ES2371472T3

ES2371472T3 - Uso de levaduras mutantes ure2 para incrementar la liberacion de tioles volátiles aromáticos mediante levadura durante la fermentación.

Info

Publication number: ES2371472T3
Application number: ES07866642T
Authority: ES
Inventors: Denis Dubourdieu; Cecile Thibon; Takatoshi Tominaga; Philippe Marullo
Original assignee: Universite Victor Segalen Bordeaux 2; Sarco
Current assignee: Universite Victor Segalen Bordeaux 2; Sarco
Priority date: 2006-12-01
Filing date: 2007-11-30
Publication date: 2012-01-03
Anticipated expiration: 2027-11-30
Also published as: EP2097511A2; EP1927654A1; WO2008068635A3; ATE481473T1; EP2097511B1; WO2008068635A2; DE602007009310D1

Abstract

Uso de una levadura mutante URE2 que tiene una mutación de pérdida de función en el gen URE2 para incrementar la liberación de tiol volátil aromático mediante levadura durante la fermentación.

Description

Uso de levaduras mutantes URE2 para incrementar la liberación de tioles volátiles aromáticos mediante levadura durante la fermentación

La reacción se refiere al uso de levaduras mutantes URE2 para incrementar la liberación de tioles volátiles aromáticos mediante levadura durante la fermentación y su aplicación para mejorar el aroma de productos fermentados, en particular bebidas alcohólicas producidas mediante fermentación de levaduras (vino, sidra, cerveza), así como para desarrollar cepas iniciadoras de levaduras con capacidades de liberación de tiol volátil optimizadas.

Los tioles volátiles son moléculas extremadamente aromáticas que pueden afectar el aroma de numerosas comidas tales como frutas y carne a la brasa (Shankaranarayana et al., Sulphur compounds in flavours. In Food Flavors; Morton, I.D., Macleod, A.J., Eds; Elsevier Science Publishers: Amsterdam, 1982; part A, p. 169-281). Diversos compuestos de esta familia juegan un papel decisivo en la contribución al aroma de vinos preparados a partir de la variedad de uva Sauvignon blanc (Tominaga et al., J. Agric. Food Chem., 1998c, 46: 5215-5219). Su contribución aromática también se demostró sucesivamente en otras variedades de uva diversas tales como Gewurztraminer, Semillon botritizado, Colombard, Petit-manseng (Tominaga et al., Am. J. Enol. Vitic., 2000a, 51, 178-181) y Merlot (Aznar et al., J. Agric. Food Chem., 2000, 49, 2924-2929). Entre estos compuestos, 4-mercapto-4metilpentan-2-ona (4MMP) (Darriet et al., Flavour Fragr. J., 1995, 10, 385-392; Tominaga et al., 1998c, citado previamente) y 3-mercaptohexan-1-ol (3MH) (Tominaga et al., Flavour Fragr. J., 1998a, 13, 159-162) se forman principalmente durante la fermentación alcohólica a partir de precursores conjugados de S-cisteína no volátiles inodoros presentes en el mosto (Tominaga et al., J. Int. Sci. Vigne Vin., 1995, 29, 227-232; Tominaga et al., 1998a). La transformación de tales precursores en tioles volátiles se logra mediante metabolismo de levaduras e implica una actividad carbono-azufre �-liasa (Tominaga et al., 1998c ; Wakabayashi et al., J. Agric. Food Chem., 2004, 52, 110-116). El acetato de 3-mercaptohexilo (3MHA o A3MH) resultante de la acetilación de 3MH mediante levadura también contribuye al aroma del vino.

4MMP, 3MHA y 3MH están caracterizados por descriptores afrutados (boj, maracuyá y pomelo, respectivamente) y presentan umbrales de percepción muy bajos (0,8, 4,2, y 60 ng l-1, respectivamente; Tominaga et al., 1998a). Además, 3MH y 3MHA son moléculas quirales con 2 enantiómeros, R y S. En el vino blanco seco preparado a partir de uvas sanas, 3MH es casi racémico (relación R y S alrededor de 50:50), mientras que 3MHA está mayormente en la forma S (relación R y S alrededor de 30:70). En los vinos preparados a partir de uvas botritizadas (Botrytis cinerea), la distribución de enantiómeros de 3MH es de 30:70 a favor de la forma S. Se demostró recientemente que los enantiómeros 3MH(R) y 3MH(S) producían matices aromáticos diferentes (pomelo y maracuyá, respectivamente) con umbrales de percepción similares en solución hidroalcohólica modelo (50 y 60 ng l, respectivamente). Los umbrales de percepción de los enantiómeros R y S de 3MHA son ligeramente diferentes (9 y 2,5 ng/l): la forma R menos odorífera es reminiscente de maracuyá, mientras que la forma S tiene un olor más herbáceo de boj (Tominaga et al., J. Agric. Food. Chem., 2006, 54, 7251-7255).

Las poderosas propiedades aromáticas de estas moléculas impulsaron estudios recientes para entender cómo puede potenciarse y modularse su producción en la vinificación. Prácticas vitícolas tales como el suministro de nitrógeno (Chone et al., J. Int. Sci. Vigne Vin., 2006, 40, 1-6) y operaciones de prefermentación tales como la maceración pelicular (Peyrot des Gachons et al., Am. J. Enol., Vitic., 2002, 53, 144-156) modulan la cantidad de precursores aromáticos en el mosto de uva. Las condiciones de la fermentación tales como la temperatura (Howell et al., FEMS Microbiol. Letter, 2004, 240, 125-129; Masneuf-Pomarede et al., Int J. Food Microbiol., 2006, 108, 385-390) también influencian la concentración final de estos aromas en el vino. Sin embargo, el factor más importante en la liberación de tiol es indudablemente la cepa de levaduras (Dubourdieu et al., Am. J. Enol. Vitic., 2006, 57, 81-88). Se encontró una fuerte variabilidad (aproximadamente de diez veces) entre las cepas iniciadoras de vino industrial de S. cerevisiae (Murat et al., 2001, Am. J. Enol., 52, 136-140; Howell et al., 2004, citado previamente; Masneuf-Pomarede et al., Int. J. Food Microbiol., 2006, 108, 385-390), S. uvarum, e híbridos interespecíficos relacionados (Masneuf et al., J. Int. Sci. Vigne Vin, 2002, 36, 205-212). Esta variabilidad indujo programas de rastreo y cría de cepas para obtener nuevas cepas que tienen liberación de tiol más alta (Murat et al., 2001; Masneuf et al., 2002, citado previamente). Sin embargo, sigue sin estar claro el determinismo genético y los mecanismos moleculares de la liberación de tiol mediante levadura.

Recientemente, Howell et al. identificaron tres genes BNA3, CYS3 y IRC7 que codifican �-liasa putativa en el genoma de Saccharomyces cerevisiae. Usando experimentos de deleción de gen en un precedente de cepas de levadura de vino, se sugiere que estas enzimas pueden escindir el precursor de 4MMP en aroma volátil relacionado durante la fermentación en el zumo de uva sintético (Howell et al., Applied Environ. Microbiology, 2005, 71, 5420-5426): Entre estos genes, se encontró que BNA3 que codifica para una arilformamidasa contribuye fuertemente a la liberación de tiol volátil. Aunque se han identificado estas enzimas, los mecanismos de escisión y asimilación de precursores mediante levaduras durante la fermentación están lejos de entenderse bien.

