DE68920882T3

DE68920882T3 - Aspartat-proteinase-defiziente filamentöse fungi.

Info

Publication number: DE68920882T3
Application number: DE68920882T
Authority: DE
Inventors: Randy San Mateo BERKA; Kirk Burlingame HAYENGA; Virgil Brian San Mateo LAWLIS; Michael Half Moon Bay WARD
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1988-07-01
Filing date: 1989-07-01
Publication date: 2005-06-09
Anticipated expiration: 2009-07-02
Also published as: ATE117720T1; US5840570A; EP0429490B1; WO1990000192A1; CA1333777C; DE68920882D1; HK110395A; DE68920882T2; EP0429490B2; US6509171B1; FI906442A0; EP0429490A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Produktion von Polypeptiden in geeigneten neuen Wirten. Spezieller betrifft diese Erfindung die Produktion von heterologen Polypeptiden in neuen filamentösen Wirtspilzen, die nicht in der Lage sind, enzymatisch aktive Aspartat-Proteinase auszuscheiden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Aspergillopepsine sind eine Familie von eng verwandten Aspartat-Proteinasen, die von gewissen filamentösen Pilzen der Art Aspergillus produziert werden. Ihnen ist weitgehende Aminosäure-Sequenzhomologie mit den Penicillopepsinen gemeinsam, die von gewissen Penicillium-Specien produzierte Aspartat-Proteinasen sind (V. Kostka, Hrsg., "Aspartic Proteinases and Their Inhibitors", Walter de Gruyter, New York, S. 27–40, 1985). Die Aspergillopepsine besitzen ebenso gemeinsame Bereiche von Homologie mit Aspartat-Proteinasen aus anderen filamentösen Pilzen, wie z. B. Mucor miehei (Neth. Milk Dairy J., 35, S. 275–280, 1981), Rhizopus chinensis (Can. J. Biochem., 51, S. 789–796, 1973) und Endothia parasitica (Eur. J. Biochem., 167, S. 327–338, 1987). Der Grad der Sequenz-Konservierung scheint in den Bereichen am stärksten zu sein, die Aminosäure-Reste an aktiven Stellen umgeben.
Die vollständige Aminosäure-Sequenz von Aspergillopepsin A aus A. awamori wurde beschrieben (Bioorg. Khim., 8, S. 1030–1047, 1986). Das reife Enzym ist aus einer einzelnen Polypeptidkette aus 238 Aminosäuren zusammengesetzt. Gene, die für die Aspartat-Proteinasen von Mucor miehei (Gene, 48, S. 41–53, 1986; Proteins, 1, S. 363–369, 1986) und Rhizopus chinensis (J. Biol. Chem., 262, S. 1461–1467, 1987) kodieren, wurden kloniert und ihre Nukleotid-Sequenzen lieferten die Information, daß diese Enzyme als Zymogen-Vorläufer synthetisiert werden. Es wurden Aspartat- Proteinasen von Pilzen eingehend untersucht, und es ist eine beträchtliche Menge an Information hinsichtlich der Stuktur-Funktion-Beziehungen (Biochim. Biophys. Acta, 336, S. 437–444, 1974), sowie der dreidimensionalen Strukturen mancher dieser Enzyme verfügbar (Nature, 267, S. 808–813, 1977; Nature, 266, S. 140–145, 1977; J. Mol. Biol., 196, S. 877–900; FEBS Lett., 174, S. 96–101, 1984; "Aspartic Proteinases and Their Inhibitors", Walter de Gruyter, New York, S. 151–161 und 163–177, 1985).
Genomische DNA-Sequenzen, die für das Aspartat-Proteinase-Gen von Mucor miehei kodieren, wurden von Gray et al. (Gene, 48, S. 41–53, 1986) isoliert. Die Nukleotid-Sequenz dieses Gens zeigte, daß sie keine intervenierenden Sequenzen enthielt.
Filamentöse Pilze wurden neuerdings als Wirte für die Expression und Sekretion heterologer Proteinprodukte verwendet (Bio/Technol., 5, S. 369–376, 1987; Bio/Technol. 5, S. 713–719, 1987; Bio/Technol., 5, S. 1301–1304, 1987). Während derartige Asparaginsäure-Proteinasen aus filamentösen Wirtspilzen ein heterologes Polypeptid abbauen können, falls sie ausreichend lange damit in Kontakt kommen, wurde angenommen, daß rasche in vitro-Trennung des Proteins ausreicht, um jegliches Stören durch Aspartat-Proteinase bei der Expression des in filamentösen Pilzen exprimierten heterologen Polypeptids zu verhindern.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wurde gefunden, daß, falls in einem filamentösen Pilz die Gensequenz, die der daraus produzierten Aspartat-Proteinase entspricht, durch stellen-gerichtete DNA-Löschung in der Gensequenz, die für die Aspartat-Proteinase kodiert, vollständig inaktiviert oder entfernt ist, ein derartiger Pilz bei Verwendung als Wirt für die Produktion eines heterologen Polypeptids die Produktion des dadurch produzierten heterologen Polypeptids überraschenderweise steigert.
