JP2000166547A

JP2000166547A - 新規グルタミナーゼ及びその製造方法

Info

Publication number: JP2000166547A
Application number: JP10347127A
Authority: JP
Inventors: Noriyuki Kitamoto; 則行北本; Shoko Yoshino; 庄子吉野; Homare Ito; 誉伊藤; Takashi Azeyanagi; 孝畔柳; Kayoko Takeda; 加代子竹田
Original assignee: Ichibiki Co Ltd; Aichi Prefecture
Current assignee: Ichibiki Co Ltd; Aichi Prefecture
Priority date: 1998-12-07
Filing date: 1998-12-07
Publication date: 2000-06-20

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】新規なグルタミナーゼの提供。【解決手段】特定の２種類のうちのいずれかのアミノ
酸配列を有するか、又はそれに対して修飾されたアミノ
酸配列を有するグルタミナーゼ。該グルタミナーゼは、
例えばアスペルギルス属微生物から得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なグルタミナ
ーゼ、該グルタミナーゼをコードする遺伝子系、及び該
グルタミナーゼの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】グルタミナーゼ(Glutaminase）〔EC3.
5. 1. 2〕はグルタミンからグルタミン酸を生成する酵
素であり、特に、麹菌が生成するグルタミナーゼは醤油
や味噌などの醸造中に旨味を高めるなどの重要な役割を
果たしている。（板倉辰六郎編著、醤油の化学と技
術、ｐ．１８１、日本醸造協会（１９８８））また、麹
菌のグルタミナーゼについては精製され、その性質が検
討されている。（T. Yano, M. Ito, K. Tomita, H. Kum
agai, and T. Tochikura, J. Ferment. Technol., 66,
137-143 (1988)）しかし、分子生物学的手法を用いたア
プローチは未だされていない。また、このグルタミナー
ゼは、安定pH範囲が狭い、温度安定性が低い、等のた
め、工業的利用の面で限界があった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、安
定pH範囲が広く、且つ温度安定性が高い新規なグルタミ
ナーゼを提供しようとするものである。本発明はさら
に、上記のグルタミナーゼの製造方法を提供し、またそ
の手段として、該グルタミナーゼをコードする遺伝子系
を提供するものである。従って本発明は、（Ａ）次の性
質：（１）作用：Ｌ−グルタミンに作用してＬ−グルタミン
酸を生成する；（２）至適pH：至適pHが約８．５である；（３）安定pH範囲：４℃にて２４時間インキュベートし
た場合、安定pH範囲はおよそ３〜１１である；（４）至適作用温度：pH８．０において測定した場合、
至適作用温度は約５０℃である；（５）温度安定性：pH８．０にて３０分間インキュベー
トした場合、４５℃以下の温度で安定である；（６）分子量：ゲル濾過により測定した場合、分子量は
約７３，０００である；を有するグルタミナーゼを提供
する。

【０００４】本発明はまた、（Ｂ）配列番号：２に示す
アミノ酸配列において、アミノ酸３４〜７０３のアミノ
酸配列を有するグルタミナーゼ；配列番号：２に示すア
ミノ酸配列中のアミノ酸番号３４〜７０３のアミノ酸配
列において、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及
び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、且
つグルタミナーゼ活性を有する修飾されたグルタミナー
ゼ；配列番号：１に示す塩基配列を有する核酸とストリ
ンジエント条件下でハイブリダイズすることができる核
酸によりコードされているグルタミナーゼ；並びに配列
番号：２に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号３４〜７
０３のアミノ酸配列に対して７０以上％の相同性を有す
るアミノ酸配列を有するグルタミナーゼを提供する。

【０００５】本発明はさらに、（Ｃ）配列番号：４に示
すアミノ酸配列において、アミノ酸３４〜７０３のアミ
ノ酸配列を有するグルタミナーゼ；配列番号：４に示す
アミノ酸配列中のアミノ酸番号３４〜７０３のアミノ酸
配列において、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加
及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、
且つグルタミナーゼ活性を有する修飾されたグルタミナ
ーゼ；配列番号：３に示す塩基配列を有する核酸とスト
リンジエント条件下でハイブリダイズすることができる
核酸によりコードされているグルタミナーゼ；並びに配
列番号：４に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号３４〜
７０３のアミノ酸配列に対して７０以上％の相同性を有
するアミノ酸配列を有するグルタミナーゼを提供する。

【０００６】本発明はまた、前記（Ｂ）に記載のグルタ
ミナーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成るベ
クター、及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞
を提供する。本発明はまた前記（Ｃ）に記載のグルタミ
ナーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成るベク
ター、及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞を
提供する。本発明はさらに、前記Ａに記載のグルタミナ
ーゼの製造方法において、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ）属に属し、該グルタミナーゼを生産する
ことができる微生物を培養し、培養物からグルタミナー
ゼを採取することを特徴とする方法を提供する。

【０００７】前記微生物は、例えば、アスペルギルス・
ソセー(Aspergillus sojae）又はアスペルギルス・オリ
ゼー（Aspergillus oryzae）である。本発明はまた、前
記（Ｂ）に記載のグルタミナーゼの製造方法において、
該グルタミナーゼをコードするＤＮＡを含んで成る発現
ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、該培
養物から、該グルタミナーゼを採取することを特徴とす
る方法を提供する。本発明はさらに、前記（Ｃ）に記載
のグルタミナーゼの製造方法において、該グルタミナー
ゼをコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターにより
形質転換された宿主細胞を培養し、該培養物から該グル
タミナーゼを採取することを特徴とする方法を提供す
る。

【０００８】

【発明の実施の形態】（１）微生物本発明の微生物、すなわち、本発明のグルタミナーゼの
発酵生産に利用する微生物、及び本発明のグルタミナー
ゼをコードする遺伝子の分離源としての微生物として
は、本発明のグルタミナーゼを生産することができる微
生物であればよいが、好ましくはアスペルギルス(Asper
gillus）属の微生物であり、さらに好ましくは、アスペ
ルギルス・ソヤー(Aspergillus sojae）又はアスペルギ
ルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)である。

【０００９】これらの種の具体的な菌株としては、アス
ペルギルス・ソヤー(Aspergillus sojae) BA-104、アス
ペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae) KBN616 を
挙げることができる。なお、アスペルギルス・ソヤー株
は、醤油や味噌の製造のために広く使用されまた市販さ
れている麹菌を単胞子分離等の常法に従って純化するこ
とにより容易に得られる。また、アスペルギルス・オリ
ゼー株は、清酒用として広く使用されまた市販されてい
る麹菌を単胞子分離等の常法に従って純化することによ
っても容易に得られる。

【００１０】（２）グルタミナーゼの精製本発明のグルタミナーゼは、該グルタミナーゼを生産す
ることができる微生物、好ましくは上に記載した微生物
を常法に従って培養し、そして酵素の精製に用いられる
常法に従って培養物から回収（採取）することができ
る。培養は液体培地でも固体培地でもよく、例えばフス
マの固体培地において培養するのが好ましい。本発明の
グルタミナーゼの発酵生産方法の一例を、アスペルギル
ス・ソヤーＢＡ−１０４株を使用した場合について、実
施例１に具体的に記載する。

【００１１】（３）グルタミナーゼの性質（ａ）活性測定法及びユニットの定義本発明のグルタミナーゼは、Ｌ−γ−グルタミニル−ｐ
−ニトロアニリドを基質として使用し、グルタミナーゼ
の作用により遊離するｐ−ニトロアニリンを比色定量す
ることにより活性測定することができる。

【００１２】具体的には、８００μｌの５０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液（pH８．０）と、該緩衝液中１mM Ｌ
−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド溶液２００μｌ
とを試験管に入れ、これを３０℃にて３分間予熱した
後、これに２００μｌの被験酵素液を加えて６０分間反
応せしめ、４００μｌの１Ｍ酢酸を添加して反応を停止
せしめ、４０５nmの吸光度を測定する。盲検として、酵
素液を加えずに同様の操作を行い、反応停止後に酵素液
を加えて、４０５nmの吸光度を測定する。上記の条件下
で１分間に１μmol のｐ−ニトロアニリンを生じさせる
酵素量を１ユニットと定義する。

【００１３】次に、本発明の酵素の１例として、アスペ
ルギルス・ソヤーＢＡ−１０４から得られたグルタミナ
ーゼの性質を次に示す。（ｂ）至適pH 緩衝液９００μｌ（pH5.0 〜7.0 : 25mM Na₂HPO₄-KH₂PO
₄; pH7.0 〜 9.5 :25mM Tris-HCl ; pH9.5 〜120 : 25
mM Na₂B₄O₇-HaOH)に酵素液１００μｌを加え、３０℃に
て６０分間反応せしめ、最高活性を１００として、各pH
における相対活性を求める。結果を図１に示す。この結
果から明らかな通り、至適pHは約８．５である。

【００１４】（ｃ）pH安定性２５０μｌの緩衝液（pH1.0 〜5.0 : 25mM HCl-CH₃COON
a ; pH5.0 〜7.0 : 25mM Na₂HPO₄-KH₂PO₄; pH7.0 〜9.
0 : 25mM Tris-HCl;pH10.0 〜12.0 : 25mM Na ₂B₄P₇-Na
OH）に２５０μｌの酵素液を加え、４℃にて２４時間イ
ンキュベートし、50mM Tris-HCl （pH８．０）緩衝液中
で（ａ）に記載したようにして活性を測定し、最高活性
を１００として各インキュベーションpHにおける活性の
相対値を求める。結果を図２に示す。この結果から明ら
かな通り、上記の条件下でおよそpH３．０〜１１．０に
おいて安定である。

【００１５】（ｄ）至適温度５０mM Tris-HCl（pH８．０）緩衝液中で２０℃〜６０
℃にて活性を測定し、最高値を１００として各温度にお
ける相対活性値を求める。結果を図３に示す。この結果
から明らかな通り、至適温度は約５０℃であり、４０℃
〜５０℃において高い活性を示す。

【００１６】（ｅ）温度安定性酵素を５０mM Tris-HCl（pH８．０）緩衝液中で２０℃
〜６０℃にて３０分間インキュベートした後、５０mM
Tris-HCl（pH８．０）緩衝液中３０℃にて活性を測定
し、３０分間のインキュベートなしのサンプルを１００
として各インキュベーション温度における相対活性値を
求める。結果を図４に示す。この結果から、本発明の酵
素は、上記の条件において、約４５℃以下において安定
である。（ｆ）基質特異性前記活性測定法（ａ）に記載した条件下で、反応液に基
質として各種試薬を添加して酵素活性を測定し、Ｌ−グ
ルタミンに対する活性を１００として相対活性を求めた
結果は次の表１に示す通りである。

【００１７】

【表１】

【００１８】本酵素はＬ−グルタミン及びグルタチオン
に対して高い反応性を示し、Ｌ−セアニンに対してはＬ
−グルタミンに比べて約６０％の反応性を示すが、Ｄ−
グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン等に
対しては実質的に反応性を示さない。

【００１９】（ｇ）金属イオンの影響精製した酵素の反応時における金属イオンの影響を調べ
た。本酵素はＣｕ²⁺で約７５％の阻害を受けたほかは、
金属イオンによる阻害はほとんど見られなかった。結果
を次の表に示す。

【００２０】

【表２】

【００２１】（ｈ）分子量ＨＰＬＣによるゲル濾過法（カラム：YMC-Pack Diol-20
0G６mm×３００mm；移動相：５０mM Tris-HCl（pH７．
０）中０．１ＭＮａＣｌ；流速：０．５ml／分；温
度：室温（２３℃）；注入量：２０μｌ；標準蛋白質：
ウシ血清アルブミン（M.W.66,000）、オバルブミン
（Ｍ．Ｗ．４２，０００）、大豆トリプシンインヒビタ
ー（M.W.20,000））において、約７３，０００の分子量
を示し、Ｌａｅｍｍｌｉ法による１０％ゲル上ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ（標準蛋白質：ＳＤＳ−ＰＡＧスタンダードＬ
ｏｗ（バイオラッド社製））において、約８３，０００
の分子量を示す。