Ure2p es un regulador transcripcional de genes implicado en el metabolismo de nitrógeno en levadura que actúa como regulador negativo de los genes sensibles a la represión por catabolito de nitrógeno (NCR) (Cooper, T. G. y Sumrada, R.A., J. Bacteriol., 1983, 155, 623-627; Coschinago, P.W. y Magasanik, B., Mol. Cell. Biol., 1991, 11, 822-832; Ter Schure et al., FEMS Microbiol. Reviews, 2000, 24, 67-83; Magasanik, B., P.N.A.S., 2005, 102, 16537-16538; Cooper T., 1982, Transport in Saccharomyces cerevisiae. En The molecular biology of yeast Saccharomyces metabolism and gene expression. Strathern, J.N., Laboratory CSH, Eds, pp. 399-461). La represión por catabolito de nitrógeno (NCR) es el mecanismo por el que una levadura puede seleccionar fuentes de nitrógeno permitiendo el mejor crecimiento (fuente de nitrógeno, fuente buena en nitrógeno o fuente rica en nitrógeno preferidas: glutamato, glutamina, amoniaco y asparragina) sobre las fuentes de nitrógeno no preferidas (fuente pobre en nitrógeno: urea, gamma-amino-butirato, aminoácidos tales como prolina y arginina), mediante la represión de la transcripción de algunos genes (genes sensibles a NCR) implicados en la utilización (transporte: permeasas; degradación: enzimas catabólicas) de las fuentes más pobres en nitrógeno (Cooper y Sumrada, citado previamente). Bajo condiciones ricas en nitrógeno (condiciones represivas), Ure2p forma complejos con Gln3p y Gatlp, activadores transcripcionales de la familia GATA, en el citoplasma, para disminuir la transcripción de genes que codifican las proteínas necesarias para el transporte y la degradación de las fuentes pobres en nitrógeno (NCR-sensitive expression; Ter Schure et al., citado previamente; Scherens et al., FEMS Yeast Res., 2006, 6, 777-791). Por otro lado, si sólo están disponibles fuentes de nitrógeno no preferidas, Gln3p y Gatlp están desfosforilados y se mueven desde el citoplasma al núcleo, en el que regulan positivamente la expresión de genes sensibles a NCR para el transporte y el catabolismo de nitrógeno. El control de la represión catabólica de nitrógeno es eficaz durante la fermentación de vino (Rossignol et al., Yeast, 2003, 20, 13691385; Beltran et al., FEMS Yeast Res., 2004, 4, 625-632) y puede eliminarse mediante deleción del gen URE2. Tal deleción mejora la captación de nitrógeno lo que conduce a una mejora en la cinética de la fermentación bajo condiciones enológicas (Salmon, J.M. y Barre P., Applied and Environ. Microbiol., 1998, 64, 3831-3837; I.S. Pretorius, Yeast, 2000, 16, 675-729).

Ure2p presenta un pliegue de GST que contiene un dominio de pliegue de tiorredoxina N-terminal y un dominio alfa helicoidal C-terminal. Un cambio conformacional transmisible de Ure2p da como resultado un prión denominado [Ure3], un amiloide infeccioso, autopropagante e inactivo. El dominio de pliegue de tiorredoxina N-terminal (N-terminal ~ 90 aminoácidos) es suficiente para inducir el fenotipo [Ure3] y también se denomina el dominio de priones de Ure2p (Masison et al., P.N.A.S., 1997, 94, 12503-12508). Además de su papel en la regulación de nitrógeno, Ure2p confiere protección a las células frente a toxicidad por oxidantes e iones metálicos pesados y muestra actividad de glutatión (GSH) peroxidasa (Bai et al., J. Biol. Chem., 2004, 279, 50025-50030). El sitio activo de GST está localizado en una hendidura entre los dominios N- y C-terminales.

El gen URE2 que se conserva en levadura codifica la subfamilia similar a Ure2p de proteínas compuestas por Ure2p de Saccharomyces cerevisiae de la secuencia de aminoácidos SEC. ID Nº: 1 (354 aminoácidos, número de acceso NP_014170.1) y glutatión S-transferasas (GSTs) relacionadas de otras levaduras que tienen una secuencia que es homóloga a la SEC. ID Nº: 1. Por ejemplo, el gen URE2 de Saccharomyces cerevisiae está localizado desde las posiciones 219138 hasta 220202 en la cadena complementaria del cromosoma XIV (número de acceso NCR_001146; gen ID 855492, marca de locus YNL229C). La secuencia de gen URE2 de otras levaduras está disponible en las bases de datos.

El gen IRC7 de Saccharomyces cerevisiae (Gen ID: 850616 ; nombre sistemático: YFR055W) que está localizado desde las posiciones 264191 hasta 265213 en el cromosoma VI (número de acceso: NCR_001138.4) codifica Irc7p: una cistationina beta-liasa.

Los inventores han construido un mutante de deleción de gen URE2 (mu t a n t e fu r e 2 ) en un precedente de cepas de levadura de vino y han mostrado que, bajo condiciones enológicas, el mutante fu r e 2 libera 3 veces más tioles volátiles que la cepa de tipo salvaje. De manera sorprendente, el equilibrio (R)/(S) de 3MH se incrementó significativamente en la cepa fu r e 2 , poniendo la razón (R)/(S) a 70:30, en comparación con 50:50 en la cepa de tipo salvaje. Estos resultados indican que, además de potenciar la liberación de aroma, la deleción de fu r e 2 modifica la percepción sensorial del aroma de 3MH de vino mediante la intensificación de los armónicos de pomelo (descriptor

3MH(R)).

Además, en contra de lo que se sugirió en informes previos (Howell et al., 2005, citado previamente), experimentos de deleción de IRC7, CYS3 y BNA3 en un precedente de levadura de vino, indicaron que Irc7p es la enzima principal implicada en la escisión de precursor de tioles bajo condiciones enológicas; Bna3p y Cys3p no parecen desempeñar un papel crucial en la liberación de tioles volátiles, bajo condiciones enológicas. Además, experimentos de deleción de IRC7 en un precedente de levadura de vino fu r e 2 indicaron que IRC7 es el gen principal activado mediante deleción de URE2. Además, en ausencia de Irc7p, no se observó el cambio estequiométrico de los enantiómeros (R)/(S)-3MH inducido mediante deleción de URE2. Este resultado sugirió que la enzima Irc7p tenía una especificidad por sustrato mejor para (RR)-P-3MH produciendo en consecuencia más (R)-3MH.

Por tanto, desde un punto de vista biotecnológico, estas propiedades novedosas de levaduras mutantes URE2 y levaduras que sobreexpresan IRC7 abren nuevas vías para la producción de vino de estilo y especificaciones definidas, así como para desarrollar cepas iniciadoras de levadura de vino con capacidades de liberación de tiol volátil optimizadas.

La invención se refiere al uso de una levadura mutante URE2 (mutante URE2) que tiene una mutación de pérdida de función en el gen URE2 para incrementar la liberación de tiol volátil aromático mediante levadura durante la fermentación.

Definición

"mutacion" se refiere a la sustitución, deleción, adición de uno o más nucleótidos en un polinucleótido (ADNc, gen).

" mutante URE2 que tiene una mutación de pérdida de función en el gen URE2 ", se refiere a un mutante de

levadura que tiene una pérdida parcial o total (mutación nula) de función en el gen URE2 y muestra defectos en la represión de catabolito de nitrógeno (NCR) y/o en la actividad de glutatión peroxidasa. El defecto en la NCR da como resultado un mutante que puede asimilar fuentes más pobres en nitrógeno en presencia de fuentes buenas en nitrógeno. El defecto en la actividad de glutatión peroxidasa incrementa la sensibilidad a oxidantes e iones metálicos pesados.

por "homologo" se entiende una secuencia con identidad suficiente con otra para conducir a una proteina que tiene la misma función, particularmente que tiene al menos una identidad del 70%, preferiblemente una identidad del 80% y más preferiblemente del 90%.

"Identidad" se refiere a la identidad de secuencia entre dos moleculas de acido nucleico o polipeptidos. Puede determinarse la identidad comparando una posición en cada secuencia que puede alinearse para los propósitos de la comparación. Si una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Un grado de similaridad o identidad entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleidos es una función del número de nucleótidos idénticos o coincidentes en posiciones compartidas por las secuencias de ácidos nucleicos. Pueden usarse varios programas y/o algoritmos de alineación para calcular la identidad entre dos secuencias, que incluyen FASTA o BLAST que están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencias GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.) y pueden usarse, p. e., con los ajustes predeterminados.

"levadura de vino" se refiere a una levadura, normalmente una cepa de Saccharomyces sp., con alta tolerancia a etanol, resistencia a dióxido de azufre y capacidad para fermentar rápida y eficazmente zumo de uva que contiene azúcar del 20 al 25% sin producir defectos organolépticos (acetato (acidez volátil)), sulfuro de hidrógeno y compuestos de fenol).

