HU219809B - Új gomba proteáz és eljárás ennek előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya egy új DNS-szekvencia, amely egy szubtilizin típusúAspergillus niger szerinproteázt kódol, a megfelelő hibrid vektor,továbbá maga a szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteáz éseljárás az előállításukra. A találmány tárgya továbbá egy új,szubtilizin típusú szerinproteáz-hiányos Aspergillus niger mutánstörzs, valamint eljárás ezen mutáns törzs előállítására. ŕ

Description

A találmány tárgya egy új DNS-szekvencia, amely egy új gombaproteázt, nevezetesen egy szubtilizin típusú Aspergillus szerinproteázt kódol, valamint maga a szubtilizin típusú Aspergillus szerinproteáz. A találmány tárgya továbbá egy új, szubtilizin típusú szerinproteázban hiányos Aspergillus mutáns törzs, amely felhasználható heterológ fehéijék kifejezésére, valamint eljárás ezen mutáns törzs előállítására.

Az Aspergillus-fajokat és különösen az Aspergillus nigert felhasználják az élelmiszeriparban enzimek ipari előállítására. Az Aspergillus niger előnye, hogy mint a rekombináns fehéijék termelésére alkalmas gazdaszervezet, nagy mennyiségben szekretálja a fehéijéket, és a rendszerek alkalmasak a molekuláris genetikai manipulációkra. Azonban a proteázok jelenléte a tenyészlében károsnak bizonyult a heterológ fehérjék kifejezésére A. nigerben, valójában az Aspergillus-fajokat használják proteázok termelésére. Az Aspergillusok által termelt extracelluláris proteázok egy részét már leírták az irodalomban [Barthomeuf et al.: Biotech. Tech. 2, 29-34 (1988), Barthomeuf et al.: Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 37, 1333-1336 (1989), Bosmann, Η. B.: Biochim. Biophys. Acta 293, 476-489 (1973), Ichishima, E.: Biochem. Biophys. Acta 258, 274-288 (1972), Chopra, S. and Mehta, P.: Fólia Microbiol. 30, 117-125 (1985), Krishnan and Vijayalakshimi: J. Chromatogr. 329, 165-170 (1985)]. A pepA gént, mely, az Aspergillus awamori által termelt aspergillopepsin A-t kódolja, nemrég klónozták [Berka et al.: Gene 86, 153-162 (1990)]. Az A. niger által szekretált savas proteázok legnagyobb része pepA génterméknek bizonyul és azok a törzsek, melyekben a pepA gén hiányzik, a heterológ fehéijék megnövelt mértékű expresszióját teszik lehetővé A. niger var. awamoriban [Dunn-Coleman et al.: Biotechnology 9, 976-981 (1991)]. Egyéb, Aspergillusokból származó proteázgéneket is az utóbbi időben klónoztak, ezek közé tartozik az A. oryzae alkalikus szerinproteáza [Tatsumi et al.: Mól. Gén. Génét. 219, 33-38 (1989)], az A. fumigatus alkalikus szerinproteáza [Jaton-Ogay et al.: FEMS Microbiol. Letts. 92, 163-168 (1992)], egy nem pepszin típusú savas proteáz az A. niger var. macrosporusból [Inoue et al.: J. Bioi. Chem. 266, 19484-89 (1991)] és egy metalloproteáz, melyet neutrális proteáz II-nek neveznek, az A. oryzaeből [Tatsumi et al.: Mól. Gén. Génét. 228,97-103 (1991)].

Az A. niger izolált és mutált proteázgénjei felhasználhatók a géndiszrupciós (szétszakítás) kísérletekben, azaz olyan mutáns törzsek előállítására, melyekben a megfelelő természetes gént szétroncsolták. Például az Aspergillus awamoriból a pepA gént törölték géndiszrupcióval a célból, hogy aspergillopepsin A deficiens törzseket állítsanak elő (Berka et al., lásd fent).

Az Aspergillus-fajok azonban, amint azt fent említettük, nagyszámú különböző proteázt termelnek, és így, állandóan igény van a fehéijék ipari előállításához egyéb proteázokban hiányos Aspergillus törzsekre. E célból szükség van tehát más proteázgénekre is, melyek felhasználhatók proteázhiányos törzsek előállítására in vitro mutagenezissel, például géndiszrupcióval. Ezen túlmenően, szükség van rekombináns proteázfehérjékre is, melyek iparilag alkalmazhatók fehéijék termelésére.

Az A. nigerben szekretált proteázaktivitások másik nagy csoportját alkotják a szerinproteázok [Sakka et al.: J. Ferment. Technoi. 63, 479-483 (1986)]. A gombából származó szerinproteázokat széleskörűen jellemezték a T. album penészben és a Saccharomyces cerevisiae élesztőben. A T. album valószínűleg három rokon szerinproteázt választ ki, a legjobban jellemzett a proteináz K. [Jany et al.: FEBS 199, 139-144 (1986)], míg egy homológ fehérje lokalizálódik élesztőben a vakuólában [Wolf and Ehmann: Eur. J. Biochem. 98, 375-384 (1979)]. A T. album és a S. cerevisiae fehérjék génjeit klónozták és jellemezték [Gunkel and Gassen: Eur. J. Biochem. 179,185-194 (1989), Samal et al.: Gene 85, 329-333 (1989), Samal et al.: Molec. Microbiol. 4,1789-1792 (1990), és Moehle et al.: Molec. Cell. Bioi. 7, 4390-99 (1987)]. Az alkalikus szerinproteázokat szintén klónozták és jellemezték A. oryzaeben, A. fumigatusban és Achremonium chrysogenumban [Tatsumi et al.: Mól. Gén Génét. 219, 33-38 (1989), Jaton-Ogay et al.: FEMS Microbiol. Letts. 92, 163-168 (1992), Isogai et al.: Agric. Bioi. Chem. 55, 471-477(1991)].

Azt találtuk, hogy az Aspergillus szintén termel szerinproteázokat, amelyek homológok a proteázok szubtilizincsaládjával. A jelen találmány az ilyen típusú proteázokra irányul.

A találmány tárgya tehát egy új DNS-molekula, amely egy szubtilizin típusú Aspergillus szerinproteázt kódol.

A találmány tárgya továbbá egy szubtilin típusú rekombináns Aspergillus szerinproteáz és ennek termeléséhez egy ene a célra transzformált Aspergillus törzs.

A találmány tárgyát képezi továbbá a szubtilizin típusú szerinproteázgénben hiányos Aspergillus törzs, mely törzs felhasználható heterológ fehéijék sokkal hatékonyabb termelésére.

A találmány tehát egy szubtilizin típusú Aspergillus szerinproteázra vonatkozik. Ezt a proteázt „Aspergillusszubtilizin”-nek neveztük el. A találmány szerinti „Aspergillus-szubtilizin” alatt olyan enzimet értünk, amely (a) Aspergillus-fajból származik, (b) proteázaktivitással rendelkezik, ami az aktív helyen lévő katalitikus szerinmaradéknak tulajdonítható, és (c) a megfelelő aminosavszekvenciája homológ a szubtilizincsaládba tartozó ismert szerinproteázokéval. Azonban a leírásban használt Aspergillus-szubtilizin elnevezés magában foglalja az ilyen enzimek fragmenseit is, amelyek még szerinproteáz-aktivitással rendelkeznek, de előnyben részesítjük a teljes hosszúságú enzimeket. Magától értetődő, hogy a találmány részét képezik azok a fúziós proteinek is, melyek a találmány szerinti „Aspergillus-szubtilizin”-t tartalmazzák a hozzákapcsolódó aminosavakkal, peptidekkel vagy fehéij ékkel együtt.

Az Aspergillus-szubtilizin egyik előnyös jelentése az Aspergillus nigerből származó proteáz vagy aktív fragmens, még előnyösebben az a proteáz és aktív fragmens, amely a szekvenciatáblázatokban megadott szekvenciák közül az 1. számú (SEQ ID NO. 1.) és 6. szá2

HU 219 809 Β mú (SEQ ID NO. 6.) aminosavszekvenciával, illetőleg -szekvencia-részlettel rendelkezik.

A találmány továbbá egy izolált DNS-szekvenciára is vonatkozik, mely a találmány szerinti Aspergillusszubtilizint kódolja, és egy hibrid vektorra ezen DNSszekvencia klónozására és sokszorozására. A találmány tárgya tehát továbbá egy expressziós hibrid vektor Aspergillus-szubtilizin termelésére, mely magában foglalja a fenti DNS-szekvenciát működőképesen kapcsolva a szabályozórégiókkal, és amely alkalmas egy megfelelő gazdasejtben az Aspergillus-szubtilizin-gén kifejezésére. A találmány vonatkozik továbbá a transzformáit gazdasejtekre is, melyek képesek az Aspergillusszubtilizin-gén kifejezésére, például egy Aspergillus törzsre, amely képes az Aspergillus-szubtilizin túltermelésére, ezáltal nagyszámú génkópiát eredményezve a transzformáció után.

A találmány oltalmi köréhez tartozik továbbá egy Aspergillus-szubtilizin-hiányos - Aspergillus törzs is és eljárás ezen törzs előállítására az Aspergillus-szubtilizint kódoló DNS-szekvencia segítségével, mutagenezissel, például géndiszrupcióval, mely szekvencia többé már nem képes a funkcionális fehérje kifejezésére.

A fentieken túlmenően a találmány magában foglal eljárásokat a DNS-szekvencia, a hibrid vektor, az expressziós vektor és a találmány szerinti Aspergillus-szubtilizin előállítására, valamint eljárásokat az Aspergillusszubtilizin-deficiens Aspergillus törzs és az Aspergillus-szubtilizint túltermelő gazdaszervezet előállítására.

Az alábbiakban a találmányt részletesebben ismertetjük.

Az Aspergillus-szubtilizint kódoló DNS-molekula, hibrid vektorok a klónozáshoz és expresszióhoz

A találmány olyan DNS-molekulára vonatkozik, amely egy Aspergillus-szubtilizint, előnyösen Aspergillus niger-szubtilizint kódoló szekvenciát foglal magában. A DNS-szekvencia tartalmazhat egy vagy több intront, mint DNS-molekulákat, izolálhatóan egy genomiális DNS-könyvtárból, például mint a pepC gén (szekvenciáját a SEQ ID NO. 1. mutatja be) és a pepD gén, melynek szekvenciáját a SEQ ID NO. 6. mutatja be. A találmány vonatkozik azonban az intron nélküli DNS-szekvencia-variánsokra is, például ezek izolálhatók a cDNS klónozásával vagy mutagenezis után, például PCR-technológia alkalmazásával. Ilyen intronhiányos gének különösen jól használhatók expresszióra nem Aspergillus gazdaszervezetekben, előnyösen prokariótákban és élesztőkben.

A találmány előnyösen egy DNS-molekulára vonatkozik, amely magában foglalja az A. niger-szubtilizin PEPC-t kódoló DNS-szekvenciát, melynek aminosavszekvenciája a SEQ ID NO. 1-ben látható, vagy egy fragmensét, mely megőrizte a szerinproteáz-aktivitást. Egy találmány szerinti DNS-szekvencia előnyösen az érett PEPC proteázt kódoló régiót tartalmazza, melynek nukleotidszekvenciája a SEQ ID NO. 1-ben látható. A találmány magában foglalja azonban a PEPC-t vagy egy fragmensét kódoló degenerált DNS-szekvenciákat is, azaz olyan szekvenciákat, amelyekben a nukleotidok helyettesítve vannak a kódolt aminosavszekvencia változása nélkül. Az ilyen DNS-szekvenciák felhasználhatók például differenciák létrehozására az előnyben részesített kodonban különböző gazdaszervezetekben vagy új felismerőhelyek létrehozására restrikciós enzimek számára.

A találmány egy másik előnyös megvalósítása egy olyan DNS-molekula, amely az A. niger-szubtilizin PEPD-t kódoló DNS-szekvenciát foglalja magában, melyet a SEQ ID NO. 6-ban mutatunk be, vagy ennek egy szerinproteáz-aktivitással rendelkező fragmensét. Egy másik előnyös találmány szerinti DNS-szekvencia így tehát az érett PEPD proteázt kódoló régió, mely a SEQ ID NO. 6. nukleotidszekvenciában látható. A találmány azonban a PEPD-t vagy egy fragmensét kódoló degenerált DNS-szekvenciára is vonatkozik, azaz olyan szekvenciákra, melyekben a nukleotidokat helyettesítjük a kódolt aminosavszekvencia változása nélkül.

A találmány egy hibrid vektorra is vonatkozik, amely tartalmaz inszertként egy találmány szerinti Aspergillus-szubtilizint kódoló DNS-szekvenciát, célszerűen annak egy előnyös formáját. Az ilyen, találmány szerinti hibrid vektor felhasználható a találmány szerinti DNS-szekvencia szaporítására és sokszorozására. A találmány tehát egy expressziós vektorra vonatkozik, mely alkalmas a találmány szerinti Aspergillusszubtilizin, célszerűen az előnyös forma, termelésére. Egy ilyen expressziós vektor tartalmaz egy „expreszsziós kazettát”, amelyben egy Aspergillus-szubtilizint kódoló DNS-szekvenciát kapcsoltunk működőképesen a szabályozórégiókkal, melyek alkalmasak a kívánt gazdaszervezetben a DNS-szekvencia expressziójának kontrolljára.

A találmány szerinti hibrid vektor, magában foglalva egy expressziós vektort, származhat bármely vektorból, mely használatos a géntechnológia területén, így vírusokból, fágokból, kozmidokból, plazmidokból vagy egy kromoszomális DNS-ből. A célnak megfelelő vektorok lehetnek az SV40, a herpesz-, a papilloma-, a retrovagy a bacilovírusok származékai, a lambda-fágok származékai (NM 989 vagy EMBL4), az Ml3 fág származékai (M13mp8), bakteriális plazmidok (pBR322, pUC18) vagy élesztőplazmidok (élesztő 2 u plazmid), vagy egy defektív vírus, fág vagy plazmid egy segítő (helper) - a defektív vírus, fág vagy plazmid replikációját lehetővé tevő - vírus, fág vagy plazmid jelenlétében: ilyen vektor például az M13(+)KS vektor például a M14K07 helper fággal együtt. A vektorok származhatnak továbbá kromoszomális DNS-ből, például fonalas gombák, így Aspergillus-fajok, különösen az A. niger kromoszomális DNS-éből (lásd 184 438 számú európai közrebocsátási irat). Előnyösek az S. cerevisiae vagy fonalas gomba vektorai, még előnyösebbek az Aspergillus fajoké, legelőnyösebb az A. nigeré.

A találmány szerinti hibrid vektor, magában foglalva az expressziós vektort, lehetővé teszi a kívánt DNS replikációját egy alkalmas gazdaszervezetben vagy extrakromoszomális elemként vagy a gazdaszervezet kromoszómáiba integrálódva. Számos olyan vektorrendszer áll rendelkezésre, ami lehetővé teszi a találmány szerinti, klónozott DNS-ek integrálódását és expresszió3

HU 219 809 Β ját. Elvben minden olyan vektor, amely replikálódik és stabilan fennmarad a választott gazdaszervezetben, alkalmazható. így, a vektor kiválasztása a transzformációhoz kiválasztott gazdasejtektől függ. Általában ilyen gazdaszervezetek lehetnek prokarióta vagy eukarióta mikroorganizmusok, úgymint baktériumok, gombák, így élesztők, előnyösen S. cerevisiae, vagy fonalas gombák, előnyösen Aspergillus-fajok, még előnyösebben A. niger, vagy magasabb rendű eukarióta szervezetek, így gerinces állatok, például emlősök sejtjei. A megfelelő gazdaszervezeteket az alábbiakban részletesen fogjuk tárgyalni. A találmány szerinti hibrid vektor, mely magában foglal egy expressziós vektort, amely fennmarad extrakromoszomális elemként, tartalmaz egy replikációs origót (őri) vagy egy autonóm módon replikálódni képes szekvenciát (ARS), szelektálható markerszekvenciákat, és adott esetben további restrikciós helyeket is. Annak a vektornak, amely képes a gazdaszervezet kromoszómájába integrálódni, nem kell ori-t vagy ARS-t tartalmaznia, mert az a sejtben a kromoszómával együtt replikálódik.

A replikációs origó vagy egy autonóm módon replikálódó szekvencia (egy olyan DNS-elem, amely önálló replikációs képességeket kölcsönöz az extrakromoszomális elemeknek) vagy adott egy vektorban egy exogén origó által, vagy más forrásokból, például Simian-vírusból (SV40) vagy más vírusból vagy a gazdasejt kromoszómakészletéből származik.

A találmány szerinti hibrid vektort, amely magában foglal egy expressziós vektort és tartalmazhat a transzformálandó gazdaszervezettől függően megválasztott szelektálható markereket is, szelektáltuk és klónoztuk. Bármely markergén használható, amely kifejeződésével elősegíti a transzformánsok fenotípus szerint történő szelektálását. Különösen azok a markergének használhatók, amelyek antibiotikumrezisztenciát (például tetraciklin- vagy ampicillinrezisztenciát) kölcsönöznek a gazdaszervezetnek, vagy - a gombák auxotróf mutánsai esetében - pótolják a gazdaszervezet genomjából a hiányzó gént. Ilyen gének például az antibiotikumcikloheximid rezisztenciagénje vagy az auxotróf élesztőmutánsokat, különösen az S. cerevisiaet, prototróffá transzformáló ura3, leu2, his3 vagy trpl gének. Markergének lehetnek még olyan struktúrgének is, amelyek egy önálló replikálódó elemhez kapcsolódva fejeződnek ki, feltéve, hogy a transzformált gazdaszervezet eredetileg auxotróf volt a struktúrgéntermékre nézve.

Különös jelentőségűek a hibrid vektorokkal, de még inkább az expressziós vektorokkal kapcsolatban azok a markergének, amelyek az A. niger gazdaszervezet lézióit kiegészítik. Ilyen például az omitin-karbamoil-transzferáz génje (argB), amelyet A. nigerből vagy A. nidulansból (184 438 számú európai szabadalmi leírás) vagy az A. niduláns olyan DNS-ffagmentumából nyerhetünk, amelyek homológok az N. crassa pyr4 génjével. Egyéb alkalmas markergéneket is leírunk az alábbiakban, ahol a transzformált gazdaszervezeteket ismertetjük.

A találmány szerinti hibrid vektor alkalmas az Aspergillus-szubtilizint kódoló DNS szokszorozására

E. coliban, például a pTZPEPC vagy a pTZPEPD plazmid, melyeket a példáknál írunk le.

Az „expressziós kazetta” kifejezés a találmány szerinti expressziós vektorral összefüggésben egy DNSszekvenciát jelent, mely képes az Aspergillus-szubtilizin kifejezésére, és magában foglal egy promotert működőképesen kapcsolva az Aspergillus-szubtilizint kódoló régióhoz, és adott esetben tartalmaz egy vagy több szabályozóelemet, így szignálszekvenciát, transzkripciós terminátort, transzkripciót növelő szekvenciát, riboszomális kötőhelyet, egy szekvenciát az RNS hatékony termelésére, egy szekvenciát a fehérje hatékony termelésére, és egy szekvenciát a korrekt fehérjelokalizáció kódolására. A találmány szerinti expressziós kazettában az Aspergillus-szubtilizint kódoló régiót összekapcsolhatjuk homológ szabályozóelemekkel, azaz amelyek a természetben egymással összekapcsoltak, illetve heterológ regulátorelemekkel, azaz olyanokkal, amelyek más génekből származnak.

A promoterszekvenciák széles variációját alkalmazhatjuk, a gazdaszervezet természetétől függően. Azok a promoterek a leginkább alkalmasak, melyek erősek és ugyanakkor jól szabályozottak. Promoterek lehetnek például a prokariotikus XP_L, λΡ_κ, E. coli lac, trp vagy tac promoter. Élesztőkben, különösen S. cerevisiaeben történő kifejezésre alkalmas promoterek a TRP1-, ADHI-, ADHII-, PH03- PH05-, GAL10- vagy a glikolitikus promoterek, mint az enoláz, glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz, 3-foszfogliceridkináz (PGK), hexokináz, piruvát-dekarboxiláz, foszfoffuktokináz, glükóz-6-foszfátizomeráz, 3-foszfogliceridmutáz, piruvátkináz, triozfoszfát-izomeráz, foszfoglükózizomeráz és glükokináz gének promoterei, vagy a PH05-GAPDH hibrid promoter (213 593 számú európai közrebocsátási irat). Az eukarióta promoterek származhatnak eukarióta vírusokból, mint például SV40, Rous-szarkómavírus, adenovírus 2, marha-papillomavírus, papovavírus, citomegalovírus vagy lehetnek emlőssejtekből származó promoterek, mint például aktin, kollagén, miozin vagy béta-globin-gén. Az eukarióta promotereket összekapcsolhatjuk növelőszekvenciákkal, úgy mint élesztő-, előnyösen S. cerevisiae, upstream aktiválószekvenciákkal (UAS), vagy vírus- vagy sejtes növelőkkel, úgy mint citomegalovírus IE növelő, immunoglobulingén-növelő vagy mások.

A növelők transzkripcióstimuláló DNS-szekvenciák, amelyek például vírusokból, így Simian-vírusból, poliómavirusból, marha-papillomavírusból vagy Moloney-szarkómavírusból származnak, illetve genomiális eredetűek. Egy növelőszekvencia tehát származhat a Physarum polycephalum extrakromoszomális riboszomális DNS-éből (PCT/EP 8500278). További alkalmas növelők, például, az élesztő savas foszfatáz PH05 génből származó upstream aktiválószekvenciák.

Szignálszekvencia lehet például egy preszekvencia vagy szekréciót vezető szekvencia, amely a polipeptid szekrécióját irányítja, és hasonlók. Az Aspergillus-szubtilizin szignál- vagy vezetőszekvenciája látható például a SEQ ID NO. 1. szekvenciaábrán. További szignálszekvenciák ismertek az irodalomból, például melyeket

HU 219 809 Β

Heijne összegyűjtött [Heijne, G.: Nucleic Acids. Rés. 14, 4683 (1986)].

Szükség van még iniciációs és terminációs szekvenciákra a transzkripcióhoz és az mRNS stabilizálásához, melyek általában a nem működő 5’-régiókból és 3’régiókból származnak, előnyösen a vírus- és eukariótacDNS-ből, például a kifejező gazdaszervezetből.

A találmány megvalósításának előnyös módját jelenti az az expressziós vektor, amely tartalmaz egy intronhiányos kódolórégiót, mely a SEQ ID NO. 1-ben bemutatott kódolórégió két exonjából vagy a SEQ ID NO. 6-ban látható kódolórégió négy exonjából áll. Ez a vektor kifejezi az Aspergillus-szubtilizint prokariótákban, például E. coliban, vagy élesztőkben, leginkább S. cerevisiaeben a GÁL 10 promoter kontrollja alatt, például a pFBY138 plazmidban.

A találmány előnyösen egy olyan vektorra vonatkozik, mely képes egy Aspergillus-szubtilizint kódoló DNS-szekvencia egy Aspergillus törzsben történő kifejezésére.

A találmány szerinti expressziós vektorok egyik típusa tartalmaz egy Aspergillus-szubtilizint kódoló DNS-szekvenciát, előnyösen A. niger-szubtilizint, egy olyan promoter kontrollja alatt, amely természetes módon kapcsolt a nevezett DNS-szekvenciával, azaz annak homológ promotere. Még előnyösebb egy olyan expressziós vektor, mely a SEQ ID NO. 1-ben a PEPC-t kódoló DNS-szekvenciát tartalmazza, legelőnyösebb pedig a SEQ ID NO. 1-ben látható DNS-szekvencia az ugyanott látható promoterrégió kontrollja alatt, vagy az az expressziós vektor, amely a SEQ ID NO. 6-ban látható DNS-szekvenciával rendelkezik, és az ugyanott látható promoterrégió kontrollja alatt áll. A SEQ ID NO. 1-ben bemutatott PEPC-t kódoló régió azonban kifejeződik a SEQ ID NO. 6-ban bemutatott PEPD promoter kontrollja alatt is, és vica versa.

Az Aspergillus-szubtilizin előnyösen a médiumba választódik ki. Ez elérhető olyan szignálszekvencia használatával, mely működőképesen kapcsolódik a struktúrgénhez, előnyösen a szignálszekvencia természetes módon kapcsolódik az Aspergillus-szubtilizin struktúrgénhez, például egy plazmidban, mint a pTZPEPC, amely hordozza a PEPC szignálszekvenciát és a SEQ ID NO. 1-ben bemutatott kódolórégiót, vagy a pTZPEPD plazmidban, mely a PEPD szignálszekvenciáját és a SEQ ID NO. 6-ban bemutatott kódolórégiót hordozza.

Ha egy ilyen expressziós vektort használunk az Aspergillus-szubtilizin kifejezésére olyan gazdaszervezetben, amelyből az Aspergillus-szubtilizin-gén eredetileg származik, az Aspergillus-szubtilizin túltermelődik (overexpression), mert mind a rekombináns, mind az eredeti gén aktív lesz az azonos expressziós körülmények között.

A találmány az expressziós vektorok egy másik típusára is vonatkozik, mely magában foglalja az Aspergillus-szubtilizint kódoló DNS-szekvenciát egy Aspergillusban funkcionáló olyan promoter kontrollja alatt, mely nem természetes módon kapcsolódik a nevezett DNS-szekvenciához. Az ilyen promoterek alkalmasak az Aspergillus-szubtilizin kifejezésére Aspergillus-fajokban, különösen A. nigerben. Ilyen egy Aspergillus spec. pektinliázgén promotere, előnyösen az A. niger PLI (lásd 0 278 355 számú európai közrebocsátási irat), PLA, PLB, PLC, PLE vagy PLF (lásd 0 353 188 számú európai közrebocsátási irat), egy Aspergillus spec. poligalakturonázgén promotere, előnyösen az A. niger PGI vagy PGII gén (lásd 421919 számú európai bejelentés) promotere, egy Aspergillus spec. piruvátkinázgén promotere, előnyösen az A. niger pki-gén promotere (439997 számú európai bejelentés), vagy egy jelen találmány szerinti Aspergillus-szubtilizin-gén promotere, előnyösen a SEQ ID NO. 1. vagy 6-ban bemutatott Aspergillus-szubtilizin-gén promotere. Az Aspergillusszubtilizin szekrécióját ebben az esetben is egy szignálszekvencia használatával valósíthatjuk meg, amely működőképesen van kapcsolva a struktúrgénhez, például az Aspergillus-szubtilizin-génnel természetes módon kapcsolt szignálszekvencia, mely a PEPC esetében a SEQ ID NO. 1-ben látható. Azonban heterológ szignálszekvenciát is alkalmazhatunk az Aspergillus-szubtilizinhez, amely lehet például az Aspergillus spec. pektinliázgén szignálszekvenciája, előnyösen az A. niger PLI gén (0 278 355 számú európai közrebocsátási irat), a PLA, PLB, PLC, PLE vagy PLF gén (0 353 188 számú európai közrebocsátási irat) promotere, vagy egy Aspergillus spec. poligalakturonázgén szignálszekvenciája, előnyösen az A. niger PGI vagy PGII gén szignálszekvenciája (421919 számú európai bejelentés).