【００２２】上記の本発明の酵素（アスペルギルス・ソ
ヤーＢＡ−１０４）とT.Yanoら、J.Ferment. Technol.
Vol. 66, p.138 (1988)に記載されているアスペルギル
ス・オリゼーＭＡ−２７由来のグルタミナーゼ（細胞内
酵素及び細胞外酵素）とを比較すれば次の表３に示す通
りである。

【００２３】

【表３】

【００２４】この表から明らかな通り、両者は、分子
量、至適pH、pH安定性、至適温度、温度安定性等の点で
明らかに異り、本発明の酵素は既知酵素に比べて、温度
安定性及びpH安定性の点で優れている。

【００２５】配列番号：１に示す塩基配列はアスペルギ
ルス・オリゼーＫＢＮ６１６株のゲノムＤＮＡの塩基配
列であり、塩基番号の８４５〜８４７のＡＴＧ（アミノ
酸番号１のＭｅｔ）が翻訳開始コドンである可能性があ
り、塩基番号８８４〜８８６のＡＴＧ（アミノ酸番号１
４のＭｅｔ）が翻訳開始コドンである可能性があり、ま
た塩基番号８８７〜８８９のＡＴＧ（アミノ酸番号１５
のＭｅｔ）が翻訳開始コドンである可能性もある。

【００２６】他方、このゲノムＤＮＡを含有する発現ベ
クターによりアスペルギルス・オリゼーＫＢＮ６１６−
３９（ｎｉａＤ^-) 株を形質転換し、該導入したゲノム
ＤＮＡを発現せしめたところ（実施例３）、その発現生
成物はグルタミナーゼ活性を有し、実施例１において精
製したグルタミナーゼと同じ分子量を示し、この発現生
成物のＮ−末端配列はAla-Ser-Thr-Phe-Ser-Pro-Ala-Ar
g-Pro-Pro-Ala-Leu （配列番号：５）であり、配列番
号：１及び配列番号：２に示すアミノ酸配列の３４位の
アミノ酸（Ａｌａ）から下流のアミノ酸配列に相当す
る。

【００２７】従って、配列番号：１及び配列番号：２に
記載のアミノ酸配列において、アミノ酸番号３４のＡｌ
ａから７０３位のＬｅｕまでがグルタミナーゼの成熟蛋
白質であり、３３位のＡｌａから上流のアミノ酸配列は
シグナル配列である可能性がある。また、配列番号：１
又は配列番号：２のアミノ酸配列において３４位のＡｌ
ａから７０３位のＬｅｕまでのアミノ酸配列が、グルタ
ミナーゼ活性のために十分であることがわかる。従っ
て、本発明は、配列番号：１又は配列番号：２におけ
る、少なくとも３４位のＡｌａから７０３位のＬｅｕま
でのアミノ酸配列を有するグルタミナーゼを提供する。

【００２８】しかしながら、ある酵素がその酵素活性を
発揮するには、生来のアミノ酸配列のすべてがそのまま
必要なわけではなく、活性の発現に必須の領域以外の領
域においては、アミノ酸の欠失、付加、置換等によりア
ミノ酸配列が修飾されていても本来の酵素活性を発揮す
ることが知られている。従って本発明は、配列番号：２
に記載のアミノ酸配列における第３４位のＡｌａから第
７０３位のＬｅｕまでのアミノ酸配列において、１又は
複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修
飾されているアミノ酸配列を有し、且つグルタミナーゼ
活性を維持している修飾型グルタミナーゼを提供する。

【００２９】上記の修飾の程度は、ＰＣＲ、部位特定変
異誘発等、周知技術により修飾できる程度であり、且つ
グルタミナーゼ活性を喪失しない範囲である。例えば、
配列番号：２に記載の第３４位のＡｌａから第７０３位
のＬｅｕまでのアミノ酸配列に対して、７０％以上、８
０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の
相同性を有するものである。従って本発明はまた、配列
番号：２に記載の第３４位のＡｌａから第７０３位のＬ
ｅｕまでのアミノ酸配列に対して、７０％以上、８０％
以上、８５％以上、９０以上、又は９５％以上の相同性
を有するアミノ酸配列を有し、且つグルタミナーゼ活性
を維持している修飾型グルタミナーゼを含む。

【００３０】一旦、酵素をコードする生来の生来のゲノ
ムＤＮＡ又はｃＤＮＡがクローニングされれば、該ゲノ
ムＤＮＡ特にそのエクソン部分もしくはｃＤＮＡ、又は
それらの一部分をプローブとして用いることにより、同
じ酵素活性を有する他の蛋白質をコードするＤＮＡを選
択することができる。従って、本発明は、配列番号：１
に示す塩基配列を有する核酸、例えばＤＮＡ、特にエク
ソン部分の配列を有する核酸、例えばＤＮＡ、例えばゲ
ノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ、あるいはそれらの断片、例え
ば好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは２０塩基
以上、例えば３０塩基以上の長さの断片とハイブリダイ
ズすることができる核酸によりコードされており、且つ
グルタミナーゼ活性を有する蛋白質をも提供する。

【００３１】上記の場合のハイブリダイゼーション条件
は、例えば、野村慎太郎、稲澤譲治著「脱アイソトープ
実験プロトコール」ｐ．４０（秀潤社、１９９４）に記
載の条件の条件（５００mM ＮａＰｉ緩衝液（pH７．
２），７％ＳＤＳ，１mM ＥＤＴＡ）である。上記ハイ
ブリダイゼーションによるスクリーニングの対象となる
核酸は特に限定される。例えば合成ＤＮＡや、生来のＤ
ＮＡを前記のごとく修飾したものでもよいが、天然のＤ
ＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡやｃＤＮＡのライブラリー
が好ましい。この様なＤＮＡライブラリーは、例えば真
菌類、例えばアスペルギルス属の微生物、例えばアスペ
ルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ソヤー、アスペ
ルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅ
ｒ）等から、常法に従って調製することができる。ある
いは、そのようなライブラリーは、他の微生物、例えば
細菌、動物細胞、植物細胞等からも調製することができ
る。

【００３２】配列番号：３に示す塩基配列はアスペルギ
ルス・ソヤーＢＡ−１０４株のゲノムＤＮＡの塩基配列
であり、塩基番号６９０〜６９２のＡＴＧ（アミノ酸番
号１のＭｅｔ）が翻訳開始コドンである可能性があり、
塩基番号７２９〜７３１のＡＴＧ（アミノ酸番号１４の
Ｍｅｔ）が翻訳開始コドンである可能性があり、さらに
塩基番号７３２〜７３４のＡＴＧ（アミノ酸番号１５の
Ｍｅｔ）が翻訳開始コドンである可能性もある。

【００３３】他方、このゲノムＤＮＡを含有する発現ベ
クターによりアスペルギルス・オリゼーＫＢＮ６１６−
３９（ｎｉａＤ^-) 株を形質転換し、該導入したゲノム
ＤＮＡを発現せしめたところ（実施例５）、その発現生
成物はグルタミナーゼ活性を有し、実施例１において精
製したグルタミナーゼと同じ分子量を示し、この発現生
成物のＮ−末端配列はAla-Ser-Thr-Phe-Ser-Pro-Ala-Ar
g-Pro-Pro-Ala-Leu(配列番号：５）であり、配列番号：
３及び配列番号：４に示すアミノ酸配列の３４位のアミ
ノ酸（Ａｌａ）から下流のアミノ酸配列に相当する。

【００３４】従って、配列番号：３及び配列番号：４に
記載のアミノ酸配列において、アミノ酸番号３４のＡｌ
ａから７０３位のＬｅｕまでがグルタミナーゼの成熟蛋
白質であり、３３位のＡｌａから上流のアミノ酸配列は
シグナル配列である可能性がある。また、配列番号：３
又は配列番号：４のアミノ酸配列において３４位のＡｌ
ａから７０３位のＬｅｕまでのアミノ酸配列が、グルタ
ミナーゼ活性のために十分であることがわかる。

【００３５】従って、本発明は、配列番号：３又は配列
番号：４における、少なくとも３４位のＡｌａから７０
３位のＬｅｕまでのアミノ酸配列を有するグルタミナー
ゼを提供する。しかしながら、ある酵素がその酵素活性
を発揮するには、生来のアミノ酸配列のすべてがそのま
ま必要なわけではなく、活性の発現に必須の領域以外の
領域においては、アミノ酸の欠失、付加、置換等により
アミノ酸配列が修飾されていても本来の酵素活性を発揮
することが知られている。従って本発明は、配列番号：
４に記載のアミノ酸配列における第３４位のＡｌａから
第７０３位のＬｅｕまでのアミノ酸配列において、１又
は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により
修飾されているアミノ酸配列を有し、且つグルタミナー
ゼ活性を維持している修飾型グルタミナーゼを提供す
る。

【００３６】上記の修飾の程度は、ＰＣＲ、部位特定変
異誘発等、周知技術により修飾できる程度であり、且つ
グルタミナーゼ活性を喪失しない範囲である。例えば、
配列番号：２に記載の第３４位のＡｌａから第７０３位
のＬｅｕまでのアミノ酸配列に対して、７０％以上、８
０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の
相同性を有するものである。従って本発明はまた、配列
番号：４に記載の第３４位のＡｌａから第７０３位のＬ
ｅｕまでのアミノ酸配列に対して、７０％以上、８０％
以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の相同
性を有するアミノ酸配列を有し、且つグルタミナーゼ活
性を維持している修飾型グルタミナーゼを含む。

【００３７】一旦、酵素をコードする生来の生来のゲノ
ムＤＮＡ又はｃＤＮＡがクローニングされれば、該ゲノ
ムＤＮＡ特にそのエクソン部分もしくはｃＤＮＡ、又は
それらの一部分をプローブとして用いることにより、同
じ酵素活性を有する他の蛋白質をコードするＤＮＡを選
択することができる。従って、本発明は、配列番号：３
に示す塩基配列を有する核酸、例えばＤＮＡ、特にエク
ソン部分の配列を有する核酸、例えばＤＮＡ、例えばゲ
ノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ、あるいはそれらの断片、例え
ば好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは２０塩基
以上、例えば３０塩基以上の長さの断片とハイブリダイ
ズすることができる核酸によりコードされており、且つ
グルタミナーゼ活性を有する蛋白質をも提供する。

【００３８】上記の場合のハイブリダイゼーション条件
は、例えば、野村慎太郎、稲澤譲治著「脱アイソトープ
実験プロトコール」ｐ．４０（秀潤社、１９９４）に記
載の条件の条件（５００mM ＮａＰｉ緩衝液（pH７．
２），７％ＳＤＳ，１mM ＥＤＴＡ）である。上記ハイ
ブリダイゼーションによるスクリーニングの対象となる
核酸は特に限定される。例えば合成ＤＮＡや、生来のＤ
ＮＡを前記のごとく修飾したものでもよいが、天然のＤ
ＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡやｃＤＮＡのライブラリー
が好ましい。この様なＤＮＡライブラリーは、例えば真
菌類、例えばアスペルギルス属の微生物、例えばアスペ
ルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ソヤー、アスペ
ルギルス・ニガー(Aspergillus niger）等から、常法に
従って調製することができる。あるいは、そのようなラ
イブラリーは、他の微生物、例えば細菌、動物細胞、植
物細胞等からも調製することができる。