"tiol volatil aromatico " se refiere a un compuesto quimico organico que: (i) contiene el grupo funcional compuesto de un átomo de azufre y un átomo de hidrógeno (-SH), (ii) tiene presiones de vapor suficientemente altas bajo condiciones normales para vaporizar significativamente y (iii) es oloroso (activo de sabor).

"fermentacion" se refiere a cualquiera de un grupo de reacciones quimicas en el que un microorganismo vivo o no vivo provoca que una sustancia orgánica se rompa en sustancias más simples; especialmente, la rotura anaeróbica de azúcar en alcohol (fermentación alcohólica).

vino se refiere a una bebida alcoholica producida mediante la fermentacion del zumo de frutas, normalmente uvas. Vinos no de uva se denominan vino de fruta o vino de la tierra. Otros productos preparados a partir de materiales basados en almidón, tales como vino de cebada, vino de arroz (sake) son más similares a cervezas. Bebidas preparadas a partir de materiales fermentables tales como (aguamiel), o que se destilan, tales como brandy, no son vinos.

cerveza se refiere a una bebida fermentada alcohólica preparada más a menudo a partir de cebada malteada, lúpulo, levadura y agua.

Según la presente invención, el tiol volátil se libera a partir de precursor(es) de tiol(es) no volátil(es) presente(s) en un producto (producto inicial), durante la fermentación mediante el mutante URE2. La fermentación del producto inicial mediante el mutante URE2 da como resultado un producto fermentado (producto terminado), en particular una bebida alcohólica (vino, sidra, cerveza), que tiene aroma mejorado como resultado de un contenido en tiol volátil activo en aroma más alto.

Según la presente invención, la mejora del aroma incluye la potenciación del aroma resultante de la liberación potenciada de los diferentes matices de dicho aroma. También puede incluir la potenciación selectiva de un matiz específico del aroma, dando como resultado una modificación selectiva del aroma.

El mutante URE2 puede ser un mutante natural o un mutante obtenido mediante manipulación genética.

El mutante se deriva de cepas de levadura que pueden fermentar alta cantidad de azúcar que incluyen cepas de destilación, de panadería, de cerveza, de vino y/o cualquier otra cepa bien conocida por su capacidad para liberar compuestos aromáticos.

Los mutantes naturales que carecen de función Ure2p (alelos nulos o mutación nula) se conocen bien en la técnica; por ejemplo alelos mutantes URE2, también conocidos como usu y gdhCR, se han descrito previamente (Grenson, M., Eur.

J. Biochem., 1969, 11, 249-260; Grenson et al., Mol. Gen. Genet., 1974, 128, 73-85; Courchesne et al., J. Bacteriol., 1988, 170, 708-713 ; Drillien et al., J. Bacteriol., 1972, 109, 203-208 (cepa FL467-3D); Legrain et al., Eur. J. Biochem., 1982, 123, 611-616 (cepa 12597a); Brandriss et al., Can. J. Bot., 1995, 73 (Suppl.): S153-S159 ; Coffman et al., J. Bacteriol., 1994, 176, 7476-7483 ; Xu et al., Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 2321-2330; Coschigano, P.W. y B. Magasanik, Mol. Cell. Biol., 1991, 11, 822-832). Estos mutantes se caracterizan como que poseen: (i) enzimas catabólicas de nitrógeno insensibles a la represión de catabolito de nitrógeno, mayormente en las rutas implicadas en asimilación de glutamato, glutamina, arginina, alantoína, urea, gamma-aminobutirato y prolina, (ii) actividad de permeasas de aminoácidos incrementada, (iii) resistencia de transporte ureido-succinato a la represión de nitrógeno. La mutación URE2 se identificó para alguno de los mutantes. Por ejemplo, la mutación Ure2-1 identificada en la cepa P5-5D de S. cerevisiae es una transición de t a c en la posición 1119 de la secuencia de nucleótidos provocando que la fenilalanina en la posición 313 de la secuencia de aminoácidos se sustituya por una serina (Coschigano, P.W. and Magasanik B., citado previamente).

Otros mutantes URE2 pueden obtenerse mediante rastreo para detectar levaduras que tienen un fenotipo tal como se definió anteriormente.

Los mutantes URE2 que tienen deleciones grandes en la secuencia codificante de URE2 y que carecen de función Ure2p, se han construido según técnicas de interrupción de gen estándar en levadura (Rothstein, R.J., Methods

Enzymol., 1983, 101, 202-211 ; Wach et al., Yeast, 1994, 10, 1793-1808). Por ejemplo, los mutantes de interrupción URE2 se construyeron mediante la sustitución de una copia cromosómica de la secuencia codificante de URE2, completamente o en parte (fragmentos de HindIII o SacII-PvuII), mediante una marcador de selección complementario para levadura (LEU2, URA3).

Los mutantes URE2 se construyeron mediante mutagénesis aleatoria (mutagénesis UV) y se rastrearon para detectar levaduras desreprimidas para la utilización de prolina bajo represión de nitrógeno, que pueden crecer en presencia de prolina como única fuente de nitrógeno y metilamina (análogo de amoniaco) a concentración represiva (Salmon, J.M. y Barre P., Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64, 3831-3837).

Otros mutantes pueden construirse mediante técnicas de mutagénesis estándar (aleatorias y dirigidas a sitio) que se conocen bien en la técnica, seguido de rastreo para detectar mutantes URE2 que tienen un fenotipo tal como se definió anteriormente.

El mutante URE2 puede ser homozigoto o heterozigoto para la mutación URE2.

Además, la mutación URE2 puede introducirse en un precedente apropiado mediante análisis de segregación y apareamiento espora a espora usando procedimientos genéticos de levadura convencional usando cepas homotálicas o heterotálicas (patente de los Estados Unidos 6.140.108; Marullo et al., FEMS Yeast Res., 2006, 6, 268-279; Bakalinsky et al., Applied and Environ. Microbiology, 1990, 56, 849-857):

La liberación de tiol volátil se mide mediante un procedimiento adecuado bien conocido en la técnica, tal como por ejemplo: Extracción específica de tioles volátiles (Tominaga et al., J. Agric. Food. Chem., 1998, 46, 1044-1048; Tominaga et al., J. Agric. Food. Chem., 2000, 48, 1799-1802), seguido de cromatografía de gas acoplada con espectrofotómetro de masas (CG/EM; Tominaga et al., J. Agric. Food. Chem., 1998, 46, 1044-1048), detección fotométrica de llama (CG/FPD; Tominaga, T. y Dubourdieu, D., Flavour Fragrance J., 1997, 12, 373-376), olfatometría (CG/olfatometría; Darriet et al., J. Int. Sci. Vigne Vin., 1991, 25, 167-174) o detección de emisión atómica (CG/AED; Howell et al., FEMS Microbiology Letters, 2004, 240, 125-129).

El aumento de tiol volátil mediante el mutante URE2 puede evaluarse mediante comparación con una cepa de levadura casi isogénica no mutada en el gen URE2, crecida en las mismas condiciones.

Según una realización preferida de dicho uso, el mutante es un mutante nulo que carece de función Ure2p.

Según otra realización preferida de dicho uso, la levadura mutante URE2 es homozigoto para la mutación URE2.

Según otra realización preferida de dicho uso, el mutante URE2 es un mutante de Saccharomyces sp. o de un híbrido interespecífico derivado. En particular, el mutante puede derivarse de S. cerevisiae, S. bayanus (var. uvarum), S. paradoxus o de híbridos interespecíficos de Saccharomyces, tales como S. pastorianus.

Según otra realización preferida de dicho uso, el mutante URE2 es un mutante de levadura de vino, preferiblemente una cepa de levadura de vino comercial elegida de: VL3c, X5 y RX60.

Según otra realización preferida de dicho uso, el tiol volátil deriva de un precursor conjugado con S-cisteína, tal como se indica en la tabla I.

El tiol volátil se selecciona preferiblemente a partir del grupo constituido por: 4MMP, 3MH, 4MMPOH, 3MHA, 3MPOH, 3MHepOH, 3M2MBOH, y/o 3M2MPOH, más preferiblemente a partir de 4MMP, 3MH y/o 3MHA. Además, el 3MH que se libera mediante el mutante de levadura puede consistir ventajosamente de más enantiómero (R) que enantiómero (S); el 3MH consiste ventajosamente de al menos el 70% de enantiómero (R) (relación de enantiómero (R) respecto a (S) superior o igual a 70:30).

