JP2003235591A - 菌類プロテアーゼ - Google Patents

菌類プロテアーゼ

Info

Publication number
JP2003235591A
JP2003235591A JP2003026301A JP2003026301A JP2003235591A JP 2003235591 A JP2003235591 A JP 2003235591A JP 2003026301 A JP2003026301 A JP 2003026301A JP 2003026301 A JP2003026301 A JP 2003026301A JP 2003235591 A JP2003235591 A JP 2003235591A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
gene
dna
aspergillus
ala
subtilisin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2003026301A
Other languages
English (en)
Other versions
JP3636455B2 (ja
Inventor
Frank Buxton
バクストン フランク
Albert Hinnen
ヒンネン アルベルト
Jacob Visser
ビザー ヤコブ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis AG
Original Assignee
Novartis AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB939305097A external-priority patent/GB9305097D0/en
Application filed by Novartis AG filed Critical Novartis AG
Publication of JP2003235591A publication Critical patent/JP2003235591A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3636455B2 publication Critical patent/JP3636455B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C12N9/62—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from Aspergillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規ＤＮＡ配列及び変異株に関する。 【解決手段】 スブチリシン型のアスペルギラスセリン
プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列及びその調製方法
に関する。さらに、本発明は、非相同タンパク質の発現
のために有用である、スブチリシン型のセリンプロテア
ーゼにおいて欠陥性のアスペルギラス変異株及びそれら
の調製方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、スブチリシン型のアスペルギラ
ス ニガーセリンプロテアーゼをコードする新規ＤＮＡ
配列、スブチリシン型のアスペルギラスセリンプロテア
ーゼ自体及びそれらの調製方法に関する。本発明はさら
に、非相同タンパク質の発現のために有用である、スブ
チリシン型のセリンプロテアーゼにおいて欠陥性の新規
アスペルギラス変異体株、及びそのような変異体株の調
製方法に関する。
【０００２】発明の背景 アスペルギラス 種及び特にアスペルギラス ニガーは、
食品加工産業において使用される酵素の産業的製造のた
めに使用される。Ａ．ニガーは、タンパク質の分泌のた
めの高い能力のために、及びシステムはその分子遺伝子
操作のために利用できるので、組換えタンパク質の生成
のための宿主として好都合である。しかしながら、培養
流体におけるプロテアーゼの存在は、Ａ．ニガーにおけ
る非相同タンパク質の発現に対して有害であることがわ
かっており；実際、アスペルギラスはプロテアーゼを生
成するために商業的には使用される。アスペルギラスか
らの多くの細胞外プロテアーゼは文献にこれまで記載さ
れて来た〔Barthomeufなど. 、Biotech.Tech. ２：29−
34 (1988) ；Barthomeufなど. 、Chem.Pharm Bull.(Tok
yo) 37：1333−1336 (1986) ；Bosmann,H.B., Biochim.
Biophys.Acta 293：476−489 (1973)；Ichishima,E., B
iochim.Biophys.Acta 258： 274−288 (1972)； Chopr
a,S.,and Mehta,P., Folia Microbiol. 30： 117−125
(1985)；Krishnan and Vijayalakshimi,J. Chromatogr.
329： 165−170 (1985)〕。アスペルギラス アワモリ
（Aspergillus awamori）からのアスペルギロペプシン
Ａをコードする遺伝子ｐｅｐＡが最近クローン化されて
いる〔 Berkaなど. 、 Gene 86： 153〜162 (1990)〕。
そのｐｅｐＡ遺伝子生成物は、Ａ．ニガーの分泌された
酸プロテアーゼの主要部分を占め、そしてｐｅｐＡ遺伝
子が欠失した株は、Ａ．ニガー var. アワモリにおける
非相同タンパク質の高められた発現を可能にした〔Dunn
-Colemanなど. 、Biotechnology ９： 976〜981 (199
1)〕。他のプロテアーゼ遺伝子はまた最近、アスペルギ
ラスからクローン化されており、そしてこれらはＡ．オ
リザエ（A.oryzae) のアルカリセリンプロテアーゼ〔 T
atsumiなど.、Mol.Gen.Genet. 219：33〜38 (1989)
〕、Ａ．フミガタス（A.fumigatus ) のアルカリセリ
ンプロテアーゼ〔Jaton-Ogayなど. 、 FEMS Microbiol
Letts 92：163〜168 (1992)〕、Ａ．ニガー var. マク
ロスポラス (A.niger var. macrosporus) からの非ペプ
シンタイプ型プロテアーゼ〔 Inoueなど. 、J.Biol.Che
m. 266： 19484〜89 (1991) 〕及びＡ．オリザエからの
中性プロテアーゼIIと呼ばれるメタロプロテラーゼ〔 T
atsumiなど. 、Mol.Gen.Genet. 228：97〜103 (1991)〕
を包含する。
【０００３】Ａ．ニガーの単離され、そして変異誘発さ
れたプロテアーゼ遺伝子は、遺伝子破壊実験、すなわち
対応する天然の遺伝子が破壊される変異体株の調製のた
めに使用され得る。たとえば、アスペルギラス アワモ
リからのｐｅｐＡ遺伝子は、アスペルギロペプチンＡ欠
陥株を調製するために遺伝子破壊により破壊されて来た
(Berkaなど. 、上掲書）。
【０００４】しかしながら、上記のように、アスペルギ
ラスは多数の異なったプロテアーゼを生成し、そして従
って、タンパク質の産業的な製造のために他のプロテア
ーゼにおける欠陥性のアスペルギラス株のための連続し
た必要性が存在する。このために、インビトロ変異誘
発、たとえば遺伝子破壊によるプロテアーゼ欠陥性株の
調製のために使用され得る他のプロテアーゼ遺伝子のた
めの必要性がまた存在する。さらに、タンパク質プロセ
ッシングのために産業的に適用され得る組換えプロテア
ーゼタンパク質のための必要性がまた存在する。
【０００５】Ａ．ニガーにおける分泌されたプロテアー
ゼ活性の他の主要構成成分はセリンプロテアーゼである
〔 Sakkaなど. 、 J.Ferment.Technol. 63： 479〜483
(1985)〕。菌類からのセリンプロテアーゼは、カビ、
Ｔ．アルブム（T.album ) 及び酵母、サッカロミセス
セレビシアエ (Saccharomyces cerevisiae) において広
範に特徴づけられている。Ｔ．アルブムはたぶん、３種
の関連するセリンプロテアーゼを分泌し、そのうち最良
に特徴づけられているものはプロテイナーゼＫであり
〔Janyなど. 、FEBS 199： 139〜144 (1986)〕、ところ
が酵母における相同タンパク質は液胞に局在する〔Wolf
and Ehmann, Eur.J.Biochem. 98： 375〜384 (197
9)〕。それらのＴ．アルブム及びＳ．セレビシアエタン
パク質のすべてのための遺伝子はクローン化されてお
り、そして特徴づけられている〔 Gunkel and Gassen,
Eur.J.Biochem. 179： 185〜194 (1989), Samalな
ど．、 Gene 85：329〜333 (1989), Samal など．、 Mo
lec.Microbiol 4：1789〜1792 (1990) 及びMoehleなど.
、Molec.Cell.Biol. 7：4390〜99 (1987) 〕。アルカ
リセリンプロテアーゼはまた、Ａ．オリザエ、Ａ．フミ
ガタス及びアクレモニウム クリソゲナム（Achremoniu
m chrysogenum) においてクローン化され、そして特徴
づけられている〔 Tatsumiなど. 、Mol.Gen.Genet. 21
9：33〜38 (1989) ；Jaton-Ogayなど. 、FEMS Microbio
l.Letts. 92： 163〜168 (1992)；Isogaiなど. 、 Agri
c Biol.Chem. 55： 471〜477 (1991)〕。アスペルギラ
スはまた、プロテアーゼのスブチリシン科に相同のセリ
ンプロテアーゼを生成することが見出された。本発明は
このタイプのプロテアーゼに関する。
【０００６】本発明の目的 スブチリシン型のアスペルギラスセリンプロテアーゼを
コードするＤＮＡ分子を供給することが本発明の目的で
ある。さらなる目的は、スブチリシン型の組換えアスペ
ルギラスセリンプロテアーゼ及びまた、その生成のため
の形質転換されたアスペルギラス株を供給することであ
る。もう１つの目的は、株が非相同タンパク質のより効
果的な生成のために使用され得る、スブチリシン型のセ
リンプロテアーゼ遺伝子において欠陥性のアスペルギラ
ス株を供給することである。
【０００７】発明の要約 本発明は、スブチリシン型のアスペルギラスセリンプロ
テアーゼに関する。そのようなプロテアーゼは、本明細
書においては、“アスペルギラス−スブチリシン”と命
名される。本発明の“アスペルギラス−スブチリシン”
は、（ａ）アスペルギラス spec.に由来し、（ｂ）活性
部位での触媒性セリン残基によるプロテアーゼ活性を示
し、そして（ｃ）スブチリシン科に分類されるために既
知のセリンプロテアーゼと相同の十分なアミノ酸配列を
有するものとして理解される。しかしながら、本発明に
使用されるようなアスペルギラス−スブチリシンはま
た、セリンプロテアーゼ活性を保持するような酵素のフ
ラグメントもまた前記用語の意味するところであるが、
しかしながら、十分な長さの酵素が好ましい態様であ
る。追加のアミノ酸、ペプチド又はタンパク質に結合さ
れる本発明の“アスペルギラス−スブチリシン”を含む
融合タンパク質もまた本発明の一部であることが理解さ
れる。
【０００８】好ましい態様において、アスペルギラス−
スブチリシンは、アスペルギラスニガーに由来するプロ
テアーゼ又はその活性フラグメント、より好ましくは配
列番号１及び６にそれぞれ示されるアミノ酸配列又はそ
の配列の一部を有するプロテアーゼ又はその活性フラグ
メントを意味する。
【０００９】本発明はまた、本発明のアスペルギラス−
スブチリシンをコードする単離されたＤＮＡ配列、及び
そのようなＤＮＡのクローニング及び操作のためのハイ
ブリッドベクターにも関する。本発明はさらに、適切な
宿主細胞におけるアスペルギラス−スブチリシンの発現
のために適切な調節領域により機能的に結合されたその
ようなＤＮＡ配列を含んで成る、アスペルギラス−スブ
チリシンの生成のための発現ハイブリッドベクターに関
する。本発明はまた、アスペルギラス−スブチリシンを
発現できる形質転換された宿主細胞、たとえば形質転換
の後、高められた遺伝子のコピー数によりアスペルギラ
ス−スブチリシンを過剰発現できるアスペルギラス株に
も関する。
【００１０】本発明はまた、アスペルギラス−スブチリ
シン遺伝子における欠陥性のアスペルギラス株、及び変
異誘発、たとえば遺伝子破壊により機能的タンパク質を
もはや発現できないアスペルギラス−スブチリシンをコ
ードするＤＮＡ配列によるその生成のための方法にも関
する。
【００１１】さらに、本発明は、本発明のＤＮＡ配列、
ハイブリッドベクター、発現ベクター及びアスペルギラ
ス−スブチリシンの調製方法、並びにアスペルギラス−
スブチリシン遺伝子における欠陥性のアスペルギラス株
及びアスペルギラス−スブチリシンを過剰生成する宿主
株の発現方法にも関する。
【００１２】発明の特定の記載 クローニング及び発現のためにアスペルギラス−スブチ
リシンハイブリッドベクターをコードするＤＮＡ 本発明は、アスペルギラス−スブチリシン、好ましくは
アスペルギラス ニガーをコードするＤＮＡ配列を含ん
で成るＤＮＡ分子に関する。そのＤＮＡ配列は、ゲノム
ＤＮＡライブラリィーから単離できるＤＮＡ分子を有す
る場合、たとえば配列番号１に示されるｐｅｐＣ遺伝子
又は配列番号６に示されるｐｅｐＤ遺伝子として１又は
複数のイントロンを含むことができる。しかしながら、
本発明はまた、たとえばｃＤＮＡクローニングにより、
又は変異誘発の後、ＰＣＲ技法の適用により単離できる
ようなＤＮＡ配列のイントロンを含まない変異体にも関
する。そのようなイントロンを含まない遺伝子は特に、
非アスペルギラス宿主、好ましくは原核生物又は酵母に
おける発現のために有用である。
【００１３】本発明は好ましくは、配列番号１で示され
るアミノ酸配列又はセリンプロテアーゼ活性を保持する
そのフラグメントを有するＡ．ニガー−スブチリシンＰ
ＥＰＣをコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ分子
に関する。本発明のＤＮＡ配列は好ましくは、配列番号
１を有するヌクレオチド配列で示される成熟ＰＥＰＣプ
ロテアーゼのためのコード領域である。しかしながら、
本発明はまた、ＰＥＰＣをコードする変性ＤＮＡ配列、
又はそのフラグメント、すなわちヌクレオチドがコード
されたアミノ酸配列を変えないで置換されている配列に
も関する。そのようなＤＮＡ配列は、たとえば種々の宿
主への好ましいコドン利用における差異により又は制限
酵素のための新規認識部位の存在により、有用である。
【００１４】本発明のもう１つの好ましい態様は、配列
番号６で示されるアミノ酸配列又はセリンプロテアーゼ
活性を保持するそのフラグメントを有するＡ．ニガー−
スブチリシンＰＥＰＤをコードするＤＮＡ配列を含んで
成るＤＮＡ分子である。従って、本発明のもう１つの好
ましいＤＮＡ配列はまた、配列番号６を有するヌクレオ
チド配列で示される成熟ＰＥＰＤプロテアーゼのための
コード領域である。しかしながら、本発明はまた、ＰＥ
ＰＤをコードする変性ＤＮＡ配列又はそのフラグメン
ト、すなわちヌクレオチドがコードされたアミノ酸配列
を変えないで置換されている配列にも関する。
【００１５】本発明はまた、本発明のアスペルギラス−
スブチリシン、好ましくはその好ましい形をコードする
ＤＮＡ配列を挿入体として含んで成るハイブリッドベク
ターにも関する。そのような本発明のハイブリッドベク
ターは、本発明のＤＮＡ配列の拡張及び操作のために有
用である。本発明はまた、本発明のアスペルギラス−ス
ブチリシン、好ましくはその好ましい形の生成のために
適切な発現ベクターにも関する。そのような発現ベクタ
ーは、アスペルギラス−スブチリシンをコードするＤＮ
Ａ配列が所望する宿主細胞においてそのようなＤＮＡ配
列の発現の制御のために適切な調節領域により機能的に
結合されている“発現カセット”を含んで成る。
【００１６】発現ベクターを含む本発明のハイブリッド
ベクターは、遺伝子工学の業界において有用ないづれか
のベクター、たとえばウィルス、ファージ、コスミド、
プラスミド又は染色体ＤＮＡ、たとえばＳＶ４０、ヘル
ペスウィルス、乳頭腫ウィルス、レトロウィルス、バキ
ュロウィルス、ファージλ、たとえばＮＭ９８９又はＥ
ＭＢＬ４、又はファージＭ１３、たとえばＭ１３ｍｐ８
の誘導体、細菌プラスミド、たとえばｐＢＲ３２２，ｐ
ＵＣ１８又は酵母プラスミド、たとえば酵母２μプラス
ミド、又は欠陥ウィルス、ファージ又はプラスミドの複
製を可能にするヘルパーウィルス、ファージ又はプラス
ミドの存在下での欠陥ウィルス、ファージ又はプラスミ
ド、たとえばＭ１４Ｋ０７ヘルパーファージの存在下で
のＭ１３（＋）ＫＳベクター、又は糸状菌、たとえばア
スペルギラス spec.、たとえばＡ．ニガーに由来する染
色体ＤＮＡ、たとえばＥＰ１８４４３８により供給され
るものに由来する。Ｓ．セレビシアエ又は糸状菌、より
好ましくはアスペルギラスspec.、さらにより好ましく
はＡ．ニガーのためのベクターが好ましい。
【００１７】発現ベクターを含む本発明のハイブリッド
ベクターは、染色体外要素として、又は宿主染色体にお
ける組込みにより適切な宿主における所望するＤＮＡの
複製を提供する。いくつかの可能なベクターシステム
が、本発明のクローン化されたＤＮＡの組込み及び発現
のために利用できる。原則的に、選択された宿主におい
て複製し、そして安定して維持されるすべてのベクター
が適切である。従って、ベクターは、形質転換のために
予想される宿主細胞に依存して選択される。一般的に、
そのような宿主細胞は、原核又は真核微生物、たとえば
細菌、菌類、たとえば酵母、好ましくはＳ．セレビシア
エ、又は糸状菌として、好ましくはアスペルギラス spe
c.、より好ましくはＡ．ニガー、又は高等真核生物起源
の細胞、たとえば脊椎動物、たとえば哺乳類細胞であり
得る。適切な宿主細胞は、下記に詳細に論ぜられるであ
ろう。染色体外要素として維持される、発現ベクターを
含む本発明のハイブリッドベクターは、複製の起点（ｏ
ｒｉ) 又は自立的に複製する配列（ＡＲＳ）、選択可能
マーカー配列、及び場合によっては、追加の制限部位を
含んで成る。宿主染色体中への組込みのために向けられ
るベクターは、染色体に関連してそれは細胞において複
製されるので、ｏｒｉ又はＡＲＳを含む必要はない。
【００１８】複製又は自立的に複製する配列の起点（染
色体外要素に自立的に複製する能力を付与するＤＮＡ要
素）は、たとえばＳＶ４０又は他のウィルス源に由来す
る外因性起点を含むベクターの構成により、又は宿主細
胞染色体機構により供給される。
【００１９】発現ベクターを含む本発明のハイブリッド
ベクターはまた、形質転換され、選択され、そしてクロ
ーン化される宿主に依存して選択マーカーを含むことが
できる。マーカーの表現型発現により形質転換体の選択
を促進するいづれかのマーカー遺伝子が使用され得る。
適切なマーカーは特に、テトラサイクリン又はアンピシ
リンに対しての抗生物質耐性、又は栄養要求性菌類変異
体の場合、宿主損傷を補う遺伝子を発現するものであ
る。その対応する遺伝子は、たとえば抗生物質シクロヘ
キシミドに対しての耐性を付与し、又は栄養要求性酵
母、好ましくはＳ．セレビシアエにおける原栄養性に、
変異体、たとえばｕｒａ３，ｌｅｕ２，ｈｉｓ３又はｔ
ｒｐ１遺伝子を供給する。形質転換されるべき宿主がマ
ーカーにより発現される生成物のために栄養要求性であ
る場合、自立的に複製するセグメントに関連するマーカ
ー構造遺伝子として使用することもまた可能である。
【００２０】Ａ．ニガーのためのハイブリッドベクタ
ー、特に発現ベクターに関して、Ａ．ニガー宿主損傷を
補足するマーカー遺伝子、たとえばＡ．ニガー又はＡ．
ニジュランス（A.nidulans) （ＥＰ１８４，４３８
号）、又はＮ．クラサ（N.crassa)ｐｙｒ４遺伝子に相
同のＡ．ニジュランスＤＮＡフラグメントに由来するオ
ルニチンカルバモイルトランスフェラーゼをコードする
ａｒｇＢ遺伝子が特に重要である。他の適切なマーカー
遺伝子は、本発明の形質転換された宿主の記載に関し
て、この後に説明される。
【００２１】Ｅ．コリにおけるアスペルギラス−スブチ
リシンをコードするＤＮＡの操作のために適切な本発明
のハイブリッドベクターは、たとえば本発明の例にこの
後、記載されるプラスミドｐＴＺＰＥＰＣ又はｐＴＺＰ
ＥＰＤである。
【００２２】本発明の発現ベクターに関して、用語“発
現カセット”とは、アスペルギラス−スブチリシンを発
現できるＤＮＡ配列を意味し、そしてアスペルギラス−
スブチリシンにより操作可能的に結合されるプロモータ
ー及び場合によっては、シグナル配列、転写ターミネー
ター、転写エンハンサー、リボソーム結合部位、効果的
なＲＮＡプロセッシングのための配列、効果的なタンパ
ク質プロセッシングをコードする配列及び正しいタンパ
ク質局在化をコードする配列から成る群からの１又は複
数の追加の調節要素を含んで成る。本発明の発現カセッ
トにおいては、アスペルギラス−スブチリシンコード領
域は、相同調節要素、すなわちそれらにより天然におい
て結合されるもの、又は非相同調節要素、すなわち他の
遺伝子に由来するものと共に組合され得る。
【００２３】広範囲の種類のプロモーター配列が、宿主
細胞の性質に依存して使用され得る。強く且つ同時に、
十分に調節されているプロモーターが最っとも有用なも
のである。
【００２４】プロモーターのための例は、原核生物のλ
ＰL ，λＰR ，Ｅ．コリのｌａｃ，ｔｒｐ又はｔａｃプ
ロモーターである。酵母、好ましくはＳ．セレビシアエ
における発現のために適切なプロモーターは、ＴＲＰ１
−，ＡＤＨ１−，ＡＤＨII−，ＰＨＯ３−，ＰＨＯ５
−，ＧＡＬ１０−、又は解糖性プロモーター、たとえば
エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｐ
ＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラー
ゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフ
ェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムター
ゼ、ピルベートキナーゼ、ホスホトリオースイソメラー
ゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼ
遺伝子のプロモーター、又はＰＨＯ５−ＧＡＰＤＨハイ
ブリッドプロモーター（ＥＰ出願番号第ＥＰ−Ａ２１３
５９３号）である。真核生物プロモーターの他の例は、
真核ウィルス、たとえばＳＶ４０、ラウス肉腫ウィル
ス、アデノウィルス２、ウシ乳頭腫ウィルス、パポーバ
ウィルス、サイトメガロウィルス由来のプロモーター、
又はたとえばアクチン、コラーゲン、ミオシン又はβ−
グロビン遺伝子の哺乳類細胞由来のプロモーターであ
る。真核生物プロモーターは、促進配列、たとえば酵
母、好ましくはＳ．セレビシアエの上流の活性化配列
（ＵＡＳ）又はウィルス又は細胞性エンハンサー、たと
えばサイトメガロウィルスＩＥエンハンサー、ＳＶ４０
エンハンサー、免疫グロブリン遺伝子エンハンサー又は
他のものと共に組合され得る。
【００２５】エンハンサーは、たとえばウィルス、たと
えばＳＶ４０、ポリオーマウィルス、ウシ乳頭腫ウィル
ス又は Moloney肉腫ウィルスに由来し、又はゲノム起源
の転写刺激ＤＮＡ配列である。エンハンサー配列はま
た、フィサラム ポリセファラム（Physarum polyceph
alum）の染色体外リボソームＤＮＡに由来する（ＰＣＴ
／ＥＰ８５００２７８）。適切なエンハンサーはまた、
酵母酸ホスファターゼＰＨＯ５遺伝子に由来する上流の
活性化部位でもある。
【００２６】シグナル配列は、たとえばポリペプチドの
分泌を方向づけるプレ配列又は分泌リーダー、又は同様
のものであり得る。シグナル配列は、たとえばアスペル
ギラス−スブチリシンのシグナル又はリーダーペプチ
ド、たとえば配列番号１に示されるシグナル配列であり
得る。追加のシグナル配列は、文献、たとえばvon Heij
ne,G., Nucleic Acids Res. 14, 4683 (1986) に包含さ
れるものから知られる。
【００２７】転写の開始及び停止、及びｍＲＮＡを安定
化するために必要な配列は、たとえば発現宿主からのウ
ィルス又は真核生物ｃＤＮＡのそれぞれの非コード５′
−領域及び３′−領域から通常利用できる。
【００２８】本発明の態様においては、たとえばプラス
ミド、ｐＦＢＹ１３８におけるようにＧＡＬ１０プロモ
ーターの制御下で、原核生物、たとえばＥ．コリ、好ま
しくは酵母、より好ましくはＳ．セレビシアエにおける
アスペルギラス−スブチリシンの発現のために配列番号
１に示されるコード領域の２つのエキソン又は配列番号
６に示されるコード領域の４つのエキソンから構成され
るイントロンを含まないコード領域を含んで成る発現ベ
クターである。本発明は好ましくは、アスペルギラス株
におけるアスペルギラス−スブチリシンをコードするＤ
ＮＡ配列の発現のために適切な発現ベクターに関する。
【００２９】本発明の１つのタイプの発現ベクターは、
アスペルギラス−スブチリシン、好ましくはＡ．ニガー
をコードするＤＮＡ配列を、そのＤＮＡ配列により天然
において結合されるプロモーター、すなわちその相同プ
ロモーターの制御下で含んで成る。より好ましくは、配
列番号１に示されるプロモーター領域の制御下で配列番
号１のＰＥＰＣをコードするＤＮＡ配列、最っとも好ま
しくは配列番号１に示されるＤＮＡ配列を含んで成る発
現ベクター、又は配列番号６に示されるプロモーター領
域の制御下で配列番号６のＰＥＰＤをコードするＤＮＡ
配列、最っとも好ましくは配列番号６に示されるＤＮＡ
配列を含んで成る発現ベクターが好ましい。しかしなが
ら、配列番号１に示されるＰＥＰＣ領域はまた、配列番
号６に示されるＰＥＰＤプロモーターの制御下で発現さ
れ、そしてまた逆も真である。
【００３０】好ましくは、アスペルギラス−スブチリシ
ンは、培地中に分泌される。これは、構造遺伝子により
機能的に結合されるシグナル配列、好ましくは、たとえ
ばＰＥＰＣシグナル配列及び配列番号１に示されるコー
ド領域を含んで成るプラスミドｐＴＺＰＥＰＣにおける
ように、又はＰＥＰＤシグナル配列及び配列番号６に示
されるコード領域を含んで成るプラスミドｐＴＺＰＥＰ
Ｄにおけるように、アスペルギラス−スブチリシン構造
遺伝子により天然において結合されるシグナル配列の使
用により達成され得る。
【００３１】そのような発現ベクターがアスペルギラス
−スブチリシン遺伝子が元来、由来される種の宿主株に
おけるアスペルギラス−スブチリシンの発現のために使
用される場合、アスペルギラス−スブチリシンは、組換
え及び元来のアスペルギラス−スブチリシン遺伝子の両
者が同じ発現条件下で活性的であるので過剰発現され
る。
【００３２】本発明の他のタイプの発現ベクターは、ア
スペルギラス−スブチリシンをコードするＤＮＡ配列に
より天然において結合されない、アスペルギラスにおい
て機能的なプロモーターの制御下で前記ＤＮＡ配列を含
んで成る。アスペルギラス spec.、特にＡ．ニガーにお
けるアスペルギラス−スブチリシンの発現のための適切
なプロモーターは、たとえばアスペルギラス spec.ペク
チンリアーゼ遺伝子のプロモーター、好ましくはＡ．ニ
ガーＰＬＩ（ＥＰ−Ａ−０２７８３５５を参照のこ
と）、ＰＬＡ，ＰＬＢ，ＰＬＣ，ＰＬＥ又はＰＬＦ（Ｅ
Ｐ−Ａ−０３５３１８８を参照のこと）のプロモータ
ー、アスペルギラス spec.ポリガラクツロナーゼ遺伝子
のプロモーター、好ましくはＡ．ニガーＰＧＩ又はＰＧ
II遺伝子（ＥＰ−出願番号ＥＰ−Ａ−４２１９１９を参
照のこと）のプロモーター、アスペルギラス spec.ピル
ベートキナーゼ遺伝子のプロモーター、好ましくはＡ．
ニガーｐｋｉ遺伝子（ＥＰ出願番号ＥＰ−Ａ−４３９９
９７を参照のこと）のプロモーター、又は本発明のアス
ペルギラス−スブチリシン遺伝子のプロモーター、好ま
しくは配列番号１又は６に示されるアスペルギラス−ス
ブチリシン遺伝子のプロモーターである。この場合、ア
スペルギラス−スブチリシンの分泌はまた、構造遺伝子
により機能的に結合されるシグナル配列、たとえばアス
ペルギラス−スブチリシン構造遺伝子により天然におい
て結合されるシグナル配列、たとえばＰＥＰＣの場合、
配列番号１に示されるシグナル配列の使用により達成さ
れ得る。しかしながら、また、アスペルギラス−スブチ
リシンに対して非相同のシグナル配列、たとえばアスペ
ルギラス spec.ペクチンリアーゼ遺伝子のシグナル配
列、好ましくはＡ．ニガーＰＬＩ（ＥＰ−Ａ−０２７８
３５５を参照のこと）、ＰＬＡ，ＰＬＢ，ＰＬＣ，ＰＬ
Ｅ又はＰＬＦ（ＥＰ−Ａ−０３５３１８８を参照のこ
と）遺伝子のシグナル配列、又はアスペルギラス spec.
ポリガラクツロナーゼ遺伝子のシグナル配列、好ましく
はＡ．ニガーＰＧＩ又はＰＧII遺伝子（ＥＰ−出願番号
ＥＰ−Ａ−４２１９１９を参照のこと）のシグナル配列
が使用され得る。
【００３３】本発明の好ましい態様において、たとえば
プラスミドｐＰＫＩＰＥＰＣＡにおいては、Ａ．ニガー
のピルベートキナーゼプロモーターが、その相同のシグ
ナル配列に結合されるアスペルギラス−スブチリシンを
コードする、配列番号１に示されるコード領域により機
能的に結合される。
【００３４】本発明のもう１つの好ましい態様におい
て、たとえばプラスミドｐＰＫＩＰＥＰＤＡにおいて
は、Ａ．ニガーのピルベートキナーゼプロモーターは、
その相同シグナル配列に組合されるアスペルギラス−ス
ブチリシンをコードする、配列番号６に示されるコード
領域により機能的に結合される。
【００３５】アスペルギラス−スブチリシン遺伝子の調
製方法 本発明はまた、本発明のアスペルギラス−スブチリシン
をコードする、好ましくは本発明のアスペルギラス−ス
ブチリシンの好ましい形をコードするような本発明のＤ
ＮＡ分子の調製方法又はそのようなＤＮＡ分子を含んで
成るハイブリッドベクターの調製方法にも関し、ここで
前記方法は、本発明の前記ＤＮＡ分子又はハイブリッド
ベクターにより形質転換された宿主を培養することを含
んで成る。本発明の他の態様において、本発明のＤＮＡ
分子は、核酸縮合を通して化学合成により調製され得
る。
【００３６】宿主の培養は、非形質転換体、すなわち所
望するＤＮＡ分子を欠く宿主から、形質転換体、すなわ
ち選択マーカーと共に所望するＤＮＡ分子を含む宿主の
負の又は陽正選択を可能にする化合物により補充され得
又はそれを除かれ得る従来の栄養培地において行なわれ
る。
【００３７】当業界において有用な形質転換可能宿主、
たとえば細菌、たとえばＥ．コリ、菌類、たとえばサッ
カロミセス セレビシアエ、クルイペロミセス ラクチ
ス（Kluyveromyces lactis) 、高等真核細胞、たとえば
昆虫細胞又は哺乳類細胞、たとえばＣＨＯ細胞、又は特
に糸状菌、たとえばアスペルギラス、たとえばＡ．ニジ
ュランス（A.nidulans) 、Ａ．オリザエ、Ａ．カルボナ
リウス（A.carbonarius ) 、Ａ．アワモリ及び特にＡ．
ニガーが使用され得る。宿主の形質転換は、従来の方法
により行なわれる。
【００３８】アスペルギラス−スブチリシンをコードす
るＤＮＡ配列は、アスペルギラス−スブチリシンを発現
できるアスペルギラス株のゲノムから得られ、又はアス
ペルギラス−スブチリシンをコードするＤＮＡ配列を含
んで成る組換えＤＮＡ分子により形質転換される宿主を
培養し、そして必要な場合、所望するＤＮＡ配列をそれ
から単離することによって調製され得る。
【００３９】特に、そのようなＤＮＡは： ａ）適切なアスペルギラス細胞からゲノムＤＮＡを単離
し、そしてＤＮＡプローブ又は適切な発現システムを用
いて、所望するＤＮＡを選択し、そして所望するポリペ
プチドの発現のためにスクリーニングし、 ｂ）適切なアスペルギラス細胞からｍＲＮＡを単離し、
所望するｍＲＮＡを、たとえばＤＮＡプローブによるハ
イブリダイゼーション又は適切な発現システムにおける
発現により選択し、そして所望するポリペプチドの発現
についてスクリーニングし、前記ｍＲＮＡに相補的な一
本鎖ｃＤＮＡ、次にそれから二本鎖ｃＤＮＡを調製し、 ｃ）ｃＤＮＡライブラリィーからｃＤＮＡを単離し、そ
して所望するｃＤＮＡを、たとえばＤＮＡプローブ又は
適切な発現システムを用いて選択し、そして所望するポ
リペプチドの発現のためにスクリーニングし、 ｄ）Ａ．ニガーｐｅｐＣ又はＡ．ニガーｐｅｐＤ又はス
ブチリシン型の他の既知のセリンプロテアーゼをコード
する遺伝子から企画されたオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いて、全体のアスペルギラスＤＮＡの二本鎖をＰ
ＣＲ技法によりインビトロで合成し、又は ｅ）段階ａ），ｂ），ｃ）又はｄ）に従って得られる二
本鎖ＤＮＡを適切なベクター中に組込み、適切な宿主を
形質転換し、その宿主を操作し、そしてＤＮＡを単離す
ることから選択された段階を含んで成る方法により調製
され得る。
【００４０】ゲノムＤＮＡは、所望するＤＮＡのために
単離され、そしてスクリーンされ得る（段階ａ）。ゲノ
ムＤＮＡは、アスペルギラス−スブチリシンを発現でき
るアスペルギラス株から単離される。ゲノムＤＮＡライ
ブラリィーは、適切な制限エンドヌクレアーゼによる消
化及び確立された方法に従って適切なベクター中への導
入によりそれから調製される。そのゲノムＤＮＡライブ
ラリィーは、この後に記載されるようにＤＮＡプローブ
によりスクリーンされ、又は適切な発現システムに発現
され、そしてその得られたポリペプチドは従来の態様で
スクリーンされる。
【００４１】ゲノムライブラリィーは、たとえばＳａｕ
３ＡＩ又はＭｂｏＩによるＡ．ニガー株、たとえばＮＷ
７５６又はＮ４００のゲノムＤＮＡの部分的消化、及び
適切な宿主ベクター、たとえばＥ．コリプラスミドｐＵ
Ｎ１２１又はλベクター、たとえばＥＭＢＬ４における
高分子ＤＮＡフラグメントのクローニングにより調製さ
れ得る。
【００４２】所望するアスペルギラス−スブチリシンを