【００３９】本発明はまた、前記の生来のグルタミナー
ゼ、又はグルタミナーゼ活性を有する蛋白質をコードす
る核酸、特にＤＮＡに関する。典型的には、配列番号：
１又は配列番号：３に示す塩基配列を有するゲノムＤＮ
Ａ、又はそのエクソン部分のみから成るｃＤＮＡであ
る。ゲノムＤＮＡのクローニング方法の１例は、実施例
２及び４において具体的に記載する。

【００４０】一旦、ゲノムＤＮＡがクローニングされれ
ば、該ゲノムＤＮＡ、又はその１部分、特にエクソン部
分のＤＮＡをプローブとして、ｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングすることにより本発明のグルタミナーゼ
をコードするｃＤＮＡを得ることができる。ｃＤＮＡラ
イブラリーの調製及びプローブハイブリダイゼーション
によるそのスクリーニングは常法に従って行うことがで
きる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えば前記の出発材
料、例えばアスペルギルス属微生物、例えばアスペルギ
ルス・オリゼー、アスペルギルス・ソヤー、アスペルギ
ルス・ニガー、等から調製することができる。

【００４１】また、修飾されたグルタミナーゼをコード
するＤＮＡは、生来のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを基礎
とし、部位特定変異誘発、ＰＣＲ、ランダム変異、ジー
ンシャッフリング等の常法に従って行うことができる。
また、１又は複数個のアミノ酸が欠失した短縮型酵素を
コードするＤＮＡは、生来のＤＮＡに開始コドン及び／
又は終止コドンを導入することによっても得られる。さ
らに、適当な制限酵素により、生来のＤＮＡを切断する
ことによっても得られる。

【００４２】本発明はまた、上記のＤＮＡを含んで成る
ベクター、特に発現ベクター、及び該ベクターにより形
質転換された宿主細胞に関する。グルタミナーゼを生産
するための宿主細胞としては、グルタミナーゼをコード
するＤＮＡがゲノムＤＮＡである場合にはスプライシン
グ活性を有する宿主細胞である必要があり、真核性細
胞、例えば真菌類、例えば酵母又は糸状真菌類、又は動
物細胞、さらには植物細胞が使用される。

【００４３】酵母としては例えばサッカロミセス（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、例えばサッカロミセ
ス・セービシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）等が挙げられ、糸状真菌類として
は、例えばアスペルギルス属微生物、例えばアスペルギ
ルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー、等が挙げら
れる。動物細胞としては、昆虫細胞、例えばカイコの細
胞、哺乳類培養細胞、例えばＣＯＳ細胞等が挙げられ
る。さらに植物細胞を用いることもできる。さらに、グ
ルタミナーゼをコードするＤＮＡがｃＤＮＡである場
合、上記の宿主の他に、原核性宿主、例えば細菌宿主を
用いることができる。細菌宿主としては、例えば大腸菌
（Escherichia coli）、バシルス（Bacillus）属細菌、
例えばバシルス・ズブチリス(Bacillus subtilis) 等の
常用の宿主が用いられる。

【００４４】発現ベクターは、宿主に応じて発現制御配
列、例えばプロモーター、ターミネーター等を含有する
必要がある。例えば、酵母用のプロモーターとしては解
糖系酵素、遺伝子のプロモーター、Ｇａｌプロモーター
等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしてはＡｍｙＡ
プロモーター等が挙げられ、動物細胞用プロモーターと
してはウイルスプロモーター等が用いられる。また、細
菌用プロモーターとしては、ウイルスベクター用プロモ
ーター等が用いられる。宿主としての細胞とそれに適合
するベクター系の使用はすでに常用技術となっており、
本発明においては、それらの既知の発現系を適宜選択し
て使用することができる。

【００４５】本発明はまた、本発明のグルタミナーゼの
製造方法を提供する。第１の態様によれば、本発明のグ
ルタミナーゼを生産することができるアスペルギルス属
微生物を培養し、該培養物から、グルタミナーゼを採取
すればよい。このための生産菌としては、アスペルギル
ス・オリゼー、アスペルギルス・ソヤー等が挙げられ、
具体例としてアスペルギルス・オリゼーＫＢＮ６１６株
及びアスペルギルス・ソヤーＢＡ−１０４株が挙げられ
る。

【００４６】グルタミナーゼの製造のための培養は、固
体培地及び液体培地のいずれでもよい。固体培地に培養
する場合には、例えばフスマ等の通気性のよい材料、好
ましくは植物材料に、必要に応じて、リン酸塩等の無機
物、又は米糖等の有機窒素源などを添加し、２０℃〜３
５℃、好ましくは約３０℃の温度で好気的に培養すれば
よい。また、液体培地に培養する場合には、アスペルギ
ルス属微生物が増殖することができる任意の液体培地を
使用することができる。

【００４７】液体培地には、アスペルギルス属微生物が
資化し得る炭素源、例えば澱粉、マルトース、グルコー
ス等を０．１〜１０％、好ましくは１〜５％含有せし
め、またアスペルギルス属微生物が資化し得る窒素源、
例えば酵母エキス、マルトエキス（炭素源としても役立
つ）等を、例えば０．１〜５％の濃度で含有せしめるこ
とができる。さらに無機窒素源として、硝酸塩、アンモ
ニウム塩等を例えば０．０１％〜２％の濃度で含有せし
めることもできる。無機塩類として、リン酸塩、硫酸
塩、塩化物等の陰イオンと、ナトリウムイオン、カリウ
ムイオン、カルシウムイオン等の陽イオンとを添加する
こともできる。

【００４８】液体培養は、通気、撹拌及び／又は振とう
等の手段により好気的条件下で行う。培養温度は約２０
〜３５℃、好ましくは２８℃〜３０℃である。本発明の
第二の態様によれば、本発明のグルタミナーゼをコード
するＤＮＡを含んで成る発現プラスミドにより形質転換
された宿主を培養する。宿主としては詳細に前記したも
のを使用し、常法に従って培養、好ましくは液体培養す
ればよい。

【００４９】本発明の酵素は菌体外に分泌される。従っ
て、固体培養した場合には、培養物を水又は水性緩衝
液、例えばリン酸緩衝液等により抽出することにより酵
素含有水溶液が得られる。また、液体培養した場合に
は、濾過、遠心分離等の常法に従って菌体を除去するこ
とにより、酵素含有液が得られる。酵素含有液から酵素
を採取、精製するには、酵素の精製のための常法を用い
ればよい。例えば、塩析、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラ
フィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を
組合せて使用することができる。

【００５０】

【実施例】次に、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。実施例１．アスペルギルス・ソヤーＢＡ−１０４からの
グルタミナーゼの製造８１０ｇのふすまに８１０mlの５０mMリン酸緩衝液（pH
７．２）を加え、１２１℃、１５分間オートクレーブを
かけ、アスペルギルス・ソヤー(Aspergillus sojae）Ｂ
Ａ−１０４を植菌後、３０℃、４日間培養した。培養
後、８．２Ｌの水を加え、４℃で１晩抽出した。濾過
後、１ＮＮａＯＨでpH４．５に調整し、１０mM酢酸ナ
トリウム−塩酸緩衝液（pH４．５）で平衡化したDEAE-S
epharose FF（アマシャムファルマシア社製）１Ｌを
加え、濾過後、同緩衝液で洗浄を行い、０．１５ＭＮ
ａＣｌを加えた同緩衝液で溶出した。

【００５１】その溶出液に４０％飽和になるように硫酸
アンモニウムを加え、４０％飽和硫酸アンモニウムを加
えた同緩衝液で平衡化したButyl Toyopearl 650M（３０
ψ×１９０mm、東ソー製）のカラムに供与し、４０％か
ら０％までの飽和硫酸アンモニウムのリニアグラジエン
トで溶出した。その活性画分を同緩衝液で透析した後、
同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥＴｏｙｏｐｅａｒｌ
６５０Ｍ（５０ψ×８７０nm、東ソー製）のカラムに供
与し、０Ｍから０．３ＭまでのＮａＣｌのリニアグラジ
エントで溶出した。

【００５２】その活性画分をＰＥＧ２００００で濃縮
後、０．２ＭＮａＣｌを加えた５０mMリン酸緩衝液
（pH７）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００
ＨＲ（１５ψ×８４０mm、アマシャムファルマシア社
製）のカラムに供与し、その活性画分を得た。１０mM酢
酸ナトリウム−塩酸緩衝液（pH４．５）で透析後、ＤＥ
ＡＥ−８ＨＲ（５ψ×５０mm、ウォーターズ社製）を用
いたＨＰＬＣを使い、同緩衝液中で０Ｍから０．２Ｍま
でのＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出した。その活
性画分を４０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加
え、Pheny l-5PW(７．５ψ×７５mm、東ソー製）を用い
たＨＰＬＣを使い、同緩衝液中で４０％から０％までの
飽和硫酸アンモニウムのリニアグラジエントで溶出し
た。この活性画分を蒸留水に対して透析後、精製酵素と
した。全精製工程での活性の回収率１．７３％、１１８
０倍に精製した。精製の工程を次の表４に示す。

【００５３】

【表４】

【００５４】実施例２．アスペルギルス・オリゼーＫＢ
Ｎ６１６からのゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡのクローニン
グ（１）部分アミノ酸配列の決定実施例において精製した酵素１００μｇ（0.1%SDS, 1mM
EDTA, 0.125M Tris-HCl, pH6.8 中）をＬａｅｍｍｌｉ
の方法を用いた１５％ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与し
た。その上にＶ８プロテアーゼ（和光純薬社製）０．０
５μｇ（0.1% SDS, 1mM EDTA, 0.01% BPB, 10%グリセロ
ール、0.125M Tris-HCl, pH6.8中）を加え、室温、３時
間泳動した。その後、ＰＶＤＦ膜にブロティングし、Ｎ
末端配列シークエンサー（パーキンエルマー社製ＡＢＩ
４７６Ａ）を用いて解析した。その結果、下記の部分
アミノ酸配列が得られた。

【００５５】

【化１】

【００５６】（２）ゲノムＤＮＡのクローニング（ａ）プローブの調製上記の部分配列Ｐ１及びＰ２に基いて、下記のプライマ
ーＧ１，Ｇ２及びＧ３を設計し、合成した。配列を下に
示す。なお、Ｇ３は、Ｐ１のアミノ酸配列をコードする
塩基配列（下記右側に示す）の相補配列である。

【００５７】

【化２】

【００５８】（ｂ）ゲノムのＤＮＡのクローニング及び
全配列の決定前記の合成ＤＮＡプライマーＧ１とＧ３を使用し、Ｒａ
ｅｄｅｒらの方法（U.Raeder and P. Broda, Lett. App
l. Microb., 1, 17-20 (1985)）により作製したアスペ
ルギルス・オリゼーＫＢＮ６１６株の染色体ＤＮＡを鋳
型としてＰＣＲで増幅を行った。その後、増幅できたＤ
ＮＡ断片をＧ２とＧ３をプライマーとして再度ＰＣＲ
し、増幅してきた９bp短い７０２bpのＤＮＡ断片（ＧＴ
Ｆ１）を得、そのＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８にサブクロ
ーニング後、その配列を決定した。上記ＧＴＦ１の塩基
配列に基いて、次の配列を有するＤＮＡプライマーを設
計し、合成した。

【００５９】

【化３】

【００６０】前記のごとく調製したアスペルギルス・オ
リゼーＫＢＮ６１６のゲノムＤＮＡの制限酵素（Ｓａｌ
Ｉ）分解物を鋳型とし、５’側用Ｓ１プライマー、５’
側用Ｓ２プライマーとSal I Cassette, Cassette Prime
r C1, Cassette Primer C2（宝酒造製）を用いて、LA-P
CR in vitro Cloning kit のプロトコールに従って５’
方向にＰＣＲで伸長増幅した。そして、得られたＤＮＡ
断片（ＧＴＦ２）についてその配列を決定した。