Según otra realización preferida de dicho uso, la liberación de al menos dos tioles volátiles aromáticos diferentes se incrementa durante la fermentación.

Según otra realización preferida de dicho uso, la liberación de tiol volátil aromático se incrementa al menos por un factor de 3.

Según otra realización preferida de dicho uso, dicha fermentación es fermentación alcohólica, preferiblemente fermentación de vino.

La invención se refiere también a un procedimiento para potenciar el aroma de un producto fermentado producido mediante fermentación de un producto inicial que contiene al menos un precursor de tiol no volátil, que comprende la incubación del producto inicial con una levadura mutante URE2 tal como se definió anteriormente, bajo condiciones que permiten que la fermentación mediante el mutante URE2 se produzca y, por tanto, que incremente la liberación de tiol(es) volátil(es) a partir del/de los precursor(es) de tiol no volátil, mediante la levadura mutante, durante la fermentación.

Según una realización preferida de dicho procedimiento el producto fermentado es una bebida alcohólica, preferiblemente vino, más preferiblemente vino preparado a partir de una variedad de uva no floral o simple, tal como por ejemplo: Sauvignon blanc, Gewurztraminer, Riesling, Semillon, Colombard, Scheurebe, Petit Manseng, Cabernet Sauvignon y Merlot.

Según otra realización preferida de dicho procedimiento el precursor de tiol no volátil es un precursor conjugado con Scisteína.

El tiol volátil se selecciona preferiblemente a partir del grupo constituido por: 4MMP, 3MH, 4MMPOH, 3MHA, 3MPOH, 3MHepOH, 3M2MBOH, y/o 3M2MPOH, más preferiblemente a partir de 4MMP, 3MH y/o 3MHA.

Según otra realización preferida de dicho procedimiento, la liberación de tiol(es) volátil(es) aromático(s) se incrementa al menos por un factor de 3.

La invención se refiere también a un procedimiento para potenciar el armónico de pomelo de un producto fermentado producido mediante fermentación de un producto inicial que contiene S-3-(hexan-1-ol)-L-cisteína (precursor de 3MH), que comprende la incubación del producto inicial con una levadura mutante URE2 tal como se definió anteriormente, bajo condiciones que permiten que la fermentación mediante el mutante URE2 se produzca y, por tanto, que incremente la liberación del enantiómero 3MH (R), mediante la levadura mutante, durante la fermentación.

Según una realización preferida de dicho procedimiento, la relación de enantiómero (R) respecto a (S) es superior o igual a 70:30 (3MH constituido por al menos el 70% de enantiómero (R)).

La invención se refiere también a un procedimiento para la identificación de levaduras que pueden mejorar el aroma de un producto fermentado, que comprende al menos las etapas de:

(a) Obtención de levaduras mutantes URE2,

(b): inoculación del/de los mutante(s) URE2 de la etapa (a) en un medio de fermentación que contiene precursor(es) de tiol(es) no volátil(es), bajo condiciones que permiten que la fermentación mediante el mutante URE2 se produzca y, por tanto, que libere el/los tiol(es) volátil(es) a partir del/de los precursor(es) de tiol(es) no volátil(es), mediante la levadura mutante, durante la fermentación,

(c): medida del/de los tiol(es) volátil(es) liberado(s) en el medio fermentado, mediante cualquier medio apropiado, tal como se definió anteriormente,

(d): identificación del/de los mutante(s) URE2 que puede(n) liberar alto nivel de tiol volátil aromático, en comparación con levadura que tiene un gen URE2 de tipo salvaje en un precedente genético casi isogénico.

Los mutantes URE2 se derivan de una cepa de levadura que puede fermentar alta cantidad de azúcar que incluye cepas de destilación, de panadería, de cerveza, de vino y/o cualquier otra cepa bien conocida por su capacidad para liberar compuestos aromáticos.

Los mutantes URE2 pueden obtenerse mediante rastreo de mutante(s) URE2 a partir de una colección de levaduras o mediante manipulación genética, según procedimientos estándar, tal como se definió anteriormente.

Según una realización preferida de dicho procedimiento, el mutante URE2 se deriva de Saccharomyces sp. o de un híbrido interespecífico derivado, tal como se definió anteriormente.

Según otra realización preferida de dicho procedimiento, el mutante URE2 se deriva de una cepa de levadura de vino, preferiblemente elegida de: VL3c, X5 y RX60.

Según otra realización preferida de dicho procedimiento, la fermentación de la etapa (b) es fermentación alcohólica.

Según otra realización preferida de dicho procedimiento, la etapa (c) comprende la medida de tiol(es) volátil(es) seleccionado(s) del grupo constituido por: 4MMP, 3MH, 4MMPOH, 3MHA, 3MPOH, 3MHepOH, 3M2MBOH, y/o 3M2MPOH, más preferiblemente a partir de 4MMP, 3MH y/o 3MHA.

Preferiblemente, el mutante URE2 identificado en la etapa (d) libera al menos dos veces, preferiblemente al menos tres veces más tiol volátil que una levadura que tiene un gen URE2 de tipo salvaje en el mismo precedente genético.

Ya que Irc7p es la enzima principal implicada en la liberación de tioles volátiles bajo condiciones enológicas, IRC7 que sobreexpresa levaduras tiene un potencial para mejorar el aroma de un producto fermentado.

La invención se refiere también a un procedimiento para el rastreo de levaduras que tienen un potencial para mejorar el aroma de un producto fermentado, que comprende al menos las etapas de:

(a): proporcionar una colección de levaduras,

(b): ensayo del nivel de expresión de IRC7 en dichas levaduras durante la fermentación alcohólica,

(c) identificación de las levaduras que tienen nivel de expresión de IRC7 alto en comparación con una levadura mutante URE2 de un precedente genético casi isogénico.

Las levaduras son cepas de levadura que pueden fermentar alta cantidad de azúcar que incluyen cepas de destilación, de panadería, de cerveza y de vino y/o cualquier otra cepa bien conocida por su capacidad para liberar compuestos aromáticos.

Según una realización preferida de dicho procedimiento, las levaduras son de Saccharomyces sp. o de un híbrido interespecífico derivado, tal como se definió anteriormente.

Según otra realización preferida de dicho procedimiento, las levaduras son cepas de levadura de vino.

El nivel de expresión de IRC7 se ensaya mediante procedimientos que se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, la transcripción de IRC7 puede medirse mediante PCR en tiempo real cuantitativa usando protocolos estándar que se conocen en la técnica.

Según otra realización preferida de dicho procedimiento, comprende las etapas adicionales de:

(d): inoculación de las levaduras que sobreexpresan IRC7 de la etapa (c) en un medio de fermentación que contiene precursor(es) de tiol(es) no volátil(es), bajo condiciones que permiten que la fermentación mediante las levaduras que sobreexpresan IRC7 se produzca y, por tanto, que libere el/los tiol(es) volátil(es) a partir del/de los precursor(es) de tiol no volátil, mediante las levaduras que sobreexpresan IRC7, durante la fermentación,

(e): medida del/de los tiol(es) volátil(es) liberado(s) en el medio fermentado, mediante cualquier medio apropiado, tal como se definió anteriormente,

(f): identificación de las levaduras que sobreexpresan IRC7 que pueden liberar alto nivel de tiol volátil aromático en comparación con una levadura mutante URE2 de un precedente genético casi isogénico.

Según otra realización preferida de dicho procedimiento, la etapa (e) comprende la medida de tiol(es) volátil(es) seleccionado(s) del grupo constituido por: 4MMP, 3MH, 4MMPOH, 3MHA, 3MPOH, 3MHepOH, 3M2MBOH y/o 3M2MPOH, más preferiblemente a partir de 4MMP, 3MH y/o 3MHA.

Preferiblemente, las levaduras que sobreexpresan IRC7 identificadas en la etapa (f) liberan al menos dos veces, preferiblemente al menos tres veces más tiol volátil que una levadura que tiene un gen URE2 de tipo salvaje en un precedente genético casi isogénico.