生成する他の菌類株、たとえばＡ．ジャポニカス（A.ja
ponicus ) 、Ａ．ニジュランス、Ａ．オリザエ、Ａ．ニ
ガーゲノムライブラリィーのための源とし作用し、そし
て他の適切なベクター、たとえば上記のものが前記フラ
グメントのための受容体として使用され得る。
【００４３】アスペルギラス−スブチリシンをコードす
るＤＮＡ配列のためのゲノムライブラリィーを好都合良
くスクリーンするためには、ハイブリダイズするＤＮＡ
プローブが必要である。これは、所望するアスペルギラ
ス−スブチリシンのアミノ酸配列又はその一部が既知で
ある場合、合成ＤＮＡプローブであり、又はアスペルギ
ラス−スブチリシン遺伝子にハイブリダイズする、たと
えば酵母からの他のスブチリシン遺伝子、又はその一部
であり得る。
【００４４】ポリアデニル化ｍＲＮＡ（段階ｂ）は、既
知方法により適切な細胞から単離される。単離方法は、
たとえば界面活性剤及びリボヌクレアーゼインヒビタ
ー、たとえばヘパリン、グアニジウムイソチオシアネー
ト又はメルカプトエタノールの存在下での均質化、場合
によっては、塩及び緩衝溶液、界面活性剤及び／又はカ
チオンキレート化剤の存在下での適切なクロロホルム−
フェノール混合物によるｍＲＮＡの抽出、及び残る水
性、塩含有相からエタノール、イソプロパノール又は同
様のものによるｍＲＮＡの沈殿を包含する。単離された
ｍＲＮＡは、塩化セシウムグラジェントによる遠心分
離、続くエタノール沈殿及び／又はクロマトグラフィー
処理方法、たとえばアフィニティークロマトグラフィー
処理、たとえばオリゴ（ｄＴ）セルロース又はオリゴ
（Ｕ）セファロース上でのクロマトグラフィー処理によ
りさらに精製され得る。好ましくは、そのような精製さ
れた全ｍＲＮＡは、線状スクロースグラジェントでのグ
ラジェント遠心分離により又は適切なサイズ分別カラ
ム、たとえばアガロースゲル上でのクロマトグラフィー
処理によりサイズに従って分別される。
【００４５】所望するｍＲＮＡは、ＤＮＡプローブによ
りｍＲＮＡを直接的にスクリーンし、又は適切な細胞又
は細胞フリーシステムにおける翻訳により、そして得ら
れたポリペプチドをスクリーンすることにより選択され
る。
【００４６】所望するｍＲＮＡの選択は好ましくは、こ
の後記載されるようにしてＤＮＡハイブリダイゼーショ
ンプローブを用いて達成され、それによって翻訳の追加
の段階を回避できる。適切なＤＮＡプローブは、既知の
ヌクレオチド配列のＤＮＡ、たとえば合成ＤＮＡ、所望
するポリペプチドをコードするｍＲＮＡに由来するｃＤ
ＮＡ、又はたとえば天然源又は遺伝子工学的に構成され
た微生物から単離される隣接ＤＮＡ配列を含んで成るゲ
ノムＤＮＡフラグメントである。
【００４７】分別されたｍＲＮＡは、細胞、たとえばカ
エル卵母細胞、又は細胞フリーシステム、たとえば網状
赤血球溶解物又は小麦胚抽出物において翻訳され得る。
得られたポリペプチドは、たとえばイムノアッセイ、た
とえばラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ又は
螢光マーカーによるイムノアッセイにおいて、酵素活性
又は生来のポリペプチドに対して生成された抗体との反
応によりスクリーンされる。ポリクローナル及びモノク
ローナル抗体のそのようなイムノアッセイ及び調製は、
当業界において十分に知られており、そして従って適用
される。
【００４８】選択されたｍＲＮＡ鋳型からの一本鎖相補
的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の調製は、一本鎖ＤＮＡから二本
鎖ＤＮＡの調製と同じように当業界において良く知られ
ている。そのｍＲＮＡ鋳型は、デオキシヌクレオシドト
リホスフェート、場合によっては放射性ラベルされたデ
オキシヌクレオシドトリホスフェート（反応の結果をス
クリーンできるために）、プライマー配列、たとえばｍ
ＲＮＡのポリ（Ａ）末端とハイブリダイズするオリゴ−
ｄＴ残基及び酵素、たとえば鳥類骨髄芽球化ウィルス
（ＡＭＶ）からの逆転写酵素の混合物と共にインキュベ
ートされる。たとえばアルカリ加水分解による鋳型ｍＲ
ＮＡの分解の後、ｃＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡを得るため
に、デオキシヌクレオシドトリホスフェート及び適切な
酵素の混合物と共にインキュベートされる。適切な酵素
は、たとえば逆転写酵素、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ又はＴ４ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント
である。通常、一本鎖ｃＤＮＡにより自発的に形成され
るヘアピンループ構造は、第２鎖の合成のためのプライ
マーとして作用する。このヘアピン構造は、Ｓ１ヌクレ
アーゼによる消化により除去される。他方、一本鎖ＤＮ
Ａの３′端は、ｍＲＮＡ鋳型の加水分解及び第２ｃＤＮ
Ａ鎖の続く合成の前、ホモポリマーデオキシヌクレオチ
ド端により拡張される。
【００４９】他方、二本鎖ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡライブ
ラリィーから単離され、そして所望するｃＤＮＡについ
てスクリーンされる（段階ｃ）。そのｃＤＮＡライブラ
リィーは、適切な細胞からｍＲＮＡを単離し、そして上
記のようにしてそれらから一本鎖及び二本鎖ｃＤＮＡを
調製することによって構成される。このｃＤＮＡは、適
切な制限エンドヌクレアーゼにより消化され、そして確
立された方法に従って、λファージ、たとえばλシャロ
ン４Ａ又はλｇｔ１１中に導入される。ニトロセルロー
ス膜上で複製されるｃＤＮＡライブラリィーが、上記の
ようにしてＤＮＡプローブを用いることによってスクリ
ーンされ、又は適切な発現システムにおいて発現され、
そして得られたポリペプチドは所望する化合物に対して
特異的な抗体との反応のためにスクリーンされる。
【００５０】二本鎖ＤＮＡのもう１つの調製方法はＰＣ
Ｒ技法である（段階ｄ）。この方法は特に、少なくとも
一部既知の配列を有する少量ＤＮＡ又はＲＮＡから出発
して多量の二本鎖ＤＮＡの調製のために使用され得る。
既知のベクターを端に有する未知の配列を有するＤＮＡ
挿入体がまた、出発材料として使用され得る。ＰＣＲ技
法においては、ＤＮＡ分子、たとえばオリゴヌクレオチ
ドが、ＤＮＡの酵素鋳型依存性合成のためのプライマー
として使用され得る。二本鎖ＤＮＡの変性、プライマー
によるハイブリダイゼーション及び酵素的合成が連続的
に反復され得るために、多量が調製され得る。合成され
たＤＮＡ分子の数は、それが個々のラウンドで二倍にな
るために指数的に上昇する。ＰＣＲ技法は当業界におい
て既知であり、そして本発明に適用され得る。オリゴヌ
クレオチドプライマーは、スブチリシン型の既知のセリ
ンプロテアーゼ間の比較に基づいて、保存されたスブチ
リシン型セリンプロテアーゼタンパク質配列をコードす
るＤＮＡにハイブリダイズするように企画され得る。Ｐ
ＣＲ技法は当業界において良く知られており、そして従
来のＰＣＲ技法、たとえば M.A.Innisなど. （出版
者）、ＰＣＲ法、A guidto methods and applications,
Academic Press, San Diego (1990)に記載される技法
が本発明に適用され得る。
【００５１】適切なベクター中への二本鎖ｃＤＮＡ又は
ゲノムＤＮＡの導入のための種々の方法が当業界におい
て知られている（段階ｃ）。たとえば、相補的ホモポリ
マー系統が、その対応するデオキシヌクレオシドトリホ
スフェート及び酵素、たとえばターミナルデオキシヌク
レオチジルトランスフェラーゼの存在下でのインキュベ
ーションにより二本鎖ＤＮＡ及びベクターＤＮＡに付加
され得る。次に、ベクター及び二本鎖ＤＮＡが、相補的
ホモポリマー末端間を塩基対合することによって連結さ
れ、そして最後に、特定の連結酵素、たとえばリガーゼ
により連結される。他の可能性は、ブラント−又は付着
末端連結による、二本鎖ＤＮＡの末端への合成リンカー
の付加、又はベクター中への二本鎖ＤＮＡの導入であ
る。適切なベクターはこの後に詳細に論ぜられるであろ
う。
【００５２】得られたハイブリッドベクターにより適切
な宿主細胞を形質転換するための形質転換法及び形質転
換された宿主細胞の選択及び操作は、当業界において良
く知られている。そのような方法のための例は、下記に
さらに与えられる。
【００５３】本発明による所望するＤＮＡ、変異体及び
そのフラグメントの単離は、当業界において知られてい
る方法、たとえばフェノール及び／又はクロロホルムに
よる抽出により達成される。場合によっては、ＤＮＡ
は、たとえば変異体を得るために変異誘発剤による処理
により、又は制限酵素により消化し、フラグメントを
得、１又は両端を変性し、ベクター中への導入を促進
し、介在配列を除去し、そして同様のことを行なうこと
によって、さらに操作され得る。
【００５４】本発明のＤＮＡのヌクレオチド配列は、そ
れ自体既知の方法により、たとえば末端ラベルされたＤ
ＮＡを用いての Maxam-Gilbert法により又はSangerのジ
デオキシ鎖終結法により決定され得る。
【００５５】本発明のアスペルギラス−スブチリシン遺
伝子配列はまた、従来の方法に従ってのインビトロ合成
により調製され得る。そのインビトロ合成は、セリンプ
ロテアーゼ活性を有するアスペルギラス−スブチリシン
のフラグメントをコードするアスペルギラス−スブチリ
シン遺伝子のより小さなフラグメントの調製のために特
に適用できる。インビトロ合成はまた、プロモーター又
はシグナルペプチドをコードするＤＮＡの合成のために
特に適用できる。そのインビトロ合成は好ましくは、
Ａ．ニガーに由来するアスペルギラス−スブチリシン遺
伝子又はそのフラグメント、最っとも好ましくは配列番
号１に示されるｐｅｐＣ遺伝子又はそのプロモーター又
はシグナル配列、又は配列番号６に示されるｐｅｐＤ遺
伝子又はそのプロモーター又はシグナル配列に適用され
る。
【００５６】ＤＮＡの合成のための適切な方法は、S.A.
Harang (Tetrahedron 39, 3, 1983)により要約形で示さ
れている。既知合成技法は、長さ１２０塩基までのポリ
ヌクレオチドの良好な収率、高い純度及び比較的短い時
間での調製を可能にする。適切に保護されたヌクレオチ
ドは、ホスホジエステル法(K.L.Agarwalなど. 、 Ange
w.Chemie 84, 489, 1972)、より効果的なホスホジエス
テル法(C.B.Reese, Tetrahedron 34, 3143, 1972) 、ホ
スフィットトリエステル法(R.L.Letsingerなど.、 J.A
m.Chem.Soc. 98, 3655, 1976) 又はホスホラミジット法
(S.L.Beaucage及びM.H.Carruthers, Tetrahedron 22,
1859, 1981) によりお互連結される。オリゴヌクレオチ
ド及びポリヌクレオチドの合成の単純化は、ヌクレオチ
ド鎖が適切なポリマーに結合される、固相法により可能
にされる。実際の二本鎖ＤＮＡは、塩基対合により正し
い配置で一緒に保持され、そして次に酵素ＤＮＡリガー
ゼにより化学的に連結される、両ＤＮＡ鎖からの化学的
に調製されたオーバーラップオリゴヌクレオチドから酵
素的に構築される。他の可能性は、ＤＮＡポリメラー
ゼ、たとえばＤＮＡポリメラーゼＩ、ポリメラーゼＩの
クレノウフラグメント又はＴ４ＤＮＡポリメラーゼと共
に又はＡＭＶ（鳥類骨髄芽球化ウィルス）逆転写酵素と
共に、４種の必要とされるデオキシヌクレオシドトリホ
スフェートの存在下で２種のＤＮＡ鎖からの１本のオー
バーラップするオリゴヌクレオチドをインキュベートす
ることを含んで成る。それによって、それらの２種のオ
リゴヌクレオチドは塩基対合により正しい配置で一緒に
保持され、そして酵素により必要とされるヌクレオチド
により補充され、完全な二本鎖ＤＮＡが得られる (S.A.
Narangなど. 、Anal.Biochem. 121 , 356, 1982)。
【００５７】本発明を実施する場合、他の種、たとえば
酵母のスブチリシン遺伝子又はそのフラグメントが、ア
スペルギラス spec.、たとえばＡ．ニガー、ＲＮＡ画分
におけるスブチリシンｍＲＮＡ又はゲノム又はｃＤＮＡ
ライブラリィーにおけるスブチリシンＤＮＡを同定する
ためのプローブとして使用され得る。Ａ．ニガー遺伝子
の主要配列及び他のプロテアーゼとの比較から、プロテ
アーゼのコード領域が推定され、そしてスブチリシン遺
伝子と前記遺伝子との関係が確認され得る。得られる遺
伝子は、下記に詳細に概略されているように、組換えプ
ロテアーゼの調製のために使用され得る。
【００５８】合成ＤＮＡプローブは、下記のようにして
既知の方法に従って、好ましくは固相ホスホトリエステ
ル、ホスフィットトリエステル又はホスホラミジット法
を用いての段階的な縮合、たとえばホスホトリエステル
法によるジヌクレオチド結合単位の縮合により合成され
る。これらの方法は、 Y.Ikeなど. (Nucleic Acids Res
earch 11, 477, 1983)により記載されるようにして適切
な縮合段階において、保護された形又は対応するジヌク
レオチドカップリング単位で、２，３又は４種のヌクレ
オチドｄＡ，ｄＣ，ｄＧ及び／又はｄＴの混合物を用い
ることによって所望するオリゴヌクレオチドの混合物の
合成に適合される。
【００５９】ハイブリダイゼーションのためには、ＤＮ
Ａプローブがラベルされ、たとえばキナーゼ反応により
放射性ラベルされる。ラベルを含むＤＮＡプローブによ
るサイズ分別されたｍＲＮＡのハイブリダイゼーション
は、既知の方法に従って、すなわちアジュバント、たと
えばカルシウムキレート化剤、粘度調節化合物、タンパ
ク質、非相同性ＤＮＡ及び同種のものを含む緩衝液及び
塩溶液において、選択的ハイブリダイゼーションに好ま
しい温度、たとえば０℃〜８０℃、たとえば２５℃〜５
０℃又はハイブリッド二本鎖ＤＮＡ溶融温度よりも約６
５℃、好ましくは約２０℃低い温度で行なわれる。
【００６０】形質転換された宿主及びその調製 さらに、本発明は、好ましくは本発明のアスペルギラス
−スブチリシンの好ましい形をコードするような、本発
明のハイブリッド又は発現ベクターにより形質転換され
た宿主細胞に関する。
【００６１】特に本発明の組換えＤＮＡ分子の増幅のた
めに適切な宿主の例は、制限酵素又は変性酵素を欠く又
はそれを少々含む微生物、たとえば細菌、特にＥ．コ
リ、たとえばＥ．コリ×１７７６，Ｅ．コリＹ１０９
０，Ｅ．コリＷ３１１０，Ｅ．コリＨＢ１０１／ＬＭ１
０３５，Ｅ．コリＪＡ２２１，Ｅ．コリＤＨ５α、又は
好ましくはＥ．コリＤＨ５αＦ′，ＪＭ１０９，ＭＨ１
又はＨＢ１０１、又はＥ．コリＫ１２株である。適切な
宿主はまた、他の原核細胞、たとえばバシラス サブチ
リス（Bacillus subtilis) 、バシラス ステアロサー
モフィラス（（Bacillus stearothermophilus) 、プソ
イドモナス (Pseudomonas ) 、ハエモフィラス (Haomop
hilus ) 、ストレプトコーカス (Streptococcus ) 及び
他のもの及び酵母、たとえばサッカロミセス セレビシ
アエ、たとえばＳ．セレビシアエＧＲＦ１８である。さ
らに適切な宿主細胞は、高等生物、特に確立された連続
的ヒト又は動物細胞系、たとえばヒト胚の肺繊維芽細胞
Ｌ１３２、ヒト悪性黒色腫 Bowes細胞、ＨｅＬａ細胞、
アフリカグリーンモンキーＣＯＳ−７のＳＶ４０ウィル
ス形質転換腎細胞又はチャイニースハムスター卵巣（Ｃ
ＨＯ）細胞である。
【００６２】本発明のアスペルギラス−スブチリシン遺
伝子の発現のための適切な細胞の例は、適切な発現ベク
ターにより形質転換された前記細胞及びさらに、バキュ
ーロウィルス発現ベクターにより形質転換された適切な
昆虫細胞、並びに特に、適切な発現ベクターにより形質
転換された、糸状菌、たとえばペニシリウム(Penicilli
um) 、セファロスポリウム (Cephalosporium) 又は適切
にはアスペルギラス s pec.、たとえばＡ．カルボナリウ
ス、Ａ．アワモリ、Ａ．ニジュランス、Ａ．オリザエ又
はより好ましくはＡ．ニガーである。
【００６３】本発明はまた、場合によっては選択マーカ
ー遺伝子と共に本発明のＤＮＡ分子又はハイブリッドベ
クターによる形質転換条件下で適切な宿主細胞の処理も
含んで成る形質転換体の調製方法及び場合によっては、
形質転換体の選択にも関する。アスペルギラス−スブチ
リシン遺伝子はまた、特に真核細胞、たとえばアスペル
ギラス spec.が宿主として使用される場合、形質転換の
後、宿主ゲノム中に組込まれ得る。
【００６４】微生物の形質転換は、たとえばＳ．セレビ
シアエ (A.Hinnenなど. 、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 7
5, 1929, 1978) 、Ｂ．サブチリス(Anagnostopoulosな
ど．、J.Bacteriol. 81, 741, 1961)、Ｅ．コリ (M.Man
delなど．、J.Mol.Biol. 53,159, 1970)及びアスペルギ
ラス〔F.Buxtonなど．、 Gene 37： 207〜14 (1985),D.
J.Balanceなど. 、 Biochem.Biophys.Res.Commun. 11
2： 284〜9 (1983)〕のために、文献に記載されるよう
な従来の方法に従って行なわれる。
【００６５】従って、Ｅ．コリ細胞の形質転換方法は、
ＤＮＡ摂取を可能にするために細胞のＣａ2+前処理及び
ハイブリッドベクターと共にインキュベーションを包含
する。形質転換された細胞の続く選択は、たとえばベク
ターＤＮＡのマーカー配列の性質に依存して親細胞から
形質転換された細胞の分離を可能にする選択増殖培地に
細胞を移すことによって達成され得る。好ましくは、ハ
イブリッドベクターを含まない細胞の増殖を可能にしな
い増殖培地が使用される。
【００６６】菌類、たとえば酵母又はアスペルギラス s
pec.の形質転換は、たとえばグルコシダーゼによる細胞
壁の酵素的除去、ポリエチレングリコール及びＣａ2+イ
オンの存在下でハイブリッドベクターによるその得られ
たスフェロプラストの処理、及び寒天中へのそのスフェ
ロプラストの固定化による細胞壁の再生の段階を含んで
成る。好ましくは、再生寒天は、上記のようにして、形
質転換された細胞の同時再生及び選択を可能にする手段
で調製される。
【００６７】高等真核生物起源の細胞、たとえば哺乳類
細胞系の形質転換は好ましくは、トランスフェクション
により達成される。トランスフェクションは、従来の技
法、たとえばリン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェ
クション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーショ
ン、すなわち、細胞膜の透過能力を一時的に高める短い
電気パルスによる、又はヘルパー化合物、たとえばジエ
チルアミノエチルデキストラン、ジメチルスルホキシ
ド、グリセロール又はポリエチレングリコールの存在下
でのＤＮＡの導入、及び同様の方法により行なわれる。
トランスフェクション方法の後、トランスフェクトされ
た細胞が、たとえば選択マーカーの性質に依存して選択
された選択培地、たとえば標準培養培地、たとえばダル
ベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最少必須培地、
ＲＰＭＩ１６４０培地及び同様のもの（たとえば対応す
る抗生物質を含む）においての培養により同定され、そ
して選択される。
【００６８】形質転換された宿主細胞は、当業界におい
て既知の方法により、同化できる炭素源、たとえば炭水
化物、たとえばグルコース又はラクトース、窒素、たと
えばアミノ酸、ペプチド、タンパク質又はそれらの分解
生成物、たとえばペプトン、アンモニウム塩又は同様の
もの、及び無機塩、たとえばスルフェート、ホスフェー
ト及び／又はナトリウム、カリウム、マグネシウム及び
カルシウムのカーボネートを含む液体培地において培養
される。その培地はさらに、たとえば増殖促進物質、た
とえば微量元素、たとえば鉄、亜鉛、マンガン及び同様
のものを含む。
【００６９】培地は好ましくは、選択圧力を付与し、そ
して形質転換されてなく、又はハイブリッドベクターを
失なった細胞の増殖を妨ぐために選択される。従って、
たとえばハイブリッドベクターがマーカーとして耐抗生
物質遺伝子を含む場合、抗生物質が培地に添加される。
たとえば必須アミノ酸において栄養要求性であるが、所
ろがハイブリッドベクターが宿主欠陥を補足する酵素を
コードする遺伝子を含む宿主細胞が使用される場合、前
記アミノ酸を欠く最少培地が前記形質転換された細胞を
培養するために使用される。
【００７０】高等真核生物起源の細胞、たとえば哺乳類
細胞が、市販の培地、たとえば上記のようなダルベッコ
変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最少必須培地、ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地及び同様のもの（場合によっては、増殖
促進物質及び／又は哺乳類血清により補充されている）
を用いて組織培養条件下で増殖される。組織培養条件下
での細胞培養のための技法は、当業界において十分知ら
れており、そしてたとえばエアリフト反応器又は連続撹
拌反応器における均質懸濁培養、又はたとえば中空繊
維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ、多
孔性ガラスビーズ、セラミックカートリッジ又は他の微
小キャリヤー上での固定化された又は閉じ込められた細
胞培養を包含する。
【００７１】培養は、当業界において知られている方法
によりもたらされる。培養条件、たとえば温度、培地の
pH値及び発酵時間は、本発明のポリペプチド又はその誘
導体の最大力価が得られるように選択される。従って、
Ｅ．コリ又は酵母株は好ましくは、約２０℃〜４０℃、
好ましくは約３０℃及び４〜８のpH、好ましくは約７の
pHで、約４〜３０時間、好ましくは本発明のポリペプチ
ド又は誘導体の最大収率に達するまで、振盪又は撹拌し
ながら、含浸培養により好気性条件下で培養される。
【００７２】非形質転換細胞から形質転換細胞の選択を
可能にするために、本発明のＤＮＡ分子は選択マーカー
を担持し、又は他方、細胞がそのようなマーカーを含む
第２ベクターにより同時形質転換される。他のシステム
におけるように、そのような選択マーカーは発現可能な
構造遺伝子であり、その発現されたポリペプチド（酵
素）は受容体生物に対して毒性の化合物に対して耐性を
付与し、又はそのような必須ポリペプチドを欠く変異体
の酵素システムを完全にする。形質転換された糸状菌細
胞の選択のために適切なそのようなマーカー遺伝子は、
たとえば既知のｑａ−２，ｐｙｒＧ，ｐｙｒ４，ｔｒｐ
Ｃ，ａｍｄＳ又はａｒｇＢ遺伝子である。
【００７３】ＥＰ−Ａ−０２７８３５５に記載されるよ
うに、マーカー遺伝子、すなわちｐｙｒＡはＡ．ニガー
のゲノムライブラリィーから単離され、これはＡ．ニジ
ュランスのｐｙｒＧ及びＮ．クラサ（N.crassa) のｐｙ
ｒ４、すなわち酵素オロチジン５′−ホスフェートデカ
ルボキシラーゼの生成に関連し、そしてそれと類似する
機能を有する。この酵素は、オロチジン５′−ホスフェ
ートのウリジル酸（ウリジン５′−ホスフェート）への
脱炭酸化及び又は、フルオロ−オロト酸の毒性フルオロ
−ウリジンへの脱炭酸化を触媒する。しかしながら、オ
ロチジン−５′−ホスフェートデカルボキシラーゼをコ
ードするいづれか他のｐｙｒ遺伝子のＤＮＡが使用され
得る。Ｅ．コリＢＪ５１８３／ｐＣＧ５９Ｄ７（ＤＳＭ
３９６８）と称する陽性クローンから、ｐｙｒＡ遺伝子
を含むプラスミドｐＣＧ５９Ｄ７が単離され、そして
Ａ．ニガーｐｙｒ- 変異体の同時形質転換のために使用
された。そのようなｐｙｒ- Ａ変異体はオロチジン５′
−ホスフェートデカルボキシラーゼ遺伝子を欠き、そし
て従って、その対応する酵素を生成できない。そのよう
な変異体は、変異誘発ＵＶ照射下でＡ．ニガーＮ７５６
の分生子柄を処理することによって調製され、そしてフ
ルオロ−オロト酸及びウリジンの存在下で生存するコロ
ニーが選択される。フルオロオロト酸の存在及びウリジ
ンの不在下で生存するコロニーが排除される。残るウリ
ジン要求変異体は、形質転換できるそれらの能力に従っ
て、それぞれＡ．ニガー変異体Ａｎ８及びＡｎ１０によ
り表わされる２種の相補性グループｐｙｒＡ及びｐｙｒ
Ｂに属する。それらは、ｐｙｒＡ含有プラスミドｐＣＧ
５９Ｄ７（ＤＳＭ３９６８）による形質転換条件下で、
そのプロトプラストの形で処理される。Ａ．ニガーＡｎ
８（ＤＳＭ３９１７）コロニーのみが、ｐＵＮ１２１の
ＤＮＡとのその消化されたＤＮＡのハイブリダイズする
能力により明らかなように、形質転換され、そしてｐｙ
ｒＡ遺伝子を含むことが見出された。
【００７４】アスペルギラス−スブチリシンの調製方法 本発明はまた、本発明のアスペルギラス−スブチリシ
ン、好ましくはその好ましい形の調製方法にも関し、こ
こで前記方法は、本発明の発現ベクターにより形質転換
された宿主を、アスペルギラス−スブチリシン遺伝子の
発現のために適切な条件下で培養することを含んで成
る。必要とされる場合、ポリペプチドは従来の手段で単
離される。発現ベクターの構成に依存して、アスペルギ
ラス−スブチリシンが、生成され、又はシグナル配列が
存在する場合、生成され、そして分泌される。選択され
た宿主が発現のために適切か又は適切でないかは、発現
ベクターを構成するために選択された調節配列、特にプ
ロモーターに主に依存する。
【００７５】アスペルギラス、好ましくはＡ．ニガー遺
伝子に由来するプロモーターが本発明のアスペルギラス
−スブチリシン遺伝子の発現のために使用される場合、
アスペルギラス株、好ましくはＡ．ニガーが適切な宿主
である。しかしながら、アスペルギラスに由来しないプ
ロモーターが本発明の発現ベクターの構成のために使用
される場合、他の宿主、たとえば細菌、たとえばＥ．コ
リ、又は酵母、たとえばＳ．セレビシアエがその発現の
ために適切である。本発明のポリペプチドの調製のため
の適切な宿主及びプロモーターはまた、前記に与えられ
た形質転換のために適切なものでもある。
【００７６】特に本発明は、形質転換されたアスペルギ
ラス宿主が、内因性アスペルギラス−スブチリシン遺伝
子が活性的である条件下で外因性アスペルギラス−スブ
チリシン遺伝子を発現し、そして従って、高められた遺
伝子用量のために天然量のアスペルギラス−スブチリシ
ンよりも多く発現する方法に関する。このためには、ア
スペルギラス宿主、特にＡ．ニガーが、アスペルギラス
−スブチリシン遺伝子を含む発現ベクターにより、その
相同性の、すなわち天然において結合される発現制御配
列、特にプロモーター及びシグナル配列の制御下で形質
転換される。
【００７７】特に、本発明はまた、形質転換されたアス
ペルギラス宿主が、外因性アスペルギラス−スブチリシ
ン遺伝子を、それは異なったプロモーターに融合される
ので、より高いレベルに又は内因性遺伝子よりも異なっ
た条件下で発現する方法にも関する。
【００７８】外因性遺伝子の最大発現のための条件は、
選択された発現システムに依存する。たとえば、Ａ．ニ
ガーのペクチンリアーゼ（ＰＬ）又はポリガラクツロナ
ーゼ（ＰＧ）遺伝子のプロモーターが使用される場合、
それらと共に結合されるアスペルギラス−スブチリシン
遺伝子の発現は、培養培地へのペクチン又はペクチン分
解生成物の添加によりＡ．ニガー細胞において誘発でき
る。しかしながら、十分なグルコースの存在において
は、プロモーターは、Ａ．ニガー株、たとえばＡｎ８
（ＤＳＭ３９１７）が宿主として使用される場合、誘発
できない。これは、Ａ．ニガーＰＬ又はＰＧプロモータ
ーの制御下でのアスペルギラス−スブチリシン遺伝子が
Ａ．ニガーにおいて“カタボライトリプレッション”さ
れることを意味する。しかしながら、他のアスペルギラ
ス株、好ましくはＡ．オリザエ又は最っとも好ましくは
Ａ．ニジュランスが使用される場合、Ａ．ニガーＰＬ又
はＰＧプロモーターの制御下でのアスペルギラス−スブ
チリシン遺伝子が、構成的に、すなわち、またペクチン
の不在及び／又はグルコースの存在下で発現される。従
って、たとえばペクチンの代わりにグルコースが遺伝子
の発現の間、エネルギー及び炭素源として栄養培地に添
加され得るので、Ａ．ニガー以外のアスペルギラス宿
主、好ましくはＡ．オリザエ又は最っとも好ましくは
Ａ．ニジュランスにおいてＡ．ニガーＰＬ又はＰＧプロ
モーターの制御下でアスペルギラス−スブチリシン遺伝
子を発現することが好都合である。
【００７９】アスペルギラス、好ましくはＡ．ニガーの
ピルベートキナーゼプロモーターがアスペルギラス−ス
ブチリシン遺伝子の発現のために使用される場合、その
遺伝子は、炭素源及びエネルギー源としてグルコースを
含む最少培地が使用される場合に発現される。
【００８０】アスペルギラス−スブチリシンを過剰発現
することが現在可能であり、それによって、種々の方法
が適用され得る。精製された単一のアスペルギラス−ス
ブチリシンは、次の方法により調製され得、ここで前記
方法とは、いづれのアスペルギラス−スブチリシンも発
現できず、又はアスペルギラス−スブチリシンを低量で
発現し、又は外因性アスペルギラス−スブチリシン遺伝
子の発現のために使用される誘発条件下でアスペルギラ
ス−スブチリシンを発現しない適切な宿主が、好ましく
はＡ．ニガー、最っとも好ましくは配列番号１に示され
るＰＥＰＣ又はアスペルギラス−スブチリシンセリンプ
ロテアーゼ活性のフラグメントからの、アスペルギラス
−スブチリシンをコードする構造遺伝子を含んで成るハ
イブリッドベクターにより形質転換され、そして前記構
造遺伝子が発現されることを含んで成る。いづれのアス
ペルギラス−スブチリシンも発現できない宿主が使用さ
れる場合、それぞれ単一のアスペルギラス−スブチリシ
ンが純粋な形で得られ、このことはいづれか他のアスペ
ルギラス−スブチリシンによって汚染されていないこと
を意味する。
【００８１】いづれのアスペルギラス−スブチリシンも
発現できない宿主は、対応する遺伝子を有さない微生
物、又は内因性アスペルギラス−スブチリシン遺伝子の
発現が適切に条件づけられた増殖培地において抑制され
るが、しかし所望するアスペルギラス−スブチリシン構
造遺伝子、たとえばＡ．ニガー由来のプロモーターによ
り操作可能的に結合される外因性アスペルギラス−スブ
チリシンプロモーターがそれらの条件下で活性的であ
り、又はアスペルギラス−スブチリシン遺伝子が他のプ
ロモーターに融合されているアスペルギラス株のいづれ
かである。アスペルギラス−スブチリシンの調製のため
に適切な他のプロモーター及び株は、本発明の発現ベク
ターの記載に与えられる。
【００８２】アスペルギラス−スブチリシン及びその使
用 本発明はまた、スブチリシン型自体の純粋なアスペルギ
ラスセリンプロテアーゼ（この後、“アスペルギラス−
スブチリシン”と称する）にも関する。そのようなプロ
テアーゼは、（ａ）アスペルギラス spec.に由来し、
（ｂ）活性部位での触媒性セリン残基によりプロテアー
ゼ活性を示し、そして（ｃ）スブチリシン科へのグルー
プ分けのために既知のセリンプロテアーゼとの十分なア
ミノ酸配列相同性を有するものとして理解されている。
用語アスペルギラス−スブチリシンとはまた、セリンプ
ロテアーゼ活性を保持するような酵素のフラグメントも
包含する。
【００８３】本発明は好ましくは、アスペルギラス ニ
ガーの純粋なアスペルギラス−スブチリシン、好ましく
は配列番号１に列挙する配列に示されるアミノ酸配列を
有するセリンプロテアーゼＰＥＰＣ又は配列番号６に列
挙する配列に示されるアミノ酸配列を有するセリンプロ
テアーゼＰＥＰＤ及びセリンプロテアーゼ活性を保持す
るそれらのフラグメント及び変異体に関する。
【００８４】本発明はさらに、１又は複数のアスペルギ
ラス−スブチリシン及び／又はセリンプロテアーゼ活性
を有するそのフラグメント、及び／又は生物学的に許容
できるその塩、及び場合によっては、アスペルギラス−
スブチリシン活性以外の活性を有する１又は複数の適切
な酵素を含んで成る酵素組成物にも関する。
【００８５】アスペルギラス−スブチリシンにおいて欠
陥性のアスペルギラス株 本発明はまた、内因性アスペルギラス−スブチリシン遺
伝子において欠陥性の、変異誘発されたアスペルギラス
株、好ましくは変異誘発されたＡ．ニガー株にも関す
る。配列番号１に示されるｐｅｐＣ遺伝子又は配列番号
６に示されるｐｅｐＤ遺伝子において欠陥性のＡ．ニガ
ー株が好ましい。ｐｅｐＣ及びｐｅｐＤ遺伝子の両者に
おいて欠陥性のＡ．ニガー株もまた好ましい。
【００８６】欠陥性アスペルギラス−スブチリシン遺伝
子を有する本発明の変異誘発されたアスペルギラス株
は、本発明の好ましい態様においては、遺伝子破壊によ
り調製され得、すなわち破壊されることが所望される内
因性アスペルギラス遺伝子に対応するＤＮＡ配列が欠陥
遺伝子にインビトロ変異誘発され、そしてアスペルギラ
ス宿主細胞が形質転換される。細胞における相同組換え
出来事により、損なわれていない内因性遺伝子が欠陥性
外因性遺伝子により置換される。通常、外因性遺伝子
は、コード領域中にマーカー遺伝子を挿入することによ
って破壊される。これは、容易にモニターされ得、そし
て破壊されたその対応する内因性遺伝子による形質転換
体の選択のために使用される欠陥性遺伝子を導びく。し
かしながら、変異誘発のための他の方法もまた、内因性
アスペルギラス−スブチリシン遺伝子が機能的なアスペ
ルギラス−スブチリシンが発現され得ないような手段で
変異誘発される、変異誘発されたアスペルギラス株、好
ましくは変異誘発されてＡ．ニガー株の調製のためにも
使用され得る。
【００８７】本発明の最っとも好ましい態様において
は、Ａ．ニガー株が、配列番号１に示されるｐｅｐＣ遺
伝子の欠陥性変異体、たとえば添付例に記載されるプラ
スミドｐＰＥＰＣＰＹＲＡに含まれるような、挿入され
る選択マーカー遺伝子を有する破壊されたｐｅｐＣ遺伝
子を含んで成るハイブリッドベクターにより形質転換さ
