，糖源包括麦芽汁、水果果汁、蜂蜜、大米淀粉或其组合。在一些实施方式中，水果果汁是葡萄果汁或苹果果汁。
在一些实施方式中，其中糖源是麦芽汁，并且方法进一步包括产生培养基，其中产生培养基包括使多种谷物与水接触；并且煮沸或浸泡水和谷物以产生麦芽汁。在一些实施方式中，方法进一步包括将至少一种啤酒花种类添加至麦芽汁以产生加了啤酒花的麦芽汁。在一些实施方式中，方法进一步包括将至少一种啤酒花种类添加至培养基。在一些实施方式中，方法进一步包括至少一种另外的发酵工艺。在一些实施方式中，方法进一步包括使发酵产物碳酸化。
本公开的方面提供了包括通过本文所述的任何方法产生的乙醇的组合物。在一些实施方式中，组合物进一步包括至少200ng/L 3-巯基己-1-醇(3MH)、3-巯基乙酸己酯(3MHA)和/或4-甲基-4-巯基戊-2-酮(4MMP)。在一些实施方式中，发酵产物包括小于500μg/L吲哚。
附图说明
当结合附图阅读以下描述的其各个方面和实施方式的详细描述时，将容易理解本公开的其他方面。
图1A-1H示出了如本文所述的制备发酵产物的方法或制备乙醇的方法的示例性流程图。图1A示出了在至少第一发酵工艺期间使本公开的修饰的细胞与培养基接触以产生发酵产物的方法。图1B示出了图1A的方法的实施方式，其中培养基通过使多种谷物与水接触、煮沸水以产生麦芽汁而产生，所述麦芽汁被冷却到培养基中。图1C示出了图1A的方法的实施方式，其中将至少一个种类的啤酒花添加至培养基中。图1D示出了图1A的方法的实施方式，其中发生至少一个另外的发酵工艺。图1E示出了图1A的方法的实施方式，其中发酵产物被碳酸化。图1F示出了制备乙醇的方法，其涉及在至少第一发酵工艺期间使本公开的修饰的细胞与培养基接触以产生包括乙醇的组合物。图1G示出了图1A的方法的实施方式，将至少一种挥发性硫醇前体(例如，Cys-MH、Glu-3MH)添加至培养基中。图1H示出了在至少第一发酵工艺期间使本公开的纯化酶与培养基接触以产生发酵产物的方法。
图2示出了通过野生型酵母菌株和工程化的酵母菌株酿造的啤酒中3-巯基己醇(3MH)和吲哚的浓度。左轴示出了3MH浓度，并且右轴记录了吲哚浓度。从左到右示出的菌株：野生型California Ale酵母(WLP001)；过度表达IRC7的WLP001(Y27)；过度表达STR3的WLP001(Y33)；过度表达TnaA的WLP001(Y182)；和过度表达TnaA-H463F的WLP001(Y502)。
图3A和3B示出了使用指定酵母菌株产生的发酵产物中3-巯基己醇(3MH)和吲哚的浓度。图3A示出了通过野生型酵母菌株和表达TnaA或TnaA H463F突变体的工程化的酵母菌株酿造的啤酒中3-巯基己-1-醇(3MH)和吲哚的浓度。左轴示出了3MH浓度(ng/L)，并且右轴记录了吲哚浓度(μg/L)。从左到右示出的菌株：野生型California Ale酵母(WLP001)；过度表达野生型TnaA的WLP001(Y319；Trpase WT)；和过度表达TnaA H463F突变体的WLP001(Y502；Trpase H463F)。图3B示出了用野生型酵母菌株和表达TnaA或TnaA H463F突变体的工程化的酵母菌株发酵的葡萄酒中3-巯基己-1-醇(3MH)和吲哚的浓度。左轴示出了3MH浓度(ng/L)，并且右轴记录了吲哚浓度(μg/L)。从左到右示出的菌株：野生型红星白丘(Cotedes Blanc)酵母菌株；过度表达野生型TnaA的红星(Y919；Trpase WT)；和过度表达TnaAH463F突变体的红星(Y484；Trpase H463F)。
图4A和4B示出了在存在或不存在添加的谷胱甘肽缀合的3-巯基己-1-醇(Glut-3MH)的情况下，使用指定酵母菌株产生的发酵产物中挥发性硫醇和吲哚的浓度。图4A示出了通过野生型酵母菌株和表达TnaA或TnaA H463F突变体的工程化的酵母菌株酿造的啤酒中3-巯基己-1-醇(3MH(ng/L))的浓度。图4B示出了通过野生型酵母菌株和表达TnaA或TnaAH463F突变体的工程化的酵母菌株酿造的啤酒中吲哚的浓度(μg/L)。从左到右示出的菌株：野生型California Ale酵母(WLP001)；过度表达野生型TnaA的WLP001(Y319；Trpase WT)；和过度表达TnaA H463F突变体的WLP001(Y502；Trpase H463F)。对于每种菌株，右栏示出含有在发酵工艺的开始添加的Glut-3MH的发酵中产生的吲哚；左栏示出在没有添加到发酵工艺的Glut-3MH的情况下产生的3MH。
图5示出了使用含有指定氨基酸突变的表达TnaA的酵母菌株酿造的啤酒中3-巯基己-1-醇(3MH)和吲哚的浓度。左轴示出了3MH浓度(ng/L)，并且右轴记录了吲哚浓度(μg/L)。从左到右示出的菌株：野生型California Ale酵母(WLP001)；过度表达野生型TnaA的WLP001(Trpase WT)；过度表达TnaA H463F突变体的WLP001(Trpase H463F)；过度表达野生型TnaA H463R突变体的WLP001(Trpase H463R)；过度表达TnaA H463E突变体的WLP001(Trpase H463E)；过度表达野生型TnaA H463T突变体的WLP001(Trpase H463T)；过度表达野生型TnaA H463G突变体的WLP001(Trpase H463G)；过度表达野生型TnaAH463I突变体的WLP001(Trpase H463I)；和过度表达野生型TnaAH463V突变体的WLP001(Trpase H463V)。
图6示出了使用表达来自无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)的色氨酸酶TnaA和来自其他物种的同源酶的酵母菌株酿造的啤酒中3-巯基己-1-醇(3MH)和吲哚的浓度。左轴示出了3MH浓度(ng/L)，并且右轴记录了吲哚浓度(μg/L)。从左到右示出的菌株：野生型California Ale酵母(WLP001)；过度表达来自无丙二酸柠檬酸杆菌(C.amalonaticus)的野生型(WT)TnaA的WLP001(Y319；Trpase WT)；过度表达来自无丙二酸柠檬酸杆菌Trpase H463F突变体的TnaA的WLP001(Y502；Trpase H463F)；过度表达来自棘孢木霉的TnaA/Trpase同源物的WLP001(Y644；T.asp同源物)；过度表达来自Aspergillussaccharolyticus的TnaA/Trpase同源物的WLP001(Y645；A.sac同源物)；和过度表达来自Zooshikella ganghwensis的TnaA/Trpase同源物的WLP001(Y646；Z.gang同源物)。
具体实施方式
在过去的十年中，热带水果风味在饮料市场上变得越来越流行。例如，在啤酒和葡萄酒行业中，对具有比如芒果、木瓜和菠萝风味基本香型的饮料的需求近年来急剧增加。在发酵饮料中赋予热带基本香型的三种风味分子是挥发性硫醇3-巯基己-1醇(3MH)、3-巯基乙酸己酯(3MHA)和4-甲基-4-巯基戊-2-醇(4MMP)。这些硫醇在发酵工艺期间由酵母表达的酶产生，这些酶将无味前体(例如，植物衍生的前体)转化为风味活性的挥发性硫醇。已经进行了几次尝试来鉴定释放高水平这些硫醇的酵母菌株，以及用于增加硫醇产生的生物工程酵母菌株，然而这些尝试仅取得了很小程度的成功，因为挥发物产生的增加是有限的，取决于环境，或因伴随释放的不希望的产物(例如，异味(off-flavor))比如吲哚而受损。本公开提供了基因修饰的酵母细胞，其已被修饰以增加这种硫醇并且减少不希望的产物的产生。
本文提供了基因修饰的酵母细胞，其已被工程化以表达具有β-裂合酶活性的酶。在一些实施方式中，具有β-裂合酶活性的酶已被修饰以增加所需挥发性硫醇的产生并且减少不希望的吲哚的产生。本文还提供了产生发酵饮料的方法，其涉及在发酵工艺期间使基因修饰的酵母细胞与包括糖源的培养基接触，所述糖源包括至少一种可发酵的糖。本文还提供了产生乙醇的方法，其涉及在发酵工艺期间使基因修饰的酵母细胞与包括糖源的培养基接触，所述糖源包括至少一种可发酵的糖。
贝塔(beta)-裂合酶(β-裂合酶)
本文所述的基因修饰的细胞含有编码具有β-裂合酶活性的酶的异源基因。如本文使用的术语“异源基因”是指对应于含有遗传指令的核酸(例如，DNA)的序列的遗传单位，该遗传指令被引入不天然地编码基因的宿主生物体(例如，基因修饰的细胞)并且由不天然地编码基因的宿主生物体(例如，基因修饰的细胞)表达。
β-裂合酶酶类参与硫醇的产生，硫醇与醇和苯基有关，但含有硫醇基或硫烷基(sulfanyl)(“-SH”)。硫醇可以具有各种各样香气或臭味(smell)中的任何一种，并且通常分类为具有负面气味的硫醇和具有正面气味的硫醇。某些含硫化合物，比如那些提供臭鸡蛋气味的化合物，是通过酵母发酵形成H2S的结果。其他次级还原气味，比如煮过的蔬菜、洋葱和卷心菜，也由比如硫代乙酸酯和硫醇(mercaptans)的含硫化合物产生，这被认为是由于发酵产物中的氧化还原电位过低所致(Brajkovich等，2005)。
对产物有积极贡献的含硫化合物被称为“挥发性硫醇”，它们趋向具有独特的香气特征。例如，引起众所周知香气的挥发性硫醇包括：3-巯基己-1-醇(3MH)(C6H14OS，也称为3-巯基-1-己醇、3-巯基己醇、3-硫烷基己-1-醇、3-硫代己醇、1-己醇、3-巯基-)，其赋予葡萄柚、百香果、醋栗和番石榴的香气；3-巯基乙酸己酯(3MHA)(C8H16O2S，也称为乙酸3-硫烷基己酯)，其赋予百香果、葡萄柚、黄杨树、醋栗和番石榴的香味；和4-甲基-4-巯基戊-2-酮(4MMP)(C6H12OS，也称为4-巯基-4-甲基-2-戊酮)，其赋予黄杨树、百香果、金雀花(broom)和黑醋栗的香气。
不希望受任何特定理论的束缚，认为芳香族前体的形成涉及酶促氧化、不饱和脂肪酸的代谢加工、与醛的半胱氨酸化(cysteinylated)或谷胱甘肽化(glutathionylated)缀合以及酒精发酵期间的β-裂合酶裂解以释放芳香族化合物的步骤。该工艺通过发酵生物体将培养基中的糖源(例如麦芽汁、原汁(must)等)的无味前体分子(例如植物来源的前体)转化为活性硫醇，并且被称为“生物转化”。参见，例如，Swiegers等,Yeast(2007)24:561-574；Santiago等,FEMS Yeast Res.(2015)15；Holt等,Appl.Environ.Microbiol.(2011)77:3626-3632；Thibon等,FEMS Yeast Res.(2008)8:1076-1086；Kishimoto等,J.Am.Soc.Brewing Chemists(2008)66:192-196。3MH和4MMP在发酵期间分别通过半胱氨酸缀合物前体分子Cys-3MH和Cys-4MMP的生物转化产生。参见，例如，Roland等,Flavour andFragrance Journal(2016)69:1323。生物转化由表达具有β-裂合酶活性的酶的生物体催化，该活性裂解半胱氨酸-缀合物以释放挥发性硫醇。参见，例如，Santiago等,FEMS YeastRes.(2015)15；Roncoroni等,Food Microbiol.(2011)926-935；Roland等,Chem.Rev.(2011)111:7355-7376。3MH随后可被表达酰基-转移酶酶类的酵母乙酰化以产生3MHA。参见，例如，Roland等,Chem.Rev.(2011)111:7355-7376。
在发酵期间，Cys3-MH和Cys-4MMP可以从培养基转运到酵母细胞中，并且被具有β-裂合酶活性的酶切割。可替选的，酿造麦芽汁和葡萄果汁或葡萄原汁也可以含有谷胱甘肽缀合物Glut-3MH和Glut-4MMP。参见，例如，Roland等,Chem.Rev.(2011)111:7355-7376；Kishimoto等,J.Am.Soc.Brewing Chemists(2008)66:192-196。谷胱甘肽缀合物可以被转运到酵母细胞中，并且被转肽酶酶类切割以产生Cys-3MH和Cys-4MMP，然后成为具有β-裂合酶活性的酶的底物。例如，参见，Howell等,Appl.Environ.Microbiol(2005)71:5420-5426；Santiago等,FEMS Yeast Res.(2015)15。然后，3MH和4MMP通过具有β-裂合酶活性的酶切割半胱氨酸缀合物而产生。多项研究表明，这种反应效率极低，并且在葡萄原汁发酵工艺期间，常用的酿酒酵母菌株仅将0.2％至2.0％的可用半胱氨酸-缀合物前体转化为风味活性硫醇。6，7，21这种低效率代表限制了发酵饮料中有益挥发性硫醇(例如，3MH、3MHA、4MMP)产生的显著的生化瓶颈。
除了产生挥发性硫醇的低效率之外，β-裂合酶的表达也可能导致不希望的分子，比如吲哚的产生增加。吲哚是由具有分子式C8H7N的芳香族杂环有机化合物形成的并且具有双环结构，双环结构由融合至五元吡咯环的六元苯环组成。吲哚广泛分布于环境中，并且天然存在于人粪便中，并且具有强烈的粪便气味。相应地，不希望在产生预期用于食用(consumption)的可发酵产物期间产生吲哚。
各种酶展示出β-裂合酶活性，例如β-裂合酶和色氨酸酶(TnaA)。在一些实施方式中，编码具有β-裂合酶活性的酶的异源基因是野生型β-裂合酶基因(例如，从生物体中分离的基因)。在一些实施方式中，编码具有β-裂合酶活性的酶的异源基因是突变体β-裂合酶基因并且在β-裂合酶基因的核酸序列中和/或在具有β-裂合酶活性的酶的氨基酸序列中含有一个或多个突变(例如，取代、缺失、插入)。如本领域普通技术人员将理解的，相对于野生型酶或参考酶，核酸序列中的突变可以改变翻译多肽的氨基酸序列(例如，取代突变)或可以不改变翻译多肽的氨基酸序列(例如，沉默突变)。
在一些实施方式中，编码具有β-裂合酶活性的酶的异源基因是截短，相对于野生型酶或参考酶，其缺乏一个或多个氨基酸，优选地在酶的N-末端或C-末端。
在一些实施方式中，β-裂合酶也可称为胱硫醚β-裂合酶(E.C.4.4.1.13)。在一些实施方式中，β-裂合酶基因来自真菌。在一些实施方式中，β-裂合酶基因来自酵母属物种，比如内源性酵母β-裂合酶。内源性酵母β-裂合酶的示例包括但不限于由基因IRC7编码的Irc7p(也称为YFR055W)和由基因STR3编码的Str3p。在一些实施方式中，β-裂合酶是来自酿酒酵母菌株VL3的IRC7或STR3。
在一些实施方式中，β-裂合酶基因来自细菌或真菌。在一些实施方式中，β-裂合酶基因来自大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方式中，β-裂合酶基因来自柠檬酸杆菌属物种。在一些实施方式中，β-裂合酶基因来自无丙二酸柠檬酸杆菌。
示例性的β-裂合酶是来自无丙二酸柠檬酸杆菌的TnaA并且由SEQ ID NO:1陈述的氨基酸序列提供。共有基序“MSAKKD”(SEQ ID NO:8)以粗体显示，其中催化残基，位置编号270的赖氨酸(称为K270)以粗体和下划线显示。保守基序“IDLLTDSGT”(SEQ ID NO:9)以粗斜体显示。
来自无丙二酸柠檬酸杆菌的野生型TnaA的氨基酸序列
Figure BDA0003697676550000111
在一些实施方式中，β-裂合酶是来自无丙二酸柠檬酸杆菌的TnaA的同源物(SEQID NO:1)。同源物或相关酶可以使用本领域已知的方法，比如本文所述的那些来鉴定。在一些实施方式中，β-裂合酶基因来自Zooshikella物种。在一些实施方式中，β-裂合酶基因来自Zooshikella ganghwensis。来自Z.ganghwensis的野生型TnaA同源物的氨基酸序列由登录号WP_094789495.1提供，并且与来自无丙二酸柠檬酸杆菌的TnaA(SEQ ID NO:1)具有82％的整体序列同一性。
在一些实施方式中，β-裂合酶基因来自曲霉属(Aspergillus)物种。在一些实施方式中，β-裂合酶基因来自Aspergillus saccharolyticus(例如，A.saccharolyticus菌株JOP 1030-1)。来自A.saccharolyticus的野生型TnaA同源物的氨基酸序列由登录号XP_025427068.1提供，并且与来自无丙二酸柠檬酸杆菌的TnaA(SEQ ID NO:1)具有44％的整体序列同一性。
在一些实施方式中，β-裂合酶基因来自曲霉属物种。在一些实施方式中，β-裂合酶基因来自棘孢木霉(Trichoderma asperellum)(例如棘孢木霉菌株CBS 433.97)。
来自棘孢木霉的野生型TnaA同源物的氨基酸序列由登录号XP_024760083.1提供，并且与来自无丙二酸柠檬酸杆菌的TnaA(SEQ ID NO:1)具有38％的整体序列同一性。来自棘孢木霉的β-裂合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)在对应于TnaA的H463(SEQ ID NO:1)的位置处含有酪氨酸(Y)。
MLPDCHLPETWRAKMVERIPSSTKDQRQEWICKADYNLFKLRSNEVRFDLGTDGGSGGMSDNQWSALMRGDSAATRSPSSYRLQEKVKELFGFTYTIPVHRGRAAKHALVQALLNEESIVPGNAFFDTTRANIESQKAIAIDCAIEGAFDIYYQHPFKGNVNLPELEKILQGSGSNVPMIMVSITCDKTGGQPVSMHNLREVKRLAKMFNVPVILDSARFAENAWFIQKNESEYSSQSIPDIVQEMYHHADGMVMSGKTDGLVNAGGFFATNNKDLFDRVGKYANLFCGLAGRDMEALTVGLGEVTQQEYLDDRIRQIHRFGMRLMAANVPIQQPIGGHAIVIDASLFLPLVPREEYVAKTLAVELYVEAGIRGAGMETVIGGGNPITGINRNRSNAKDFLYLAIPRQAYTNDQLSFVANALIQIFERRFTITRGLYVVHEDAILRYLTIQLKKADGKSIA(SEQ ID NO:3)
β-裂合酶的氨基酸可以被修饰(例如，取代)以产生β-裂合酶变体。例如，如本文所述的，SEQ ID NO:1的称为组氨酸463(H463)的位置463处的氨基酸被突变以产生具有所需活性的β-裂合酶。在一些实施方式中，对应于SEQ ID NO:1的位置463处的组氨酸(H463)的氨基酸用不是组氨酸残基的氨基酸(例如，任何其他氨基酸)取代。在一些实施方式中，对应于SEQ ID NO:1的位置463处的组氨酸(H463)的氨基酸用选自丙氨酸(A)、精氨酸(R)、赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(G)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)的氨基酸取代。
在一些实施方式中，对应于SEQ ID NO:1的位置463处的组氨酸(H463)的氨基酸用疏水性氨基酸(例如，丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W))取代。在一些实施方式中，对应于SEQ ID NO:1的位置463处的组氨酸(H463)的氨基酸用苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)取代。在一些实施方式中，对应于SEQ ID NO:1的位置463处的组氨酸(H463)的氨基酸用苯丙氨酸(F)残基(H463F)取代，由SEQ ID NO:2提供的。在一些实施方式中，对应于SEQ ID NO:1的位置463处的组氨酸(H463)的氨基酸用精氨酸(R)残基(H463R)取代。在一些实施方式中，对应于SEQ ID NO:1的位置463处的组氨酸(H463)的氨基酸用谷氨酸(E)残基(H463E)取代。在一些实施方式中，对应于SEQ ID NO:1的位置463处的组氨酸(H463)的氨基酸用苏氨酸(T)残基(H463T)取代。在一些实施方式中，对应于SEQ IDNO:1的位置463处的组氨酸(H463)的氨基酸用甘氨酸(G)残基(H463G)取代。在一些实施方式中，对应于SEQ ID NO:1的位置463处的组氨酸(H463)的氨基酸用异亮氨酸(I)残基(H463I)取代。在一些实施方式中，对应于SEQ ID NO:1的位置463处的组氨酸(H463)的氨基酸用缬氨酸(V)残基(H463V)取代。
在一些实施方式中，对应于SEQ ID NO:1的位置463处的组氨酸(H463)的氨基酸用苯丙氨酸(F)残基(H463F)取代并且由SEQ ID NO:4提供。在一些实施方式中，对应于SEQ IDNO:1的位置463处的组氨酸(H463)的氨基酸用苯丙氨酸(F)残基(H463F)取代并且由SEQ IDNO:5提供。
来自无丙二酸柠檬酸杆菌的TnaA的氨基酸序列–H463F取代突变(Y502)
MDNFKHLPEPFRIRVIEPVKRTTREHRNNAIIKSGMNPFLLDSEDVFIDLLTDSGTGAVTQNMQAAMLRGDEAYSGSRSYYALSEAVKNIFGYQYTIPTHQGRGAEQIYIPVLIKKREQEKGLDRSKMAVFSNYFFDTTQGHSQINGCAVRNVYIKEAFDTGVRYDFKGNFDLDGLERGIQEVGPNNVPYIVATITSNSAGGQPVSLANLKAMYNIAKKYDIPVVMDSARFAENAYFIQKREAEYRDWSIEEITRETYKYADMLAMSAKKDAMVPMGGLLCIKDDTYFDVYTECRTLCVVQEGFPTYGGLEGGAMERLAVGLVDGMNQDWLAYRIAQVQYLVDGLEAIGVTCQQAGGHAAFVDAGKLLPHIPAEQFPAQALACELYKVAGIRAVEIGSFLLGRDPKTGKQLPCPAELLRLTIPRATYTQSHMDFIIEAFEHVKENSMNIKGLTFTYEPKVLRFFTAKLKEV(SEQ ID NO:2)
由登录号WP_094789495.1提供来自Z.ganghwensis的TnaA同源物的氨基酸序列–H463F取代突变