【００６１】また、アスペルギルス・オリゼーＫＢＮ６
１６のゲノムＤＮＡのＰｓｔＩ分解物を鋳型とし、３’
側用Ｓ１プライマー、３’側用Ｓ２プライマーとPst I
Cassette, Cassette Primer C1, Cassette Primer C2
（宝酒造製）を用いて、LA-PCRin vitro Cloning kit
のプロトコールに従って３’方向にＰＣＲで伸長増幅し
た。そして、得られたＤＮＡ断片（ＧＴＦ３）について
その配列を決定した。決定した配列ＧＴＦ１，ＧＴＦ
２，ＧＴＦ３を統合し、配列番号：１に記載する全ゲノ
ムＤＮＡ配列を決定した。

【００６２】（ｃ）発現用形質転換体の調製配列番号：１に示す塩基番号８８４から３９８９の下流
にＳａｌＩの切断点を導入しながらＰＣＲで増幅するた
めに、下記のプライマー：Ｇ４ＡＴＧＡＴＧＣＡＴＴＴＣＣＴＣＴＣＧＴＴＣＴ
ＧＴＣＴＧＴＣＧ（配列番号：１７）Ｇ５ＧＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＡＧＣＧＧＴＧＴＴＴ
ＧＡＧＴＣＣＧＴ（配列番号：１８）を調製し、アスペルギルス・オリゼーＫＢＮ６１６のゲ
ノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ増幅により、３．
１kbp のＥｃｏＴ２２１−ＳａｌＩのＤＮＡ断片（ｇ
ｔｍＡ）を得、その配列を確認した。

【００６３】ｐＴＦ１００(N. Kitamoto, et al. Appl.
Microbiol. Biotechnol., 50, 85-92 (1998）をＳａｌ
ＩとＥｃｏＴ２２Ｉで切断してアスペルギルス・オリゼ
ーＴＥＦ１−α遺伝子プロモーター断片（０．７６kbp)
を取り出し、前記のｇｔｍＡと接続後、pND300 (N. Kit
amoto, T. Kimura, Y. Kito, K.Ohmiya, N. Tsukagosh
i, Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1795-1797 (199
5))のＳａｌＩサイトに挿入し、発現用ベクターｐＴＦ
ＧＬ２００を作製した。Ｋｉｔａｍｏｔｏらの方法（N.
Kitamoto, T. Kimura, Y. Kito, K. Ohmiya,N. Tsukag
oshi, Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1795-1797 (19
95)) に従いｐＴＦＧＬ２００をAspergillus oryzae KB
N616-39 (niaD^-) 株に形質転換し、形質転換株ＧＬ２
０を得た。

【００６４】（ｄ）アスペルギルス・オリゼーＫＢＮ６
１６のグルタミナーゼをコードするｃＤＮＡのクローニ
ング前記形質転換株ＧＬ２０をＧＰ培地で３０℃、３日間振
とう培養、培養菌糸からライフテックオリエンタル社製
ＴＲＩＺＯＬ試薬を用い、そのプロトコールに従って全
ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡから、宝酒造製
３’−ＦｕｌｌＲＡＣＥＣｏｒｅＳｅｔとＥｘ−Ｔ
ａｑを使用し、上流プライマーにＧ４を使用し、ＲＴ−
ＰＣＲを行い、ｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡの塩基配
列を決定し、これと配列番号：１に記載する全ゲノムＤ
ＮＡ配列を比較することにより、イントロンを決定し
た。その結果から配列番号：１及び配列番号：２のアミ
ノ酸配列を決定した。

【００６５】実施例３．アスペルギルス・オリゼーのグ
ルタミナーゼの発現前記形質転換株ＧＬ２０を用いてＧＰ培地（N. Kitamot
o, et al. Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 85-92
(1998)）１００mlを用い、３０℃、１０日間静置培養を
行ったところ、９．４ユニット／ｌのグルタミナーゼ活
性を得た。また、同じ培養液をＬａｅｍｍｌｉの方法に
基づくＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、精製したグル
タミナーゼと同様の位置にバンドが存在し、同様のグル
タミナーゼの発現が確認できた。また、発現した蛋白質
のＮ末端アミノ酸配列はＡｌａＳｅｒＴｈｒＰｈｅＳｅ
ｒＰｒｏＡｌａＡｒｇＰｒｏＰｒｏＡｌａＬｅｕであ
り、精製グルタミナーゼと同じであった。

【００６６】実施例４．アスペルギルス・ソヤーＢＡ−
１０４からの全ゲノムＤＮＡ配列及びｃＤＮＡ配列の決
定（１）ゲノムＤＮＡのクローニングアスペルギルス・ソヤーＢＡ−１０４株から、Ｒａｅｄ
ｅｒらの方法(U. Raeder et. al., Lett. Appl. Micro
b., Vol. 1, p.17-20 (1985))により染色体ＤＮＡを調
整し、これを鋳型としてＰＣＲ増幅を行った。その場合
のプライマーは前記実施例２（２）（ｃ）記載のＧ５
（配列番号：１８）と下記のＧ６を使用し行った。Ｇ６ＡＴＴＧＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＡＧＡＴＧＴＣ
ＴＧＴＧＡＴＧ（配列番号：１９）得られた３．９kbp ＤＮＡ断片の全ＤＮＡ配列を決定
し、配列番号：３に記載する全ゲノムＤＮＡ配列とし
た。

【００６７】（２）発現用形質転換体の調整配列番号：３に示す塩基番号７２９から３８５４の下流
にＳａｌＩの切断点を導入しながらＰＣＲで増幅するた
めに、前記実施例２（２）（ｃ）記載のＧ５（配列番
号：１８）と下記のプライマー：Ｇ７ＡＴＧＡＴＧＣＡＴＴＴＣＣＴＣＴＣＧＴＴＴＴ
ＧＴＣＴＧＴＣＧ（配列番号：２０）を調整し、前記のアスペルギルス・ソヤーＢＡ−１０４
のゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ増幅により、
３．１kbp のＥｃｏＴ２２Ｉ−ＳａｌＩのＤＮＡ断片を
得た。

【００６８】このＤＮＡ断片を前記実施例２（２）
（ｃ）記載の方法と全く同じ方法でアスペルギルス・ソ
ヤーＢＡ−１０４のグルタミナーゼの発現用ベクターｐ
ＴＦＧＬ２０１を構築し、Kitamotoらの方法(N. Kitamo
to, Y. Kito, K. Ohmiya, N. Tsukagoshi., Biosci. Bi
otech. Biochem., 59, 1795-1797 (1995))に従い、ｐＴ
ＦＧＬ２０１をアスペルギルス・オリゼーＫＢＮ６１６
−３９（ｎｉａＤ^-）株に形質転換し、形質転換株２２
−３０を得た。

【００６９】（３）アスペルギルス・ソヤーＢＡ−１０
４のグルタミナーゼをコードするｃＤＮＡクローニング前記形質転換株２２−３０をＧＰ培地で３０℃、３日間
振とう培養、培養菌糸からライフテックオリエンタル社
製ＴＲＩＺＯＬ試薬を用い、そのプロトコールに従っ
て、全ＤＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡから、宝酒
造製３’ＦｕｌｌＲＡＣＥＣｏｒｅＳｅｔとＥｘ−
Ｔａｑを使用し、上流プライマーにＧ７を使用し、ＲＴ
−ＰＣＲを行い、ｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡの塩基
配列を決定し、これと配列番号：３に記載する全ゲノム
ＤＮＡ配列を比較することにより、イントロンを決定し
た。その結果から配列番号：３及び配列番号：４のアミ
ノ酸配列を決定した。

【００７０】実施例５．アスペルギルス・ソヤーＢＡ−
１０４のグルタミナーゼ発現２２−３０株を用いてＧＰ培地（N. Kitamoto, et al.
Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 85-92 (1998)) １
００mlを用い、３０℃、９日間静置培養を行ったとこ
ろ、７．３ユニット／ｌのグルタミナーゼ活性を得た。
また、同じ培養液をＬａｅｍｍｌｉの方法に基づくＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを行ったところ、精製したグルタミナーゼ
と同様の位置にバンドが存在し、同様のグルタミナーゼ
の発現が確認できた。また、発現した蛋白質のＮ末端ア
ミノ酸配列はAla-Ser-Thr-Phe-Ser-Pro-Ala-Arg-Pro-Pr
o-Ala-Leu-であり、精製グルタミナーゼと同じであっ
た。