A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint például a pPKIPEPCA plazmidban az A. niger piruvátkináz promoterét működőképesen kapcsoljuk a SEQ ID NO. 1. szerinti, Aspergillus-szubtilizint kódoló régióval, mely a saját, homológ szignálszekvenciájához van kapcsolva.

A találmány egy másik előnyös megvalósítása szerint a pPKIPEPDA plazmidban az A. niger piruvátkináz promoterét működőképesen kapcsoltuk a SEQ. ID NO.

6. szerinti, Aspergillus-szubtilizint kódoló régióval, mely a saját szignálszekvenciájához kapcsolódik.

Eljárás az Aspergillus-szubtilizin-gén kinyerésére

A találmány tehát egy, találmány szerinti DNS-molekula előállítására vonatkozik, azaz egy, találmány szerinti Aspergillus-szubtilizint kódoló molekulára, előnyösen az Aspergillus-szubtilizin előnyös formáját kódolóra, vagy egy ilyen DNS-molekulát hordozó hibrid vektor előállítására, továbbá eljárásra, mely magában foglalja a nevezett DNS-molekulával vagy hibrid vektorral transzformált gazdaszervezet tenyésztését. A találmány szerinti DNS-molekula előállítható kémiai szintézissel is a nukleotidok kondenzálásával.

A gazdasejtek tenyésztését a szokásos táptalajokon végezhetjük, adott esetben kiegészítve vagy elvonva belőlük kémiai vegyületeket, melyek lehetővé teszik a transzformánsok negatív vagy pozitív szelekcióját, azaz olyan gazdasejtekét, melyek a kívánt DNS-molekulát a szelekciós markerrel együtt tartalmazzák, és a nem transzformánsokét, azaz olyan gazdasejtekét, melyekből hiányzik a kívánt DNS-molekula.

Bármely transzformálható gazdasejt - mely a szakirodalomból ismert - felhasználható, így például bakté5

HU 219 809 Β rium, mint az E. coli, gomba, mint a Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, magasabb rendű eukarióta sejtek, mint a rovar- vagy emlőssejtek, például CHO-sejtek, de különösen a fonalas gombák, mint az Aspergillusok, így az A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori és különösen az A. niger sejtjei. A gazdasejtek transzformálását a szokásos módszerekkel végezzük.

Az Aspergillus-szubtilizint kódoló DNS-szekvenciát megkaphatjuk egy Aspergillus törzs genomjából, amely képes az Aspergillus-szubtilizin kifejezésére, vagy előállíthatjuk például egy rekombináns DNS-molekulával mely az Aspergillus-szubtilizint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazza - transzformált gazdasejt tenyésztésével, és kívánt esetben, izoláljuk a DNS-szekvenciát ebből.

Előnyösen egy ilyen DNS-szekvencia izolálására az alábbi eljárási lépéseket alkalmazzuk:

a) izoláljuk a genomiális DNS-t a megfelelő Aspergillus-sejtekből és szelektáljuk a kívánt DNS-t, például DNS-próba vagy egy megfelelő expressziós rendszer alkalmazásával és screeneljük a kívánt polipeptid expressziójára, vagy

b) izoláljuk az mRNS-t a megfelelő Aspergillus-sejtekből, szelektáljuk a keresett mRNS-t, például DNShibridizációs próbával vagy egy megfelelő expressziós rendszerben történő expresszióval és screeneljük a kívánt polipeptid expressziójára, a kiválasztott mRNS-sel komplementer egyszálú, majd kettős szálú cDNS-másolatot készítünk, vagy

c) egy cDNS-könyvtárból izoláljuk a cDNS-t és szelektáljuk a kívánt cDNS-t DNS-próba vagy egy alkalmas expressziós rendszer segítségével és screeneljük a kívánt polipeptid expressziójára, vagy

d) in vitro szintetizáljuk az Aspergillus teljes DNSkészletét PCR-módszerrel oligonukleotid-primereket használva, mely készletet az A. niger pepC vagy A. niger pepD vagy egyéb ismert szubtilizin típusú szerinproteázt kódoló génből szerkesztünk, és

e) az a), b), c) vagy d) lépés szerint kapott kettős szálú DNS-t beépítjük egy alkalmas vektorba, ezzel transzformáljuk a megfelelő gazdasejtet, tenyésztjük a gazdasejtet és izoláljuk a DNS-t.

A genomot alkotó DNS-készletből az a) pont szerint nyerhetjük ki a kívánt DNS-molekulát. A genomiális DNS-t egy Aspergillus-szubtilizin kifejezésére képes törzsből izoláljuk, majd alkalmas restrikciós endonukleázokkal végzett emésztéssel és alkalmas vektorokba történő inkorpolálás útján elkészítjük a genomiális DNS-könyvtárat. Ezt a könyvtárat egy DNS-próbával vizsgáljuk végig, mint azt az alábbiakban lettjük, vagy alkalmas expressziós rendszerben kifejezzük, és a kapott polipeptideket screeneljük a szokásos módon.

A genomiális könyvtárat elkészíthetjük egy A. niger törzs (például NW756 vagy N400) genomiális DNS-ének parciális emésztésével (például Sau3AI vagy Mbol), és a nagy molekulatömegű DNS-ffagmens egy alkalmas vektorban (például E. coli plazmid-pUN121) vagy egy lambda-vektorban (például EMBL4) történő klónozásával.

Más gombatörzsek is szolgálhatnak a genomiális könyvtár számára fonásként, melyek a kívánt Aspergillus-szubtilizint termelik, így például az A. japonicus, A. oryzae, A. niduláns, A. niger, és más alkalmas vektorok, melyeket a fentiekben említettünk, melyek képesek a fragmensek befogadására.

A célból, hogy a genomiális könyvtárat sikeresen screeneljük az Aspergillus-szubtilizint kódoló DNSszekvenciára, szükség van hibridizáló DNS-próbára is. Ez lehet egy szintetikus DNS-próba, ha a kívánt Aspergillus-szubtilizin aminosavszekvenciája vagy annak egy része ismert, vagy egy másik szubtilizingén, például élesztőből vagy annak egy része, mely hibridizál az Aspergillus-szubtilizin-génhez.

A poliadenilezett mRNS-ek ismert módon a b) pont szerint izolálhatok a megfelelő sejtekből. Az izolálás történhet például oly módon, hogy a sejteket egy detergens és egy ribonukleázinhibitor (például heparin, guanidium-izocianát vagy merkapto-etanol) jelenlétében homogenizáljuk, az mRNS-t kloroform-fenol eleggyel, adott esetben só- és pufferoldatok, detergensek és/vagy kelátképző szerek jelenlétében extraháljuk, majd a vizes, sótartalmú fázisból az mRNS-t etanollal, izopropanollal vagy más alkohollal kicsapjuk. Az izolált mRNS-t tovább tisztíthatjuk centrifugálással céziumklorid-gradiensben, majd ezt követő etanolos kicsapással és/vagy kromatográfiás módszerekkel, például affinitáskromatográfiával, például oligo(dT)-cellulózon vagy oligo(U)-Sepharose-on. Az így tisztított mRNSkeveréket előnyösen méret szerint frakcionáljuk gradienscentrifugálással (például lineáris szacharózgradiensben) vagy kromatográfiával alkalmas méretű ffakcionálóoszlopokon (például agarózgéloszlopokon).

A kívánt mRNS-t kiválaszthatjuk közvetlenül egy DNS-próbával screenelve az mRNS-eket vagy alkalmas sejtekbe vagy sejtmentes rendszerekbe történő transzlációval és kapott polipeptidek screenelésével.

Előnyös, ha a kívánt mRNS-t egy DNS hibridizációs próba segítségével választjuk ki, mint azt az alábbiakban leírjuk, mert így elkerülhetjük a plusztranszlációs lépést. Alkalmas DNS-próbák lehetnek ismert nukleotidszekvenciájú DNS-ek, például szintetikus DNS-ek, cDNS-ek, melyek a kívánt polipeptidet kódoló mRNSből származnak, vagy genomiális DNS-ffagmensek, melyek tartalmaznak például szomszédos DNS-szekvenciákat, melyeket természetes forrásból vagy géntechnológiai úton előállított mikroorganizmusból izoláltunk.

A frakcionált mRNS transzlációja történhet sejtekben (például békapetesejtekben) vagy sejtmentes rendszerekben (például retikulocitalizátumban vagy búzacsíra-kivonatban). A kapott polipeptidek kiválasztása történhet enzimaktivitás alapján vagy a natív polipeptid ellen készített antitesttel, azaz immunológiai módszerekkel (például radioimmunoassay, enzimmel vagy fluoreszcens markerrel kapcsolt immunoassay). Az ilyen immunvizsgálatok, valamint a monoklonális és poliklonális antitestek előállítása jól ismert és a szokott módon végeztük azokat.

Az egyszálú, komplementer DNS (cDNS) előállítása a kiválasztott mRNS-templátról, valamint a kettős szálú

HU 219 809 Β

DNS preparálása az egyszálú DNS-ről, a szakember számára jól ismert. A mRNS-templátot inkubáljuk dezoxinukleozid-trifoszfátok, adott esetben radioaktívan jelzett dezoxinukleozid-trifoszfátok keverékével (mert így a reakció követhető), a primer szekvenciát, úgymint oligo-dT-maradékot hibridizáljuk az mRNS poli(A) részével egy alkalmas enzim, úgymint reverz transzkriptáz jelenlétében, mely például a mieloblasztvírusból (AMV) származik. A templát-mRNS-t például lúgos hidrolízissel lebontjuk, a cDNS-t dezoxinukleotid-trifoszfátok elegyével inkubáljuk, és egy megfelelő enzimmel kettős szálú DNS-t szintetizálunk. Alkalmas enzimek erre a célra például a reverz transzkriptáz, a Klenowfragmens az E. coli DNS-polimerázból vagy a T4 DNSpolimeráz. A hajtűhurok-struktúra általában spontán képződik az egyszálú DNS-ek esetében, mikor azok primerként hatnak a kétszálú DNS-ek szintézisében. Ezt a hajtűhurok-szerkezetet SÍ nukleázzal történő emésztéssel akadályozhatjuk meg. Eljárhatunk úgy is, hogy az mRNS-templát hidrolízise előtt először kialakítunk egy homopolimer dezoxinukleotid-„farkat” az egyszálú DNS 3’-végén és ezt követően szintetizáljuk a második cDNS-szálat.

Ha a c) pont szerint járunk el, akkor egy kettős szálú cDNS-t izolálunk egy cDNS-könyvtárból és vizsgáljuk a kívánt DNS-re. A cDNS-könyvtárat úgy készítjük, hogy az mRNS-t izoláljuk a megfelelő sejtekből, és erről elkészítjük az egyszálú és kettős szálú cDNS-eket, amint azt a fentiekben leírtuk. Ezt a cDNS-t alkalmas restrikciós endonukleázzal emésztjük és beépítjük egy lambda-fágba (például lambda-charon-4A vagy lambdagtll) ismert eljárások szerint. Nitro-cellulóz-membránon végzett szaporítás után a cDNS-könyvtárat átvizsgáljuk egy DNS-próbával, ahogy azt az előzőkben leírtuk, vagy kifejezzük egy expressziós rendszerben, és a kapott polipeptidet screeneljük specifikus antitestreakcióval a kívánt vegyületre.

A d) pontban leírt eljárás szerint a kettős szálú DNS-t PCR-technika segítségével készítjük el. Ez a módszer különösen alkalmas nagy mennyiségű DNS preparálására legalább részben ismert szekvenciájú, kis mennyiségű DNS-ből vagy RNS-ből. De egy ismert szekvenciájú DNS-inszert - mely szomszédos ismert vektorszekvenciákkal - is használható kiindulási anyagként. A PCR-technikában a DNS-molekulákat, például oligonukleotidokat, használjuk primerként a DNS enzimatikus templátfüggő szintézisében. Nagy mennyiség készíthető, mert a kettős szálú DNS denaturálódása, hibridizálása a primerekkel és az enzimatikus szintézis szekvenciálisán ismételhető. A szintetizált DNS-molekulák száma exponenciálisan növekszik, mert az megkettőződik minden körben. A PCR-technika a szakember számára ismert, és a szokásos módon alkalmazzuk a jelen találmányban. Az oligonukleotid-primert jelölhetjük a DNS-sel való hibridizációhoz, hogy kódolni lehessen a konzervált szubtilizin típusú szerinproteáz fehérjeszekvenciákat összehasonlítva az ismert szubtilizin típusú szerinproteázokkal. A PCR-technika jól ismert a szakterületen és a konvencionális PCR-technikákat alkalmazzuk a jelen találmányban [például M. A. Innis et al. (eds.): PCR protocols. A guide to methods and applications. Academic Press, San Diego (1990)].

A kettős szálú cDNS vagy a genomiális DNS beépítésére egy megfelelő vektorba [e) lépés] számos módszer áll rendelkezésünkre. így például komplementer, homopolimer végeket adunk hozzá a kettős szálú és a vektor-DNS-hez a megfelelő dezoxinukleotid-trifoszfátok és egy enzim, úgymint terminális dezoxinukleotidil-transzferáz jelenlétében történő inkubálással. A vektort és a kettős szálú DNS-t összekapcsoljuk bázispáronként a komplementer homopolimer farkak között, és végül ligáljuk specifikus kapcsolóenzimekkel, úgymint ligázokkal. Egyéb lehetőségek is vannak a kettős szálú DNS terminálisához a szintetikus linkerek hozzákapcsolására, vagy a kettős szálú DNS beépítésére a vektorba a tompa vagy ragadós végek ligálásával. Az alkalmas vektorokat részletesen az alábbiakban tárgyaljuk.

A transzformálóeljárások az alkalmas gazdasejtek transzformálására a kapott hibrid vektorral, és a transzformáit gazdasejtek szelektálása és szaporítása a szakember számára ismertek. Néhányat közülük az alábbiakban ismertetünk.

A találmány szerinti DNS, valamint mutánsainak és fragmenseinek izolálását ismert módszerekkel végezzük, például fenolos és/vagy kloroformos extrakcióval. Adott esetben a DNS-t tovább manipulálhatjuk, például mutagén szerekkel kezelve mutánsokat kapunk, vagy restrikciós enzimekkel emésztve ffagmenseket kapunk, módosíthatjuk mindkét terminálist a vektorba történő beépítés megkönnyítésére, eltávolíthatjuk a közbenső szekvenciákat és ehhez hasonlók.

A találmány szerinti DNS szekvenciáját önmagában ismert módszerekkel határozhatjuk meg, például Maxam-Gilbert módszere szerint végjelzett DNS-t használva vagy Sanger módszere szerint a didezoxilánc végződésével.

A találmány szerinti Aspergillus-szubtilizin-génszekvenciák in vitro szintézissel is előállíthatok a szokásos módszerekkel.

Az in vitro szintézis különösen jól használható az Aspergillus-szubtilizin-gén kisebb fragmenseinek előállítására, melyek az Aspergillus-szubtilizin szerinproteáz-aktivitású fragmenseit kódolják. Az in vitro szintézis tehát különösen felhasználható a promotert és a szignálpeptidet kódoló DNS-ek szintézisére. Az in vitro szintézist előnyösen az A. nigerből származó Aspergillusszubtilizin-génhez vagy fragmenseihez alkalmazzuk, legelőnyösebben a SEQID NO. 1-ben látható pepC gén vagy annak promoter- vagy szignálszekvenciájához, vagy a SEQ ID NO. 6-ban látható pepD gén vagy annak promoter- vagy szignálszekvenciájához.

A DNS-szintézis módszereit S. A. Narang foglalta össze [Tetrahedron 39, 3 (1983)]. Az ismert szintézistechnikák 120 bázis hosszúságig teszik lehetővé a polinukleotid szintézisét jó termeléssel, nagy tisztaságban és viszonylag rövid idő alatt. Megfelelően védett nukleotidokat kapcsoltak egymással foszfodiésztermódszerrel [K. L. Agarwal et al.: Angew. Chemie 84, 489 (1972)], a nagyobb hatékonyságú foszfotriésztermódszerrel [R. L. Letsinger et al.: J. Am. Chem. Soc. 98,

HU 219 809 Β

3655 (1976)] vagy foszforamidátmódszerrel [S. L. Beaucage és Μ. H. Carruthers: Tetrahedron 22, 1859 (1981)]. Az oligonukleotidok és polinukleotidok szintézisének egyszerűsítését a szilárd fázisú módszer teszi lehetővé, amelyben a nukleotidláncokat egy alkalmas polimerhez kötik. Az aktuális kettős szálú DNS-t enzimatikusan képezik a kémiai úton előállított átlapolónukleotidokból mindkét DNS-szálból, amelyeket összetart a bázispárok korrekt elrendeződése, és amelyeket aztán kémiailag, a DNS-ligázzal kapcsolnak össze. Egy másik lehetőség szerint a két DNS-szálból az átlapoló egyes oligonukleotidokat inkubálják a négy szükséges oligonukleotid jelenlétében DNS-polimerázzal, például DNS-polimeráz I-gyel, a polimeráz I vagy T4 DNSpolimeráz Klenow-ffagmensével, vagy AMV (majommieloblasztvírus) reverz transzkriptázzal. A két oligonukleotid így korrekt elrendezésben van a bázispárok által, és kiegészül a kívánt nukleotidokkal enzim segítségével a komplett kettős szálú DNS-sé [S. A. Narang et al.: Anal. Biochem. 121, 356 (1982)].

A találmány szerinti eljárásban egyéb fajok (például élesztő) szubtilizingénjét vagy annnak fragmensét használhatjuk próbaként egy Aspergillus-faj (például A. niger) identifikálására, az RNS-frakcióban a szubtilizin mRNS- vagy a genomiális vagy cDNS-könyvtárban egy szubtilizin-DNS azonosítására. Az A. niger gén primer szekvenciájából és a proteázt kódoló régió más proteázokkal történő összehasonlításából arra lehet következtetni, hogy ez a gén a szubtilizingének családjával rokon. A kapott gének felhasználhatók rekombináns proteázok termelésére, mint azt az alábbiakban részletezzük.

A szintetikus DNS-próbákat ismert módszerek szerint szintetizálhatjuk (lásd alább), előnyösen stepwise (lépésenkénti) kondenzációval szilárd fázisú módszerrel foszfotriészter-, foszfit-triészter- vagy foszfor-amidátos módszerrel, például dinukleotidok kondenzációjával, az egységeket foszfotriésztermódszerrel összekapcsolva. Ezeket a módszereket adaptálhatjuk a kívánt oligonukleotidok keverékeinek szintéziséhez felhasználva két, három vagy négy nukleotidot (dA, dC, dG és/vagy dT) védett formában vagy megfelelő dinukleotidokat, kapcsolva az egységeket kondenzációs lépésben Y. Ike és munkatársai szerint [Nucleic Acids Research 11,477 (1983)].

A hibridizációhoz a DNS-próbákat radioaktívan jelöljük, például kinázrakcióval. A méret szerint frakcionált mRNS hibridizációt ajelölt DNS-próbákkal ismert módon végezzük, azaz segédanyagot tartalmazó puffer- és sóoldatban (például kalcium-kelátképzők, viszkozitásszabályozó vegyületek, fehérjék, nem homológ DNS és hasonlók) a szelektív hibridizációnak kedvező hőmérsékleten, például 0 °C és 80 °C között, 25 és 50 °C között vagy 65 °C körül, előnyösen 20 °C körül vagy alacsonyabban, mint a hibrid kettős szálú DNS olvadási hőmérséklete.

Transzformált gazdaszervezetek és előállításuk

A találmány tárgyához tartoznak továbbá a találmány szerinti hibrid vagy expressziós vektorral transzformáit gazdaszervezetek (-sejtek) is, előnyösen a találmány szerinti Aspergillus-szubtilizin előnyös formáit kódoló gazdasejtek.

A találmány szerinti rekombináns DNS-molekulák sokszorozására különösen előnyös gazdaszervezetek az olyan mikroorganizmusok, amelyekben nincs vagy csak kevés restrikciós vagy más, a DNS-molekulákat módosítani képes enzim van. Ilyenek különösen az Escherichia coli különböző törzsei (X1766, Y1090, W3110, HB1O1/LM1O35, JA221, DH5alfa, előnyösen a DH5alfaF, JM109, MH1 vagy HB101, vagy a K12 törzs), más prokarióta sejtek (például Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus és mások) és élesztők (például Saccharomyces cerevisiae, úgymint S. cerevisiae GRF 18).

Használhatók továbbá magasabb rendű szervezetek sejtjei, különösen folytonosan szaporodó emberi vagy állati sejtvonalak is, mint amilyenek az L132 emberi embriótüdőfibroblaszt-sejtek, az emberi malignus melanoma Bowes-sejtjei, a Hela-sejtek, az afrikai zöld majom SV40 vírussal transzformált COS-7 vesesejtjei vagy az aranyhörcsög petefészeksejtjei (CHO).

A találmány szerinti Aspergillus-szubtilizin-gén expressziójára alkalmasak a fent említett sejtek transzformálva egy megfelelő vektorral, ezeken kívül a rovarsejtek transzformálva egy Baculovirus expressziós vektorral, és különösképpen a fonalas gombák, például Penicillium-, Cephalosporium- vagy előnyösen az Aspergillus-fajok, így az A. carbonarius, A. awamori, A. nidulans, A. oryzae vagy még előnyösebben az A. niger, egy alkalmas expressziós vektorral transzformálva.

A találmány tárgyához tartozik az említett transzformánsok létrehozásának eljárása is, amely magában foglalja a gazdasejtek kezelését a transzformációt elősegítő körülmények között a találmány szerinti DNS-molekulákkal vagy hibrid vektorokkal, amelyek adott esetben egy szelekciós markergént is hordoznak, valamint a létrejött transzformánsok szelekcióját. Az Aspergillusszubtilizin-gént tehát megkaphatjuk úgy, hogy transzformációval a gazdasejt genomjába integráljuk, különösen eukarióta sejtekbe, például Aspergillus-fajokat használva gazdaként.

A mikroorganizmusok transzformációját az irodalomban leírt, szokásos módszerekkel végezhetjük el: a Saccharomyces cerevisiae transzformálására A. Hinnen és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)], a Bacillus subtilis transzformálására Anagnostopoulos és munkatársai (J. Bacteriol. 81, 741 (1961)], az E. coli transzformálásra M. Mandel és munkatársai [J. Mól. Bioi. 53, 159 (1970)] és az Aspergillus transzformálására F. Buxton és munkatársai [Gene, 37, 207-14 (1985)] és D. J. Balance és munkatársai [Biochem. Biophys. Rés. Commun. 112, 284-9 (1983)] adnak útmutatást.

Ennek megfelelően az E. coli transzformálása például úgy történhet, hogy a sejteket előkezeljük kalciumionokkal a DNS felvételének elősegítésére, majd inkubáljuk a hibrid vektorral. Ezt követi a transzformált sejtek kiválogatása, amit például szelektív táptalajok segítségével végezhetünk, amelyeken a transzformált sejtek a szülősejtektől a vektor-DNS markerszekvenciájának

HU 219 809 Β természete alapján szeparálhatók. Előnyösen olyan táptalajt is használhatunk, amelyeken a hibrid vektort nem tartalmazó sejtek képtelenek a növekedésre.

A gombák, így az élesztő- vagy az Aspergillusfajok transzformálása során először a sejtfalat kell eltávolítani glükozidázenzimekkel, majd az így kapott szferoplasztokat polietilénglikol és kalciumionok jelenlétében kezeljük a hibrid vektorral, és végül regeneráljuk a sejtfalat a szferoplasztok agarba történő beágyazásával. Előnyösen a regenerálóagart úgy készítjük, hogy a transzformált sejtek regenerálása és szelektálása egyidejűleg végbemenjen.

A magasabb rendű eukarióta szervezetek sejtjeinek, így az emlőssejtvonalaknak a transzformálása, célszerűen transzfekcióval történhet. A transzfekciót hagyományos technikával végezhetjük, például kalcium-foszfátos precipitációval, mikroinjekcióval, protoplasztfúzióval, elektroporációval (a DNS-nek rövid, a sejtmembránt átmenetileg fellazító elektromos impulzusokkal történő bejuttatásával) vagy segítővegyületekkel, például dietil-amino-etil-dextránnal, dimetil-szulfoxiddal, glicerinnel vagy polietilénglikollal. A transzfekció után a transzformált sejteket azonosítjuk és szelektáljuk egy, az adott markertől függően megválasztott táptalajon, például a Dulbecco által módosított táptalajon (DMEM), minimáltáptalajon, RPMI 1640 táptalajon való tenyésztéssel, amelyek a megfelelő antibiotikumot tartalmazzák.

A transzformált gazdasejteket ismert módon, asszimilálható szénforrást, például szénhidrátokat (glükózt vagy laktózt), nitrogénforrást, például aminosavakat, peptideket, fehéijéket vagy ezek lebontásával kapott termékeket (peptonokat, ammóniumsókat stb.) és különböző ásványi sókat, például nátrium-, kálium-, magnézium- és kalcium-szulfátot, -foszfátot és/vagy -karbonátot tartalmazó tápfolyadékban tenyészthetjük. A tápfolyadék tartalmazhat szaporodásserkentő anyagokat, például nyomelemeket (vas, cink, mangán és hasonlók) is.

A tápközeget úgy választjuk meg, hogy gátolja a nem transzformálódott vagy a hibrid vektort elvesztett sejtek szaporodását. Ezt úgy valósíthatjuk meg a markerként antibiotikumrezisztenciát tartalmazó hibrid vektorok esetében, hogy a tápközeghez antibiotikumot adunk. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy auxotróf gazdasejtet választunk egy esszenciális aminosavra és olyan hibrid vektorral transzformáljuk, amely tartalmazza a hiányzó enzimet kódoló gént, ilyenkor a minimáltápközegből kihagyjuk a nevezett aminosavat, amely nélkül a nem transzformált sejtek képtelenek a szaporodásra, és ezen tenyésztünk.