MNNFKHLPEPFRIRVVEPVKRTTLAYREKAILNAGMNPFLLDSKDVFIDLLTDSGTGAITQEMQAAMFIGDEAYSGSRSYYALADAVKDIFGYEYTIPTHQGRGAEQIYIPVLIKKREKEKGLDRTKMVALSNYFFDTTQGHTQLNACVAKNVFTKEAFDTSISADFKGNFDLELLEHAILEAGPQNVPYIVSTITCNSAGGQPVSIANLKAVYEIAQRYEIPVIMDSARFAENAYFIQQREPEYQDWSIEAITFESYKYADALAMSAKKDAMVQMGGLLCFKDKSMLDVYNECRTLCVVQEGFPTYGGLEGGAMERLAVGLYDGMRQDWLAYRINQVQYLVNGLESIGIVCQQAGGHAAFVDAGKLLPHIPADQFPAHALACELYKVAGIRAVEIGSLLLGRDPTTGKQHPCPAELLRLTIPRATYTQTHMDFIIEAFEKVKENASHVKGLTFTYEPEVLRFFTARLKEVEN(SEQ ID NO:4)
由登录号XP_025427068.1提供来自A.saccharolyticus的TnaA同源物的氨基酸序列–H463F取代突变
MPNTATPETWRVKTVEHIRPSTRDQRQQWIEEAGFNLFTLPSDRVFIDLLTDSGTGAMSDRQWAAIMSGDESYAGSTSFHALHEVVQDLFGLEYLLPVHQGRAAENALFSVLVHEDQLVPANSHFDTTRAHIEFRKAAAVDCLSSGAYDVTDTNPFKGNMNLDMLRDILQESHARVPFILLTITCNTTGGQPVSLANIAAVKALADRYHKPLVVDAARFAENAWFIQQREPGYRDTSLRDITRQMLGMADAMVMSAKKDGLVNIGGFLATRHREWFDQATEYVILFEGFRTYGGLAGRDLAALAVGLEEVISADYLASRIGQVQRFGQRLIDAGVPIQQPVGGHAVLVDASRFLPEVPREEYVAQTLAVELYLEAGVRGVEIGTLLNGRDPESGEERFAETEWLRLAIPRRVYSNDHLEYVAQALIDLYHRRSEIRAGVRIVEEKPVLRFFTVRLERKTE(SEQ ID NO:5)
由登录号WP_094789495.1提供来自Z.ganghwensis的TnaA同源物的氨基酸序列–野生型序列
MNNFKHLPEPFRIRVVEPVKRTTLAYREKAILNAGMNPFLLDSKDVFIDLLTDSGTGAITQEMQAAMFIGDEAYSGSRSYYALADAVKDIFGYEYTIPTHQGRGAEQIYIPVLIKKREKEKGLDRTKMVALSNYFFDTTQGHTQLNACVAKNVFTKEAFDTSISADFKGNFDLELLEHAILEAGPQNVPYIVSTITCNSAGGQPVSIANLKAVYEIAQRYEIPVIMDSARFAENAYFIQQREPEYQDWSIEAITFESYKYADALAMSAKKDAMVQMGGLLCFKDKSMLDVYNECRTLCVVQEGFPTYGGLEGGAMERLAVGLYDGMRQDWLAYRINQVQYLVNGLESIGIVCQQAGGHAAFVDAGKLLPHIPADQFPAHALACELYKVAGIRAVEIGSLLLGRDPTTGKQHPCPAELLRLTIPRATYTQTHMDFIIEAFEKVKENASHVKGLTFTYEPEVLRHFTARLKEVEN(SEQ ID NO:6)
由登录号XP_025427068.1提供来自A.saccharolyticus的TnaA同源物的氨基酸序列–野生型序列
MPNTATPETWRVKTVEHIRPSTRDQRQQWIEEAGFNLFTLPSDRVFIDLLTDSGTGAMSDRQWAAIMSGDESYAGSTSFHALHEVVQDLFGLEYLLPVHQGRAAENALFSVLVHEDQLVPANSHFDTTRAHIEFRKAAAVDCLSSGAYDVTDTNPFKGNMNLDMLRDILQESHARVPFILLTITCNTTGGQPVSLANIAAVKALADRYHKPLVVDAARFAENAWFIQQREPGYRDTSLRDITRQMLGMADAMVMSAKKDGLVNIGGFLATRHREWFDQATEYVILFEGFRTYGGLAGRDLAALAVGLEEVISADYLASRIGQVQRFGQRLIDAGVPIQQPVGGHAVLVDASRFLPEVPREEYVAQTLAVELYLEAGVRGVEIGTLLNGRDPESGEERFAETEWLRLAIPRRVYSNDHLEYVAQALIDLYHRRSEIRAGVRIVEEKPVLRHFTVRLERKTE(SEQ ID NO:7)
在一些实施方式中，酶包括SEQ ID NO:1-7的任何一个的氨基酸序列并且对应于SEQ ID NO:1的位置463处的组氨酸(H463)的氨基酸用不是组氨酸残基的氨基酸(例如，任何其他氨基酸)取代。在一些实施方式中，酶包括SEQ ID NO:1-7的任何一个的氨基酸序列并且对应于SEQ ID NO:1的位置463处的组氨酸(H463)的氨基酸用选自丙氨酸(A)、精氨酸(R)、赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(G)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)的氨基酸取代。
在一些实施方式中，酶包括SEQ ID NO:1-7的任何一个的氨基酸序列并且对应于SEQ ID NO:1的位置463处的组氨酸(H463)的氨基酸用疏水氨基酸(例如，丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W))取代。在一些实施方式中，对应于SEQ ID NO:1的位置463处的组氨酸(H463)的氨基酸用苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)取代。
在一些实施方式中，异源基因编码具有β-裂合酶活性的酶，使得与不表达异源基因的细胞相比表达所述酶的细胞能够产生增加水平的挥发性硫醇。在一些实施方式中，异源基因编码具有β-裂合酶活性的酶，使得与表达具有野生型β-裂合酶活性的酶的细胞相比，表达所述酶的细胞能够产生增加水平的挥发性硫醇。在一些实施方式中，能够产生增加水平的挥发性硫醇的具有β-裂合酶活性的酶含有对应于SEQ ID NO:1的位置463处的组氨酸(H463)的位置处的氨基酸的取代。在一些实施方式中，能够产生增加水平的挥发性硫醇的具有β-裂合酶活性的酶具有SEQ ID NO:2-5的任何一个提供的序列。
在一些实施方式中，突变体β-裂合酶产生增加效价/水平的挥发性硫醇。在一些实施方式中，突变体β-裂合酶产生增加效价/水平的3MH。在一些实施方式中，突变体β-裂合酶产生增加效价/水平的3MHA。在一些实施方式中，突变体β-裂合酶产生增加效价/水平的4MMP。在一些实施方式中，突变体β-裂合酶产生增加效价/水平的一种或多种挥发性硫醇，例如，3MH、3MHA和/或4MMP。
在一些实施方式中，异源基因编码具有β-裂合酶活性和减少的色氨酸酶活性的酶。在一些实施方式中，异源基因编码具有β-裂合酶活性的酶，使得与具有野生型β-裂合酶活性的酶相比所述酶产生增加浓度的挥发性硫醇并且其还减少色氨酸酶活性。
在一些实施方式中，具有β-裂合酶活性的酶具有与SEQ ID NO:1-7的任何一个陈述的序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，具有β-裂合酶活性的酶具有与SEQ ID NO:1-7的任何一个陈述的序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的氨基酸序列并且对应于SEQ ID NO:1的位置463处的组氨酸(H463)的氨基酸用不是组氨酸残基的氨基酸(例如，任何其他氨基酸)取代。在一些实施方式中，具有β-裂合酶活性的酶具有与SEQID NO:1-7的任何一个陈述的序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的氨基酸序列并且对应于SEQ ID NO:1的位置463处的组氨酸(H463)的氨基酸用选自丙氨酸(A)、精氨酸(R)、赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(G)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)的氨基酸取代。
如本文它们可以互换地使用的，术语“同一性百分数”、“序列同一性”、“同一性％”、“序列同一性％”和“同一的％”是指两个序列(例如，核酸或氨基酸)之间相似性的定量量度。同一性百分数可以使用Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990的算法，如Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993中改进的确定。将这种算法并入Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序，评分＝50，字长＝3进行，以获得与感兴趣的蛋白质分子同源的氨基酸序列。其中间隙(gap)存在两个序列之间，Gapped BLAST可以如Altschul等,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997中描述的利用。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
当说明同一性百分数或其范围(例如，至少、大于等)时，除非另外指出，端点应包括在内并且范围(例如，至少70％同一性)应该包括列举范围内的所有范围(例如，至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％同一性)以及其所有增量(例如，每一百的十分之一(即，0.1％)，每一百的百分之一(即，0.01％)等)。
在一些实施方式中，具有β-裂合酶活性的酶包括SEQ ID NO:2陈述的氨基酸序列。在一些实施方式中，具有β-裂合酶活性的酶由SEQ ID NO:2中陈述的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，具有β-裂合酶活性的酶包括SEQ ID NO:3陈述的氨基酸序列。在一些实施方式中，具有β-裂合酶活性的酶由SEQ ID NO:3陈述的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，具有β-裂合酶活性的酶包括SEQ ID NO:4陈述的氨基酸序列。在一些实施方式中，具有β-裂合酶活性的酶由SEQ ID NO:4陈述的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，具有β-裂合酶活性的酶包括SEQ ID NO:5陈述的氨基酸序列。在一些实施方式中，具有β-裂合酶活性的酶由SEQ ID NO:5陈述的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，编码具有β-裂合酶活性的酶的基因包括编码包括与SEQ IDNO:2-5的任何一个陈述的序列具有至少80％(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％)序列同一性的氨基酸序列的酶的核酸序列。在一些实施方式中，编码具有β-裂合酶活性的酶的基因包括编码包括SEQ ID NO:2陈述的氨基酸序列的酶的核酸序列。在一些实施方式中，编码具有β-裂合酶活性的酶的基因包括编码由SEQ ID NO:2-5的任何一个陈述的氨基酸序列组成的酶的核酸序列。
可以进行具有β-裂合酶活性或预测具有β-裂合酶活性的另外的酶的鉴定，例如基于与β-裂合酶的一个或多个结构域的相似性或同源性，比如由SEQ ID NO:1-7的任何一个提供的β-裂合酶。在一些实施方式中，可以基于与活性结构域，比如催化结构域，比如与β-裂合酶活性相关的催化结构域的相似性或同源性来鉴定用于本文所述的修饰的细胞和方法的酶。在一些实施方式中，用于本文所述的修饰的细胞和方法的酶可以与参考β-裂合酶，例如野生型β-裂合酶，比如SEQ ID NO:1，在催化结构域的区域中，具有相对高水平的序列同一性，但基于酶的较大部分或跨越酶的全长的分析，与参考β-裂合酶具有相对低水平的序列同一性。在一些实施方式中，用于本文所述的修饰的细胞和方法的酶相对于参考β-裂合酶(例如，SEQ ID NO:1)在酶的催化结构域的区域中具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性。
在一些实施方式中，用于本文所述的修饰的细胞和方法的酶相对于参考β-裂合酶(例如，SEQ ID NO:1、3、6或7)在酶的催化结构域的区域中具有相对高水平的序列同一性，并且基于酶的较大部分或跨越酶的全长的分析，与参考β-裂合酶具有相对低水平的序列同一性。在一些实施方式中，用于本文所述的修饰的细胞和方法的酶相对于参考β-裂合酶(例如，SEQ ID NO:1、3、6或7)基于酶的一部分或跨越酶的全长具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性。
在一些实施方式中，氨基酸取代可以在活性位点中。如本文使用的，术语“活性位点”是指与底物相互作用的酶区域。包括活性位点的氨基酸和围绕活性位点的氨基酸，包括每个氨基酸的官能团，可有助于活性位点的大小、形状和/或底物可及性。在一些实施方式中，β-裂合酶变体含有一种或多种修饰，所述修饰是选定的氨基酸被具有不同官能团的氨基酸取代。
该信息还可用于鉴定具有或预测具有β-裂合酶活性的其他酶中的位置，例如相应位置。如对本领域普通技术人员将是显而易见的，在一种β-裂合酶酶类中鉴定的位置处的氨基酸取代也可以在另一种β-裂合酶酶类的相应氨基酸位置中进行。在这种情况下，一种β-裂合酶酶类可以用作参考酶。例如，如本文所述的，来自无丙二酸柠檬酸杆菌的TnaA的位置H463处的氨基酸取代已显示增加挥发性硫醇的产生并且减少吲哚的产生。可以使用TnaA作为参考(例如，SEQ ID NO:1)在具有β-裂合酶活性的其他酶的相应位置处进行类似的氨基酸取代。例如，如本文所述的，可以使用TnaA作为参考(例如，SEQ ID NO:1)，在来自Z.ganghwensis或A.saccharolyticus的β-裂合酶的相应位置处进行氨基酸取代。在一些实施方式中，在另一酶(例如，来自棘孢木霉的β-裂合酶)中在对应于来自无丙二酸柠檬酸杆菌的TnaA(SEQ ID NO:1)的位置H463的位置处的氨基酸不是组氨酸，参见，例如，SEQ IDNO:3。
对本领域技术人员或普通技术人员也将显而易见，β-裂合酶中选定的残基的氨基酸位置编号在另一β-裂合酶酶类(例如，参考酶)中可具有不同的氨基酸位置编号。通常，可以使用本领域已知的方法，例如通过比对两种或更多种酶的氨基酸序列来鉴定其他β-裂合酶酶类中的相应位置。用于比对氨基酸(或核苷酸)序列的软件程序和算法在本领域是已知的并且容易获得，例如，Clustal Omega(Sievers等,2011)。
本文所述的β-裂合酶变体可进一步含有一种或多种另外的修饰，例如以特定改变与其所需生理活性无关的多肽特征。可选地或另外地，本文所述的β-裂合酶变体可含有一种或更多种另外的突变以调节细胞中酶的表达。
编码β-裂合酶的核酸突变优选地保留编码序列的氨基酸阅读框，并且优选地不创建可能杂交以形成二级结构，例如发夹或环的核酸中的区域，其可能对酶的表达有害。
可以通过选择氨基酸取代或通过随机诱变编码多肽的核酸中选定的位点来进行突变。如本文所述的，可以表达变体多肽并且测试一种或多种活性以确定哪种突变提供具有所需特性的变体多肽。可以对变体(或非变体多肽)进行进一步突变，所述变体(或非变体多肽)对多肽的氨基酸序列是沉默的，但提供了用于特定宿主中翻译的优选密码子(称为密码子优化)。用于例如，酿酒酵母中核酸的翻译的优选密码子是本领域普通技术人员众所周知的。还可以对基因或cDNA克隆的非编码序列进行其他突变以增强多肽的表达。β-裂合酶变体的活性可以通过将编码β-裂合酶变体的基因克隆到表达载体中，将载体引入合适的宿主细胞，表达β-裂合酶变体，并且测试β-裂合酶的功能能力来测试，如本文公开的。
本文所述的β-裂合酶变体含有对应于参考β-裂合酶的一个或多个位置的氨基酸取代。在一些实施方式中，β-裂合酶变体含有对应于参考β-裂合酶的1、2、3、4、5或更多个位置处的氨基酸取代。在一些实施方式中，β-裂合酶不是天然存在的β-裂合酶，例如，是基因修饰的。在一些实施方式中，β-裂合酶不具有由SEQ ID NO:1提供的氨0基酸序列。在一些实施方式中，β-裂合酶不具有由SEQ ID NO:3提供的氨基酸序列。在一些实施方式中，β-裂合酶不具有由SEQ ID NO:6提供的氨基酸序列。在一些实施方式中，β-裂合酶不具有由SEQ IDNO:7提供的氨基酸序列。
在一些实施方式中，β-裂合酶变体还可以含有一个或多个基本上不影响β-裂合酶酶类的活性和/或结构的氨基酸取代。本领域技术人员还将认识到可以在β-裂合酶变体中进行保守氨基酸取代以提供前述多肽的功能等效变体，即，变体保留多肽的功能能力。如本文使用的，“保守氨基酸取代”是指不改变进行氨基酸取代的蛋白质的相对电荷或大小特征的氨基酸取代。可以根据本领域普通技术人员已知的用于改变多肽序列的方法制备变体，比如在汇编这种方法的参考文献中发现的，例如，Molecular Cloning:A LaboratoryManual,J.Sambrook等,eds.,第四版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,New York,2012,或Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等,eds.,John Wiley&Sons,Inc.,New York。多肽的示例性功能等效变体包括本文公开的蛋白质的氨基酸序列中的保守氨基酸取代。氨基酸的保守取代包括以下组内的氨基酸之间进行的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N和(g)E、D。
如本领域普通技术人员将意识到，编码具有β-裂合酶的酶的同源基因可以从其他物种获得并且可以通过同源性搜索来鉴定，例如通过可在国家生物技术信息中心(NCBI)网站(ncbi.nlm.nih.gov)获得的蛋白质BLAST搜索。通过将酶的氨基酸序列与一种或多种参考酶比对和/或通过将相似或同源酶的二级或三级结构与一种或多种参考β-裂合酶进行比较，可以确定相似或同源酶中相应氨基酸残基并且可以确定相似或同源酶中突变的氨基酸残基。
与本公开相关的基因可以从来自任何含有给定基因的DNA来源的DNA获得(例如，通过PCR扩增)。在一些实施方式中，与本发明相关的基因是合成的，例如，通过体外化学合成产生。任何获得编码本文所述酶的基因的方法都与本文所述的修饰的细胞和方法相兼容。
本文提供的公开内容涉及编码具有β-裂合酶活性的酶的基因的重组表达、前述的功能修饰和变体，以及与其相关的用途。可以通过常规技术鉴定与本发明相关的核酸的同源物和等位基因。本发明还涵盖在严格的条件下与本文所述核酸杂交的核酸。如本文所用的，术语“严格的条件”是指具有本领域熟悉的参数。核酸杂交参数可在汇编这种方法的参考文献中发现，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook等,eds.,第四版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,2012,或Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等,eds.,John Wiley&Sons,Inc.,New York。
还有其他条件、试剂等可以使用，它们导致相似程度的严格性。本领域技术人员将熟悉这些条件，并且因此这里不给出它们。然而，应当理解，本领域技术人员将能够以允许清楚鉴定本发明核酸的同源物和等位基因的方式操纵条件(例如，通过使用较低严格性的条件)。本领域技术人员还熟悉筛选细胞和文库用于表达这些分子的方法，然后常规分离这些分子，随后分离相关核酸分子并且测序。
本发明还包括简并(degenerate)核酸，其包括天然材料中存在的密码子的可替选的密码子。例如，丝氨酸残基由密码子TCA、AGT、TCC、TCG、TCT和AGC编码。为了编码丝氨酸残基的目的，六个密码子中的每一个都是等效的。因此，对于本领域普通技术人员将是显而易见的，可采用任何编码丝氨酸的核苷酸三联体(triplet)以在体外或体内指导蛋白质合成装置将丝氨酸残基并入延伸多肽中。类似地，编码其他氨基酸残基的核苷酸序列三联体包括但不限于：CCA、CCC、CCG和CCT(脯氨酸密码子)；CGA、CGC、CGG、CGT、AGA和AGG(精氨酸密码子)；ACA、ACC、ACG和ACT(苏氨酸密码子)；AAC和AAT(天冬酰胺密码子)；以及ATA、ATC和ATT(异亮氨酸密码子)。其他氨基酸残基可以类似地由多个核苷酸序列编码。因此，本发明涉及由于遗传密码的简并性而在密码子序列中不同于生物学分离的核酸的简并核酸。本发明还涵盖密码子优化以适应宿主细胞的最佳密码子使用。
本发明还提供了修饰的核酸分子，其包括一个或多个核苷酸的添加、取代和缺失。在优选的实施方式中，这些修饰的核酸分子和/或它们编码的多肽保留了未修饰的核酸分子和/或多肽的至少一种活性或功能，例如酶活性。在某些实施方式中，修饰的核酸分子编码修饰的多肽，优选地具有如本文别处描述的保守氨基酸取代的多肽。修饰的核酸分子在结构上与未修饰的核酸分子相关，并且在优选的实施方式中，在结构上与未修饰的核酸分子充分相关，使得修饰的和未修饰的核酸分子在本领域技术人员已知的严格条件下杂交。