【００７１】

【配列表】ＳＥＱＵＥＮＣＥＬＩＳＴＩＮＧ〈１１０〉〈１２０〉Novel glutaminase and process for puroduction there of 〈１６０〉〈２１０〉１〈２１１〉３４３１〈２１２〉ＤＮＡ〈２１３〉Aspergillus oryzae KBN616 〈２２０〉〈２２１〉ＣＤＳ〈２２２〉（８９４）…（１０８０）、（１０９６）…（１４５１）、（１５１０）…（１９５４）、（２００９）…（２５９６）、（２６４７）…（２８４７）、（２５９４）…（３０３７）、（３０９３）…（３２２８）、（３２７５） …（３３４１）〈２２１〉ｉｎｔｒｏｎ〈２２２〉（１０８１）…（１０９５）、（１４５２）…（１５０９）、（１９５５）…（２００８）、（２５９７）…（２６４６）、（２８４８）…（２８９３）、（３０３８）…（３０９２）、（３２２９）…（３２７４）〈２２３〉Genomic DNA coding for glutaminase derived from Aspergillus or yzae KBN616 〈４００〉1 gtcgacacat ctgcgacgcg aatcgtccca gtcgacccca tcccagttga tgcagtagct 60 cggctaccgg aagagattta ttcttagtcc cttgttggga ttgggattca ccctcgcttc 120 tgtttctcac cgtatttata tcgcgcaatg agattgatcc ggatataaga tgtctgtgat 180 gcactctttc tcacgcaccg aggtaatcaa tatcatatgc tttcccctca tatcactgcc 240 gaaaagacta actcggtcta ccccatagtc accagccact agcgcttctt gggcctctcc 300 ttgtttgctc aggtggatct aaagccaaga ctatcatggt ttagtgtcgg gttgtcttca 360 ttagatcgtc tgcagcccca gagtgtatcg gcttaggact ggtcgagccc gacgcggcta 420 aggataaggt acatactccc actctatcga cccttgcttg ttaatctccg atcttgtctc 480 ctgtccaatt gtcgggcttc tcctggaatt ccaggtttct ttcacctgtc gggcagccgg 540 atcgaggccg catgaattgc tcccccacag agactgacag gtcaggcgat attgggggag 600 tcacaatcat gcgcgccccc attccgcatt ccgtttctcg accctcatgc agcgtgctaa 660 acttccatag tccctcctga attgtctgcc ctgccctccg gtatgcgggc tggaccaact 720 atataagtgt gcctaacatt ccttcagcat tcttcaggcc cacattctcg ggggcacgtt 780 ttttggcgga tctcgatcct actctttcat tctttgaaga aacctggaat tattacgtgt 840 ataa atg aag gat gta ccc tgt gtg aat ccc tca ata cgg atc atg atg 889 Met Lys Asp Val Pro Cys Val Asn Pro Ser Ile Arg Ile Met Met 5 10 15 cat ttc ctc tcg ttc tgt ctg tcg gtg gcc tcc ctg gtg tct tac gcc 937 His Phe Leu Ser Phe Cys Leu Ser Val Ala Ser Leu Val Ser Tyr Ala 20 25 30 gga gct gcg tca aca ttc tcc cct gcg agg cca ccc gcc ctg ccc ttg 985 Gly Ala Ala Ser Thr Phe Ser Pro Ala Arg Pro Pro Ala Leu Pro Leu 35 40 45 gct gtc aaa tcg ccg tac ttg agc aca tgg ctc tct gcg ggc aca gat 1033 Ala Val Lys Ser Pro Tyr Leu Ser Thr Trp Leu Ser Ala Gly 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Asp Val Asp Val Glu Ser Ile Asp Gly Lys Ala His Asp Ile Gln 155 160 165 170 gtg tac gca gac att tca gca g gtaagcaaga cgacaaccca cctggaacag 1481 Val Tyr Ala Asp Ile Ser Ala G 175 tgcgaatatc catctaaccg ggtcttag aa tgg gcg tcc ggg gac cga aac 1534 lu Trp Ala Ser Gly Asp Arg Asn 180 185 gcc att gcg cag tgg gac tat ggt gtc aca gat gat ggc gtt gcc tat 1582 Ala Ile Ala Gln Trp Asp Tyr Gly Val Thr Asp Asp Gly Val Ala Tyr 190 195 200 cac aag gtt tac cgc caa acg cag ctg ctg ttt tcc gaa aac act gag 1630 His Lys Val Tyr Arg Gln Thr Gln Leu Leu Phe Ser Glu Asn Thr Glu 205 210 215 cag gcc gaa tgg ggc gag tgg tac tgg gcc aca gac gac caa gat ggt 1678 Glu Ala Glu Trp Gly Glu Trp Tyr Trp Ala Thr Asp Asp Gln Asp Gly 220 225 230 ctg agc tac cag tcc gga ccg gat gtt gat gtg cga ggg gca ttc gca 1726 Leu Ser Tyr Gln Ser Gly Pro Asp Val Asp Val Arg Gly Ala Phe Ala 235 240 245 aag aac gga aag ttg gcg aat tcg gat gat aaa aat tat cgt gca atc 1774 Lys Asn Gly Lys Leu Ala Asn Ser Asp Asp Lys Asn Tyr Arg Ala Ile 250 255 260 265 tcg acc aat tgg ccc gtg ttt gcc ttc tcc cgc gat ctt ggc tcg gtg 1822 Ser Thr Asn Trp Pro Val Phe Ala Phe Ser Arg Asp Leu Gly Ser Val 270 275 280 aag acg tct gct ggc acg tta ttc tcc att ggc ctt gcg cag gac agt 1870 Lys Thr Ser Ala Gly Thr Leu Phe Ser Ile Gly Leu ala Gln Asp Ser 285 290 295 gcc ata cag tac agt ggg aaa cct gaa ggg aca act gtg atg cct tca 1918 Ala Ile Gln Tyr Ser Gly Lys Pro Glu Gly Thr Thr Val Met Pro Ser 300 305 310 ctc tgg aag agc tac ttc agc act gcg act gct gcg gtaagtggcc 1964 Leu Trp Lys Ser Tyr Phe Ser Thr Ala Thr Ala Ala 315 320 325 cactgctgtt tcggacctag aacataatct gaccatctat gtag ctt gag ttc ttc 2020 Leu Glu Phe Phe cat cat gat tat gct gct gca gct gca cta tcg aag gat ctc gat gac 2068 His His Asp Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Lys Asp Leu Asp Asp 330 335 340 345 cgg ata tcc aag gat tcc att gat gcc gct ggc cag gac tac ctg aca 2116 Arg Ile Ser Lys Asp Ser Ile Asp Ala Ala Gly Gln Asp Tyr Leu Thr 350 355 360 atc acc tcc ctc acg gtc cgt caa gtc ttt gct gcc gtg caa ttg acc 2164 Ile Thr Ser Leu Thr Val Arg Gln Val Phe Ala Ala Val Gln Leu Thr 365 370 375 ggc acg ccc gag gac ccc tac atc ttc atg aag gag atc tcg tcc aat 2212 Gly Thr Pro Glu Asp Pro Tyr Ile Phe Met Lys Glu Ile Ser Ser Asn 380 385 390 ggc aac atg aac act gtg gac gtc atc ttc ccc gct cac ccg atc ttt 2260 Gly Asn Met Asn Thr Val Asp Val Ile Phe Pro Ala His Pro Ile Phe 395 400 405 ttg tac acc aat ccc gag ctc ctc aaa ctg att ctg aag cca atc tat 2308 Leu Tyr Thr Asn Pro Glu Leu Leu Lys Leu Ile Leu Lys Pro Ile Tyr 410 415 420 425 gag att caa gag aac gga aag tat ccc aac aca tac gcc atg cac gat 2356 Glu Ile Gln Glu Asn Gly Lys Tyr Pro Asn Thr Tyr Ala Met His Asp 430 435 440 att gga acc cac tac ccg aac gcc acg ggc cat cct aag ggc gac gac 2404 Ile Gly Thr His Tyr Pro Asn Ala Thr Gly His Pro Lys Gly Asp Asp 445 450 455 gag aaa atg cca ctc gag gag tgt gga aac atg gtt atc atg gcc ctt 2452 Glu Lys Met Pro Leu Glu Glu Cys Gly Asn Met Val Ile Met Ala Leu 460 465 470 gcc tac gcc cag aag gcc aag gac aac gac tat ctt tca cag cac tat 2500 Ala Tyr Ala Gln Lys Ala Lys Asp Asn Asp Tyr Leu Ser Gln His Tyr 475 480 485 ccc atc ctc aac aaa tgg aca aca tac ctc gtc gag gat tct att tac 2548 Pro Ile Leu Asn Lys Trp Thr Thr Tyr Leu Val Glu Asp Ser Ile Tyr 490 495 500 505 ccg gcg aac cag atc tct acg gat gac ttt gct ggc tcg cta gc 2596 Pro Ala Asn Gln Ile Ser Thr Asp Asp Phe Ala Gly Ser Leu Al 510 515 gtaagtgata tacatacacg acacaggcgg tgatactaat agtatgtacag a aac 2650 a Asn cag acc aac ctg gca ttg aag gga atc att gga atc cag gca atg gct 2698 Gln Thr Asn Leu Ala Leu Lys Gly Ile Ile Gly Ile Gln Ala Met Ala 525 530 535 gtg atc agc aat acg aca gga cac ccg gac gat gcc tcc aac cac tcc 2746 Val Ile Ser Asn Thr Thr Gly His Pro Asp Asp Ala Ser Asn His Ser 540 545 550 agc att gcc aag gac tac atc gcg agg tgg cag aca cta ggc gta gct 2794 Ser Ile Ala Lys Asp Tyr Ile Ala Arg Trp Gln Thr Leu Gly Val Ala 555 560 565 cac gat gcc aat cct ccg cat aca acg ctg tcg tac gga gcg aac gag 2840 His Asp Ala Asn Pro Pro His Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Ala Asn Glu 570 575 580 585 act cat g gtcagttagc cgctccgggt gcacttataa tactgacttt ctccag gg 2895 Thr His G ly ctt ctg tac aat ctg tat gcg gat cgt gaa ttg ggc ttg aac ttg gtt 2943 Leu Leu Tyr Asn Leu Tyr Ala Asp Arg Glu Leu Gly Leu Asn Leu Val 590 595 600 cct cag tcg gtc tat gac atg caa aac acc ttc tat ccg acg gtg aag 2991 Pro Gln Ser Val Tyr Asp Met Gln Asn Thr Phe Tyr Pro Thr Val Lys 605 610 615 620 gag aag tat gga gtg ccg ctc gat act cga cac gtg tac act aag g 3037 Glu Lys Tyr Gly Val Pro Leu Asp Thr Arg His Val Tyr Thr Lys A 625 630 635 gtaagctcga tatgttcttt ctaatgtttg acattgaata ttgacttgtc cccag cg 3094 la gat tgg gag ctt ttc aca gct gcg gtt gcg tcg gag agt gtc cga gac 3142 Asp Trp Glu Leu Phe Thr Ala Ala Val Ala Ser Glu Ser Val Arg Asp 640 645 650 atg ttc cac cag gcg ctc gcg acg tgg atc aac gag aca ccg acc aac 3190 Met Phe His Gln Ala Leu Ala Thr Trp Ile Asn Glu Thr Pro Thr Asn 655 660 665 cgt gcc ttt acg gat ctc tat gat acc caa act gga aa gtaagtgttt 3238 Arg Ala Phe Thr Asp Leu Tyr Asp Thr Gln Thr Gly As 670 675 680 gccaaggggc tgcttgggcc ttgctgacca atatag t tat ccg gcg ggc att 3290 n Tyr Pro Ala Gly Ile 685 acg ttc att gcg cgg ccc gtc atg ggt ggt gcc ttt gcg ttg tta att 3338 Thr Phe Ile Ala Arg Pro Val Met Gly Gly Ala Phe Ala Leu Leu Ile 690 695 700 ctc tag agtcgtttca ttgtatattg attttattcg cttctgggcg cgagtggaga 3394 Leu cacttgctta ctttgtttcc aattttatta ttaccgtggc tatgggacca gattgaccgt 3454 tgttaatagc gtacctcata catagcattt ttattctgca aatagtgttg ttgtatttgg 3514 gtctccaata ataatgcgtt cgtagacgat gctccaaagg aactatctgg tctgcaagct 3574 gcttatatca agcatatata aagatctacg tatccagtcg tgcttatcca agtggctctg 3634 gccatctacc gcagatcgta agtggactcg accgagccat cccacgcatc aaaagcgcga 3694 ataagatcta caaagtcagc aatcatactc ctcgcaacct ttgataaagc agagaaagag 3754 aggaaaaaga acataccata atacaaagcc atcgcctcca aatgcacatc aaccgcgacc 3814 ctctcatcaa ccgtatgaat attcaacgcc cccccagccc ttgacggact ccaccgataa 3874 atattcctcg acaaattcca ataaaacctc gtgtcagtat tccccgtcat gatatcccca 3934 ctcaccacca ccgtcttgcc cttcaaactg ggcacggact caaacaccgc tctagcgacg 3994 ccggcaaacc gcgtccaaac cgcatcctcg cccgtccccg tcggactcac cggcgccggc 4054 gacacgatcc gctcaacgtc gagatcgtca aatggttcac cttcccttcc tcctccttct 4114 tgttctccgg gaacgcagct aacgtgagat taaacttctc cacaatgggc gacacaatcc 4174 gcacagcccg atccatgact tcttccgggg tttggtgcaa cgcaacccgg tagttcacga 4234 tcgcttcgat atgttccggg agtgcgttcg tcttgacccc gccgtggaag agatcggctg 4294 cttgcgaggt ctgcag 4310