Ya que Irc7p es la enzima principal implicada en la liberación de tioles volátiles bajo condiciones enológicas, las levaduras que seobreexpresan IRC7 pueden sustituir a las levaduras mutantes URE2 en el uso y en los procedimientos, tal como se definió anteriormente.

La invención se refiere también al uso de una levadura que sobreexpresa IRC7 para incrementar la liberación de tiol volátil aromático mediante levadura durante la fermentación.

El tiol volátil se selecciona preferiblemente a partir del grupo constituido por: 4MMP, 3MH, 4MMPOH, 3MHA, 3MPOH, 3MHepOH, 3M2MBOH y/o 3M2MPOH, más preferiblemente a partir de 4MMP, 3MH y/o 3MHA.

Además, el 3MH que se libera mediante la levadura puede consistir ventajosamente de más enantiómero (R) que enantiómero (S); el 3MH consiste ventajosamente de al menos el 70% de enantiómero (R) (relación de enantiómero (R) respecto a (S) superior o igual a 70:30).

La invención se refiere también a un procedimiento para potenciar el aroma de un producto fermentado producido mediante fermentación de un producto inicial que contiene al menos un precursor de tiol no volátil, que comprende la inoculación del producto inicial con una levadura que sobreexpresa IRC7, bajo condiciones que permiten que la fermentación mediante la levadura que sobreexpresa IRC7 se produzca y, por tanto, que incremente la liberación de tiol(es) volátil(es) a partir del/de los precursor(es) de tiol no volátil, mediante la levadura que sobreexpresa IRC7, durante la fermentación.

Según una realización preferida de dicho procedimiento, el producto fermentado es una bebida alcohólica, preferiblemente vino, más preferiblemente vino preparado a partir de una variedad de uva no floral o simple, tal como por ejemplo: Sauvignon blanc, Gewurztraminer, Riesling, Semillon, Colombard, Scheurebe, Petit Manseng, Cabernet Sauvignon y Merlot.

La invención se refiere también a un procedimiento para potenciar el armónico de pomelo de un producto fermentado producido mediante fermentación de un producto inicial que contiene S-3-(hexan-1-ol)-L-cisteína (precursor de 3MH), que comprende la inoculación del producto inicial con una levadura que sobreexpresa IRC7 tal como se definió anteriormente, bajo condiciones que permiten que la fermentación mediante la levadura que sobreexpresa IRC7 se produzca y, por tanto, que incremente la liberación del enantiómero 3MH (R), mediante la levadura que sobreexpresa IRC7, durante la fermentación.

La levadura que sobreexpresa IRC7 puede obtenerse mediante rastreo de una colección de levaduras tal como se definió anteriormente o mediante manipulación genética, según procedimientos estándar.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de microbiología, ADN recombinante, biología molecular, biología celular y cultivo celular que están dentro del alcance de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Methods of classical genetics. Biotechnology Handbooks Saccharomyces. Vol 4. (Wickner, R, Truite M. & Oliver S., Eds, 1991, pp 101-147); Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Además de las características precedentes, la invención también comprende otras características que surgen de la descripción que sigue, que se refiere a ejemplos que ilustran el uso de mutantes URE2 según la invención, así como a los dibujos adjuntos en los que:

-: la figura 1 ilustra la estéreoselectividad de mutantes fure2 para enantiómeros 3MH. En la cepa de deleción fure2, la producción de 3MH se incrementó fuertemente en comparación con el control; además, la relación 3MH(R)/(S) se desequilibró ampliamente, con el 70% de 3MH(R). Los valores son el promedio de los experimentos por triplicado.

-: la figura 2 representa la secuencia de un fragmento de 346 pb del gen URE2 de tipo salvaje (cepa S288c; SEC. ID Nº: 16) en comparación con la de un alelo defectivo URE2 que lleva la mutación G182E (SEC. ID Nº: 17). El fragmento de 346 pb corresponde a las posiciones de 219511 a 219856 de la secuencia NCBI con número de acceso NC_001146. La mutación introduce un sitio Mnl1 (cctc; destacado en gris) en el alelo URE2 mutante que puede detectarse mediante PCR/RFLP (la escisión de Mnl1 se produce en la posición 156 del fragmento).

Ejemplo 1: La deleción de URE2 mejora la liberación de tiol bajo condiciones enológicas

1) Material y procedimientos

a) Condiciones de cultivo y fermentación

Se cultivaron las levaduras a 30ºC en medio YPD completo (extracto de levadura al 1%, peptona al 1% y dextrosa al 2%) solidificado con agar al 2% en caso necesario. Se añadió G418 (100 -1) a YPD para seleccionar cepas

(g ml transformadas. Se indujo la esporulación sobre medio de acetato (acetato de potasio al 1%, agar al 2%) durante tres días a 24ºC. Se llevaron a cabo experimentos de fermentación a 24ºC en botellas de 350 ml que contenían medio modelo sintético descrito previamente como medio KP (Marullo et al., FEMS Yeast Research, 2006, 6, 268-279). Se tamponó este medio hasta pH 3,3 y se contuvieron 80 g l-1 de glucosa, 80 g l-1 de fructosa y 190 mg l-1 de nitrógeno disponible. Se añadieron precursores de aroma (P-4MMP y P-3MH) al medio antes de la inoculación de levadura a diferentes concentraciones, tal como se indico en el texto. Se inocularon cepas de levadura a 1x106 células ml-1 a partir de un cultivo durante toda una noche. Se midió la liberación de tiol volátil después de la fermentación completa (medida mediante pérdida de peso). Se llevaron a cabo todos los experimentos por triplicado y se repitieron independientemente dos o tres veces.

b) Cepas de levadura

Se derivó la cepa VL3-1D de Saccharomyces cerevisiae de un iniciador comercial (VL3c, Laffort Oenologie). Se asume que VL3-1D, un clon de espora diploide homotálica (HO/HO) obtenido mediante microdisección de tétradas, es totalmente homozigoto (Marullo et al., FEMS Yeast Research, 2004, 4, 711-719). Las cepas L-U (fure2/fure2), L-B ( Lbna3/ Lbna3), Lcys3/ Lcys3 y Lirc7/ Lirc7 se construyeron a partir de la cepa VL3-1D usando la estrategia de deleción mediante PCR (Baudin et al., Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3329-330; Wach et al., Yeast, 1994, 10, 1793- 1808).

Se obtuvieron casetes de deleción mediante amplificación del ADN genómico de cepas eliminadas apropiadas (BY4742 background) a partir de la colección Euroscarf (Frankfurt, Alemania). Se obtuvieron los casetes ure2::KanMx4 y bna3::KanMx4 usando los pares de cebadores p59: 5'-caaatgccgagaaaaataccgc-3' (SEC. ID Nº: 2) y p60: 5'- aaacgaacgccgaaacacata-3' (SEC. ID Nº: 3), pl: 5'-gagcagattgttttgagtagg-3' (SEC. ID Nº: 4), p2: 5'-ttcctaagcaactcatcgtg-3' (SEC. ID Nº: 5), respectivamente. Se obtuvieron los casetes irc7::KanMx4 y cys3::KanMx4 usando los pares de cebadores p314: 5'-tgataacgattttattgtcgcctc-3' (SEC. ID Nº: 6) y p315: 5'-tgatacagctagaaaattgaacca-3' (SEC. ID Nº: 7) y p316: 5'-gaccccataccacttctttttgtt-3' (SEC. ID Nº: 7) y p317: 5'-tgatctcgttctagttctggaagc-3' (SEC. ID Nº: 8), respectivamente.