例如，可以制备编码具有单个氨基酸变化的多肽的修饰的核酸分子。这些核酸分子中的每一个可以具有一个、两个或三个核苷酸取代，不包括对应于本文所述遗传密码简并性的核苷酸变化。相似地，可以制备编码具有两个氨基酸变化的多肽的修饰的核酸分子，其具有例如2-6个核苷酸变化。本领域技术人员将容易想到许多类似这些的修饰的核酸分子，包括例如，编码氨基酸2和3、2和4、2和5、2和6等的密码子中的核苷酸取代。在前述的示例中，两个氨基酸的每个组合都包括在修饰的核酸分子的组中，以及编码氨基酸取代的所有核苷酸取代。还可以制备编码具有另外取代(即，3个或更多)、添加或缺失(例如，通过引入终止密码子或剪接位点)的多肽的另外核酸分子，并且被本发明涵盖，如由本领域普通技术人员容易设想的。任何前述核酸或多肽可以通过常规实验测试，以保留与本文公开的核酸和/或多肽的结构关系或活性。
在一些实施方式中，与本发明相关的一种或多种基因在重组表达载体中表达。如本文使用的，“载体”可以是许多核酸中的任何一种，其中通过限制和连接可以将所需的一个或多个序列插入以用于不同遗传环境之间的运输或用于宿主细胞中表达。载体通常包括DNA，虽然也可以使用RNA载体。载体包括但不限于：质粒、福斯质粒(fosmid)、噬菌粒、病毒基因组和人工染色体。
克隆载体是一种能够自主复制或整合到宿主细胞的基因组中的载体。在质粒的情况下，所需序列的复制可发生许多次，因为质粒在宿主细胞，比如宿主细菌内的拷贝数增加，或在宿主通过有丝分裂繁殖之前每个宿主仅发生一次。在噬菌体的情况下，复制可在裂解阶段主动发生或在溶原阶段被动发生。
表达载体是一种载体，其中可以通过限制和连接将所需的DNA序列插入，从而使其与调节序列可操作地连接并且可以表达为RNA转录体。载体可以进一步含有一种或多种标记序列，其适合用于鉴定已经或还未用载体转化或转染的细胞。标记包括，例如，编码增加或减少对抗生素或其他化合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因，编码其活性可通过本领域已知的标准测定检测的酶(例如，β-半乳糖苷酶、萤光素酶或碱性磷酸酶)的基因，以及明显影响转化或转染的细胞、宿主、菌落或噬斑的表型的基因(例如，绿色荧光蛋白)的基因。优选的载体是那些能够自主复制和表达存在于它们可操作地连接的DNA片段中的结构基因产物的载体。
如本文使用的，当编码序列和调节序列以将编码序列的表达或转录置于调节序列的影响或控制之下的这种方式共价连接时，它们被称为“可操作地”连接。如果需要将编码序列翻译成功能性蛋白质，如果在5’调节序列中诱导启动子导致编码序列的转录，并且如果两个DNA序列之间的连接性质不会(1)导致引入移码突变、(2)干扰启动子区域指导编码序列转录的能力或(3)干扰相应的RNA转录体被翻译成蛋白质的能力，则两个DNA序列被称为“可操作地”连接。因此，如果启动子区域能够影响该DNA序列的转录，使得可以将所得转录体翻译成所需的蛋白质或多肽，则启动子区域将与编码序列可操作地连接。
当编码要求保护的发明的任何酶的核酸分子在细胞中表达时，各种转录控制序列(例如，启动子/增强子序列)可用于指导其表达。启动子可以是天然启动子，即，基因在其内源环境中的启动子，其提供基因表达的正常调节。在一些实施方案中，启动子可以是组成型的，即，启动子不受调节，允许其相关基因(例如，具有β-裂合酶活性的酶)的连续转录。也可以使用各种条件启动子，比如由分子的存在或不存控制的启动子。
基因表达所需的调控序列的精确性质可以在物种或细胞类型之间改变，但一般应根据需要包括分别涉及转录和翻译启动的5’非转录和5’非翻译序列，比如TATA盒、封端序列、CAAT序列等。特别地，这种5’非转录调控序列将包括启动子区域，其包括用于对可操作地连接的基因进行转录控制的启动子序列。根据需要，调控序列还可以包括增强子序列或上游激活子序列。本发明的载体可以任选地包括5’前导或信号序列。适当的载体的选择和设计在本领域普通技术人员的能力和判断范围内。
含有所有表达所需元件的表达载体是商业上可获得的并且对本领域技术人员是已知的。参见，例如，Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第四版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,2012。通过引入至异源DNA(RNA)的细胞来对细胞进行基因工程化。该异源DNA(RNA)被置于转录元件的可操作的控制之下，以允许宿主细胞中异源DNA的表达。在使用酿酒酵母菌株WLP001的示例中证明了在基因修饰的酵母细胞中编码具有β-裂合酶活性的酶的的基因的异源表达，例如在产生发酵饮料，比如啤酒的方法中。如本领域普通技术人员将认识到，本文所述的任何酶也可以在其他酵母细胞，包括用于产生葡萄酒、蜂蜜酒、清酒、苹果酒等的酵母菌株中表达。
可以使用本领域标准的方法和技术将编码要求保护的发明的酶的核酸分子引入一个或多个细胞中。例如，可以通过标准方案比如转化(包括化学转化和电穿孔、转导、粒子轰击等)引入核酸分子。表达编码要求保护的发明的酶的核酸分子也可以通过将核酸分子整合到基因组来实现。
异源基因的并入可以通过将新核酸并入酵母细胞的基因组中，或通过将新核酸瞬时或稳定地维持为游离型元件(episomal element)来完成。在真核细胞中，永久性的、可遗传的基因变化一般是通过将DNA引入细胞的基因组来实现的。
异源基因还可以包括表达编码基因产物(例如，具有β-裂合酶活性的酶)所需的各种转录元件。例如，在一些实施方式中，异源基因可以包括启动子。在一些实施方式中，启动子可以与异源基因的基因可操作地连接。在一些实施方式中，细胞是诱导型启动子。在一些实施方式中，启动子在发酵工艺的特定阶段是有活性的。在一些实施方式中，启动子是组成型启动子。用于酵母细胞的组成型启动子的示例在本领域是已知的并且对本领域普通技术人员是显而易见的。在一些实施方式中，启动子是酵母启动子，例如，来自表达异源基因的酵母细胞的天然启动子。在一些示例中，启动子是PKG1启动子(pPGK1)或HHF2启动子(pHHF2)。
基因修饰的酵母细胞
本公开的方面涉及基因修饰的酵母细胞(修饰的细胞)和产生发酵产物(例如，发酵饮料)的方法和产生乙醇的方法中这种修饰的细胞的用途。本文所述的基因修饰的酵母细胞用编码具有β-裂合酶活性的酶的异源基因进行基因修饰。
如在本文中可互换使用的术语“基因修饰的细胞”、“基因修饰的酵母细胞”和“修饰的细胞”是指真核细胞(例如，酵母细胞，其已经或目前可以，通过引入异源基因进行修饰。术语(例如，修饰的细胞)包括已经通过引入异源基因进行基因修饰的原始细胞的后代。本领域技术人员应当理解，由于突变(即，修饰的细胞的核酸的自然的、偶然的或故意的改变)，单个细胞的后代在形态学或基因组或总核酸互补体上不一定与原始亲本完全相同。
本文所述的方法中使用的酵母细胞优选地能够发酵糖源(例如，可发酵的糖)和产生乙醇(乙基醇)和二氧化碳。在一些实施方式中，酵母细胞是酵母菌属的。酵母菌属包括接近500个不同的物种，其中许多用于生产食品。一个示例物种是酿酒酵母(S.cerevisiae)，其通常被称为“啤酒酵母”或“面包酵母”，并且用于产生葡萄酒、面包、啤酒等其他产物。酵母菌属的其他成员包括但不限于野生型酵母奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)(其是酿酒酵母的近亲)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)、卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、布拉迪酵母(Saccharomyces cerevisiae var boulardii)、真贝酵母(Saccharomyces eubayanus)。在一些实施方式中，酵母是酿酒酵母(S.cerevisiae)。
酵母菌属物种可以是单倍体(即，具有单组染色体)、二倍体(即，具有成对组的染色体)或多倍体(即，携带或含有多于两个同源组的染色体)。用于例如啤酒酿造的酵母菌属物种通常分为两组：ale菌株(例如，酿酒酵母)，其是顶部发酵的，以及lager菌株(例如，巴斯德酵母、卡尔斯伯酵母、葡萄汁酵母)，其是底部发酵。这些特性反映了它们在开放式方形发酵罐中的分离特性，以及通常其他特性，比如优选的发酵温度和达到的酒精浓度。
尽管啤酒酿造和葡萄酒生产传统上侧重于使用酿酒酵母菌株，但其他酵母属在发酵饮料的生产中也受到重视。在一些实施方式中，酵母细胞属于非酵母菌属。参见，例如，Crauwels等,Brewing Science(2015)68:110-121；Esteves等,Microorganisms(2019)7(11):478。在一些实施方式中，酵母细胞是克勒克酵母属(Kloeckera)、假丝酵母菌属(Candida)、晋宁斯塔莫酵母属(Starmerella)、有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)/Lachance、梅奇酵母属(Metschnikowia)、类酵母属(Saccharomycodes)、接合酵母属(Zygosaccharomyce)、德克酵母属(Dekkera)(也称为酒香酵母属(Brettanomyces))、威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)或有孢圆酵母属(Torulaspora)。非酵母菌属酵母的示例包括但不限于葡萄有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)、季氏有孢汉逊酵母(Hanseniaspora guillermondii)、葡萄酒有孢汉逊酵母(Hanseniaspora vinae)、美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces/Lachancea thermotolerans)、Starmerella bacillaris(以前称为星形假丝酵母(Candida stellata)/泽普林假丝酵母菌(Candida zemplinicysi))、路德类酵母(Saccharomycodes ludwigii)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、布鲁塞尔德克酵母(Dekkera bruxellensis)、异型德克酵母(Dekkera anoma)、班图酒香酵母(Brettanomyces custersianus)、纳氏布雷坦酵母菌(Brettanomycesnaardenensis)、纳努斯布雷特酵母菌(Brettanomyces nanus)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)和戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)。
在一些实施方式中，本文所述的方法涉及使用多于一种基因修饰的酵母。例如，在一些实施方式中，方法可以涉及使用多于一种属于酵母菌属的基因修饰的酵母。在一些实施方式中，所述方法可以涉及使用多于一种属于非酵母菌属的基因修饰的酵母。在一些实施方式中，方法可以涉及使用多于一种属于酵母菌属的基因修饰的酵母和一种属于非酵母菌属的基因修饰的酵母。可替选地或另外地，本文所述的任何方法可以涉及使用一种或多种基因修饰的酵母和一种或多种非基因修饰的(野生型)酵母。
在一些实施方式中，酵母是杂交菌株。如对本领域普通技术人员将是显而易见的，酵母的术语“杂交菌株”是指由两种不同酵母菌株杂交(crossing)产生的酵母菌株，例如，以实现一种或多种所需特性。例如，杂交菌株可以发生属于相同属或相同物种的两种不同酵母菌株的杂交。在一些实施方式中，杂交菌株由酿酒酵母菌株和真贝酵母菌株的杂交产生。参见，例如，Krogerus等,Microbial Cell Factories(2017)16:66。
在一些实施方式中，酵母菌株是野生型酵母菌株，比如从天然来源分离并且随后繁殖的酵母菌株。可选地，在一些实施方式中，酵母菌株是驯化的酵母菌株。驯化的酵母菌株已经进行人类选择和育种以具有所需的特性。
在一些实施方式中，基因修饰的酵母细胞可用于与细菌菌株共生基质中并且用于产生发酵饮料，例如康普茶、酸乳酒(kefir)和姜汁啤酒。例如，脆壁酵母菌(Saccharomycesfragilis)是酸乳酒培养物的一部分，并且在乳清中含有的乳糖上生长。
基因修饰的酵母细胞的方法是在本领域已知的。在一些实施方式中，酵母细胞是二倍体，并且将如本文所述的编码具有β-裂合酶活性的酶的异源基因的一个拷贝引入酵母基因组中。在一些实施方式中，酵母细胞是二倍体，并且将如本文所述的编码具有β-裂合酶活性的酶的异源基因的一个拷贝引入酵母基因组的两个拷贝中。在一些实施方式中，异源基因的拷贝是相同的。在一些实施方式中，异源基因的拷贝是不相同的，但基因编码具有β-裂合酶活性的相同的酶。在一些实施方式中，异源基因的拷贝是不相同的，并且基因编码不同的具有β-裂合酶活性的酶(例如，其突变体、变体、片段)。
在一些实施方式中，酵母细胞是四倍体。四倍体酵母细胞是维持四个完整染色体组的细胞(即，四个拷贝的完整染色体组)。在一些实施方式中，酵母细胞是四倍体，并且将如本文所述的编码具有β-裂合酶活性的酶的异源基因的拷贝引入基因组的至少一个拷贝中。在一些实施方式中，酵母细胞是四倍体，并且将如本文所述的编码具有β-裂合酶活性的酶的异源基因的拷贝引入基因组的多于一个拷贝中。在一些实施方式中，酵母细胞是四倍体，并且将如本文所述的编码具有β-裂合酶活性的酶的异源基因的拷贝引入基因组的所有四个拷贝中。在一些实施方式中，异源基因的拷贝是相同的。在一些实施方式中，异源基因的拷贝是不相同的，但基因编码相同的具有β-裂合酶活性的酶。在一些实施方式中，异源基因的拷贝是不相同的，并且基因编码不同的具有β-裂合酶活性的酶(例如，其突变体、变体、片段)。
可以与本文所述的方法一起使用的酵母细胞的菌株对本领域普通技术人员是已知的，并且包括用于酿造所需发酵饮料的酵母菌株以及商业上可获得的酵母菌株。常见啤酒菌株的示例包括但不限于美式艾尔菌株(American ale strains)、比利时式艾尔菌株(Belgian ale strains)、英式艾尔菌株(British ale strains)、比利时式拉比克/酸艾尔菌株(Belgian lambic/sour ale strains)、大麦啤酒/帝王世涛菌株(Barleywine/Imperial Stout strains)、印度淡色艾尔菌株(India Pale Ale strains)、棕色艾尔菌株(Brown Ale strains)、科隆和阿尔特菌株(Kolsch and Altbier strains)、世涛和波特菌株(Stout and Porter strains)、小麦啤酒菌株(Wheat beer strains)。
与本文所述的基因修饰的细胞和方法一起使用的酵母菌株的非限制性示例包括Wyeast美式艾尔(Wyeast American Ale)1056、Wyeast美式艾尔II 1272、Wyeast Denny的最爱物(Wyeast Denny’s Favorite)50 1450、Wyeast西北方艾尔(Wyeast Northwest Ale)1332、Wyeast灵伍德艾尔(Wyeast Ringwood Ale)1187、Siebel Inst.美式艾尔(SiebelInst.American Ale)BRY 96、怀特实验室美式艾尔酵母混合物(White Labs American AleYeast Blend)WLP060、怀特实验室加利福尼亚艾尔(White Labs California Ale)VWLP051、怀特实验室加利福尼亚艾尔(White Labs California Ale)WLP001、怀特实验室老索诺玛艾尔(White Labs Old Sonoma Ale)WLP076、怀特实验室太平洋艾尔(White LabsPacific Ale)WLP041、怀特实验室东海岸艾尔(White Labs East Coast Ale)WLP008、怀特实验室东密德兰艾尔(White Labs East Midlands Ale)WLP039、怀特实验室圣地亚哥超级酵母(White Labs San Diego Super Yeast)WLP090、怀特实验室旧金山拉格啤酒(WhiteLabs San Francisco Lager)WLP810、怀特实验室中性谷物(White Labs Neutral Grain)WLP078、拉曼美式西海岸艾尔(Lallemand American West Coast Ale)BRY-97、拉曼CBC-1(桶内和瓶内加工)(Lallemand CBC-1(Cask and Bottle Conditioning))、Brewferm Top、库珀纯啤酒酵母(Coopers Pure Brewers’Yeast)、弗曼迪斯(Fermentis)US-05、RealBrewers Yeast Lucky#7、芒顿特级金(Muntons Premium Gold)、芒顿标准酵母(MuntonsStandard Yeast)、东海岸酵母东北艾尔(East Coast Yeast Northeast Ale)ECY29、东海岸酵母老纽瓦克艾尔(East Coast Yeast Old Newark Ale)ECY10、东海岸酵母老纽瓦克啤酒(East Coast Yeast Old Newark Beer)ECY12、弗曼迪斯(Fermentis)Safale US-05、弗曼迪斯(Fermentis)Safbrew T-58、Real Brewers Yeast The One、红树林杰克美国西海岸酵母(Mangrove Jack US West Coast Yeast)、红树林杰克工马啤酒酵母(Mangrove JackWorkhorse Beer Yeast)、拉曼阿比比利时式艾尔(Lallemand Abbaye Belgian Ale)、怀特实验室阿贝(White Labs Abbey)IV WLP540、怀特实验室美式农舍混合物(White LabsAmerican Farmhouse Blend)WLP670、怀特实验室安特卫普艾尔(White Labs AntwerpAle)WLP515、东海岸酵母比利时式阿比(East Coast Yeast Belgian Abbaye)ECY09、怀特实验室比利时式艾尔(White Labs Belgian Ale)WLP550、红树林杰克比利时式艾尔酵母(Mangrove Jack Belgian Ale Yeast)、Wyeast比利时式深色艾尔(Wyeast Belgian DarkAle)3822-PC、Wyeast比利时式塞松(Wyeast Belgian Saison)3724、怀特实验室比利时式塞松(White Labs Belgian Saison)I WLP565、怀特实验室比利时式塞松(White LabsBelgian Saison)II WLP566、怀特实验室比利时式塞松(White Labs Belgian Saison)IIIWLP585、Wyeast比利时式谢德艾尔(Wyeast Belgian Schelde Ale)3655-PC、Wyeast比利时式烈性黑啤酒(Wyeast Belgian Stout)1581-PC、怀特实验室比利时式风格艾尔酵母混合物(White Labs Belgian Style Ale Yeast Blend)WLP575、怀特实验室比利时式风格季节艾尔混合物(White Labs Belgian Style Saison Ale Blend WLP568、东海岸酵母比利时式怀特(East Coast Yeast Belgian White)ECY11、拉曼贝莱塞松(Lallemand BelleSaison)、Wyeast Biere de Garde 3725-PC、怀特实验室布雷特酒香酵母布鲁氏菌(WhiteLabs Brettanomyces Bruxellensis)Trois VraiWLP648、Brewferm Top、Wyeast加拿大式/比利时式艾尔(Wyeast Canadian/Belgian Ale)3864-PC、拉曼CBC-1(桶内和瓶内加工)(Lallemand CBC-1(Cask and Bottle Conditioning))、Wyeast农舍艾尔(WyeastFarmhouse Ale)3726-PC、东海岸酵母农舍布雷特(East Coast Yeast Farmhouse Brett)ECY03、Wyeast弗兰德斯金色艾尔(Wyeast Flanders Golden Ale)3739-PC、怀特实验室弗兰德式艾尔混合物(White Labs Flemish Ale Blend)WLP665、怀特实验室法式艾尔(WhiteLabs French Ale)WLP072、Wyeast法式季节(Wyeast French Saison)3711、Wyeast鲁汶淡色艾尔(Wyeast Leuven Pale Ale)3538-PC、弗曼迪斯(Fermentis)SafbrewT-58、东海岸酵母塞松啤酒店混合物(East Coast Yeast Saison Brasserie Blend)ECY08、东海岸酵母塞松单一菌株(East Coast Yeast Saison Single-Strain)ECY14、Real Brewers Yeast TheMonk、Siebel Inst.