【００７２】〈２１０〉２〈２１１〉７０３〈２１２〉ＰＲＴ〈２１３〉Aspergillus orizae KBN616 〈２１４〉Amino acid sequence of glutaminase of Aspergillus oryzae KBN61 6 〈４０２〉２ Met Lys Asp Val Pro Cys Val Asn Pro Ser Ile Arg Ile Met Met His 5 10 15 Phe Leu Ser Phe Cys Leu Ser Val Ala Ser Leu Val Ser Tyr Ala Gly 20 25 30 Ala Ala Ser Thr Phe Ser Pro Ala Arg Pro Pro Ala Leu Pro Leu Ala 35 40 45 Val Lys Ser Pro Tyr Leu Ser Thr Trp Leu Ser Ala Gly Thr Asp Gly 50 55 60 Gly Asn Gly Gly Tyr Leu Ala Gly Gln Trp Pro Thr Phe Trp Phe Gly 65 70 75 80 Gln Val Thr Gly Trp Ala Gly Gln Ile Arg Val Asp Asn Ser Thr Tyr 85 90 95 Thr Trp Met Gly Ala Ile Pro Asn Thr Pro Thr Val Asn Gln Thr Ser 100 105 110 Phe Glu Tyr Thr Ser Thr Ser Ser Val Phe Thr Met Arg Val Gly Asp 115 120 125 Met Val Glu Met Lys Val Lys Phe Leu Ser Pro Ile Thr Pro Asp Asp 130 135 140 Leu Arg Arg Gln Ser Leu Val Phe Ser Tyr Leu Asp Val Asp Val Glu 145 150 155 160 Ser Ile Asp Gly Lys Ala His Asp Ile Gln Val Tyr Ala Asp Ile Ser 165 170 175 Ala Glu Trp Ala Ser Gly Asp Arg Asn Ala Ile Ala Gln Trp Asp Tyr 180 185 190 Gly Val Thr Asp Asp Gly Val Ala Tyr His Lys Val Tyr Arg Gln Thr 195 200 205 Gln Leu Leu Phe Ser Glu Asn Thr Glu Glu Ala Glu Trp Gly Glu Trp 210 215 220 Tyr Trp Ala Thr Asp Asp Gln Asp Gly Leu Ser Tyr Gln Ser Gly Pro 225 230 235 240 Asp Val Asp Val Arg Gly Ala Phe Ala Lys Asn Gly Lys Leu Ala Asn 245 250 255 Ser Asp Asp Lys Asn Tyr Arg Ala Ile Ser Thr Asn Trp Pro Val Phe 260 265 270 Ala Phe Ser Arg Asp Leu Gly Ser Val Lys Thr Ser Ala Gly Thr Leu 275 280 285 Phe Ser Ile Gly Leu Ala Gln Asp Ser Ala Ile Gln Tyr Ser Gly Lys 290 295 300 Pro Glu Gly Thr Thr Val Met Pro Ser Leu Trp Lys Ser Tyr Phe Ser 305 310 315 320 Thr Ala Thr Ala Ala Leu Glu Phe Phe His His Asp Tyr Ala Ala Ala 325 330 335 Ala Ala Leu Ser Lys Asp Leu Asp Asp Arg Ile Ser Lys Asp Ser Ile 340 345 350 Asp Ala Ala Gly Gln Asp Tyr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Thr Val Arg 355 360 365 Gln Val Phe Ala Ala Val Gln Leu Thr Gly Thr Pro Glu Asp Pro Tyr 370 375 380 Ile Phe Met Lys Glu Ile Ser Ser Asn Gly Asn Met Asn Thr Val Asp 385 390 395 400 Val Ile Phe Pro Ala His Pro Ile Phe Leu Tyr Thr Asn Pro Glu Leu 405 410 415 Leu Lys Leu Ile Leu Lys Pro Ile Tyr Glu Ile Gln Glu Asn Gly Lys 420 425 430 Tyr Pro Asn Thr Tyr Ala Met His Asp Ile Gly Thr His Tyr Pro Asn 435 440 445 Ala Thr Gly His Pro Lys Gly Asp Asp Glu Lys Met Pro Leu Glu Glu 450 455 460 Cys Gly Asn Met Val Ile Met Ala Leu Ala Tyr Ala Gln Lys Ala Lys 465 470 475 480 Asp Asn Asp Tyr Leu Ser Gln His Tyr Pro Ile Leu Asn Lys Trp Thr 485 490 495 Thr Tyr Leu Val Glu Asp Ser Ile Tyr Pro Ala Asn Gln Ile Ser Thr 500 505 510 Asp Asp Phe Ala Gly Ser Leu Ala Asn Gln Thr Asn Leu Ala Leu Lys 515 520 525 Gly Ile Ile Gly Ile Gln Ala Met Ala Val Ile Ser Asn Thr Thr Gly 530 535 540 His Pro Asp Asp Ala Ser Asn His Ser Ser Ile Ala Lys Asp Tyr Ile 545 550 555 560 Ala Arg Trp Gln Thr Leu Gly Val Ala His Asp Ala Asn Pro Pro His 565 570 575 Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Ala Asn Glu Thr His Gly Leu Leu Tyr Asn 580 585 590 Leu Tyr Ala Asp Arg Glu Leu Gly Leu Asn Leu Val Pro Gln Ser Val 595 600 605 Tyr Asp Met Gln Asn Thr Phe Tyr Pro Thr Val Lys Glu Lys Tyr Gly 610 615 620 Val Pro Leu Asp Thr Arg His Val Tyr Thr Lys Ala Asp Trp Glu Leu 625 630 635 640 Phe Thr Ala Ala Val Ala Ser Glu Ser Val Arg Asp Met Phe His Gln 645 650 655 Ala Leu Ala Thr Trp Ile Asn Glu Thr Pro Thr Asn Arg Ala Phe Thr 660 665 670 Asp Leu Tyr Asp Thr Gln Thr Gly Asn Tyr Pro Ala Gly Ile Thr Phe 675 680 685 Ile Ala Arg Pro Val Met Gly Gly Ala Phe Ala Leu Leu Ile Leu 690 695 700