A magasabb rendű szervezetek sejtjei, például az emlőssejtek, a szövettenyésztés ismert módszereivel, például a fent említett tápközegekben (DMEM, minimál, RPMI 1640) tenyészthetők, adott esetben kiegészítve szaporodásserkentő anyagokkal és/vagy emlősszérummal. A tenyésztés technikája is jól ismert: történhet homogén szuszpenziós tenyészetben (például levegőztetett vagy folyamatosan kevert reaktorban) vagy immobilizált, illetve beágyazott sejttenyészetekben (például üreges rostok, mikrokapszulák, agarózmikroágy, porózus üveggyöngyágy, kerámiahordozók vagy egyéb mikrohordozókon).

A tenyésztés körülményeivel ismert módon befolyásolhatjuk az eljárás eredményességét, ezért a hőmérsékletet, a pH-t és a tenyésztés időtartamát úgy választjuk meg, hogy a találmány szerinti polipeptidet vagy származékát az elérhető maximális mennyiségben kapjuk, így az E. coli vagy élesztőtörzseket célszerűen aerob körülmények között, rázott vagy kevert süllyesztett kultúrában, 20-40 °C közötti, előnyösen 30 °C körüli hőmérsékleten, 4-8 közötti, előnyösen 7 körüli pH-értéken, 4-30 órán át, előnyösen a kívánt termék maximális koncentrációjának eléréséig tenyésztjük.

Annak érdekében, hogy a transzformálódott sejteket kiválaszthassuk a nem transzformálódottak közül, vagy a találmány szerinti DNS-molekulának kell egy szelekciós markert hordoznia, vagy a sejteket egyidejűleg egy másik, a szelekciós markert hordozó vektorral is transzformálni kell (kotranszformáció). Mint az előbbi esetekben, a szelekciós marker itt is egy kifejeződni képes struktúrgén lehet, melynek polipeptidterméke (általában egy enzim) megvédi a befogadósejtet a toxikus anyagokkal szemben vagy kiegészíti a mutáns enzimrendszerét a hiányzó esszenciális polipeptiddel. A transzformált fonalasgomba-sejtek szelektálására előnyösen alkalmazható markerek az ismert ga-2, pyrG, pyr4, trpC, amdS vagy argB gének.

A 0 278 355 európai közrebocsátási iratban leírtak szerint izoláltuk a pyrA-nak nevezett markergént az A. niger genomiális könyvtárából, amely igen hasonlít az A. nidulansból izolált pyrG és az N. crassaból izolált pyr4 markergénekhez és hasonló funkcióval rendelkezik, nevezetesen az orotidin-5’-foszfát-dekarboxiláz-enzimet termeli. Ez az enzim katalizálja az orotidin-5’-foszfát dekarboxilezését uridilsavvá (uridin-5’foszfát) és képes a fluor-orotsavat is átalakítani a toxikus fluor-uridinné. Azonban bármely pyr gént, mely az orotidin-5’-foszfátot kódolja, használhatjuk. Egy pozitív kiónból, az E. coli BJ5183/pCG59D7-ből (DSM 3968) izoláltuk a PCG59D7 plazmidot - amely a pyrA gént hordozza - és kotranszformáltuk vele az A. niger pyrA-mutánst. Az ilyen mutáns az orotidin-5-foszfátdekarboxiláz-génnel nem rendelkezik és így képtelen a megfelelő enzim termelésére. Az ilyen mutánsokat úgy hoztuk létre, hogy az A. niger N756 konidiospóráit mutagén UV sugárzással kezeltük, majd izoláltuk azokat a telepeket, amelyek fluor-orotsav és uridin jelenlétében fejlődtek ki. Ezeket tovább szelektálva kizártuk a fluor-orotsav jelenlétében, de uridin hiányában is fejlődőképes telepeket, majd az így kapott uridinigényes mutánsokat transzformáltuk és két csoportba soroltuk annak alapján, hogy a pyrA vagy pyrB gén hiányzik-e belőlük. A két csoportot az An8 és AnlO mutánsok képviselik. Ezeket protoplaszt formába hoztuk és transzformáltuk a pyrA gént hordozó pCG59D7 (DSM 3968) plazmiddal. Ennek során csak az An8 (DSM 3917) típusú telepek transzformálódtak, amelyekben a pyrA gén megjelenését az emésztett DNS-nek a pUN 121 plazmidból származó DNS-sel való hibridizációs képessége igazolta.

HU 219 809 Β

Aspergillus-szubtilizin előállítása

A találmány tárgyához tartozik az Aspergillus-szubtilizin előállítására szolgáló eljárás, célszerűen annak előnyös formáiban, amely magában foglalja a találmány szerinti expressziós vektorral transzformált gazdasejt tenyésztését az Aspergillus-szubtilizin-gén kifejeződésére alkalmas körülmények között. Kívánt esetben a polipeptidet izoláljuk a szokásos módon. Az expressziós vektor szerkezetétől függően az Aspergillus-szubtilizin vagy csak termelődik, vagy - ha a szignálszekvencia is jelen van - termelődik és kiválasztódik.

Hogy a szelektált gazdaszervezet alkalmas-e az expresszióra vagy nem, az főként a regulátorszekvenciáktól függ, melyeket az expressziós vektor megszerkesztéséhez kiválasztottunk, különösen a promotertől.

így például, ha a találmány szerinti Aspergillus-szubtilizin-gén promotere egy Aspergillusból, előnyösen A. nigerből származik, akkor egy Aspergillus törzs, célszerűen A. niger az alkalmas gazdaszervezet. Ha azonban a promoter nem a találmány szerinti expressziós vektor megkonstruálására használt Aspergillus-génből származik, akkor más gazdaszervezetek is alkalmasak az expresszióra, így baktériumok, mint az E. coli vagy élesztők, mint az S. cerevisiae. A találmány szerinti polipeptidek előállítására alkalmas gazdaszervezetek és promoterek azonosak a transzformálásnál a fentiekben megadottakkal.

A találmány különösen egy olyan eljárásra vonatkozik, amelyben a transzformált Aspergillus-gazdasejt az exogén Aspergillus-szubtilizin-gént fejezi ki olyan körülmények között, melyekben az endogén Aspergillusszubtilizin-gének aktívak, és így a természetes mennyiségű Aspergillus-szubtilizinnél nagyobb mennyiség fejeződik ki a megnövekedett géndózis által. Erre a célra egy Aspergillus-gazdasejtet, különösen A. nigeri transzformálunk egy Aspergillus-szubtilizin-gént tartalmazó expressziós vektorral, mely a homológ, azaz a természetesen kapcsolódó, expressziós kontrollszekvenciák, így a promoter- és szignálszekvencia kontrollja alatt áll.

A találmány továbbá olyan eljárásra is vonatkozik, melyben a transzformált Aspergillus-gazdasejt az exogén Aspergillus-szubtilizint fejezi ki magasabb szinten vagy az endogén génétől eltérő körülmények között, mert azt más promoterhez fuzionáltuk.

Az exogén gén vagy gének maximális expressziójának feltételei a kiválasztott expressziós rendszertől függnek. így például, ha az A. niger pektinliáz (PL) vagy poligalakturonáz (PG) génjének promoterét használjuk, kapcsolva a génhez, az Aspergillus-szubtilizingén expressziója indukálódik az A. niger sejtben, ha pektint vagy pektinlebontási termékeket adunk a tápközeghez. Elegendő glükóz jelenlétében azonban a promoter nem indukálóképes, ha egy A. niger törzset, például az An8 jelű (DSM 3917) törzset használjuk. Ez azt jelenti, hogy az Aspergillus-szubtilizin-gén egy A. niger PL vagy PG promoter kontrollja alatt „katabolite el van nyomva” A. nigerben. Ha azonban egy másik Aspergillus törzset használunk, előnyösen A. oryzaet vagy még előnyösebben A. nidulanst, akkor az A. niger PL vagy PG promotere alatt álló Aspergillus-szubtilizingén lényegében kifejeződik, azaz pektin távollétében és/vagy glükóz jelenlétében. Ezért tehát előnyös ezen promoterek kontrollja alatt álló Aspergillus-szubtilizingént egy A. nigertől eltérő gazdasejtben, előnyösen A. oryzaeben, még előnyösebben A. nidulansban kifejezni, mert például pektin helyett glükózt adhatunk a gén expressziója során energia- és szénforrásként a tápközeghez.

Ha egy Aspergillust, előnyösen A. niger piruvátkináz promotert használunk az Aspergillus-szubtilizin gén expressziójához, a gén kifejeződik, ha minimáltápközeget glükózzal, mint energia- és szénforrással, alkalmazunk.

Az Aspergillus-szubtilizin túltermelésére (overexpress) különböző módszereket lehet alkalmazni. A tisztított egyes Aspergillus-szubtilizineket elő lehet állítani olyan módszerrel, melyben egy alkalmas gazdaszervezetet, amely nem képes az Aspergillus-szubtilizin kifejezésére vagy csak igen kis mennyiségben, vagy nem fejezi ki az Aspergillus-szubtilizint az exogén Aspergillus-szubtilizin-gén kifejezésére használt indukálófeltételek alatt, transzformálunk egy Aspergillus-szubtilizint, előnyösen A. nigerből származót, legelőnyösebben a SEQID NO. 1-ben bemutatott PEPC-szekvenciát kódoló struktúrgént vagy egy Aspergillus-szubtilizin szerinproteáz-aktivitású ffagmenst kódoló gént hordozó hibrid vektorral, és a nevezett struktúrgént kifejezzük. Ha az alkalmazott gazdaszervezet nem képes semmilyen Aspergillus-szubtilizin kifejezésére, akkor az illető egyetlen Aspergillus-szubtilizint megkaphatjuk tiszta formában, ami azt jelenti, hogy nem szennyezi semmilyen más Aspergillus-szubtilizin.

Egy gazdaszervezet nem képes semmilyen Aspergillus-szubtilizin kifejezésére, ha a mikroorganizmusnak nincs a megfelelő génje, vagy az Aspergillus törzs endogén Aspergillus-szubtilizin-génjeinek expressziója el van nyomva egy megfelelően kondicionált növesztőközegben, míg az exogén Aspergillus-szubtilizin promoter, mely operatív módon van kapcsolva a kívánt Aspergillus-szubtilizin struktúrgénhez, például egy A. nigerből származó promoter, ilyen feltételek alatt aktív, vagy ahol az Aspergillus-szubtilizin-gént fuzionáltuk egy másik promoterhez.

Más promoterek és törzsek is alkalmasak az Aspergillus-szubtilizin előállítására, melyeket az expressziós vektorok leírásánál megadtunk.

Aspergillus-szubtilizin és felhasználása

A találmány továbbá egy szubtilizin típusú, tiszta Aspergillus szerinproteázra vonatkozik, melyet „Aspergillus-szubtilizin”-nek nevezünk. Ez a proteáz (a) egy Aspergillus sp.-ből származik, (b) proteázaktivitással rendelkezik az aktív centrumban lévő katalitikus szerinmaradék révén, és (c) a megfelelő aminosavszekvenciája homológ az ismert szerinproteázokéval, melyek a szubtilizincsaládba tartoznak. Az Aspergillus-szubtilizin megjelölés alatt ezen enzim fragmenseit is értjük, melyek még szerinproteáz-aktivitással rendelkeznek.

A találmány előnyösen az A. niger tiszta Aspergillus-szubtilizinjére vonatkozik, különösen a szerinproteáz PEPC-re, melynek aminosavszekvenciája a SEQ

HU 219 809 Β

ID NO. 1-ben látható, vagy a szerinproteáz PEPD-re, melynek aminosavszekvenciája a SEQ ID NO. 6-ban látható, és ezek fragmenseire, valamint mutánsaira, melyek még szerinproteáz-aktivitással bírnak.

A találmány továbbá enzimkompozíciókra vonatkozik, melyek egy vagy több Aspergillus-szubtilizint és/vagy annak szerinproteáz-aktivitású származékát és/vagy biológiailag elfogadható sóját tartalmazzák adott esetben előre meghatározott kombinációban egy vagy több alkalmas enzimmel, melyek aktivitása az Aspergillus-szubtilizinétől eltér.

Aspergillus-szubtilizin-hiányos Aspergillus törzs

A találmány vonatkozik a mutált Aspergillus törzsre is, előnyösen a mutált A. niger törzsre, melyből az endogén Aspergillus-szubtilizin-gén hiányzik. Előnyös az az A. niger törzs, amely pepC génben (SEQ ID NO. 1.) hiányos vagy a pepD génben (SEQ ID NO. 6.). Előnyös az az A. niger törzs is, mely mindkét génben, pepC és pepD, hiányos.

A találmány szerinti mutált Aspergillus törzset, melyből hiányzik az Aspergillus-szubtilizin-gén, célszerűen előállíthatjuk géndiszrupcióval, azaz az endogén Aspergillus-génnek megfelelő DNS-szekvencia törlésével in vitro mutációval, majd Aspergillus-gazdasejtbe történő transzformációval. A homológ rekombináció lejátszódása során a sejtben az intakt endogén gén helyettesítődik a hiányos exogén gén által. Rendszerint az exogén gén törlődik a markergénnek a kódolórégióba történő beépítése során. Ez egy hiánygénhez vezet, amely könnyen megfigyelhető és felhasználható a transzformánsok szelektálására a megfelelő diszruptált endogén génnel. Más módszerek is alkalmazhatók azonban mutációra, hogy a mutált Aspergillus törzset, előnyösen a mutált A. nigeri előállítsuk, amelyben az endogén Aspergillus-szubtilizingént mutáltuk oly módon, hogy semmilyen funkcionális Aspergillus-szubtilizin ne fejeződjön ki.

A találmány szerinti eljárás legelőnyösebb kivitelezése szerint egy A. niger törzset transzformálunk egy hibrid vektorral, amely a pepC gén (lásd SEQ ID NO. 1.) hiánymutánsát tartalmazza, például a diszruptált pepC gént, amelybe egy szelekciós markergént inszertáltunk, például az alábbi példákban leírt pPEPCPYRA plazmádban, és a transzformánsokat szelektáljuk.

A találmány szerinti eljárás másik legelőnyösebb kivitelezése szerint egy A. niger törzset olyan hibrid vektorral transzformálunk, amely a pepD gén (lásd SEQ ID NO. 6.) hiánymutánsát tartalmazza, például a diszruptált pepD gént, amelybe egy szelekciós markert építettünk be, például az alábbi példákban leírt pPEPDPYRA plazmidban, és a transzformánsokat szelektáljuk.

A harmadik legelőnyösebb kiviteli mód szerint egy A. niger törzset a pepC gén (SEQ ID NO. 1.) hiánymutánsával, például egy szelekciós markergént hordozó diszruptált génnel, amelyet az alábbi példákban leírt pPEPCPYRA plazmid tartalmaz, transzformálunk, és a pepD gén hiánymutánsával (SEQ ID NO. 6.), például egy szelekciós markergént hordozó diszruptált génnel, amelyet az alábbi példákban leírt pPEPDPYRA plazmid tartalmaz, és mind a pepC mind a pepD génben hiányos mutánsokat szelektáljuk.

A találmány szerinti mutált Aspergillus törzs, melyből hiányzik az Aspergillus-szubtilizin-gén, felhasználható heterológ vagy homológ fehéijék fokozott kifejezésére mind intra-, mind extracellulárisan.

A heterológ vagy homológ fehérjék expressziója Aspergillus sp.-ben a szokásos módszerekkel kivitelezhető. Rendszerint egy expressziós vektort szerkesztünk, amely tartalmazza a homológ vagy heterológ gént működőképesen kapcsolva az Aspergillusban funkcionáló homológ vagy heterológ promoterrel és adott esetben egyéb - Aspergillusban funkcionáló - expressziós kontrollszekvenciákat, például azokat, amelyeket a fentiekben definiáltunk. Kívánt esetben a polipeptidet izoláljuk ismert módon. Az expressziós vektor megszerkesztése függ attól, hogy a termékek a gazdasejtben termelődnek-e vagy - ha szignálszekvencia is jelen van - a gazdasejtben termelődnek és kiválasztódnak.

Struktúrgénekként szóba jöhetnek például vírusokból, prokarióta sejtekből és eukarióta sejtekből származó struktúrgének, vagy amelyek genomiális DNS-ből vagy cDNS-ből származnak mRNS úton előállítva, vagy amelyeket kémiai úton szintetizáltunk és a felhasználható polipeptidek széles skáláját kódolják, többek között a glükozilált polipeptideket, különösen a magasabb rendű eukarióták, így emlősök és különösen az emberi szervezet polipeptidjeit, úgymint enzimeket, melyek felhasználhatók például tápanyagok termelésére és a kémiában enzimes reakciók kivitelezésére, vagy polipeptideket, amelyek felhasználhatók és értékesek az emberi és állati betegségek kezelésében vagy megelőzésében, például hormonok, antitestek, vírusantigének, vakcinák, véralvadási faktorok, élelmiszerek és hasonlók.

Ilyen struktúrgének lehetnek például azok, melyek a következő polipeptideket kódolják: Aspergillus-poligalakturonáz (PGI vagy PGII), Aspergillus-pektinliáz (PLI, PLA, PLB, PLC, PLE és PLF), hormonok, úgymint szekretin, timozin, relaxin, kalcitonin, luteinizáló hormon, paratiroid hormon, adrenokortikotropin, melanocitastimuláló hormon, béta-lipotropin, urogasztron vagy inzulin, növekedési faktor, úgymint epidermális növekedési faktor, inzulinszerű növekedési faktor (IGF, például IGF-I és IGF-II), hízósejt-növekedési faktor, idegnövekedési faktor; glia-ból származó idegsejt-növekedési faktor, vagy transzformáló növekedési faktor (TGF), úgymint TGF-béta, növekedési hormonok, úgymint humán vagy szarvasmarha-növekedési hormonok, interleukin, így interleukin-1 vagy -2, humán makrofágmigrációt gátló faktor (MIF), interferonok, úgymint humán alfa-interferon, például interferon-alfaA, -alfaB, -alfaD vagy -alfaF, béta-interferon, gamma-interferon vagy egy hibrid interferon, például egy alfaA-alfaD- vagy egy alfaB-alfaD-hibrid interferon, különösen a BDBB hibrid interferon, proteinázinhibitorok, úgymint alfal-antitripszin, SLPI és hepatitis vírusantigének, úgymint hepatitis B vírus felületi és core antigén vagy hepatitis A vírusantigén, vagy hepatitis nem A-nem B antigén, plazminogén-aktivátorok, úgymint szöveti plazminogén-aktivátor vagy urokináz, tumomekrózis faktor, szomatosztatin, renin, béta-endorfin, immunglobulinok, úgymint a D-, E- vagy G-im11

HU 219 809 Β munglobulin könnyű- és/vagy nehézláncai, vagy humán-egér hibrid immunglobulinok, immunglobulint kötő faktorok, úgymint immunglobulin E-t kötő faktor, kalcitonin, humán kalcitoninszerű peptid, véralvadási faktorok, úgymint IX vagy VIIIc faktor, eritropoietin, eglin, úgymint eglin C, hirudin, deszulfato-hirudin, úgymint deszulfato-hirudin HV1, HV2 vagy PA, humán szuperoxid-diszmutáz, vírusos timidinkináz, béta-laktamáz, glükózizomeráz. Előnyösek a humán alfa-interferont vagy hibrid interferont kódoló gének, különösen a BDBB hibrid interferont, a humán szöveti plazminogén-aktivátort (t-PA), a hepatitis B vírus felületi antigént (HBVsAg), az inzulinszerű növekedési faktor I-et és ΙΙ-t, az eglin C-t és a deszulfato-hirudint, különösen a HVl-variánst kódoló gének.

A találmány legelőnyösebb megvalósítási lehetőségeit a példákban mutatjuk be.

A példákban a következő rövidítéseket használjuk:

BSA	marha-szérumalbumin
DTT	ditiotreitol
EDTA	dinátrium-etilén-diamin-tetraacetát
IPTG	izopropil-béta-D-galaktopiranozid
kbp	kilobázispár
PEG	polietilénglikol
SDS	nátrium-dodecil-szulfát
Tris	trisz(hidroxi-metil)-amino-metán
X-gal	5-bróm-4-klór-3-indolil-béta-galaktozidáz
Pufferek, tápközegek, reagensek
SM	100 mM NaCl, 8,1 mM MgSO4, 50 mM Tris-HCl (pH=7,5), 0,01% zselatin
LB	1% triptikázpepton (BBL), 0,5% élesztőkivonat (BBL), 1% NaCl, 0,5 mM Tris-HCl (pH=7,5)
LM	1% triptikázpepton (BBL), 0,5% élesztőkivonat (BBL), 10 mM NaCl, 10 mM MgCl
SSC	0,15 mM NaCl, 0,015 M trinátrium-citrát
PBS	10 mM Tris-HCl (pH=7,6), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl
TE	10 mM Tris-HCl (pH=8,0), 0,1 mM EDTA (pH=8,0)

minimáltápközeg: 1 1 tápközegben 1,5 g KH₂PO₄, 0,5 g KC1, 0,5 g MgSO₄.7 H₂O, 0,9 mg ZnSO₄.7 H₂O, 0,2 mg MnCl₂.4 H₂O, 0,06 mg CoC1₂.6 H₂O, 0,06 mg CuSO₄.5 H₂O, 0,29 mg CaCl₂.6 H₂O, 0,2 mg FeSO₄.7 H₂O, nitrogén- és szénforrás változó (megadva a szövegben) vagy 6 g NaNO₃ és 10 g glükóz van, pH=6,0 (NaOHdal beállítva) komplett tápközeg: minimáltápközeg, amelynek 1 literében 6 g NaNO₃, 10 g glükóz, 2 g triptikázpepton (BBL), 1 g kazaminosav (Difco), 1 g élesztőkivonat (BBL), 0,5 g élesztő-ribonukleinsav-nátriumsó (ICN, Cleveland, USA) 2 ml vitaminoldat van, pH=6,0 (NaOH-dal beállítva) vitaminoldat: 10 mg tiamin, 100 mg riboflavin, 10 mg pantoténsav, 2 mg biotin, 10 mg p-aminobenzoesav, 100 mg nikotinamid, 50 mg piridoxin-HCl 100 ml vízben

TBE 4 ml 0,5 M EDTA-oldat (pH=8,0), 10,8 g Tris, 5,5 g H₃BO₃11 vízben fenol Maniatis és munkatársai szerint kezelve [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory 438. oldal (1982)] mintapuffer: 10% (térfogat/térfogat) glicerin, 100 mM

EDTA (pH=8,0) és brómfenolkék RNáz A Maniatis és munkatársai szerint (lásd fenti irodalom 451.0.)

A felhasznált törzsek és vektorok A. niger N400 vad törzs

A. niger An8 magas szintű pektináztermelő A. niger N756 uridin auxotróf mutánsa (DSM 3917), leírva 0 278 355 számú európai közrebocsátási iratban

E. coli LE392 F~, Aj<7R514 (rk~, mk+), supE44, supF58, /acYl vagy (7aclZY)6, galK2, galT22, metBl, npR55, lambda-,

E. coli DH5alfaF’F’, enrfAl, hsdRUJ, (rk~, mk⁺, s«pE44, thi-1, recAl, gyrA, relAl, 80ómega-/flcZM15, deltaf/acZYAargF)U169, lambda EMBL4 az EMBL4 egy lambda helyettesítővektor 9-23 kbp klónozókapacitással [Frischauf et al.: J. Mól. Bioi. 170, 827-842 (1983)], mely egy multiklónozórégiót tartalmaz a lambda karok és a nem esszenciális hordozórégió között. Ez teszi lehetővé a sokszoros restrikciós enzimes emésztéseket oly módon, hogy a hordozó újraligálása a vektorkarokhoz csökken, míg a kívánt idegen DNS beépül. A vektor lehetővé teszi a Spi fenotípus felhasználását is a rekombinánsok direkt szelekciójára [Zissler et al.: A. D. Hershey (ed.) The Bacteriophage lambda, Cold Spring Harbour Laboratory, 1971].

A következő példák a találmány bemutatását szolgálják, de nem jelentik annak korlátozását a bemutatottakra.

1. példa: Az Aspergillus niger génkönyvtárának megszerkesztése

1.1.példa:Nagy molekulatömegű DNS izolálása A. niger N400-ból

200 ml minimáltáptalajt beoltottunk Aspergillus niger N400 jelű törzs konidiospóráival (10⁶ spóra/ml) és 24 órán át rázattuk (300 fordulat/perc) 1 literes Erlenmeyer-lombikban, 28 °C hőmérsékleten. A micéliumot Büchner-tölcséren, Myracloth-szűrővásznon nyertük ki, hideg, steril fiziológiás sóoldattal mostuk, folyékony nitrogénben lefagyasztottuk és vagy azonnal felhasználtuk vagy -60 °C-on tároltuk. A DNS izolálását a génkönyvtár készítéséhez lényegében Yelton és munkatársai által leírt eljárással végeztük [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,1470-74 (1984)].

A könyvtár készítéséhez 10 g micéliumot homogenizáltunk 1 g-os adagokban, folyékony nitrogénben,

HU 219 809 Β

Braun-mikrohomogenizátorban. A homogenizált micéliumot átvittük egy steril 1 literes Erlenmeyer-lombikba, amely 200 ml extrakciós puffért (50 mM EDTA, 0,2% SDS, pH=8,5) és 200 pl dietil-pirokarbonátot tartalmazott. A keveréket lassan hagytuk felmelegedni szobahőmérsékletre, majd 20 perc alatt felmelegítettük 68 °C-ra időnként összerázva. A szuszpenziót lehűtöttük szobahőmérsékletre és centrifügáltuk 15 percig 12 000 g-vel, majd a felülúszóhoz 1/16 térfogatnyi 8 M kálium-acetát-oldatot (pH=4,2) adtunk, és a keveréket hagytuk jégen állni 1 órán át. A csapadékot centrifugálással elválasztottuk (20 perc, 16 000xg, 4 °C). A nukleinsavakat kicsaptuk a felülúszóból úgy, hogy 0,6 térfogatnyi izopropanollal inkubáltuk jégen 15 percig. A kicsapódott nukleinsavakat centrifúgálással összegyűjtöttük (10 perc, 6000xg, 4 °C), mostuk 70%-os etanollal és szárítottuk. A pelletet 10 ml 20 pg/ml RNáz A-t (Boehringer, Mannheim) tartalmazó TE-ben szuszpendáltuk és 15 percig 37 °C-on inkubáltuk. A DNS-t 1 órán át 37 °C-on kezeltük pronázmentes nukleázzal (végső koncentráció 1 mg/ml) (Kochlight, Coinbrook).