れ、そして形質転換体が選択される。
【００８８】本発明のもう１つの最っとも好ましい態様
においては、Ａ．ニガー株が、配列番号６に示されるｐ
ｅｐＤ遺伝子の欠陥性変異体、たとえば添付例に記載さ
れるプラスミドｐＰＥＰＣＰＹＲＡに含まれるような、
挿入される選択マーカー遺伝子を有する破壊されたｐｅ
ｐＤ遺伝子を含んで成るハイブリッドベクターにより形
質転換され、そして形質転換体が選択される。
【００８９】本発明の第三の最っとも好ましい態様にお
いては、Ａ．ニガー株が、配列番号１に示されるｐｅｐ
Ｃ遺伝子の欠陥性変異体、たとえば添付例に記載される
プラスミドｐＰＥＰＣＰＹＲＡに含まれるような、挿入
される選択マーカー遺伝子を有する破壊されたｐｅｐＣ
遺伝子により、及び配列番号６に示されるｐｅｐＤ遺伝
子の欠陥性変異体、たとえば添付例に記載されるプラス
ミドｐＰＥＰＣＰＹＲＡに含まれるような、挿入される
選択マーカー遺伝子を有する破壊されたｐｅｐＤ遺伝子
により形質転換され、そして両ｐｅｐＣ及びｐｅｐＤに
おいて欠陥性の形質転換体が選択される。
【００９０】欠陥性アスペルギラス−スブチリシン遺伝
子を有する本発明の変異誘発されたアスペルギラス株
は、非相同性又は相同性タンパク質の改良された生成の
細胞内又は細胞外発現のために有用である。アスペルギ
ラス spec.における非相同又は相同タンパク質の発現
は、従来の方法に従って達成され得る。通常、アスペル
ギラスにおいて機能的な相同又は非相同プロモーター及
び場合によっては、アスペルギラスにおいて機能的な他
の発現制御配列、たとえば前記に定義されたものにより
操作可能的に結合される相同又は非相同遺伝子を含んで
成る発現ベクターが構成される。必要とされる場合、ポ
リペプチドは従来の手段で単離される。発現ベクターの
構成に依存して、生成物は、宿主細胞に生成され、又は
シグナル配列が存在する場合、細胞に生成され、そして
分泌される。
【００９１】これに関しての構造遺伝子は、たとえばウ
ィルス、原核細胞又は真核細胞に起因し、そしてゲノム
ＤＮＡ、又はｍＲＮＡ路を通して調製されたｃＤＮＡに
由来し、又は化学的に合成され得、そして広範囲の種類
の有用なポリペプチド、たとえば特に高等真核生物、特
に哺乳類、たとえば動物又は特にヒト起源のグリコシル
化されたポリペプチド、たとえば栄養物の生成及び酵素
反応を化学的に行なうために使用され得る酵素、又はヒ
ト及び動物疾病の処置又はその予防のために有用且つ価
値があるポリペプチド、たとえばホルモン、免疫調節、
抗ウィルス及び抗腫瘍性質を有するポリペプチド、抗
体、ウィルス抗原、ワクチン、血餅因子、食物及び同様
のものをコードする。
【００９２】そのような構造遺伝子の例は、アスペルギ
ラスポリガラクツロナーゼ、たとえばＰＧＩ又はＰＧI
I、又はアスペルギラスペクチンリアーゼ、たとえばＰ
ＬＩ，ＰＬＡ，ＰＬＢ，ＰＬＣ，ＰＬＥ及びＰＬＦ、又
はホルモン、たとえばセレクチン、チモシン、レラキシ
ン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモ
ン、アデノコルチコトロピン、メラニン細胞刺激ホルモ
ン、β−リポトロピン、ウロガストロン又はインスリ
ン、増殖因子、たとえば上皮増殖因子、インスリン様増
殖因子（ＩＧＦ）、たとえばＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−I
I、マスト細胞増殖因子、神経増殖因子、グリア由来の
神経細胞増殖因子、又は形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、
たとえばＴＧＦβ、増殖ホルモン、たとえばヒト又はウ
シ増殖ホルモン、インターロイキン、たとえばインター
ロイキン−１又は２、ヒトマクロファージ遊走阻止因子
（ＭＩＦ）、インターフェロン、たとえばヒトα−イン
ターフェロン、たとえばインターフェロン−αＡ，α
Ｂ，αＤ又はαＦ，β−インターフェロン、γ−インタ
ーフェロン又はハイブリッドインターフェロン、たとえ
ばαＡ−αＤ−又はαＢ−αＤ−ハイブリッドインター
フェロン、特にハイブリッドインターフェロンＢＤＢ
Ｂ、プロテイナーゼインヒビター、たとえばα1 −抗ト
リプシン、ＳＬＰＩ及び同様のもの、肝炎ウィルス抗
原、たとえばＢ型肝炎ウィルス表面又はコア抗原又はＡ
型肝炎ウィルス抗原、又は非Ａ−非Ｂ型肝炎抗原、プラ
スミノーゲン活性化因子、たとえば組織プラスミノーゲ
ン活性化因子又はウロキナーゼ、腫瘍壊死因子、ソマト
スタチン、レニン、β−エンドロピン、免疫グロブリ
ン、たとえば免疫グロブリンのＬ及び／又はＨ鎖、又は
ヒト−マウスハイブリッド免疫グロブリン、免疫グロブ
リン結合因子、たとえば免疫グロブリンＥ結合因子、カ
ルシトニン、ヒトカルシトニン−関連ペプチド、血餅因
子、たとえば第IX又は第VIIIｃ因子、エリトロポエチ
ン、エグリン(eglin) 、たとえばエグリンＣ、ヒルジ
ン、デスルファトヒルジン、たとえばデスルファトヒル
ジン変異ＨＶ１，ＨＶ２又はＰＡ、ヒトスーパーオキシ
ドジスムターゼ、ウィルスチミジンキナーゼ、β−ラク
タマーゼ、グルコースイソメラーゼをコードするもので
ある。好ましい遺伝子は、ヒトα−インターフェロン又
はハイブリッドインターフェロン、特にハイブリッドイ
ンターフェロンＢＤＢＢ、ヒト組織プラスミノーゲン活
性化因子（ｔ−ＰＡ）、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（Ｈ
ＢＶｓＡｇ）、インスリン様増殖因子Ｉ及びII、エグリ
ンＣ及びデスルファトヒルジン、たとえば変異ＨＶＩを
コードするものである。最っとも好ましい態様は、次の
例に記載されるものである。
【００９３】
【実施例】次の例は本発明を例示するものであって、限
定するものではない。 略語は次の意味を有する： ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン ＤＴＴ：１，４−ジチオトレイトール ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩 ＩＰＴＧ：イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ
シド kbp ：キロ塩基対 ＰＥＧ：ポリエチレングリコール ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム Tris：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン Ｘ−ｇａｌ：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
−β−ガクラトシド
【００９４】緩衝液、培地、試薬 ＳＭ：１００mMのＮａＣｌ，８．１mMのＭｇＳＯ4 ，５
０mMのトリス−ＨＣｌ，pH７．５，０．０１％のゼラチ
ン ＬＢ：１％のトリプチカーゼペプトン（ＢＢＬ）、０．
５％の酵母抽出物（ＢＢＬ）、１％のＮａＣｌ及び０．
５mMのトリス−ＨＣｌ，pH７．５ ＬＭ：１％のトリプチカーゼペプトン（ＢＢＬ）、０．
５％の酵母抽出物（ＢＢＬ）、１０mMのＮａＣｌ及び１
０mMのＭｇＣｌ2 ＳＳＣ：０．１５ＭのＮａＣｌ，０．０１５Ｍのクエン
酸三ナトリウム ＰＳＢ：１０mMのトリス−ＨＣｌ，pH７．６，１００mM
のＮａＣｌ，１０mMのＭｇＣｌ2 ＴＥ：１０mMのトリス−ＨＣｌ，pH８．０，０．１mMの
ＥＤＴＡ，pH８．０ 最少培地：１ｌは、１．５ｇのＫＨ2 ＰＯ4 ，０．５ｇ
のＫＣｌ，０．５ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ，０．９mg
のＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ，０．２mgのＭｎＣｌ2 ・４Ｈ
2 Ｏ，０．０６mgのＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ，０．０６mg
のＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ，０．２９mgのＣａＣｌ2 ・６
２Ｈ2 Ｏ，０．２mgのＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、テキスト
に特定されるような窒素及び炭素源又はそれらの源が明
白に言及されていなければ、１ｌ当たり６ｇのＮａＮＯ
3 及び１０ｇのグルコース（ＮａＯＨによりpH６．０に
調節されている） 完全培地：１ｌ当たり６ｇのＮａＮＯ3 及び１０ｇのグ
ルコースを含む最少培地＋１ｌ当たり２ｇのトリプチカ
ーゼペプトン（ＢＢＬ）、１ｇのカザミノ酸(Difco) 、
１ｇの酵母抽出物（ＢＢＬ）、酵母からの０．５ｇのリ
ボ核酸ナトリウム塩(ICN, Cleveland, USA) 、２mlのビ
タミン溶液、ＮａＯＨによりpH６．０に調製されている ビタミン溶液：１００ml当たり、１０ngのチアミン、１
００mgのリボフラビン、１０mgのパントテン酸、２mgの
ビオチン、１０mgのＰ−アミノ安息香酸、１００mgのニ
コチンアミド、５０mgのピリドキシン−ＨＣｌ ＴＢＥ：１ｌ当たり４mlの０．５ＭのＥＤＴＡ（pH８．
０）溶液、１０．８ｇのトリス及び５．５ｇのＨ3 ＢＯ
3 を含む フェノール：Maniatisなど. 、 Molecular Cloning：A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory
1982 (p438) により記載しているようにして処理された
フェノール サンプル緩衝液：１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、１
００mMのＥＤＴＡ，pH８．０及び０．０１％のブロモフ
ェノールブルー RNase Ａ：Maniatisなど. 、 Molecular Cloning：A La
boratory Manual, ColdSpring Harbour Laboratory 198
2 (p451) により記載しているようにして処理されたRNa
se Ａ
【００９５】次の株及びベクターが使用される：Ａ．ニガー Ｎ４００：野生型Ａ．ニガー Ａｎ８：ＥＰ−Ａ−０２７８３５５に開示さ
れ、ＤＳＭ３９１７として寄託されている、ペクチナー
ゼ複合体を高く生成する株Ａ．ニガーＮ７５６のウリジ
ン栄養要求変異体。Ｅ．コリ ＬＥ３９２：Ｆ- ， hsdR514 (rk- ，mk+ ),
supE44, supF58, l acY1、又は ( lac1ZY)6, gal
K2, galT22, metB1, trpR55, λ- 。Ｅ．コリ ＤＨ５αＦ′：Ｆ′, endA1, hsdR17, (rk
- ，mk+ ), supE44, t hi−1, recA1, gyrA, r
elA1,)80φ lacZM15, Δ (lacZYA − argF)U169, λ
- 。 ＥＭＢＬ４：ＥＭＢＬ４は９〜２３kbp のクローニング
能力を有するλ置換ベクターである(Frischaufなど、
J.Mol.Biol. 170： 827〜842, 1983)。それはλアーム
と非必須スタファー(stuffer) 領域との間に複数のクロ
ーニング領域を含む。これは、ベクターアームへのスタ
ファーの再連結が、対象の外来性ＤＮＡが挿入されるに
つれて減じられるような態様での複数の制限酵素消化の
実施を可能にする。そのベクターはまた、組換え体に直
接的な選択を提供するためにＳｐｉ表現型を使用する(Z
isslerなど. 、A.D.Hershey, The Bacteriophagelambd
a, Cold Spring Harbour Laboratory, 1971)。
【００９６】例１：アスペルギラス ニガーのゲノムラ
イブラリィーの構成例 １．１：Ａ．ニガーＮ４００から高分子量ＤＮＡの単離 アスペルギラス ニガー株Ｎ４００の分生子柄を、２０
０mlの最少培地に接種し、１０6 個の胞子／mlの最終胞
子密度にし、そして１ｌの三角フラスコにおいて２８℃
で２４時間、３００rpm で振盪する。菌糸をブフナー漏
斗上での Myraclothを通しての濾過により収穫し、冷た
い滅菌塩溶液により洗浄し、液体窒素中で凍結し、そし
て−６０℃で貯蔵し又は直接的に使用する。ゲノムライ
ブラリィーを調製するためにＤＮＡの単離に使用される
方法は、Yeltonなど. 〔 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：
1470〜1474 (1984) 〕に記載される方法に基づかれる。
【００９７】ライブラリィー構成のためには、１０ｇの
菌糸を、 Braunマイクロ−ディスメンブレーターにおい
て、１ｇづつ液体窒素中で粉砕する。粉砕された菌糸
を、２００mlの抽出緩衝液（５０mMのＥＤＴＡ，pH８．
５，０．２％のＳＤＳ）及び２００μｌのジエチルピロ
カーボネートを含む１ｌの滅菌三角フラスコに移す。そ
の混合物をゆっくり室温に暖め、そして時々振盪しなが
ら、６８℃に２０分間にわたって加熱する。その懸濁液
を室温に冷却し、そして１２，０００×ｇで１５分間、
遠心分離する。８Ｍの酢酸カリウム溶液（pH４．２）の
１／１６体積を、前記上清液に添加し、そしてその混合
物を氷上に１時間放置する。沈殿物を遠心分離（２０
分；１６，０００×ｇ；４℃）により除去する。核酸
を、氷上で１５分間イソプロパノール０．６体積と共に
インキュベーションすることにより上清液から沈殿せし
める。その沈殿された核酸を遠心分離（１０分；６，０
００×ｇ；４℃）により集め、７０％エタノールにより
洗浄し、そしてすぐに乾燥せしめる。ペレットを、２０
μｇ／mlのRNAse Ａ (Boehringer, Mannheim) を含むＴ
Ｅ１０mlに懸濁し、そして３７℃で１５分間インキュベ
ートする。ＤＮＡをヌクレアーゼを含まないプロナーゼ
（１mg／mlの最終濃度)(Kochlight, Coinbrook)により
３７℃で１時間、処理する。
【００９８】８．５ｇのＣｓＣｌを、得られたＤＮＡ溶
液９mlに溶解し、１０mg／mlの臭化エチジウム０．２ml
を添加し、そしてこの溶液を、Beckman ＳＷ４１ロータ
ーにより３３，０００rpm で６０時間又はBeckman ５０
Ｔｉローターにより４５，０００rpm で４０時間、遠
心分離する。ＤＮＡバンドを集めし、そして臭化エチジ
ウムを、水中、ＮａＣｌの飽和溶液により平衡化された
イソプロパノールによる複数回の抽出により除去する。
５体積のＴＥを添加し、そしてそのＤＮＡ溶液を、ＴＥ
飽和フェノール、フェノール／クロロホルム／イソアミ
ルアルコール２５：２４：１及びクロロホルム／イソア
ミルアルコール２４：１により連続的に処理する。その
ＤＮＡを、０．１体積の３Ｍの酢酸ナトリウムpH５．
２、２．５体積のエタノールの添加及び−２０℃での一
晩のインキュベーションにより沈殿せしめる。沈殿物を
遠心分離（１時間；３０，０００×ｇ；４℃）により集
め、７０％エタノールにより洗浄し、乾燥せしめ、そし
て４００μｌのＴＥに溶解する。
【００９９】例１．２：ＭｂｏＩによるＡ．ニガーＮ４
００ＤＮＡの部分的消化及びフラグメントの単離 １３．６〜２３kbp のＤＮＡフラグメントの最大量を付
与するＭｂｏＩ濃度について試験するために、１μｇの
Ａ．ニガーＮ４００ＤＮＡを、供給者により推薦される
適切な緩衝液において、低下する量のＭｂｏＩ（０．５
〜０．００１Ｕ）により３７℃で１時間、１０μｌの体
積で消化する。その反応を、０．２５ＭのＥＤＴＡ １
μｌの添加により停止し、そしてサンプルを、１μｇ／
mlの臭化エチジウムを含むＴＢＥ緩衝液において０．６
％のアガロースゲル上に負荷する。高収率の所望する１
３．６〜２３kbp フラグメントを得るために必要とされ
るＭｂｏＩ濃度は約０．０２Ｕ／μｇ ＤＮＡである。
従って、２mlの合計体積でのＤＮＡ ２００μｇを消化
する。３７℃で１時間後、ＥＤＴＡを添加し、２５mMの
最終濃度にし、酵素を６５℃で１０分間、熱不活性化
し、そしてＤＮＡを沈殿せしめ、洗浄し、乾燥せしめ、
そして４００μｌのＴＥに溶解する。フラグメント化さ
れたＤＮＡを、４℃及び４０Ｖ（３Ｖ／cm）で０．４％
の予備アガロース上で分離する。正しい大きさのフラグ
メントをゲルから切断し、そしてＤＮＡを１００Ｖで２
〜３時間、２mlのＴＢＥにおいて滅菌透析管においてゲ
ルから電気溶離する。電流を３０秒間、逆転し、そして
ＤＮＡを含む緩衝液を集める。次に、フラグメントをエ
タノール沈殿法により濃縮し、そして１００μｌのＴＥ
に溶解する。
【０１００】例１．３：ベクターＤＮＡの調製 Ａ．ニガー 株Ｎ４００のゲノムライブラリィーを、λベ
クターＥＭＢＬ４で構成した。９〜２３kbp のクローニ
ング容量を有するベクターは、 Frischaufなど. 〔 J.M
ol.Biol. 170： 827〜842 (1983)〕及びKarnなど. 〔 P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 77：5172〜76 (1980) 〕により
記載されており、そしてPromega Biotechnology Inc.か
ら購入され得る。１つのファージ中にクローン化される
ゲノムの異なった部分から由来する２種の挿入体を回避
するために、１３．６kbp の最少長さのフラグメントを
クローニングのために使用する。
【０１０１】λＥＭＢＬ４のＤＮＡ １０μｇを、供給
者により推薦される緩衝液において、１００μｌの体積
で３７℃で２時間、５０単位のＢａｍＨＩにより完結ま
で消化する。酵素を６５℃で１０分間、不活性化する。
ＮａＣｌ濃度を１５０mMに高め、そして５０単位のＳａ
ｌＩを添加し、そして３７℃でのインキュベーションを
さらに２時間続ける。その後、ＥＤＴＡを添加し、２５
mMの濃度にし、そして６５℃で１０分間、加熱すること
によって酵素を不活性化する。その溶液を、等体積のフ
ェノール（ＴＥ飽和された）、フェノール／クロロホル
ム／イソアミルアルコール２５：２４：１及びクロロホ
ルム／イソアミルアルコール２４：１により抽出する。
小さなＢａｍＨＩ／ＳａｌＩポリリンカーフラグメント
を排除するために、ＤＮＡを、３Ｍの酢酸ナトリウム
（pH５．２）０．１体積の添加後、イソプロパノール
０．６体積により沈殿せしめる。氷上で１５分間及び４
℃及び１２，０００×ｇでの１５分間の遠心分離の後、
沈殿物を７０％エタノールにより十分に洗浄し、乾燥せ
しめ、そして４０μｌのＴＥに溶解する。
【０１０２】例１．４：ゲノムＡ．ニガーＮ４００ＤＮ
Ａフラグメントの連結及びインビトロパッケージング 例２．３に従って調製されたベクターのＣＯＳ部位を、
連結反応の前、アニールすることが必須である。１０mM
のトリス−ＨＣｌ（pH７．５）及び１０mMのＭｇＣｌ2
におけるベクターを、６５℃で１０分間加熱し、そして
次に、４２℃で１時間アニールする。試験連結から、約
１：１（重量）のベクター：フラグメント比は、ほとん
どの組換え体を付与することが見出される。連結は、５
０mMのトリスＨＣｌ（pH７．５），１０mMのＭｇＣｌ
2 ，１０mMのＤＴＴ及び１mMのＡＴＰにおいて、９．５
μｇのベクター及び１０μｇのＤＮＡフラグメントを用
いて、合計体積１００μｌで起こる。ＤＮＡリガーゼ
（ＢＲＬ）を、０．５Ｕ／μｇのＤＮＡ濃度で添加し、
そしてその連結混合物を１４℃で一晩インキュベートす
る。連結について試験するために、連結されたＤＮＡの
サンプルをアガロースゲル上で実験する。また、対照と
して、０．５μｇのベクターを、５μｌの体積でフラグ
メントの添加を伴わないで連結する。
【０１０３】連結混合物をエタノール沈殿法により濃縮
し、そしてインビトロパッケージングの前、２０μｌの
ＴＥに溶解する。インビトロパッケージングは、１μｇ
のＤＮＡをパッケージするために１０μｌの部分を用い
て製造業者の指示に従って、Promega Packagene抽出物
により行なう。抽出物により供給される、１μｇの高分
子量の対照ファージλｃＩ８５７ Ｓａｍ７を、対照と
して別々にパッケージする。パッケージングの後、５０
０μｌのファージ溶液緩衝液（ＰＳＢ）及び５μｌのク
ロロホルムを添加する。組換え体ファージストックを４
℃で貯蔵する。
【０１０４】例１．５：Ａ．ニガー株Ｎ４００ゲノムラ
イブラリィーの滴定及び増幅 Ｅ．コリＮＭ５３９の細胞を、０．２％マルトース、１
０mMのＭｇＳＯ4 及び１mMのＣａＣｌ2 を含むＬＢ培地
上で、１．０の光学密度（６００nm）に増殖する。この
培養物の０．２mlのアリコートを、ＰＳＢにおける適切
なファージ希釈溶液０．１mlに添加する。３７℃で２０
分間のファージの吸着の後、４５℃での０．６％ＬＢ上
部寒天３mlを添加し、その混合物をＬＢ寒天プレート上
にプレートし、そしてそれらを３７℃で一晩インキュベ
ートする。ファージ懸濁液１ml当たりのプラーク形成単
位(pfu) の数は、例１．４に従って調製された２種のフ
ァージストックのために１２×１０5 及び４．２×１０
5pfu／mlである。フラグメントを伴わないで（それぞれ
１７％及び４０％）、対照連結から計算されるバックグ
ラウンドを減じた後、組換え体の絶対数は６×１０5 で
ある。組換え体に含まれるＤＮＡは、２００以上のアス
ペルギラス ニガーゲノムに等しい。
【０１０５】ライブラリィーを増幅するために、両ファ
ージストックの８０μｌアリコートを、ＬＢ寒天プレー
ト上でのＬＢ上部アガロースにプレートし、そして次に
３７℃で一晩インキュベートされるＥ．コリＮＭ５３９
細胞を感染せしめるために使用する。ファージを、室温
で１時間、プレート当たり５mlのＰＳＢを有するプレー
トを軽く振盪することによってアガロースから溶離す
る。ＰＳＢを集め、細菌を除去するために遠心分離し
（６０００×ｇで１０分）、そしてクロロホルムを添加
する（０．５％の最終濃度）。同じ程度にほぼ増幅され
る両ファージストックを、混合し（４０μｌのストッ
ク）、滴定し（８×１０9pfu／ml) 、そして４℃で貯蔵
する。
【０１０６】例２：酵母ＰＲＢプローブの調製例 ２．１：酵母プローブの調製 プラスミドｐＧＰ２０２（ＤＳＭ７０１８として寄託さ
れている）は、ＨｉｎｄIII 及びＳａｕＩにより便利に
切断され得る、酵母ＰＲＢ遺伝子をコードする、酵母Ｄ
ＮＡの３．２kbフラグメントを含む。このプラスミドを
ＨｉｎｄIII 及びＳａｕＩにより消化し、そしてフラグ
メントを０．８％アガロースゲル上で分離する。３．２
kbのフラグメントを切断し、そしてＤＮＡを電気溶離す
る。このフラグメント１００ngを、ラベルされたヌクレ
オチドとして、32Ｐ−ｄＡＴＰによりニックトランスレ
ーションし、そしてすぐに、サザンブロット又はプラー
クリフトプロービングのために使用する。
【０１０７】例２．２：Ａ．ニガーＤＮＡのサザンブロ
ット 上記ようにして調製されたＡ．ニガーＤＮＡの２μｇリ
コートを、ＢａｍＨＩ又はＨｉｎｄIII のいづれかによ
り消化し、そして０．８％アガロースゲル上で分離す
る。臭化エチジウム染色ゲルの写真を撮った後、ＤＮＡ
を細管ブロッティングによりニトロセルロースフィルタ
ーに移し〔 Southern,E.M., J.Mol.Biol.98： 503〜517
(1975)〕、そして例３に記載されているようにして、
ラベルされた酵母ＰＲＢプローブによりハイブリダイズ
する。両消化物を含むニトロセルロースの別々のストリ
ップを、種々の洗浄手段にゆだね、ノイズ比に対する最
強のシグナルを付与する条件を決定する。６×ＳＳＣに
おける４７℃での予備洗浄、続く２×ＳＳＣにおける室
温での２回の洗浄が最良の結果を付与した。
【０１０８】例３：酵母ＰＲＢプローブによるＡ．ニガ
ーＮ４００ライブラリィーのスクリーニング 上記（例１）アスペルギラス ニガー株Ｎ４００のゲノ
ムライブラリィーの一部を、ＳＭに希釈し、そしてそれ
ぞれ約２０００pfu を含む０．１mlの部分をプレートす
る。宿主細胞を、０．２％マルトースにより補充された
ＬＢ−培地５０mlをＬＢ−培地中、Ｅ．コリＮＭ５３９
の一晩の培養物０．５mlにより接種し、３７℃，２５０
rpm で４時間振盪し、続いて０．５mlの１Ｍ ＭｇＳＯ
4 及び０．５mlの０．５Ｍ ＣａＣｌ2 を添加すること
によって調製する。それぞれの細胞の０．２mlアリコー
トを、ファージ懸濁液０．１mlと共にそれぞれ混合し、
そして室温で３０分間インキュベートする。次に、４７
℃でのＬＭ−培地中、０．７％アガロース３mlを添加
し、短時間撹拌し、そしてすぐに、ＬＭ寒天プレート上
にプレートする。そのプレートを３７℃で一晩インキュ
ベートし、そして４℃で２時間、急冷する。
【０１０９】Benton and Davisプラークハイブリダイゼ
ーション法〔 Benton,W.D. and Davis,R.W., Science 1
96： 180〜182 (1977)〕に従って、個々のプレートから
２種のレプリカを製造する。第１のフィルター(Schleic
her and Schuell BA85) をプレートの上部に１分間配置
し、第２レプリカを２分間配置し、そしてレプリカの位
置を Indiaインクを用いて印を付ける。フィルターの除
去の後、それらを、変性溶液（１ＭのＮａＣｌ，０．５
ＭのＮａＯＨ）１００mlを含む皿に０．５分間配置し、
そして次に中和溶液（０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ，pH
７．５，１．５ＭのＮａＣｌ）１００mlに１分間配置す
る。フィルターを３×ＳＳＣを含む皿に移し、手ぶくろ
をした手で軽くこすり、細菌残骸を除去し、そして３×
ＳＳＣによりすすぐ。フィルターをブロットし、室温で
１０分間、乾燥せしめ、そしてWhatman ３ＭＭ紙上で８
０℃で２時間、オーブン中において焼付ける。
【０１１０】焼付けられたフィルターを３×ＳＳＣにお
いて湿潤し、室温で１時間その溶液により洗浄し、そし
て次に、２５０mlの予熱された（６５℃）プレハイブリ
ダイゼーション混合物（６×ＳＳＣ，１０×Denhardt's
（０．２％ＢＳＡ，Boehringer画分Ｖ；０．２％ Ficol
l ４００， Pharmacia；０．２％ポリビニルピロリドン
−１０，Sigma)，０．１％ＳＤＳ及び０．１mg／mlの剪
断され、そして新たに変性されたニシン精子ＤＮＡ）を
含む皿に移す。振盪水においての６５℃での１時間のプ
レハイブリダイゼーションの後、フィルターを２５０ml
の予熱された（６５℃）ハイブリダイゼーション混合物
に３０分間、１度洗浄し、ここで前記混合物は前記プレ
ハイブリダイゼーション混合物と同じであるが、但しニ
シン精子ＤＮＡを欠いている。次に、フィルターを、１
５０mlの予熱された（６５℃）ハイブリダイゼーション
混合物を含む皿に移し、これに、前もってラベルされた
プローブが新たに添加される。
【０１１１】６５℃で１４時間のハイブリダイゼーショ
ンの後、フィルターを、２５０mlの予熱された（４７
℃）ハイブリダイゼーション混合物により４７℃で３０
分間、１度洗浄し、続いて２５０mlの２×ＳＳＣにより
２回、それぞれ４５分間、室温で洗浄する。フィルター
を乾燥せしめ、そして増感スクリーンを用いて、Kodak
ＸＡＲ５フィルムに−７０℃で１〜３日間、感光する。
【０１１２】この場合、３種の陽性シグナルがスクリー
ンされた６種のプレートから得られる。陽性プラーク
を、インクマーカーを用いてオートラジオグラム上のプ
レートを注意して位置決定することにより滅菌ピペット
により打抜く。陽性プラークを含む寒天の断片を、ＳＭ
１mlに添加し、そしてクロロホルム２．５μｌを添加
する。ファージを、室温で１時間、時々撹拌しながら、
寒天から拡散せしめ、そして次に４℃で一晩インキュベ
ートする。寒天及び細胞残骸を５分間の遠心分離により
除去し、クロロホルム２．５μｌを添加し、そしてファ
ージストックを４℃で貯蔵する。陽性クローンをλ１，
λ２，λ４と命名する。ファージは高密度でプレートさ
れるので、陽性プラークを、それらを低密度でプレート
し、そしてレプリカプレーティング、ハイブリダイゼー
ション及び陽性プラークのピッキングの完全な方法をく
り返すことによって２度精製する。
【０１１３】例４：λクローンの特徴化例 ４．１：λＤＮＡの単離 組換えクローンからＤＮＡを単離するために、ファージ
まず増幅する。このためには、Ｅ．コリＬＥ３９２宿主
細胞を、１０mMのＭｇＳＯ4 及び０．２％のマルトース
により補充されたＬＢ−培地において１．０の光学密度
（６００nm）に増殖する。次に、精製されたファージの
ストック５０μｌを上記のようにして別々にプレートす
る。３０℃での一晩のインキュベーションの後、ファー
ジを、プレート上にＳＭ ５mlを広げ、そして軽く振盪
しながら、２時間インキュベートすることによって非集
密性プレートから溶離する。溶離されたファージを収穫
し、そしてクロロホルム０．１mlを添加する。その混合
物を短時間撹拌し、そして細胞残骸を遠心分離により除
去する。上清液を回収し、クロロホルムを添加し、０．
３％にし、そして得られたプレート溶解物を４℃で貯蔵
する。
【０１１４】ファージＤＮＡの単離のために出発材料と
してほぼ集密性のプレートを得るために、プレート溶解
物１０mlを、Ｅ．コリＬＥ３９２宿主細胞によりプレー
トする。３７℃で一晩のインキュベーションの後、アガ
ロース上部層を３種のほぼ集密的なプレートから削取
る。それらの層を組合し、２０mlのＳＭ及び０．４mlの
クロロホルムを添加し、そして得られた混合物を３７℃
で３０分間振盪する。細胞残骸及びアガロースを遠心分
離により除去し、上清液を回収し、そしてその体積をＳ
Ｍにより１８mlに調整する。ＳＭ中、等体積の２ＭのＮ
ａＣｌ，２０％のＰＥＧ６０００（ＢＤＨ，Pooole, Ｇ
Ｂ）を添加し、そしてその溶液を混合し、そして氷上に
プレートする。７５分後、ファージを、４℃及び１２０
０×ｇで２０分間の遠心分離によりペレット化する。上
清液をデカントし、そして残る流体を Kleenexティシュ
により除去する。ペレットを３mlのＳＭに再懸濁し、そ
して続いて３mlのクロロホルムにより抽出する。水性相
を３７℃で２０分間、RNaseＡ（６７μｇ／ml）及びDNa
se Ｉ（３３μｇ／ml）により処理する。次に、その混
合物を、フェノール２mlを添加し、撹拌し、クロロホル
ム１mlを添加し、再び撹拌し、そして遠心分離により２
つの相に分離することによって抽出する。水性相を、そ
れぞれ３mlのフェノール／クロロホルム（１：１）及び
３mlのクロロホルムにより２度以上抽出する。次に、Ｄ
ＮＡを、３Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（pH５．２）０．
３ml及びエタノール６mlの連続的な添加により水性相か
ら沈殿せしめる。この混合物を４℃で１６時間放置し、
そして次にＤＮＡを遠心分離（１０分、１２０００×
ｇ，４℃）により回収する。ペレットをＴＥ緩衝液０．
４mlに溶解し、RNase Ａを添加し、２００μｇ／mlに
し、そして３７℃で１時間インキュベートする。ＤＮＡ
を、３Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（pH５．２）３８μｌ
及びエタノール０．８mlの添加により４℃で１時間、沈
殿せしめる。ＤＮＡを遠心分離により回収し、そして続
いて、ＴＥ １００μｌに溶解する。
【０１１５】例４．２：Ａ．ニガーＮ４００ｐｅｐＣク
ローンの制限分析 すべての３種のファージがＡ．ニガーゲノムの同じ領域
に由来する挿入体を含み、そしてλ１の部分的制限地図
が構成されることは、制限分析により確立する。ファー
ジＤＮＡ２μｇを、供給者により推薦される緩衝液（Ｂ
ＲＬ）において２０μｌの体積でのＥｃｏＲＩ ２０単
位により３７℃で１時間消化し、そして次に６５℃で１
０分間加熱する。サンプルを０．７％アガロースゲル上
で実験し、そして写真を撮る。ＤＮＡをニトロセルロー
ス膜に移し、そしてラベルされた酵母ＰＲＢプローブに
よりハイブリダイズする。１２kb及び２．７kbのＥｃｏ
ＲＩフラグメントを含むすべての３種のファージは同一
であることがそれらの消化物から明らかである。１２kb
のフラグメントは、ＰＲＢプローブにハイブリダイズさ
れる唯一のフラグメントであり、そして従って、対応す
るＡ．ニガー遺伝子のすべてではないが、ほとんどを含
むことがまた明らかである。λ１を追加の分析のために
選択する。
【０１１６】λ１を種々の制限酵素によりさらに消化
し、そして再びサザン分析にゆだねる。ＰＲＢプローブ
にハイブリダイズするすべてのバンドを含むと思われる
最少バンドは、３．２kbのＥｃｏＲＩ ＢａｍＨＩフラ
グメントである。その結果、これはプラスミド中にサブ
クローン化される。
【０１１７】例５：プラスミド中へのＰＥＰＣのクロー
ニング及びその配列決定及び特徴化例 ５．１：ｐＴＺＰＥＰＣの構成 λ１ＤＮＡを上記のようにして、制限酵素ＢａｍＨＩ及
びＥｃｏＲＩと共にインキュベートする。クロロホルム
による抽出の後、ＤＮＡを沈殿せしめ、遠心分離により
ペレット化し、サンプル緩衝液に溶解し、そして１×Ｔ
ＢＥ緩衝液中、０．６％アガロースゲル上での電気泳動
にゆだねる。３．２kbp のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラ
グメントを含むゲルスライスを回収し、そしてＤＮＡを
電気溶離する。次に、それをクロロホルム１００μｌに
より抽出し、そしてエタノール沈殿せしめ、そしてＴＥ
緩衝液４０mlに再溶解する。ＤＮＡ濃度を、アガロース
ゲル電気泳動、続くＵＶ光下でのバンドの可視化により
推定する。
【０１１８】ｐＴＺ１８Ｒベクターを、供給者（ＢＲ
Ｌ）により推薦される条件下で、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏ
ＲＩによる消化により調製する。ＤＮＡをフェノール、
フェノール／クロロホルム（１：１）及びクロロホルム
により抽出し、そしてＤＮＡをエタノール沈殿せしめ
る。上記個々のフラグメント１００ngを、ＢＲＬにより
推薦される緩衝液＋ＡＴＰ（１mM），１．５ＵのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）を含む反応体積２５μｌにおい
て一緒に連結する。その反応混合物を１６℃で１６時間