特拉普派艾尔(Siebel Inst.Trappist Ale)BRY 204、东海岸酵母特拉普派艾尔(East Coast Yeast Trappist Ale)ECY13、怀特实验室特拉普派艾尔(WhiteLabs Trappist Ale)WLP500、Wyeast特拉普派混合物(Wyeast Trappist Blend))3789-PC、Wyeast英式艾尔(Wyeast British Ale)1098、Wyeast英式艾尔(Wyeast British Ale)II1335、Wyeast英式桶艾尔(Wyeast British Cask Ale)1026-PC、Wyeast英格兰式特别苦啤酒(Wyeast English Special Bitter)1768-PC、Wyeast爱尔兰式艾尔(Wyeast Irish Ale)1084、Wyeast伦敦式艾尔(Wyeast London Ale)1028、Wyeast伦敦式艾尔(Wyeast IrishAle)III 1318、Wyeast伦敦式ESB艾尔(Wyeast London ESB Ale)1968、Wyeast灵伍德艾尔(Wyeast Ringwood Ale)1187、Wyeast泰晤士河谷艾尔(Wyeast Thames Valley Ale)1275、Wyeast泰晤士河谷艾尔(Wyeast Thames Valley Ale)II 1882-PC、Wyeast西约克郡艾尔(Wyeast West Yorkshire Ale)1469、Wyeast惠特布雷德艾尔(Wyeast Whitbread Ale)1099、红树林杰克英式艾尔酵母(Mangrove Jack British Ale Yeast)、红树林杰克伯顿联盟酵母(Mangrove Jack Burton Union Yeast)、红树林杰克工马啤酒酵母(Mangrove JackWorkhorse Beer Yeast)、东海岸酵母英式淡味啤酒艾尔(East Coast Yeast BritishMild Ale)ECY18、东海岸酵母东北艾尔(East Coast Yeast Northeast Ale)ECY29、东海岸酵母伯顿联盟(East Coast Yeast Burton Union)ECY17、东海岸酵母老纽瓦克艾尔(EastCoast Yeast Old Newark Ale)ECY10、怀特实验室贝德福特英式艾尔(White LabsBedford British Ale)WLP006、怀特实验室英式艾尔(White Labs British Ale)WLP005、怀特实验室伯顿艾尔(White Labs Burton Ale)WLP023、怀特实验室东密德兰艾尔(WhiteLabs East Midlands Ale)WLP039、怀特实验室英格兰式艾尔混合物怀特实验室英格兰式艾尔(White Labs English Ale)Blend)WLP085、怀特实验室英格兰式艾尔(White LabsEnglish Ale)WLP002、怀特实验室埃塞克斯艾尔酵母(White Labs Essex Ale Yeast)WLP022、怀特实验室爱尔兰式艾尔(White Labs Irish Ale)WLP004、怀特实验室伦敦式艾尔(White Labs London Ale)WLP013、怀特实验室曼彻斯特艾尔(White Labs ManchesterAle)WLP038、怀特实验室老索诺玛艾尔(White Labs Old Sonoma Ale)WLP076、怀特实验室圣地亚哥超级酵母(White Labs San Diego Super Yeast)WLP090、怀特实验室惠特布雷德艾尔(White Labs Whitbread Ale)WLP017、怀特实验室北约克郡艾尔(White Labs NorthYorkshire Ale)WLP037、库珀纯啤酒酵母(Coopers Pure Brewers'Yeast)、Siebel Inst.英格兰式艾尔(Siebel Inst.English Ale)BRY 264、芒顿优质黄金(Muntons PremiumGold)、芒顿标准酵母(Muntons Standard Yeast)、拉曼诺丁汉(Lallemand Nottingham)、弗曼迪斯(Fermentis)Safale S-04、弗曼迪斯(Fermentis)Safbrew T-58、拉曼温莎(英式艾尔)(Lallemand Windsor(British Ale))、Real Brewers Yeast Ye Olde English、Brewferm Top、怀特实验室美式威士忌酒(White Labs American Whiskey)WLP065、怀特实验室干式英格兰式艾尔(White Labs Dry English Ale)WLP007、怀特实验室爱丁堡艾尔(White Labs Edinburgh Ale)WLP028、弗曼迪斯(Fermentis)Safbrew S-33、Wyeast苏格兰式艾尔(Wyeast Scottish Ale)1728、东海岸酵母苏格兰式希维(East Coast YeastScottish Heavy)ECY07、怀特实验室超级高比重(White Labs Super High Gravity)WLP099、怀特实验室惠特布雷德艾尔(White Labs Whitbread Ale)WLP017、Wyeast比利时式蓝比克混合物(Wyeast Belgian Lambic Blend)3278、Wyeast比利时式谢德艾尔(WyeastBelgian Schelde Ale)3655-PC、Wyeast柏林白啤酒混合物(Wyeast Berliner-WeisseBlend)3191-PC、Wyeast布雷特酒香酵母布鲁氏菌(Brettanomyces Bruxellensis)5112、Wyeast布雷特酒香酵母兰比克(Brettanomyces Lambicus)5526、Wyeast乳杆菌(WyeastLactobacillus)5335、Wyeast啤酒小球菌(Wyeast Pediococcus Cerevisiae)5733、Wyeast鲁瑟拉勒艾尔混合物(Wyeast Roeselare Ale Blend)3763、Wyeast特拉普派混合物(Wyeast Trappist Blend)3789-Pc、怀特实验室比利时式酸混合体(White Labs BelgianSour Mix)Wlp655、怀特实验室柏林白啤酒混合物(White Labs Berliner Weisse Blend)Wlp630、怀特实验室酵母“布鲁氏菌”三株(White Labs Saccharomyces“Bruxellensis”Trois)Wlp644、怀特实验室布雷特酒香酵母布鲁氏菌(White Labs BrettanomycesBruxellensis)Wlp650、怀特实验室克劳森酒香酵母(White Labs BrettanomycesClaussenii)Wlp645、怀特实验室布雷特酒香酵母兰比克(White Labs BrettanomycesLambicus)Wlp653、怀特实验室弗兰德式艾尔混合物(White Labs Flemish Ale Blend)Wlp665、东海岸酵母柏林混合物(East Coast Yeast Berliner Blend)Ecy06、东海岸酵母(East Coast Yeast)Brett Anomala Ecy04、东海岸酵母Brett Bruxelensis Ecy05、东海岸酵母Brett Custersianus Ecy19、东海岸酵母Brett Nanus Ecy16、斯特兰(Strain)#2、东海岸酵母BugCounty ECY20、东海岸酵母BugFarm ECY01、东海岸酵母农舍布雷特(EastCoast Yeast Farmhouse Brett)ECY03、东海岸酵母弗兰德艾尔(East Coast YeastFlemish Ale)ECY02、东海岸酵母Oud Brune ECY23、Wyeast美式艾尔(Wyeast AmericanAle)1056、Siebel Inst.美式艾尔(Siebel Inst.American Ale)BRY 96、White Labs美式艾尔酵母混合物(White Labs American Ale Yeast Blend)WLP060、怀特实验室波本威士忌酵母(White Labs Bourbon Yeast)WLP070、怀特实验室加利福尼亚艾尔(White LabsCalifornia Ale)V WLP051、怀特实验室加利福尼亚艾尔(White Labs California Ale)WLP001、怀特实验室干式英格兰式艾尔(White Labs Dry English Ale)WLP007、怀特实验室东海岸艾尔(White Labs East Coast Ale)WLP008、怀特实验室中性谷物(White LabsNeutral Grain)WLP078、怀特实验室超级高比重(White Labs Super High Gravity)WLP099、怀特实验室田纳西州(White Labs Tennessee)WLP050、弗曼迪斯(Fermentis)US-05、Real Brewers Yeast Lucky#7、弗曼迪斯(Fermentis)Safbrew S-33、东海岸酵母苏格兰式希维(East Coast Yeast Scottish Heavy)ECY07、拉曼温莎(英式艾尔)(LallemandWindsor(British Ale))、Wyeast美式艾尔(Wyeast American Ale)1056、Wyeast美式艾尔(Wyeast American Ale)II 1272、Wyeast英式艾尔(Wyeast British Ale)1098、Wyeast英式艾尔(Wyeast British Ale)II 1335、Wyeast丹尼的最爱物(Wyeast Denny’s Favorite)50 1450、Wyeast伦敦式艾尔(Wyeast Irish Ale)1028、Wyeast伦敦式艾尔(Wyeast IrishAle)III 1318、Wyeast伦敦式ESB艾尔(Wyeast London ESB Ale)1968、Wyeast西北方艾尔(Wyeast Northwest Ale)1332、Wyeast灵伍德艾尔(Wyeast Ringwood Ale)1187、SiebelInst.美式艾尔(Siebel Inst.American Ale)BRY 96、怀特实验室美式艾尔酵母混合物(White Labs American Ale Yeast Blend)WLP060、怀特实验室贝德福特英式艾尔(WhiteLabs Bedford British Ale)WLP006、怀特实验室英式艾尔(White Labs British Ale)WLP005、怀特实验室伯顿艾尔(White Labs Burton Ale)WLP023、怀特实验室加利福尼亚艾尔(White Labs California Ale)V WLP051、怀特实验室加利福尼亚艾尔(White LabsCalifornia Ale)WLP001、怀特实验室东海岸艾尔(White Labs East Coast Ale)WLP008、怀特实验室英格兰式艾尔(White Labs English Ale)WLP002、怀特实验室伦敦式艾尔(White Labs London Ale)WLP013、怀特实验室埃塞克斯艾尔酵母(White Labs Essex AleYeast)WLP022、怀特实验室太平洋艾尔(White Labs Pacific Ale)WLP041、怀特实验室圣地亚哥超级酵母(White Labs San Diego Super Yeast)WLP090、怀特实验室惠特布雷德艾尔(White Labs Whitbread Ale)WLP017、Brewferm Top、红树林杰克伯顿联盟酵母(Mangrove Jack Burton Union Yeast)、红树林杰克美国西海岸酵母(Mangrove Jack USWest Coast Yeast)、红树林杰克工马啤酒酵母(Mangrove Jack Workhorse Beer Yeast)、库珀纯啤酒酵母(Coopers Pure Brewers’Yeast)、弗曼迪斯(Fermentis)US-05、弗曼迪斯(Fermentis)SafaleS-04、弗曼迪斯(Fermentis)SafbrewT-58、Real Brewers YeastLucky#7、Real Brewers Yeast The One、芒顿优质黄金(Muntons Premium Gold)、芒顿标准酵母(Muntons Standard Yeast)、东海岸酵母东北方艾尔(East Coast YeastNortheast Ale)ECY29、拉曼诺丁汉(Lallemand Nottingham)、拉曼温莎(英式艾尔)(Lallemand Windsor(British Ale))、Wyeast美式艾尔(Wyeast American Ale)1056、Wyeast美式艾尔(Wyeast American Ale)II 1272、Wyeast英式艾尔(Wyeast British Ale)1098、Wyeast英式艾尔(Wyeast British Ale)II 1335、Wyeast泰晤士河谷艾尔(WyeastThames Valley Ale)1275、Wyeast泰晤士河谷艾尔(Wyeast Thames Valley Ale)II 1882-PC、Wyeast西约克郡艾尔(Wyeast West Yorkshire Ale)1469、Wyeast惠特布雷德艾尔(Wyeast Whitbread Ale)1099、Wyeast英式桶艾尔(Wyeast British Cask Ale)1026-PC、Wyeast英格兰式特别苦啤酒(Wyeast English Special Bitter)1768-PC、Wyeast伦敦式艾尔(Wyeast Irish Ale)1028、Wyeast伦敦式艾尔(Wyeast Irish Ale)III 1318、Wyeast伦敦式ESB艾尔(Wyeast London ESB Ale)1968、Wyeast西北艾尔(Wyeast Northwest Ale)1332、Wyeast灵伍德艾尔(Wyeast Ringwood Ale)1187、怀特实验室美式艾尔酵母混合物(White Labs American Ale Yeast Blend)WLP060、怀特实验室英式艾尔(White LabsBritish Ale)WLP005、怀特实验室贝德福特英式艾尔(White Labs Bedford British Ale)WLP006、怀特实验室英式艾尔(White Labs British Ale)WLP005、怀特实验室伯顿艾尔(White Labs Burton Ale)WLP023、怀特实验室加利福尼亚艾尔(White Labs CaliforniaAle)V WLP051、怀特实验室加利福尼亚艾尔(White Labs California Ale)WLP001、怀特实验室东海岸艾尔(White Labs East Coast Ale)WLP008、怀特实验室英格兰式艾尔(WhiteLabs English Ale)WLP002、怀特实验室埃塞克斯艾尔酵母(White Labs Essex AleYeast)WLP022、怀特实验室法式艾尔(White Labs French Ale)WLP072、怀特实验室伦敦式艾尔(White Labs London Ale)WLP013、怀特实验室太平洋艾尔(White Labs PacificAle)WLP041、怀特实验室惠特布雷德艾尔(White Labs Whitbread Ale)WLP017、BrewfermTop、东海岸酵母英式淡味啤酒艾尔(East Coast Yeast British Mild Ale)ECY18、库珀纯啤酒酵母(Coopers Pure Brewers’Yeast)、芒顿优质黄金(Muntons Premium Gold)、芒顿标准酵母(Muntons Standard Yeast)、红树林杰克纽卡斯尔黑色艾尔酵母(Mangrove JackNewcastle Dark Ale Yeast)、拉曼CBC-1(桶内和瓶内加工)(Lallemand CBC-1(Cask andBottle Conditioning))、拉曼诺丁汉(Lallemand Nottingham)、拉曼温莎(英式艾尔)(Lallemand Windsor(British Ale))、弗曼迪斯(Fermentis)Safale S-04、弗曼迪斯(Fermentis)US-05、Siebel Inst.美式艾尔(Siebel Inst.American Ale)BRY 96、Wyeast美式小麦(Wyeast American Wheat)1010、Wyeast德式艾尔(Wyeast German Ale)1007、Wyeast
Figure BDA0003697676550000351
2565、Wyeast Kolsch II 2575-PC、怀特实验室比利时式拉格啤酒(WhiteLabs Belgian Lager)WLP815、怀特实验室杜塞尔多夫(White Labs Dusseldorf)AltWLP036、怀特实验室欧洲式艾尔(White Labs European Ale)WLP011、怀特实验室德式艾尔(White Labs German Ale)/
Figure BDA0003697676550000352
WLP029、东海岸酵母
Figure BDA0003697676550000353
ECY21、红树林杰克工马啤酒酵母(Mangrove Jack Workhorse Beer Yeast)、Siebel Inst.Alt艾尔(Ale)BRY144、Wyeast美式艾尔(Wyeast American Ale)1056、Wyeast美式艾尔(Wyeast AmericanAle)II 1272、Wyeast英式艾尔(Wyeast British Ale)1098、Wyeast英式艾尔(WyeastBritish Ale)II 1335、(Wyeast Denny’s Favorite50 1450、Wyeast英国特别苦啤酒(Wyeast English Special Bitter)1768-PC、Wyeast爱尔兰式艾尔(Wyeast Irish Ale)1084、Wyeast伦敦式艾尔(Wyeast Irish Ale)1028、Wyeast伦敦式艾尔(Wyeast IrishAle)III 1318、Wyeast伦敦式ESB艾尔(Wyeast London ESB Ale)1968、Wyeast西北方艾尔(Wyeast Northwest Ale)1332、Wyeast灵伍德艾尔(Wyeast Ringwood Ale)1187、Wyeast泰晤士河谷艾尔(Wyeast Thames Valley Ale)1275、Wyeast泰晤士河谷艾尔(Wyeast ThamesValley Ale)II 1882-PC、Wyeast西约克郡艾尔(Wyeast West Yorkshire Ale)1469、Wyeast惠特布雷德艾尔(Wyeast Whitbread Ale)1099、怀特实验室美式艾尔酵母混合物(White Labs American Ale Yeast Blend)WLP060、怀特实验室贝德福特英式艾尔(WhiteLabs Bedford British Ale)WLP006、怀特实验室英式艾尔(White Labs British Ale)WLP005、怀特实验室伯顿艾尔(White Labs Burton Ale)WLP023、怀特实验室加利福尼亚艾尔(White Labs California Ale)V WLP051、怀特实验室加利福尼亚艾尔(White LabsCalifornia Ale)WLP001、怀特实验室东海岸艾尔(White Labs East Coast Ale)WLP008、怀特实验室东密德兰艾尔(White Labs East Midlands Ale)WLP039、怀特实验室英格兰式艾尔(White Labs English Ale)WLP002、怀特实验室埃塞克斯艾尔酵母(White LabsEssex Ale Yeast)WLP022、怀特实验室爱尔兰式艾尔(White Labs Irish Ale)WLP004、怀特实验室伦敦式艾尔(White Labs London Ale)WLP013、怀特实验室老索诺玛艾尔(WhiteLabs Old Sonoma Ale)WLP076、怀特实验室太平洋艾尔(White Labs Pacific Ale)WLP041、怀特实验室惠特布雷德艾尔(White Labs Whitbread Ale)WLP017、库珀纯啤酒酵母(Coopers Pure Brewers’Yeast)、(Fermentis US-05、芒顿优质黄金(Muntons PremiumGold)、芒顿标准酵母(Muntons Standard Yeast)、弗曼迪斯(Fermentis)Safale S-04、拉曼诺丁汉(Lallemand Nottingham)、拉曼温莎(英式艾尔)(Lallemand Windsor(BritishAle))、Siebel Inst.美式艾尔(Siebel Inst.American Ale)BRY 96、怀特实验室美式小麦啤酒艾尔(White Labs American Hefeweizen Ale)320、怀特实验室(White Labs)Bavarian Weizen艾尔(Ale)351、怀特实验室比利时式威特艾尔(White Labs Belgian WitAle)400、怀特实验室比利时式威特艾尔(White Labs Belgian Wit Ale)II410、怀特实验室小麦啤酒艾尔(White Labs Hefeweizen Ale)300、怀特实验室小麦啤酒IV艾尔(WhiteLabs Hefeweizen IV Ale)380、Wyeast美式小麦(Wyeast American Wheat)1010、Wyeast巴伐利亚小麦(Wyeast Bavarian Wheat)3638、Wyeast巴伐利亚小麦混合物(WyeastBavarian Wheat Blend)3056、Wyeast比利时阿登(Wyeast Belgian Ardennes)3522、Wyeast比利时式小麦(Wyeast Belgian Wheat)3942、Wyeast比利时小麦啤酒(WyeastBelgian Witbier)3944、Wyeast加拿大式/比利时式艾尔(Wyeast Canadian/Belgian Ale)3864-PC、Wyeast禁止水果酵母(Wyeast Forbidden Fruit Yeast)3463、Wyeast德式小麦(Wyeast German Wheat)3333、Wyeast Weihenstephan Weizen 3068、Siebel InstituteBavarian Weizen BRY 235、弗曼迪斯(Fermentis)Safbrew WB-06、红树林杰克巴伐利亚小麦(Mangrove Jack Bavarian Wheat)、拉曼Lallemand)Munich(德国小麦啤酒)、布鲁斯布兰奇(Brewferm Blanche)、布鲁斯拉格啤酒(Brewferm Lager)、东海岸酵母比利时式怀特(East Coast Yeast Belgian White)ECY11。在一些实施方式中，酵母是酿酒酵母菌株WLP001。