Dementsprechend wird ein neuer mutanter filamentöser Pilz und eine Pilzkultur bereitgestellt, die für die Produktion von heterologen Polypeptiden geeignet sind, und der eine irreversible stellen-gerichtete Löschung enthält, die dazu führt, daß der filamentöse Pilz nicht fähig ist, enzymatisch aktive Aspartat-Proteinase auszuscheiden.
Es wird ein Verfahren zur Produktion eines heterologen Polypeptids in einem filamentösen Pilz beschrieben, das das Kultivieren eines filamentösen Pilzes, der in der Lage ist, das heterologe Polypeptid zu exprimieren und der eine irreversible stellen-gerichtete Löschung enthält, die dazu führt, daß der filamentöse Pilz nicht fähig ist, enzymatisch aktive Aspartat-Proteinase auszuscheiden, bis sich eine Menge des heterologen Polypeptids im Kulturmedium angesammelt hat, und die anschließende Gewinnung des Polypeptids umfaßt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1: Southern-Hybridisierung der gesamten Zell-DNA aus A. awamori-Stamm UVK143f. DNA wurde mit den oberhalb jeder Reihe angegebenen Restriktionsenzymen digeriert, durch Agarosegel-Elektrophorese fraktioniert und auf eine Nytran-Membran geblottet. Das Membranfilter wurden anschließend mit einem radioaktiv markierten 59mer sondiert, das den Aminosäure-Resten 5–24 des reifen Aspergillopepsins A entspricht. Die Größen der HindIII-digerierten Bakteriophagen-λ-DNA-Marker und HaeIII-digerierten ϕX174-RF-DNA-Marker sind dargestellt.
2: Partielle Restriktionskarte eines 9 kb EcoRI-Fragments und eines 2,4 kb SalI-Fragments von genomischer A. awamori-DNA, die für das Aspergillopepsin A-Gen kodiert. Richtungspfeile unter der Restriktionskarte bezeichnen Fragmente, die in M13-Vektoren zur DNA-Sequenzierung subkloniert wurden.
3: Nukleotid-Sequenz des Aspergillopepsin A-Gens aus A. awamori und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz. Die Reste –69 bis –50 umfassen ein vermutliches Signalpeptid, und die Reste –49 bis –1 können einen stark geladenen Propeptid-Bereich darstellen. Es ist ein mögliches Polyadenylierungssignal (***) dargestellt. Die TATAA-Sequenz stromaufwärts der Transkriptions-Initiierungsstelle ist eingekreist. Die PuCTPuAC-Konsens-Sequenzen, die allgemein innerhalb von Intronen von filamentösen Pilzen zu finden sind, sind überstrichen.
4: Konstruktion des Aspergillopepsin-Gen-Ersatzvektors pUCΔAP-argB. Details dieser Konstruktion sind in den Beispielen angeführt.
5: Spalte A: Southern-Hybridisierungsanalyse der gesamten Zell-DNA, die aus A. awamori-Aspergillopepsin-defizienten Transformanten extrahiert wurde. Die DNA wurde mit SalI digeriert, durch Agarosegel-Elektrophorese fraktioniert und auf eine Nytran-Membran geblottet. Die Membran wurde mit einem radioaktiv markierten Fragment von A. awamori-DNA sondiert, das den gesamten Aspergillopepsin-Kodierbereich sowie DNA-Sequenzen aus den 5'- und 3'-Flankenbereichen enthielt. Die Reihen sind: (1) Stamm-GC12 als Vergleich; (2) ΔAP3; (3) ΔAP4; (4) ΔAP5; (5) ΔAP6. Die Positionen der HindIII-digerierten Bakteriophagen-λ-DNA-Marker sind dargestellt. Spalte B: Hybridisierungsanalyse der gesamten Zell-DNA, die aus A. awamori-Stamm UVK143f (Reihe 1), der ein Wildtyp-Vergleich ist, und Stamm ΔAP6, der ein aspergillopepsin-defizienter Transformant ist, extrahiert wurde. Die Positionen von RNA-Größenmarkern (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) sind dargestellt.