A kapott DNS-oldat 9 ml-ében feloldottunk 8,5 g CsCl-ot, hozzáadtunk 0,2 ml 10 mg/ml-es etidium-bromid-oldatot és vagy Beckman SV41 rotorral (33 000 fordulat/perc, 60 óra), vagy Beckman 50 Ti rotorral (45 000 fordulat/perc, 40 óra) centrifugáltuk. A DNSsávokat összegyűjtöttük és az etidium-bromidot telített, vizes nátrium-klorid-oldattal ekvilibrált izopropanollal többszörös kirázással eltávolítottuk. Öt térfogatnyi TE puffért adtunk a DNS-oldathoz és egymás után kezeltük telített fenollal, fenol/kloroform/izoamil-alkohol 25:24:1 arányú elegyével és kloroform/izoamil-alkohol 24:1 arányú eleggyel. Az így előkészített oldatból a DNS-t 0,1 térfogatnyi, 3 M nátrium-acetát (pH=5,2) és 2,5 térfogatnyi etanol hozzáadásával, -20 °C hőmérsékleten, egy éjszakán át tartó inkubációval csaptuk ki. A csapadékot centrifúgálással (30 000 g, 1 óra, 4 °C) kinyertük, 70%-os etanollal mostuk és 400 pl TE-pufferben oldottuk.

1.2. példa: Az A. niger N400 DNS-ének részleges emésztése Mbol-gyel és a fragmensek izolálása

Annak meghatározására, hogy milyen Mbol-koncentrációval kaphatjuk a legtöbb 13,6-23 kbp nagyságú DNS-fragmenst, az 1.1. példában kapott DNS 1-1 pg-ját alkalmas pufferben csökkenő mennyiségű (0,5-0,001 U) Mbol-gyel emésztettük 10 pl térfogatokban, 37 °C-on, 1 órán át. A reakciókat 1 pl 0,25 M EDTA-val leállítottuk, és a mintákat 0,6%-os agarózgélen, 1 pg/ml etidium-bromidot tartalmazó TBE-pufferben szélesztettük. A kívánt 13,6-23 kbp-ú fragmensek legnagyobb mennyiségét körülbelül 0,02 U/pg DNS-aránynál kaptuk. Az előkísérlet szerint 200 pg DNS-t 2 ml össztérfogatban emésztettünk. 1 órás, 37 °C-on végzett emésztés után EDTA-t adtunk az elegyhez 25 mM végkoncentrációban, az enzimet 65 °C-on 10 perc alatt inaktiváltuk, a DNS-t kicsaptuk, mostuk, szárítottuk és újraoldottuk 400 pl TE-ben.

1.3. példa: A vektor-DNSelkészítése

Az A. niger génkönyvtárat az EMBL4 lambda vektorban hoztuk létre. Ezt a vektort, amelynek klónozókapacitása 9-23 kbp, Frischauf és munkatársai [J. Mól. Bioi. 170, 827-842 (1983)], valamint Kam és munkatársai írták le [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5172-76 (1980)] és a Promega Biotechnology Inc.-től beszerezhető. A genom különböző részeiből származó két inszert (kettős inszert) keletkezésének kizárására a klónozandó fragmensek hosszúságát 13,6 kbp-ban minimalizáltuk.

pg lambda-EMBL4 DNS-t emésztettünk 50 U BamHI-gyel a gyártó által előírt pufferben (100 pl, 37 °C, 2 óra), majd az enzimet hővel inaktiváltuk 10 perc alatt, 65 °C-on. Az oldat nátrium-klorid-koncentrációját 150 mM-ra emeltük és 50 U Sall-gyel inkubáltuk 37 °C-on 2 órán keresztül, ezután EDTA-t adtunk 25 mM koncentráció eléréséig és az enzimet újra hővel inaktiváltuk (65 °C, 10 perc). Extrakció után (a fentiekben ismertetett fenol/TE, fenol/kloroform/izoamil-alkohol és kloroform/izoamil-alkohol elegyekkel) a DNS-t 0,1 térfogatnyi 3 M nátrium-acetát (pH=5,2) és 0,6 térfogatnyi izopropanol hozzáadásával kicsaptuk, ezáltal elimináltuk a kisméretű BamHI-Sall polilinkerfragmenseket. Az elegyet 15 percig jégen állni hagytuk, utána lecentrifugáltuk (15 perc, 12 000xg, 4° C), a csapadékot alaposan átmostuk 70%-os etanollal, megszárítottuk és feloldottuk 40 pl TE-pufferben.

1.4. példa: Az A. niger N400 genomiális DNS-fragmenseinek ligálása és in vitro pakolása

Feltétlenül szükséges, hogy az 1.3. példa szerinti előkészített vektor cos területét a ligálás megkezdése előtt hőkezeljük. Ennek érdekében a vektort 10 mM magnézium-kloridot tartalmazó 100 mM Tris-HCl-pufferben (pH=7,5) 10 percig 65° C-on, majd 1 órán át 42° C-on tartottuk. A tesztkísérletekben a legtöbb rekombinánst az 1:1 vektor-ffagmens tömegaránynál kaptuk. A ligálást 100 pl össztérfogatú, 50 mM TrisHCl-pufferben (pH=7,5), 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT és 1 mM ATP jelenlétében, 9,5 pg vektor-DNS-sel és 10 pg DNS-fragmenssel végeztük. Az oldathoz 0,5 U/pg DNS-mennyiségben DNS-ligázt (BRL) adtunk, és a keveréket inkubáltuk 14 °C-on egy éjszakán át. A ligálást a ligáit DNS-minták agarózgélen való futtatásával teszteltük. Kontrollként 0,5 pg vektor-DNS-t inkubáltunk 5 pl térfogatban a fragmensek nélkül.

A ligációs keveréket etanolos kicsapással koncentráltuk és 20 pl TE-ben oldottuk az in vitro pakolás előtt. Az in vitro pakolást a Promega Packagene extraktummal, a gyártó utasítása szerint végeztük, 10 pl-t használva 1 pg DNS-hez. Kontrollként 1 pg nagy molekulatömegű cI857 Sam7 jelű lambda fágot használtunk, mely a Packagene tartozéka, külön csomagolva. A pakolás után minden mintához 500 pl fágoldatpuffert (PSB) és 5 pl kloroformot adtunk. A rekombináns fágokat 4 °Con tároltuk felhasználásig.

1.5. példa: Az A. niger génkönyvtár titrálása és amplifikálása

HU 219 809 Β

Az E. coli NM539 törzs sejtjeit LB tápközegben tenyésztettük (0,2% maltóz, 10 mM MgSO₄, 1 mM CaCl₂) az 1,0 optikai sűrűségig (600 nm), majd a tenyészet 0,2 ml-éhez 0,1 ml, PBS-ben megfelelően hígított fágmintát adtunk. A fágok adszorpciója után (37 °C, 20 perc) a mintát 3 ml, 0,6% agart tartalmazó, 45 °C hőmérsékletű LB fedőtáptalajhoz kevertük, amit LB táptalajból öntött lemezek felszínére szélesztettünk és egy éjszakán át inkubáltuk. A tarfoltképző egységek (pfu) száma 12 χ 10⁵ és 4,2 χ 10⁵ volt a két, 1.4. példa szerint előállított fágkészítmény 1 ml-ére vonatkoztatva. A háttér (17% és 40%, a fragmensek nélkül végzett kísérletből számolva) levonása után a keletkezett rekombinánsok abszolút számát 6x10⁵-nek találtuk, az általuk tartalmazott DNS mennyisége több mint 200 Aspergillus niger genomnak felel meg.

A génkönyvtár sokszorozása (amplifikálása) céljából mindkét fág 80 pl aliquotjaival fertőztük az E. coli NM359 sejteket, amelyeket LB fedőagarózban szélesztettünk LB agarózlemezeken és inkubáltuk egy éjszakán át 37 °C-on. A fágokat 5-5 ml PSB-vel óvatosan kimostuk a lemezekből, majd a mosófolyadékokat egyesítettük és centrifugáltuk (10 perc, 6000xg), hogy a baktériumokat eltávolítsuk és 0,5% végkoncentrációig kloroformot adtunk hozzá. Mindkét fágkészletet, amelyek körülbelül ugyanolyan mértékben sokszorozódtak, egyesítettük (40 pl készlet), titráltuk (8 χ 10⁹ pfu/ml) és 4 °C-on tároltuk.

2. példa: PRB élesztőpróba preparálása

2.1. példa: Elesztőpróba elkészítése

A pGP202 plazmid (deponálási száma DSM 7018), amely a 3,2 kb élesztő-DNS-fragmenst tartalmazza, amely a PRB gént kódolja, szokásos módon hasítottuk HindlII-mal és Saul-gyel. Ezt a plazmidot emésztettük HindlII-mal és Saul-gyel, és a fragmenseket elválasztottuk 0,8% agarózgélen.

A 3,2 kb fragmenst tartalmazó területet kivágtuk, és a DNS-t elektrodializáltuk. Ezen fragmens 100 ng-ját jelöltük ³²P-dATP-vel, mint jelzett nukleotiddal és közvetlenül felhasználtuk vagy Southern- vagy plakkpróbához.

2.2. példa: Az A. niger DNS Southern-hibridizációja

Az A. niger DNS 2 pg aliquotjait, melyeket a fenti módon állítottunk elő, emésztettük BamHI-gyel vagy HindlII-mal és 0,8%-os agarózgélen elválasztottuk. Lefényképezés után a DNS-t átvittük etidium-bromid-tartalmú nitro-cellulóz-membránra Southem-módszerével [J. Mól. Bioi. 98, 503-517 (1975)], és a 3. példában leírtak szerint hibridizáltuk jelzett PRB élesztőpróbával. A nitro-cellulóz elkülönült sávjait, melyek mindkét emésztési terméket tartalmazták, különböző sorrendű mosási próbáknak vetettük alá, hogy meghatározzuk azokat a feltételeket, melyek a legerősebb jeleket adják a háttérzaj mellett. Azt találtuk, hogy egy előzetes mosás 6 χ SSC-ben 47 °C-on és egy ezt követő mosás 2 χ SSC-ben szobahőmérsékleten, szolgáltatta a legjobb eredményt.

3. példa: Az A. niger N400 génkönyvtár screenelése PRB élesztőpróbával

Az 1. példa szerint létrehozott Aspergillus niger N400 génkönyvtár egy részét SM-pufferrel felhígítottuk és 0,1 ml-es adagokra szétosztottuk, melyek mindegyike körülbelül 2000 pfu-t tartalmazott. A gazdasejteket úgy állítottuk elő, hogy egy éjszaka LB tápközegben tenyésztett E. coli NM539 sejttenyészet 0,5 ml-ét 0,2% maltózt tartalmazó tápközegben inokuláltuk, 4 órán át 37 °C-on 250 rpm-mel rázattuk, majd ezt követően 0,5 ml 1 M MgSO₄-ot és 0,5 ml 0,5 M CaCl₂ot adtunk hozzá. Ezen sejtek 0,2 ml-es aliquotjait összekevertük 0,1 ml fágszuszpenzióval és fél órán át inkubáltuk szobahőmérsékleten. Ezután a keverékeket 3 ml, 0,7% agarózt tartalmazó, 47 °C-os LM táptalajhoz adtuk és azonnal LM agarlemezekre szélesztettük. A lemezeket egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk, majd órán át hűtöttük 4 °C-on.

Minden lemezről két másolatot készítettünk Benton és Davis plakk (tarfolt) hibridizációs módszere szerint [Science 196, 180-182 (1977], Az első szűrőt (Schleicher és Schuell BA85) egy percre, a másodikat 2 percre helyeztük a lemezre és helyzetüket tussal bejelöltük. A szűrőket ezután 100 ml denaturálóoldatot (1 m NaCl, 0,5 M NaOH) tartalmazó tálba merítettük fél percre, majd 100 ml közömbösítőoldatban (0,5 M Tris-HCl, pH = 7,5, 1,5 M NaCl) öblítettük egy percig, utána χ SSC-oldatban finoman lemostuk róla a baktériumok maradványait, végül leitattuk, 10 percig szárítottuk szobahőmérsékleten és Whatman 3 MM szűrőpapíron 80 °C-on 2 órán át besütöttük.

A besütött szűrőket 3 χ SSC-oldatban áztattuk órán át szobahőmérsékleten, majd 250 ml előmelegített (65 °C) prehibridizációs keverékbe tettük [6 χ SSC, lOxDenhardt’s /0,2% BSA, Boehringer-frakció V, 0,2% Ficoll 400, Pharmacia, 0,2% poli(vinil-pirrolidon)-10, Sigma/, 0,1% SDS és 0,1 mg/ml frissen denaturált heringsperma-DNS], A prehibridizációt 1 órán át folytattuk 65 °C-on, rázott vízfürdőn, majd a szűrőket fél órán át mostuk 250 ml, 65 °C-os prehibridizációs keverékben, amely csak abban különbözött a fenti keveréktől, hogy nem tartalmazott heringsperma-DNS-t. Ezután a szűröket 150 ml, 65 °C-os hibridizációs keverékbe tettük, amelyhez frissen adtuk hozzá az előzőleg jelölt próbát.

A 14 órán át 65 °C-on végzett hibridizáció után a szűrőket egyszer mostuk 250 ml előmelegített (47 °C) hibridizációs keverékkel fél órán át 47 °C-on, majd ezt követően mostuk szobahőmérsékleten kétszer 250 ml χ SSC-oldatban, minden alkalommal 45 percig. A szűrőket szárítottuk és exponáltuk Kodak XAR5 filmre 1-3 napon át -70 °C-on, intenzitásfokozó szűrő közbeiktatásával.

Ily módon hat vizsgált szűrőn három pozitív szignált kaptunk. A pozitív plakkokat steril Pasteur-pipettával kiemeltük az eredeti agarlemezekből óvatosan megjelölve a helyüket a lemezen az autodiagramon tustollat használva. Az agardarabokat, melyek a pozitív plakkokat tartalmazták, 1 ml SM-pufferbe tettük, 2,5 μΐ kloroformot adtunk hozzá, majd szobahőmérsékleten

HU 219 809 Β órán át, utána 4 °C-on egy éjszakán át állni hagytuk, hogy a fágok kidiffúndálhassanak az agárból.

Az így izolált pozitív kiónokat lambdal, lambda2 és lambda4-nek neveztük el. Mivel a fágok igen nagy sűrűségűek, a pozitív plakkokkal még kétszer végrehajtottuk a teljes fenti eljárást, hogy minél tisztább és a korábbihoz képest kisebb sűrűségű kiónokat kapjunk.

4. példa: A lambda-klónokjellemzése

4.1. példa: A lambda-DNS izolálása

Ahhoz, hogy a rekombináns klónokból DNS-t izolálhassunk, először a fágokat sokszorozni (amplifikálni) kellett. Erre a célra E. coli LE392 gazdasejteket 10 mM MgSO₄-tel és 0,2% maltózzal kiegészített LB táptalajon növesztettünk 1,0 optikai sűrűség (600 nm) eléréséig. A tisztított fágok 50 μΐ-jeit elkülönítve szélesztettük, mint azt a fentiekben leírtuk. Egy éjszakán át tartó 37 °C-os inkubálás után a fágokat eluáltuk a nem összefolyt lemezekről 5 ml SM-nek a lemezekre szórásával és 2 órán át, enyhén rázatva inkubáltuk. A lemosott fágokat összegyűjtöttük és 0,1 ml kloroformot adtunk hozzá, majd a sejttörmeléket centrifúgálással eltávolítottuk. A felülúszót elválasztottuk, 0,3%-ig kloroformot adtunk hozzá, és a kapott lemezlizátumot (fágszuszpenziót) 4 °C-on lefagyasztottuk.

A fág-DNS izolálásához kiindulási anyagként olyan lemezeket választottunk, amelyen a tarfoltok összefolytak. Ezeket úgy állítottuk elő, hogy a fágszuszpenziók 10-10 ml-ével fertőztünk E. coli LE392 gazdasejteket. Egy éjszakán át 37° C-on inkubáltuk, majd az agaróz felső réteget lekapartuk három, majdnem teljesen összefolyt lemezről. Ezeket a rétegeket egyesítettük, 20 ml SM-et és 0,4 ml kloroformot adtunk hozzá, majd a kapott keveréket 30 percig 37 °C-on rázattuk. A sejttörmeléket és az agarózt centrifúgálással eltávolítottuk, a felülúszó térfogatát SM-mel 18 ml-re kiegészítettük, majd azonos térfogatú 2 M NaCl-ot, 20% PEG 6000-et (BDH, Poole, GB) tartalmazó SM-t adtunk hozzá, kevertük és jégre tettük. 75 perc múlva a fágokat centrifúgálással (20 perc, 1200 xg, 4 °C) összegyűjtöttük, a felülúszót dekantáltuk és a maradék folyadékot Kleenex-szövettel eltávolítottuk. A csapadékot 3 ml SM-ben felszuszpendáltuk és 3 ml kloroformmal extraháltuk. A vizes fázist RNáz A-val (67 pg/ml) és DNáz I-vel (33 pg/ml) 20 percig 37 °C-on kezeltük. Az így kapott keveréket ezután előbb 2 ml fenollal, majd 1 ml kloroformmal összeráztuk, centrifúgálással a két fázist elválasztottuk, a vizes fázist pedig még kétszer extraháltuk 3 ml fenol/kloroform (1:1) eleggyel, illetve 3 ml kloroformmal. A vizes fázisból a DNS-t 0,3 ml 3 M nátrium-acetát-puffer (pH=5,2) és 6 ml etanol adagonkénti hozzáadásával csaptuk ki. Ezt a keveréket 16 órán át 4 °C-on állni hagytuk, majd a DNS-t centrifúgálással (10 perc, 12 000 χ g, 4 °C) kinyertük. A pelletet feloldottuk 0,4 ml TE-pufferben, 200 pg/ml RNáz A-t adtunk hozzá és 37 °C-on 1 órán át inkubáltuk. Az újabb kicsapást 38 μΐ 3 M nátrium-acetát-pufferrel (pH=5,2) és 0,8 ml etanollal végeztük 4 °Con, 1 órán át, majd a centrifúgálással összegyűjtött DNS-t 100 μΐ TE-pufferben oldottuk fel.

4.2. példa: Az A. niger N400pepC-klónjainak restrikciós analízise

A restrikciós analízis során megállapítottuk, hogy mind a három fág tartalmaz olyan inszerteket, melyek az A. niger genomjának ugyanazon régiójából származnak, és elkészítettük a lambdal részleges restrikciós térképét.

pg fág-DNS-t emésztettünk 20 egység EcoRI-gyel 20 μΐ pufferben BRL jelenlétében 1 órán át, 37 °C hőmérsékleten, majd 10 percre 65 °C-on tartottuk. A mintákat 0,7%-os agarózgélen megfúttattuk és lefényképeztük. A DNS-t átvittük nitro-cellulóz-membránra és a jelzett PRB élesztőpróbával hibridizáltuk. Ezekből az emésztésekből kitűnt, hogy mind a három fág tartalmazott egy azonos 12 kb-ú és egy 2,7 kb-ú EcoRI-ffagmenst. Az is kiderült, hogy a 12 kb-ú fragmens az egyetlen fragmens, amely hibridizál a PRB-próbához, és ennélfogva a megfelelő A. niger genom legnagyobb részét - hacsak nem az egészet - tartalmazza. A lambdal-et választottuk ki a további analízisre.

A lambdal-et tovább emésztettük sokféle restrikciós enzimmel és ismét Southem-analízist végeztünk. A legkeskenyebb csík, amely úgy tűnik, hogy a PRB-próbához hibridizáló csíkok összességét tartalmazza, egy 3,2 kbp EcoRI/BamHI fragmens. így ezt szubklónoztuk a plazmidba.

5.példa: A PEPC klónozása plazmidba, szekvenálása és jellemzése

5.1. példa: ApTZPEPCmegkonstruálása

A lambdal DNS-t a fent leírt módon emésztettük a BamHI és EcoRI restrikciós enzimekkel. Ezt követően kloroformmal extraháltuk, a kicsapódott DNS-t centrifúgálással elválasztottuk, puffermintában feloldottuk és elektroforézist végeztünk 0,6%-os agarózgélben 1 χΤΒΕ-pufferben. A 3,2 kbp BamHI/EcoRI fragmenst tartalmazó gélszeletet feltártuk és a DNS-t elektrodializáltuk. Ezt aztán 100 μΐ kloroformmal extraháltuk, etanollal kicsaptuk és újraoldottuk 40 ml TE-pufferben. A DNS-koncentrációt agaróz-gélelektroforézissel megnöveltük, miután a csíkok szabad szemmel UV-lámpa alatt láthatóvá váltak.

A pTZ18R vektort BamHI-s és EcoRI-s emésztéssel preparáltuk, a szállító (BRL) által megadott feltételek mellett. A DNS-t fenollal, fenol-kloroform (1:1) eleggyel és kloroformmal extraháltuk, majd a DNS-t etanollal kicsaptuk.

A fenti fragmensek mindegyikének 100 ng-ját ligáltuk egymáshoz 25 μΐ reakcióelegyben, amely a BRL által ajánlott puffert+ATP-t (1 mM) és 1,5 egység T4 DNS-ligázt (BRL) tartalmazott. A reakciókeveréket 16 órán át 16 °C-on inkubáltuk és E. coli DH5aF’ transzformálására használtuk. A sejteket LB agarlemezeken szélesztettük, amelyek 25 pg/ml ampicillint, 0,005% Xgal-t, 0,05 mM IPTG-t tartalmaztak, és egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk.

A lemezekről néhány egyedülálló fehér telepet tovább szaporítottunk egy éjszakán át LB táptalajban, amelyet 0,1% glükózzal és 2,5 mg/ml ampicillinnel egészítet15

HU 219 809 Β tünk ki. Az így kapott tenyészetek sejtjeiből izoláltuk a plazmidot Holmes és Quigley „miniprep” módszere szerint [Anal. Biochem. 114, 193 (1981)]. A plazmidokat emésztettük néhány restrikciós enzimmel, a gyártó utasításai szerint (BRL) és 0,5 mg/ml RNáz A jelenlétében, majd a termékeket agarózgélen analizáltuk. Azokat a plazmidokat, amelyek a várt méretű BamHI-EcoRI és HindlII íragmenseket tartalmazták, szelektáltuk és az ezeket hordozó E. coli sejteket glicerinben -20 °C-on tartottuk. Ezt a plazmidot pTZPEPC-nek neveztük el és DSM 7019 számon deponáltuk.

5.2. példa: ApepCnukleotidszekvenciája

A pepC-szubklónt, azaz a 3,2 kbp BamHI-EcoRI fragmenst a pTZ18R vektorban, teljesen szekvenáltuk a didezoxilánc terminálisát meghatározó Sangerféle módszer szerint [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-67 (1977)] szintetikus oligonukleotid-primereket és szekvenázt (United States Biochemical Corp.) használva.

A komplett nukleotidszekvenciát a szekvencialistában mutatjuk be. Nyitott leolvasási keretben azonosítható más ismert, a szubtilizincsaládba tartozó szerinproteázokkal, és ez összhangban áll a transzkripciós térképpel.

5.3. példa : A PEPC RNS-térképe

A totál RNS-t liofilizált micéliumból állítottuk elő, amelyet glükózt, mint szénforrást és ammóniumot, mint nitrogénforrást tartalmazó minimáltáptalajon növesztettünk, Frederick és Kinsey módszere szerint [Curr. Génét. 18, 53-58 (1990)]. A messenger RNS 5’végét úgy azonosítottuk, hogy a totál RNS-hez hibridizáltunk 32-P-vel végjelzett oligonukleotidot, oligo A-t (a SEQ ID NO. 1. 433-456 nukleotidjaival komplementer) és mértük a transzkriptumokat, amelyeket reverz transzkriptázzal szekvenálógélben állítottunk elő, és összehasonlítottuk a didezoxiszekvenálás során kapott ugyanolyan oligonukleotidokkal (Maniatis et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982). Az intron pontos hasítóhelyeit a pepC egy parciális cDNS másolatának klónozásával és szekvenálásával azonosítottuk. Az első szál szintézisét standard módszerekkel végeztük (Maniatis et al. - lásd fent) kivéve a kezdő oligonukleotidot, az oligo-C-t (a SEQ ID NO. 1. 923-944-es nukleotidjaival komplementer). Ezt a cDNS-t alkalmaztuk a PCR-hez használva az oligo-B-t (SEQ ID NO. 1. 631-657-es nukleotidjainak felel meg) és a C-t és a pTZ18R plazmidba klónoztuk. (Megjegyezzük, hogy az oligo B tartalmaz egy plusz-BamHI hasítóhelyet az 5’-végen és az oligo-C egy plusz-EcoRI hasítóhelyet.) A két különböző klón mindkét szálát teljes szekvenálásnak vetettük alá. A pepC gén által termelt mRNS teljes hosszát meghatároztuk Northemanalízissel, próbaként a 3,2 kb EcoRI-BamHI fragmenst használva (Maniatis - lásd fent), és megállapítottuk, hogy az 1,5 és 1,8 kb között van, amely megfelel a nyitott leolvasási keret méretéből és a transzkripció kezdőhelyének a helyzetéből elvártnak.

6. példa: A PEPC genomiális diszrupciója

6.1. példa: A pTZPEPCE megszerkesztése

A pTZPEPC plazmidot BamHI-gyel emésztettük, T4 polimerázzal kezeltük és újraligáltuk nem foszforilált EcoRI linkerek (5 GGA ATTCC) 10-szeres moláris feleslegében. E. coliba történő transzformálás után a korrekt plazmidot EcoRI hasításokkal a pepC gén mindkét végen, ,pniniscreen”-nel azonosítottuk.

6.2. példa: ApAXlmegszerkesztése

A pCG59D7 plazmidot, amelyet az Escherichia coli BJ5138/pCG59D7 (DSM 3968)-ból nyertünk ki, emésztettünk Xbal-gyel és az A. niger pyrA teljes gént tartalmazó fragmenst tisztítottuk. Ezt klónoztuk a pTZ18R plazmid Xbal helyére, megalkotva ezzel a pXAI plazmidot, melyet DSM 7017 számon deponáltunk.