在一些实施方式中，与本文所述的基因修饰的细胞和方法一起使用的酵母菌株是葡萄酒酵母菌株。与本文所述的基因修饰的细胞和方法一起使用的酵母菌株的示例包括但不限于红星蒙哈榭(Red Star Montrachet)、红星白丘(Red Star Cote des Blancs)、红星一级特酿(Red Star Premier Cuvee)、红星巴斯德红(Red Star Pasteur Red)、红星巴斯德香槟(Red Star Pasteur Champagne)、弗曼迪斯(Fermentis)BCS-103和弗曼迪斯(Fermentis)VR44。
方法
本公开的方面涉及使用本文所述的任何基因修饰的酵母细胞产生发酵产物的方法。还提供了使用本文所述的任何基因修饰的酵母细胞产生乙醇的方法。
发酵工艺利用了使用微生物将碳水化合物转化为酒精和二氧化碳的自然过程。它是一种代谢过程，通过酶促作用使有机底物产生化学变化。在食物生产的背景下，发酵泛指微生物的活性为食物产物或饮料带来期望变化的任何过程。发酵的条件和发酵的进行在本文中被称为“发酵工艺”。
在一些方面中，本公开涉及产生发酵产物，比如发酵饮料的方法，其涉及在第一发酵工艺期间使本文所述的任何修饰的细胞与包括至少一种可发酵的糖的培养基接触，以产生发酵产物(图1A-1G)。如本文使用的，“培养基”是指有助于发酵的液体，意味着不抑制或阻止发酵工艺的液体。在一些实施方式中，培养基是水。在一些实施方式中，产生发酵产物的方法涉及在第一发酵工艺期间使纯化的酶(例如，本文所述的任何β-裂合酶)与包括至少一种可发酵的糖的培养基接触，以产生发酵产物(图1H)。
也如本文使用的，术语“可发酵的糖”是指可被微生物，比如本文所述的任何细胞转化为酒精和二氧化碳的碳水化合物。在一些实施方式中，可发酵的糖通过酶，比如重组酶或表达酶的细胞转化为酒精和二氧化碳。可发酵的糖的示例包括但不限于葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖和麦芽三糖。
在一些实施方式中，可发酵的糖在糖源中提供。用于要求保护的方法中的糖源可以取决于例如，发酵产物和可发酵的糖的类型。糖源的示例包括但不限于麦芽汁、谷物(grain)/谷类植物(cereal)、水果果汁(例如，葡萄果汁、苹果果汁/苹果酒)、蜂蜜、蔗糖、水稻和酒曲。
如对本领域普通技术人员将是显而易见的，在一些情况下，可能需要加工糖源以使可发酵的糖可用于发酵。使用啤酒生产作为示例发酵饮料，将谷物(谷类植物，大麦)煮沸或浸泡在水中，使谷物水合并且激活麦芽酶，将淀粉转化为可发酵的糖，称为“糖化”。如本文使用的，术语“麦芽汁”是指在糖化工艺中产生的液体，其含有可发酵的糖。然后将麦芽汁暴露于发酵生物体(例如，本文所述的任何细胞)，这允许发酵生物体的酶将麦芽汁中的糖转化为酒精和二氧化碳。在一些实施方式中，使麦芽汁与重组酶(例如，本文所述的任何酶)接触，所述重组酶可任选地从产生酶的生物体中纯化或分离，从而允许酶将麦芽汁中的糖转化为酒精和二氧化碳。
在一些实施方式中，谷物是发芽的、未发芽的，或包括发芽和未发芽的谷物的组合。用于本文所述方法的谷物的示例包括但不限于大麦、燕麦、玉米、水稻、黑麦、高粱、小麦、karasumugi和鸠麦(Hatomugi)。
在产生清酒的示例中，糖源是水稻，其用曲霉(Aspergillus oryzae)孵育将大米淀粉转化为可发酵的糖，产生酒曲。然后将酒曲暴露于发酵生物体(例如，本文所述的任何细胞)，其允许发酵生物体的酶将酒曲中的糖转化为酒精和二氧化碳。在一些实施方式中，使酒曲与重组酶(例如本文所述的任何酶)接触，其可任选地从产生酶的生物体中纯化或分离，从而允许酶将酒曲中的糖转化为酒精和二氧化碳。
在产生葡萄酒的示例中，葡萄被收获、捣碎(例如，碾碎)成含有果皮、固形物、果汁和种子的组合物。所得组合物被称为“原汁(must)”。葡萄果汁可以从原汁中分离并且被发酵，或全部原汁(即，具有果皮、种子、固形物)可以被发酵。然后将葡萄果汁或原汁暴露于发酵生物体(例如，本文所述的任何细胞)，其允许发酵生物体的酶将葡萄果汁或原汁中的糖转化为酒精和二氧化碳。在一些实施方式中，葡萄果汁或原汁与重组酶(例如，本文所述的任何酶)接触，所述重组酶可任选地从产生酶的生物体中纯化或分离，从而允许酶将葡萄果汁或原汁中的糖转化为酒精和二氧化碳。
在一些实施方式中，本文所述的方法涉及产生培养基，这可涉及加热或浸泡糖源，例如在水中。在一些实施方式中，水具有至少50摄氏度(50℃)的温度并且与糖源一起孵育一段时间。在一些实施方式中，水具有至少75℃的温度并且与糖源一起孵育一段时间。在一些实施方式中，水具有至少100℃的温度并且与糖源一起孵育一段时间。优选地，在添加本文所述的任何细胞之前冷却培养基。
在一些实施方式中，本文所述的方法进一步包括在第一发酵工艺期间将至少一种前体(例如，植物来源的或化学合成的)添加到培养基中(图1G)。前体的示例包括但不限于3-巯基己-1-醇(Cys 3-MH)、半胱氨酸-缀合的4-甲基-4-巯基戊-2-酮(Cys 4MMP)、谷胱甘肽-缀合的3-巯基己-1-醇(Glut-3-MH)和/或谷胱甘肽缀合的4-甲基-4-巯基戊2-酮(Glut4MMP)。在一些实施方式中，前体是植物衍生的前体。在一些实施方式中，前体是化学合成的前体。产生和/或获得前体的方法在本领域是已知的，例如，Grant-Preece等,J.Agric.FoodChem.(2010)58(3):1383-1389；Fedrizzi等,J.Agric.Food Chem.(2009)57(3):991-995；Pardon等,J.Agric.Food Chem.(2008)56(10):3758-3763；Howell等,FEMSMicrobiol.Lett.(2004)240(2):125-9。
在一些实施方式中，本文所述的方法进一步包括在发酵工艺期间将至少一种(例如，1、2、3、4、5或更多种)啤酒花种类添加到例如培养基中，麦芽汁中。啤酒花是啤酒花植物(Humulus lupulus)的花，并且通常用于发酵以赋予发酵产物各种风味和香气。除了花香、果香和/或柑橘风味和香气之外，啤酒花被认为赋予苦风味，并且可以基于预期目的进行表征。例如，由于啤酒花花中α酸的存在，苦味啤酒花赋予发酵产物一定程度的苦味，而香气啤酒花具有较低的α酸，并且为发酵产物贡献所需的香气和风味。
是否将一个或多个种类的啤酒花添加到培养基和/或麦芽汁中以及在哪个阶段添加啤酒花可基于各种因素，比如啤酒花的预期目的。例如，旨在赋予发酵产物苦味的啤酒花通常在制备麦芽汁期间，例如在煮沸麦芽汁期间添加。在一些实施方式中，将旨在赋予发酵产物苦味的啤酒花添加到麦芽汁中并且与麦芽汁一起煮沸一段时间，例如约15-60分钟。而旨在赋予发酵产物所需香味的啤酒花通常比用于苦味的酒花更晚添加。在一些实施方式中，将旨在赋予发酵产物所需香味的啤酒花在煮沸结束时或在麦芽汁煮沸之后添加(即，“啤酒花干泡(dry hopping)”)。在一些实施方式中，将一个或多个种类的啤酒花在方法期间以多次(例如，至少两次、至少三次或更多次)添加。
在一些实施方式中，啤酒花以湿或干啤酒花的形式添加，并且可以任选地与麦芽汁一起煮沸。在一些实施方式中，啤酒花是以干啤酒花小球的形式。在一些实施方式中，将至少一个种类的啤酒花添加到培养基中。在一些实施方式中，啤酒花是湿的(即，未干燥的)。在一些实施方式中，啤酒花是干的，并且任选地可以在使用之前进一步加工。在一些实施方式中，啤酒花在发酵工艺之前添加到麦芽汁中。在一些实施方式中，啤酒花在麦芽汁中煮沸。在一些实施方式中，啤酒花与麦芽汁一起煮沸，并且然后与麦芽汁一起冷却。
许多种类的啤酒花在本领域是已知的并且可以用于本文所述的方法。啤酒花种类的示例包括但不限于Ahtanum、Amarillo、Apollo、Cascade、Centennial、Chinook、Citra、Cluster、Columbus、Crystal/Chrystal、Eroica、Galena、Glacier、Greenburg、Horizon、Liberty、Millennium、Mosaic、Mount Hood、Mount Rainier、Newport、Nugget、Palisade、Santiam、Simcoe、Sterling、Summit、Tomahawk、Ultra、Vanguard、Warrior、Willamette、Zeus、Admiral、Brewer's Gold、Bullion、Challenger、First Gold、Fuggles、Goldings、Herald、Northdown、Northern Brewer、Phoenix、Pilot、Pioneer、Progress、Target、Whitbread Golding Variety(WGV)、Hallertau、Hersbrucker、Saaz、Tettnang、Spalt、Feux-Coeur Francais、Galaxy、Green Bullet、Motueka、Nelson Sauvin、Pacific Gem、Pacific Jade、Pacifica、Pride of Ringwood、Riwaka、Southern Cross、Lublin、Magnum、Perle、Polnischer Lublin、Saphir、Satus、Select、Strisselspalt、Styrian Goldings、Tardif de Bourgogne、Tradition、Bravo、Calypso、Chelan、Comet、El Dorado、San JuanRuby Red、Satus、Sonnet Golding、Super Galena、Tillicum、Bramling Cross、Pilgrim、Hallertauer Herkules、Hallertauer Magnum、Hallertauer Taurus、Merkur、Opal、Smaragd、Halleratau Aroma、Kohatu、Rakau、Stella、Sticklebract、Summer Saaz、SuperAlpha、Super Pride、Topaz、Wai-iti、Bor、Junga、Marynka、Premiant、Sladek、StyrianAtlas、Styrian Aurora、Styrian Bobek、Styrian Celeia、Sybilla Sorachi Ace、Hallertauer Mittelfrueh、Hallertauer Tradition、Tettnanger、Tahoma、Triple Pearl、Yahima Gold和Michigan Copper。
在一些实施方式中，包括至少一种可发酵的糖的至少一种糖源的发酵工艺可以进行约1天至约30天。在一些实施方式中，发酵工艺进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或更长。在一些实施方式中，一种或多种可发酵的糖的发酵工艺可以在约4℃至约30℃的温度进行。在一些实施方式中，一种或多种可发酵的糖的发酵工艺可以在约8℃至约14℃或约18℃至约24℃的温度进行。在一些实施方式中，一种或多种可发酵的糖的发酵工艺可以在约4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃的温度进行。
本文所述的方法可以涉及至少一种另外的发酵工艺，例如如图1D中显示的。这种另外的发酵方法可以称为二次发酵工艺(也称为“老化(aging)”或“成熟(maturing)”)。如本领域普通技术人员将理解的，二次发酵通常涉及将发酵饮料转移到第二容器(receptacle)(例如，玻璃酸瓶(glass carboy)、桶)中，其中将发酵饮料孵育一段时间。在一些实施方式中，二次发酵进行10分钟和12个月之间的一段时间。在一些实施方式中，二次发酵进行10分钟、20分钟、40分钟、40分钟、50分钟、60分钟(1小时)、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长。在一些实施方式中，一种或多种可发酵的糖的另外或二次发酵工艺可以在约4℃至约30℃的温度进行。在一些实施方式中，一种或多种可发酵的糖的另外或二次发酵工艺可以在约8℃至约14℃或约18℃至约24℃的温度进行。在一些实施方式中，一种或多种可发酵的糖的另外或二次发酵过程可以在约4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃的温度进行。
对本领域普通技术人员将是显而易见的，用于另外或二次发酵工艺的时间段和温度的选择将取决于比如啤酒的类型、所需啤酒的特性和方法中使用的酵母菌株的因素。
在一些实施方式中，在发酵工艺之前或之后将一种或多种另外的风味组分添加到培养基中。示例包括啤酒花油、啤酒花芳香剂、啤酒花提取物、啤酒花苦味剂和异构化的啤酒花提取物。
发酵后可发生各种精制、过滤和老化工艺，然后将液体装瓶(例如，捕获并且密封在容器中以分配、储存或消耗)。本文所述的任何方法可进一步涉及使发酵产物蒸馏、巴氏杀菌和/或碳酸化。在一些实施方式中，方法包括使发酵产物碳酸化，例如如图1E中显示的。使发酵饮料碳酸化的方法是本领域中已知的并且包括例如用气体(例如二氧化碳、氮气)强制碳酸化，通过向发酵饮料添加另外的糖源天然地碳酸化，以促进进一步发酵和产生二氧化碳(例如，瓶内加工)。
发酵产物
本公开的方面涉及通过本文公开的任何方法产生的发酵产物。在一些实施方式中，发酵产物是发酵饮料。发酵饮料的示例包括但不限于啤酒、葡萄酒、清酒、蜂蜜酒、苹果酒、卡瓦酒(cava)、气泡酒(香槟)、康普茶、姜汁啤酒、水酸乳酒。在一些实施方式中，饮料是啤酒。在一些实施方式中，饮料是葡萄酒。在一些实施方式中，饮料是清酒。在一些实施方式中，饮料是蜂蜜酒。在一些实施方式中，饮料是苹果酒。
在一些实施方式中，发酵产物是发酵食品产物。发酵食品产物的示例包括但不限于发酵酸奶(cultured yogurt)、豆豉、味噌、泡菜、酸菜、发酵香肠、面包、酱油。
根据本发明的方面，通过在酵母细胞中重组表达与本发明相关的基因以及在本文所述的方法中使用细胞来产生增加效价的挥发性硫醇。如本文使用的，“增加效价”或“高效价”是指以纳克每升(ng L-1)等级计的效价。给定产物产生的效价将受到包括培养基的选择和发酵条件的多种因素的影响。
在一些实施方式中，挥发性硫醇(例如，3MH、3MHA和/或4MMP)的效价是至少100ngL-1。例如，效价可以是至少100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1050、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000或大于3000ng L-1。
在一些实施方式中，挥发性硫醇的效价是至少1μg L-1，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1050、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000μg L-1。
在一些实施方式中，挥发性硫醇的效价是至少1mg L-1，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1050、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000mg L-1或更多。
在一些实施方式中，挥发性硫醇的效价受添加至发酵工艺的前体的量限制。
本公开的方面涉及在产物发酵期间减少不希望的产物(例如，副产物，异味)比如吲哚的产生。在一些实施方式中，相对于使用野生型β-裂合酶的不希望的产物(例如，吲哚)的产生，本文所述的β-裂合酶的表达减少了约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的不希望的产物的产生。
测量挥发性硫醇和/或吲哚的效价/水平的方法对本领域普通技术人员将是显而易见的。在一些实施方式中，挥发性硫醇和/或吲哚的效价/水平使用气相色谱质谱(GC/MS)测量。在一些实施方式中，挥发性硫醇和/或吲哚的效价/水平使用感官小组，包括例如人类味觉测试者评估。
在一些实施方式中，发酵饮料含有按体积计0.1％和30％之间的醇(也称为“ABV”、“abv”或“alc/vol”)。在一些实施方式中，发酵饮料含有按体积计约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.07％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％或更多的醇。在一些实施方式中，发酵饮料是非酒精的(例如，具有按体积计小于0.5％的醇)。
试剂盒
本公开的方面还提供了使用基因修饰的酵母细胞，例如来产生发酵产物或乙醇的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒含有修饰的细胞，所述修饰的细胞含有编码具有β-裂合酶活性的酶的异源基因。
在一些实施方式中，试剂盒用于产生发酵饮料。在一些实施方式中，试剂盒用于产生啤酒。在一些实施方式中，试剂盒用于产生葡萄酒。在一些实施方式中，试剂盒用于产生清酒。在一些实施方式中，试剂盒用于产生蜂蜜酒。在一些实施方式中，试剂盒用于产生苹果酒。
试剂盒还可包括用于本文所述的任何方法的或用于本文所述的任何细胞的其他组分。例如，在一些实施方式中，试剂盒可含有谷物、水、麦芽汁、原汁、酵母、啤酒花、果汁或其他糖源。在一些实施方式中，试剂盒可含有一种或多种可发酵的糖。在一些实施方式中，试剂盒可含有一种或多种另外试剂、成分或组分。
进行本文所述方法的说明也可包括在本文所述的试剂盒中。
可以安排试剂盒以指示含有本文所述的任何修饰的细胞的单次使用组合物(single use composition)。例如，单次使用组合物(例如，待使用的量)可以是包装的组合物(例如，修饰的细胞)，比如打包的(即包含在小包中)粉末、小瓶、安瓿、培养管、片剂、囊片、胶囊或含有液体的小袋。
组合物(例如，修饰的细胞)可以以干燥、冻干、冷冻或液体形式提供。在一些实施方式中，修饰的细胞在琼脂培养基上以菌落提供。在一些实施方式中，修饰的细胞可以以pitch可直接投入培养基中的起子培养物(starter culture)的形式提供。当试剂或组分以干燥形式提供时，重构通常通过添加溶剂，比如培养基。溶剂可以以另一包装方式提供并且可以由本领域技术人员选择。
本领域技术人员已知许多包装或试剂盒用于分配组合物(例如，修饰的细胞)。在某些实施方式中，包装是贴标签的泡罩包装、刻度盘分配器包装、管、小包、鼓状物(drum)或瓶子。
本文所述的任何试剂盒可进一步包括一个或多个用于进行本文所述方法的容器，例如玻璃酸瓶或桶(barrel)。
通用技术
除非另有说明，否则本公开主题的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术内。在文献中充分地解释了这些技术，比如，但不限于，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:ALaboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell,eds.,1993-8)J.Wiley和Sons；Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell,eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Millerand M.P.Calos,eds.,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等,eds.,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等,eds.,1994)；CurrentProtocols in Immunology(J.E.Coligan等,eds.,1991)；Short Protocols in MolecularBiology(Wiley and Sons,1999)。
等效物和范围
应当理解，本公开不限于本文明确描述的任何或所有特定实施方式，并且因此当然可以变化。还应理解，本文使用的术语仅仅用于描述特别的实施方式的目的并且不旨在是限制性的。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料也可以用于本公开的实践或测试，但是现在描述了优选的方法和材料。
引用本公开中引用的所有出版物和专利以公开和描述与引用该出版物相关的方法和/或材料。所有这些出版物和专利都通过引用并入本文，好像每个单独的出版物或专利被具体地和单独地指示通过引用并入一样。这种通过引用并入明确限于所引用的出版物和专利中描述的方法和/或材料，并且不延伸到所引用的出版物和专利中的任何词典定义(即，不是在本公开中也明确重复的引用的出版物和专利中的任何词典定义不应被视为这样并且不应被理解为定义出现在所附权利要求中的任何术语)。如果任何并入的参考文献与本公开内容之间存在冲突，应以本公开内容为准。此外，落入现有技术的本公开的任何特定实施方式可以明确地排除在任何一项或多项权利要求之外。因为这种实施方式被认为是本领域普通技术人员已知的，所以即使本文没有明确陈述排除，它们也可以被排除。出于任何原因，无论是否与现有技术的存在相关，本公开的任何特定实施方式都可以从任何权利要求中排除。