インキュベートし、そして次にＥ．コリＤＨ５αＦ′を
形質転換する。細胞を、２５μｇ／mlのアンピシリン、
０．００５％のＸｇａｌ，０．０５mMのＩＰＴＧを含む
ＬＢ寒天プレート上にプレートし、そして３７℃で一晩
インキュベートする。
【０１１９】いくつかの単一の白色コロニーを用いて、
０．１％のグルコース及び２５mg／mlのアンピシリンに
より補充されたＬＢ培地において一晩の培養物を調製す
る。それらの培養物を、Holmes及びQuigley 〔 Holmes,
P.S. and Quigley,M., Anal.Biochem. 114：193 (198
1)〕のminiprep法を用いて、プラスミドを単離するため
に使用する。プラスミドを、供給者（ＢＲＬ）の推薦に
従って及びRNase Ａ（０．５mg／ml）の存在下で、いく
つかの制限酵素により消化し、そして生成物をアガロー
スゲル上で分析する。予測されるサイズのＢａｍＨＩ−
ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII フラグメントを生ぜしめる
プラスミドを選択し、そしてそれらを含むＥ．コリ細胞
をグリセロール上で−２０℃で維持する。このプラスミ
ドを、ｐＴＺＰＥＰＣ（ＤＳＭ７０１７とし寄託され
た）と称する。
【０１２０】例５．２：ｐｅｐＣのヌクレオチド配列 ｐｅｐＣサブクローン、すなわちｐＴＺ１８Ｒベクター
における３．２kbp のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメ
ントを、合成オリゴヌクレオチドプライマー及びSequen
ase (United States Biochemical Corp.)を用いて、ジ
デオキシ−鎖停止法〔Sangerなど. 、 Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 74：5463〜67 (1977) 〕により完全に配列決定
する。完全なヌクレオチド配列は、配列表に存在する。
その読み取り枠を他の既知のスブチリシン科のセリンプ
ロテアーゼとの比較により同定し、そしてこれを転写マ
ッピングにより確かめる。
【０１２１】例５．３：ＰＥＰＣのＲＮＡマッピング 全ＲＮＡを、炭素源としてグルコース及び窒素源として
アンモニアを含む最少培地上で増殖される粉砕凍結乾燥
された菌糸体から Frederick及びKinsey〔Curr.Genet.
18：53〜58 (1990) 〕の方法により調製する。ｍＲＮＡ
の５′端を、３２−Ｐ末端ラベル化オリゴヌクレオチ
ド、すなわちオリゴＡ（配列番号１のヌクレオチド４３
３〜４５６に相補的）により全ＲＮＡをハイブリダイズ
し、そして同じオリゴヌクレオチドによるジデオキシ配
列決定により生成される配列決定反応と比較することに
より、配列決定ゲル上での逆転写酵素により生成される
流出転写体をサイズ分類することによって同定する（Ma
niatisなど．、Molecular Cloning. A Laboratory Manu
al. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Har
bor, NY, 1982)。イントロンの正確なスプライス部位
を、ｐｅｐＣ情報の一部のｃＤＮＡコピーをクローン化
し、そして配列決定することによって同定する。第１の
鎖合成を標準方法（Maniatisなど．、前記）により行な
う。但し、プライミングオリゴヌクレオチドはオリゴＣ
（配列番号１のヌクレオチド９２３〜９４４に相補的）
である。このｃＤＮＡを、オリゴＢ（配列番号１のヌク
レオチド６３１〜６５７に対応する）及びＣを用いてＰ
ＣＲにゆだね、そしてｐＴＺ１８Ｒ中にクローン化す
る。（オリゴＢはさらに、その５′端上にＢａｍＨＩ部
位を有し、そしてオリゴＣはさらにＥｃｏＲＩ部位を有
することを注目すること）。２種の独立したクローンの
両鎖を完全に配列決定する。ｐｅｐＣ遺伝子により生成
されるｍＲＮＡの全長さを、３．２kbのＥｃｏＲＩ−Ｂ
ａｍＨＩフラグメントをプローブとして用いて、ノザン
分析により決定し（Maniatisなど．、前記）、そして
１．５〜１．８kbの間であることが決定され、それは読
み取り枠のサイズ及び転写開始部位の位置から予測され
るものに相当する。
【０１２２】例６：ＰＥＰＣのゲノム破壊例 ６．１：ｐＴＺＰＥＰＣＥの構成 プラスミドｐＴＺＰＥＰＣを、ＢａｍＨＩにより消化
し、Ｔ４ポリメラーゼにより処理し、そして１０モル過
剰のリン酸化されていないＥｃｏＲＩリンカー（５′GG
AATTCC) の存在下で連結する。Ｅ．コリの形質転換の
後、ｐｅｐＣ遺伝子の両端を端に有するＥｃｏＲＩ部位
を有する正しいプラスミドをミニスクリーンにより同定
する。
【０１２３】例６．２：ｐＡＸＩの構成 Ｅ．コリＢＪ５１３８／ｐＣＧ５９Ｄ７（ＤＳＭ３９６
８）から得られるプラスミドｐＣＧ５９Ｄ７をＸｂａＩ
により消化し、そしてＡ．ニガーｐｙｒＡ遺伝子の全体
を含むフラグメントを精製する。これを、ｐＴＺ１８Ｒ
のＸｂａＩ部位中にクローン化し、プラスミドｐＡＸＩ
（ＤＳＭ７０１７として寄託される）を構築する。
【０１２４】例６．３：ｐＰＥＰＣＰＹＲＡの構成 ｐｙｒＡ遺伝子を含む４kbのＸｂａＩフラグメントを、
ｐＡＸＩから切断し、そしてそのベクター配列から精製
する。２μｇのｐＴＺＰＥＰＣＥを製造業者の推薦に従
ってＢｇｌIIにより切断し、そしてフェノール抽出し、
エタノール沈殿せしめ、そして水２０μｌに再溶解す
る。このＤＮＡを、製造業者により推薦されるようにし
て、細菌アルカリホスファターゼにより処理し、５′ホ
スフェト基を除去する。５kbのフラグメントをゲルから
精製する。
【０１２５】上記フラグメントの両者を、製造業者の指
示に従って、Ｔ４ポリメラーゼにより処理し、そしてフ
ェノール抽出し、そしてエタノール沈殿せしめる。それ
らの２種のフラグメントを一緒に混合し、そして連結す
る。Ｅ．コリの形質転換の後、正しいプラスミドを担持
するコロニーを、ミニ−プラスミド調製物の制限消化物
により同定する。
【０１２６】ｐＰＥＰＣＰＹＲＡは、オロチジンモノホ
スフェートデカルボキシラーゼをコードするＸｂａＩ
ＤＮＡフラグメントにより置換された、活性部位ヒスチ
ジン及びセリンの両者をコードする、中央のＢｇｌIIフ
ラグメントを有する、ＰＥＰＣ遺伝子を担持するＥｃｏ
ＲＩフラグメント上に含むｐＴＺ１８Ｒベクターから成
る。
【０１２７】例６．４：Ａ．ニガーの形質転換 １０μｇのプラスミドｐＰＥＰＣＰＹＲＡを、ＥｃｏＲ
Ｉにより完全に消化する。消化物の完全性を、ゲル上に
アリコートを作用せしめることによって調べ、そして残
りのＤＮＡをフェノール抽出し、エタノール沈殿せし
め、そして２０μｌの滅菌水に再懸濁する。
【０１２８】栄養要求性Ａ．ニガーＡｎ８（ＤＳＭ３９
１７）の分生胞子を、十分に胞子形成されるまで、完全
培地上で２８℃で４日間、増殖する。２×１０8 個の分
生子柄を用いて、１ｇ／ｌのアルギニン及びウリジンに
より補充された最少培地２００mlを接種する。
【０１２９】２８℃及び１８０rpm での２０時間の増殖
の後、菌糸体を Miraclothを通しての濾過により収穫
し、０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ2 の溶液１０
mlにより２度洗浄し、そして０．８ＭのＫＣｌ，５０mM
のＣａＣｌ2 ，０．５mg／mlのNovozym ２３４(Novo In
dustries) の溶液２０mlに再懸濁する。その混合物を、
十分なプロトプラストが開放されるまで（９０〜１２０
分後、顕微鏡により検出される）、振盪水浴においてイ
ンキュベートする（３０℃，５０rpm ）。プロトプラス
ト懸濁液を、菌糸体残骸を除去するために、漏斗におけ
るガラス羊毛プラグを通して濾過する。プロトプラスト
を室温で、軽い遠心分離（１０分、２０００rpm ）によ
りペレット化し、そして０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣ
ａＣｌ2 の溶液１０mlにより２度洗浄する。最終的にプ
ロトプラストを０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ2
の溶液２００〜５００μｌに再懸濁し、１×１０8 個の
スフェロプラスト／mlの濃度を付与する。
【０１３０】形質転換のために、プロトプラスト懸濁液
の２００μｌアリコートを、ＥｃｏＲＩにより消化され
たｐＰＥＰＣＰＹＲＡ ５μｇ及び５０μｌのＰＣＴ
（１０mMのトリス−ＨＣｌ，pH７．５，５０mMのＣａＣ
ｌ2 ，２５％のＰＥＧ６０００）と共にインキュベート
する。そのインキュベーション混合物を２０分間氷上に
保持し、他の２mlのＰＣＴを添加し、そしてその混合物
を室温でさらに５分間インキュベートする。０．８Ｍの
ＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ2 の溶液４mlを添加し、そし
て最終形質転換溶液の１mlアリコートを、液体最少寒天
培地（最少培地＋１ｇ／ｌのアルギニン＋１０ｇ／ｌの
Bacto-Agar (Difco)) と共に混合し、０．８ＭのＫＣｌ
により安定化する。その混合物をすぐに、同じ培地の寒
天プレート上に注ぎ、そして３０℃でインキュベートす
る。２８℃で２〜３日間の増殖の後、安定した形質転換
体は激しく増殖し、そして数百の小さな、たぶん早産の
形質転換体のコロニーをバックグラウンド増殖に対して
胞子形成するように思われる。
【０１３１】例６．５：遺伝子破壊の同定 安定コロニーから、個々の胞子懸濁液を製造し、そして
新鮮な最少＋アルギニンプレート上で画線培養する。単
一のコロニーを選択し、そして再画線培養し、純粋な培
養物を付与する。それらは、１ｇ／ｌのアルギニンによ
り補充された液体最少培地２００mlを接種するために使
用される。３０℃で２４時間１８０rpmでの振盪の後、
菌糸体をフィルター紙上に収穫し、そしてパッドを凍結
乾燥せしめる。乾燥の後、ＤＮＡを個々のパッドから、
そのパッドを乳棒及び乳ばちを用いて細かな粉末に粉砕
することによって調製する。この粉末６０mgを、１％ド
デシル硫酸ナトリウム、０．１％のTween ８０，１Ｍの
酢酸アンモニウムの溶液３mlに撹拌しながら再懸濁す
る。これを、時々混合しながら、６５℃で２０分間加熱
する。細胞残骸を、１５，０００rpm での５分間の遠心
分離によりＤＮＡ溶液から分離する。上清液をフェノー
ルにより２度、クロロホルムにより２度抽出し、そして
エタノール沈殿せしめる。そのＤＮＡを滅菌ＴＥ １０
０mlに再溶解する。
【０１３２】個々のＤＮＡ ２０μｌを、 RNAase Ａ
１μｇの存在下で１時間、ＢａｌIIにより消化する。こ
れをアガロース上で分離し、そしてニトロセルロース膜
に移し、そして焼き付ける。ＰＥＰＣを含むｐＴＺＰＥ
ＰＣからのＥｃｏＲＩフラグメントを精製し、ニックト
ランスレーションによりラベルし、そしてフィルターを
プローブするために使用する。ｐｅｐＣ遺伝子の破壊を
担持する株は、１．２kbのＢｇｌIIハイブリダイゼーシ
ョンフラグメントを欠き、そして他の２つのフランキン
グフラグメントの変更された移動性を有することによっ
て容易に認識される。
【０１３３】それらの株の１つを、ウリジン及び５−フ
ルオロ−オロト酸を含む培地上にプレートする。ピリミ
ジン栄養要求性に対する変異体を、この培地上で最強の
増殖により同定し、そして採取し、そして単一のコロニ
ーのために画線培養することによって精製する。
【０１３４】例６．６：ｐｅｐＣ- Ａ．ニガー株におけ
るインターフェロンの生成 例６．５で単離されたｐｅｐＣ- Ａ．ニガーＡｎ８株の
１つを、ｐｙｒＡ+ 含有プラスミド及びインターフェロ
ンのための非相同遺伝子を含む発現カセットによる続く
形質転換のための宿主として使用する。
【０１３５】Ａ．ニガーＡｎ８のウリジン栄養要求性ｐ
ｅｐＣ- 変異体の分生胞子を、十分に胞子形成されるま
で、完全培地において２８℃で４日間、培養する。２×
１０ 8 個の分生子柄を用いて、１ｇ／ｌのアルギニン及
びウリジンにより補充された最少培地２００mlを接種す
る。
【０１３６】２８℃及び１８０rpm での２０時間の増殖
の後、菌糸体を、 Miraclothを通しての濾過により収穫
し、０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ2 の溶液１０
mlにより２度洗浄し、そして０．８ＭのＫＣｌ，５０mM
のＣａＣｌ2 ，０．５mg／mlのNovozym ２３４(Novo In
dustries) の溶液２０mlに再懸濁する。その混合物を、
十分なプロトプラストが開放されるまで（９０〜１２０
分後、顕微鏡により検出される）、振盪水浴においてイ
ンキュベートする（３０℃，５０rpm ）。そのプロトプ
ラスト懸濁液を漏斗におけるガラス羊毛プラグを通して
濾過し、菌糸残骸を除去する。プロトプラストを室温で
軽い遠心分離（１０分、２０００rpm ）によりペレット
化し、そして０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ2 の
溶液１０mlにより２度洗浄する。最後に、プロトプラス
トを、０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ2 の溶液２
００〜５００μｌに再懸濁し、１×１０8 ／mlの濃度を
得る。
【０１３７】形質転換のために、プロトプラスト懸濁液
の２００μｌアリコートを、５μｇのｐＣＧ５９Ｄ７
（ＤＳＭ３９６８）及び５０μｇのｐＧIIｓｓ−ＩＦＮ
ＡＭ１９又はｐＧII−ＩＦＮ ＡＭ１１９ＤＮＡ（両
プラスミドはＥＰ−出願第０４２１９１９号に十分に開
示される）、及び５０μｌのＰＣＴ（１０mMのトリス−
ＨＣｌ，pH７．５，５０mMのＣａＣｌ2 ，２５％のＰＥ
Ｇ６０００）と共にインキュベートする。そのインキュ
ベーション混合物を２０分間氷上に保持し、他の２mlの
ＰＣＴを添加し、そしてその混合物を室温でさらに５分
間インキュベートする。０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣ
ａＣｌ2 の溶液４mlを添加し、そして最終形質転換溶液
の１mlアリコートを、液体最少寒天培地（最少培地＋１
ｇ／ｌのアルギニン＋１０ｇ／ｌのBacto-Agar (Difc
o)) と共に混合し、０．８ＭのＫＣｌにより安定化す
る。その混合物をすぐに、同じ培地の寒天プレート上に
注ぎ、そして３０℃でインキュベートする。２８℃で２
〜３日間の増殖の後、安定した形質転換体は激しく増殖
し、そして数百の小さな、たぶん早産の形質転換体のコ
ロニーをバックグラウンド増殖に対して胞子形成するよ
うに思われる。
【０１３８】形質転換体を採取し、そしてインターフェ
ロン発現について分析する。インターフェロン活性を、
ヒトＣＣＬ−２３細胞及び挑戦ウィルスとして水疱性口
内炎ウィルス（ＶＳＶ）を用いて、 Armstrongの方法
(J.A.Armstrong, Appl.Microbiol. 21, 732 (1971)) に
従って決定する。
【０１３９】形質転換体からの分生胞子を、予備培養培
地(Pectin Slow Set L (Unipectin,SA, Redon, France)
３ｇ／ｌ，ＮＨ4 Ｃｌ ２ｇ／ｌ，ＫＨ2 ＰＯ4 ０．
５ｇ／ｌ，ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ，ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ ０．５ｇ／ｌ，Ｃａ2ＳＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ０．５
ｇ／ｌ，pH７．０，１％のアルギニン）５０ml中で個々
に予備培養する。その予備培養物を、２５０rpm 及び２
８℃で７２時間インキュベートする。１０％の予備培養
物を用いて、主要培養培地（大豆粉２０ｇ／ｌ、ペクチ
ン Slow Set ５ｇ／ｌ，１％のアルギニン）５０mlを接
種する。その培養物を、２５０rpm 及び２８℃で、７２
〜９６時間、増殖せしめる。
【０１４０】種々の時間（２０時間ごとに）で、サンプ
ルを採取し、細胞を遠心分離によりペレット化し、そし
て凍結乾燥及び乾燥粉砕により破壊する。上清液及び細
胞抽出物を、記載のようにしてインターフェロン活性に
ついて両者とも試験する。大部分のインターフェロン活
性は、ｐＧIIｓｓ−ＩＦＮ ＡＭ１１９を担持する形質
転換体においては、培地中に分泌されることが見出さ
れ、そしてｐＧII−ＩＦＮ ＡＭ１１９を担持する形質
転換体においては、それは細胞抽出物に主に見出され
る。
【０１４１】例７：Ａ．ニガーにおけるｐｅｐＣの過剰
発現例 ７．１：複数コピーの過剰発現 Ａ．ニガー Ａｎ８を、１μｇのｐＡＸＩ＋１０μｇのｐ
ＴＺＰＥＰＣにより形質転換し、ウリジンフォートフス
(Photohuhs) を生成する。コロニーを精製し、そしてＤ
ＮＡを上記のようにして調製する。ｐＴＺＰＥＰＣのＥ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを用いてのサザンブ
ロットは、いくつかの形質転換体がそれらのゲノム中に
組込まれたｐＴＺＰＥＰＣの単一コピーを有し、ところ
が他はそれらのゲノム中に１０までの及び１０以上の余
分なコピーを有することを示した。それらの株は、対応
して一層のタンパク質分解活性を生成し、そして分裂的
に安定する。
【０１４２】例７．２：遺伝子融合体からｐｅｐＣの過
剰発現 プラスミドｐＧＷ１１００（ＤＳＭ５７４７として寄託
される）をＢａｍＨＩ及びＳａｃＩにより切断する。ピ
ルベートキナーゼプロモーター及び５′端を含む１．２
kbp のフラグメントを精製し、Ｔ４ポリメラーゼにより
処理し、そしてＴ４ポリメラーゼによりブラント末端化
され、そしてアクリルホスファターゼにより処理され
る、ｐｅｐＣクローンの５′端でｐＴＺＰＥＰＣのユニ
ークＢａｍＨＩ部位中にクローン化する。
【０１４３】正しいプラスミドを、ミニスクリーニング
により同定し、そして１つを選択し、そしてｄｕｔ−，
ｕｎｇ−Ｅ．コリ株ＢＷ３１３を形質転換する。これを
ＭＢＫ０７により過剰感染せしめ、プラスミドからの一
本鎖ウラシル−置換されたＤＮＡを得る。
【０１４４】オリゴヌクレオチド（配列番号３）は、３
７個のヌクレオチドから成る。初めの１９個のヌクレオ
チドは、ｐｅｐＣ読み取り枠の初めの１９個のヌクレオ
チドに対して相補的であり、そして最後の１８個はピル
ベートキナーゼ遺伝子のＡＴＧの前の最後の１８個のヌ
クレオチドに対して相補的である。このプラスミドのイ
ンビトロ変異誘発のためには、５pMのオリゴヌクレオチ
ド１を、供給者により推薦されるように、５０μｌのキ
ナーゼ緩衝液中、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１０Ｕ
によりオリゴヌクレオチドを処理することによって、１
００pMのＡＴＰにより５′末端でリン酸化する。その反
応を、６５℃で１０分間加熱することによって停止せし
める。
【０１４５】０．２pMのウラシル含有一本鎖ＤＮＡを、
２０mMのトリス−ＨＣｌ，pH７．５，１０mMのＭｇＣｌ
2 ，２０mMのＮａＣｌ中において、１０μｌの最終体積
で、０．５pMのリン酸化されたオリゴヌクレオチド１と
共に混合する。その混合物を６５℃で５分間インキュベ
ートし、ゆっくり室温に６０分間にわたって冷却し、そ
して氷上に１５分間置く。次に、５００μＭのｔＮＴＰ
２μｌ、１０mMのＡＴＰ １．５μｌ，Ｔ７ＤＮＡポ
リメラーゼ（１２Ｕ／μｌ Pharmacia）１ml及びＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（１．２Ｕ／μｌ ＢＲＬ）１μｌを前記
混合物に添加し、そしてこの重合混合物を３７℃で１５
分間インキュベートする。その反応を６５℃で５分間加
熱することによって停止し、そしてアリコートを用い
て、Ｅ．コリＤＨ５αＦ′を形質転換する。
【０１４６】正しいプラスミドを、ミニプラスミド調製
物を消化することによって同定する。３種を選択し、そ
してＥｃｏＲＩフラグメントを、合成オリゴヌクレオチ
ドを用いて完全に配列決定する。ｐＰＫＩＰＥＰＣＡと
呼ばれる、ｐｅｐＣ読み取り枠へのピルベートキナーゼ
プロモーターの完全な融合体を含む１つのプラスミド
を、ｐＡＸＩと共に使用し、ウリジン原栄養性にＡ．ニ
ガーＡｎ８を同時形質転換する。
【０１４７】ｐｋｉ−ｐｅｐＣ融合体の存在は、個々の
精製された形質転換体からＤＮＡを製造し、そしてｐｋ
ｉ及びｐｅｐＣからのプローブを用いてサザン分析のた
めにそれを使用することによって確認される。ゲノム中
に組込まれる遺伝子融合体の１又は複数のコピーを有す
る株は、細胞がＣ源としてのグルコース上で急速に増殖
される場合、より一層のタンパク質分解活性を生成する
ことが示される。
【０１４８】例８：他の生物におけるｐｅｐＣの発現：
酵母における発現 プラスミドｐＰＫＩＰＥＰＣＡを、配列番号４及び５に
列挙する配列に示される２種の合成オリゴヌクレオチド
によりインビトロ変異誘発する。前者は、ｐｅｐＣのＡ
ＴＧのすぐ前にＥｃｏＲＩ部位を構築し、そして他は全
イントロンをループする。これは、その配列が完全な配
列決定により確認されているプラスミドｐＰＫＩＰＥＰ
ＣＢを創造する。
【０１４９】ｐｅｐＣのＡＴＧのすぐ前で開始し、そし
てｐｅｐＣターミネーターの後で終わる２．８kbのＥｃ
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを精製し、そして酵母
ＧＡＬ１０プロモーターを含む、ｐＦＢＹ１２９（ＤＳ
Ｍ７０１６として寄託される）の５２０bpのＢａｍＨＩ
−ＥｃｏＲＩフラグメントと共に、酵母基材の２μｍベ
クターｐＦＢＹ２５（ＤＳＭ７０２０として寄託され
る）のＳｎａＢＩ部位中に連結する。正しいプラスミド
を、制限消化物により同定する。このプラスミド、すな
わちｐＦＢＹ１３８を用いて酵母を形質転換し、そして
遺伝子融合がガラクトースにより誘発される場合、ｐｅ
ｐＣタンパク質を生成することが示される。
【０１５０】例９：Ａ．ニガースブチリシン株セリンプ
ロテアーゼについてのスクリーニングのためのＤＮＡプ
ローブの単離 例９．１：変性ＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）のプライ
マーの構成 ポリメラーゼ鎖反応(Saikiなど. 、 Science 230：1350
〜1354 (1985))を用いて、このスクリーニングのための
プローブを単離する。それぞれ、活性部位残基ヒスチジ
ン及びセリンを含む２つの領域は、スブチリシンクラス
の異なったプロテアーゼ間に十分に保存される。コンセ
ンサスアミノ酸配列がそれらの個々の領域のために誘導
され、そしてそれらの２つのアミノ酸配列をコードでき
るＤＮＡ配列が推定される。縮重のレベルを減じるため
に、保存された領域の個々のための２つのプライマーを
構成する。ＰＣＲオリゴ１及びＰＣＲオリゴ２（それぞ
れ配列番号８及び９に示される）はＨｉｓ活性部位領域
に対応し、そしてＰＣＲオリゴ３及びＰＣＲオリゴ４
（それぞれ配列番号１０及び１１に示される）は、Ｓｅ
ｒ活性部位領域に対応する。ＰＣＲ生成物の後でのサブ
クローニングを促進するためには、ＰＣＲオリゴ１及び
２はＢａｍＨＩを含み、そしてＰＣＲオリゴ３及び４
は、同様にそれらの５′端近くにＥｃｏＲＩ制限部位を
含む。
【０１５１】例９．２：Ａ．ニガーゲノムＤＮＡの増幅 Ａ．ニガー ゲノムＤＮＡを、例１に記載されるようにし
て単離する。４種の増幅反応を、上記４種のＰＣＲオリ
ゴの対様組合せを用いて行なう。ポリメラーゼ鎖反応の
ための反応混合物は、１００ngの完全なゲノムＡ．ニガ
ーＤＮＡ、１００ｐモルの個々のプライマー、１０mMの
トリス−ＨＣｌ，５０mMのＫＣｌ，１．５mMのＭｇＣｌ
2 ，１mg／mlのゼラチン（pH８．３）及び５単位のＴａ
ｑ ＤＮＡポリメラーゼを合計５０μｌで含む。そのＤ
ＮＡを９４℃で３０秒間変性し、次にプライマーを４２
℃で４０秒間アニールし、そして拡張段階を７２℃で６
０秒間行なう。それらの３段階を４０回くり返す。
【０１５２】例９．３：ＰＣＲ生成物の単離及び特徴化 前記増幅反応の生成物を、１％アガロースゲル上で分離
し、そしてＤＮＡフラグメントを上記のようにして電気
溶離によりゲルから単離する。単離されたフラグメント
（２００〜３００ng）をフェノール及び次にクロロホル
ムにより抽出し、そしてエタノールにより沈殿せしめ
る。遠心分離の後、ＤＮＡペレットを乾燥せしめ、そし
て次に、１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解する。次に、この
ＤＮＡを１０単位のＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素
により２０μｌの体積で３７℃で１時間、供給者（ＢＲ
Ｌ）により推薦される緩衝液中で消化する。フェノール
及びクロロホルムによる抽出及びエタノールによる沈殿
化に続いて、消化されたＤＮＡをペレット化し、乾燥せ
しめ、そして１０μｌのＴＥ緩衝液に再溶解する。その
ＤＮＡ濃度を、アガロースゲル電気泳動、続くＵＶ光下
でのＤＮＡバンドの可視化により推定する。
【０１５３】ｐＴＺ１８Ｒベクターを、供給者（ＢＲ
Ｌ）により推薦される条件下でＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲ
Ｉによる消化により調製し、そして次に上記のようにし
て抽出し、そしてエタノール沈殿せしめる。１００ngの
単離されたＰＣＲフラグメントを、上記調製されたｐＴ
Ｚ１８Ｒベクター１００ngと共に２０μｌの体積で、１
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結する。使用される
緩衝液条件は、供給者（ＢＲＬ）により示唆される条件
である。１６℃で１６時間、その反応混合物をインキュ
ベートした後、それを用いて、Ｅ．コリＤＨ５αＦ′株
を形質転換する。細胞を、２５μｇ／mlのアンピシリ
ン、０．００５％のＸｇａｌ，０．０５mMのＩＰＴＧを
含むＬＢ寒天プレート上にプレートし、そして３７℃で
一晩インキュベートする。
【０１５４】いくつかの単一の白色コロニーが、０．１
％のグルコース及び２５μｇ／mlのアンピシリンにより
補充された５mlのＬＢ培地における一晩の培養物を調製
するために使用される。これらの培養物は、Holmes及び
Quigley (Holmes D.S. and Quigley,M., Anal Biochem.
114：193 (1981)) のミニプレ方法を用いて、プラスミ
ドＤＮＡを単離するために使用される。プラスミドを、
供給者（ＢＲＬ）の推薦に従ってＢａｍＨＩ及びＥｃｏ
ＲＩ制限酵素により消化する。
【０１５５】選択されたプラスミドの挿入体を、合成オ
リゴヌクレオチドプライマー及びSequenase (United St
ates Biochemical Corp.) を用いて、ジデオキシ−鎖停
止方法 (Sangerなど. 、 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：
5463〜67 (1977))により配列決定する。
【０１５６】例９．４：ＰＣＲ生成物の配列のコンピュ
ーター分析 上記挿入体のヌクレオチド配列を、組合された GenBank
及びＥＭＢＬデータベースにおけるすべてのＤＮＡ配列
に比較する。それらの中で、スブチリシン型プロテアー
ゼをコードするＤＮＡ配列に対して強い相同性を示すも
のをプローブとして選択し、そしてＡ．ニガーゲノムラ
イブラリィーの続くスクリーニングのためにＰＣＲ−プ
ローブと称する。このフラグメント（ＰＣＲプライマー
を有さない）の配列は、配列番号６に示される配列にお
けるヌクレオチド１４７４〜２０２０間の配列である。
【０１５７】例１０：ＰＣＲプローブによるＡ．ニガー
Ｎ４００ライブラリィーのスクリーニング 上記アスペルギラス ニガーが株Ｎ４００のゲノムライ
ブラリィーのプラークハイブリダイゼーションのための
フィルター（例１）を調製し、そして例３に従ってプレ
ハイブリダイズする。６５℃で１４〜１６時間のハイブ
リダイゼーションの後、フィルターを、室温で２５０ml
の２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で３０分間、１度洗浄
し、続いて室温で２５０mlの０．２×ＳＳＣ，０．１％
ＳＤＳ中でそれぞれ２０分間、２度洗浄し、そして最後
に、２５０mlの０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中にお
いて６５℃でそれぞれ２０分間、２度洗浄する。フィル
ターを乾燥せしめ、そして増強スクリーンを用いて、Ko
dak ＸＡＲ５フィルムに−７０℃で１〜３日間、暴露す
る。
【０１５８】この場合、５種の陽性シグナルが６種のス
クリーンされたプレートから得られる。陽性プラーク
を、インクマーカーを用いてオートラジオグラム上のプ
レートを注意して位置決定することによって滅菌 Paste
urピペットにより打抜く。陽性プラークを含む寒天断片
を、１mlのＳＭに添加し、そして２．５μｌのクロロホ
ルムを添加する。ファージを、時々撹拌しながら、室温
で１時間、寒天からの拡散を可能にせしめ、そして次に
４℃で一晩インキュベートする。寒天及び細胞残骸を５
分間の遠心分離により除去し、２．５μｌのクロロホル
ムを添加し、そしてファージストックを４℃で貯蔵す
る。
【０１５９】例１１：λクローンの特徴化 例１１．１：λＤＮＡの単離及びＡ．ニガーＮ４００ｐ
ｅｐＤクローンの制限分析 λＤＮＡを、例４．１に記載しているようにして単離す
る。すべての５種のファージλａ〜λｅは、Ａ．ニガー
ゲノムの同じ領域に由来する挿入体を含むことは制限分
析により確立され、そしてそのゲノム領域の部分的制限
地図を構成する。
【０１６０】２μｇのファージＤＮＡを、供給者（ＢＲ
Ｌ）により推薦される緩衝液において３７℃で１時間、
２０μｌの体積で、２０単位のＥｃｏＲＩ又はＢａｍＨ
Ｉにより消化し、そして次に、６５℃で１０分間、加熱
する。サンプルを０．７％アガロースゲル上で実験し、
そして写真を撮る。そのＤＮＡをニトロセルロース膜に
移し、そしてラベルされたＰＣＲプローブによりハイブ
リダイズせしめる。
【０１６１】５つのファージは、ＰＣＲ−プローブにハ
イブリダイズし、そして従って対応するＡ．ニガー遺伝
子のほとんど（すべてではないが）を含む約５．５kbの
オーバーラップ領域を含むことはそれらの消化物から明
らかである。６．０kbp の長さのＢａｍＨＩフラグメン
トがこの領域を含み、そして追加の分析のために選択す
る。
【０１６２】例１２：プラスミド中へのＰＥＰＤのクロ
ーニング及びその配列決定及び特徴化 例１２．１：ｐＴＺＰＥＰＤの構成 ６．０kbのＢａｍＨＩフラグメントを、制限酵素Ｈｉｎ
ｄIII と共にインキュベートする。クロロホルムによる
抽出の後、ＤＮＡを沈殿せしめ、遠心分離によりペレッ
ト化し、サンプル緩衝液に溶解し、そして１×ＴＢＥ緩
衝液において０．６％アガロースゲル上での電気泳動に
ゆだねる。３．０kbp のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII フラ
グメントを含むゲルスライスを回収し、そしてＤＮＡを
電気溶離する。次にこれを１００μｌのクロロホルムに
より抽出し、そしてエタノール沈殿せしめ、そして４０
mlのＴＥ緩衝液に再溶解する。そのＤＮＡ濃度を、アガ
ロースゲル電気泳動、続くＵＶ光下でのバンドの可視化
により推定する。
【０１６３】ｐＴＺ１８Ｒベクターを、供給者（ＢＲ
Ｌ）により推薦される条件下で、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎ
ｄIII による消化により調製する。そのＤＮＡを、フェ
ノール、フェノール／クロロホルム（１：１）及びクロ
ロホルムにより抽出し、そしてエタノール沈殿せしめ
る。個々の上記フラグメント１００ngを、ＢＲＬにより
推薦される緩衝液＋ＡＴＰ（１mM），１５ＵのＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（ＢＲＬ）を含む、２５μｌの反応体積にお
いて一緒に連結する。その反応混合物を１６℃で１６時
間インキュベートし、そして次に、それを用いてＥ．コ
リＤＨ５αＦ′を形質転換する。細胞を、２５μｇ／ml
のアンピシリン、０．００５％のＸｇａｌ，０．０５mM
のＩＰＴＧを含むＬＢ寒天プレート上にプレートし、そ
して３７℃で一晩インキュベートする。
【０１６４】いくつかの単一の白色コロニーが、０．１
％のグルコース及び２５μｇ／mlのアンピシリンにより
補充されたＬＢ培地における一晩の培養物を調製するた
めに使用される。これらの培養物は、Holmes及びQuigle
y (Holmes D.S. and Quigley,M., Anal Biochem. 114：
193 (1981)) のミニプレ方法を用いて、プラスミドを単
離するために使用される。プラスミドを、供給者（ＢＲ
Ｌ）の推薦に従って及びRNase Ａ（０．５mg／ml）の存
在下でいくつかの制限酵素により消化し、そして生成物
をアガロースゲル上で分析する。予測されるサイズのＢ
ａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントを生成するプラス
ミドを選択し、そしてそれらを有するＥ．コリ細胞を−
２０℃でグリセロール上に維持する。このプラスミド
を、ｐＴＺＰＥＰＤ（ＤＳＭ７４０９として寄託されて
いる）と称する。
【０１６５】例１２．２：ｐｅｐＤのヌクレオチド配列 ｐＴＺ１８ＲベクターにおけるｐｅｐＤサブクローン、
すなわち３．０kbp のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII フラグ
メントを、合成オリゴヌクレオチドプライマー及びSequ
enase (United States Biochemical Corp.) を用いて、