6: Aspergillopepsin-Aktivität in Kulturfiltraten der Stämme GC12, ΔAP3 und ΔAP4, wie auf Magermilch-Agarose-Platten festgestellt. PEP, mit 0,1 mM Pepstatin behandelt; PMSF, mit 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid behandelt; EDTA, mit 10 mM EDTA behandelt; DAN, mit 12 mM Diazoacetylnorleucinmethylester behandelt.
7: Rekombinationsmodell für die Erzeugung von aspergillopepsin-defizienten A. awamori-Stämmen durch Genersetzungs-Vorgänge am Aspergillopepsin-Genlocus.
8: Ergebnisse von doppelten 50 ml-Schüttelkolben-Kulturen eines aspergillopepsin-gelöschten Stammes (Stamm ΔAP4-1) und eines aspergillopepsin-nicht-gelöschten Stammes (Stamm 12). Die Konzentration von Chymosin wurde in überschüssigem Überstand bestimmt, der jeder Kultur von Tag 2 an täglich entnommen wurde.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Enzymatisch aktive Aspartat-Proteinasen sind jene Enzyme oder Stücke von Enzymen, die bei niedrigem pH proteolytische Aktivität zeigen und katalytische Asparaginsäure-Reste an ihrer aktiven Stelle enthalten. Sie werden normalerweise aus filamentösen Pilzen isoliert, sind in ihrer Aktivität ähnlich und haben gemeinsame Bereiche von Homologie, besonders um Aminosäure-Reste an aktiven Stellen herum. Wo eine ausreichend große Löschung erfolgt, d. h., wo DNA, die für zumindest die 2 Asparaginsäure-Reste der aktiven Stellen kodiert, aus der Gensequenz herausgeschnitten wird, ist jedes falls überhaupt ausgeschiedene Polypeptid proteolytisch inaktiv. Beispiele für Aspartat-Proteinasen sind Aspergillopepsin aus Aspergillus, Mucor-Aspartat-Proteinase aus Mucor, Rhizopuspepsin aus Rhizopus und Endothiapepsin aus Endothia.
Filamentöse Pilze, die sich für die Produktion von heterologen Polypeptiden eignen, bedeutet filamentöse Pilze, die mit geeigneten Vektoren unter Anwendung von rekombinanten DNA-Vorgangsweisen transformiert oder transfiziert werden oder werden können. Der Ausdruck Vektoren bezeichnet DNA-Konstrukte, die eine DNA-Sequenz enthalten, die mit einer geeigneten Steuersequenz operabel verbunden ist, die in der Lage ist, die Expression der DNA in einem geeigneten Wirt zu bewirken. Derartige Steuersequenzen umfassen einen Promotor zum Bewirken von Transkription, gegebenenfalls eine Regelsequenz zum Steuern derartiger Transkription, eine Sequenz, die für geeignete mRNA-Ribosom-Bindungsstellen kodiert, und Sequenzen, die die Termination von Transkription und Translation steuern. Der Vektor kann ein Plasmid, ein Virusteilchen oder einfach ein lineares DNA-Fragment sein. Einmal in den geeigneten Wirt transformiert, kann der Vektor in das Genom integriert werden. In der vorliegenden Beschreibung werden "Plasmid" und "Vektor" manchmal austauschbar verwendet, da das Plasmid die zurzeit am häufigsten verwendete Form eines Vektors ist. Die Erfindung soll jedoch derartige anderen Formen von Expressionsvektoren umfassen, die äquivalente Funktionen erfüllen und die nach dem Stand der Technik bekannt sind oder werden.
"Operabel verbunden", falls die Beziehung zwischen zwei DNA-Bereichen beschrieben wird, bedeutet einfach, daß sie in ihrer Funktion miteinander verwandt sind. Beispielsweise ist eine Präsequenz mit einem Peptid operabel verbunden, falls sie als Signalsequenz fungiert, die an der Sekretion der reifen Form des Proteins teilnimmt, das höchstwahrscheinlich die Spaltung der Signalsequenz einschließt. Ein Promotor ist mit einer Kodiersequenz operabel verbunden, falls er die Transkription der Sequenz steuert; eine Ribosom-Bindungsstelle ist mit einer Kodiersequenz operabel verbunden, falls sie so positioniert ist, um die Translation zuzulassen.