对任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开内容，不应解释为承认本公开无权凭借在先公开而早于这种出版物。进一步，提供的公布日期可与可能需要独立确认的实际公开日期不同。
如本领域技术人员在阅读本公开后将显而易见的，本文描述和说明的每个单独的实施方式具有不同的组分和特征，它们可以容易地与任何其他几个实施方式中的特征分离或组合而不背离脱离本公开的范围或精神。任何列举的方法都可以按照列举的事件的顺序或任何其他逻辑上可能的顺序来执行。
在权利要求书中，比如“一个(a/and)”、“一种(a/an)”和“所述”的冠词可以表示一个或多于一个，除非有相反的说明或另外从上下文中明显看出。无论在本文何处使用性别代词(例如，男性、女性、中性、其他等)，代词应解释为性别中性(即解释为平等地指代所有性别)，无论隐含的性别如何，除非上下文清楚地表明或另有要求。无论在何处使用，以单数使用的词语包括复数，并且以复数使用的词语包括单数，除非上下文清楚地表明或要求其他。如果一个、多于一个或所有组成员存在于、采用于给定产物或工艺中或以其他方式与给定产品或工艺相关，则认为在组的一个或多个成员之间包含“或”的权利要求或描述已满足，除非从上下文有相反的或其他明显的说明。本公开包括其中该组中的一个成员恰好存在于、采用于给定产物或工艺中或以其他方式与给定产物或工艺相关的实施方式。本公开包括其中一个以上或所有组成员存在于、采用于给定产物或工艺中或以其他方式与给定产物或工艺相关的实施方式。
此外，本公开涵盖所有变体、组合和排列，其中将来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、要素、条款和描述性术语引入另一权利要求。例如，可以修改从属于另一权利要求的任何权利要求以包括在从属于相同基本权利要求的任何其他权利要求中发现的一个或多个限制。以列表呈现元素(例如，以马库什组格式)的情况下，还公开了元素的每个子组，并且可以从组中去除任何元素。应当理解，一般而言，在本公开或本公开的方面被称为包括特定元素和/或特征的情况下，本公开的某些实施方式或本公开的方面由这样的元素和/或特征组成或基本上由这样的元素和/或特征组成。为简化起见，那些实施方式并未在本文中用同样的话具体地陈述。还应注意，术语“包括”和“含有”旨在是开放式的并且允许包含另外的元素或步骤。在给出范围的情况下，除非另有说明，端点都包括在这些范围内。此外，除非另有说明或从上下文和本领域普通技术人员的理解中显而易见，表示为范围的值可以假定在本公开的不同实施方式中所述范围内的任何特定值或子范围，范围下限的单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定与本文所述的特定实施方式的许多等效物。本文所述的本实施方式的范围不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求中陈述的。本领域技术人员将认识到，在不背离本公开的精神或范围的情况下，可以对该说明书进行各种改变和修改，如以下权利要求中所限定的。
实施例
实施例1
介绍
挥发性硫醇分子像3MH、3MHA和4MMP是某些食品和饮料中发现的热带水果风味的主要贡献者。在葡萄酒工业内，已经进行了显著的研究努力，以提高酵母菌属葡萄酒酵母在葡萄原汁的发酵期间对这些挥发性硫醇的生物合成。这些努力主要集中在提高β-裂合酶催化的酶促反应的效率，该酶促反应从其半胱氨酸缀合物前体产生3MH和4MMP。几个小组已经表明，内源性酵母β-裂合酶IRC7和STR3的过度表达可以提高葡萄原汁或合成葡萄媒介发酵期间挥发性硫醇的产生7，10。在酵母细胞中大肠杆菌(E.coli)色氨酸酶/β-裂合酶TnaA的表达大大提高了模型葡萄果汁和白苏维浓果汁发酵期间挥发性硫醇的产生5，30。
WLP001H463F突变增加3MH浓度，同时抑制吲哚产生
研究了在酵母菌属啤酒酵母中IRC7、STR3或TnaA的过度表达是否会提高啤酒发酵期间挥发性硫醇的释放。反过来，这些基因中的每一个都被整合到加利福尼亚艾尔酵母(California Ale Yeast)WLP001的ADE2基因座中。强组成型启动子PGK1用于驱动异源基因的表达。
使用过度表达IRC7、STR3或TnaA的酵母菌株以及非工程化的WLP001对照(野生型)酿造啤酒。发酵之后，感官分析表明，用过度表达STR3或IRC7的酵母细胞的过度表达菌株发酵的啤酒具有与野生型对照菌株相当的气味特征。而由过度表达TnaA的酵母细胞发酵的啤酒具有明显的强烈气味，其特征为热带/番石榴和粪便/尿布(即，异味)。
为了定量测量每个这些发酵期间产生的挥发性硫醇和其他风味分子的浓度，对这些啤酒进行了气相色谱/质谱(GC/MS)分析。分析显示，野生型菌株酿造的啤酒中挥发性硫醇3MH、3MHA和4MMP的浓度非常低，显著低于该试验的5纳克每升(ng/L)检测限。STR3或IRC7的过度表达对挥发性硫醇产生的影响可以忽略不计，并且由这些菌株酿造的啤酒中这些硫醇的水平也低于检测限(图3，Y27和Y33)。而使用过度表达TnaA的酵母菌株(Y182)酿造的啤酒含有229ng/L的3MH，与使用野生型菌株酿造的啤酒相比增加超过45倍(图3)。
TnaA表达还导致增加产生其他未鉴定的硫醇分子(未显示)，以及大量产生吲哚(302μg/L)，一种已知赋予强烈粪便气味的异味分子(图3)。从这些数据可以得出结论，酿造酵母中的TnaA表达增加了3MH和其他挥发性硫醇的浓度，这些挥发性硫醇在啤酒中赋予热带水果风味，然而其也增加了异味、不希望的产物吲哚的产生。
先前的研究发现，TnaA通过色氨酸的裂解催化吲哚的产生30。不希望受任何特定理论的束缚，假设由过度表达TnaA的酵母细胞发酵的啤酒中吲哚的增加产生是由于TnaA的色氨酸的裂解。然后对TnaA进行工程化以降低作为底物的色氨酸的活性，同时通过突变氨基酸H463以产生TnaA-H463F变体，保持与是热带水果风味的挥发性硫醇前体的半胱氨酸缀合物底物的相对高活性。
已经报道了几种具有底物色氨酸和半胱氨酸缀合物S-乙基-L-半胱氨酸的TnaA突变体的活性25。来自文献的数据显示，H463F突变的引入会使具有色氨酸的TnaA活性降低>2000倍，而具有S-乙基-L-半胱氨酸的活性仅降低2倍。
TnaA-H463F突变被整合到WLP001菌株中，并且用于用以上描述的麦芽汁发酵产生啤酒。发现成品啤酒具有强烈的番石榴/木瓜香味，与使用表达野生型TnaA的酵母酿造的啤酒相比，不含有任何粪便气味。GC/MS分析显示用表达TnaA-H463F的酵母发酵的啤酒中吲哚的浓度可忽略不计(图3，Y502)。令人惊讶地，虽然先前报道了H463F取代降低了具有半胱氨酸缀合物的TnaA酶的活性，但与使用表达野生型TnaA的酵母细胞产生的啤酒相比，使用表达TnaA-H463F的酵母细胞产生的啤酒中3MH浓度增加了～25％。用TnaA-H463F突变体酿造的啤酒中3MH浓度是285ng/L，与用Y182和野生型酵母菌株酿造的啤酒相比，分别增加了1.2倍和56倍。
这些数据表明，啤酒酿造酵母菌株中TnaA-H463F的表达驱动了啤酒中3MH的强烈产生，并且还减少了不希望的吲哚的产生。此外，相对于使用表达野生型TnaA的酵母细胞产生的3MH水平，还出人意料地发现TnaA中的H463F突变增加了啤酒中3MH的产生。
方法
酿造酵母菌株的构建
这里使用的TnaA编码序列源自无丙二酸柠檬酸杆菌和优化用于在酵母菌属酵母中表达的密码子。该编码序列由TWIST Bioscience(San Francisco,CA)合成，并且克隆至质粒中，使得其侧翼为源自酿酒酵母的PGK1启动子和ENO1终止子序列。该质粒还含有酿酒酵母ADE2编码序列和调节区，以及另外编码与ADE2基因座同源的序列，以使基因组能够通过同源重组插入酿造酵母中。TnaA-H463F基因通过PCR诱变制造，使用该质粒作为模板。本工作中使用的STR3和IRC7编码序列从葡萄酒酵母菌株VL3中进行PCR扩增，并且类似地克隆至整合质粒中。
在转化到酵母中之前，用限制性内切酶消化质粒以产生含有ADE2和感兴趣的基因的线性DNA片段，两侧是ADE2同源区。将线性DNA转化到携带ADE2编码序列缺失的酿造酵母菌株WLP001中，导致编码TnaA-H463F基因的核酸的同源重组。
转化后三天，基于TnaA-ADE2核酸的腺嘌呤生物合成途径的拯救选择白色菌落，并且通过诊断性PCR筛选用于在ADE2基因座处插入ADE2/TnaA-H463F DNA。
啤酒酿造
将菌株在YPD培养基上划线并且在25℃生长3天。单菌落用于在玻璃培养管中接种初始5毫升(mL)麦芽提取物(ME，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)培养物，其在25℃以200转每分钟(rpm)摇动生长1天。使用所得培养基来在2L玻璃锥形瓶中接种1(L)ME培养物，并且然后其在25℃以200rpm摇动生长2天。然后使用所得培养基以在圆锥形发酵罐中接种20L啤酒麦芽汁，并且在20℃生长10天。
对于啤酒发酵，将28.6千克(kg)的2排麦芽(2-Row malt)研磨，与2.3kg燕麦合并且，并且添加至用39克(g)的酿造盐处理过的100L水中。在67℃进行糖化60分钟(min)。允许麦芽汁再循环10min并且通过过滤(lautering)分离。进行喷洒(sparging)37min，在146L的酿造锅中得到最终预煮体积。将麦芽汁煮沸直至其达到137L的最终体积和12.6柏拉图(Plato)的重(gravity)。将五十八克Warrior啤酒花颗粒添加到锅中并且煮沸1小时(h)。除非另有说明，否则成分均来源于Brewers Supply Group(Shakopee，MN，USA)。将麦芽汁与热酿(hot trub)分离后，将其转移到六个20L圆锥形发酵罐(SS Brewtech，Temecula，CA，USA)。啤酒在20℃发酵直至它们达到最终的重，保持另外24h以去除附近的二酮(VDK)，然后在0℃条件冷却以产生成品啤酒，随后其通过气相色谱质谱分析对挥发性硫醇和吲哚进行分析。
GC/MS分析
3巯基己醇和吲哚通过气相色谱/质谱(GC/MS)分析进行定量，使用Agilent 6890系列GC和5973N质量选择检测器，电子离子源在阳性模式下运行(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)。对于所有实验，氦气(He)用作载气，以1.0mL/min的恒定速率流入HP-5ms色谱柱(Agilent，30m长度，0.25mm内径(i.d.)，0.25μm薄膜厚度)。烘箱温度在50℃保持3min，随后以10℃/min渐升至275℃的温度并且保持1min，随后以50℃/min渐升至325℃的最终温度并且保持5min。所有试剂和标准品从Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA获取。
对于每种分析物优化了取样和离子监测：为了量化3巯基己醇，200mL成品啤酒用于分析。添加1g EDTA二钠盐和2g NaCl并且在分液漏斗中用23mL戊烷提取样品两次。合并有机相，然后用20mL NaHCO3(0.3％重量对体积(weight to volume)(w/v)，pH 6)洗涤。将硫醇去质子化并且通过反萃取从有机相提取至6mL冷的(4℃)1N NaOH。然后将水相转移至20mL顶层空间取样瓶(headspace vial)中。通过使N2气体的稳定气流流过样品上7min去除残留的戊烷。添加100微升(μL)的2,3,4,5,6-五氟溴苄(EtOH中的0.4％v/v)并且用螺帽密封小瓶并且在室温衍生20min。然后添加0.5g酒石酸以将样品的pH降低至～4.5。添加2gNaCl，然后重新密封小瓶。在70℃，将衍生的硫醇吸附到PDMS/DVB固相微萃取纤维上1小时。然后使用不分流进样在250℃将分析物解吸到色谱柱上10min。通过选择性监测m/z离子133和181检测衍生的硫醇。使用MassHunter软件(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)对3巯基己醇的峰面积进行定量。绝对样品浓度使用包括真实标准品的标准曲线生成的线性模型并且使用181作为定量离子来计算。
为了量化吲哚，对1mL的啤酒进行取样并且用0.5mL乙酸乙酯通过涡旋10秒(sec)进行提取，随后以15,000×重力离心10min。将有机相转移到1.5mL管中，并且过量添加Na2SO4以去除残留的水。然后将样品短暂涡旋并且以15,000×重力离心5min。然后将乙酸乙酯转移到GC小瓶中，并且使用不分流进样将1μL的所得提取物注入色谱柱。通过选择性监测m/z离子63、90和117来检测吲哚。使用Agilent MassHunter Qualitative软件对吲哚的峰面积进行定量。绝对样品浓度使用包括真实标准品的标准曲线生成的线性模型并且使用117作为定量离子来计算。
如图2中显示的，发现使用过度表达野生型TnaA的WLP001(Y182)和过度表达TnaA-H463F突变体的WLP001(Y502)酿造的啤酒相对于使用野生型加利福尼亚艾尔酵母(WLP001)、过度表达IRC7的WLP001(Y27)和过度表达STR3的WLP001(Y33)酿造的啤酒含有增加浓度的3MH)。然而，还发现使用过度表达野生型TnaA的WLP001(Y182)酿造的啤酒含有增加浓度的吲哚，而使用过度表达TnaA-H463F突变体的WLP001(Y502)酿造的啤酒含有低的吲哚水平。
实施例2
葡萄酒发酵菌株的产生
TnaA编码序列源自无丙二酸柠檬酸杆菌和优化用于在酵母菌属酵母中表达的密码子，如实施例1中描述的，并且用于转化成葡萄酒发酵酵母菌株红星白丘。
发酵产物的产生
本文所述的基因修饰的酵母菌株在啤酒和葡萄酒的发酵中进行了评估。简言之，培养实施例1中描述的啤酒酿造菌株加利福尼亚艾尔酵母WLP001和表达野生型TnaA(Y919)和TnaA H463F(Y484)的葡萄酒发酵菌株红星白丘，并且用于接种初始培养基。所得培养基用于接种较大的培养物，然后生长数天。然后在发酵罐中将所得培养物用于在啤酒发酵的情况下接种20L麦芽汁，或对于葡萄酒发酵接种葡萄原汁或葡萄果汁，并且生长数天直到它们达到所需的最终重量(terminal gravity)。如实施例1描述的，随后通过气相色谱质谱分析对挥发性硫醇和吲哚进行分析。
如图3A和3B中显示的，表达TnaA H463F突变的菌株导致发酵产物具有增加的3MH浓度，同时保持与野生型亲本菌株(分别为WLP001和红星)相当的吲哚浓度。
实施例3
将前体添加到发酵工艺
使用涉及将前体添加到发酵工艺的工艺进一步分析本文所述的酵母菌株产生的发酵产物。如图1G中显示的，至少一种前体到培养基或在第一次发酵过程中。
如实施例1中描述的培养酵母菌株。在发酵工艺的开始时，将谷胱甘肽缀合的3-巯基己-1-醇(Glut-3-MH)添加至麦芽汁中。在存在或不存在Glut-3-MH的情况下将酵母菌株接种到麦芽汁中。啤酒在20℃发酵直到它们达到最终重量，保持另外24h以去除附近的二酮(VDK)，并且然后在0℃条件冷却以产生成品啤酒，随后其通过气相色谱质谱分析对挥发性硫醇和吲哚进行分析。
如图4A和4B中显示，在发酵工艺中存在或不存在另外的Glut-3-MH的情况下，使用表达野生型TnaA或TnaA H463F突变体的菌株在啤酒发酵中发酵产物中的3MH浓度增加。在发酵工艺中存在或不存在另外的Glut-3-MH的情况下，使用表达野生型TnaA的菌株在啤酒发酵中发酵产物中吲哚浓度也增加了，然而，使用表达TnaA H463F突变体的菌株在啤酒发酵中的吲哚浓度与野生型亲本菌株(WLP001)相当。与未添加Glut-3MH的对照发酵相比，前体Glut-3MH添加至发酵工艺导致增加产生3MH。
实施例4
TnaA取代突变体的评估
如实施例1所描述的，与使用表达野生型TnaA的酵母菌株酿造的啤酒相比，发现使用表达TnaA H463F突变体的酵母菌株酿造的啤酒含有增加水平的3MH和低水平的吲哚。还评估了作为TnaA的位置463的组氨酸残基的另外氨基酸取代。简言之，通过PCR诱变制造含有在位置463处的组氨酸残基取代为精氨酸(H463R)、谷氨酸(H463E)、苏氨酸(H463T)、甘氨酸(H463G)、异亮氨酸(H463I)或缬氨酸(H463V)的突变体TnaA基因，在HHF2启动子控制下克隆至表达质粒中，并且转化到酵母菌株中。参见表1。
表1：酵母菌株
Figure BDA0003697676550000551
将酵母菌株接种在麦芽汁中并且在20℃发酵直至它们达到最终重量，保持另外24h用于去除附近的二酮(VDK)，然后在0℃条件冷却以产生成品啤酒，随后其通过气相色谱质谱分析对挥发性硫醇和吲哚进行分析。
如图5中显示，使用表达野生型TnaA或TnaA H463突变体的菌株的啤酒发酵中发酵产物中的3MH浓度增加。使用表达野生型TnaA的菌株的啤酒发酵中发酵产物中的吲哚浓度也增加，然而，使用表达TnaA H463突变体的菌株的啤酒发酵中的吲哚浓度与野生型亲本菌株(WLP001)相当。
TnaA同源物的评估
鉴定了来自无丙二酸柠檬酸杆菌的TnaA同源物，在PGK1启动子控制下克隆到整合质粒中，并且转化至酵母菌株中。参见表1。
将酵母菌株接种到麦芽汁中并且在20℃发酵直至它们达到最终重量，保持另外24h用于去除附近的二酮(VDK)，然后在0℃条件冷却以产生成品啤酒，随后其通过气相色谱质谱分析对挥发性硫醇和吲哚进行分析。
如图6中显示，使用表达野生型TnaA、TnaA H463F突变体或来自分别与无丙二酸柠檬酸杆菌的TnaA具有38％、44％和82％序列同一性的棘孢木霉、A.saccharolyticus和Z.ganghwensis的TnaA同源物的菌株酿造的啤酒中3MH的浓度增加。使用表达野生型TnaA的菌株酿造的啤酒中吲哚浓度也增加了，然而，使用表达TnaA H463F突变体或来自A.saccharolyticus和Z.ganghwensis的TnaA同源物的菌株的啤酒发酵中的吲哚浓度与野生型亲本菌株(WLP001)相当。
参考文献
1.Cannon,R.J.&Ho,C.-T.Volatile sulfur compounds in tropicalfruits.Journal of Food and Drug Analysis(2018)26,445–468.
2.Watson,B.Early 2018Beer Style Trends|Brewers Association.BrewersAssociation(2018).Available at:brewersassociation.org/insights/early-2018-beer-style-trends/.
3.Hahn,F.Why the hottest trend in beer is an IPA that tastes likepineapple or mango.Washington Post(2016).Available at:washingtonpost.com/lifestyle/food/pineapple-and-mango-in-the-pint-glass-so-hot-right-now/2016/05/22/73f6c52a-1dd2-11e6-b6e0-c53b7ef63b45_story.html.
4.Tominaga,T.,Furrer,A.,Henry,R.&Dubourdieu,D.Identification of newvolatile thiols in the aroma of Vitis vinifera L.var.Sauvignon blancwines.Flavour and Fragrance Journal(1998)13,159–162.
5.Swiegers,J.H等人，Engineering volatile thiol release inSaccharomyces cerevisiae for improved wine aroma.Yeast(2007)24,561–574.
6.Howell,K.S等人，Genetic determinants of volatile-thiol release bySaccharomyces cerevisiae during wine fermentation.Appl.Environ.Microbiol.(2005)71,5420–5426.
7.Santiago,M.&Gardner,R.C.Yeast genes required for conversion ofgrape precursors to varietal thiols in wine.FEMS Yeast Res.(2015)15,fov034.
8.Roland,A.,Cavelier,F.&Schneider,R.How organic and analyticalchemistry contribute to knowledge of the biogenesis of varietal thiols inwine.A review.Flavour and Fragrance Journal(2012)27,266–272.
9.Jeffery,D.W.Spotlight on Varietal Thiols and Precursors in Grapesand Wines.Australian Journal of Chemistry(2016)69,1323.
10.Holt,S等人，Engineering Saccharomyces cerevisiae to release 3-Mercaptohexan-1-ol during fermentation through overexpression of anS.cerevisiae Gene,STR3,for improvement of wine aroma.Appl.Environ.Microbiol.7(2011)7,3626–3632.
11.Roncoroni,M等人，The yeast IRC7 gene encodes aβ-lyase responsiblefor production of the varietal thiol 4-mercapto-4-methylpentan-2-one inwine.Food Microbiol.(2011)28,926–935.