ジデオキシ−鎖停止方法〔Sangerなど. 、 Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 74：5463〜67 (1977) 〕により完全に配列
決定する。
【０１６６】その完全なヌクレオチド配列は、配列番号
６として配列表に存在する。その読み取り枠を、他の既
知のスブチリシン型のセリンプロテアーゼとの比較によ
り同定し、そしてこれを転写マッピングにより確かめ
る。
【０１６７】例１２．３：ＰＥＰＤのＲＮＡマッピング 全ＲＮＡを、炭素源としてグルコース及び窒素源として
アンモニアを含む最少培地上で増殖される粉砕された凍
結乾燥菌糸体から Frederick及びKinsey〔Curr.Genet.
18：53〜58 (1990) 〕の方法により調製する。ｍＲＮＡ
の５′端を、３２−Ｐ末端ラベル化オリゴヌクレオチ
ド、すなわちオリゴＡ（配列番号６のヌクレオチド８５
１〜８７６に相当する）により全ＲＮＡをハイブリダイ
ズし、そして同じオリゴヌクレオチドによるジデオキシ
配列決定により生成される配列決定反応との比較により
配列決定ゲル上で逆転写酵素により生成される流出転写
体をサイズ分けすることによって同定する〔Maniatisな
ど．、Molecular Cloning. ALaboratory Manual. Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,
1982)。イントロンの正確なスプライス部位を、ｐｅｐ
Ｄ情報の一部のｃＤＮＡコピーをクローン化し、そして
配列決定することによって同定する。第１鎖の合成を、
標準方法（Maniatisなど．、前記）により行なう。但
し、プライミングオリゴヌクレオチドはオリゴＣ（配列
番号６のヌクレオチド１９１４〜１９４１に対して相補
的である）である。このｃＤＮＡを、オリゴＢ（配列番
号６のヌクレオチド１１０２〜１１２９に対応する）及
びＣを用いてＰＣＲにゆだね、そしてｐＴＺ１８Ｒ中に
クローン化する。ヌクレオチド１１０７〜１１０９（Ｇ
ＧＴ）はオリゴＢにおいてＡＴＣにより置換され、従っ
て新規のＢａｍＨＩ部位を創造することを注目するこ
と。同様に、ヌクレオチド１９３２（Ａ）及び１９３５
（Ａ）を、オリゴＣにおいて、それぞれＧ及びＴにより
置換し、従って新規ＨｉｎｄIII 部位を創造する。２種
の独立したクローンの両鎖を完全に配列決定する。ｐｅ
ｐＤ遺伝子により生成されるｍＲＮＡの全長さを、プロ
ーブとして３．０kbのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII フラグ
メントを用いてノザン分析により決定（Maniatisな
ど．、前記）、そして読み取り枠の大きさ及び転写開始
部位の位置から予測される長さに対応する１．４〜１．
７kbの間であることが決定される。
【０１６８】例１３：ＰＥＰＤのゲノム破壊 例１３．１：ｐＰＥＰＣＰＹＲＡの構成 ｐｙｒＡ遺伝子を含む４kbのＸｂａＩフラグメントを、
ｐＡＸＩ（ＤＳＭ７０１７）から切断し、そしてベクタ
ー配列から精製する。２μｇのｐＴＺＰＥＰＤを、製造
業者の推薦に従ってＮｈｅＩ及びＮｃｏ１により切断
し、そして次にフェノール抽出し、エタノール沈殿せし
め、そして水２０μｌに再溶解する。次に、このＤＮＡ
を細菌アルカリホスファターゼにより処理し、５′ホス
フェート基を除去する。Ｈｉｓ及びＳｅｒ活性部位を含
む０．６kbp のＮｈｅＩ−ＮｃｏＩフラグメントを欠く
５．３kbのフラグメントを、ゲルから精製する。
【０１６９】上記両フラグメントを、製造業者の指示に
従ってＴ４ポリメラーゼにより処理し、そしてフェノー
ル抽出し、そしてエタノール沈殿せしめる。その２つの
フラグメントを一緒に混合し、そして連結する。Ｅ．コ
リの形質転換の後、正しいプラスミドを担持するコロニ
ーを、ミニ−プラスミド調製物の制限消化物により同定
する。ｐＰＥＰＤＰＹＲＡは、オロチジンモノホスフェ
ートデカルボキシラーゼをコードするＸｂａＩ ＤＮＡ
フラグメントにより置換された、Ｈｉｓ及びＳｅｒ活性
部位をコードする、中心ＮｈｅＩ−ＮｃｏＩフラグメン
トを有する、ｐｅｐＤ遺伝子を担持するＢａｍＨＩ−Ｈ
ｉｎｄIII フラグメントを含むｐＴＺ１８Ｒベクターか
ら成る。
【０１７０】例１３．４：Ａ．ニガーの形質転換 １０μｇのプラスミドｐＰＥＰＣＰＹＲＡを、ＥｃｏＲ
Ｉにより完全に消化する。消化物の完全性を、ゲル上に
アリコートを作用せしめることによって調べ、そして残
りのＤＮＡをフェノール抽出し、エタノール沈殿せし
め、そして２０μｌの滅菌水に再懸濁する。栄養要求性
Ａ．ニガーＡｎ８（ＤＳＭ３９１７）の分生胞子を、十
分に胞子形成されるまで、完全培地上で２８℃で４日
間、増殖する。２×１０8 個の分生子柄を用いて、１ｇ
／ｌのアルギニン及びウリジンにより補充された最少培
地２００mlを接種する。
【０１７１】２８℃及び１８０rpm での２０時間の増殖
の後、菌糸体を Miraclothを通しての濾過により収穫
し、０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ2 の溶液１０
mlにより２度洗浄し、そして０．８ＭのＫＣｌ，５０mM
のＣａＣｌ2 ，０．５mg／mlのNovozym ２３４(Novo In
dustries) の溶液２０mlに再懸濁する。その混合物を、
十分なプロトプラストが開放されるまで（９０〜１２０
分後、顕微鏡により検出される）、振盪水浴においてイ
ンキュベートする（３０℃，５０rpm ）。プロトプラス
ト懸濁液を、菌糸体残骸を除去するために、漏斗におけ
るガラス羊毛プラグを通して濾過する。プロトプラスト
を室温で、軽い遠心分離（１０分、２０００rpm ）によ
りペレット化し、そして０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣ
ａＣｌ2 の溶液１０mlにより２度洗浄する。最終的にプ
ロトプラストを０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ2
の溶液２００〜５００μｌに再懸濁し、１×１０8 個の
スフェロプラスト／mlの濃度を付与する。
【０１７２】形質転換のために、プロトプラスト懸濁液
の２００μｌアリコートを、ＥｃｏＲＩにより消化され
たｐＰＥＰＣＰＹＲＡ ５μｇ及び５０μｌのＰＣＴ
（１０mMのトリス−ＨＣｌ，pH７．５，５０mMのＣａＣ
ｌ2 ，２５％のＰＥＧ６０００）と共にインキュベート
する。そのインキュベーション混合物を２０分間氷上に
保持し、他の２mlのＰＣＴを添加し、そしてその混合物
を室温でさらに５分間インキュベートする。０．８Ｍの
ＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ2 の溶液４mlを添加し、そし
て最終形質転換溶液の１mlアリコートを、液体最少寒天
培地（最少培地＋１ｇ／ｌのアルギニン＋１０ｇ／ｌの
Bacto-Agar (Difco)) と共に混合し、０．８ＭのＫＣｌ
により安定化する。その混合物をすぐに、同じ培地の寒
天プレート上に注ぎ、そして３０℃でインキュベートす
る。２８℃で２〜３日間の増殖の後、安定した形質転換
体は激しく増殖し、そして数百の小さな、たぶん早産の
形質転換体のコロニーをバックグラウンド増殖に対して
胞子形成するように思われる。
【０１７３】例１３．５：遺伝子破壊の同定 安定コロニーから、個々の胞子懸濁液を製造し、そして
新鮮な最少＋アルギニンプレート上で画線培養する。単
一のコロニーを選択し、そして再画線培養し、純粋な培
養物を付与する。それらは、１ｇ／ｌのアルギニンによ
り補充された液体最少培地２００mlを接種するために使
用される。３０℃で２４時間１８０rpmでの振盪の後、
菌糸体をフィルター紙上に収穫し、そしてパッドを凍結
乾燥せしめる。乾燥の後、ＤＮＡを個々のパッドから、
そのパッドを乳棒及び乳ばちを用いて細かな粉末に粉砕
することによって調製する。この粉末６０mgを、１％ド
デシル硫酸ナトリウム、０．１％のTween ８０，１Ｍの
酢酸アンモニウムの溶液３mlに撹拌しながら再懸濁す
る。これを、時々混合しながら、６５℃で２０分間加熱
する。細胞残骸を、１５，０００rpm での５分間の遠心
分離によりＤＮＡ溶液から分離する。上清液をフェノー
ルにより２度、クロロホルムにより２度抽出し、そして
エタノール沈殿せしめる。そのＤＮＡを滅菌ＴＥ １０
０μｌに再溶解する。
【０１７４】個々のＤＮＡ ２０μｌを、 RNAase Ａ
１μｇの存在下で１時間、ＢａｌIIにより消化する。こ
れをアガロース上で分離し、そしてニトロセルロース膜
に移し、そして焼き付ける。ＰＥＰＤを含むｐＴＺＰＥ
ＰＤからのＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩフラグメントを精
製し、ニックトランスレーションによりラベルし、そし
てフィルターをプローブするために使用する。ｐｅｐＤ
遺伝子の破壊を担持する株は、０．６kbのＮｈｅＩ−Ｎ
ｈｏＩハイブリダイゼーションフラグメントを欠き、そ
して他の２つのフランキングフラグメントの変更された
移動性を有することによって容易に認識される。
【０１７５】それらの株の１つを、ウリジン及び５−フ
ルオロ−オロト酸を含む培地上にプレートする。ピリミ
ジン栄養要求性に対する変異体を、この培地上で最強の
増殖により同定し、そして採取し、そして単一のコロニ
ーのために画線培養することによって精製する。
【０１７６】例１３．６：ｐｅｐＤ- Ａ．ニガー株にお
けるインターフェロンの生成 例６．５で単離されたｐｅｐＤ- Ａ．ニガーＡｎ８株の
１つを、ｐｙｒＡ+ 含有プラスミド及びインターフェロ
ンのための非相同遺伝子を含む発現カセットによる続く
形質転換のための宿主として使用する。Ａ．ニガーＡｎ
８のウリジン栄養要求性ｐｅｐＤ- 変異体の分生胞子
を、十分に胞子形成されるまで、完全培地において２８
℃で４日間、培養する。２×１０ 8 個の分生子柄を用い
て、１ｇ／ｌのアルギニン及びウリジンにより補充され
た最少培地２００mlを接種する。
【０１７７】２８℃及び１８０rpm での２０時間の増殖
の後、菌糸体を、 Miraclothを通しての濾過により収穫
し、０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ2 の溶液１０
mlにより２度洗浄し、そして０．８ＭのＫＣｌ，５０mM
のＣａＣｌ2 ，０．５mg／mlのNovozym ２３４(Novo In
dustries) の溶液２０mlに再懸濁する。その混合物を、
十分なプロトプラストが開放されるまで（９０〜１２０
分後、顕微鏡により検出される）、振盪水浴においてイ
ンキュベートする（３０℃，５０rpm ）。そのプロトプ
ラスト懸濁液を漏斗におけるガラス羊毛プラグを通して
濾過し、菌糸残骸を除去する。プロトプラストを室温で
軽い遠心分離（１０分、２０００rpm ）によりペレット
化し、そして０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ2 の
溶液１０mlにより２度洗浄する。最後に、プロトプラス
トを、０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ2 の溶液２
００〜５００μｌに再懸濁し、１×１０8 ／mlの濃度を
得る。
【０１７８】形質転換のために、プロトプラスト懸濁液
の２００μｌアリコートを、５μｇのｐＣＧ５９Ｄ７
（ＤＳＭ３９６８）及び５０μｇのｐＧIIｓｓ−ＩＦＮ
ＡＭ１９又はｐＧII−ＩＦＮ ＡＭ１１９ＤＮＡ（両
プラスミドはＥＰ−出願第０４２１９１９号に十分に開
示される）、及び５０μｌのＰＣＴ（１０mMのトリス−
ＨＣｌ，pH７．５，５０mMのＣａＣｌ2 ，２５％のＰＥ
Ｇ６０００）と共にインキュベートする。そのインキュ
ベーション混合物を２０分間氷上に保持し、他の２mlの
ＰＣＴを添加し、そしてその混合物を室温でさらに５分
間インキュベートする。０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣ
ａＣｌ2 の溶液４mlを添加し、そして最終形質転換溶液
の１mlアリコートを、液体最少寒天培地（最少培地＋１
ｇ／ｌのアルギニン＋１０ｇ／ｌのBacto-Agar (Difc
o)) と共に混合し、０．８ＭのＫＣｌにより安定化す
る。その混合物をすぐに、同じ培地の寒天プレート上に
注ぎ、そして３０℃でインキュベートする。
【０１７９】２８℃で２〜３日間の増殖の後、安定した
形質転換体は激しく増殖し、そして数百の小さな、たぶ
ん早産の形質転換体のコロニーをバックグラウンド増殖
に対して胞子形成するように思われる。形質転換体を採
取し、そしてインターフェロン発現について分析する。
インターフェロン活性を、ヒトＣＣＬ−２３細胞及び挑
戦ウィルスとして水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）を用
いて、 Armstrongの方法(J.A.Armstrong, Appl.Microbi
ol. 21, 732 (1971)) に従って決定する。
【０１８０】形質転換体からの分生胞子を、予備培養培
地(Pectin Slow Set L (Unipectin,SA, Redon, France)
３ｇ／ｌ，ＮＨ4 Ｃｌ ２ｇ／ｌ，ＫＨ2 ＰＯ4 ０．
５ｇ／ｌ，ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ，ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ ０．５ｇ／ｌ，Ｃａ2ＳＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ０．５
ｇ／ｌ，pH７．０，１％のアルギニン）５０ml中で個々
に予備培養する。その予備培養物を、２５０rpm 及び２
８℃で７２時間インキュベートする。１０％の予備培養
物を用いて、主要培養培地（大豆粉２０ｇ／ｌ、ペクチ
ン Slow Set ５ｇ／ｌ，１％のアルギニン）５０mlを接
種する。その培養物を、２５０rpm 及び２８℃で、７２
〜９６時間、増殖せしめる。
【０１８１】種々の時間（２０時間ごとに）で、サンプ
ルを採取し、細胞を遠心分離によりペレット化し、そし
て凍結乾燥及び乾燥粉砕により破壊する。上清液及び細
胞抽出物を、記載のようにしてインターフェロン活性に
ついて両者とも試験する。大部分のインターフェロン活
性は、ｐＧIIｓｓ−ＩＦＮ ＡＭ１１９を担持する形質
転換体においては、培地中に分泌されることが見出さ
れ、そしてｐＧII−ＩＦＮ ＡＭ１１９を担持する形質
転換体においては、それは細胞抽出物に主に見出され
る。
【０１８２】例１４：Ａ．ニガーにおけるｐｅｐＤの過
剰発現 例１４．１：複数コピーの過剰発現 Ａ．ニガー Ａｎ８を、１μｇのｐＡＸＩ＋１０μｇのｐ
ＴＺＰＥＰＤにより形質転換し、ウリジンフォートフス
(Photohuhs) を生成する。コロニーを精製し、そしてＤ
ＮＡを上記のようにして調製する。ｐＴＺＰＥＰＤのＨ
ｉｎｄIII フラグメントを用いてのサザンブロットは、
いくつかの形質転換体がそれらのゲノム中に組込まれた
ｐＴＺＰＥＰＤの単一コピーを有し、ところが他はそれ
らのゲノム中に１０までの及び１０以上の余分なコピー
を有することを示した。それらの株は、対応して一層の
タンパク質分解活性を生成し、そして分裂的に安定す
る。
【０１８３】例１４．２：遺伝子融合体からｐｅｐＤの
過剰発現 Ａ．ニガー ピルベートキナーゼプロモーター領域、及び
Ａ．ニガーｐｅｐＤ遺伝子のコード及びターミネーター
領域から成る遺伝子融合体を構成する。その融合体は、
組換えＰＣＲ(R.Higuchi：Recombinant PCR, 177〜183
ページ、 Innisなど. 、PCR Protocols, Academic Pres
s,Inc. (1990))により構成される。 fusoligo １，２及
び３がそれぞれ配列番号１２，１３及び１４に示されて
いる４種のオリゴヌクレオチドプライマーを企画し、と
ころがここで fusoligo ４は配列番号１におけるヌクレ
オチド２８５８〜２８７４の間の配列に対して相補的で
ある。 Fusoligo １は、ＡＴＧ開始コドンの０．７５kb
p 上流のｐｋｉプロモーターにハイブリダイズする。 F
usoligo ２及び３は、相補的鎖上で一部オーバーラップ
し、両者は、ＡＴＧ翻訳開始コドンからのすぐ上流のｐ
ｋｉプロモーターの配列、ＡＴＧコドン自体及びまた、
ＡＴＧコドンのすぐ下流のｐｅｐＤコード領域の配列を
含む。 Fusoligo ４は、翻訳停止部位の０．６５kbp 下
流のｐｅｐＤ遺伝子下流領域にハイブリダイズする。２
種のＰＣＲ反応は上記のようにして実質的に行なわれ
る。初めにおいては、０．７５kbp のｐｋｉプロモータ
ーフラグメントを、鋳型として fusoligo １及び２、及
びｐＧＷ１１００（ＤＳＭ５７４７）を用いて増幅す
る。次に、ｐｅｐＤコード及び終結領域を含む２．０kb
フラグメントを、鋳型として fusoligo ３及び４を用い
て増幅する。それらの増幅生成物をアガロースゲルから
精製し、組合し、変性し、そして再アニールする。それ
らの２種のフラグメントは、 fusoligo ２及び３による
それらのオーバーラップ端のために再アニール反応の
間、ホモ一及び又はホモ二本鎖を形成する。次にこのア
ニールされた混合物を、２種の“外部 (outside)”プラ
イマー(fusoligo１及び４）を用いてＰＣＲにより再増
幅する。この反応の生成物を、単離し、精製し、そして
プラスミドベクター中にサブクローン化する。
【０１８４】正しいプラスミドを、ミニプラスミド調製
物を消化することによって同定する。２種を選択し、そ
してその挿入体を、合成オリゴヌクレオチドを用いて完
全に配列決定する。ｐＰＫＩＰＥＰＤＡと呼ばれる、ｐ
ｅｐＤ読み取り枠へのピルベートキナーゼプロモーター
の完全な融合体を含む１つのプラスミドを、ｐＡＸＩと
共に使用し、ウリジン原栄養性にＡ．ニガーＡｎ８を同
時形質転換する。
【０１８５】ｐｋｉ−ｐｅｐＤ融合体の存在は、個々の
精製された形質転換体からＤＮＡを製造し、そしてｐｋ
ｉ及びｐｅｐＤからのプローブを用いてサザン分析のた
めにそれを使用することによって確認される。ゲノム中
に組込まれる遺伝子融合体の１又は複数のコピーを有す
る株は、細胞がＣ源としてのグルコース上で急速に増殖
される場合、より一層のタンパク質分解活性を生成する
ことが示される。
【０１８６】例８：他の生物におけるｐｅｐＤの発現：
酵母における発現 プラスミドｐＴＺＰＥＰＤを、ＥｃｏＲＩにより切断
し、Ｔ４ポリメラーゼによりブラント末端化し、そして
連結し、従って、ポリリンカー領域からＥｃｏＲＩ部位
を除去する。次に、その得られたプラスミドを、それぞ
れ、配列番号１５，１６，１７及び１８として配列表に
おいて示される４種の合成オリゴヌクレオチドオリゴ酵
母１，２，３及び４によりインビトロ変異誘発せしめ
る。オリゴ酵母１は、ｐｅｐＤのＡＴＧのすぐ上流にＥ
ｃｏＲＩ部位を構築し、そして他の３種は個々の３種の
全イントロンをループする。これは、その配列が完全な
配列決定により確認されているプラスミドｐＴＺＰＥＰ
Ｄを創造する。
【０１８７】ｐｅｐＤのＡＴＧのすぐ前で始まり、そし
てターミネーター領域の後で終結する２．２kbのＥｃｏ
ＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを精製し、そして酵母Ｇ
ＡＬ１０プロモーターを含む、ｐＦＢＹ１２９（ＤＳＭ
７０１６として寄託される）の５２０bpのＢａｍＨＩ−
ＥｃｏＲＩフラグメントと共に、酵母基材の２μｍベク
ターｐＦＢＹ２５（ＤＳＭ７０２０として寄託される）
のＳｎａＢＩ部位中に連結する。正しいプラスミドを、
制限消化物により同定する。このプラスミド、すなわち
ｐＧＡＬ１０ＰＥＰＤを用いて酵母を形質転換し、そし
て遺伝子融合がガラクトースにより誘発される場合、ｐ
ｅｐＤタンパク質を生成することが示される。
【０１８８】微生物の寄託 次の微生物を、Deutsche Sammlung von Mikroorganisme
n und Zellkulturen,Mascheroder Wey 1b, D-3300 Brau
nschweig にブダペスト条約下で寄託する： 微生物／プラスミド 寄託日 寄託番号 Ｅ．コリ DH5αＦ′／pGW1100 １月 18, 1990 DSM 5747Ｅ．コリ BJ5183 ／pCG59D7 ２月 2, 1987 DSM 3968Ａ．ニガー An8 12月 11, 1986 DSM 3917Ｅ．コリ DH5αＦ′／pTZPEPC ３月 30, 1992 DSM 7019Ｅ．コリ DH5αＦ′／pGP202 ３月 30, 1992 DSM 7018Ｅ．コリ DH5αＦ′／pFBY129 ３月 30, 1992 DSM 7016Ｅ．コリ DH5αＦ′／pAXI ３月 30, 1992 DSM 7017Ｅ．コリ DH5αＦ′／pFBY25 ３月 30, 1992 DSM 7020Ｅ．コリ DH5αＦ′／pTZPEPD １月 19, 1993 DSM 7409
【０１８９】
【配列表】 一般情報： 配列の数：１８ 配列番号１についての情報： 配列特徴： 長さ：３２２０個の塩基対 型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 起源： 生物名：アスペルギラス ニガー 株名：Ｎ４００ 直接の起源： クローン名：ｐＴＺＰＥＰＣ 特徴： 名称：プロモーター 位置：１..３７７ 特徴： 名称：シグナルペプチド 位置：３７８..４３５ 特徴： 名称：成熟ペプチド 他の情報：スブチリシン型 プロテアーゼ；アスペルギラス ニガーのＰＥＰＣ；遺伝子ｐｅｐＣの生 成物 特徴： 名称：イントロン 位置：７５７..８２６ 特徴： 名称：コード配列（停止コドンを含む） 位置：連結（３８８..７５６，８２７..２０５９） 配列：配列番号１： GGATCCATCC ATTCACTCAG CTTTCCTTGT CGGTGGACTG TCGAGTCTAC CCCAGGTCCC 60 AGTTTCTCCG ACCGCGCTAA TCGGGGGCTA TCGACAACCA GTGATTCTGC TGTGTCATCC 120 GGGCGTATGG CGTAAATTAC CGTATGCCGG TTGCATCATC ACCTGCTGCC CTTGCCTCTT 180 GCTGAATACC GTCCGCCATC CATCTGTCCT CCTCTCCCTC TCTCTTCATC TCCAACCTCC 240 CCTTCCTCCT CCCTCCCTCC TTCTCTTCAT CTTTATCTTG ACCTATTTCC ATCTTTCTCA 300 TCTCTCAGTT GTTTCAATCT CTTGTACACG CCCTACTCAC TCTCCTTTTC ACCGGGCTGC 360 TGTGGGTTCC GTCTTAAGCT ATCCATC ATG AAG GGC ATC CTC GGC CTT TCC 411 Met Lys Gly Ile Leu Gly Leu Ser -16 -15 -10 CTC CTC CCG TTG CTG ACG GCT GCG TCG CCC GTC TTC GTT GAC TCC ATC 459 Leu Leu Pro Leu Leu Thr Ala Ala Ser Pro Val Phe Val Asp Ser Ile -5 1 5 CAT AAT GAA GCT GCC CCC ATC TTG TCT GCT ACC AAC GCG AAG GAG GTT 507 His Asn Glu Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala Thr Asn Ala Lys Glu Val 10 15 20 CCC GAC TCC TAC ATC GTC GTT TTC AAG AAG CAC GTC ACT TCA GAG CTG 555 Pro Asp Ser Tyr Ile Val Val Phe Lys Lys His Val Thr Ser Glu Leu 25 30 35 40 GCT TCG GCT CAC CAC AGC TGG GTG CAG GAC ATC CAT GAC TCT CAG AGC 603 Ala Ser Ala His His Ser Trp Val Gln Asp Ile His Asp Ser Gln Ser 45 50 55 GAG CGG ACT GAG CTG AAG AAG CGG TCG CTC TTC GGC CTT GGG GAC GAG 651 Glu Arg Thr Glu Leu Lys Lys Arg Ser Leu Phe Gly Leu Gly Asp Glu 60 65 70 GTC TAT CTG GGT CTC AAG AAC ACC TTT GAC ATT GCT GGT TCT CTG ATC 699 Val Tyr Leu Gly Leu Lys Asn Thr Phe Asp Ile Ala Gly Ser Leu Ile 75 80 85 GGT TAC TCT GGT CAC TTC CAC GAG GAT GTC ATC GAG CAA GTC CGC AGA 747 Gly Tyr Ser Gly His Phe His Glu Asp Val Ile Glu Gln Val Arg Arg 90 95 100 CAC CCC GAT GTGAGTTACA CCCCCTATCT AAGCATCCCT CGTTATCTCT 796 His Pro Asp 105 AAGATAAGCT TCTAACATCG GTCAATGTAG GTC GAT TAC ATC GAG CGG GAT TCC 850 Val Asp Tyr Ile Glu Arg Asp Ser 110 115 GAA GTT CAC ACC ATG GAA GGG GCC ACC GAA AAG AAC GCC CCT TGG GGT 898 Glu Val His Thr Met Glu Gly Ala Thr Glu Lys Asn Ala Pro Trp Gly 120 125 130 CTG GCT CGT ATC TCT CAC CGT GAT AGC CTG ACC TTC GGT AAC TTC AAC 946 Leu Ala Arg Ile Ser His Arg Asp Ser Leu Thr Phe Gly Asn Phe Asn 135 140 145 AAG TAC CTG TAT GCC TCC GAG GGG GGT GAG GGC GTT GAC GCC TAC ACC 994 Lys Tyr Leu Tyr Ala Ser Glu Gly Gly Glu Gly Val Asp Ala Tyr Thr 150 155 160 ATT GAC ACG GGT ATC AAC GTT GAC CAC GTT GAC TTC GAG GGC CGT GCC 1042 Ile Asp Thr Gly Ile Asn Val Asp His Val Asp Phe Glu Gly Arg Ala 165 170 175 ACT TGG GGC AAG ACA ATC CCT ACC AAC GAT GAA GAT CTC GAT GGC AAT 1090 Thr Trp Gly Lys Thr Ile Pro Thr Asn Asp Glu Asp Leu Asp Gly Asn 180 185 190 195 GGT CAC GGA ACT CAC TGC TCC GGA ACC ATG GCT GGT AAG AAG TAC GGT 1138 Gly His Gly Thr His Cys Ser Gly Thr Met Ala Gly Lys Lys Tyr Gly 200 205 210 GTT GCC AAG AAG GCC AAC CTC TAT GCT GTC AAG GTC CTC CGG TCG AGC 1186 Val Ala Lys Lys Ala Asn Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Arg Ser Ser 215 220 225 GGC TCT GGC ACC ATG TCT GAT GTC GTT TCT GGT GTC GAG TAT GCC GTC 1234 Gly Ser Gly Thr Met Ser Asp Val Val Ser Gly Val Glu Tyr Ala Val 230 235 240 CAG GCT CAT ATC AAG AAG GCC AAG GAT GCC AAG AAC GGC AAG GTC AAG 1282 Gln Ala His Ile Lys Lys Ala Lys Asp Ala Lys Asn Gly Lys Val Lys 245 250 255 GGA TTC AAG GGC AGC GTT GCC AAC ATG AGT CTC GGT GGT GGC AAG TCT 1330 Gly Phe Lys Gly Ser Val Ala Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Lys Ser 260 265 270 275 AAG ACC CTC GAG GAT GCT GTT AAC GCT GGT GTT GAG GCT GGT CTT CAC 1378 Lys Thr Leu Glu Asp Ala Val Asn Ala Gly Val Glu Ala Gly Leu His 280 285 290 TTC GCC GTT GCC GCC GGT AAT GAC AAT GCT GAT GCT TGC AAC TAC TCT 1426 Phe Ala Val Ala Ala Gly Asn Asp Asn Ala Asp Ala Cys Asn Tyr Ser 295 300 305 CCT GCT GCT GCC GAG AAG GCC ATC ACC GTT GGT GCC TCG ACA CTT GCT 1474 Pro Ala Ala Ala Glu Lys Ala Ile Thr Val Gly Ala Ser Thr Leu Ala 310 315 320 GAC GAG CGT GCG TAC TTC TCC AAC TAC GGA GAG TGC ACT GAC ATC TTC 1522 Asp Glu Arg Ala Tyr Phe Ser Asn Tyr Gly Glu Cys Thr Asp Ile Phe 325 330 335 GCT CCT GGT CTC AAC ATC CTG TCC ACC TGG ATT GGC AGC AAC TAC GCC 1570 Ala Pro Gly Leu Asn Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly Ser Asn Tyr Ala 340 345 350 355 ACC AAC ATC ATC TCT GGC ACT TCC ATG GCC TCT CCT CAC ATT GCT GGC 1618 Thr Asn Ile Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Ile Ala Gly 360 365 370 CTG CTG GCC TAC TTT GTC TCC CTC CAG CCC TCC TCG GAC TCT GCA TTC 1666 Leu Leu Ala Tyr Phe Val Ser Leu Gln Pro Ser Ser Asp Ser Ala Phe 375 380 385 GCT GTT GAG GAG CTT ACT CCT GCT AAG CTG AAG AAG GAC ATC ATC GCC 1714 Ala Val Glu Glu Leu Thr Pro Ala Lys Leu Lys Lys Asp Ile Ile Ala 390 395 400 ATC GCC ACC GAG GGC GCT CTC ACT GAC ATT CCC TCC AAC ACC CCC AAC 1762 Ile Ala Thr Glu Gly Ala Leu Thr Asp Ile Pro Ser Asn Thr Pro Asn 405 410 415 GTA AGT CAT GCC GCT GTT GGT ATT TAT AAG AGA AAC GAG CTA ACT CAG 1810 Val Ser His Ala Ala Val Gly Ile Tyr Lys Arg Asn Glu Leu Thr Gln 420 425 430 435 AAA TTC AGC TCC TTG CCT GGA ACG GTG GTG GTT CCG AGA ACT ACA CCG 1858 Lys Phe Ser Ser Leu Pro Gly Thr Val Val Val Pro Arg Thr Thr Pro 440 445 450 ACA TCG TTG GCA GCG GTG GCT ACA AGG TCT CCT CTG CCA AGA ACC GCA 1906 Thr Ser Leu Ala Ala Val Ala Thr Arg Ser Pro Leu Pro Arg Thr Ala 455 460 465 TCG AGG ACC GTA TTG AGG GTC TCG TTC ACA AGG CCG AAG AGC TGC TCA 1954 Ser Arg Thr Val Leu Arg Val Ser Phe Thr Arg Pro Lys Ser Cys Ser 470 475 480 CCG AGG AGC TTG GTG CCA TCT ACA GCG AGA TCC AGG ATG CCG TCG TCG 2002 Pro Arg Ser Leu Val Pro Ser Thr Ala Arg Ser Arg Met Pro Ser Ser 485 490 495 CAT AGA TCA GAA CTC GTG CTT TCC AGA CGT AGA TCG GAA GAC TTG GTT 2050 His Arg Ser Glu Leu Val Leu Ser Arg Arg Arg Ser Glu Asp Leu Val 500 505 510 515 TTT TTT TGAGGTATGG GATGGTTGAT CGGACATTTT GGCGCTGGTC TCTTTTTATT 2106 Phe Phe GTGTTTGGTC TCGAAGACGC TGATGCATTG ACTGTATCGG CTGTATCACT CCGCCCCTGC 2166 TTATCTGTTT GGTTCATCTT TATGGTAGTA TACATGTCTG CAAAGAAGGT TTTGTTACCT 2226 CACTTAGAAT GTTCTGGTTC TATAACAGAC TGACAATCTC ACTGGGTTAT CTAAGAGATC 2286 TGACAAACGC TTGGTAGAAG AGAAAGGTGA GGGAGTAGAC ATCATCAGTC TAAATCCACA 2346 TTACGACATG CCGTAATAGA TGAGAGCACC GGATGCTAGC CTTTGTAGAC TACAAAGGAG 2406 AAAACCCCTA GGAAAGGTAA TTTCTAAGTC ATGCCCACCT ATTCTCTCTA TCTCTTACTG 2466 AGACAGTCAA TCCCATGACG AACAACTAAT GACATCATGG GTCACGCTAC GGGGTCATGC 2526 CGAAACGAAG CCGAAGTACT ACTCCTAAGT AAAGCCACAA CTTTGCATAC GTTCATTCAG 2586 GAAACGGAAA CACAGGAGGA AGAATATTGA AATATCTTGA GGGGCTTCAT ATAGAATAGA 2646 CAGATATATA ATAGTTGTCA AAGTATACAA AAAGACCTCA TGCATGCTAA CAGATAAAGC 2706 AAAGGATCTC ATATTGATAG ACTGTGCTGT ATACCACCTC TTAATGCAGC GCCTGCGCTA 2766 TGCCACGATG AAATATAAAG GGGGAAAAAG TCATGTAAGT AGTAAGTAGA AACTCCAAGC 2826 GCCAAATATA TAGATAGTAA TAGGGGTGGC GACATAATTT GGCTTTTATA CTTGATAGGT 2886 TGAACAAATC AAGTGGCCCT GAGCTCGTCT TCCTCCTCAT CACTGCCGGA ATCTTGGTCT 2946 TCGTCATCGT CATCGACGTC AAGGTCCTCG TCGGAGTCGC TACCGCCGAA GACGTCGTCG 3006 TCCACATCGC TCTCGGCCCA GAAGTCGGAG TCGTCCTTCT CCACAGGTTT GGAGACTGTC 3066 GTGGTGGATT CGTGAGTCGG CATGACGAAT CCCTCGGGAA TATCGTTCTT CGAATCCTCC 3126 ACGTGCTGTT TCACGATCGA TTTGTATTCG TCGGGGCTCT TGCGCAACAT GACCGAGGCG 3186 TCAACGTTGG CGGGGGAAGA GATCCGGGGA ATTC 3220