6.3. példa : A pPEPCPYRA megszerkesztése

A pyrA gént tartalmazó 4 kb Xbal fragmenst kivágtuk a pAXI-ből és a vektorszekvenciáktól megtisztítottuk.

pg pTZPEPCE-t BglII-vel hasítottunk a gyártó utasításai szerint, majd fenollal extraháltuk, etanollal kicsaptuk és 20 μΐ vízben újraoldottuk. Az így kapott DNS-t bakteriális alkalikus foszfatázzal kezeltük, hogy eltávolítsuk az 5’-foszfátcsoportot, ezt is a gyártó utasításai szerint végezve. Az 5 kb fragmenst a géltől megtisztítottuk.

Mindkét fenti fragmenst T4 polimerázzal kezeltünk a gyártó instrukciói szerint, majd fenollal extraháltuk és etanollal kicsaptuk, végül a két fragmenst összekevertük és ligáltuk egymással. Ezután E. coliba transzformáltuk, és azokat a telepeket, melyek a korrekt plazmidokat hordozzák, miniplazmid-preparátumok restrikciós emésztésével azonosítottuk.

A pPEPCPYRA a pTZ18R vektorból áll, amely a PEPC gént hordozó EcoRI-fragmenst tartalmazza, mely génben a központi BglII-fragmens - mely mindkét aktív helyet, a hisztidint és a szerint, kódolja - helyettesítve van az orotidin-monofoszfát-dekarboxilázt kódoló Xbal DNS-fragmenssel.

6.4. példa: Az A. niger transzformálása pg pPEPCPYRA plazmidot teljesen emésztettünk EcoRI-gyel. Az emésztés teljességét egy aliquotnak gélen történő futtatásával, ellenőriztük és a DNSmaradékot fenollal extraháltuk, etanollal kicsaptuk és 20 pl steril vízben reszuszpendáltuk.

Auxotróf A. niger An8 (DSM 3917) konidiospóráit 4 napon át 23 °C-on komplett táptalajon tenyésztettük a teljes spórázásig. 2 χ 10⁸ konidiospórával inokuláltunk 200 ml minimáltáptalajt, melyet 1 g/1 argininnel és uridinnel egészítettünk ki.

Húszórás 28 °C-on (180 fordulat/perc) való tenyésztés után a micéliumot Miracloth-szűrővel összegyűjtöttük, kétszer mostuk 10 ml 0,8 M KCl-dal, 50 mM CaCl₂-dal és reszuszpendáltuk 20 ml 0,8 M KC1, 50 mM CaCl₂ és 0,5 mg/ml Novozym (Novo Industries) elegyében. A keveréket vízfürdőn rázatva inkubáltuk (30 °C, 50 fordulat) míg alkalmas protoplasztok

HU 219 809 Β képződtek (90-120 perc után mikroszkóppal detektáltuk). A kapott protoplasztszuszpenziót üveggyapotdugón keresztül tölcsérben szűrtük, hogy eltávolítsuk a micéliális sejttörmeléket. A protoplasztokat enyhe centrifugálással (10 perc, 2000 fordulat/perc) szobahőmérsékleten pelletizáltuk és kétszer mostuk 10 ml 0,8 M KCl-dal és 50 mól CaCl₂-dal. Végül a protoplasztokat reszuszpendáltuk 200-500 pl 0,8 M KC1, 50 mM CaCl₂ elegyben úgy, hogy milliliterenként 1 χ 10⁸ szferoplasztot kapjunk.

A transzformáláshoz a protoplasztszuszpenzió 200 pl aliquotjait inkubáltuk 5 pg, EcoRI-gyel emésztett pPEPCPYRA-val 50 pl PCT-ben (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl₂, 25%-os PEG 6000). Az inkubációs keveréket 20 percig jégen tartottuk, majd további 2 ml PCT-t adtunk hozzá, és a keveréket inkubáltuk még 5 percig szobahőmérsékleten. 4 ml 0,8 M KC1 és 50 mM CaCl₂ hozzáadása után a végső oldat 1 ml-es aliquotjait összekevertük folyékony minimál-agartápközeggel [minimáltápközeg+1 g/1 arginin+10 g/1 BactoAgar (Difco)] és 0,8 M KCl-dal stabilizáltuk. Az így kapott keverékeket azonnal agarlemezekre öntöttük ugyanilyen tápközegbe és 30 °C-on inkubáltuk.

2-3 napos, 28 °C-on végzett szaporítás után a stabil transzformánsok gyorsan növekvő és spórázó telepekként jelentek meg, a háttérben sok száz kicsi, feltehetően abortív transzformánssal.

6.5. példa: A géndiszrupciók azonosítása

A stabil kolóniákból különálló spóraszuszpenziókat készítettünk, és friss, pluszarginin-tartalmú minimáltápközeges lemezekre rétegeztük. Az egyedülálló kolóniákat szelektáltuk és újrarétegeztük, hogy tiszta tenyészeteket kapjunk, majd ezekkel beoltottunk 1 g/1 argininnel kiegészített 200 ml minimál-tápfolyadékot. 24 órás 30 °Con rázatott (180 fordulat) inkubálás után a micéliumot szűrőpapíron összegyűjtöttük és fagyasztva szárítottuk. Szárítás után az egyes szűrőpapírokból a DNS-t izoláltuk úgy, hogy a szűrőpapírokat finom porrá törtük mozsárban mozsártörővei. Ebből a porból 60 mg-ot reszuszpendáltunk 3 ml 1% nátrium-dodecil-szulfát, 0,1% Tween 80 és 1 M ammónium-acetátban, majd 65 °C-on tartottuk 20 percig időnként megkeverve. A DNS-oldatból a sejttörmeléket centrifugálással elválasztottuk (5 perc, 15 000 fordulat/perc). A felülúszót extraháltuk kétszer fenollal, kétszer kloroformmal és etanollal kicsaptuk. A DNS-csapadékot újraoldottuk 100 pl steril TE-pufferben.

Minden egyes DNS-ből 20 pl-t emésztettünk 1 órán át BglII-gyel 1 pg RNáz A jelenlétében, majd agarózgélen szeparáltuk, átvittük nitro-cellulóz-membránra és besütöttük. A pTZPEPC-ből az EcoRI-ffagmenst, amely a PEPC-t tartalmazta, tisztítottuk, transzlációval jelöltük és ezt használtuk a szűrökhöz próbaként. Azok a törzsek, amelyek a pepC gén diszrupcióját hordozzák, könnyen felismerhetők az 1,2 kb BG1II hibridizáló ffagmens hiánya révén és azáltal, hogy másik két szomszédos fragmens megváltozott mobilitásával rendelkeznek.

Ezen törzsek egyikét uridint és 5-fluor-orotsavat tartalmazó tápközegben szélesztettük. A pirimidin auxotróf mutánsokat ezen tápközegben erősebb növekedésük által azonosítottuk, összegyűjtöttük és tisztítottuk rétegzéssel, míg egyes kolóniákat kaptunk.

6.6. példa: InterferontermeléspepC~ A. niger törzsben

A pepC- A. niger An8 törzsek egyikét a 6.5. példa szerint izoláltuk és ezt használtuk gazdaszervezetként a pyrA⁺ -tartalmú plazmidok és expressziós kazetták egymást követő transzformálására, melyek az interferon heterológ gént tartalmazták.

Az A. niger An8 uridin auxotróf pepC- mutánsának konidiospóráit 4 napon át növesztettük 23 °C-on komplett tápközegben a teljes spórázásig. 2xl0⁸ konidiospórával inokuláltunk 200 ml minimáltáptalajt, melyet 1 g/1 argininnel és uridinnel egészítettünk ki.

Húszórás tenyésztés után (28 °C, 180 fordulat/perc) a micéliumot Miracloth-szűrővel összegyűjtöttük, mostuk kétszer 10 ml 0,8 M KCl-dal, 50 mM CaCl₂-dal és reszuszpendáltuk 20 ml 0,8 M KC1, 50 mM CaCl₂ és 0,5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industries) elegyében. A keveréket vízfürdőn rázatva inkubáltuk (30 °C, 50 fordulat/perc), míg megfelelő protoplasztokat kaptunk (mikroszkóppal detektáltuk 90-120 perc után). A protoplasztszuszpenziót üveggyapottölcsérben szűrtük, hogy a sejttörmeléket eltávolítsuk. Enyhe centrifugálással (10 perc, 2000 fordulat/perc) szobahőmérsékleten a protoplasztokat összegyűjtöttük és mostuk kétszer 10 ml 0,8 M KC1 és 50 mM CaCl₂ elegyével. Végül a protoplasztokat reszuszpendáltuk 200-500 pl 0,8 M KC1 és 50 mM CaCl₂ elegyben, hogy 1 χ 10⁸/ml koncentrációt kapjunk.

A transzformáláshoz a protoplasztszuszpenzió 200 pl aliquotját inkubáltuk 5 pg pCG59D7 (DSM 3968) és 50 pg pGIIss-IFN AMI 19 vagy pGII-IFN AM119 DNS-sel (mindkét plazmidot leírták a 421 919 számú európai közrebocsátási iratban) 50 pl PCT-ben (10 mM Tris-HCl pH=7,5, 50 mM CaCl₂, 25% PEG 6000). Az inkubációs keveréket 20 percig jégre tettük, majd további 2 ml PCT-t adtunk hozzá és 5 percen át szobahőmérsékleten inkubáltuk. Végül 4 ml 0,8 M KC1, 50 mM CaCl₂-ot adtunk hozzá és a végső transzformációs oldat 1 ml aliquotjait összeráztuk folyékony minimál-agartápközeggel [minimáltáptalaj + 1 g/1 arginin+10 g/1 Bacto-Agar (Difco)] és 0,8 M KCl-dal stabilizáltuk. A keveréket közvetlenül ugyanilyen táptalajból készült agarlemezekre öntöttük és 30 °C-on inkubáltuk.

Két-három nap múlva 28 °C-on tenyésztve, stabil transzformánsok jelennek meg mint gyorsan növekvő és spórázó kolóniák a háttérben sok száz kicsi, valószínűleg abortív, transzformánssal.

A transzformánsokat összegyűjtöttük és interferontermelő képességüket analizáltuk. Az interferonaktivitást Armstrong eljárása szerint határoztuk meg [J. A. Armstrong: Appl. Microbiol. 21, 732 (1971)] humán CCL-23 sejtek és vezikuláris sztomatitiszvírus (VSV) mint reagáltatóvírus segítségével.

A transzformánsokból a konidiospórákat egyenként leoltottuk 50 ml előtenyésztő táptalajra [Pectin Slow

HU 219 809 Β

Set L (Unipectin, SA, Redon, Francé) 3 g/1, NH₄C1 2 g/1, KH₂PO₄ 0,5 g/1, NaCl 0,5 g/1, Mg₂SO₄.7 H₂O 0,5 g/1, Ca₂SO₄.2 H₂O 0,5 g/1 pH 7,0, 1% arginin]. Az előtenyészetet inkubáltuk 72 órán keresztül 28 °C-on, 250 fordulat/perc rázatással és ennek 10%-át használtuk inokulumként 50 ml fő tenyésztőközeghez (Soybean fluor 20 g/1, pectin Slow Set 5 g/1, 1% arginin). A tenyészetet 72-96 órán át inkubáltuk rázatva (28 °C, 250 fordulat/perc).

Különböző időpontokban (minden 20 órában) mintát vettünk, a sejteket centrifugálással leülepítettük, fagyasztva szárítottuk és szárazon szétdörzsöltük. A felülúszót és a sejtextraktumot is megvizsgáltuk interferonaktivitásra a fent leírt módon. Az interferonaktivitás legnagyobb része a médiumba szekretálódott azon transzformánsoknál, melyek a pGIIss-IFN AMI 19 plazmidot hordozták, míg a pGII-IFN AMI 19 plazmidot hordozó transzformánsok esetén ez főként a sejtextraktumban volt található.

7.példa: A pepC hiperexpressziója A. nigerben

7.1. példa: A sokszorozott kópiák hiperexpreszsziója

A. niger An8-at transzformáltunk 1 pg pAXI+10 pg pTZPEPC-vel, hogy uridin fototópokat kapjunk. A telepeket tisztítottuk és a DNS-t a fent leírt módon kipreparáltuk. A pTZPEPC EcoRI-BamHI fragmensének Southem-blot-analízise megmutatta, hogy néhány transzformáns a pTZPEPC egyetlen másolatát integrálta a genomjába, míg mások a fenti 10 extrakópiát integrálták a genomjukba. Ezek a törzsek ennek megfelelően nagyobb proteolitikus aktivitást mutattak és mitozisosan stabilak.

7.2. példa: A génfúzióból származó pepC hiperexpressziója

A pGWllOO plazmidot (DSM 5747 számon deponálva) BamHI-gyel és Sacl-gyel hasítottuk. Az 1,2 kbp fragmenst, körülfogva a piruvátkináz promoterrel és az 5’-véggel, tisztítottuk, T4-polimerázzal kezeltük és klónoztuk a pTZPEPC egyetlen BamHI hasítóhelyére a pepC klón 5’-végénél, azaz a tompa végnél T4-polimerázzal és kezeltük alkalikus foszfatázzal.

A korrekt plazmidokat azonosítottuk miniscreeneléssel és egyet kiválasztottunk, amelyet dut- ungE. coli BW313 törzsbe transzformáltunk. Ezt M13K07tel felülfertőzve a plazmidból egyszálú uracilszubsztituált DNS-t kaptunk.

Az 1 oligonukleotid (szekvenciája a SEQ ID NO. 3. alatt látható) 37 nukleotidból áll. Az első 19 nukleotid komplementer a pepC első 19 nukleotidjával nyitott leolvasási keretben és az utolsó 18 komplementer a piruvátkinázgén utolsó 18 nukleotidjával az ATG előtt. Az 1 oligonukleotid 5 pM ilyen plazmidjának in vitro mutageneziséhez foszforiláltunk az 5’-végen 100 pM ATPvel kezelve az oligonukleotidot 50 pl kinázpufferben 10 E T4 polinukleotidkinázzal a gyártó utasításai szerint. A reakciót befejeztük 10 perces 65 °C-on való melegítéssel.

0,2 pM uraciltartalmú egyszálú DNS-t kevertünk 0,5 pM foszforilált 1 oligonukleotiddal 10 pl végső térfogatban (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 25 mM NaCl). A keveréket inkubáltuk 65 °C-on 5 percig, majd lassan lehűtöttük szobahőmérsékletre 60 perc alatt és 15 percre jégre tettük. Ezután 2 pl 500 pM dNTP’s, 1,5 pl 10 mM ATP, 1 ml T7 DNS-polimeráz (12 U/pl Pharmacia) és 1 pl T4 DNS-polimeráz elegyét adtuk a keverékhez és ezt a polimerizációs elegyet inkubáltuk 15 percen át 37 °C-on. A reakciót 5 perces 65 °Con történő melegítéssel fejeztük be és az aliquotokat használtuk az E. coli DH5alfaF’ transzformálásához.

A korrekt plazmidokat emésztés után a miniplazmidok preparálásával azonosítottuk. Hármat kiválasztottunk és az EcoRI-fragmenst teljesen szekvenáltuk szintetikus oligonukleotidokat használva. Az egyik plazmidot, amely a piruvátkináz-promoter perfekt fúzióját tartalmazta a pepC-hez nyitott leolvasási keretben, pPKIPEPCA-nak neveztük el, és ezt használtuk pAXI-gyel az A. niger kotranszformálására uridinprototrófiához.

A pki-pepC fúzió jelenlétét igazoltuk oly módon, hogy az egyes tisztított transzformánsokból kinyertük a DNS-t és Southem-analízissel vizsgáltuk azokat pki- és pepC-próbákat alkalmazva. Azok a törzsek, amelyek egy vagy több ilyen génfüziót integráltak a genomjukba, nagyobb proteolitikus aktivitástermelést mutattak, amikor a sejtek glükózon, mint szénforráson növekedtek.

8. példa: A pepC expressziója más mikroorganizmusban : kifejeződés élesztőben

A pPKIPEPCA plazmidba in vitro mutagenezissel két szintetikus oligonukleotidot, melyek szekvenciája SEQ ID NO. 4. és 5. alatt látható a szekvencialistában, vittünk be. Az előzőt beépítettük az EcoRI hasítóhelyre közvetlenül a pepC ATG-kodonja elé, míg az utóbbit az intronhoz hurkoltuk. Az így készített plazmid a pPKIPEPCB, melynek szekvenciáját teljes szekvenálással igazoltuk.

A 2,8 kb EcoRI-BamHI-fragmenst, amely éppen a pepC ATG-kodonja előtt kezdődik és befejeződik a pepC terminátor után, tisztítottunk és a kétmikronos pFBY25 élesztővektorba (deponálva DSM 7020 számon) ligáltuk az SnaBI helyre a pFbY129 (deponálva DSM 7016 számon) 520 bp BamHI-EcoRI fragmensével együtt, amely az élesztő GÁL 10 promotert tartalmazta. A korrekt plazmidot restrikciós emésztéssel azonosítottuk.

Ezt a pFBY138 jelű plazmidot transzformáltuk az élesztőbe és az pepC fehéqét termelt, ha a génfúziót galaktózzal indukáltuk.

9. példa: DNS-próba izolálása A. niger szubtilizinszerű szerinproteázok kimutatására

9.1. példa: Degenerált PCR-primerek szerkesztése

A PCR-t, azaz a polimeráz-láncreakciót [Saiki et al.: Science 230, 1350-1354 (1965)] használják próbák izolálására proteázok screeneléséhez. A két régió, amely a hisztidin és szerin aktív helyeit tartalmazza, jól

HU 219 809 Β konzervált a szubtilizinosztályba tartozó különböző proteázok között. Egy konszenzus-aminosavszekvenciát vezettünk le, amely ezen régiók egyikéből származik és a DNS-szekvenciát, amely képes ezen két aminosavszekvencia kódolására. A konzervált régió mindegyikéhez két prímért szerkesztettünk hogy a degeneráltság mértékét csökkentsük.

A PCRoligo 1 és a PCRoligo 2 (szekvenciájuk a SEQID NO. 8. és 9. alatt látható) megfelel a His aktív hely régiónak és a PCRoligo 3 és PCRoligo 4 (szekvenciájuk a SEQ ID NO. 10. és 11-ben látható) megfelel a Ser aktív hely régiónak. A célból, hogy a későbbiekben megkönnyítsük a PCR-termékek szubklónozását, a PCRoligo 1 és 2 tartalmaz egy BamHI restrikciós helyet és a PCRoligo 3 és 4 pedig egy EcoRI restrikciós helyet az 5’-vég közelében.

9.2. példa: Az A. niger genomiális DNS amplifikálása

Az A. niger genomiális DNS-ét az 1. példában leírt módon izoláltuk. Négy amplifikációs reakciót viteleztünk ki páronként kombinálva az előző példában leírt PCRoligokkal. A polimeráz-láncreakcióhoz a reakcióelegy tartalmazott 100 ng A niger összgenomiális DNS-t, 100 pmol-t mindegyik primerből, 10 mM TRIS-HC1,50 mM KC1,1,5 mM MgCl₂,1 mg/ml zselatin elegyét (pH 8,3) és 5 egység Taq DNS-polimerázt 50 pl össztérfogatban. A DNS-t 94 °C-on 30 másodperc alatt denaturáltuk, majd a primereket 42 °C-on 40 másodperc alatt hőkezeltük és az extenziós lépést 72 °C-on 60 s alatt játszattuk le. Ezt a három lépést aztán 40-szer megismételtük.

9.3. példa: A PCR-termékek izolálása és jellemzése

Az amplifikációs reakció termékeit 1%-os agarózgélen elválasztottuk és a DNS-ffagmenseket a gélből elektroelúcióval a fent leírt módon izoláltuk. Az izolált ffagmenseket (200-300 ng) fenollal, majd kloroformmal extraháltuk, végül etanollal kicsaptuk. Centrifúgálás után a DNS-csapadékot szárítottuk, majd 10 μΐ TEpufferben feloldottuk. Ezután a DNS-t emésztettük 10 egység BamHI és EcoRI restrikciós enzimekkel 20 μΐ térfogatban 1 órán át 37 °C-on a gyártó utasításai szerint. Ezt követően extraháltunk fenollal és kloroformmal, majd etanollal kicsaptuk az emésztett DNS-t, a csapadékot elválasztottuk, szárítottuk és újraoldottuk 10 μΐ ΤΕ-pufferben. A DNS-koncentrációt meghatároztuk agaróz-gélelektroforézist követően a DNS-telepek UV fény alatti láthatóvá tételével.

A pTZ18R vektort BamHI és EcoRI-s emésztéssel készítettük a gyártó által megadott körülmények között, majd extraháltuk és kicsaptuk a fent leírt módon.

Az izolált PCR-fragmensek 100 ng-ját ligáltuk 100 ng preparált pTZ18R vektorral 20 μΐ térfogatban 1 egység T4 DNS-ligázzal a gyártó által előírt feltételek mellett. A reakcióelegyet inkubáltuk (160 °C, 16 óra), majd ezzel transzformáltuk az E. coli DH5alfaF’ törzset. A transzformált sejteket 25 pg/ml ampicillin, 0,005% Xgal és 0,05 mM IPTG-tartalmú LB agarlemezekre szélesztettük és inkubáltuk egy éjszakán át 37 °C-on.

Néhány egyedülálló fehér kolóniát használtunk fel egyéjszakás tenyészetek készítésére 5 ml LB tápközegben, melyet 0,1% glükózzal és 25 pg/ml ampicillinnel egészítettünk ki. Ezekből a tenyészetekből izoláltuk a plazmid-DNS-t felhasználva Holmes és Quigley „miniprep”-módszerét [Anal Biochem. 114, 193 (1981)]. A plazmidokat BamHI és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztettük az előírt módon és a ffagmenseket tartalmazó plazmidokat tovább analizáltuk.

A szelektált plazmidok inszertjeit szekvenáltuk Sanger módszere szerint [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-67 (1977)] szintetikus oligonukleotid-primereket és szekvenátort (United States Biochemical Corp.) alkalmazva.

9.4. példa: A PCR-termékek szekvenciájának komputeranalízise

A fenti inszertek nukleotidszekvenciáit összehasonlítottuk minden DNS-szekvenciával, amely a génbankban és az EMBL adatbázisban szerepel. Közülük egyet, amely erős homológiát mutatott a szubtilizin típusú proteázokat kódoló DNS-szekvenciákhoz, kiválasztottunk próbának az A. niger génkönyvtár ezt követő screeneléséhez és PCR-próbának neveztük el. Ezen fragmens szekvenciája (PCR-primer nélkül) a SEQ ID NO. 6. alatt látható szekvencia 1471. és 2020 nukleotidjai közé esik.

10. példa: Az A. niger N400 könyvtár screenelése PCR-próbával

Az Aspergillus niger N400 törzs génkönyvtárának plakkhibridizációjához a szűrőket az 1. példában leírt módon készítettük és a 3. példa szerint előhibridizáltuk.

Hibridizálás után (14-16 óra, 65 °C) mostuk a szűrőket egyszer 250 ml 2 χ SSC, 0,1% SDS-ben fél órán át szobahőmérsékleten, majd ezt követően mostuk szobahőmérsékleten 250 ml 0,2 χ SSC, 0,1% SDS-ben két részletben, minden alkalommal 20 percig, és végül kétszer 250 ml 0,2 χ SSC, 0,1% SDS-ben 65 °C-on egyenként 20 percig. A szűrőket szárítottuk és XAR5 Kodak filmre exponáltuk 1-3 napon át -70 °C-on intenzitásfokozó szűrőt használva.

Ezen a módon 5 pozitív jelet kaptunk hat screenelt lemezről. A pozitív plakkokat kiemeltük steril Pasteurpipettával óvatosan megjelölve helyüket a lemezen az autodiagramon tustollat használva. Az agardarabkákat, melyek a pozitív plakkokat tartalmazták 1 ml SM-hez adtuk és 2,5 pl kloroformot adtunk hozzá. A fágokat hagytuk kidiffúndálni az agárból szobahőmérsékleten időnként megkeverve a levegőt és inkubáltuk 4 °C-on éjszakán át. Az agart és a sejttörmeléket 5 perces centrifúgálással eltávolítottuk, 2,5 pl kloroformot adtunk hozzá és a fágokat 4 °C-on tároltuk.

A pozitív kiónokat Xa, Xb, Xc, Xd és Xe-nek neveztük el. Mivel a fágok szélesztve igen nagy sűrűségűek, a pozitív plakkokat tisztítottuk kétszeri szélesztéssel alacsony sűrűségig és a teljes eljárást megismételtük a replikonokkal, a szélesztést, hibridizációt és a pozitív plakkok összegyűjtését.

HU 219 809 Β

11. példa: A lambda-klémokjellemzése

11.1. példa: A lambda-DNS izolálása és az A. niger M400pepD-klőnok restrikciós analízise

A lambda-DNS-t a 4.1. példában leírt módon izoláltuk. Restrikciós analízissel megállapítottuk, hogy mind az öt fág (Xa-Xe) tartalmaz inszerteket, melyek az A. niger ugyanazon régiójából származnak és megszerkesztettük a genomiális régió parciális restrikciós térképét.

pg fág-DNS-t emésztettünk 20 egység EcoRI-gyel vagy BamHI-gyel 20 μΐ térfogatban 1 órán át 37 °C-on a gyártó által ajánlott pufferben, majd 65 °C-on tartottuk 10 percig. A mintákat megfuttattuk 0,7%-os agarózgélen és fotografáltuk. A DNS-t nitro-cellulózmembránra átvittük és hibridizáltuk a jelzett PCRpróbával.

Ezekből az emésztésekből látható, hogy mind az öt fág tartalmaz egy körülbelül 5,5 kb átfedőrégiót, amely hibridizál a PCR-próbához és ennélfogva tartalmazza e megfelelő A. niger gén legnagyobb részét - hacsak nem az egészet. A 6,0 kbp hosszúságú BamHI-ffagmens tartalmazta ezt a régiót és ezt választottuk ki a további analízisre.

12. példa: A PEPD klónozása plazmidba, annak szekvenálása és jellemzése

12.1. példa: A pTZPEPD megszerkesztése

A 6,0 kb BamHI-fagmenst inkubáltuk Hindlll restrikciós enzimmel. Ezt követően extraháltuk kloroformmal, a DNS-t kicsaptuk, centrifugálással elválasztottuk, feloldottuk puffermintában és elektroforézist végeztünk 0,6%-os agarózgélben 1 χ TBE-pufferben. A gélszeletet, amely a 3,0 kbp BamHI-HindlII ffagmenst tartalmazta feltártuk és a DNS-t elektrodializáltuk, majd extraháltuk 100 μΐ kloroformmal és etanollal kicsaptuk, végül újraoldottuk 40 ml TE-pufferben. A DNS-koncentrációt megnöveltük agaróz-gélelektroforézissel, miután a csíkok UV fény alatt láthatóvá váltak.