12.Thibon,C等人，Nitrogen catabolic repression controls the release ofvolatile thiols by Saccharomyces cerevisiae during wine fermentation.FEMSYeast Res.(2008)8,1076–1086.
13.Bartowsky,E.J.&Pretorius,I.S.Microbial Formation and Modificationof Flavor and Off-Flavor Compounds in Wine.Biology of Microorganisms onGrapes,in Must and in Wine 209–231doi:10.1007/978-3-540-85463-0_11.
14.Holt,S.,Miks,M.H.,de Carvalho,B.T.,Foulquié-Moreno,M.R.&Thevelein,J.M.The molecular biology of fruity and floral aromas in beer and otheralcoholic beverages.FEMS Microbiol.Rev.(2019)43,193–222.
15.Vanzo,A等人，UHPLC-MS/MS determination of varietal thiol precursorsin Sauvignon Blanc grapes.Sci.Rep.(2017)7.
16.Roland,A.,Schneider,R.,Razungles,A.&Cavelier,F.Varietal thiols inwine:discovery,analysis and applications.Chem.Rev.(2012)111,7355–7376.
17.Tominaga,T.,Masneuf-Pomarède,I.&Dubourdieu,D.A S-cysteineconjugate,precursor of aroma of White Sauvignon.OENO One(1995)29,227.
18.Tominaga,T.,des Gachons,C.P.&Dubourdieu,D.A New Type of FlavorPrecursors in Vitis vinifera L.cv.Sauvignon Blanc:S-CysteineConjugates.Journal of Agricultural and Food Chemistry(1998)46,5215–5219.
19.
Figure BDA0003697676550000571
-Gallego,A.,Hernández-Orte,P.,Cacho,J.&Ferreira,V.S-Cysteinylated and S-glutathionylated thiol precursors in grapes.A review.FoodChemistry(2012)131,1–13.
20.Kishimoto,T.,Morimoto,M.,Kobayashi,M.,Yako,N.&Wanikawa,A.Behaviorsof 3-Mercaptohexan-1-ol and 3-Mercaptohexyl Acetate during BrewingProcesses.Journal of the American Society of Brewing Chemists(2008)66,192–196.
21.Pinu,F.R.,Jouanneau,S.,Nicolau,L.,Gardner,R.C.&Villas-Boas,S.G.Concentrations of the Volatile Thiol 3-Mercaptohexanol in Sauvignon blancWines:No Correlation with Juice Precursors.American Journal of Enology andViticulture(2012)63,407–412.
22.Newton,W.A.&Snell,E.E.CATALYTIC PROPERTIES OF TRYPTOPHANASE,AMULTIFUNCTIONAL PYRIDOXAL PHOSPHATE ENZYME.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1964)51,382–389.
23.Pretorius,I.S.&Swiegers,J.H.Methods and micro-organisms formodulating the conversion of non-volatile sulfur compounds to volatile thiolcompounds.PCT Publication No.WO 2007/095682.
24.Pinu,F.R.,Edwards,P.J.B.,Gardner,R.C.&Villas-Boas,S.G.Nitrogen andcarbon assimilation by Saccharomyces cerevisiae during Sauvignon blanc juicefermentation.FEMS Yeast Res.(2014)14,1206–1222.
25.Phillips,R.S.,Johnson,N.&Kamath,A.V.Formation in Vitro of HybridDimers of H463F and Y74F Mutant Escherichia coli Tryptophan Indole-lyaseRescues Activity with l-Tryptophan
Figure BDA0003697676550000581
.Biochemistry(2002)41,4012–4019.
26.Cordente,A.G等人，Inactivating Mutations in Irc7p Are Common inWine Yeasts,Attenuating Carbon-Sulfurβ-Lyase Activity and Volatile SulfurCompound Production.Appl.Environ.Microbiol.(2019)85.
27.Davis,P.M.&Qian,M.C.Progress on Volatile Sulfur Compound Analysisin Wine.ACS Symposium Series 93–115(2011).doi:10.1021/bk-2011-1068.ch005
28.Smith,M.E.,Bekker,M.Z.,Smith,P.A.&Wilkes,E.N.Sources of volatilesulfur compounds in wine.Australian Journal of Grape and Wine Research(2015)21,705–712.
29.Charoenchai,C.Yeasts in Fruit Wine Fermentation.Yeasts in theProduction of Wine(2019)461–476.doi:10.1007/978-1-4939-9782-4_15
30.Li,G.&Young,K.D.Indole production by the tryptophanase TnaA inEscherichia coli is determined by the amount of exogenoustryptophan.Microbiology(2013)159,402–410
序列表
<110> 伯克利酿酒科学公司
<120> 基因工程化的酵母细胞及其使用方法
<130> B1509.70000WO00
<140> 还未分配
<141> 同时在此
<150> US 63/086,363
<151> 2020-10-01
<150> US 62/916,529
<151> 2019-10-17
<160> 9
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 471
<212> PRT
<213> 无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)
<400> 1
Met Asp Asn Phe Lys His Leu Pro Glu Pro Phe Arg Ile Arg Val Ile
1 5 10 15
Glu Pro Val Lys Arg Thr Thr Arg Glu His Arg Asn Asn Ala Ile Ile
20 25 30
Lys Ser Gly Met Asn Pro Phe Leu Leu Asp Ser Glu Asp Val Phe Ile
35 40 45
Asp Leu Leu Thr Asp Ser Gly Thr Gly Ala Val Thr Gln Asn Met Gln
50 55 60
Ala Ala Met Leu Arg Gly Asp Glu Ala Tyr Ser Gly Ser Arg Ser Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Leu Ser Glu Ala Val Lys Asn Ile Phe Gly Tyr Gln Tyr Thr
85 90 95
Ile Pro Thr His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Gln Ile Tyr Ile Pro Val
100 105 110
Leu Ile Lys Lys Arg Glu Gln Glu Lys Gly Leu Asp Arg Ser Lys Met
115 120 125
Ala Val Phe Ser Asn Tyr Phe Phe Asp Thr Thr Gln Gly His Ser Gln
130 135 140
Ile Asn Gly Cys Ala Val Arg Asn Val Tyr Ile Lys Glu Ala Phe Asp
145 150 155 160
Thr Gly Val Arg Tyr Asp Phe Lys Gly Asn Phe Asp Leu Asp Gly Leu
165 170 175
Glu Arg Gly Ile Gln Glu Val Gly Pro Asn Asn Val Pro Tyr Ile Val
180 185 190
Ala Thr Ile Thr Ser Asn Ser Ala Gly Gly Gln Pro Val Ser Leu Ala
195 200 205
Asn Leu Lys Ala Met Tyr Asn Ile Ala Lys Lys Tyr Asp Ile Pro Val
210 215 220
Val Met Asp Ser Ala Arg Phe Ala Glu Asn Ala Tyr Phe Ile Gln Lys
225 230 235 240
Arg Glu Ala Glu Tyr Arg Asp Trp Ser Ile Glu Glu Ile Thr Arg Glu
245 250 255
Thr Tyr Lys Tyr Ala Asp Met Leu Ala Met Ser Ala Lys Lys Asp Ala
260 265 270
Met Val Pro Met Gly Gly Leu Leu Cys Ile Lys Asp Asp Thr Tyr Phe
275 280 285
Asp Val Tyr Thr Glu Cys Arg Thr Leu Cys Val Val Gln Glu Gly Phe
290 295 300
Pro Thr Tyr Gly Gly Leu Glu Gly Gly Ala Met Glu Arg Leu Ala Val
305 310 315 320
Gly Leu Val Asp Gly Met Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Arg Ile Ala
325 330 335
Gln Val Gln Tyr Leu Val Asp Gly Leu Glu Ala Ile Gly Val Thr Cys
340 345 350
Gln Gln Ala Gly Gly His Ala Ala Phe Val Asp Ala Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Pro His Ile Pro Ala Glu Gln Phe Pro Ala Gln Ala Leu Ala Cys Glu
370 375 380
Leu Tyr Lys Val Ala Gly Ile Arg Ala Val Glu Ile Gly Ser Phe Leu
385 390 395 400
Leu Gly Arg Asp Pro Lys Thr Gly Lys Gln Leu Pro Cys Pro Ala Glu
405 410 415
Leu Leu Arg Leu Thr Ile Pro Arg Ala Thr Tyr Thr Gln Ser His Met
420 425 430
Asp Phe Ile Ile Glu Ala Phe Glu His Val Lys Glu Asn Ser Met Asn
435 440 445
Ile Lys Gly Leu Thr Phe Thr Tyr Glu Pro Lys Val Leu Arg His Phe
450 455 460
Thr Ala Lys Leu Lys Glu Val
465 470
<210> 2
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
Met Asp Asn Phe Lys His Leu Pro Glu Pro Phe Arg Ile Arg Val Ile
1 5 10 15
Glu Pro Val Lys Arg Thr Thr Arg Glu His Arg Asn Asn Ala Ile Ile
20 25 30
Lys Ser Gly Met Asn Pro Phe Leu Leu Asp Ser Glu Asp Val Phe Ile
35 40 45
Asp Leu Leu Thr Asp Ser Gly Thr Gly Ala Val Thr Gln Asn Met Gln
50 55 60
Ala Ala Met Leu Arg Gly Asp Glu Ala Tyr Ser Gly Ser Arg Ser Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Leu Ser Glu Ala Val Lys Asn Ile Phe Gly Tyr Gln Tyr Thr
85 90 95
Ile Pro Thr His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Gln Ile Tyr Ile Pro Val
100 105 110
Leu Ile Lys Lys Arg Glu Gln Glu Lys Gly Leu Asp Arg Ser Lys Met
115 120 125
Ala Val Phe Ser Asn Tyr Phe Phe Asp Thr Thr Gln Gly His Ser Gln
130 135 140
Ile Asn Gly Cys Ala Val Arg Asn Val Tyr Ile Lys Glu Ala Phe Asp
145 150 155 160
Thr Gly Val Arg Tyr Asp Phe Lys Gly Asn Phe Asp Leu Asp Gly Leu
165 170 175
Glu Arg Gly Ile Gln Glu Val Gly Pro Asn Asn Val Pro Tyr Ile Val
180 185 190
Ala Thr Ile Thr Ser Asn Ser Ala Gly Gly Gln Pro Val Ser Leu Ala
195 200 205
Asn Leu Lys Ala Met Tyr Asn Ile Ala Lys Lys Tyr Asp Ile Pro Val
210 215 220
Val Met Asp Ser Ala Arg Phe Ala Glu Asn Ala Tyr Phe Ile Gln Lys
225 230 235 240
Arg Glu Ala Glu Tyr Arg Asp Trp Ser Ile Glu Glu Ile Thr Arg Glu
245 250 255
Thr Tyr Lys Tyr Ala Asp Met Leu Ala Met Ser Ala Lys Lys Asp Ala
260 265 270
Met Val Pro Met Gly Gly Leu Leu Cys Ile Lys Asp Asp Thr Tyr Phe
275 280 285
Asp Val Tyr Thr Glu Cys Arg Thr Leu Cys Val Val Gln Glu Gly Phe
290 295 300
Pro Thr Tyr Gly Gly Leu Glu Gly Gly Ala Met Glu Arg Leu Ala Val
305 310 315 320
Gly Leu Val Asp Gly Met Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Arg Ile Ala
325 330 335
Gln Val Gln Tyr Leu Val Asp Gly Leu Glu Ala Ile Gly Val Thr Cys
340 345 350
Gln Gln Ala Gly Gly His Ala Ala Phe Val Asp Ala Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Pro His Ile Pro Ala Glu Gln Phe Pro Ala Gln Ala Leu Ala Cys Glu
370 375 380
Leu Tyr Lys Val Ala Gly Ile Arg Ala Val Glu Ile Gly Ser Phe Leu
385 390 395 400
Leu Gly Arg Asp Pro Lys Thr Gly Lys Gln Leu Pro Cys Pro Ala Glu
405 410 415
Leu Leu Arg Leu Thr Ile Pro Arg Ala Thr Tyr Thr Gln Ser His Met
420 425 430
Asp Phe Ile Ile Glu Ala Phe Glu His Val Lys Glu Asn Ser Met Asn
435 440 445
Ile Lys Gly Leu Thr Phe Thr Tyr Glu Pro Lys Val Leu Arg Phe Phe
450 455 460
Thr Ala Lys Leu Lys Glu Val
465 470
<210> 3
<211> 461
<212> PRT
<213> 棘孢木霉(Trichoderma asperellum)
<400> 3
Met Leu Pro Asp Cys His Leu Pro Glu Thr Trp Arg Ala Lys Met Val
1 5 10 15
Glu Arg Ile Pro Ser Ser Thr Lys Asp Gln Arg Gln Glu Trp Ile Cys
20 25 30
Lys Ala Asp Tyr Asn Leu Phe Lys Leu Arg Ser Asn Glu Val Arg Phe
35 40 45
Asp Leu Gly Thr Asp Gly Gly Ser Gly Gly Met Ser Asp Asn Gln Trp
50 55 60
Ser Ala Leu Met Arg Gly Asp Ser Ala Ala Thr Arg Ser Pro Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Leu Gln Glu Lys Val Lys Glu Leu Phe Gly Phe Thr Tyr Thr
85 90 95
Ile Pro Val His Arg Gly Arg Ala Ala Lys His Ala Leu Val Gln Ala
100 105 110
Leu Leu Asn Glu Glu Ser Ile Val Pro Gly Asn Ala Phe Phe Asp Thr
115 120 125
Thr Arg Ala Asn Ile Glu Ser Gln Lys Ala Ile Ala Ile Asp Cys Ala
130 135 140
Ile Glu Gly Ala Phe Asp Ile Tyr Tyr Gln His Pro Phe Lys Gly Asn
145 150 155 160
Val Asn Leu Pro Glu Leu Glu Lys Ile Leu Gln Gly Ser Gly Ser Asn
165 170 175
Val Pro Met Ile Met Val Ser Ile Thr Cys Asp Lys Thr Gly Gly Gln
180 185 190
Pro Val Ser Met His Asn Leu Arg Glu Val Lys Arg Leu Ala Lys Met
195 200 205
Phe Asn Val Pro Val Ile Leu Asp Ser Ala Arg Phe Ala Glu Asn Ala
210 215 220
Trp Phe Ile Gln Lys Asn Glu Ser Glu Tyr Ser Ser Gln Ser Ile Pro
225 230 235 240
Asp Ile Val Gln Glu Met Tyr His His Ala Asp Gly Met Val Met Ser
245 250 255
Gly Lys Thr Asp Gly Leu Val Asn Ala Gly Gly Phe Phe Ala Thr Asn
260 265 270
Asn Lys Asp Leu Phe Asp Arg Val Gly Lys Tyr Ala Asn Leu Phe Cys
275 280 285
Gly Leu Ala Gly Arg Asp Met Glu Ala Leu Thr Val Gly Leu Gly Glu
290 295 300
Val Thr Gln Gln Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Ile Arg Gln Ile His Arg
305 310 315 320
Phe Gly Met Arg Leu Met Ala Ala Asn Val Pro Ile Gln Gln Pro Ile
325 330 335
Gly Gly His Ala Ile Val Ile Asp Ala Ser Leu Phe Leu Pro Leu Val
340 345 350
Pro Arg Glu Glu Tyr Val Ala Lys Thr Leu Ala Val Glu Leu Tyr Val
355 360 365
Glu Ala Gly Ile Arg Gly Ala Gly Met Glu Thr Val Ile Gly Gly Gly
370 375 380
Asn Pro Ile Thr Gly Ile Asn Arg Asn Arg Ser Asn Ala Lys Asp Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Leu Ala Ile Pro Arg Gln Ala Tyr Thr Asn Asp Gln Leu Ser
405 410 415
Phe Val Ala Asn Ala Leu Ile Gln Ile Phe Glu Arg Arg Phe Thr Ile
420 425 430
Thr Arg Gly Leu Tyr Val Val His Glu Asp Ala Ile Leu Arg Tyr Leu
435 440 445
Thr Ile Gln Leu Lys Lys Ala Asp Gly Lys Ser Ile Ala
450 455 460
<210> 4
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
Met Asn Asn Phe Lys His Leu Pro Glu Pro Phe Arg Ile Arg Val Val
1 5 10 15
Glu Pro Val Lys Arg Thr Thr Leu Ala Tyr Arg Glu Lys Ala Ile Leu
20 25 30
Asn Ala Gly Met Asn Pro Phe Leu Leu Asp Ser Lys Asp Val Phe Ile
35 40 45
Asp Leu Leu Thr Asp Ser Gly Thr Gly Ala Ile Thr Gln Glu Met Gln
50 55 60
Ala Ala Met Phe Ile Gly Asp Glu Ala Tyr Ser Gly Ser Arg Ser Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Asp Ile Phe Gly Tyr Glu Tyr Thr
85 90 95
Ile Pro Thr His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Gln Ile Tyr Ile Pro Val
100 105 110
Leu Ile Lys Lys Arg Glu Lys Glu Lys Gly Leu Asp Arg Thr Lys Met
115 120 125
Val Ala Leu Ser Asn Tyr Phe Phe Asp Thr Thr Gln Gly His Thr Gln
130 135 140
Leu Asn Ala Cys Val Ala Lys Asn Val Phe Thr Lys Glu Ala Phe Asp
145 150 155 160
Thr Ser Ile Ser Ala Asp Phe Lys Gly Asn Phe Asp Leu Glu Leu Leu
165 170 175
Glu His Ala Ile Leu Glu Ala Gly Pro Gln Asn Val Pro Tyr Ile Val
180 185 190
Ser Thr Ile Thr Cys Asn Ser Ala Gly Gly Gln Pro Val Ser Ile Ala
195 200 205
Asn Leu Lys Ala Val Tyr Glu Ile Ala Gln Arg Tyr Glu Ile Pro Val
210 215 220
Ile Met Asp Ser Ala Arg Phe Ala Glu Asn Ala Tyr Phe Ile Gln Gln
225 230 235 240
Arg Glu Pro Glu Tyr Gln Asp Trp Ser Ile Glu Ala Ile Thr Phe Glu
245 250 255
Ser Tyr Lys Tyr Ala Asp Ala Leu Ala Met Ser Ala Lys Lys Asp Ala
260 265 270
Met Val Gln Met Gly Gly Leu Leu Cys Phe Lys Asp Lys Ser Met Leu
275 280 285
Asp Val Tyr Asn Glu Cys Arg Thr Leu Cys Val Val Gln Glu Gly Phe
290 295 300
Pro Thr Tyr Gly Gly Leu Glu Gly Gly Ala Met Glu Arg Leu Ala Val
305 310 315 320
Gly Leu Tyr Asp Gly Met Arg Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Arg Ile Asn
325 330 335
Gln Val Gln Tyr Leu Val Asn Gly Leu Glu Ser Ile Gly Ile Val Cys
340 345 350