"Unfähig, Aspartat-Proteinase auszuscheiden" bedeutet, daß der Organismus nicht zur Reversion zum Wildtyp fähig ist. Reversion ist eine zeitlich begrenzte Wahrscheinlichkeit, die bei natürlich vorkommenden oder induzierten Punktmutationen auftritt, worin die einzelnen Mutationen während der Verwendung zur Produktion eines aktiven Genprodukts auf natürliche Weise leicht zurück mutieren könnte. Das steht im Gegensatz zu hier vorgesehenen großen Löschungen oder Löschungen aktiver Stellen. Die Löschungen der Erfindung sollten zumindest die Kodone für die 2 Asparaginsäure-Reste der aktiven Stellen der Aspartyl-Proteinase-Gensequenz umfassen, und vorzugsweise sollte DNA gelöscht werden, die zumindest für etwa 100 Aminosäuren kodiert. Noch bevorzugter ist sogar, daß die gesamte Gensequenz, die für die Aspartat-Proteinase kodiert, gelöscht wird. Es ist möglich, genau jene DNA zu löschen, die für Aminosäuren kodiert, die den Resten der aktiven Stellen entsprechen. In diesem Fall wird am meisten bevorzugt, daß die Kodone für zumindest 2 der Asparaginsäure-Reste der aktiven Stellen gelöscht werden, um die Reversion zur Rekonstruktion einer aktiven Form des Enzyms zu verhindern. "Polypeptide" sind Polymere aus Aminosäuren, die kovalent durch Peptidbindungen verbunden sind. Polypeptide umfassen Polymere mit niedrigem Molekulargewicht, die allgemeiner als Proteine bezeichnet werden. Außerdem kann ein Polypeptid ein Phosphopolypeptid, Glykopolypeptid oder Metallopolypeptid sein. Weiters können eine oder mehrere Polymerketten zu einem Polypeptid kombiniert sein.
Wie hierin verwendet, ist ein "heterologes Polypeptid" ein Polypeptid, das vom filamentösen Pilz, der verwendet wird, um das spezielle Polypeptid zu exprimieren, normalerweise nicht exprimiert und sekretiert wird. Heterologe Polypeptide umfassen Polypeptide, die aus prokaryotischen Quellen stammen (z. B. α-Amylase aus Bacillus-Spezien, alkalische Proteinase aus Bacillus-Spezien und verschiedene hydrolytische Enzyme aus Pseudomonas, etc.), Polypeptide, die aus eukaryotischen Quellen stammen (z. B. Rinderchymosin, menschlicher Gewebeplasminogenaktivator, menschliches Wachstumshormon, menschliches Interferon, Urokinase, menschliches Serumalbumin, Faktor VIII, etc.) und Polypeptide, die aus anderen Wirtspilzen als der Expressionswirt stammen (z. B. Glucoamylase aus A. niger und Humicola grisea, exprimiert in A. nidulans, die Aspartyl-Proteinase aus Mucor miehei, exprimiert in A. nidulans, etc.).
Heterologe Polypeptide umfassen auch Hybrid-Polypeptide, die eine Kombination von partiellen oder vollständigen Polypeptid-Sequenzen umfassen, die von zumindest zwei unterschiedlichen Polypeptiden stammen, die jeweils hinsichtlich des Expressions-Wirtspilzes homolog oder heterolog sein können. Beispiele für derartige Hybrid-Polypeptide umfassen: 1) für Prochymosin kodierende DNA-Sequenzen, die mit DNA-Sequenzen verschmolzen sind, die allein oder in Verbindung mit verschiedenen Mengen von aminoterminalen oder reifen Glucoamylase-Kodonen, für die A. niger- oder A. awamori-Glucoamylase-Signal- und -prosequenz, kodieren, und 2) DNA-Sequenzen, die für Pilz-Glucoamylase oder irgendeine Pilz-Aspartat-Proteinase, menschlichen Gewebeplasminogenaktivator oder menschliches Wachstumshormon kodieren, verschmolzen mit DNA-Sequenzen, die allein oder in Verbindung mit verschiedenen Mengen von aminoterminalen Kodonen oder reifen Glucoamylase-Kodonen, die mit dem funktionellen Signal verbunden sind, für eine funktionelle Signalsequenz, kodieren.
Weiters umfassen die heterologen Polypeptide der vorliegenden Erfindung ebenso: 1) natürlich vorkommende allelische Variationen, die in der Sequenz von Polypeptiden existieren oder auftreten können, die aus den zuvor erwähnten prokaryotischen, eukaryotischen und Pilz-Quellen stammen, sowie jene, die verwendet werden, um die zuvor beschriebenen heterologen Polypeptide zu bilden, und 2) maßgeschneiderte Variationen der zuvor erwähnten heterologen Polypeptide, die beispielsweise mittels stellen-spezifischer Mutagenese hergestellt werden, worin verschiedene Löschungen, Einfügungen oder Substitutionen einer oder mehrerer Aminosäuren in den heterologen Polypeptiden vollzogen werden.
Für jedes der eben definierten heterologen Polypeptide wird von einer heterologen DNA-Sequenz kodiert, die ein Stopsignal enthält, das vom filamentösen Pilz erkannt wird, in dem die Expression und Sekretion erfolgt. Falls von diesen erkannt, beendet das Stopsignal die Translation der für das heterologe Polypeptid kodierenden mRNA.