A pTZ18R vektort BamHI-gyel és HindlII-mal emésztettük a szállító (BRL) által megadott feltételek mellett. A DNS-t fenollal, fenol-kloroform 1:1 eleggyel és kloroformmal extraháltuk, majd a DNS-t etanollal kicsaptuk.

A fenti ffagmensek mindegyikének 100 ng-ját ligáltuk egymáshoz 25 μΐ reakcióelegyben, amely a BRL által ajánlott puffert+ATP-t (1 mM) és 1,5 egység T4 DNS-ligázt (BRL) tartalmazott. A reakciókeveréket 16 órán át 16 °C-on inkubáltuk és E. coli DH5aF’ transzformálására használtuk. A sejteket LB agarlemezeken szélesztettük, amelyek 25 pg/ml ampicillint, 0,005% Xgal-t, 0,05 mM IPTG-t tartalmaztak, és egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk.

A lemezekről néhány egyedülálló fehér telepet tovább szaporítottunk egy éjszakán át LB táptalajban, amelyet 0,1% glükózzal és 25 mg/ml ampicilinnél egészítettünk ki. Az így kapott tenyészetek sejtjeiből izoláltuk a plazmidot Holmes és Quigley „miniprep” módszere szerint [Anal. Biochem. 114, 193 (1981)]. A plazmidokat emésztettük néhány restrikciós enzimmel, a gyártó utasításai szerint (BRL) és 0,5 mg/ml RNáz A jelenlétében, majd a termékeket agarózgélen analizáltuk. Azokat a plazmidokat, amelyek a várt méretű BamHI-HindlII ffagmenseket tartalmazták, szelektáltuk és az ezeket hordozó E. coli sejteket glicerinben -20 °C-on tároltuk. Ezt a plazmidot pTZPEPD-nek neveztük el és DSM 7409 számon deponáltuk.

12.2. példa: ApepD nukleotidszekvenciája

A pepD szubklónt, azaz a 3,0 kbp BamHI-HindlII ffagmenst a pTZ18R vektorban, teljesen szekvenáltuk a didezoxilánc terminálisát meghatározó Sanger-féle módszer szerint [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-67 (1977)] szintetikus oligonukleotid-primereket és szekvenázt (United States Biochemical Corp.) használva.

A komplett nukleotidszekvenciát a szekvencialistában mutatjuk be a SEQ ID NO. 6. alatt. Nyitott leolvasási keretben azonosítható más ismert, a szubtilizincsaládba tartozó szerinproteázokkal és ez összhangban áll a transzkripciós térképpel.

12.3. példa: A PEPD RNS-térképe

A totál RNS-t liofilizált micéliumból állítottuk elő, amelyet glükózt, mint szénforrást és ammóniumiont, mint nitrogénforrást tartalmazó minimáltáptalajon növesztettünk, Frederick és Kinsey módszere szerint [Curr. Génét. 13, 53-58 (1990)]. A messenger RNS 5’-végét úgy azonosítottuk, hogy a totál-RNS-hez hibridizáltunk 32-P-vel végjelzett oligonukleotidot, oligo A-t (a SEQ ID NO. 6. 851 -876 nukleotidjaival komplementer) és mértük a transzkriptumokat, amelyeket reverz transzkriptázzal szekvenálógélben állítottunk elő, és összehasonlítottuk a didezoxiszekvenálás során kapott ugyanolyan oligonukleotidokkal (Maniatis et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982). Az intronok pontos hasítóhelyeit a pepD egy parciális cDNS-másolatának klónozásával és szekvenálásával azonosítottuk. Az első szál szintézisét standard módszerekkel végeztük (Maniatis et al. - lásd fent) kivéve a kezdő oligonukleotidot, az oligo C-t (a SEQ ID NO. 6. 1914-1941 nukleotidjaival komplementer). Ezt a cDNS-t alkalmaztuk a PCR-hez használva az oligo B-t (SEQ ID NO. 6. 1102-1129 nukleotidjainak felel meg) és a C-t és a pTZ18R plazmidba klónoztuk. Megjegyezzük, hogy az oligo B-ben az 1107-1109 oligonukleotidokat (GGT) helyettesítettük ATC-vel létrehozva így egy új BamHl hasítóhelyet. Hasonlóképpen az 1932(A) és az 1935 (A) nukleotidokat is helyettesítettük G-vel és T-vel az oligoC-ben létrehozva ezáltal egy új Hindlll hasítóhelyet. A két különböző klón mindkét szálát teljes szekvenálásnak vetettük alá. A pepD gén által termelt mRNS teljes hoszszát meghatároztuk Northem-analízissel, próbaként a 3,0 kb EcoRI-HindlII ffagmenst használva (Maniatis szerint: lásd fent), és megállapítottuk, hogy az 1,4 és 1,7 kb között van, amely megfelel a nyitott leolvasási keret méretéből és a transzkripció kezelőhelyének helyzetéből elvártnak.

HU 219 809 Β

73. példa: A PEPD genomiális diszrupciója

13.1. példa: ApPEPDPYRA megszerkesztése

A pyrA gént tartalmazó 4 kb Xbal-ffagmenst kivágtuk a pAXI-ből (DSM 7017) és a vektorszekvenciáktól megtisztítottuk.

pg pTZPEPD-t Nhel-gyel és Ncol-gyel hasítottunk a gyártó utasításai szerint, majd fenollal extraháltuk, etanollal kicsaptuk és 20 pl vízben újraoldottuk. Az így kapott DNS-t bakteriális alkalikus foszfatázzal kezeltük, hogy eltávolítsuk az 5’-foszfátcsoportot, ezt is a gyártó utasításai szerint végezve. Az 5,3 kb fragmenst, amelyből hiányzik a His és Ser aktív helyeket tartalmazó 0,6 kbp Nhel-Ncol fragmens, a géltől megtisztítottuk.

Mindkét fenti fragmenst T4 polimerázzal kezeltünk a gyártó instrukciói szerint, majd fenollal extraháltuk és etanollal kicsaptuk, végül a két fragmenst összekevertük és ligáitok egymással. Ezután E. coliba transzformáltuk, és azokat a telepeket, melyek a korrekt plazmidokat hordozzák, mini-plazmidpreparátumok restrikciós emésztésével azonosítottuk.

A pPEPDPYRA a pTZ18R vektorból áll, amely a PEPD gént hordozó BamHI-HindlII fragmenst tartalmazza, mely génben a központi Nhel-Ncol fragmenst - mely a hisztidint és a szerin aktív helyeket kódolja helyettesítettük az orotidin-monofoszfát-dekarboxilázt kódoló Xbal DNS-fragmenssel.

13.4. példa: Az A. niger transzformálása pg pPEPDPYRA plazmidot teljesen emésztettünk EcoRI-gyel. Az emésztés teljességét egy aliquotnak gélen történő futtatásával ellenőriztük és a DNSmaradékot fenollal extraháltuk, etanollal kicsaptuk és 20 pl steril vízben reszuszpendáltok.

Auxotróf A. niger An8 (DSM 3917) konidiospóráit 4 napon át 20 °C-on komplett táptalajon tenyésztettük a teljes spórázásig. 2xl0⁸ konidiospórával inokuláltunk 200 ml minimáltáptalajt, melyet 1 g/1 argininnel és uridinnel egészítettünk ki.

Húszórás 28 °C-on (180 fordulat/perc) való tenyésztés után a micéliumot Miracloth-szűrővel összegyűjtöttük, kétszer mostuk 10 ml 0,8 M KCl-dal, 50 mM CaCl₂-dal és reszuszpendáltok 20 ml 0,8 M KC1, 50 mM CaCl₂ és 0,5 mg/ml Novozym (Novo Industries) elegyében. A keveréket vízfürdőn rázatva inkubáltuk (30 °C, 50 fordulat) míg alkalmas protoplasztok képződtek (90-120 perc után mikroszkóppal detektáltuk). A kapott protoplasztszuszpenziót üveggyapotdugón keresztül tölcsérben szűrtük, hogy eltávolítsuk a micéliális sejttörmeléket. A protoplasztokat enyhe centrifugálással (10 perc, 2000 fordulat/perc) szobahőmérsékleten elválasztottuk és kétszer mostok 10 ml 0,8 M KCl-dal és 50 mM CaCl₂-dal. Végül a protoplasztokat reszuszpendáltok 200-500 pl 0,8 M KC1, 50 mM CaCl₂ elegyben úgy, hogy milliliterenként 1 χ 10⁸ szferoplasztot kapjunk.

A transzformáláshoz a protoplasztszuszpenzió 200 pl aliquotjait inkubáltuk 5 pg, EcoRI-gyel emésztett pPEPDPYRA-val 50 pl PCT-ben (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl₂, 25%-os PEG 6000). Az inkubációs keveréket 20 percig jégen tartottuk, majd további 2 ml PCT-t adtunk hozzá, és a keveréket inkubáltuk még 5 percig szobahőmérsékleten. 4 ml 0,8 M KC1 és 50 mM CaCl₂ hozzáadása után a végső oldat 1 ml-es aliquotjait összekevertük folyékony minimál-agartápközeggel [minimáltápközeg+1 g/1 arginin+10 g/1 BactoAgar (Difco)] és 0,8 M KCl-dal stabilizáltuk. Az így kapott keverékeket azonnal agarlemezekre öntöttük ugyanilyen tápközegbe és 30 C-on inkubáltuk.

2-3 napos, 28 C-on végzett szaporítás után a stabil transzformánsok gyorsan növekvő és spórázó telepekként jelentek meg, a háttérben sok száz kicsi, feltehetően abortív transzformánssal.

13.5. példa: A géndiszrupciókazonosítása

A stabil kolóniákból különálló spóraszuszpenziókat készítettünk, és friss, pluszarginin-tartalmú minimáltápközeges lemezekre rétegeztük. Az egyedülálló kolóniákat szelektáltok és újrarétegeztük, hogy tiszta tenyészeteket kapjunk, majd ezekkel beoltottunk 1 g/1 argininnel kiegészített 200 ml minimál-tápfolyadékot. 24 órás 30 °C-on rázatott (180 fordulat) inkubálás után a micéliumot szűrőpapíron összegyűjtöttük és fagyasztva szárítottuk. Szárítás után az egyes szűrőpapírokból a DNS-t izoláltuk úgy, hogy a szűrőpapírokat finom porrá törtük mozsárban mozsártörő vei. Ebből a porból 60 mg-ot reszuszpendáltonk 3 ml 1% nátrium-dodecil-szulfát, 0,1% Tween 80 és 1 M ammónium-acetátban, majd 65 °C-on tartottuk 20 percig időnként megkeverve. A DNS-oldatból a sejttörmeléket centrifugálással elválasztottuk (5 perc, 15 000 fordulat/perc). A felülúszót extraháltuk kétszer fenollal, kétszer kloroformmal és etanollal kicsaptok. A DNS-csapadékot újraoldottuk 100 pl steril TE-pufferben.

Minden egyes DNS-ből 20 pl-t emésztettünk 1 órán át Nhel-gyel és Ncol-gyel 1 pg RNáz A jelenlétében, majd agarózgélen szeparáltok, átvittük nitro-cellulózmembránra és rögzítettük. A pTZPEPD-ből a HindlIIBamHI fragmenst, amely a PEPD-t tartalmazta, tisztítottuk, transzlációval jelöltük és ezt használtuk a szűrőkhöz próbaként. Azok a törzsek, amelyek a pepD gén diszrupcióját hordozzák, könnyen felismerhetők a 0,6 kb Nhel-Ncol hibridizálófragmens hiánya révén és azáltal, hogy másik két szomszédos fragmens megváltozott mobilitásával rendelkeznek.

Ezen törzsek egyikét uridint és 5-fluor-orotsavat tartalmazó tápközegben szélesztettük. A pirimidin auxotróf mutánsokat ezen tápközegben erősebb növekedésük által azonosítottuk, összegyűjtöttük és tisztítottuk rétegzéssel, míg egyes kolóniákat kaptunk.

13.6. példa: Interferontermelés pepD~ A. niger törzsben

A pepD- A. niger An8 törzsek egyikét a 6.5. példa szerint izoláltok és ezt használtuk gazdaszervezetként a pyrA⁺ -tartalmú plazmidok és expressziós kazetták egymást követő transzformálására, melyek az interferon heterológ gént tartalmazták.

Az A. niger An8 uridin auxotróf pepD' mutánsának konidiospóráit 4 napon át növesztettük 28 °C-on komp21

HU 219 809 Β lett tápközegben a teljes spórázásig. 2xl0⁸ konidiospórával inokuláltunk 200 ml minimáltáptalajt, melyet g/1 argininnel és uridinnel egészítettünk ki.

Húszórás tenyésztés után (28 °C, 180 fordulat/perc) a micéliumot Miracloth-szűrővel összegyűjtöttük, mostuk kétszer 10 ml 0,8 M KCl-dal, 50 mM CaCl₂-dal és reszuszpendáltuk 20 ml 0,8 M KC1, 50 ml CaCl₂ és 0,5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industries) elegyében. A keveréket vízfürdőn rázatva inkubáltuk (30 °C, 50 fordulat/perc) míg megfelelő protoplasztokat kaptunk (mikroszkóppal detektáltuk 90-120 perc után). A protoplasztszuszpenziót üveggyapottölcsérben szűrtük, hogy a sejttörmeléket eltávolítsuk. Enyhe centrifugálással (10 perc, 2000 fordulat/perc) szobahőmérsékleten a protoplasztokat összegyűjtöttük és mostuk kétszer 10 ml 0,8 M KC1 és 50 mM CaCl₂ elegyével. Végül a protoplasztokat reszuszpendáltuk 200-500 μΐ 0,8 M KC1 és 50 mM CaCl₂ elegyben, hogy 1 χ 10⁸/ml koncentrációt kapjunk.

A transzformáláshoz a protoplasztszuszpenzió 200 μΐ aliquotját inkubáltuk 5 pg pCG59D7 (DSM 3968) és 50 pg pGIIss-IFM AMI 19 vagy pGII-IFM AMI 19 DNS-sel (mindkét plazmidot leírták a 421 919 számú európai közrebocsátási iratban) 50 pl PCT-ben (10 mM Tris-HCl pH=7,5, 50 mM CaCl₂, 25% PEG 6000). Az inkubációs keveréket 20 percig jégre tettük, majd további 2 ml PCT-t adtunk hozzá és 5 percen át szobahőmérsékleten inkubáltuk. Végül 4 ml 0,8 M KC1, 50 mM CaCl₂-ot adtunk hozzá és a végső transzformációs oldat 1 ml aliquotjait összeráztuk folyékony minimál-agartápközeggel [minimáltáptalaj+1 g/1 arginin +10 g/1 Bacto-Agar (Difco)] és 0,8 M KCl-dal stabilizáltuk. A keveréket közvetlenül ugyanilyen táptalajból készült agarlemezekre öntöttük és 30 °C-on inkubáltuk.

Két-három nap múlva 28 °C-on tenyésztve, stabil transzformánsok jelennek meg mint gyorsan növekvő és spórázó kolóniák, a háttérben sok száz kicsi, valószínűleg abortív, transzformánssal.

A transzformánsokat összegyűjtöttük és interferontermelő képességüket analizáltuk. Az interferonaktivitást Armstrong eljárása szerint határoztuk meg [J. A. Armstrong: Appl. Microbiol. 21, 732 (1971)] humán CCL-23 sejtek és vezikuláris sztomatitiszvírus (VSV) segítségével.

A transzformánsokból a konidiospórákat egyenként leoltottuk 50 ml előtenyésztő táptalajra [Pectin Slow Set L (Unipectin, SA, Redon, Francé) 3 g/1, NH₄C1 g/1, KH₂PO₄ 0,5 g/1, NaCl 0,5 g/1, Mg₂SO₄.7 H₂O 0,5 g/1, Ca₂SO₄.2 H₂O 0,5 g/1 pH 7,0, 1% arginin]. Az előtenyészetet inkubáltuk 72 órán keresztül 23 °C-on, 250 fordulat/perc rázatással és ennek 10%-át használtuk inokulumként 50 ml fő tenyésztőközeghez (20 g/1 Soybean fluor, 5 g/1 pectin Slow Set, 1% arginin). A tenyészetet 72-96 órán át inkubáltuk rázatva (28 °C, 250 fordulat/perc).

Különböző időpontokban (minden 20 órában) mintát vettünk, a sejteket centrifugálással leülepítettük, fagyasztva szárítottuk és szárazon szétdörzsöltük. A felülúszót és a sejtextraktumot is megvizsgáltuk interferonaktivitásra a fent leírt módon. Az interferonaktivitás legnagyobb része a médiumba szekretálódott azon transzformánsoknál, melyek a pGIIss-IFN AMI 19 plazmidot hordozták, míg a pGII-IFM AMI 19 plazmidot hordozó transzformánsok esetén ez főként a sejtextraktumban volt található,

14. példa: A pepD hiperexpressziója A. nigerben

14.1. példa: A sokszorozott kópiák hiperexpreszsziója

A. niger An8-at transzformáltunk 1 pg pAXI+10 pg pTZPEPD-vel hogy uridin fototópokat kapjunk. A telepeket tisztítottuk és a DNS-t a fent leírt módon kipreparáltuk. A pTZPEPD HindlII-fragmensének Southemblot-analízise megmutatta, hogy néhány transzformáns a pTZPEPD egyetlen másolatát integrálta a genomjába, míg mások a fenti 10 extra kópiát integrálták a genomjukba. Ezek a törzsek ennek megfelelően nagyobb proteolitikus aktivitást mutattak és mitozisosan stabilak.

14.2. példa: A génfúzióból származó pepD hiperexpressziója

Egy fúziós gént szerkesztettünk, amely az A. niger piruvátkináz promoterrégiójából és az A. niger pepD gént kódoló régióból és a terminátorrégióból áll. A fúziót rekombináns PCR-rel hoztuk létre [R. Higuchi: Recombinant PCR, pp. 177-183 in Innis et al., (eds) PCR Protocols, Academic Press, Inc. (1990)]. Négy oligonukleotid prímért vizsgáltunk, melyek közül a fuzoligo 1, 2 és 3 a SEQ ID NO. 12., 13. és 14-ben látható, míg a fuzoligo 4 komplementer a SEQ ID NO.

szekvencia 2858 és 2874 közötti nukleotidokkal. A fuzoligo 1 hibridizál a 0,75 kbp pki promoterhez ellenkező irányban az ATG startkodonnal. A fuzoligo és 3 részlegesen átfedi a komplementer szálakat, mindkettő tartalmaz pki promoterszekvenciákat közvetlenül az ATG transzlációs startkodontól visszafelé, az ATG startkodont magát és pepD-t kódoló szekvenciákat is közvetlenül az ATG-kodont követően. A fuzoligo 4 hibridizál a pepD gén 0,65 kbp downstream régiójához, a transzlációs stophelytől lefelé. A két PCRreakciót a fentiekben leírt módon hajtottuk végre. Az elsőben egy 0,75 kbp pki promoterffagmenst amplifikáltunk, templátként a fuzoligo 1-et, a fuzoligo 2-t és a pGW 1100-t (DSM 5747) használva. A másodikban egy 2,0 kb fragmenst, amely a pepD-t kódoló és terminátorrégiót tartalmazta, amplifikáltunk templátként a fuzoligo 3-t, a fuzoligo 4-t és a pTZPEPD-t alkalmazva. Az amplifikációs termékeket agarózgélből tisztítottuk, egyesítettük, denaturáltuk és újraanneáltuk. A homo- és a heteroduplexekből is két fragmens az újraanneálás során az átlapolóvégek következtében fuzilogo 2-nek és 3-nak bizonyult. Ezt az anneált keveréket aztán ismét amplifikáltuk PCR-módszerrel két „külső” prímért (fuzoligo 1 és 4) használva. A reakcióterméket izoláltuk, tisztítottuk és szubklónoztuk egy plazmidvektorba.

A korrekt plazmidokat emésztés után a miniplazmidok preparálásával azonosítottuk. Kettőt kiválasztot22

HU 219 809 Β tünk és az inszertet teljesen szekvenáltuk szintetikus oligonukleotidokat használva. Az egyik plazmidot, amely a piruvátkináz promoter perfekt fúzióját tartalmazta a pepD-hez nyitott leolvasási keretben, pPKIPEPDA-nak neveztük el, és ezt használtuk pAXI-gyel az A. niger 5 kotranszformálására uridinprototrófiához.

A pki-pepD-fiizió jelenlétét igazoltuk oly módon, hogy az egyes tisztított transzformánsokból kinyertük a DNS-t és Southem-analízissel vizsgáltuk azokat pki- és pepD-próbákat alkalmazva. Azok a törzsek, amelyek 10 egy vagy több ilyen génfiiziót integráltak a genomjukba, nagyobb proteolitikus aktivitástermelést mutattak, amikor a sejtek gyorsan növekedtek glükózon, mint szénforráson.

15. példa: A pepD expressziója más mikroorganizmusban : kifejeződés élesztőben

A pTZPEPD plazmidot EcoRI-gyel hasítottuk, tompa végeket alakítottunk ki T4-polimerázzal és újraligáltuk, eltávolitva így az EcoRI hasítóhelyet a polilin- 20 kerrégióból. Az így kapott plazmidba aztán in vitro mutagenezissel négy szintetikus oligonukleotidot, az élesztőoligo 1, 2, 3 és 4-et, melyek szekvenciája a SEQ ID NO. 15., 16., 17. és 18. alatt látható a szekvencialistában, vittünk be. Az élesztőoligo 1-et beépí- 25 tettük az EcoRI hasítóhelyre közvetlenül a pepD ATGkodonja elé, míg a másik hármat a 3 intron közül az egyik teljeshez hurkoltuk. Az így készített plazmid a pTZPEPD, melynek szekvenciáját teljes szekvenálással igazoltuk.

A 2,8 kb EcoRI-BamHI fragmenst, amely éppen a pepD ATG-kodonja előtt kezdődik és befejeződik a pepD terminátor után, tisztítottunk és a kétmikronos pFBY25 élesztővektorba (deponálva DSM 7020 számon) ligáltuk az SnaBI helyre a pFBY129 (deponálva DSM 7016 számon) 520 bp BamHI-EcoRI fragmensével együtt, amely az élesztő-GALlO promotert tartalmazta. A korrekt plazmidot restrikciós emésztéssel azonosítottuk.

A 2,2 kb EcoRI-BamHI fragmenst, amely közvetlenül a pepD ATG-kodonja előtt kezdődik és a terminátorrégió után végződik, tisztítottuk és ligáltuk a pFBY129 (DSM 7016) plazmid 520 bp BamHI-EcoRI fragmensével együtt - mely az élesztő-GALlO promotert tartalmazta - a 2 mikronos pFBY25 (DSM 7020) élesztővektor SnaBI hasítóhelyére. A korrekt plazmidot restrikciós emésztéssel azonosítottuk. Ezt a pGALlOPEPD jelű plazmidot transzformáltuk élesztőbe és az pepD fehérjét termelt, ha a génfiiziót galaktózzal indukáltuk.

Letétbe helyezett mikroorganizmusok

Az alábbi mikroorganizmusokat a Budapesti Szerződés szerint helyeztük letétbe a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM), Mascheroder Weg lb, D-3300, Braunschweig, Német Szövetségi Köztársaság gyűjteményében:

Mikroorganizmus/plazmidok	Deponálási szám	Deponálás ideje
E. coli DH5alfaF’/pGW1100	DSM 5747	1990.01. 18.
E. coli BJ5138/pCG59D7	DSM 3968	1987. 02. 02.
A. niger An8	DSM 3917	1986.12. 11.
E. coli DH5alfaF’/pTZPEPC	DSM 7019	1992. 03. 30.
E. coli DH5alfaF’/pGP202	DSM 7018	1992. 03. 30.
E. coli DH5alfaF’/pFBY129	DSM 7016	1992. 03. 30.
E. coli DH5alfaF’/pAXI	DSM 7017	1992. 03. 30.
E. coli DH5alfaF’/pFBY25	DSM 7020	1992. 03. 30.
E. coli DH5alfaF’/pTZPEPD	DSM 7409	1993.01. 19.