Se transformaron químicamente las células (Puig et al., J. Agric. Food Chem., 1998, 46, 1689-1693) y se seleccionaron positivamente en YPD-G418. Se esporularon los clones crecientes de G418 y se microdiseccionaron para obtener clones de espora completamente homozigotos que llevan dos copias de gen eliminado. Se verificaron las deleciones correctas mediante PCR.

c) Síntesis de precursores

Síntesis de P-4MMP

Se sintetizó S-4-(4-metilpentan-2-ona)-L-cisteína (P-4MMP) mediante la adición de óxido de mesitilo (22 mmol) en Lcisteína (20 mmol) en agua destilada durante 16 h. Después de la extracción con éter dietílico (2 x 30 ml), se enfrió la capa acuosa hasta 0ºC y se añadió dicarbonato de di-ter-butilo (4,6 g, 21 mmol) en 20 ml de THF gota a gota y se agitó durante toda una noche. Después de la eliminación de THF mediante evaporación rotatoria, se ajustó la capa acuosa hasta pH 2-3 con ácido cítrico al 10 % en agua y se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). Se lavaron las capas orgánicas combinadas con agua (50 ml) y salmuera (50 ml), se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron a presión reducida. La purificación del producto en bruto mediante cromatografía en gel de sílice (pentano/ éter dietílico 35/65, Rf = 0,5) proporcionó un aceite incoloro (4,5 g, 70 %). Se añadió 1 ml de HCl acuoso 10 M (10 mmol) a (terbutoxicarbonil)- S-4-(4-metilpentan-2-ona)-L-cisteína (0,63g, 2 mmol) a temperatura ambiente. Después de que se completara la reacción, se retiró el exceso de HCl mediante calentamiento a 60ºC bajo presión reducida (0,1 mm Hg).

Síntesis de P-3MH

Se sintetizó S-3-(hexan-1-ol)-L-cisteína (P-3MH) según (Wakabayashi et al., J. Agric. Food Chem., 2004, 52, 110-116) y se modificó como sigue: Se añadió trans-2-hexen-1-al (5 mmol) a una solución agitada de N-(ter-butoxicarbonil) Lcisteína (4,5 mmol) y carbonato de cesio (2,25 mmol) en acetonitrilo durante toda una noche. Después de la eliminación del acetonitrilo mediante evaporación rotatoria, se añadió borohidruro de sodio (2,5 mmol) en 10 ml de metanol gota a gota y se agitó durante toda una noche. Se llevó a cabo la desprotección de 0,5 ml de N-(ter butoxicarbonil)-S-3-(hexan- 1-ol)-L-cisteína mediante la adición de HCl 10 M (5 mmol). Se concentró el producto en bruto y se purificó en una columna de intercambio de iones (DOWEX 50 WX8).

d) Ensayos de tiol volátil

Se extrajeron tioles volátiles al final de la fermentación a partir de 250 ml de medio sintético usando el procedimiento descrito previamente (Tominaga et al., J. Agric. Food Chem., 1998b, 46, 1044-1048) y se modificaron según (Tominaga et al., J. Agric. Food Chem., 2000b, 48, 1799-1802). Se cuantificaron cantidades de 4MMP, 3MH y 3MHA mediante

5 CGEM (cromatografía de fases y microextracción en fase sólida) según los procedimientos descritos por Tominaga et al., 1998b.

2) Resultados:

La cepa VL3-1D es un clon de espora meiótica (HO/HO) de la cepa comercial VL3c descrita previamente por su fuerte capacidad para revelar tioles volátiles (Murat et al., Am. J. Enol. Vitic., 2001, 52, 136-140; Howell et al., FEMS Microbiol

10 Lett., 2004, 240, 125-129; Howell et al., Appl. Environ. Microbiol., 2005, 71, 5420-5426; Masneuf-Pomarede et al., Int. J. Food Microbiol., 2006, 108385-390). Se obtuvo la cepa L-U que lleva dos copias eliminadas de URE2 (fure2/fure2) a partir de VL3-1D mediante deleción mediada por casete ure2::KanMx4.

Se compararon las propiedades cinéticas de este mutante con la cepa ts usando biorreactores tal como se describió previamente (Marullo et al., FEMS Yeast Research, 2006, 6, 268-279). Bajo condiciones enológicas, ambas cepas 15 mostraron parámetros cinéticos idénticos. Entonces se ensayó la liberación de tiol volátil de cepas ts y fu r e 2 en cultivos por lotes de 350 ml usando un medio de uva sintético con la adición de precursores sintéticos. Se ajustaron las concentración de precursor hasta 20 nM para P- 4MMP y 2000 nM para P-3MH de acuerdo con la composición de mosto de Sauvignon Blanc estándar (Peyrot des Gachons et al., J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 3387-3391). Durante la fermentación, el metabolismo de levadura produjo 4-mercapto-4-metilpentan-2-ona (4MMP) a partir de su conjugado de 20 S-cisteína (S-4-(4-metilpentan-2-ona)-Lcisteína) de aquí en adelante denominado como P-4MMP. De manera similar, se produjo 3-mercaptohexanol (3MH) a partir de S-3((hexan-1-ol)-L-cisteína (de aquí en adelante denominado como P 3MH). También puede acetilarse una parte de 3MH durante la fermentación, produciendo 3-acetato de mercaptohexilo (3MHA). Al final de la fermentación, se extrajeron de manera orgánica 4MMP, 3MH, y 3MHA producidos mediante levadura y se midieron mediante CG-EM (Tominaga et al., Flavour Fragr. J., 1998a, 13, 159-162). Se demostró

25 previamente la ausencia de tioles volátiles en el control no fermentado (Murat et al., Am. J. Enol. Vitic., 2001, 52, 136 140). Tal como se muestra en la tabla II, el mutante fure2 liberó 3 veces más tioles volátiles (4MMP, 3MH y 3MHA) que la cepa de tipo salvaje.

Tabla II: La deleción de URE2 potencia la liberación de tiol volátil bajo condiciones enológicas

30 a se midieron los aromas al final de la fermentación alcohólica de medio sintético que contenía precursores de aroma: P-4MMP=20 nM, P-3MH 2000 nM.

Los valores son el promedio de dos experimentos independientes llevados a cabo por triplicado.

* Diferente significativamente del control, ANOVA valor p <0,001

35 Ejemplo 2: La deleción de URE2 modifica el equilibrio de enantiómeros de 3MH

1) Material y procedimientos

Separación de dos enantiómeros de 3MH

Se inyectaron tioles volátiles extraídos en una columna quiral (INTERCHIM) Lipodex C (50 m x 0,25 mm) para separar los dos enantiómeros de 3MH. Las condiciones de cromatografía fueron idénticas a las descritas por Tominaga et al. (J. 40 Agric. Food Chem., 2006, 54, 7251-7255).

2) Resultados:

3MH es una molécula quiral con 2 enantiómeros, 3MH(R) y 3MH(S). Usando una metodología de CG-EM específica (Tominaga et al., J. Agric. Food. Chem., 2006, 54, 7251-7255), se midieron R y S-3MH en medio sintético al final de la fermentación alcohólica. En la figura 1 se muestra la cantidad relativa de los enantiómeros de 3MH de cepas VL3-1D 45 (ts) y L-U (fure2). Tal como se observó generalmente en el vino blanco seco, el medio fermentado mediante VL3-1D (ts) presentaba una mezcla racémica entre los enantiómeros (R) y (S) de 3MH (50:50). De manera sorprendente, las formas (R) y (S) en la cepa fure2 se incrementaron de manera significativa (4,1 veces y 2,0 veces, respectivamente),

poniendo la relación (R)/(S) a 70:30. Esta modificación del equilibrio (R)/(S) de 3MH sugiere que se producen mecanismos estéreoselectivos en mutantes de fure2. Estos hallazgos indicaron que, además de potenciar la liberación de aroma, la deleción de fu r e 2 puede modificar la percepción sensorial del aroma de 3MH de vino mediante la intensificación de los armónicos de pomelo (descriptor 3MH(R)).

Estos hallazgos demostraron que el gen URE2 inhibe fuertemente los mecanismos de liberación de tiol volátil durante la fermentación alcohólica, implicado probablemente la represión catabólica de nitrógeno. Debido a la regulación en dirección 5’, diversas dianas reguladas pueden afectar a la liberación de tiol. La activación completa de los factores de transcripción Gln3p y Gatlp pueden potenciar la expresión de las dos principales categorías de genes. En primer lugar, los genes regulados para aumentar su expresión que codifican enzimas catabólicas de nitrógeno (Scherens et al., FEMS, Yeast Research, 2006, 6, 777-791) pueden contribuir a la potenciación de la reserva de enzimas de escisión de precursores. En segundo lugar, transportadores pobres en nitrógeno expresados pueden incrementar la captación de precursor debido a su estructura similar a aminoácido.