【０１９０】 配列番号２についての情報： 配列特徴： 長さ：５３３個のアミノ酸 型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 特徴：アスペルギラス ニガーのスブチリシン型プロテアーゼＰＥＰＣ；遺伝 子ｐｅｐＣの生成物；シグナルペプチドを有する成熟ペプチド 配列：配列番号２： Met Lys Gly Ile Leu Gly Leu Ser Leu Leu Pro Leu Leu Thr Ala Ala -16 -15 -10 -5 Ser Pro Val Phe Val Asp Ser Ile His Asn Glu Ala Ala Pro Ile Leu 1 5 10 15 Ser Ala Thr Asn Ala Lys Glu Val Pro Asp Ser Tyr Ile Val Val Phe 20 25 30 Lys Lys His Val Thr Ser Glu Leu Ala Ser Ala His His Ser Trp Val 35 40 45 Gln Asp Ile His Asp Ser Gln Ser Glu Arg Thr Glu Leu Lys Lys Arg 50 55 60 Ser Leu Phe Gly Leu Gly Asp Glu Val Tyr Leu Gly Leu Lys Asn Thr 65 70 75 80 Phe Asp Ile Ala Gly Ser Leu Ile Gly Tyr Ser Gly His Phe His Glu 85 90 95 Asp Val Ile Glu Gln Val Arg Arg His Pro Asp Val Asp Tyr Ile Glu 100 105 110 Arg Asp Ser Glu Val His Thr Met Glu Gly Ala Thr Glu Lys Asn Ala 115 120 125 Pro Typ Gly Leu Ala Arg Ile Ser His Arg Asp Ser Leu Thr Phe Gly 130 135 140 Asn Phe Asn Lys Tyr Leu Tyr Ala Ser Glu Gly Gly Glu Gly Val Asp 145 150 155 160 Ala Tyr Thr Ile Asp Thr Gly Ile Asn Val Asp His Val Asp Phe Glu 165 170 175 Gly Arg Ala Thr Typ Gly Lys Thr Ile Pro Thr Asn Asp Glu Asp Leu 180 185 190 Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Cys Ser Gly Thr Met Ala Gly Lys 195 200 205 Lys Tyr Gly Val Ala Lys Lys Ala Asn Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 210 215 220 Arg Ser Ser Gly Ser Gly Thr Met Ser Asp Val Val Ser Gly Val Glu 225 230 235 240 Tyr Ala Val Gln Ala His Ile Lys Lys Ala Lys Asp Ala Lys Asn Gly 245 250 255 Lys Val Lys Gly Phe Lys Gly Ser Val Ala Asn Met Ser Leu Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Ser Lys Thr Leu Glu Asp Ala Val Asn Ala Gly Val Glu Ala 275 280 285 Gly Leu His Phe Ala Val Ala Ala Gly Asn Asp Asn Ala Asp Ala Cys 290 295 300 Asn Tyr Ser Pro Ala Ala Ala Glu Lys Ala Ile Thr Val Gly Ala Ser 305 310 315 320 Thr Leu Ala Asp Glu Arg Ala Tyr Phe Ser Asn Tyr Gly Glu Cys Thr 325 330 335 Asp Ile Phe Ala Pro Gly Leu Asn Ile Leu Ser Thr Typ Ile Gly Ser 340 345 350 Asn Tyr Ala Thr Asn Ile Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His 355 360 365 Ile Ala Gly Leu Leu Ala Tyr Phe Val Ser Leu Gln Pro Ser Ser Asp 370 375 380 Ser Ala Phe Ala Val Glu Glu Leu Thr Pro Ala Lys Leu Lys Lys Asp 385 390 395 400 Ile Ile Ala Ile Ala Thr Glu Gly Ala Leu Thr Asp Ile Pro Ser Asn 405 410 415 Thr Pro Asn Val Ser His Ala Ala Val Gly Ile Tyr Lys Arg Asn Glu 420 425 430 Leu Thr Gln Lys Phe Ser Ser Leu Pro Gly Thr Val Val Val Pro Arg 435 440 445 Thr Thr Pro Thr Ser Leu Ala Ala Val Ala Thr Arg Ser Pro Leu Pro 450 455 460 Arg Thr Ala Ser Arg Thr Val Leu Arg Val Ser Phe Thr Arg Pro Lys 465 470 475 480 Ser Cys Ser Pro Arg Ser Leu Val Pro Ser Thr Ala Arg Ser Arg Met 485 490 495 Pro Ser Ser His Arg Ser Glu Leu Val Leu Ser Arg Arg Arg Ser Glu 500 505 510 Asp Leu Val Phe Phe 515
【０１９１】 配列番号３についての情報： 配列特徴： 長さ：３７個の塩基対 型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 特徴： 名称：Ａ．ニガーｐｅｐＣに相同の領域 位置：１..１９ 特徴： 名称：Ａ．ニガーｐｋｉ遺伝子に相同の領域 位置：２０..３７ 配列：配列番号３： GGCCGAGGAT GCCCTTCATC TTGACGGATG ATTGATC 37
【０１９２】 配列番号４についての情報： 配列特徴： 長さ：４４個の塩基対 型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列：配列番号４： GCCGAGGATG CCCTTCATCT TGAATTCGGA TGATTGATCT CTAC 44
【０１９３】 配列番号５についての情報： 配列特徴： 長さ：３２個の塩基対 型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列：配列番号５： GCTCGATGTA ATCGACATCG GGGTGTCTGC GG 32
【０１９４】 配列番号６についての情報： 配列特徴： 長さ：２９９３個の塩基対 型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 起源： 生物名：アスペルギラス ニガー 株名：Ｎ４００ 直接の起源： クローン名：ｐＴＺＰＥＰＤ 特徴： 名称：プロモーター 位置：１..８２９ 特徴： 名称：停止コドンを含むコード配列 位置：連結（８３０..１１５３，１２０５..１６４９，１６９７..１７８５ ，１８４１..２２３３） 他の情報：アスペルギラス ニガーのスブチリシン型プロテアーゼＰＥＰＤ ；遺伝子ｐｅｐＤの生成物 特徴： 名称：イントロン 位置：１１５４..１２０４ 特徴： 名称：イントロン 位置：１６５０..１６９６ 特徴： 名称：イントロン 位置：１７８６..１８４０ 配列：配列番号６： AAGCTTCGTA TATAATTCCC TTTTGACAAT GTCAAAATCT TTTGGACCAC TAATATAGCT 60 GCATGGACCG GTTAATCAGA GGTTATTTTT GTGCTCGAAT GCCGTGTAAC ATTGGATAAT 120 AGTACACTCC TTTCACCCAC CCTCAGATGC CCGCCCCCTA CAGTAGGGTT GTCAATATCC 180 CTCACCTTTC CAATTGCTGA TGCAGAATGG ACCTGATATA GAAGCCTCAC AGCACCAGAG 240 ACTACCGCCT GAAGATGCCA AGTATTGATG GGTTACATTG GCTGGCGAAT AGACTGTTCA 300 CCATCCCCCG CCTGTACAAG GCTCATTGAG CGACCTTTAT TTCTATGAAG GCTTCTTGCA 360 GTGTAGAGCC GCTGTTTAGA ACTCGGAAAT AGGCGTGCAT AGTATGAACT CAATCAGCAG 420 AGTCAATCGA TTGACACTAA CGCCTAGCAA GCAATCAGTG CTCAGAGGAA GCTAACAGAT 480 GGCTGGTTAA GCTGCCCCAG AAACGAAATG TGTCCGCAAT CCCATCCCTG CATGCTTATC 540 TGTATTCTGT GCATGCATGA TGCTTTCCTC ACGGGGCATT ACCCAGTAGT CCGAAGACGC 600 AATGTGACCA TCTGACTGAG TTTTAAATAT ACTGTCCAAG TGCCTTCTGA CCCGGTCCCC 660 GCTTGATGAC AATCAACAAA AGGTGAATGT GACTGAAAGG CGTGGTCCAG ACAACAGGCC 720 TTAGACTTTA TTGTGAGACT ATAAAAGGAT CTAACTATTG CACTACTGAA ATTAAGCATT 780 CTAGTCTACC ATTGACATTT CTCCCCTTTC GGTGGGCCAC TCGCTCAAC ATG GCT 835 Met Ala 1 TTC CTC AAA CGC ATT CTC CCG CTG CTG GCC CTC ATC TTG CCT GCA GTT 883 Phe Leu Lys Arg Ile Leu Pro Leu Leu Ala Leu Ile Leu Pro Ala Val 5 10 15 TTC AGT GCC ACA GAA CAG GTC CCT CAT CCG ACC ATC CAG ACC ATC CCG 931 Phe Ser Ala Thr Glu Gln Val Pro His Pro Thr Ile Gln Thr Ile Pro 20 25 30 GGG AAG TAC ATT GTT ACT TTC AAG TCC GGC ATT GAC AAT GCG AAA ATT 979 Gly Lys Tyr Ile Val Thr Phe Lys Ser Gly Ile Asp Asn Ala Lys Ile 35 40 45 50 GAG TCT CAT GCC GCA TGG GTA ACG GAG CTC CAC AGG CGC AGC TTA GAA 1027 Glu Ser His Ala Ala Typ Val Thr Glu Leu His Arg Arg Ser Leu Glu 55 60 65 GGC CGC AGT ACA ACC GAA GAT GAC CTT CCC GCC GGG ATC GAG AGA ACT 1075 Gly Arg Ser Thr Thr Glu Asp Asp Leu Pro Ala Gly Ile Glu Arg Thr 70 75 80 TAC AGA ATT GCC AAT TTT GCT GGG TAC GCG GGG TCT TTC GAT GAG AAA 1123 Tyr Arg Ile Ala Asn Phe Ala Gly Tyr Ala Gly Ser Phe Asp Glu Lys 85 90 95 ACT ATC GAG GAG ATC CGC AAA CAT AAC CAT GTTTGTGTCC ACGTATCCCA 1173 Thr Ile Glu Glu Ile Arg Lys His Asn His 100 105 GGCCGTATGG TTTCGACTAA CTGCTGTACA G GTA GCC TAT GTG GAA CAA GAT 1225 Val Ala Tyr Val Glu Gln Asp 110 115 CAG GTC TGG TAC CTC GAT ACG CTA GTT ACC GAA AGA CGA GCT CCT TGG 1273 Gln Val Typ Tyr Leu Asp Thr Leu Val Thr Glu Arg Arg Ala Pro Typ 120 125 130 GGA CTG GGG AGC ATC TCT CAC CGT GGT GCG TCT AGC ACC GAC TAC ATC 1321 Gly Leu Gly Ser Ile Ser His Arg Gly Ala Ser Ser Thr Asp Tyr Ile 135 140 145 TAT GAT GAC AGC GCT GGG GAG GGT ACA TAC GCT TAT GTA GTG GAC ACT 1369 Tyr Asp Asp Ser Ala Gly Glu Gly Thr Tyr Ala Tyr Val Val Asp Thr 150 155 160 GGC ATC TTG GCT ACG CAT AAT GAG TTT GGT GGT CGT GCT AGC CTG GCA 1417 Gly Ile Leu Ala Thr His Asn Glu Phe Gly Gly Arg Ala Ser Leu Ala 165 170 175 TAC AAT GCT GCA GGG GGT GAG CAC GTT GAT GGT GTT GGA CAT GGC ACA 1465 Tyr Asn Ala Ala Gly Gly Glu His Val Asp Gly Val Gly His Gly Thr 180 185 190 195 CAT GTA GCA GGG ACC ATC GGT GGC AAA ACA TAC GGG GTT TCG AAA AAT 1513 His Val Ala Gly Thr Ile Gly Gly Lys Thr Tyr Gly Val Ser Lys Asn 200 205 210 GCT CAC CTA CTG TCC GAG AAG GTG TTT GTA GGT GAA TCC AGC TCG ACA 1561 Ala His Leu Leu Ser Val Lys Val Phe Val Gly Glu Ser Ser Ser Thr 215 220 225 TCG GTC ATT CTG GAT GGC TTC AAT TGG GCT GCC AAT GAT ATC GTG AGC 1609 Ser Val Ile Leu Asp Gly Phe Asn Typ Ala Ala Asn Asp Ile Val Ser 230 235 240 AAG AAC CGG ACC AGT AAG GCG GCG ATT AAC ATG AGT CTT G GTATGTGCGC 1659 Lys Asn Arg Thr Ser Lys Ala Ala Ile Asn Met Ser Leu 245 250 255 CCTCTCTGGG GATCTAATGC CGTTAACCGT GATGCAG GT GGA GGC TAC TCC TAT 1713 Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr 260 GCG TTT AAC AAT GCA GTT GAG AAT GCT TTT GAC GAG GGT GTG CTC TCT 1761 Ala Phe Asn Asn Ala Val Glu Asn Ala Phe Asp Glu Gly Val Leu Ser 265 270 275 TGT GTT GCC GCT GGA AAT GAG AAT GTAAGCTCTG CTGAACTGTC CACCATTGAG 1815 Cys Val Ala Ala Gly Asn Glu Asn 280 285 CTAAATTTAG ACTAATGTTT TGCAG AGA GAT GCA GCA CGG ACT AGC CCG GCT 1867 Arg Asp Ala Ala Arg Thr Ser Pro Ala 290 295 TCT GCA CCC GAC GCC ATT ACT GTT GCC GCT ATC AAC AGA AGC AAT GCC 1915 Ser Ala Pro Asp Ala Ile Thr Val Ala Ala Ile Asn Arg Ser Asn Ala 300 305 310 CGT GCG TCA TTC TCA AAC TAC GGC TCT GTG GTT GAC ATT TTT GCC CCG 1963 Arg Ala Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ser Val Val Asp Ile Phe Ala Pro 315 320 325 GGA GAG CAA GTA CTT TCT GCA TGG ACC GGC TCG AAC TCG GCC ACC AAC 2011 Gly Glu Gln Val Leu Ser Ala Typ Thr Gly Ser Asn Ser Ala Thr Asn 330 335 340 ACG ATC TCC GGC ACG TCC ATG GCT ACA CCT CAT GTG ACA GGT TTG ATC 2059 Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Thr Gly Leu Ile 345 350 355 CTC TAT TTG ATG GGC TTG CGG GAC CTT GCT ACC CCA GCG GCT GCA ACG 2107 Leu Tyr Leu Met Gly Leu Arg Asp Leu Ala Thr Pro Ala Ala Ala Thr 360 365 370 375 ACC GAG CTC AAG AGG TTG GCT ACG CGG AAT GCT GTC ACC AAT GTG GCG 2155 Thr Glu Leu Lys Arg Leu Ala Thr Arg Asn Ala Val Thr Asn Val Ala 380 385 390 GGT AGC CCC AAT CTT CTG GCC TAC AAT GGA AAC AGC GGC GTG TCA AAA 2203 Gly Ser Pro Asn Leu Leu Ala Tyr Asn Gly Asn Ser Gly Val Ser Lys 395 400 405 GGG GGT AGC GAT GAT GGA GAT GAG GAC TAGGTGCGTA ACATGAGTGA 2250 Gly Gly Ser Asp Asp Gly Asp Glu Asp 410 415 ATATGGCTTA GAATAGTGGG GATCGGAGAG TAGACTAGTT TATATGCGAA ATAAAGTGTG 2310 TATCAGCACC CTGGCCTGTT CATGTAAGTC GGCATTTTCA CTTTTGCCGA CACCGCAAAT 2370 ATGCTGTGCT TGAGGCTGTT GCCTCCCCAG CCAGCCTTCC CGAGACTGAA ACTCACACAT 2430 CCATTGGATG TATAAAGTTC TGCACATGCG AAATGCCGCT GCCGCTTACC TCCCGACGTG 2490 GTACCGGACC GAAGGCAGAC ACAGATCATG GACCGCTATA CCGCACAGAC AACTTGTGCT 2550 CCTTACTGAA AGTACCATTC CACAGGTCAT TGCAGCATGA TGAGTGATGA TGTACTTCTC 2610 CCCATCAAGA ACCACTGACG GTGGTTGGAA TGAATCTAGA TCAAAGAGAT CAACCGCTTC 2670 CCCAGACAGA TCAGGCCTAT GCCCATAATG AACCGGTGAC TGTGTAACCC TGTTACAATC 2730 CGTTTGTTAT TGGTCCTTTC TGTTTGCTGG ATGGCGTGTA CTACCTCAGA GCTTGTGCTC 2790 CTAGGAGCTC ATACTGGAGA CAGGTTCTTG TATATAGTCA TAGCCTAAGT CCGGTGTCTA 2850 GGAAACAGTA TGCTCGAGGT CTTTTCCGAT TCTCACAATG AGAACTGTCG CCCGGGTCTT 2910 TACGGCCCCT GTGGAAAGCG AAAAGGAGAC GCTTCTGGCG CTGCTTCCGC AATACGGGCT 2970 CAAACTAGCC CCGGACGGGA TCC 2993
【０１９５】 配列番号７についての情報： 配列特徴： 長さ：４１７個のアミノ酸 型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 特徴：アスペルギラス ニガーのスブチリシン型プロテアーゼＰＥＰＤ；遺伝 子ｐｅｐＣの生成物；シグナル配列を含む成熟ペプチド 配列：配列番号７： Met Ala Phe Leu Lys Arg Ile Leu Pro Leu Leu Ala Leu Ile Leu Pro 1 5 10 15 Ala Val Phe Ser Ala Thr Glu Gln Val Pro His Pro Thr Ile Gln Thr 20 25 30 Ile Pro Gly Lys Tyr Ile Val Thr Phe Lys Ser Gly Ile Asp Asn Ala 35 40 45 Lys Ile Glu Ser His Ala Ala Typ Val Thr Glu Leu His Arg Arg Ser 50 55 60 Leu Glu Gly Arg Ser Thr Thr Glu Asp Asp Leu Pro Ala Gly Ile Glu 65 70 75 80 Arg Thr Tyr Arg Ile Ala Asn Phe Ala Gly Tyr Ala Gly Ser Phe Asp 85 90 95 Glu Lys Thr Ile Glu Glu Ile Arg Lys His Asn His Val Ala Tyr Val 100 105 110 Glu Gln Asp Gln Val Typ Tyr Leu Asp Thr Leu Val Thr Glu Arg Arg 115 120 125 Ala Pro Typ Gly Leu Gly Ser Ile Ser His Arg Gly Ala Ser Ser Thr 130 135 140 Asp Tyr Ile Tyr Asp Asp Ser Ala Gly Glu Gly Thr Tyr Ala Tyr Val 145 150 155 160 Val Asp Thr Gly Ile Leu Ala Thr His Asn Glu Phe Gly Gly Arg Ala 165 170 175 Ser Leu Ala Tyr Asn Ala Ala Gly Gly Glu His Val Asp Gly Val Gly 180 185 190 His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Gly Gly Lys Thr Tyr Gly Val 195 200 205 Ser Lys Asn Ala His Leu Leu Ser Val Lys Val Phe Val Gly Glu Ser 210 215 220 Ser Ser Thr Ser Val Ile Leu Asp Gly Phe Asn Typ Ala Ala Asn Asp 225 230 235 240 Ile Val Ser Lys Asn Arg Thr Ser Lys Ala Ala Ile Asn Met Ser Leu 245 250 255 Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr Ala Phe Asn Asn Ala Val Glu Asn Ala Phe 260 265 270 Asp Glu Gly Val Leu Ser Cys Val Ala Ala Gly Asn Glu Asn Arg Asp 275 280 285 Ala Ala Arg Thr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Asp Ala Ile Thr Val Ala 290 295 300 Ala Ile Asn Arg Ser Asn Ala Arg Ala Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ser 305 310 315 320 Val Val Asp Ile Phe Ala Pro Gly Glu Gln Val Leu Ser Ala Typ Thr 325 330 335 Gly Ser Asn Ser Ala Thr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr 340 345 350 Pro His Val Thr Gly Leu Ile Leu Tyr Leu Met Gly Leu Arg Asp Leu 355 360 365 Ala Thr Pro Ala Ala Ala Thr Thr Glu Leu Lys Arg Leu Ala Thr Arg 370 375 380 Asn Ala Val Thr Asn Val Ala Gly Ser Pro Asn Leu Leu Ala Tyr Asn 385 390 395 400 Gly Asn Ser Gly Val Ser Lys Gly Gly Ser Asp Asp Gly Asp Glu Asp 405 410 415
【０１９６】 配列番号８についての情報： 配列特徴： 長さ：２６個の塩基対 型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列：配列番号８： GCTGGATCCC AYGGNACNCA YGTNGC 26
【０１９７】 配列番号９についての情報： 配列特徴： 長さ：２６個の塩基対 型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列：配列番号９： GCTGGATCCC AYGGNACNCA YTGYGC 26
【０１９８】 配列番号１０についての情報： 配列特徴： 長さ：２３個の塩基対 型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列：配列番号１０： CTAGAATTCG CCATNGANGT NCC 23
【０１９９】 配列番号１１についての情報： 配列特徴： 長さ：２３個の塩基対 型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列：配列番号１１： CTAGAATTCG CCATRCTNGT NCC 23
【０２００】 配列番号１２についての情報： 配列特徴： 長さ：１７個の塩基対 型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列：配列番号１２： AGAATGGATC CGCGACG 17
【０２０１】 配列番号１３についての情報： 配列特徴： 長さ：２７個の塩基対 型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 特徴： 名称：Ａ．ニガーｐｅｐＤに相同の領域 位置：１..１２ 特徴： 名称：Ａ．ニガーｐｋｉ遺伝子に相同の領域 位置：１０..２７ 配列：配列番号１３： GAGGAAAGCC ATCTTGACGG ATGATTG 27
【０２０２】 配列番号１４についての情報： 配列特徴： 長さ：２９個の塩基対 型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 特徴： 名称：Ａ．ニガーｐｋｉ遺伝子に相同の領域 位置：１..１０ 特徴： 名称：Ａ．ニガーｐｅｐＤ遺伝子に相同の領域 位置：８..２７ 配列：配列番号１４： CGTCAAGATG GCTTTCCTCA AACGCATTC 29
【０２０３】 配列番号１５についての情報： 配列特徴： 長さ：３１個の塩基対 型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列：配列番号１５： GGTGGGCCAC GAATTCAACA TGGCTTTCCT C 31
【０２０４】 配列番号１６についての情報： 配列特徴： 長さ：４１個の塩基対 型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列：配列番号１６： GGAGATCCGC AAACATAACC ATGTAGCCTA TGTGGAACAA G 41
【０２０５】 配列番号１７についての情報： 配列特徴： 長さ：４０個の塩基対 型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列：配列番号１７： GGCGATTAAC ATGAGTCTTG GTGGAGGCTA CTCCTATGCG 40
【０２０６】 配列番号１８についての情報： 配列特徴： 長さ：４０個の塩基対 型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列：配列番号１８： GCCGCTGGAA ATGAGAATAG AGATGCAGCA CGGACTAGCC 40
フロントページの続き (72)発明者 ヤコブ ビザー オランダ国，6703 セーカー ワゲニンゲ ン，ヒンケローセウェヒ ５ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA20 BA14 CA03 CA04 DA06 DA11 EA03 EA04 GA11 HA01 4B065 AA26X AA62X AA62Y AA72X AA72Y AB01 BA02 BA10 BB03 BB15 BB19 BB20 BB28 BB29 BC03 BC08 BD01 CA24