【００７３】〈２１０〉３〈２１１〉３８５４〈２１２〉ＤＮＡ〈２１３〉Aspergillus sojae BA-104 〈２２０〉〈２２１〉ＣＤＳ〈２２２〉（６９０）…（９２５）、（１００１）…（１２９６）、（１３５５）…（１７９７）、（１８５２）…（２４３５）、（２４８６）…（２６８５）、（２７３５）…（２８７９）、（２９３５）…（３０７０）、（３１１７）… （３１８３）〈２２１〉ｉｎｔｒｏｎ〈２２２〉（９２５）…（１０００）、（１２９７）…（１３５４）、（１７９８）…（１８５１）、（２４３６）…（２４８５）、（２６８６）…（２７３４）、（２８８０）…（２９３４）、（３０７１）…（３１１６）〈２２３〉Genomic DNA coding for glutaminase derived from Aspergillus so jae BA-104 〈４００〉３ gatccggata taagatgtct gtgatgctct ctttctcgcg caccgaggta atcaatgtca 60 tatgctttcc cctcatatca ctgccgaaaa gactaactcg gtctacccca tagtcaccag 120 ccactagcgc ttcttgggcc tctccttgtt tgctcaggtg gatctaaagc caagactatc 180 atggtttagt gtcgggttgt cttcattaga tcgcctgcag ccccagagta tatcggccta 240 ggactggtcg agcccggagc ggctaaggat aaggtacata ctcccagtcc gtcgaccctt 300 gcttgttaat ctccgatctt gtctcctgtc caattgtcgg gcttctcctg gaattccgtg 360 tttctttcac ctgtcgggca ggcggatcga ggccgcatga attgcttccc cacagagact 420 ggcaggtcag gcgatattgg gggagtcaca atcatgcgcg cccccattcc gcattccgtt 480 tctagaccct catgcagcgt gctaaacttc catagtccct cctgaattgt ctaccctgcc 540 ctccggtatg cgggctggac caactatata agtgtgccta acattccttc agcattcttc 600 aggcccacat tctcggtggc acgtttttcg gcggatttcg atcctactct ttcattcttt 660 gaagaaatct ggaattatta cgtgtataa atg aag gat gta ccc tgt gtg aat 713 Met Lys Asp Val Pro Cys Val Asn 5 ccc tca ata cgg atc atg 731 Pro Ser Ile Arg Ile Met 10 atg cat ttc ctc tcg ttt tgt ctg tcg gtg gcc tcc ctg gtc tct tac 779 Met His Phe Leu Ser Phe Cys Leu Ser Val Ala Ser Leu Val Ser Tyr 15 20 25 30 gcg gga gct gcg tca acc ttc tcc cct gcg agg cca ccc gcc ctg ccc 827 Ala Gly Ala Ala Ser Thr Phe Ser Pro Ala Arg Pro Pro Ala Leu Pro 35 40 45 ttg gct gtc aag tcg ccg tac ttg agc aca tgg ctc tct gcg ggc acg 875 Leu Ala Val Lys Ser Pro Tyr Leu Ser Thr Trp Leu Ser Ala Gly Thr 50 55 60 gat ggc ggt aat gga ggg tac ctg gcc ggc caa tgg cct acc ttc tgg 923 Asp Gly Gly Asn Gly Gly Tyr Leu Ala Gly Gln Trp Pro Thr Phe Trp 65 70 75 tt gtgagtagtc ccgtgctgta gaaatgaaga catccaactt ggtgtacatt 975 Ph ggctaaacca cgttcctggt ggcag c ggc cag gtg acc ggc tgg gct ggt cag 1028 e Gly Gln Val Thr Gly Trp Ala Gly Gln 80 85 atc cgg gtc gat aat tcg acc tac aca tgg atg ggg gcg atc cct aac 1076 Ile Arg Val Asp Asn Ser Thr Tyr Thr Trp Met Gly Ala Ile Pro Asn 90 95 100 acc cct acg gtg aac cag aca tcc ttc gag tac acc tcg acg tcg agc 1124 Thr Pro Thr Val Asn Gln Thr Ser Phe Glu Tyr Thr Ser Thr Ser Ser 105 110 115 120 gtg ttc acg atg cgt gtt ggg gat atg gtg gaa atg aaa gtg aaa ttc 1172 Val Phe Thr Met Arg Val Gly Asp Met Val Glu Met Lys Val Lys Phe 125 130 135 ctt tcc cct atc aca cca gat gat ctc cgg aga cag tcg ctt gtg ttt 1220 Leu Ser Pro Ile Thr Pro Asp Asp Leu Arg Arg Gln Ser Leu Val Phe 140 145 150 tcc tat ctg gac gta gat gtc gaa tcg atc gac ggc aaa gcg cat gac 1268 Ser Tyr Leu Asp Val Asp Val Glu Ser Ile Asp Gly Lys Ala His Asp 155 160 165 ata cag gtg tac gca gac ata tca gca g gtaagcaaga tgacgaacca 1316 Ile Gln Val Tyr Ala Asp Ile Ser Ala G 170 175 cctggaacag tgcgaatatc catctaaccg ggccttag ag tgg gtg tcc ggg gac 1371 lu Trp Val Ser Gly Asp 180 cga aat gcc att gcg cag tgg gac tat ggt gtc acg gat gat ggc gtc 1419 Arg Asn Ala Ile Ala Gln Trp Asp Tyr Gly Val Thr Asp Asp Gly Val 185 190 195 gcc tat cac aag gtt tac cgc caa acg caa ctg ctg ttc tcc gag aac 1467 Ala Tyr His Lys Val Tyr Arg Gln Thr Gln Leu Leu Phe Ser Glu Asn 200 205 210 215 act gaa cag gcc gaa tgg ggc gag tgg tac tgg gca aca gac gac caa 1515 Thr Glu Gln Ala Glu Trp Gly Glu Trp Tyr Trp Ala Thr Asp Asp Gln 220 225 230 gat ggt ctg acc tac cag tcc gga ccg gat gtt gat gtg cgc ggg gca 1563 Asp Gly Leu Thr Tyr Gln Ser Gly Pro Asp Val Asp Val Arg Gly Ala 235 240 245 ttc gca aag aac gga aag ttg gtg aat tct gat gat aaa aat tac cgt 1611 Phe Ala Lys Asn Gly Lys Leu Val Asn Ser Asp Asp Lys Asn Tyr Arg 250 255 260 gca atc tcg acc aat tgg cct gtg ttt gcc ttc tcc cgc gac ctt ggc 1659 Ala Ile Ser Thr Asn Trp Pro Val Phe Ala Phe Ser Arg Asp Leu Gly 265 270 275 acg gtg aag acg tct gct ggc acg tta ttc tcc att ggc ctt gcg cag 1707 Thr Val Lys Thr Ser Ala Gly Thr Leu Phe Ser Ile Gly Leu Ala Gln 280 285 290 295 gac agt gcc att cag tac agt ggg aaa gct gaa gga aca acc gtg atg 1755 Asp Ser Ala Ile Gln Tyr Ser Gly Lys Ala Glu Gly Thr Thr Val Met 300 305 310 cct tca ctc tgg aag agc tat ttc agc act gcg act gct gcg 1797 Pro Ser Leu Trp Lys Ser Tyr Phe Ser Thr Ala Thr Ala Ala 315 320 325 gtgagtgatc cactgttatt tcggacctag aacataatct gacaatccat gtag ctt 1854 Leu gag ttc ttc cat cat gat tat gct gct gct gca gca cta tcg aag gat 1902 Glu Phe Phe His His Asp Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Lys Asp 330 335 340 ctc gat gac cgg ata tcc aag gat tcc att gat gcc gcc ggc cag gac 1950 Leu Asp Asp Arg Ile Ser Lys Asp Ser Ile Asp Ala Ala Gly Gln Asp 345 350 355 tac ttg aca atc acc tcc ctt acg gtt cgt caa gtc ttt gct gca gtg 1998 Tyr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Thr Val Arg Gln Val Phe Ala Ala Val 360 365 370 caa ttg acc ggg acg ccc gag gac ccc tac atc ttc atg aag gaa atc 2046 Gln Leu Thr Gly Thr Pro Glu Asp Pro Tyr Ile Phe Met Lys Glu Ile 375 380 385 390 tcg tct aat ggc aac atg aac act gtg gac gtc atc ttc ccc gct cac 2094 Ser Ser Asn Gly Asn Met Asn Thr Val Asp Val Ile Phe Pro Ala His 395 400 405 ccg atc ttt ttg tac acc aat ccc gag ctc ctc aaa ctg att ctg aag 2142 Pro Ile Phe Leu Tyr Thr Asn Pro Glu Leu Leu Lys Leu Ile Leu Lys 410 415 420 cca atc ttt gag att caa gag aac gga aag tat ccc aac aca tac gcc 2190 Pro Ile Phe Glu Ile Gln Glu Asn Gly Lys Tyr Pro Asn Thr Tyr Ala 425 430 435 atg cac gat att gga acc cac tac ccg aat gcc acc ggt tat cct aag 2238 Met His Asp Ile Gly Thr His Tyr Pro Asn Ala Thr Gly Tyr Pro Lys 440 445 450 ggc gac gac gag aaa atg cca ctc gag gag tgt gga aac atg gtt atc 2286 Gly Asp Asp Glu Lys Met Pro Leu Glu Glu Cys Gly Asn Met Val Ile 455 460 465 470 atg gcc ctt gcc tac gcc cag aag gct aag gac aac gac tat ctc tca 2334 Met Ala Leu Ala Tyr Ala Gln Lys Ala Lys Asp Asn Asp Tyr Leu Ser 475 480 485 cag cac tat ccc atc ctc gaa aaa tgg aca aca tac ctc gtg gag gat 2382 Gln His Tyr Pro Ile Leu Glu Lys Trp Thr Thr Tyr Leu Val Glu Asp 490 495 500 tct att tac ccg gcg aac cag atc tct acg gat gac ttt gct ggc tcg 2430 Ser Ile Tyr Pro Ala Asn Gln Ile Ser Thr Asp Asp Phe Ala Gly Ser 505 510 515 cta gc gtaagtgata tacatgcacg agacaggcgt tgatactaat agtatgtacag a 2486 Leu Al a aac cag acc aac ctg gca tta aag gga atc att gga atc cag gca atg 2534 Asn Gln Thr Asn Leu Ala Leu Lys Gly Ile Ile Gly Ile Gln Ala Met 525 530 535 gct gtg atc agc aat acg aca gga cac ccg gac gat gcg tct aac cac 2582 Ala Val Ile Ser Asn Thr Thr Gly His Pro Asp Asp Ala Ser Asn His 540 545 550 tcc agc att gcc aag gac tac atc gcg agg tgg cag aca cta ggc gta 2630 Ser Ser Ile Ala Lys Asp Tyr Ile Ala Arg Trp Gln Thr Leu Gly Val 555 560 565 gct cac gat gcc aat cct ccg cat acg aca ctg tcg tac gga gcg aac 2678 Ala His Asp Ala Asn Pro Pro His Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Ala Asn 570 575 580 gag act cat g gtcagttggc cgctccgggt acacttatag tactgacttt ctccag 2734 Glu Thr His G 585 gg ctt ctg tac aat ctg tac gcg gat cgt gaa ttg ggc ttg aac ttg 2782 ly Leu Leu Tyr Asn Leu Tyr Ala Asp Arg Glu Leu Gly Leu Asn Leu 590 595 600 gtt cct cag tca gtc tat gac atg caa aac acc ttt tat ccg acg gtg 2830 Val Pro Gln Ser Val Tyr Asp Met Gln Asn Thr Phe Tyr Pro Thr Val 605 610 615 aag gag acg tat gga gtg ccg ctt gat act cga cat gtg tac act aag 2878 Lys Glu Thr Tyr Gly Val Pro Leu Asp Thr Arg His Val Tyr Thr Lys 620 625 630 635 g gtaagttcaa tatgttcttt ctgatgtttg aaattgaata ttgactggtc cccag cg 2936 A la gat tgg gag ctt ttc aca gcc gcg att gcg tcg gag agc gtc cga gac 2984 Asp Trp Glu Leu Phe Thr Ala Ala Ile Ala Ser Glu Ser Val Arg Asp 640 645 650 atg ttc cac aag gcg ctt gcg acg tgg atc aac gag acc ccg acc aac 3032 Met Phe His Lys Ala Leu Ala Thr Trp Ile Asn Glu Thr Pro Thr Asn 655 660 665 cgt gcc ttt acg gat ctc tat gat acc caa act gga aa gtaagtgttt 3080 Arg Ala Phe Thr Asp Leu Tyr Asp Thr Gln Thr Gly As 670 675 680 gccgacgggc tgcttgggcc ttgctgacca atatag t tat ccg gcg ggc att 3132 n Tyr Pro Ala Gly Ile 685 acg ttc att gcg cgg ccc gtc atg ggt ggt gcc ttt gcg ttg tta att 3180 Thr Phe Ile Ala Arg Pro Val Met Gly Gly Ala Phe Ala Leu Leu Ile 690 695 700 ctc tag agttgtttca ttgtatattt gattttattc gcttctgggc gcgagtggag 3236 Leu acacttgctt actttgattc taattttatt attaccatgg ctatgagacc aaattgaccg 3296 ttgttaatag cgtacctcat atatagcatt tttattctgc aaatacacag tgttattgta 3356 tttgggtctt tgataataat gtgttcgtag acgatgctcg aaaggaacta tctggtctgc 3416 aagctgcttc taccaagcat atatcaagat ctacgcatcc agtcgtgctt atccatgtgg 3476 ctctgaccat ctaccgcaga tcgtaagagg actcgaccga gccatcccac gcatcaaaag 3536 cgcgaataag atctaccaaa gtcagcaatc atactcttta caaaccccga caaagaagag 3596 agagaaaggg gaaaaaagaa aaagaaaaag aacataccat aatacaaagc catcgcctcc 3656 aaatgcacat caacagcgac cctctcatca accgtatgaa tattcaacgc tcctccagcc 3716 cgcgacggac tccaccgata gatattcctc gacaaattcc aataaaacct ggtatcagta 3776 ttgcccgtca tgatatcccc actcaccacc accgtcttgc ccttcaaact cggcacggac 3836 tcaaacaccg ctctagtc 3854

【００７４】〈２１０〉４〈２１１〉７０３〈２１２〉ＰＲＴ〈２１３〉ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅＢＡ−１０４〈２２３〉Amino acid sequence coding for glutaminase of Aspergillus soja e BA-104 〈４００〉４ Met Lys Asp Val Pro Cys Val Asn Pro Ser Ile Arg Ile Met Met His 5 10 15 Phe Leu Ser Phe Cys Leu Ser Val Ala Ser Leu Val Ser Tyr Ala Gly 20 25 30 Ala Ala Ser Thr Phe Ser Pro Ala Arg Pro Pro Ala Leu Pro Leu Ala 35 40 45 Val Lys Ser Pro Tyr Leu Ser Thr Trp Leu Ser Ala Gly Thr Asp Gly 50 55 60 Gly Asn Gly Gly Tyr Leu Ala Gly Gln Trp Pro Thr Phe Trp Phe Gly 65 70 75 80 Gln Val Thr Gly Trp Ala Gly Gln Ile Arg Val Asp Asn Ser Thr Tyr 85 90 95 Thr Trp Met Gly Ala Ile Pro Asn Thr Pro Thr Val Asn Gln Thr Ser 100 105 110 Phe Glu Tyr Thr Ser Thr Ser Ser Val Phe Thr Met Arg Val Gly Asp 115 120 125 Met Val Glu Met Lys Val Lys Phe Leu Ser Pro Ile Thr Pro Asp Asp 130 135 140 Leu Arg Arg Gln Ser Leu Val Phe Ser Tyr Leu Asp Val Asp Val Glu 145 150 155 160 Ser Ile Asp Gly Lys Ala His Asp Ile Gln Val Tyr Ala Asp Ile Ser 165 170 175 Ala Glu Trp Val Ser Gly Asp Arg Asn Ala Ile Ala Gln Trp Asp Tyr 180 185 190 Gly Val Thr Asp Asp Gly Val Ala Tyr His Lys Val Tyr Arg Gln Thr 195 200 205 Gln Leu Leu Phe Ser Glu Asn Thr Glu Gln Ala Glu Trp Gly Glu Trp 210 215 220 Tyr Trp Ala Thr Asp Asp Gln Asp Gly Leu Thr Tyr Gln Ser Gly Pro 225 230 235 240 Asp Val Asp Val Arg Gly Ala Phe Ala Lys Asn Gly Lys Leu Val Asn 245 250 255 Ser Asp Asp Lys Asn Tyr Arg Ala Ile Ser Thr Asn Trp Pro Val Phe 260 265 270 Ala Phe Ser Arg Asp Leu Gly Thr Val Lys Thr Ser Ala Gly Thr Leu 275 280 285 Phe Ser Ile Gly Leu Ala Gln Asp Ser Ala Ile Gln Tyr Ser Gly Lys 290 295 300 Ala Glu Gly Thr Thr Val Met Pro Ser Leu Trp Lys Ser Tyr Phe Ser 305 310 315 320 Thr Ala Thr Ala Ala Leu Glu Phe Phe His His Asp Tyr Ala Ala Ala 325 330 335 Ala Ala Leu Ser Lys Asp Leu Asp Asp Arg Ile Ser Lys Asp Ser Ile 340 345 350 Asp Ala Ala Gly Gln Asp Tyr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Thr Val Arg 355 360 365 Gln Val Phe Ala Ala Val Gln Leu Thr Gly Thr Pro Glu Asp Pro Tyr 370 375 380 Ile Phe Met Lys Glu Ile Ser Ser Asn Gly Asn Met Asn Thr Val Asp 385 390 395 400 Val Ile Phe Pro Ala His Pro Ile Phe Leu Tyr Thr Asn Pro Glu Leu 405 410 415 Leu Lys Leu Ile Leu Lys Pro Ile Phe Glu Ile Gln Glu Asn Gly Lys 420 425 430 Tyr Pro Asn Thr Tyr Ala Met His Asp Ile Gly Thr His Tyr Pro Asn 435 440 445 Ala Thr Gly Tyr Pro Lys Gly Asp Asp Glu Lys Met Pro Leu Glu Glu 450 455 460 Cys Gly Asn Met Val Ile Met Ala Leu Ala Tyr Ala Gln Lys Ala Lys 465 470 475 480 Asp Asn Asp Tyr Leu Ser Gln His Tyr Pro Ile Leu Glu Lys Trp Thr 485 490 495 Thr Tyr Leu Val Glu Asp Ser Ile Tyr Pro Ala Asn Gln Ile Ser Thr 500 505 510 Asp Asp Phe Ala Gly Ser Leu Ala Asn Gln Thr Asn Leu Ala Leu Lys 515 520 525 Gly Ile Ile Gly Ile Gln Ala Met Ala Val Ile Ser Asn Thr Thr Gly 530 535 540 His Pro Asp Asp Ala Ser Asn His Ser Ser Ile Ala Lys Asp Tyr Ile 545 550 555 560 Ala Arg Trp Gln Thr Leu Gly Val Ala His Asp Ala Asn Pro Pro His 565 570 575 Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Ala Asn Glu Thr His Gly Leu Leu Tyr Asn 580 585 590 Leu Tyr Ala Asp Arg Glu Leu Gly Leu Asn Leu Val Pro Gln Ser Val 595 600 605 Tyr Asp Met Gln Asn Thr Phe Tyr Pro Thr Val Lys Glu Thr Tyr Gly 610 615 620 Val Pro Leu Asp Thr Arg His Val Tyr Thr Lys Ala Asp Trp Glu Leu 625 630 635 640 Phe Thr Ala Ala Ile Ala Ser Glu Ser Val Arg Asp Met Phe His Lys 645 650 655 Ala Leu Ala Thr Trp Ile Asn Glu Thr Pro Thr Asn Arg Ala Phe Thr 660 665 670 Asp Leu Tyr Asp Thr Gln Thr Gly Asn Tyr Pro Ala Gly Ile Thr Phe 675 680 685 Ile Ala Arg Pro Val Met Gly Gly Ala Phe Ala Leu Leu Ile Leu 690 695 700