Ejemplo 3: Impacto de diversas 1-liasas de levadura sobre la liberación de tioles volátiles en función de la concentración de precursor

1) Material y procedimientos

Véase el ejemplo 1

2) Resultados

Se describió que tres genes (BNA3, CYS3 y IRC7) contribuían fuertemente a la liberación de tioles volátiles (Howell et al., Appl. Environ. Microbiol., 2005, 71, 5420-5426). Ya que la deleción de URE2 parece que incrementa principalmente la actividad de escisión enzimática, se investigó en profundidad el papel de estos tres genes y su regulación mediante NCR en condiciones enológicas. Se eliminaron las dos copias de los genes BNA3, CYS3 y IRC7 en el precedente de VL3-1D. En primer lugar se ensayó el efecto de la deleción de estos genes mediante la medida de la liberación de tioles volátiles al final del proceso de fermentación alcohólica de un zumo de uva sintético que contenía cantidades naturales de precursores de aroma (es decir, P-4MMP = 20 nM y P-3MH = 3000 nM). A estas concentraciones, la deleción de IRC7 redujo drásticamente la liberación de 3MH (-41%) y de 4MMP (-96%) (tabla III) mientras que la deleción de BNA3 y de CYS3 no afectó a la liberación de tioles. Este resultado contradice parcialmente el presentado por (Howell et al., Appl. Environ. Microbiol., 2005, 71, 5420-5426)) que mostraba un papel para los genes CYS3, BNA3 y IRC7 en la liberación de 4MMP. Sin embargo, sus conclusiones se basaron en condiciones experimentales en las que el medio sintético contenía 0,1 g l-1 (450 (M) de P-4MMP, mientras que en el zumo de uva natural sólo se encuentran unos pocos (g l-1 (de 0,5 a 20 nM) Peyrot des Gachons et al., J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 3387-3391). Se planteó la hipótesis de que estas concentraciones altas pueden influenciar las condiciones estequiométricas de la reacción de liasa. Para verificar esta hipótesis, se midió la liberación de 4MMP en medio modelo sintético que contenía 200.000 nM de P-4MSP, correspondientes a 10.000 veces la concentración de P-4MMP en el zumo de uva. De acuerdo con los hallazgos de Howell, a esta concentración, la liberación de 4MMP caía cerca del 81% y del 96% para las cepas f bna3 y firc7, respectivamente (tabla III). Sin embargo, la deleción del gen CYS3 no afectó a esta liberación incluso cuando se usó una concentración alta de P-4MSP.

Tabla III: La cistationina 1-liasa Irc7p es la principal enzima implicada en la escisión de precursores de tiol

Ejemplo 4: El efecto de potenciación de la deleción de URE2 está mediada por la expresión de Irc7p.

1) Material y procedimientos

Extracción de ARN y síntesis de ADNc

Se recogieron muestras de biomasa para ensayo de expresión para el 10, 20, 40 y el 60 % del total de CO2 liberado. Se centrifugaron muestras de diez mililitros (5 min, 10.000 g) para sedimentar las células y se logra además la extracción completa según las instrucciones del fabricante. Se realizó el tratamiento de lisis usando un aparato Fastprep FP120 con los parámetros siguientes: 45 s a 65 m s-1 aplicado dos veces. Se separaron los dos ciclos mediante 5 min sobre hielo. Se trató la contaminación de ADN usando kit libre de ADN (AMBION INC), según las instrucciones del fabricante.

Se comprobó la ausencia de ADN contaminante mediante PCR directamente sobre los ARN. Se retrotranscribieron los ARN en ADNc usando el kit de síntesis de ADNc ScriptTM (BIO-RAD), según las instrucciones del fabricante. Para ambas cepas (fu r e 2 y TS) se realizaron extracciones a partir de tres lotes independientes. Análisis de expresión de IRC7 mediante PCR en tiempo real.

Se realizó PCR en tiempo real cuantitativa con SYBR-Green I usando el sistema de detección de PCR en tiempo real iCycler iQ (BIO-RAD). Cebadores p325 (5'-tcagcttctgggcttggttct-3', (SEC. ID Nº: 10) y p326 (5'-tcaacaccgaacttggccaat-3', SEC. ID Nº: 11) y p323 (5'-taccggccaaatcgattctc-3', SEC. ID Nº: 12) y p324 5'-cactggtattgttttggatacc-3', SEC. ID Nº: 13) se usaron para amplificar 137 pb de IRC7 (gen de interés) y 124 pb de ACT1 (gen de mantenimiento), respectivamente.

Se ha descrito el uso de ACT1 como gen de mantenimiento de manera rutinaria en la bibliografía (Giulietti et al., Methods, 2001; 25, 386-401 ; Bleve et al., Appl. Environ. Microbiol., 2003, 69, 4116-4122) como marcador de cuantificación para muchas especies de levaduras a través de PCR en tiempo real cuantitativa. Se llevaron a cabo PCRq en tiempo real usando mezcla iQ SYBR Green Super (BIO-RAD). Se añadieron los cebadores a una concentración de 0,3 mM cada uno. El programa de PCR fue como sigue: 3 min a 95ºC para desnaturalización inicial, entonces 40 ciclos de 30 s a 95ºC durante, 30 s a 58ºC y 30 s a 72ºC. Se llevó a cabo una curva de fusión final mediante 51 ciclos de 10 s comenzando a 65ºC con etapas de incremento de 0,5ºC en cada ciclo. La eficacia fue del 97,9 % y del 102,8 % para IRC7 y ACT1, respectivamente. Se determinó una curva estándar para cada gen en la que x es el ciclo umbral e y es el valor logarítmico de la cantidad de partida (ng): (IRC7 y= -3,374 x + 19,132, R2=0,997 y ACT1 y= -3,257 x + 20,308, R2=0,993). Se obtuvieron curvas estándar a partir de 8 puntos y se observó la linealidad desde 0,15 pg hasta 63 ng de ADN. Se fijó manualmente un valor umbral para la fluorescencia de todas las muestras, para mantener el mismo valor en cada experimento. Para la comparación de cepas, se calcularon las cantidades relativas de IRC7 y de ACT1 mediante representación sobre la curva estándar.

Se dan los resultados como la expresión en veces relativa de (IRC7/ACT1) tomando como referencia (=1) el valor de tipo salvaje al 10% de CO2 producido.

2) Resultados

Se demostró recientemente la activación de la transcripción de IRC7(YFR055c) en un precedente de fu r e 2 en condiciones de laboratorio (Scherens et al., Yeast Research, 2006, 6, 777-791). Se investigó esta activación de la transcripción durante la fermentación alcohólica para la cepa de vino de este estudio, usando PCR en tiempo real.

Durante la fermentación alcohólica, el nivel de transcripción de IRC7 se incrementó fuertemente en la cepa fu r e 2 en comparación con el control (TS) (tabla IV). Se encontró que los niveles de transcripción de IRC7 eran diferentes significativamente después de la liberación del 40% del CO2 (ANOVA de una dirección, P=0,05). Aunque pequeño, este incremento de 2 veces en la expresión de IRC7 en la cepa fu r e 2 explicaría la sobreproducción de 3 veces observada de tioles. No obstante, otras enzimas no investigadas, junto con Irc7p, pueden activarse mediante deleción de URE2 y entonces contribuir adicionalmente a la escisión enzimática. Por lo tanto, se investigó la contribución de Irc7p en un precedente de fu r e 2 mediante la comparación de la liberación de tioles en TS, fu r e2 , f icr7 y el mutante doble fu r e 2 firc7 (tabla V).

La liberación de 4MMP y de 3MH fue idéntica en las cepas f irc7 y fu r e 2 firc7. Por lo tanto en ausencia de la enzima Irc7p, la deleción de URE2 no incrementa la liberación de tioles. Esto demostró la relación epistática entre IRC7 y URE2 sugiriendo que en células derreprimidas, ninguna otra enzima que contribuye a la liberación de aroma se activó a través 5 de la ruta de NCR. Por tanto, Irc7p fue la única enzima cuya actividad de escisión de precursor se indujo transcripcionalmente a través de la ruta de regulación de NCR. Además, si Irc7p estaba ausente, no se observó el cambio estequiométrico de los enantiómeros (R)/(S)-3MH inducido mediante deleción de URE2 (tabla VI). Este hallazgo sugirió que la enzima Irc7p tenía una afinidad por sustrato mejor para (RR)-P-3MH produciendo en consecuencia más (R)-3MH. Se ha descrito previamente este tipo de estéreoselectividad para los diastereoisómeros de P-3MH para otras

10 �-liasas (Wakabayashi et al., J Agric. Food Chem., 2004, 52, 110-116).