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 スブチリシン型のアスペルギラス ニガ
    ーセリンプロテアーゼのための遺伝子における欠陥を有
    するアスペルギラス ニガー株。
  2. 【請求項２】 配列番号１の配列のｐｅｐＣ遺伝子にお
    ける欠陥を有するアスペルギラス ニガー、配列番号６
    の配列のｐｅｐＤ遺伝子における欠陥を有するアスペル
    ギラス ニガー、又はそれぞれ配列番号１及び６の配列
    のｐｅｐＣ及びｐｅｐＤ遺伝子の両者における欠陥を有
    するアスペルギラス ニガーから成る群から選択された
    請求項１記載のアスペルギラス ニガー株。
  3. 【請求項３】 スブチリシン型のアスペルギラス ニガ
    ーセリンプロテアーゼのための遺伝子における欠陥を有
    するアスペルギラス ニガー株の調製方法であって、ス
    ブチリシン型のセリンプロテアーゼのための内因性染色
    体アスペルギラス ニガー遺伝子に変異を導入すること
    を含んで成る方法。
  4. 【請求項４】 スブチリシン型のアスペルギラス ニガ
    ーセリンプロテアーゼのための遺伝子における欠陥を有
    するアスペルギラス ニガーの調製のための方法におい
    て、スブチリシン型のアスペルギラス ニガーセリンプ
    ロテアーゼのための遺伝子のインビトロ変異、スブチリ
    シン型のセリンプロテアーゼのための対応する内因性染
    色体遺伝子を担持するアスペルギラス ニガー宿主の前
    記インビトロ変異された遺伝子による形質転換、及び前
    記内因性遺伝子が前記インビトロ変異された遺伝子によ
    り置換されている変異体の単離、を含んで成る請求項３
    記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記内因性遺伝子が、配列番号１を有す
    る配列のアスペルギラス ニガーｐｅｐＣ遺伝子、配列
    番号６を有する配列のアスペルギラス ニガーｐｅｐＤ
    遺伝子、又は前記ｐｅｐＣ及びｐｅｐＤ遺伝子の両者で
    ある請求項４記載の方法。
JP2003026301A 1992-04-15 2003-02-03 菌類プロテアーゼ Expired - Lifetime JP3636455B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP92810281 1992-04-15
GB939305097A GB9305097D0 (en) 1993-03-12 1993-03-12 Noval fungal protease
GB9305097:9 1993-03-12
GB92810281:3 1993-03-12