SZEKVENCIALISTA Szekvenciák száma: 18 Információk a SEQ ID NO. 1-ről:

A szekvencia jellemzői:

hossza: 3220bázispár típusa: nukleinsav szála: kettős topológiája: lineáris

Molekulatípus: DNS (genomiális)

Eredeti fonás: organizmus: Aspergillus niger törzs: N400 Kísérleti forrás: klón: pTZPEPC

Jellemzői: szubtilizin típusú proteáz, az Aspergillus niger PEPC-je, a pepC gén terméke 1-től 377-ig: promoter 378-tól 435-ig: szignálpeptid 757-től 826-ig: intron

388-tól 756-ig és 827-től 2059-ig: érett peptidet kódoló szekvencia (magában foglalva a stopkodont)

A SEQ ID NO. 1. szekvencia leírása:

GGATCCATCC ATTCACTCAG CTTTCCTTGT CGGTGGACTG TCGAGTCTAC CCCACGTCCC 60

HU 219 809 Β

AGTTTCTCCG ACCGCGCTAA TCGGGGGCTA TCGACAACCA	GTGATTCTGC TGTGTCATCC	120
GGGCGTATGG CGTAAATTAC CGTATGCCGG TTGCATCATC	ACCTGCTGCC CTTGCCTCTT	180
GCTGAATACC GTCCGCCATC CATCTGTCCT CCTCTCCCTC	TCTCTTCATC TCCAACCTCC	240
CCTTCCTCCT CCCTCCCTCC TTCTCTTCAT CTTTATCTTG	ACCTATTTCC ATCTTTCTCA	300
TCTCTCAGTT GTTTCAATCT CTTGTACACG CCCTACTCAC	TCTCCTTTTC ACCGGGCTGC	360
TGTGGGTTCC GTCTTAAGCT ATCCATC ATG AAG GGC ATC CTC GGC CTT TCC	411

Met Lys Gly Ile Leu Gly Leu Ser -16 -15 -10

CTC Leu

CTC CCG

TTG Leu -5

CTG Leu

ACG Thr

GCT GCG

TCG Ser 1

CCC Pro

GTC Va 1

TTC Phe

GTT Va 1 5

GAC As p

TCC Ser

ATC Ile

459

Leu

Pro

Al a

Al a

CAT

AAT

GAA

GCT

GCC

CCC

ATC

TTG

TCT

GCT

ACC

AAC

GCG

AAG

GAG

GTT

507

Hi s

Asn 10

Glu

Al a

Al a

Pro

Ile 15

Leu

Ser

Al a

Thr

Asn 20

Alá

Ly s

Glu

Va 1

CCC

GAC

TCC

TAC

ATC

GTC

GTT

TTC

AAG

AAG

CAC

GTC

ACT

TCA

GAG

CTG

555

Pro 25

Asp

Ser

Tyr

Ile

Val 30

Val

Phe

Lys

Lys

Hi s 35

Va 1

Thr

Se r

Glu

Leu 40

GCT

TCG

GCT

CAC

CAC

AGC

TGG

GTG

CAG

GAC

ATC

CAT

GAC

TCT

CAG

AGC

603

Al a

Ser

Al a

Hi s

Hi s 45

Ser

Trp

Val

Gin

Asp 50

Ile

Hi s

Asp

Ser

Gin 55

Ser

GAG

CGG

ACT

GAG

CTG

AAG

AAG

CGG

TCG

CTC

TTC

GGC

CTT

GGG

GAC

GAG

651

Glu

Arg

Thr

Glu 60

Leu

Lys

Lys

Arg

Ser 65

Leu

Phe

Gly

Leu

Gly 70

Asp

Glu

GTC

TAT

CTG

GGT

CTC

AAG

AAC

ACC

TTT

GAC

ATT

GCT

GGT

TCT

CTG

ATC

699

Val

Tyr

Leu 75

Gl y

Leu

Lys

Asn

Thr 80

Phe

Asp

Ile

Alá

Gly 85

Ser

Leu

Ile

GGT

TAC

TCT

GGT

CAC

TTC

CAC

GAG

GAT

GTC

ATC

GAG

CAA

GTC

CGC

AGA

747

Gly

Tyr

Ser

Gly

Hi s

Phe

Hi s

Glu

Asp

Va 1

Ile

Glu

Gin

Val

Arg

Arg

95 100

CAC CCC GAT GTGAGTTACA CCCCCTATCT AAGCATCCCT CGTTATCTCT 796

His Pro Asp

105

AAGATAAGCT TCTAACATCG GTCAATGTAG GTC GAT TAC ATC GAG CGG GAT TCC 8 50

Val Asp Tyr Ile Glu Arg Asp Ser

110 115

GAA GTT CAC ACC

ATG Me t 120

GAA GGG GCC Glu Gly Alá

ACC Thr

GAA Glu 125

AAG Ly s

AAC Asn

GCC CCT TGG GGT

898

Glu Val

Hi s

Thr

Al a

Pro

Trp 130

Gly

CTG

GCT

CGT

ATC

TCT

CAC

CGT

GAT

AGC

CTG

ACC

TTC

GGT

AAC

TTC

AAC

946

Leu

Al a

Arg

Ile

Ser

Hi s

Arg

Asp

Ser

Leu

Thr

Phe

Gly

Asn

Phe

Asn

135 140 145

HU 219 809 Β

AAG Lys

TAC Tyr

CTG Leu 150

TAT GCC TCC

GAG Glu

GGG GGT GAG GGC GTT GAC GCC

TAC Tyr

ACC Thr

994

Tyr

Al a

Ser

Gly Gly 155

Glu

Gly

Val

Asp 160

Al a

ATT

GAC

ACG

GGT

ATC

AAC

GTT

GAC

CAC

GTT

GAC

TTC

GAG

GGC

CGT

GCC

1042

lle

As p

Thr

Gly

lle

Asn

Va 1

As p

Hi s

Val

As p

Phe

Glu

Gly

Arg

Al a

165

170

175

ACT

TGG

GGC

AAG

ACA

ATC

CCT

ACC

AAC

GAT

GAA

GAT

CTC

GAT

GGC

AAT

1090

Thr

Trp

Gly

Lys

Thr

lle

Pro

Thr

Asn

Asp

Glu

As p

Leu

As p

Gly

Asn

180

185

190

195

GGT

CAC

GGA

ACT

CAC

TGC

TCC

GGA

ACC

ATG

GCT

GGT

AAG

AAG

TAC

GGT

1138

Gly

Hi s

Gly

Thr

Hi s

Cys

Ser

Gly

Thr

Me t

Al a

Gly

Ly s

Ly s

Tyr

Gly

200

205

210

GTT

GCC

AAG

AAG

GCC

AAC

CTC

TAT

GCT

GTC

AAG

GTC

CTC

CGG

TCG

AGC

1186

Val

Al a

Ly s

Ly s

Alá

Asn

Leu

Tyr

Al a

Val

Ly s

Val

Leu

Arg

Ser

Ser

215

220

225

GGC

TCT

GGC

ACC

ATG

TCT

GAT

GTC

GTT

TCT

GGT

GTC

GAG

TAT

GCC

GTC

1234

Gly

Ser

Gly

Thr

Me t

Ser

Asp

Va 1

Va 1

Ser

Gly

Va 1

Glu

Tyr

Al a

Va 1

230

235

240

CAG

GCT

CAT

ATC

AAG

AAG

GCC

AAG

GAT

GCC

AAG

AAC

GGC

AAG

GTC

AAG

1282

Gin

Al a

His

lle

Ly s

Lys

Al a

Lys

Asp

Al a

Ly s

Asn

Gly

Ly s

Val

Ly s

245

250

255

GGA

TTC

AAG

GGC

AGC

GTT

GCC

AAC

ATG

AGT

CTC

GGT

GGT

GGC

AAG

TCT

1330

Gly

Phe

Lys

Gly

Ser

Val

Al a

As n

Me t

Ser

Leu

Gly

Gly

Gly

Ly s

Ser

260

265

270

275

AAG

ACC

CTC

GAG

GAT

GCT

GTT

AAC

GCT

GGT

GTT

GAG

GCT

GGT

CTT

CAC

1378

Lys

Thr

Leu

Glu

Asp

Al a

Val

Asn

Al a

Gly

Val

Glu

Al a

Gly

Leu

Hi s

280

285

290

TTC

GCC

GTT

GCC

GCC

GGT

AAT

GAC

AAT

GCT

GAT

GCT

TGC

AAC

TAC

TCT

1426

Phe

Al a

Val

Al a

Al a

Gly

Asn

Asp

Asn

Al a

As p

Al a

Cy s

Asn

Tyr

Ser

295

300

305

CCT

GCT

GCT

GCC

GAG

AAG

GCC

ATC

ACC

GTT

GGT

GCC

TCG

ACA

CTT

GCT

1474

Pro

Al a

Al a

Al a

Glu

Ly s

Al a

lle

Thr

Va 1

Gly

Al a

Ser

Thr

Leu

Al a

310

315

320

GAC

GAG

CGT

GCG

TAC

TTC

TCC

AAC

TAC

GGA

GAG

TGC

ACT

GAC

ATC

TTC

1522

Asp

Glu

Arg

Al a

Tyr

Phe

Ser

Asn

Tyr

Gly

Glu

Cys

Thr

As p

lle

Phe

325

330

335

GCT

CCT

GGT

CTC

AAC

ATC

CTG

TCC

ACC

TGG

ATT

GGC

AGC

AAC

TAC

GCC

1570

Al a

Pro

Gly

Leu

Asn

lle

Leu

Ser

Thr

Trp

lle

Gly

Ser

As n

Tyr

Alá

340

345

350

355

ACC

AAC

ATC

ATC

TCT

GGC

ACT

TCC

ATG

GCC

TCT

CCT

CAC

ATT

GCT

GGC

1618

Thr

As n

lle

lle

Se r

Gly

Thr

Ser

Me t

Al a

Ser

Pro

Hi s

lle

Al a

Gly

360

365

370

CTG

CTG

GCC

TAC

TTT

GTC

TCC

CTC

CAG

CCC

TCC

TCG

GAC

TCT

GCA

TTC

1666

Leu

Leu

Al a

Tyr

Phe

Val

Ser

Leu

Gin

Pro

Ser

Ser

Asp

Ser

Al a

Phe

375

380

385

HU 219 809 Β

GCT GTT GAG

GAG Glu

CTT Le u

ACT Thr

CCT GCT AAG CTG AAG AAG GAC ATC ATC GCC

1714

Al a

Val

Glu 390

Pro

Al a 395

Lys

Leu

Ly s

Lys

Asp 400

Ile

Ile

Al a

ATC

GCC

ACC

GAG

GGC

GCT

CTC

ACT

GAC

ATT

CCC

TCC

AAC

ACC

CCC

AAC

1762

Ile

Al a 405

Thr

Glu

Gly

Al a

Leu 410

Thr

Asp

Ile

Pro

Ser 415

Asn

Thr

Pro

As n

GTA

AGT

CAT

GCC

GCT

GTT

GGT

ATT

TAT

AAG

AGA

AAC

GAG

CTA

ACT

CAG

1810

Val 420

Ser

Hi s

Al a

Al a

Va 1 425

Gly

Ile

Tyr

Ly s

Arg 430

Asn

Glu

Le u

Thr

Gin 435

AAA

TTC

AGC

TCC

TTG

CCT

GGA

ACG

GTG

GTG

GTT

CCG

AGA

ACT

ACA

CCG

1858

Lys

Phe

Ser

Ser

Leu 440

Pro

Gly

Thr

Val

Va 1 445

Va 1

Pro

Arg

Thr

Thr 450

Pro

ACA

TCG

TTG

GCA

GCG

GTG

GCT

ACA

AGG

TCT

CCT

CTG

CCA

AGA

ACC

GCA

1906

Thr

Ser

Leu

Alá 455

Al a

Va 1

Al a

Thr

Arg 460

Ser

Pro

Leu

Pro

Arg 465

Thr

Al a

TCG

AGG

ACC

GTA

TTG

AGG

GTC

TCG

TTC

ACA

AGG

CCG

AAG

AGC

TGC

TCA

1954

Ser

Arg

Thr 470

Va 1

Le u

Arg

Va 1

Ser 475

Phe

Thr

Arg

Pro

Ly s 480

Ser

Cys

Ser

CCG

AGG

AGC

TTG

GTG

CCA

TCT

ACA

GCG

AGA

TCC

AGG

ATG

CCG

TCG

TCG

2002

Pro

Arg 485

Ser

Le u

Va 1

Pro

Ser 490

Thr

Al a

Arg

Ser

Arg 495

Me t

Pro

Ser

Ser

CAT

AGA

TCA

GAA

CTC

GTG

CTT

TCC

AGA

CGT

AGA

TCG

GAA

GAC

TTG

GTT

2050

Hi s

Arg

Ser

Glu

Leu

Val

Leu

Ser

Arg

Arg

Arg

Ser

Glu

As p

Leu

Val

500 505 510 515

TTT _{τττ TGAGGTATGG} GATGGTTGAT CGGACATTTT GGCGCTGGTC TCTTTTTATT 2106 Phe Phe

GTGTTTGGTC	TCGAAGACGC	TGATGCATTG	ACTGTATCGG	CTGTATCACT	CCGCCCCTGC	2166
TTATCTGTTT	GGTTCATCTT	TATGGTAGTA	TACATGTCTG	CAAAGAAGGT	TTTGTTACCT	2226
CACTTAGAAT	GTTCTGGTTC	TATAACAGAC	TGACAATCTC	ACTGGGTTAT	CTAAGAGATC	2286
TGACAAACGC	TTGGTAGAAG	AGAAAGGTGA	GGGAGTAGAC	ATCATCAGTC	TAAATCCACA	2346
TTACGACATG	CCGTAATAGA	TGAGAGCACC	GGATGCTAGC	CTTTGTAGAC	TACAAAGGAG	2406
AAAACCCCTA	GGAAAGGTAA	TTTCTAAGTC	ATGCCCACCT	ATTCTCTCTA	TCTCTTACTG	2466
AGACAGTCAA	TCCCATGACG	AACAACTAAT	GACATCATGG	GTCACGCTAC	GGGGTCATGC	2526
CGAAACGAAG	CCGAAGTACT	ACTCCTAAGT	AAAGCCACAA	CTTTGCATAC	GTTCATTCAG	2586
GAAACGGAAA	CACAGGAGGA	AGAATATTGA	AATATCTTGA	GGGGCTTCAT	ATAGAATAGA	2646
CAGATATATA	ATAGTTGTCA	AAGTATACAA	AAAGACCTCA	TGCATGCTAA	CAGATAAAGC	2706
AAAGGATCTC	ATATTGATAG	ACTGTGCTGT	ATACCACCTC	TTAATGCAGC	GCCTGCGCTA	2766
TGCCACGATG	AAATATAAAG	GGGGAAAAAG	TCATGTAAGT	AGTAAGTAGA	AACTCCAAGC	2826
GCCAAATATA	TAGATAGTAA	TAGGGGTGGC	GACATAATTT	GGCTTTTATA	CTTGATAGGT	2886

HU 219 809 Β

TGAACAAATC	AAGTGGCCCT	GTGCTCGTCT	TCCTCCTCAT	CACTGCCGGA	ATCTTGGTCT	2946
TCGTCATCGT	CATCGACGTC	AAGGTCCTCG	TCGGAGTCGC	TACCGCCGAA	GACGTCGTCG	3006
TCCACATCGC	TCTCGGCCCA	GAAGTCGGAG	TCGTCCTTCT	CCACAGGTTT	GGAGACTGTC	3066
GTGGTGGATT	CGTGAGTCGG	CATGACGAAT	CCCTCGGGAA	TATCGTTCTT	CGAATCCTCC	3126
ACGTGCTGTT	TCACGATCGA	TTTGTATTCG	TCGGGGCTCT	TGCGCAACAT	GACCGAGGCG	3186
TCAACGTTGG	CGGGGGAAGA	GATCCGGGGA	ATTC			3220

Információk a SEQ ID NO. 2-ról:

A szekvencia jellemzői: hossza: 533 aminosav típusa: aminosav topológiája: lineáris

Molekulatípus: fehérje

Jellemzői: az Aspergillus niger szubtilizin típusú PEPC proteáza, a pepC gén terméke, az érett peptid a szignál szekvenciával

A SEQ IDNO.

2. szekvencia leírása:

Me t -16

Ly s -15

Gly

Ile

Leu

Gly

Leu -10

Ser

Leu

Leu

Pro

Leu -5

Leu

Thr

Al a

Al a

Ser 1

Pro

Val

Phe

Val 5

Asp

Ser

Ile

Hi s

Asn 10

Glu

Al a

Al a

Pro

Ile 15

Leu

Ser

Al a

Thr

Asn 20

Al a

Lys

Glu

Val

Pro 25

As p

Se r

Tyr

Ile

Val 30

Val

Phe

Lys

Lys

Hi s 35

Val

Thr

Ser

Glu

Leu 40

Al a

Ser

Al a

Hi s

Hi s 45

Ser

Trp

Val

Gin

Asp 50

Ile

Hi s

As p

Ser

Gin 55

Se r

G1 u

Arg

Thr

Glu 60

Leu

Ly s

Lys

Arg

Ser 65

Leu

Phe

Gly

Leu

Gly 70

Asp

Glu

Val

Tyr

Leu 75

Gly

Leu

Lys

Asn

Thr 80

Phe

As p

Ile

Al a

Gly 85

Ser

Leu

Ile

Gly

Tyr 90

Ser

Gly

Hi s

Phe

Hi s 95

Glu

Asp

Val

Ile

Glu 100

Gin

Val

Arg

Arg

H i s 105

Pro

As p

Val

Asp

Tyr 110

Ile

Glu

Arg

Asp

Ser 115

Glu

Val

Hi s

Thr

Me t 120

Glu

G1 y

Al a

Thr

Glu 125

Ly s

Asn

Al a

Pro

Trp 130

Gly

Leu

Al a

Arg

Ile 135

Ser

Hi s

Arg

As p

Ser 140

Leu

Thr

Phe

Gly

Asn 145

Phe

Asn

Lys

Tyr

Leu 150

Tyr

Al a

Ser

Glu

Gly 155

Gly

Glu

Gly

Val

Asp 160

Al a

Tyr

Thr

Ile

As p 165

Thr

Gly

Ile

Asn

Va 1 170

As p

Hi s

Val

As p

Phe 175

Glu

Gly

Arg

Al a

Thr 180

Trp

Gly

Ly s

Thr

Ile 185

Pro

Thr

Asn

Asp

Glu 190

Asp

Leu

HU 219 809 Β

Asp

Gly

Asn 195

Gly

Hi s

Gly

Thr

Hi s 200

Cy s

Ser

Gly

Thr

Me t 205

Al a

Gly

Ly s

Ly s

Tyr 210

Gly

Val

Al a

Ly s

Ly s 215

Al a

Asn

Leu

Tyr

Al a 220

Val

Ly s

Val

Leu

Arg 225

Ser

Ser

Gly

Ser

Gly 230

Thr

Me t

Ser

As p

Val 235

Val

Ser

Gly

Val

Glu 240

Tyr

Al a

Val

Gin

Alá 245

Hi s

Ile

Ly s

Ly s

Al a 250

Ly s

As p

Al a

Ly s

Asn 255

Gly

Lys

Val

Lys

Gly 260

Phe

Lys

Gly

Ser

Val 265

Al a

As n

Me t

Ser

Leu 270

Gly

Gly

Gly

Ly s

Ser 275

Lys

Thr

Leu

Glu

Asp 280

Al a

Val

As n

Al a

Gly 285

Va 1

Glu

Al a

Gly

Le u 290

Hi s

Phe

Al a

Val

Al a 295

Al a

Gly

Asn

Asp

Asn 300

Al a

As p

Alá

Cys

Asn 305

Tyr

Ser

Pro

Al a

Alá 310

Al a

Glu

Ly s

Al a

Ile 315

Thr

Va 1

Gly

Al a

Ser 320

Thr

Le u

Al a

As p

Glu 325

Arg

Al a

Tyr

Phe

Ser 330

Asn

Tyr

Gly

Glu

Cy s 335

Thr

Asp

Ile

Phe

Al a 340

Pro

Gly

Leu

As n

Ile 345

Leu

Ser

Thr

TrP

Ile 350

Gly

Ser

Asn

Tyr

Al a 355

Thr

Asn

Ile

Ile

Ser 360

Gly

Thr

Ser

Me t

Al a 365

Ser

Pro

Hi s

Ile

Al a 370

Gly

Leu

Leu

Al a

Tyr 375

Phe

Val

Ser

Le u

Gin 380

Pro

Ser

Ser

Asp

Ser 385

Al a

Phe

Al a

Va 1

Glu 390

Glu

Leu

Thr

Pro

Alá 395

Lys

Leu

Ly s

Ly s

As p 400

Ile

Ile

Al a

Ile

Al a 405

Thr

G1 u

Gly

Al a

Leu 410

Thr

Asp

Ile

Pro

Ser 415

Asn

Thr

Pr o

Asn

Val 420

Ser

Hi s

Alá

Al a

Val 425

G1 y

Ile

Tyr

Lys

Arg 430

Asn

Glu

Leu

Thr

Gin 435

Lys

Phe

Ser

Ser

Leu 440

Pro

Gly

Thr

Val

Val 445

Va 1

Pro

Arg

Thr

Thr 450

Pro

Thr

Ser

Leu

Al a 455

Al a

Va 1

Al a

Thr

Arg 460

Ser

Pro

Leu

Pro

Arg 465

Thr

Al a

Ser

Arg

Thr 470

Va 1

Leu

Arg

Va 1

Ser 475

Phe

Thr

Arg

Pro

Ly s 480

Ser

Cy s

Ser

Pro

Arg 485

Ser

Leu

Va 1

Pro

Ser 490

Thr

Al a

Arg

Ser

Arg 495

Me t

Pro

Ser

Ser

Hi s

Arg

Ser

Glu

Leu

Va 1

Leu

Ser

Arg

Arg

Arg

Ser

Glu

500 505 510

HU 219 809 Β

Asp Leu Val Phe Phe 515

Információk a SEQ ID NO. 3-ról:

A szekvencia jellemzői:

hossza: 37 bázispár típusa: nukleinsav szála: egyes topológiája: lineáris

Molekulatípus: DNS

Jellemzői: 1-19 régió homológ az A. niger pepC-vel

20-37 régió homológ az A. niger pki-génnel

A SEQ ID NO. 3. szekvencia leírása:

GGCCGAGGAT GCCCTTCATC TTGACGGATG ATTGATC

Információk a SEQ ID NO. 4-ről:

A szekvencia jellemzői:

hossza: 44 bázispár típusa: nukleinsav szála: egyes topológiája: lineáris

Molekulatípus: DNS A SEQ ID NO. 4. szekvencia leírása:

GCCGAGGATG CCCTTCATCT TGAATTCGGA TGATTGATCT CTAC

Információk a SEQ ID NO. 5-ről:

A szekvencia jellemzői:

hossza: 32 bázispár típusa: nukleinsav szála: egyes topológiája: lineáris

Molekulatípus: DNS A SEQ ID NO. 5. szekvencia leírása:

GCTCGATGTA ATCGACATCG GGGTGTCTGC GG

Információk a SEQ ID NO. 6. szekvenciáról:

A szekvencia jellemzői:

hossza: 2993 bázispár típusa: nukleinsav szála: kettős topológiája: lineáris

Molekulatípus: DNS (genomiális)

Eredeti forrás: Aspergillus niger N400 törzs Közvetlen forrás: pTZPEPD klón

Jellemzői: az Aspergillus niger PEPD szubtilizin típusú proteáza, a pepD gén terméke 1-től 829-ig: promoter

830-1153, 1205-1649, 1697-1785, 1841-2233: kódolószekvenciák, magában foglalva a stopko dönt is

1154-1204,1650-1696,1786-1840: intronok A SEQ ID NO. 6. szekvencia leírása:

AAGCTTCGTA	TATAATTCCC	TTTTGACAAT	GTCAAAATCT	TTTGGACCAC	TAATATAGCT	60
GCATGGACCG	GTTAATCAGA	GGTTATTTTT	GTGCTCGAAT	GCCGTGTAAC	ATTGGATAAT	120
AGTACACTCC	TTTCACCCAC	CCTCAGATGC	CCGCCCCCTA	CAGTAGGGTT	GTCAATATCC	180

HU 219 809 Β

CTCACCTTTC	CAATTGCTGA TGCAGAATGG ACCTGATATA GAAGCCTCAC AGCACCAGAG	240
ACTACCGCCT	GAAGATGCCA AGTATTGATG GGTTACATTG GCTGGCGAAT AGACTGTTCA	300
CCATCCCCCG	CCTGTACAAG GCTCATTGAG CGACCTTTAT TTCTATGAAG GCTTCTTGCA	360
GTGTAGAGCC	GCTGTTTAGA ACTCGGAAAT AGGCGTGCAT AGTATGAACT CAATCAGCAG	420
AGTCAATCGA	TTGACACTAA CGCCTAGCAA GCAATCAGTG CTCAGAGGAA GCTAACAGAT	480
GGCTGGTTAA	GCTGCCCCAG AAACGAAATG TGTCCGCAAT CCCATCCCTG CATGCTTATC	540
TGTATTCTGT	GCATGCATGA TGCTTTCCTC ACGGGGCATT ACCCAGTAGT CCGAAGACGC	600
AATGTGACCA	TCTGACTGAG TTTTAAATAT ACTGTCCAAG TGCCTTCTGA CCCGGTCCCC	660
GCTTGATGAC	AATCAACAAA AGGTGAATGT GACTGAAAGG CGTGGTCCAG ACAACAGGCC	720
TTAGACTTTA	TTGTGAGACT ATAAAAGGAT CTAACTATTG CACTACTGAA ATTAAGCATT	780
CTAGTCTACC	ATTGACATTT CTCCCCTTTC GGTGGGCCAC TCGCTCAAC ATG GCT	835