Die "filamentösen Pilze" (Fadenpilze) der vorliegenden Erfindung sind eukaryotische Mikroorganismen und umfassen alle filamentösen Formen der Unterabteilung Eumycotina. Diese Pilze sind durch ein vegetatives Mycel mit einer Zellwand aus Chitin, Zellulose und anderen komplexen Polysacchariden gekennzeichnet. Die filamentösen Pilze der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich morphologisch, physiologisch und genetisch von Hefen. Das vegetative Wachstum der filamentösen Pilze erfolgt durch Hyphenverlängerung, und der Kohlenstoff-Katabolismus ist unbedingt aerob. Im Gegensatz dazu erfolgt das vegetative Wachstum von Hefen, wie z. B. S. cerevisiae, durch Knospung eines einzelligen Thallus, und der Kohlenstoff- Katabolismus kann fermentativ sein. S. cerevisiae besitzt eine hervorstechende, sehr stabile, diploide Phase, während in filamentösen Pilzen, wie A. nidulans und Neurospora crassa, Diploide nur kurz vor der Meiose auftreten. S. cerevisiae besitzt 17 Chromosomen, während A. nidulans und N. crassa nur 8 bzw. 7 aufweisen. Neuliche Aufstellungen der Unterschiede zwischen S. cerevisiae und filamentösen Pilzen umfassen die Unfähigkeit von S. cerevisiae, Aspergillus- und Trichoderma-Introne zu verarbeiten und viele transkriptionale Regulatoren der filamentösen Pilze zu erkennen.
Viele Spezien von filamentösen Pilzen können als Expressionswirte verwendet werden, einschließlich der folgenden Arten: Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Podospora, Endothia, Mucor, Cochliobolus und Pyricularia. Spezielle Expressionswirte umfassen A. nidulans, A. niger, A. awamori, z. B. NRRL 3112, ATCC 22342 (NRLL 3112), ATCC 44733, ATCC 14331 und Stamm UVK143f, A. oryzae, z. B. ATCC 11490, N. crassa (16, 17, 23), Trichoderma reesei, z. B. NRLL 15709, ATCC 13631, 56764, 56765, 56466, 56767, und Trichoderma viride, z. B. ATCC 32098 und 32086.
Wie hierin verwendet, ist eine "Promotor-Sequenz" eine DNA-Sequenz, die vom speziellen filamentösen Pilz zu Expressionszwecken erkannt wird. Sie ist mit einer DNA-Sequenz, die für die zuvor definierten Polypeptide kodiert, operabel verbunden. Eine derartige Bindung umfaßt das Positionieren des Promotors gegenüber dem Initiierungskodon der DNA-Sequenz, die für die Signalsequenz der beschriebenen Transformationsvektoren kodiert. Die Promotor-Sequenz enthält Transkriptions- und Translations-Steuersequenzen, die die Expression von Signalsequenz und heterologem Polypeptid vermitteln. Beispiel umfassen den Promotor von A. niger-Glucoamylase, die Mucor miehei-Aspartyl-Proteinase und A. niger-α-Glucosidase von Trichoderma reesei-Cellobiohydrolase I, A. nidulans-trpC und höhere eukaryotische Promotoren, wie z. B. den frühen SV40-Promotor.
In ähnlicher Weise ist eine "Terminatorsequenz" eine DNA-Sequenz, die vom Expressionswirt zum Beenden der Transkription erkannt wird. Sie ist mit dem 3'-Ende der für das zu exprimierende heterologe Polypeptid kodierenden DNA operabel verbunden. Beispiele umfassen den Terminator von A. nidulans-trpC, A. niger-Glucoamylase (39, 48), A. niger-α-Amylase und der Mucor miehei-Aspartat-Proteinase, obwohl wahrscheinlich jeder Pilz-Terminator in der vorliegenden Erfindung funktionell sein wird.
Eine "Polyadenylierungs-Sequenz" ist eine DNA-Sequenz, die, falls transkribiert, vom Expressionswirt erkannt wird, um Polyadenosin-Reste an transkribierte mRNA anzufügen. Sie ist mit dem 3'-Ende der für das zu exprimierende heterologe Polypeptid kodierenden mRNA operabel verbunden. Beispiele umfassen Polyadenylierungs-Sequenzen von A. nidulans-trpC, A. niger-Glucoamylase, A. niger-α-Amylase und der Mucor miehei-Aspartat-Proteinase. Wahrscheinlich wird jedoch jede Pilz-Polyadenylierungs-Sequenz in der vorliegenden Erfindung funktionell sein.