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP08663293A Division JP3424840B2 (ja) 1992-04-15 1993-04-14 菌類プロテアーゼ

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2003235591A true JP2003235591A (ja) 2003-08-26
JP3636455B2 JP3636455B2 (ja) 2005-04-06

Family

ID=26132501

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP08663293A Expired - Lifetime JP3424840B2 (ja) 1992-04-15 1993-04-14 菌類プロテアーゼ
JP2003026301A Expired - Lifetime JP3636455B2 (ja) 1992-04-15 2003-02-03 菌類プロテアーゼ

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP08663293A Expired - Lifetime JP3424840B2 (ja) 1992-04-15 1993-04-14 菌類プロテアーゼ

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP0574347B1 (ja)
JP (2) JP3424840B2 (ja)
KR (1) KR100270644B1 (ja)
AT (1) ATE252156T1 (ja)
AU (1) AU663173B2 (ja)
CA (1) CA2093950C (ja)
CY (1) CY2507B1 (ja)
DE (1) DE69333249T2 (ja)
DK (1) DK0574347T3 (ja)
ES (1) ES2208637T3 (ja)
FI (1) FI112667B (ja)
HU (1) HU219809B (ja)
IL (2) IL105383A0 (ja)
MX (1) MX9302202A (ja)
NO (1) NO315379B1 (ja)
NZ (1) NZ247397A (ja)
PT (1) PT574347E (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MD4186C1 (ro) * 2012-02-20 2013-06-30 Институт Микробиологии И Биотехнологии Академии Наук Молдовы Tulpină de fungi Fusarium gibbosum - producătoare de proteaze acide şi neutre, xilanaze şi b-glucozidaze

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5821350A (en) * 1995-11-01 1998-10-13 Nexia Biotechnologies, Inc. Aspergillus niger beta-galactosidase gene
AU1092897A (en) * 1995-12-15 1997-07-14 Novo Nordisk A/S A funguns wherein the area, pepc and/or pepe genes have been inactivated
AU2152897A (en) 1996-03-27 1997-10-17 Novo Nordisk A/S Alkaline protease deficient filamentous fungi
EP0907744A1 (en) * 1996-06-05 1999-04-14 Gist-Brocades B.V. Fungal metallo protease genes
JPH1016992A (ja) * 1996-07-04 1998-01-20 Toagosei Co Ltd 接着剤用容器
US6806062B1 (en) 1998-10-05 2004-10-19 Novozymes A/S Fungal transcriptional activator useful in methods for producing polypeptides
WO2001068864A1 (en) 2000-03-14 2001-09-20 Novozymes A/S Fungal transcriptional activator useful in methods for producing polypeptides
US7858360B2 (en) 2005-10-17 2010-12-28 Novozymes A/S Use of fungal mutants for expression of antibodies
WO2009071530A1 (en) 2007-12-06 2009-06-11 Novozymes A/S Fungal pepc inhibitor
WO2011075677A2 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Novozymes, Inc. Methods for producing polypeptides in protease-deficient mutants of trichoderma
DK3019602T3 (en) 2013-07-10 2018-11-12 Glykos Finland Oy MULTIPLE PROTEASE-DEFECTED FILAMENTARY FUNGAL CELLS AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
DK3036324T3 (en) * 2013-08-23 2019-04-01 Novozymes As Regulated PepC expression
CA2954974A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Glykos Finland Oy Production of glycoproteins with mammalian-like n-glycans in filamentous fungi

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1333777C (en) * 1988-07-01 1995-01-03 Randy M. Berka Aspartic proteinase deficient filamentous fungi

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MD4186C1 (ro) * 2012-02-20 2013-06-30 Институт Микробиологии И Биотехнологии Академии Наук Молдовы Tulpină de fungi Fusarium gibbosum - producătoare de proteaze acide şi neutre, xilanaze şi b-glucozidaze

Also Published As

Publication number Publication date
JPH0646863A (ja) 1994-02-22
KR100270644B1 (ko) 2000-11-01
MX9302202A (es) 1994-04-29
CY2507B1 (en) 2005-12-23
HU9301087D0 (en) 1993-06-28
IL105383A0 (en) 1993-08-18
FI931634A0 (fi) 1993-04-08
AU3695993A (en) 1993-10-21
NO315379B1 (no) 2003-08-25
EP0574347B1 (en) 2003-10-15
NO931368L (no) 1993-10-18
PT574347E (pt) 2004-02-27
NO931368D0 (no) 1993-04-14
CA2093950C (en) 2006-05-09
ATE252156T1 (de) 2003-11-15
IL170763A (en) 2007-10-31
KR930021783A (ko) 1993-11-23
EP0574347A3 (ja) 1994-04-13
AU663173B2 (en) 1995-09-28
HUT67800A (en) 1995-05-29
DE69333249T2 (de) 2004-07-29
DK0574347T3 (da) 2004-01-26
NZ247397A (en) 1995-08-28
ES2208637T3 (es) 2004-06-16
DE69333249D1 (de) 2003-11-20
JP3636455B2 (ja) 2005-04-06
JP3424840B2 (ja) 2003-07-07
EP0574347A2 (en) 1993-12-15
FI931634A (fi) 1993-10-16
CA2093950A1 (en) 1993-10-16
FI112667B (fi) 2003-12-31
HU219809B (hu) 2001-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3424840B2 (ja) 菌類プロテアーゼ
CA2205411A1 (en) Lysophospholipase produced from aspergillus by recombinant methods
JP2633885B2 (ja) 新規な発現系
EP0655497B1 (en) Fungal protease
US5846802A (en) Fungal Protease
JP3576549B2 (ja) 真核生物発現系
EP0439997B1 (en) Novel fungal expression system
JP2001500022A (ja) 麹菌における蛋白分解酵素の発現の増強
JPH06343471A (ja) ポリペプチドの製造方法
JP2003505085A (ja) Ｐｙｒｆ遺伝子及びその使用
JPWO2003083109A1 (ja) 選択マーカー遺伝子
JP2002514077A (ja) １を超える非リボソームｒｎａをコードしているドメインの染色体ゲノムに組込まれた少なくとも２コピーの所望遺伝子を含む、特にクルイベロミセスによる酵母細胞

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20040115

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20040511

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20040730

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20040806

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20041029

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20041130

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20050104

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080114

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090114

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090114

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100114

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110114

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110114

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120114

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130114

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130114

Year of fee payment: 8

EXPY Cancellation because of completion of term