Ejemplo 5: Selección de cepa de levadura mutante URGE2

Se introdujo un alelo defectivo de URE2 en un precedente de cepa industrial (cepa derivada X5) mediante procedimiento de retrocruzamiento. Se produjo el alelo de URE2 mediante un mutante EMS obtenido a partir de una cepa de levadura de laboratorio (Sigma 1219) según el procedimiento descrito en Drillien, R y F. Lacroute (J. Bacteriol., 15 1972, 109, 203-208). Comparado con el genoma S288c este mutante mostró una sustitución G182E en la parte central de la proteína (figura 2) correspondiente con la coordenada genómica de 219511 a 219856. Esta sustitución puede seguirse mediante una prueba de PCR/RFLP amplificando esta porción genómica mediante los cebadores P273 (5'aaagcttgtccaatcattggc-3', SEC. ID Nº: 14) y P274 (5'-ttttctctcacaggtctgcg-3', SEC. ID Nº: 15). Se detectó el alelo mutante mediante el corte del fragmento de PCR con la enzima Mnl1 que corta de manera específica dicho fragmento en la

20 posición 156.

Se siguió el alelo mutante URE2 durante un experimento de retrocruzamiento tal como se describió para otros rasgos por (Marullo et al., 2007 FEMS Yeast Res., 2007, 7, 1295-1306, Epub 2007 Sep 20). Después de dos retrocruzamientos, se comparó una cepa (BC2-3) que lleva este alelo con la cepa parental inicial (PI). Se esperaba que esta cepa compartiera más del 75% de homología con la cepa parental inicial. En términos de producción de tioles volátiles, esta

25 cepa produce 3 veces más 3MH que la cepa parental inicial (tabla VI).

Tabla VI: Potenciación de la producción de 3MH para una cepa URE2 obtenida mediante retrocruzamiento

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> SARCO

30 UNIVERSITE VICTOR SEGALEN BORDEAUX 2 INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE MARULLO, Philippe

THIBON, Cecile DUBOURDIEU, Denis TOMINAGA, Takatoshi

<120> Uso de levaduras mutantes URE2 para incrementar la liberación de tioles volátiles aromáticos mediante levadura 5 durante la fermentación

<130> s2012PCT1

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

10 <211> 354

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisae

<400> 1 <210>2

<211> 22

<212> ADN 5 <213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 2 caaatgccga gaaaaatacc gc 22 <210>3

10 <211> 21

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 3 aaacgaacgc cgaaacacat a 21 <210>4

<211> 21

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 4 gagcagattg ttttgagtag g 21 <210>5

<211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 5 ttcctaagca actcatcgtg 20 <210>6

<211> 24

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador p314

<400> 6 tgataacgat tttattgtcg cctc 24 <210>7

<211> 24

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador p315

<400> 7 tgatacagct agaaaattga acca 24 <210>8

<211> 24

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador p316

<400> 8 gaccccatac cacttctttt tgtt 24 <210>9

<211> 24

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador p317

<400> 9 tgatctcgtt ctagttctgg aagc 24

<210> 10

<211> 21

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador p325

<400> 10 tcagcttctg ggcttggttc t 21

<210> 11

<211> 21

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador p326

<400> 11 tcaacaccga acttggccaa t 21

<210> 12

<211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador p323

<400> 12 taccggccaa atcgattctc 20

<210> 13

<211> 22

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador p324

<400> 13 cactggtatt gttttggata cc 22

<210> 14

<211> 21

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador p273

<400> 14 aaagcttgtc caatcattgg c 21

<210> 15

5 <211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador p274 10 <400> 15 ttttctctca caggtctgcg 20

<210> 16 <211>346

<212> ADN

<213> secuencia artificial

15 <220>

<223> fragmento URE2 de tipo salvaje de 346 pb

<400> 16

20 <210> 17

<211> 346

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220> 25 <223> fragmento mutante URE2 G183E de 346 pb

<400> 17

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Uso de una levadura mutante URE2 que tiene una mutación de pérdida de función en el gen URE2 para incrementar la liberación de tiol volátil aromático mediante levadura durante la fermentación.
2.

Uso de la reivindicación 1, en el que el mutante es un mutante nulo que carece de función Ure2p.
3.

Uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que el mutante es un mutante de Saccharomyces sp. o de un híbrido interespecífico derivado.
4.

Uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el mutante es un mutante de una cepa de levadura de vino.
5.

Uso de la reivindicación 4, en el que la cepa de levadura de vino se selecciona del grupo constituido por: VL3c, X5 y RX60.
6.

Uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el tiol volátil aromático deriva de un precursor conjugado con S-cisteína.
7.

Uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el tiol volátil se selecciona del grupo constituido por: 4mercapto-4-metilpentan-2-ona (4MMP), 3-mercaptohexan-1-ol (3MH), 4-mercapto-4-metilpentan-2-ol (4MMPOH), acetato de 3-mercaptohexilo (3MHA), 3-mercaptopentan-1-ol (3MPOH), 3-mercaptoheptan-1-ol (3MHepOH), 3mercapto-2-metilbutan-1-ol (3M2MBOH) y/o 3-mercapto-2-metilpentan-1-ol (3M2MPOH).
8.

Uso de la reivindicación 7, en el que el 3MH que se libera mediante el mutante consiste de más enantiómero (R) que enantiómero (S).
9.

Uso de la reivindicación 8, en el que el 3MH consiste de al menos el 70% de enantiómero (R).
10.

Uso se cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la liberación de tiol volátil se incrementa al menos por un factor de 3.
11.

Uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la fermentación es fermentaciónalcohólica.
12.

Uso de la reivindicación 11, en el que el producto fermentado es una bebida alcohólica tal como vino.
13.

Uso de la reivindicación 12, en el que el vino se prepara mediante fermentación de una variedad de uva no floral o simple seleccionada del grupo constituido por: Sauvignon blanc, Gewurztraminer, Riesling, Semillon, Colombard, Scheurebe, Petit Manseng, Cabernet Sauvignon y Merlot.
14.

Procedimiento para potenciar el aroma de un producto fermentado producido mediante fermentación de un producto inicial que contiene al menos un precursor de tiol no volátil, que comprende la incubación del producto inicial con una levadura mutante URE2 tal como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, bajo condiciones que permiten que la fermentación mediante el mutante URE2 se produzca y, por tanto, que incremente la liberación de tiol(es) volátil(es) mediante la levadura mutante, durante la fermentación.
15.

Procedimiento para potenciar el armónico de pomelo de un producto fermentado producido mediante fermentación de un producto inicial que contiene S-3-(hexan-1-ol)-L-cisteína (precursor de 3MH), que comprende la incubación del producto inicial con una levadura mutante URE2 tal como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, bajo condiciones que permiten que la fermentación mediante el mutante URE2 se produzca y, por tanto, que incremente la liberación del enantiómero 3MH (R), mediante la levadura mutante, durante la fermentación.
16.

Procedimiento para la identificación de levaduras que pueden mejorar el aroma de un producto fermentado, que comprende al menos las etapas de:

(a) obtención de levaduras mutantes URE2,

(b)

inoculación del/de los mutante(s) URE2 de la etapa (a) en un medio de fermentación que contiene precursor(es) de tiol(es) no volátil(es), bajo condiciones que permiten que la fermentación mediante el/los mutante(s) URE2 se produzca y, por tanto, que libere el/los tiol(es) volátil(es) mediante el mutante, durante la fermentación,

(c)

medida del/de los tiol(es) volátil(es) liberado(s) en el medio fermentado, mediante cualquier medio apropiado y

(d)

identificación del/de los mutante(s) URE2 que puede(n) liberar alto nivel de tiol volátil, en comparación con levadura que tiene un gen URE2 de tipo salvaje en un precedente genético casi isogénico.

FIGURA 1

A >ts URE2 Chr 14 desde 219511 hasta 219856

5 B

>mutante URE2 Chr 14 desde 219511 hasta 219856

FIGURA 2

10 5