Eine "Signalsequenz" ist eine Aminosäure-Sequenz, die, falls operabel mit dem Aminoterminus eines heterologen Polypeptids verbunden, die Sekretion derartiger heterologer Polypeptide aus dem filamentösen Pilz ermöglicht. Derartige Signalsequenzen können die Signalsequenz sein, die normalerweise mit dem heterologen Polypeptid assoziiert ist (d. h. eine native Signalsequenz) oder können aus anderen Quellen stammen (d. h. eine fremde Signalsequenz). Signalsequenzen sind mit einem heterologen Polypeptid entweder unter Verwendung einer nativen Signalsequenz oder durch Anhängen einer DNA-Sequenz, die für eine fremde Signalsequenz kodiert, an eine DNA-Sequenz, die für das heterologe Polypeptid kodiert, im richtigen Leserahmen operabel verbunden, um die Translation der Signalsequenz und des heterologen Polypeptids zu ermöglichen. Bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignete Signalsequenzen umfassen Signale abgeleitet von Rinder-Präprochymosin, A. niger-Glucoamylase, der Mucor miehei-Aspartat-Proteinase und Trichoderma reesei-Cellulasen. Es wird jedoch jede Signalsequenz, die in der Lage ist, die Sekretion eines heterologen Polypeptids zu ermöglichen, durch die vorliegende Erfindung in Erwägung gezogen.
Ein "Propeptid" oder eine "Prosequenz" ist eine Aminosäuresequenz am Aminoterminus eines reifen biologisch aktiven Polypeptids. Falls so positioniert, wird das erhaltene Polypeptid ein Zymogen genannt. Zymogene sind im allgemeinen biologisch inaktiv und können durch katalytische oder autokatalytische Abspaltung des Propeptids vom Zymogen zu reifen aktiven Polypeptiden umgewandelt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der ausgewählte filamentöse Wirtspilz ein Aspergillus, der transformiert wird, um das heterologe Polypeptid Chymosin zu exprimieren. Chymosin aus filamentösen Wirtspilzen ist von besonderem Wert bei der Käseherstellung. Isoliertes rekombinantes Chymosin aus filamentösen Wirtspilzen ist üblicherweise mit verschiedenen anderen Proteinasen verunreinigt, und man nimmt an, daß Aspartat-Proteinase wegen ihrer undifferenzierten Hydrolyse bei Käse zu untypischem Geschmack führen würde.
Die beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen dienen als Beispiele und sollen den Bereich der Erfindung nicht einschränken. Der Fachmann auf dem diesem Gebiet kann auf der Basis dieser Beschreibung leicht andere filamentöse Pilze, heterologe Polypeptide und Verfahrensbedingungen auswählen.
ALLGEMEINE VERFAHREN
Es wird ein filamentöser Pilz ausgewählt, der fähig ist, ein heterologes Gen zu exprimieren, oder dieses bereits exprimiert, beispielsweise jene in US-Ser.No.-882.224, eingereicht am 7. Juli 1986, allgemein beschriebenen filamentösen Pilze, und der eine Aspartat-Proteinase exprimiert.
"Transformation" ist ein Verfahren, worin ein Transformationsvektor in einen filamentösen Pilze eingebracht wird. Die Transformationsverfahren der vorliegenden Erfindung führten zur stabilen Integration des gesamten oder eines Teils des Transformationsvektors in das Genom des filamentösen Pilzes. Beim Hinweis auf das heterologe Polypeptid werden auch selbst-replizierende extra-chromosomale Transformationsvektoren in Betracht gezogen. Ein Verfahren zur Transformation wird im Detail im Abschnitt der bevorzugten Ausführungsform beschrieben.
"Digestion" von DNA bedeutet katalytische Spaltung der DNA mit einem Enzym, das nur an gewissen Stellen in der DNA angreift. Derartige Enzyme werden Restriktionsenzyme und die Stellen, für die jedes spezifisch ist, werden Restriktionsstellen genannt. "Partielle" Digestion bedeutet unvollständige Digestion durch ein Restriktionsenzym, d. h., es werden Bedingungen gewählt, die zur Spaltung von manchen, aber nicht allen Stellen für eine gegebene Restriktionsendonuklease in einem DNA-Substrat führen. Die verschiedenen hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind kommerziell erhältlich, und ihre Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderen Anforderungen wurden, wie vom Enzymhändler angegeben, verwendet. Im allgemeinen wird etwa 1 μg Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 1 Enzymeinheit und etwa 20 μl Pufferlösung eingesetzt. Geeignet Puffer- und Substratmengen für spezielle Restriktionsenzyme werden vom Hersteller genau angegeben. Es werden normalerweise Inkubationszeiten von etwa 1 h bei 37°C verwendet, diese können jedoch je nach Angaben des Händlers variieren. Nach der Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt, und die digerierte Nukleinsäure wird aus der wäßrigen Fraktion durch Fällung mit Ethanol gewonnen. Auf die Digestion mit einem Restriktionsenzym kann eine Hydrolyse der terminalen 5'-Phosphate mit bakterieller alkalischer Phosphatase folgen, um die beiden Enden eines DNA-Fragments daran zu hindern, eine geschlossene Schleife zu bilden, die die Einfügung eines weiteren DNA-Fragments an der Restriktionsstelle bei der Ligation behindern würde.