Gln Gln Ala Gly Gly His Ala Ala Phe Val Asp Ala Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Pro His Ile Pro Ala Asp Gln Phe Pro Ala His Ala Leu Ala Cys Glu
370 375 380
Leu Tyr Lys Val Ala Gly Ile Arg Ala Val Glu Ile Gly Ser Leu Leu
385 390 395 400
Leu Gly Arg Asp Pro Thr Thr Gly Lys Gln His Pro Cys Pro Ala Glu
405 410 415
Leu Leu Arg Leu Thr Ile Pro Arg Ala Thr Tyr Thr Gln Thr His Met
420 425 430
Asp Phe Ile Ile Glu Ala Phe Glu Lys Val Lys Glu Asn Ala Ser His
435 440 445
Val Lys Gly Leu Thr Phe Thr Tyr Glu Pro Glu Val Leu Arg Phe Phe
450 455 460
Thr Ala Arg Leu Lys Glu Val Glu Asn
465 470
<210> 5
<211> 460
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
Met Pro Asn Thr Ala Thr Pro Glu Thr Trp Arg Val Lys Thr Val Glu
1 5 10 15
His Ile Arg Pro Ser Thr Arg Asp Gln Arg Gln Gln Trp Ile Glu Glu
20 25 30
Ala Gly Phe Asn Leu Phe Thr Leu Pro Ser Asp Arg Val Phe Ile Asp
35 40 45
Leu Leu Thr Asp Ser Gly Thr Gly Ala Met Ser Asp Arg Gln Trp Ala
50 55 60
Ala Ile Met Ser Gly Asp Glu Ser Tyr Ala Gly Ser Thr Ser Phe His
65 70 75 80
Ala Leu His Glu Val Val Gln Asp Leu Phe Gly Leu Glu Tyr Leu Leu
85 90 95
Pro Val His Gln Gly Arg Ala Ala Glu Asn Ala Leu Phe Ser Val Leu
100 105 110
Val His Glu Asp Gln Leu Val Pro Ala Asn Ser His Phe Asp Thr Thr
115 120 125
Arg Ala His Ile Glu Phe Arg Lys Ala Ala Ala Val Asp Cys Leu Ser
130 135 140
Ser Gly Ala Tyr Asp Val Thr Asp Thr Asn Pro Phe Lys Gly Asn Met
145 150 155 160
Asn Leu Asp Met Leu Arg Asp Ile Leu Gln Glu Ser His Ala Arg Val
165 170 175
Pro Phe Ile Leu Leu Thr Ile Thr Cys Asn Thr Thr Gly Gly Gln Pro
180 185 190
Val Ser Leu Ala Asn Ile Ala Ala Val Lys Ala Leu Ala Asp Arg Tyr
195 200 205
His Lys Pro Leu Val Val Asp Ala Ala Arg Phe Ala Glu Asn Ala Trp
210 215 220
Phe Ile Gln Gln Arg Glu Pro Gly Tyr Arg Asp Thr Ser Leu Arg Asp
225 230 235 240
Ile Thr Arg Gln Met Leu Gly Met Ala Asp Ala Met Val Met Ser Ala
245 250 255
Lys Lys Asp Gly Leu Val Asn Ile Gly Gly Phe Leu Ala Thr Arg His
260 265 270
Arg Glu Trp Phe Asp Gln Ala Thr Glu Tyr Val Ile Leu Phe Glu Gly
275 280 285
Phe Arg Thr Tyr Gly Gly Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ala Ala Leu Ala
290 295 300
Val Gly Leu Glu Glu Val Ile Ser Ala Asp Tyr Leu Ala Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Gln Val Gln Arg Phe Gly Gln Arg Leu Ile Asp Ala Gly Val Pro
325 330 335
Ile Gln Gln Pro Val Gly Gly His Ala Val Leu Val Asp Ala Ser Arg
340 345 350
Phe Leu Pro Glu Val Pro Arg Glu Glu Tyr Val Ala Gln Thr Leu Ala
355 360 365
Val Glu Leu Tyr Leu Glu Ala Gly Val Arg Gly Val Glu Ile Gly Thr
370 375 380
Leu Leu Asn Gly Arg Asp Pro Glu Ser Gly Glu Glu Arg Phe Ala Glu
385 390 395 400
Thr Glu Trp Leu Arg Leu Ala Ile Pro Arg Arg Val Tyr Ser Asn Asp
405 410 415
His Leu Glu Tyr Val Ala Gln Ala Leu Ile Asp Leu Tyr His Arg Arg
420 425 430
Ser Glu Ile Arg Ala Gly Val Arg Ile Val Glu Glu Lys Pro Val Leu
435 440 445
Arg Phe Phe Thr Val Arg Leu Glu Arg Lys Thr Glu
450 455 460
<210> 6
<211> 473
<212> PRT
<213> Zooshikella ganghwensis
<400> 6
Met Asn Asn Phe Lys His Leu Pro Glu Pro Phe Arg Ile Arg Val Val
1 5 10 15
Glu Pro Val Lys Arg Thr Thr Leu Ala Tyr Arg Glu Lys Ala Ile Leu
20 25 30
Asn Ala Gly Met Asn Pro Phe Leu Leu Asp Ser Lys Asp Val Phe Ile
35 40 45
Asp Leu Leu Thr Asp Ser Gly Thr Gly Ala Ile Thr Gln Glu Met Gln
50 55 60
Ala Ala Met Phe Ile Gly Asp Glu Ala Tyr Ser Gly Ser Arg Ser Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Asp Ile Phe Gly Tyr Glu Tyr Thr
85 90 95
Ile Pro Thr His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Gln Ile Tyr Ile Pro Val
100 105 110
Leu Ile Lys Lys Arg Glu Lys Glu Lys Gly Leu Asp Arg Thr Lys Met
115 120 125
Val Ala Leu Ser Asn Tyr Phe Phe Asp Thr Thr Gln Gly His Thr Gln
130 135 140
Leu Asn Ala Cys Val Ala Lys Asn Val Phe Thr Lys Glu Ala Phe Asp
145 150 155 160
Thr Ser Ile Ser Ala Asp Phe Lys Gly Asn Phe Asp Leu Glu Leu Leu
165 170 175
Glu His Ala Ile Leu Glu Ala Gly Pro Gln Asn Val Pro Tyr Ile Val
180 185 190
Ser Thr Ile Thr Cys Asn Ser Ala Gly Gly Gln Pro Val Ser Ile Ala
195 200 205
Asn Leu Lys Ala Val Tyr Glu Ile Ala Gln Arg Tyr Glu Ile Pro Val
210 215 220
Ile Met Asp Ser Ala Arg Phe Ala Glu Asn Ala Tyr Phe Ile Gln Gln
225 230 235 240
Arg Glu Pro Glu Tyr Gln Asp Trp Ser Ile Glu Ala Ile Thr Phe Glu
245 250 255
Ser Tyr Lys Tyr Ala Asp Ala Leu Ala Met Ser Ala Lys Lys Asp Ala
260 265 270
Met Val Gln Met Gly Gly Leu Leu Cys Phe Lys Asp Lys Ser Met Leu
275 280 285
Asp Val Tyr Asn Glu Cys Arg Thr Leu Cys Val Val Gln Glu Gly Phe
290 295 300
Pro Thr Tyr Gly Gly Leu Glu Gly Gly Ala Met Glu Arg Leu Ala Val
305 310 315 320
Gly Leu Tyr Asp Gly Met Arg Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Arg Ile Asn
325 330 335
Gln Val Gln Tyr Leu Val Asn Gly Leu Glu Ser Ile Gly Ile Val Cys
340 345 350
Gln Gln Ala Gly Gly His Ala Ala Phe Val Asp Ala Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Pro His Ile Pro Ala Asp Gln Phe Pro Ala His Ala Leu Ala Cys Glu
370 375 380
Leu Tyr Lys Val Ala Gly Ile Arg Ala Val Glu Ile Gly Ser Leu Leu
385 390 395 400
Leu Gly Arg Asp Pro Thr Thr Gly Lys Gln His Pro Cys Pro Ala Glu
405 410 415
Leu Leu Arg Leu Thr Ile Pro Arg Ala Thr Tyr Thr Gln Thr His Met
420 425 430
Asp Phe Ile Ile Glu Ala Phe Glu Lys Val Lys Glu Asn Ala Ser His
435 440 445
Val Lys Gly Leu Thr Phe Thr Tyr Glu Pro Glu Val Leu Arg His Phe
450 455 460
Thr Ala Arg Leu Lys Glu Val Glu Asn
465 470
<210> 7
<211> 460
<212> PRT
<213> Aspergillus saccharolyticus
<400> 7
Met Pro Asn Thr Ala Thr Pro Glu Thr Trp Arg Val Lys Thr Val Glu
1 5 10 15
His Ile Arg Pro Ser Thr Arg Asp Gln Arg Gln Gln Trp Ile Glu Glu
20 25 30
Ala Gly Phe Asn Leu Phe Thr Leu Pro Ser Asp Arg Val Phe Ile Asp
35 40 45
Leu Leu Thr Asp Ser Gly Thr Gly Ala Met Ser Asp Arg Gln Trp Ala
50 55 60
Ala Ile Met Ser Gly Asp Glu Ser Tyr Ala Gly Ser Thr Ser Phe His
65 70 75 80
Ala Leu His Glu Val Val Gln Asp Leu Phe Gly Leu Glu Tyr Leu Leu
85 90 95
Pro Val His Gln Gly Arg Ala Ala Glu Asn Ala Leu Phe Ser Val Leu
100 105 110
Val His Glu Asp Gln Leu Val Pro Ala Asn Ser His Phe Asp Thr Thr
115 120 125
Arg Ala His Ile Glu Phe Arg Lys Ala Ala Ala Val Asp Cys Leu Ser
130 135 140
Ser Gly Ala Tyr Asp Val Thr Asp Thr Asn Pro Phe Lys Gly Asn Met
145 150 155 160
Asn Leu Asp Met Leu Arg Asp Ile Leu Gln Glu Ser His Ala Arg Val
165 170 175
Pro Phe Ile Leu Leu Thr Ile Thr Cys Asn Thr Thr Gly Gly Gln Pro
180 185 190
Val Ser Leu Ala Asn Ile Ala Ala Val Lys Ala Leu Ala Asp Arg Tyr
195 200 205
His Lys Pro Leu Val Val Asp Ala Ala Arg Phe Ala Glu Asn Ala Trp
210 215 220
Phe Ile Gln Gln Arg Glu Pro Gly Tyr Arg Asp Thr Ser Leu Arg Asp
225 230 235 240
Ile Thr Arg Gln Met Leu Gly Met Ala Asp Ala Met Val Met Ser Ala
245 250 255
Lys Lys Asp Gly Leu Val Asn Ile Gly Gly Phe Leu Ala Thr Arg His
260 265 270
Arg Glu Trp Phe Asp Gln Ala Thr Glu Tyr Val Ile Leu Phe Glu Gly
275 280 285
Phe Arg Thr Tyr Gly Gly Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ala Ala Leu Ala
290 295 300
Val Gly Leu Glu Glu Val Ile Ser Ala Asp Tyr Leu Ala Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Gln Val Gln Arg Phe Gly Gln Arg Leu Ile Asp Ala Gly Val Pro
325 330 335
Ile Gln Gln Pro Val Gly Gly His Ala Val Leu Val Asp Ala Ser Arg
340 345 350
Phe Leu Pro Glu Val Pro Arg Glu Glu Tyr Val Ala Gln Thr Leu Ala
355 360 365
Val Glu Leu Tyr Leu Glu Ala Gly Val Arg Gly Val Glu Ile Gly Thr
370 375 380
Leu Leu Asn Gly Arg Asp Pro Glu Ser Gly Glu Glu Arg Phe Ala Glu
385 390 395 400
Thr Glu Trp Leu Arg Leu Ala Ile Pro Arg Arg Val Tyr Ser Asn Asp
405 410 415
His Leu Glu Tyr Val Ala Gln Ala Leu Ile Asp Leu Tyr His Arg Arg
420 425 430
Ser Glu Ile Arg Ala Gly Val Arg Ile Val Glu Glu Lys Pro Val Leu
435 440 445
Arg His Phe Thr Val Arg Leu Glu Arg Lys Thr Glu
450 455 460
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)
<400> 8
Met Ser Ala Lys Lys Asp
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)
<400> 9
Ile Asp Leu Leu Thr Asp Ser Gly Thr
1 5

Claims (58)

1.一种基因修饰的酵母细胞(修饰的细胞)，其包括编码具有β-裂合酶活性的酶的异源基因。
2.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述具有β-裂合酶活性的酶具有与SEQ IDNO:2陈述的序列至少90％序列同一性的序列。
3.根据权利要求1或2所述的修饰的细胞，其中所述具有β-裂合酶活性的酶不包括SEQID NO:1、6或7陈述的序列。
4.根据权利要求1-3的任一项所述的修饰的细胞，其中所述具有β-裂合酶活性的酶具有SEQ ID NO:2陈述的序列。
5.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述具有β-裂合酶活性的酶具有与S EQ IDNO:4或5的任一个陈述的序列至少90％序列同一性的序列。
6.根据权利要求1或5所述的修饰的细胞，其中所述具有β-裂合酶活性的酶具有SEQ IDNO:4-7的任一个陈述的序列。
7.根据权利要求1-6的任一项所述的修饰的细胞，其中所述具有β-裂合酶活性的酶包括对应于SEQ ID NO:1的位置H463的位置处的取代突变。
8.根据权利要求7所述的修饰的细胞，其中对应于SEQ ID NO:1的位置H463的位置处的取代突变是苯丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、苏氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。
9.根据权利要求1-8的任一项所述的修饰的细胞，其中酵母细胞是酵母菌属。
10.根据权利要求9所述的修饰的细胞，其中酵母细胞具有物种酿酒酵母。
11.根据权利要求10所述的修饰的细胞，其中酵母细胞是酿酒酵母加利福尼亚艾尔酵母菌株WLP001或红星白丘。
12.根据权利要求9所述的修饰的细胞，其中酵母细胞是物种巴斯德酵母。
13.一种产生发酵产物的方法，其包括，使权利要求1-12的任一项所述的修饰的细胞与包括至少一种可发酵的糖的培养基接触，其中在至少第一发酵工艺期间进行接触，以产生发酵产物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一种可发酵的糖在至少一种糖源中提供。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中可发酵的糖是葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和/或麦芽三糖。
16.根据权利要求13-15的任一项所述的方法，其中至少一种糖源包括至少一种前体。
17.根据权利要求16所述的方法，其中至少一种前体包括半胱氨酸缀合的3-巯基己-1-醇(Cys 3-MH)、半胱氨酸-缀合的4-甲基-4-巯基戊-2-酮(Cys 4MMP)、谷胱甘肽缀合的3-巯基己-1-醇(Glut-3-MH)和/或谷胱甘肽缀合的4-甲基-4-巯基戊2-酮(Glut 4MMP)。
18.根据权利要求13-17的任一项所述的方法，其进一步包括将一种或多种前体添加到培养基中，其中所述前体包括3-巯基己-1-醇(Cys 3-MH)、半胱氨酸-缀合的4-甲基-4-巯基戊-2-酮(Cys 4MMP)、谷胱甘肽缀合的3-巯基己-1-醇(Glut-3-MH)和/或谷胱甘肽缀合的4-甲基-4-巯基戊2-酮(Glut 4MMP)。
19.根据权利要求9-18的任一项所述的方法，其中与由不表达异源基因的对应细胞或表达具有β-裂合酶活性的野生型酶的对应细胞产生的发酵产物相比，发酵产物包括增加水平的至少一种挥发性巯基。
20.根据权利要求19所述的方法，其中至少一种挥发性巯基包括3-巯基己-1-醇(3MH)、3-巯基乙酸己酯(3MHA)、4-甲基-4-巯基戊-2-酮(4MMP)或其组合。
21.根据权利要求20所述的方法，其中发酵产物包括至少200ng/L 3-巯基己-1-醇(3MH)、3-巯基乙酸己酯(3MHA)和/或4-甲基-4-巯基戊-2-酮(4MMP)。
22.根据权利要求13-21的任一项所述的方法，其中与由不表达异源基因的对应细胞或表达具有β-裂合酶活性的野生型酶的对应细胞产生的发酵产物相比，发酵产物包括降低水平的至少一种不希望的产物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中至少一种不希望的产物是吲哚。
24.根据权利要求13-23的任一项所述的方法，其中所述发酵产物是发酵饮料。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述发酵饮料是啤酒、葡萄酒、起泡酒(香槟)、清酒、蜂蜜酒、康普茶或苹果酒。
26.根据权利要求13-25的任一项所述的方法，其中所述糖源包括麦芽汁、水果果汁、蜂蜜、大米淀粉或其组合。
27.根据权利要求26所述的方法，其中水果果汁是葡萄果汁或苹果果汁。
28.根据权利要求13-27的任一项所述的方法，其中所述糖源是麦芽汁并且所述方法进一步包括产生培养基，其中产生培养基包括：
(a)使多种谷物与水接触；和
(b)煮沸或浸泡水和谷物以产生麦芽汁。
29.根据权利要求28所述的方法，进一步包括将至少一种啤酒花种类添加到麦芽汁中以产生加了啤酒花的麦芽汁。
30.根据权利要求13-29的任一项所述的方法，进一步包括将至少一种啤酒花种类添加到培养基中。
31.根据权利要求13-30的任一项所述的方法，进一步包括至少一种另外的发酵工艺。
32.根据权利要求13-31的任一项所述的方法，进一步包括使发酵产物碳酸化。
33.通过权利要求13-32的任一项所述的方法产生的发酵产物。
34.根据权利要求33所述的发酵产物，其中所述发酵产物包括至少200ng/L 3-巯基己-1-醇(3MH)、3-巯基乙酸己酯(3MHA)和/或4-甲基-4-巯基戊-2-酮(4MMP)。
35.根据权利要求33或34所述的发酵产物，其中所述发酵产物包括小于500μg/L吲哚。
36.一种产生包括乙醇的组合物的方法，其包括，使权利要求1-12的任一项所述的修饰的细胞与包括至少一种可发酵的糖的培养基接触，其中这种接触在至少第一发酵工艺期间进行，以产生包括乙醇的组合物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中至少一种可发酵的糖在至少一种糖源中提供。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中可发酵的糖是葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和/或麦芽三糖。
39.根据权利要求36-38的任一项所述的方法，其中至少一种糖源包括至少一种前体。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述至少一种前体包括半胱氨酸缀合的3-巯基己-1-醇(Cys 3-MH)、半胱氨酸-缀合的4-甲基-4-巯基戊-2-酮(Cys 4MMP)、谷胱甘肽缀合的3-巯基己-1-醇(Glut-3-MH)和/或谷胱甘肽缀合的4-甲基-4-巯基戊-2-酮(Glut 4MMP)。
41.根据权利要求36-40的任一项所述的方法，进一步包括将一种或多种前体添加到培养基中，其中所述前体包括3-巯基己-1-醇(Cys 3-MH)、半胱氨酸-缀合的4-甲基-4-巯基戊-2-酮(Cys 4MMP)、谷胱甘肽缀合的3-巯基己-1-醇(Glut-3-MH)和/或谷胱甘肽缀合的4-甲基-4-巯基戊-2-酮(Glut 4MMP)。
42.根据权利要求36-41的任一项所述的方法，其中与包括由不表达异源基因的对应细胞或表达具有β-裂合酶活性的野生型酶的对应细胞产生的乙醇的组合物相比，包括乙醇的组合物进一步包括增加水平的至少一种挥发性巯基。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述至少一种挥发性硫醇包括3-巯基己-1-醇(3MH)、3-巯基乙酸己酯(3MHA)、4-甲基-4-巯基戊-2-酮(4MMP)或其组合。
44.根据权利要求43所述的方法，其中包括乙醇的组合物进一步包括至少200ng/L 3-巯基己-1-醇(3MH)、3-巯基乙酸己酯(3MHA)和/或4-甲基-4-巯基戊-2-酮(4MMP)。
45.根据权利要求36-44的任一项所述的方法，其中与包括由不表达异源基因的对应细胞或表达具有β-裂合酶活性的野生型酶的对应细胞产生的乙醇的组合物相比，包括乙醇的组合物进一步包括降低水平的至少一种不希望的产物。
46.根据权利要求45所述的方法，其中至少一种不希望的产物是吲哚。
47.根据权利要求36-46的任一项所述的方法，其中包括乙醇的组合物是发酵饮料。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述发酵饮料是啤酒、葡萄酒、起泡酒(香槟)、清酒、蜂蜜酒、康普茶或苹果酒。
49.根据权利要求36-48的任一项所述的方法，其中糖源包括麦芽汁、水果果汁、蜂蜜、大米淀粉或其组合。
50.根据权利要求49所述的方法，其中水果果汁是葡萄果汁或苹果果汁。
51.根据权利要求36-50的任一项所述的方法，其中所述糖源是麦芽汁并且所述方法进一步包括产生培养基，其中产生培养基包括：
(a)使多种谷物与水接触；和
(b)煮沸或浸泡水和谷物以产生麦芽汁。
52.根据权利要求51所述的方法，进一步包括将至少一种啤酒花种类添加到麦芽汁中以产生加了啤酒花的麦芽汁。
53.根据权利要求36-52的任一项所述的方法，进一步包括将至少一种啤酒花种类添加到培养基中。
54.根据权利要求36-53的任一项所述的方法，进一步包括至少一种另外的发酵工艺。
55.根据权利要求36-54的任一项所述的方法，进一步包括使发酵产物碳酸化。
56.通过权利要求36-55的任一项所述的方法产生的包括乙醇的组合物。
57.根据权利要求56所述的组合物，其中组合物进一步包括至少200ng/L 3-巯基己-1-醇(3MH)、3-巯基乙酸己酯(3MHA)和/或4-甲基-4-巯基戊-2-酮(4MMP)。
58.根据权利要求56或57所述的组合物，其中发酵产物包括小于500μg/L吲哚。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090221027A1 (en) * 2005-07-18 2009-09-03 Basf Ag Use of a bacillus meti gene to improve methionine production in microorganisms
WO2007095682A1 (en) * 2006-02-24 2007-08-30 The Australian Wine Research Institute Methods and micro-organisms for modulating the conversion of non-volatile sulfur compounds to volatile thiol compounds

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