Met Alá 1

TTC CTC

AAA Lys 5

CGC ATT CTC

CCG Pro

CTG CTG GCC

CTC ATC

TTG Leu 15

CCT Pro

GCA Al a

GTT Va 1

883

Phe

Leu

Arg

Ile

Leu

Leu 10

Leu

Al a

Leu

Ile

TTC

AGT

GCC

ACA

GAA

CAG

GTC

CCT

CAT

CCG

ACC

ATC

CAG

ACC

ATC

CCG

931

Phe

Ser

Al a

Thr

Glu

Gin

Val

Pro

Hi s

Pro

Thr

Ile

Gin

Thr

Ile

Pro

20

25

30

GGG

AAG

TAC

ATT

GTT

ACT

TTC

AAG

TCC

GGC

ATT

GAC

AAT

GCG

AAA

ATT

979

Gly

Ly s

Tyr

Ile

Va 1

Thr

Phe

Lys

Ser

Gly

Ile

Asp

Asn

Al a

Lys

Ile

35

40

45

50

GAG

TCT

CAT

GCC

GCA

TGG

GTA

ACG

GAG

CTC

CAC

AGG

CGC

AGC

TTA

GAA

1027

Glu

Ser

Hi s

Al a

Al a

Trp

Val

Thr

Glu

Leu

Hi s

Arg

Arg

Ser

Leu

Glu

55

60

65

GGC

CGC

AGT

ACA

ACC

GAA

GAT

GAC

CTT

CCC

GCC

GGG

ATC

GAG

AGA

ACT

1075

Gly

Arg

Ser

Thr

Thr

Glu

Asp

As p

Leu

Pro

Al a

Gly

Ile

Glu

Arg

Thr

70

75

80

TAC

AGA

ATT

GCC

AAT

TTT

GCT

GGG

TAC

GCG

GGG

TCT

TTC

GAT

GAG

AAA

1123

Tyr

Arg

Ile

Alá

As n

Phe

Al a

Gly

Tyr

Al a

Gly

Ser

Phe

Asp

Glu

Lys

85

90

95

ACT

ATC

GAG

GAG

ATC

CGC

AAA

CAT

AAC

CAT

GTTTGTGTCC ACGTATCCCA

1173

Thr

Ile

Glu

Glu

I 1 e

Arg

Ly s

Hi s

Asn

Hi s

100 105

GGCCGTATGG TTTCGACTAA CTGCTGTACA G GTA GCC TAT GTG GAA CAA GAT 1225 Val Alá Tyr Val Glu Gin Asp

110 115

CAG GTC TGG TAC CTC GAT ACG CTA GTT ACC GAA AGA CGA GCT CCT TGG 1273

Gin Val Trp Tyr Leu Asp Thr Leu Val Thr Glu Arg Arg Alá Pro Trp

120 125 130

HU 219 809 Β

GGA CTG

GGG Gly

AGC ATC

TCT Ser

CAC CGT GGT GCG

TCT Ser

AGC Ser

ACC Thr

GAC As p 145

TAC Tyr

ATC lle

1321

Gly

Leu

Ser 135

lle

Hi s

Arg

Gly 140

Al a

TAT

GAT

GAC

AGC

GCT

GGG

GAG

GGT

ACA

TAC

GCT

TAT

GTA

GTG

GAC

ACT

1369

Tyr

As p

Asp 150

Ser

Al a

Gly

Glu

Gly 155

Thr

Tyr

Al a

Tyr

Va 1 160

Va 1

Asp

Thr

GGC

ATC

TTG

GCT

ACG

CAT

AAT

GAG

TTT

GGT

GGT

CGT

GCT

AGC

CTG

GCA

1417

Gly

lle 165

Leu

Alá

Thr

Hi s

Asn 170

Glu

Phe

Gly

Gly

Arg 175

Al a

Ser

Leu

Al a

TAC

AAT

GCT

GCA

GGG

GGT

GAG

CAC

GTT

GAT

GGT

GTT

GGA

CAT

GGC

ACA

1465

Tyr 180

Asn

Alá

Al a

Gly

Gly 185

Glu

Hi s

Val

As p

Gly 190

Val

Gl y

Hi s

Gly

Thr 195

CAT

GTA

GCA

GGG

ACC

ATC

GGT

GGC

AAA

ACA

TAC

GGG

GTT

TCG

AAA

AAT

1513

Hí s

Va 1

Alá

Gly

Thr 200

lle

Gly

Gly

Lys

Thr 205

Tyr

Gly

Va 1

Ser

Ly s 210

Asn

GCT

CAC

CTA

CTG

TCC

GTG

AAG

GTG

TTT

GTA

GGT

GAA

TCC

AGC

TCG

ACA

1561

Al a

Hi s

Leu

Leu 215

Se r

Val

Lys

Val

Phe 220

Val

Gly

Glu

Ser

Se r 225

Ser

Thr

TCG

GTC

ATT

CTG

GAT

GGC

TTC

AAT

TGG

GCT

GCC

AAT

GAT

ATC

GTG

AGC

1609

Ser

Val

lle 230

Leu

As p

Gly

Phe

Asn 235

Trp

Al a

Al a

Asn

As p 240

lle

Va 1

Ser

AAG Lys

AAC As n 245

CGG Arg

ACC Thr

AGT Ser

AAG Lys

GCG Al a 250

GCG Al a

ATT lle

AAC Asn

ATG Me t

AGT Ser 255

CTT Leu

G GTATGTGCGC

1659

CCTCTCTGGG GATCTAATGC CGTTAACCGT GATGCAG GT Gly

GGA Gly

GGC Gly

TAC Tyr 260

TCC Ser

TAT Tyr

1713

GCG

TTT

AAC

AAT

GCA

GTT

GAG

AAT

GCT

TTT

GAC

GAG

GGT

GTG

CTC

TCT

1761

Al a

Phe

Asn 265

Asn

Al a

Val

Glu

As n 270

Alá

Phe

Asp

Glu

Gly 275

Val

Leu

Ser

TGT Cys

GTT Va 1 280

GCC Al a

GCT Al a

GGA Gly

AAT Asn

GAG Glu 285

AAT Asn

GTAAGCTCTG CTGAACTGTC CACCATTGAG

1815

CTAAATTTAG ACTAATGTTT TGCAG

AGA Arg

GAT As p

GCA Al a

GCA Al a 290

CGG Arg

ACT Thr

AGC Ser

CCG Pro

GCT Al a 295

1867

TCT

GCA

CCC

GAC

GCC

ATT

ACT

GTT

GCC

GCT

ATC

AAC

AGA

AGC

AAT

GCC

1915

Ser

Al a

Pro

Asp

Al a 300

lle

Thr

Val

Al a

Al a 305

lle

Asn

Arg

Ser

Asn 310

Al a

CGT

GCG

TCA

TTC

TCA

AAC

TAC

GGC

TCT

GTG

GTT

GAC

ATT

TTT

GCC

CCG

1963

Arg

Al a

Ser

Phe 315

Ser

Asn

Tyr

Gly

Ser 320

Va 1

Va 1

As p

lle

Phe 325

Al a

Pro

GGA

GAG

CAA

GTA

CTT

TCT

GCA

TGG

ACC

GGC

TCG

AAC

TCG

GCC

ACC

AAC

2011

Gly

Gl u

Gin 330

Val

Leu

Ser

Al a

Trp 335

Thr

Gly

Ser

Asn

Ser 340

Al a

Thr

Asn

HU 219 809 Β

ACG ATC TCC GGC

ACG TCC ATG GCT

ACA Thr

CCT Pro

CAT Hi s

GTG Val 355

ACA Thr

GGT Gly

TTG Leu

ATC I le

2059

Thr

I le 345

Ser

Gly

Thr

Ser Met 350

Al a

CTC

TAT

TTG

ATG

GGC

TTG

CGG

GAC

CTT

GCT

ACC

CCA

GCG

GCT

GCA

ACG

2107

Leu

Tyr

Leu

Me t

Gly

Leu

Arg

As p

Leu

Alá

Thr

Pro

Al a

Al a

Al a

Thr

360

365

370

375

ACC

GAG

CTC

AAG

AGG

TTG

GCT

ACG

CGG

AAT

GCT

GTC

ACC

AAT

GTG

GCG

2155

Thr

Glu

Leu

Lys

Arg

Leu

Al a

Thr

Arg

Asn

Al a

Va 1

Thr

Asn

Va 1

Al a

380

385

390

GGT

AGC

CCC

AAT

CTT

CTG

GCC

TAC

AAT

GGA

AAC

AGC

GGC

GTG

TCA

AAA

2203

Gly

Ser

Pro

Asn

Leu

Leu

Al a

Tyr

Asn

Gly

Asn

Ser

Gly

Va 1

Ser

Lys

395

400

405

GGG

GGT

AGC

GAT

GAT

GGA

GAT

GAG

GAC

TAGGTGCGTA ACATGAGTGA

2250

Gly

Gly

Ser

Asp

As p

Gly

Asp

Glu

Asp

410 415

ATATGGCTTA	GAATAGTGGG	GATCGGAGAG	TAGACTAGTT	TATATGCGAA	ATAAAGTGTG	2310
TATCAGCACC	CTGGCCTGTT	CATGTAAGTC	GGCATTTTCA	CTTTTGCCGA	CACCGCAAAT	2370
ATGCTGTGCT	TGAGGCTGTT	GCCTCCCCAG	CCAGCCTTCC	CGAGACTGAA	ACTCACACAT	2430
CCATTGGATG	TATAAAGTTC	TGCACATGCG	AAATGCCGCT	GCCGCTTACC	TCCCGACGTG	2490
GTACCGGACC	GAAGGCAGAC	ACAGATCATG	GACCGCTATA	CCGCACAGAC	AACTTGTGCT	2550
CCTTACTGAA	AGTACCATTC	CACAGGTCAT	TGCAGCATGA	TGAGTGATGA	TGTACTTCTC	2610
CCCATCAAGA	ACCACTGACG	GTGGTTGGAA	TGAATCTAGA	TCAAAGAGAT	CAACCGCTTC	2670
CCCAGACAGA	TCAGGCCTAT	GCCCATAATG	AACCGGTGAC	TGTGTAACCC	TGTTACAATC	2730
CGTTTGTTAT	TGGTCCTTTC	TGTTTGCTGG	ATGGCGTGTA	CTACCTCAGA	GCTTGTGCTC	2790
CTAGGAGCTC	ATACTGGAGA	CAGGTTCTTG	TATATAGTCA	TAGCCTAAGT	CCGGTGTCTA	2850
GGAAACAGTA	TGCTCGAGGT	CTTTTCCGAT	TCTCACAATG	AGAACTGTCG	CCCGGGTCTT	2910
TACGGCCCCT	GTGGAAAGCG	AAAAGGAGAC	GCTTCTGGCG	CTGCTTCCGC	AATACGGGCT	2970
CAAACTAGCC	CCGGACGGGA	TCC				2993

Információk a SEQ ID NO. 7. szekvenciáról: hossza: 417 aminosav típusa: aminosav topológiája: lineáris

Molekulatípus: fehérje

Jellemzői: az Aspergillus niger szubtilizin típusú PEPD proteáza, a pepC gén terméke, érett peptid a szignálszek venciával

A SEQ ID NO. 7. szekvencia leírása:

Met Alá Phe Leu Lys Arg 1 le Leu Pro Leu Leu Alá Leu I le Leu Pro

10 15

Alá Val Phe Ser Alá Thr Glu Gin Val Pro His Pro Thr I le Gin Thr 20 25 30

HU 219 809 Β

He

Pro

Gly 35

Ly s

Tyr

Ile

Val

Thr 40

Phe

Ly s

Ser

Gly

Ile 45

As p

Asn

Al a

Lys

Ile 50

Glu

Ser

Hi s

Al a

Al a 55

Trp

Va 1

Thr

Glu

Leu 60

Hi s

Arg

Arg

Ser

Leu 65

Glu

Gly

Arg

Ser

Thr 70

Thr

Gl u

Asp

Asp

Le u 75

Pro

Al a

Gly

Ile

Glu 80

Arg

Thr

Tyr

Arg

11 e 85

Al a

Asn

Phe

Al a

Gly 90

Tyr

Al a

Gly

Ser

Phe 95

Asp

Glu

Lys

Thr

Ile 100

Glu

Glu

Ile

Arg

Ly s 105

Hi s

Asn

Hi s

Val

Al a 110

Tyr

Val

Glu

Gin

As p 115

Gin

Va 1

Trp

Tyr

Leu 120

As p

Thr

Leu

Val

Thr 125

Glu

Arg

Arg

Al a

Pro 130

Trp

Gly

Leu

Gly

Ser 135

Ile

Ser

Hi s

Arg

Gly 140

Al a

Ser

Ser

Thr

Asp 145

Tyr

Ile

Tyr

As p

Asp 150

Ser

Al a

Gl y

Glu

Gly 155

Thr

Tyr

Al a

Tyr

Va 1 160

Va 1

As p

Thr

Gly

Ile 165

Leu

Al a

Thr

Hi s

As n 170

Glu

Phe

Gly

Gly

Arg 1 75

Al a

Ser

Leu

Al a

Tyr 180

Asn

Al a

Al a

Gly

Gl y 185

Gl u

Hi s

Val

As p

Gly 190

Va 1

Gly

Hi s

Gly

Thr 195

Hi s

Va 1

Al a

Gly

Thr 200

Ile

Gly

Gly

Lys

Thr 205

Tyr

Gly

Val

Ser

Ly s 210

Asn

Al a

Hi s

Leu

Leu 215

Ser

Val

Lys

Val

Phe 220

Val

Gly

Glu

Ser

Ser 225

Ser

Thr

Ser

Va 1

Ile 230

Leu

As p

Gly

Phe

As n 235

Trp

Al a

Alá

Asn

Asp 240

Ile

Val

Ser

Ly s

Asn 245

Arg

Thr

Ser

Ly s

Al a 250

Al a

Ile

Asn

Me t

Ser 255

Leu

Gly

Gly

Gly

Tyr 260

Ser

Tyr

Al a

Phe

Asn 265

Asn

Al a

Val

Glu

As n 270

Alá

Phe

Asp

Glu

Gl y 275

Va 1

Leu

Ser

Cys

Va 1 280

Al a

Alá

Gly

Asn

Glu 285

As n

Arg

As p

Al a

Alá 290

Arg

Thr

Ser

Pro

Al a 295

Ser

Al a

Pro

Asp

Al a 300

Ile

Thr

Val

Al a

Al a 305

Ile

Asn

Arg

Ser

Asn 310

Al a

Arg

Al a

Ser

Phe 315

Ser

Asn

Tyr

Gly

Ser 320

Val

Val

Asp

Ile

Phe 325

Alá

Pro

Gly

Glu

Gin 330

Val

Leu

Ser

Al a

Trp 335

Thr

Gly

Ser

Asn

Ser 340

Al a

Thr

Asn

Thr

I le 345

Ser

Gly

Thr

Ser

Me t 350

Al a

Thr

HU 219 809 Β

Pro

Hi s

Val

Thr

Gly

Leu

Ile

Leu

Tyr

Leu

Me t

Gly

Leu

Ar

g

As p

Leu

355

360

365

Al a

Thr

Pro

Al a

Al a

Al a

Thr

Thr

Glu

Leu

Ly s

Arg

Leu

Al

a

Thr

Arg

370

375

380

Asn

Al a

Val

Thr

Asn

Va 1

Al a

Gly

Ser

Pro

As n

Leu

Leu

Al

a

Tyr

Asn

385

390

395

400

Gly

Asn

Ser

Gly

Va 1

Ser

Ly s

Gly

Gly

Ser

As p

Asp

Gly

As

P

Glu

As p

405

410

415

Információk a SEQ ID NO. 3. szekvenciáról: A szekvencia jellemzői:

hossza: 26 bázispár típusa: nukleinsav szála: egyes topológiája: lineáris

Molekulatípus: DNS A SEQ ID NO. 8. szekvencia leírása:

GCTGGATCCC AYGGNACNCA YGTNGC

Információk a SEQ ID NO. 9. szekvenciáról: A szekvencia jellemzői:

hossza: 26 bázispár típusa: nukleinsav szála: egyes topológiája: lineáris

Molekulatípus: DNS A SEQ ID NO. 9. szekvencia leírása:

GCTGGATCCC AYGGNANCA YTGYGC

Információk a SEQ ID NO. 10. szekvenciáról: A szekvencia jellemzői:

hossza: 23 bázispár típusa : nukleinsav szála: egyes topológiája: lineáris

Molekulatípus: DNS A SEQ ID NO. 10. szekvencia leírása:

CTAGAATTCG CCATNGANGT NCC

Információk a SEQ ID NO. 11. szekvenciáról: A szekvencia jellemzői:

hossza: 23 bázispár típusa: nukleinsav szála: egyes topológiája: lineáris

Molekulatípus: DNS A SEQ ID NO. 11. szekvencia leírása:

CTAGAATTCG CCATRCTNGT NCC

Információk a SEQ ID NO. 12. szekvenciáról: A szekvencia jellemzői:

hossza: 17 bázispár típusa: nukleinsav

HU 219 809 Β szála: egyes topológiája: lineáris

Molekulatípus: DNS A SEQID NO. 12. szekvencia leírása:

AGAATGGATC CGCGACG

Információk a SEQ ID NO. 13. szekvenciáról:

A szekvencia jellemzői:

hossza: 27 bázispár típusa: nukleinsav szála: egyes topológiája: lineáris

Molekulatípus: DNS

Jellemzői: 1-12 régió homológ az A. niger pepD-vel

10-27 régió homológ az A. niger pki-génnel

A SEQ ID NO. 13. szekvencia leírása:

GAGGAAAGCC ATCTTGACGG ATGATTG

Információk a SEQ ID NO. 14. szekvenciáról:

A szekvencia jellemzői:

hossza: 29 bázispár típusa: nukleinsav szála: egyes topológiája: lineáris

Molekulatípus: DNS

Jellemzői: 1-10 régió homológ az A. niger pki-génnel 8-27 régió homológ az A. niger pepD génnel

A SEQ ID NO. 14. szekvencia leírása:

CGTCAAGATG GCTTTCCTCA AACGCATTC

Információk a SEQ ID NO. 15. szekvenciáról:

A szekvencia jellemzői:

hossza: 31 bázispár típusa: nukleinsav szála: egyes topológiája: lineáris

Molekulatípus: DNS A SEQ ID NO. 15. szekvencia leírása:

GGTGGGCCAC GAATTCAACA TGGCTTTCCT C

Információk a SEQ ID NO. 16. szekvenciáról:

A szekvencia jellemzői:

hossza: 41 bázispár típusa: nukleinsav szála: egyes topológiája: lineáris

Molekulatípus: DNS A SEQ ID NO. 16. szekvencia leírása:

GGAGATCCGC AAACATAACC ATGTAGCCTA TGTGGAACAA G

Információk a SEQ ID NO. 17. szekvenciáról:

A szekvencia jellemzői:

hossza: 40 bázispár típusa: nukleinsav

HU 219 809 Β szála: egyes topológiája: lineáris

Molekulatípus: DNS A SEQID NO. 17. szekvencia leírása:

GGCGATTAAC ATGAGTCTTG GTGGAGGCTA CTCCTATGCG

Információk a SEQ ID NO. 18. szekvenciáról:

A szekvencia jellemzői:

hossza: 40 bázispár típusa: nukleinsav szála: egyes topológiája: lineáris

Molekulatípus: DNS A SEQ ID NO. 18. szekvencia leírása:

GCCGCTGGAA ATGAGAATAG AGATGCAGCA CGGACTAGCC

Claims (34)

1. Eljárás izolált DNS-molekula előállítására, amely magában foglal egy szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázt kódoló DNS-szekvenciát, azzal jellemezve, hogy az ilyen DNS-molekulával transzformált gazdasejtet tenyésztjük, és a gazdasejtből izoláljuk a kívánt DNS-molekulát.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azon DNS-molekula előállítására, amely magában foglalja a 2. vagy 7. azonosítási számú aminosavszekvenciával rendelkező Aspergillus niger szerinproteázt kódoló DNS-szekvenciát, azzal jellemezve, hogy az ilyen DNS-molekulával transzformált gazdasejtet tenyésztjük, és a gazdasejtből izoláljuk a kívánt DNS-molekulát.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás azon DNS-molekula előállítására, amely magában foglalja az 1. azonosítási számú pepC kódolórégiójának megfelelő vagy a 6. azonosítási számú pepD kódolórégiójának megfelelő DNS-szekvenciát, azzal jellemezve, hogy az ilyen DNSmolekulával transzformált gazdasejtet tenyésztjük, és a gazdasejtből izoláljuk a kívánt DNS-molekulát.

4. Eljárás hibrid vektor előállítására, amely magában foglal egy szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázt kódoló DNS-szekvenciát, azzal jellemezve, hogy a nevezett hibrid vektorral transzformált gazdasejtet tenyésztjük, és a hibrid vektort a gazdasejtből izoláljuk.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás azon hibrid vektor előállítására, amely magában foglal egy szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázt kódoló DNS-szekvenciát, működőképesen kapcsolva olyan szabályozószekvenciákkal, melyek lehetővé teszik a nevezett DNSszekvencia kifejeződését alkalmas gazdasejtben, azzal jellemezve, hogy a nevezett hibrid vektorral transzformáit gazdasejtet tenyésztjük, és a hibrid vektort a gazdasejtből izoláljuk.

6. A 4. igénypont szerinti eljárás azon hibrid vektor előállítására, amely magában foglal egy szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázt kódoló DNS-szekvenciát, működőképesen kapcsolva olyan szabályozószekvenciákkal, melyek alkalmasak ezen DNS-szekvencia egy Aspergillus törzsben történő kifejezésére, azzal jellemezve, hogy a nevezett hibrid vektorral transzformáit gazdasejtet tenyésztjük, és a hibrid vektort a gazdasejtből izoláljuk.

7. A 6. igénypont szerinti eljárás azon hibrid vektor előállítására, amely magában foglal egy, egy szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázt kódoló DNS-szekvenciával homológ promotert, azzal jellemezve, hogy a nevezett hibrid vektorral transzformált gazdasejtet tenyésztjük, és a hibrid vektort a gazdasejtből izoláljuk.

8. Az 5. igénypont szerinti eljárás azon hibrid vektor előállítására, amelyben a promoter heterológ a szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázt kódoló DNS-szekvenciával, azzal jellemezve, hogy a nevezett hibrid vektorral transzformált gazdasejtet tenyésztjük, és a hibrid vektort a gazdasejtből izoláljuk.

9. Eljárás egy Aspergillus niger törzs előállítására, amelyből hiányzik a szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázgén, azzal jellemezve, hogy az endogén kromoszomális, szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázgént mutáljuk.

10. A 9. igénypont szerinti eljárás azon Aspergillus niger törzs előállítására, amelyből hiányzik az 1. szekvenciájú pepC gén vagy azon Aspergillus niger törzs előállítására, amelyből hiányzik a 6. szekvenciájú pepD gén vagy mindkettő, azzal jellemezve, hogy az endogén kromoszomális, szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázgént mutáljuk.

11. A 9. igénypont szerinti eljárás egy Aspergillus niger törzs előállítására, amelyből hiányzik a szubtilizin típusú szerinproteázgén, azzal jellemezve, hogy a szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázgént in vitro mutagenezissel mutáljuk, az in vitro mutált génnel egy Aspergillus niger gazdasejtet transzformálunk, amely hordozza a szubtilizin típusú szerinproteáznak megfelelő endogén kromoszomális gént, és azokat a mutánsokat izoláljuk, melyekben az endogén gén az in vitro mutált génnel van helyettesítve.

12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan Aspergillus niger gazdasejtet transzfor36

HU 219 809 Β málunk, amelyben az endogén gén az Aspergillus niger 1. szekvenciájú pepC génje vagy az Aspergillus niger 6. szekvenciájú pepD génje vagy mind a pepC, mind a pepD gén.

13. Eljárás polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy Aspergillus niger törzset, amelyből hiányzik egy szubtilizin típusú szerinproteázgén, transzformálunk egy expressziós vektorral, amely egy, a kívánt polipeptid kifejezésére alkalmas expressziós kazettát hordoz, a transzformált Aspergillus niger törzset tenyésztjük a kívánt polipeptid kifejezésére alkalmas körülmények között, és a kívánt polipeptidet izoláljuk.

14. Eljárás egy szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteáz előállítására, azzal jellemezve, hogy egy hibrid expressziós vektorral transzformált megfelelő gazdasejtet, amely tartalmazza a szubtilizin típusú Asp. niger szerinproteázt kódoló DNS-szekvenciát, működőképesen kapcsolva ezen DNS-szekvencia gazdasejtben való kifejezésére alkalmas szabályozóelemekkel, tenyésztünk.

15. A 14. igénypont szerinti eljárás a 2. szekvenciájú PEPC és a 7. szekvenciájú PEPD szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteáz előállítására, azzal jellemezve, hogy az ezen szekvenciákat tartalmazó gazdasejtet tenyésztjük.

16. Eljárás transzformált gazdasejt előállítására, amelyet olyan hibrid expressziós vektorral transzformálunk, amely tartalmaz egy szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázt kódoló DNS-szekvenciát, működőképesen kapcsolva szabályozóelemekkel, azzal jellemezve, hogy a megfelelő gazdasejtet egy ilyen hibrid expreszsziós vektorral transzformáljuk a DNS-szekvencia gazdasejtben való kifejeződését lehetővé tevő körülmények között.

17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzformálandó gazdaszervezetként egy Aspergillus törzset alkalmazunk.

18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy Aspergillus niger törzset transzformálunk egy olyan hibrid expressziós vektorral, amely tartalmaz egy, a kívánt, szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázt kódoló DNS-szekvenciával homológ promotert.

19. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy Aspergillus niger törzset transzformálunk egy olyan hibrid expressziós vektorral, amely a kívánt, szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázt kódoló DNS-szekvenciával heterológ promotert tartalmaz.

20. Izolált DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy magában foglal egy szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázt kódoló DNS-szekvenciát.

21. A 20. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy magában foglalja a 2. vagy a 7. aminosavszekvenciával rendelkező, Aspergillus niger szerinproteázt kódoló DNS-szekvenciát.

22. A 21. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy magában foglalja az 1. pepC vagy a 6. pepC kódolórégiójának megfelelő DNS-szekvenciát.

23. A 20. igénypont szerinti DNS-molekulát tartalmazó hibrid vektor, azzal jellemezve, hogy magában foglal egy szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázt kódoló DNS-szekvenciát.

24. A 23. igénypont szerinti hibrid vektor, azzal jellemezve, hogy magában foglal egy szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázt kódoló DNS-szekvenciát, működőképesen összekapcsolva olyan szabályozószekvenciákkal, amelyek lehetővé teszik a nevezett DNS-szekvencia kifejeződését megfelelő gazdasejtben.

25. A 24. igénypont szerinti hibrid vektor, azzal jellemezve, hogy ebben egy szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázt kódoló DNS-szekvencia működőképesen összekapcsolódik olyan szabályozószekvenciákkal, amelyek alkalmasak ezen DNS-szekvencia Aspergillus nigerben való kifejezésére.

26. A 25. igénypont szerinti hibrid vektor, azzal jellemezve, hogy magában foglal egy, szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázt kódoló keresett DNSszekvenciával homológ promotert.

27. A 24. igénypont szerinti hibrid vektor, azzal jellemezve, hogy ebben a promoter heterológ a szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázt kódoló keresett DNS-szekvenciával.

28. Aspergillus niger törzs, azzal jellemezve, hogy nem tartalmazza a szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázgént.

29. A 28. igénypont szerinti Aspergillus niger törzs, azzal jellemezve, hogy ebből hiányzik az 1. szekvenciájú pepC gén vagy a 6. szekvenciájú pepD gén, vagy mind az 1., mind 6. szekvenciájú pepC, illetve pepD gén.

30. Szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteáz, azzal jellemezve, hogy szekvenciája a 2. szekvenciájú pepC-vel vagy a 7. szekvenciájú pepD-vel azonos.

31. Hibrid expressziós vektorral transzformált gazdaszervezet, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázt kódoló DNS-szekvenciát, működőképesen összekapcsolva szabályozóelemekkel, amelyek lehetővé teszik az említett DNS-szekvencia kifejeződését az említett gazdaszervezetben.

32. A 31. igénypont szerinti gazdaszervezet, azzal jellemezve, hogy ez egy Aspergillus niger törzs.

33. A 32. igénypont szerinti gazdaszervezet, azzal jellemezve, hogy ezt olyan hibrid expressziós vektorral transzformáltuk, amely a szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázt kódoló DNS-szekvenciával homológ promotert tartalmaz.

34. A 32. igénypont szerinti gazdaszervezet, azzal jellemezve, hogy ezt olyan hibrid expressziós vektorral transzformáltuk, amely a szubtilizin típusú Aspergillus niger szerinproteázt kódoló DNS-szekvenciával heterológ promotert tartalmaz.