"Gewinnung" oder "Isolierung" eines gegebenen DNA-Fragments aus einem Restriktionsdigest bedeutet die Auftrennung des Digests durch Polyacrylamid- oder Agarosegel-Elektrophorese, Identifizierung der interessierenden Fragments, Entfernung des Gelabschnitts, der das gewünschte Fragment enthält, und Abtrennung der DNA vom Gel, im allgemeinen durch Elektroelution.
"Ligation" bedeutet das Verfahren der Bildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen zwei doppelstrangigen Nukleinsäure-Fragmenten. Falls nicht anders angegeben, erfolgte die Ligation unter Verwendung von bekannten Puffern und Bedingungen mit 1 Einheit T4-DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 μg von ungefähr gleichen molaren Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente.
"Oligonukleotide" sind kurze ein- oder doppelstrangige Polydesoxynukleotide, die chemisch synthetisiert und anschließend auf Polyacrylamidgelen gereinigt wurden.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung zeigten, daß, falls zumindest ein Abschnitt des Aspartat-Proteinase-Gens durch stellen-gerichtete Mutagenese oder andere in vitro-Verfahren, wie z. B. Entfernung des Gensegments durch Digestion mit Restriktionsenzymen, aus dem filamentösen Pilz entfernt wird, sodaß er nicht zur Reversion zurück zur Wildtyp-Expression der Aspartat-Proteinase fähig ist, ein derartiger Organismus ein geeigneter Wirt zur Produktion von heterologen Polypeptiden ist. Das Ergebnis dieser Erfindung ist, daß der filamentöse Wirtspilz mehr heterologes Polypeptid produziert, als wenn der Wirt auch aktive Aspartat-Proteinase liefert. Über den Mechanismus der gesteigerten Produktion kann spekuliert werden, z. B. daß Proteinasen das produzierte Polypeptid abbauen. In ähnlicher Weise, daß Aspartat-Proteinase mit der Produktion oder Funktion von anderen Polypeptiden wechselwirken kann, die für die Produktion von heterologen Proteinen notwendig sind, oder daß für den Organismus mehr Energie vorhanden ist, da er keine Energie für die Herstellung der Aspartat-Proteinase verschwendet. Was auch immer der Mechanismus sein mag, es ist überraschend, daß ein derartiger Organismus üblicherweise ohne Aspartat-Proteinase überlebt oder daß derartige Mechanismen signifikant genug sind, um zu einer verbesserten Ausbeute an heterologem Polypeptid zu führen. Auch da es viele andere Proteinasen in filamentösen Pilzen gibt, ist es überraschend, daß das Löschen von Aspartat-Proteinase allein ausreicht, um die Expression signifikant zu verbessern.
Während stellen-gerichtete Mutagenese genutzt werden kann, um spezielle Aminosäure-Reste zu modifizieren, z. B. zum Ändern oder Löschen der DNA, die für die Aminosäuren der aktiven Stellen kodiert, wird zum Transformieren des filamentösen Wirtspilzes zu einem, der unfähig ist, aktive Aspartat-Proteinase auszuscheiden, im allgemeinen ein Vektor verwendet, der einen mit der gewünschten Aspartat-Proteinase des filamentösen Pilzes homologen Abschnitt enthält, der jedoch eine Löschung im Aspartat-Proteinase-Gen aufweist. Lebensfähige Transformanten können durch Screenen auf einen auswählbaren Marker, der in den Vektor inkludiert ist, oder durch Screenen auf fehlende Proteinasenaktivität identifiziert werden.
a) Klonieren der Aspartat-Proteinase
Die gewünschte Aspartat-Proteinase wird zuerst gereinigt. Der gewünschte filamentöse Pilz wird in einem Kulturmedium gezüchtet. Die Zellen werden normalerweise mit geeigneten Mengen an Kohlenstoff-, Stickstoff- und Schwefel-Substraten (z. B. Glucose, NaNO₃ und MgSO₄) 3–5 d lang bei Temperaturen von etwa 28–37°C unter geeigneter Belüftung gezüchtet, um die Akkumulation der Aspartat-Proteinase zu ermöglichen. Die Mycelien werden anschließend durch Filtration oder Zentrifugation entfernt. Die verbleibende Kulturbrühe wird danach irgendeinem gewünschten Verfahren unterzogen, um die Proteinase von der Kulturbrühe zu trennen. Vorzugsweise werden mehrere Chromotografie-Schritte oder Affinitäts-Säulen verwendet, um eine Aspartat-Proteinase von vorzugsweise zumindest 95% Reinheit zu erhalten.