【００７５】〈２１０〉５〈２１１〉１２〈２１２〉ＰＲＴ〈２１３〉ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ〈２２０〉〈２２３〉N-terminal sequence of Aspergillus oryzae and Aspergillus soja e glutaminase 〈４００〉５ Ala Ser Thr Phe Ser Pro Ala Arg Pro Pro Ala Leu 5 10

【００７６】〈２１０〉６〈２１１〉１２〈２１２〉ＰＲＴ〈２１３〉ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ〈２２０〉〈２２３〉Partial sequence of A. oryzae glutaminase 〈４００〉６ Asn Gly Lys Tyr Pro Asn Thr Tyr Ala Met His Asp 5 10

【００７７】〈２１０〉７〈２１１〉１１〈２１２〉ＰＲＴ〈２１３〉ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ〈２２０〉〈２２１〉Ｕｎｓｕｒｅ〈２２２〉１，４，６〈２２３〉Partial sequence of A. oryzae glutaminase 〈４００〉７ Xaa Gly Glu Xaa Tyr Xaa Ala Thr Asp Asp Gln 5 10

【００７８】〈２１０〉８〈２１１〉３０〈２１２〉ＰＲＴ〈２１３〉ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ〈２２０〉〈２２３〉Partial sequence of A. oryzae glutaminase 〈４００〉８ Thr Tyr Gly Val Pro Leu Asp Thr Arg His Val Tyr Thr Lys Ala Asp 5 10 15 Trp Glu Leu Phe Thr Ala Ala Ile Ala Ser Glu Ser Val Arg 20 25 30

【００７９】〈２１０〉９〈２１１〉２０〈２１２〉ＤＮＡ〈２１３〉ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ〈２２０〉〈２２３〉ｐｒｉｍｅｒ〈４００〉９ ggy gar tgy tay tgy gcy ac 20 Gly Glu Xaa Tyr Xaa Ala Thr 5

【００８０】〈２１０〉１０〈２１１〉２０〈２１２〉ＤＮＡ〈２１３〉ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ〈２２０〉〈２２３〉ｐｒｉｍｅｒ〈４００〉１０ tay tgy gcy acy gay gay ca 20 Tyr Xaa Ala Thr Asp Asp Gln 5

【００８１】〈２１０〉１１〈２１１〉２０〈２１２〉ＤＮＡ〈２１３〉ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ〈２２０〉〈２２３〉ｐｒｉｍｅｒ〈４００〉１１ tgs atr gcr tar gtr ttr gg 20 5

【００８２】〈２１０〉１２〈２１１〉２０〈２１２〉ＤＮＡ〈２１３〉ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ〈２２０〉〈２２３〉〈４００〉１２ ccy aay acy tay gcy aty ca 20 Pro Asn Thr Tyr Ala Met His 5

【００８３】〈２１０〉１３〈２１１〉３０〈２１２〉ＤＮＡ〈２１３〉ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ〈２２０〉〈２２３〉Ｐｒｉｍｅｒ〈４００〉１３ accgtgaggg aggtgattgt caggtagtcc 30

【００８４】〈２１０〉１４〈２１１〉３０〈２１２〉ＤＮＡ〈２１３〉ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ〈２２０〉〈２２３〉Ｐｒｉｍｅｒ〈４００〉１４ gagaataacg tgccagcaga cgtcttcacc 30

【００８５】〈２１０〉１５〈２１１〉３０〈２１２〉ＤＮＡ〈２１３〉ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ〈２２０〉〈２２３〉Ｐｒｉｍｅｒ〈４００〉１５ tgccatacag tacgatggga aacctgaagg 30

【００８６】〈２１０〉１６〈２１１〉３１〈２１２〉ＤＮＡ〈２１３〉ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ〈２２０〉〈２２３〉Ｐｒｉｍｅｒ〈４００〉１６ aggactacct gacaatcacc tccctcacgg t 31

【００８７】〈２１０〉１７〈２１１〉３０〈２１２〉ＤＮＡ〈２１３〉ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ〈２２０〉〈２２３〉Ｐｒｉｍｅｒ〈４００〉１７ atgatgcatt tcctctcgtt ctgtctgtcg 30

【００８８】〈２１０〉１８〈２１１〉３０〈２１２〉ＤＮＡ〈２１３〉ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ〈２２０〉〈２２３〉Ｐｒｉｍｅｒ〈４００〉１８ ggcgtcgact agagcggtgt ttgagtccgt 30

【００８９】〈２１０〉１９〈２１１〉２９〈２１２〉ＤＮＡ〈２１３〉ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ〈２２０〉〈２２３〉Ｐｒｉｍｅｒ〈４００〉１９ attgatccgg atataagatg tctgtgatg 29

【００９０】〈２１０〉２０〈２１１〉３０〈２１２〉ＤＮＡ〈２１３〉ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ〈２２０〉〈２２３〉Ｐｒｉｍｅｒ〈４００〉２０ atgatgcatt tcctctcgtt ttgtctgtcg 30

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明のグルタミナーゼの至適pHを示す
グラフである。

【図２】図２は本発明のグルタミナーゼのpH安定性を示
すグラフである。

【図３】図３は本発明のグルタミナーゼの至適温度を示
すグラフである。

【図４】図４は本発明のグルタミナーゼの温度安定性を
示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:69） (72)発明者北本則行愛知県名古屋市守山区大字下志段味字風越 1931番地の１ (72)発明者吉野庄子愛知県名古屋市守山区金屋二丁目280番地 (72)発明者伊藤誉愛知県豊橋市東小鷹野３−15−９シティハイツ明105 (72)発明者畔柳孝愛知県豊橋市中岩田２−４−21 ハイカムール中岩田Ｂ−102 (72)発明者竹田加代子愛知県海部郡美和町北苅上深坪57 Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA11 CA04 DA11 HA01 4B050 CC03 DD03 FF09E FF11E FF12E LL02 4B065 AA60X AA60Y AA63X AA63Y AB01 CA31 CA42

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次の性質：（１）作用：Ｌ−グルタミンに作用してＬ−グルタミン
酸を生成する；（２）至適pH：至適pHが約８．５である；（３）安定pH範囲：４℃にて２４時間インキュベートし
た場合、安定pH範囲はおよそ３〜１１である；（４）至適作用温度：pH８．０において測定した場合、
至適作用温度は約５０℃である；（５）温度安定性：pH８．０にて３０分間インキュベー
トした場合、４５℃以下の温度で安定である；（６）分子量：ゲル濾過により測定した場合、分子量は
約７３，０００である；を有するグルタミナーゼ。
【請求項２】配列番号：２に示すアミノ酸配列におい
て、アミノ酸３４〜７０３のアミノ酸配列を有するグル
タミナーゼ。
【請求項３】配列番号：２に示すアミノ酸配列中のア
ミノ酸番号３４〜７０３のアミノ酸配列において、１個
又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換によ
り修飾されたアミノ酸配列を有し、且つグルタミナーゼ
活性を有する修飾されたグルタミナーゼ。
【請求項４】配列番号：１に示す塩基配列を有する核
酸とストリンジエント条件下でハイブリダイズすること
ができる核酸によりコードされているグルタミナーゼ。
【請求項５】配列番号：２に示すアミノ酸配列中のア
ミノ酸番号３４〜７０３のアミノ酸配列に対して７０以
上％の相同性を有するアミノ酸配列を有するグルタミナ
ーゼ。
【請求項６】配列番号：４に示すアミノ酸配列におい
て、アミノ酸３４〜７０３のアミノ酸配列を有するグル
タミナーゼ。
【請求項７】配列番号：４に示すアミノ酸配列中のア
ミノ酸番号３４〜７０３のアミノ酸配列において、１個
又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換によ
り修飾されたアミノ酸配列を有し、且つグルタミナーゼ
活性を有する修飾されたグルタミナーゼ。
【請求項８】配列番号：３に示す塩基配列を有する核
酸とストリンジエント条件下でハイブリダイズすること
ができる核酸によりコードされているグルタミナーゼ。
【請求項９】配列番号：４に示すアミノ酸配列中のア
ミノ酸番号３４〜７０３のアミノ酸配列に対して７０以
上％の相同性を有するアミノ酸配列を有するグルタミナ
ーゼ。
【請求項１０】請求項２〜５のいずれか１項に記載の
グルタミナーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項１１】イントロンを含んで成る請求項１０に
記載のＤＮＡ。
【請求項１２】ゲノムＤＮＡである請求項１１に記載
のＤＮＡ。
【請求項１３】請求項６〜９のいずれか１項に記載の
グルタミナーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項１４】イントロンを含んで成る請求項１３に
記載のＤＮＡ。
【請求項１５】ゲノムＤＮＡである請求項１４に記載
のＤＮＡ。
【請求項１６】請求項１０〜１２のいずれか１項に記
載のＤＮＡを含んで成るベクター。
【請求項１７】請求項１３〜１５のいずれか１項に記
載のＤＮＡを含んで成るベクター。
【請求項１８】請求項１６に記載のベクターにより形
質転換された宿主細胞。
【請求項１９】請求項１７に記載のベクターにより形
質転換された宿主細胞。
【請求項２０】請求項１に記載のグルタミナーゼの製
造方法において、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ）属に属し、該グルタミナーゼを生産することがで
きる微生物を培養し、培養物からグルタミナーゼを採取
することを特徴とする方法。
【請求項２１】前記微生物が、アスペルギルス・ソセ
ー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）又はアスペ
ルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙ
ｚａｅ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】請求項２〜５のいずれか１項に記載の
グルタミナーゼの製造方法において、該グルタミナーゼ
をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターにより形
質転換された宿主細胞を培養し、該培養物から、該グル
タミナーゼを採取することを特徴とする方法。
【請求項２３】請求項６〜９のいずれか１項に記載の
グルタミナーゼの製造方法において、該グルタミナーゼ
をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターにより形
質転換された宿主細胞を培養し、該培養物から該グルタ
ミナーゼを採取することを特徴とする方法。