Die gereinigte Proteinase wird anschließend sequenziert. Ein bevorzugtes Verfahren ist das NH₂-terminale Sequenzieren. Andere Verfahren umfassen Sequenz-Analyse von Peptidfragmenten, die durch chemische oder enzymatische Spaltung der Aspartat-Proteinase erhalten werden. Die Aspartat-Proteinasen weisen eine Länge von etwa 328 Aminosäuren auf.
Die Sequenz der Proteinase wird danach verwendet, um eine Oligonukleotid-Sonde zu konstruieren. Diese Sonden-Konstruktion braucht nur mit etwa 6–20 Aminosäuren der reifen Proteinase übereinzustimmen. Es wurde aber entdeckt, daß Sonden für die ersten ungefähr 25 Aminosäuren (5–24 bei Aspergillopepsin) bevorzugt sind und die benötigte Zeit zum Konstruieren einer geeigneten Sonde wesentlich verringern. Der Grund dafür ist der, daß die veröffentlichte Aminosäuresequenz von Aspergillopepsin, falls überhaupt, wenige Bereiche von sechs oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren mit sehr geringer Kodon-Degeneration enthalten. Die Oligonukleotid-Sonde wird anschließend verwendet, um das Aspartat-Proteinase-Gen zu klonieren. Die genomische DNA des filamentösen Pilzes wird isoliert und mit geeigneten Restriktionsenzymen digeriert. Die Fragmente werden danach durch Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt, auf ein Filter geblottet und mit der aus der Aspartat-Proteinase-Sequenz hergestellten Oligonukleotid-Sonde nach irgendeinem Standardverfahren für eine derartige Behandlung sondiert. Ein dem DNA-Segment entsprechendes Fragment, das durch Hybridisierung an die Oligonukleotid-Sonde identifiziert wurde, wird isoliert. Das isolierte Fragment wird verwendet, um an einen geeigneten Vektor (z. B. pBR322) ligiert zu werden und anschließend einen Wirt, z. B. E. coli 294, zu transformieren, um DNA-Klone zu produzieren.
b) Lage des Kodierbereichs für Aspartat-Proteinase und Löschungsauswahl
Die Lage der 5'- und 3'-Enden der Aspartat-Proteinase kann anschließend mittels einer Reihe von Verfahren bestimmt werden. Beispielsweise wird die DNA Hybridisiereung mit Oligonukleotiden unterzogen, um die 5'- und 3'-Termini zu lokalisieren. Alternativ kann die DNA-Sequenz verwendet werden, um die Lage des Gens zu bestimmen. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, S. 5463–5467, 1977).
Nachdem die Lage des Gens einmal bestimmt wurde, wird ein Abschnitt des oder das gesamte Aspartat-Proteinase-Gen zur Löschung ausgewählt. Man entscheidet sich entweder für ein DNA-Segment, das für zumindest etwa 100 aufeinanderfolgende Aminosäuren kodiert, oder für 2 Kodone, die 2 der Aminosäuren entsprechen, die als die katalytischen Stellen gekennzeichnet sind, von denen es drei in der Aspartat-Proteinase gibt. Diese Stellen liegen bei oder nahe von Asp 32 oder Asp 215 (nach dem Schweinepepsin-Numerierungssystem) und stimmen in allen pepsinähnlichen Aspartat-Proteinasen aus eukaryotischen Quellen grob überein. Vorzugsweise wird das gesamte Gen gelöscht. Noch bevorzugter werden das gesamte Gen und zumindest etwa 200 Basenpaare an jeder Seite der Gensequenz gelöscht.
c) Löschen der ausgewählten Gensequenz und etwaiges Ersetzen durch einen selektierbaren Marker
Nachdem die Gensequenz für die Löschung einmal bestimmt ist, kann jedes geeignete Verfahren angewandt werden, um diese zu löschen. Es kann stellen-gerichtete Mutagenese verwendet werden, um einzelne Stellen zu mutieren (z. B. wo einzelne Löschungen von Aminosäuren der aktiven Stellen erfolgen), oder Entfernung des Gensegments unter Verwendung von Restriktionsenzymen. Nach erfolgter Löschung werden die übrigen 5'- und 3'-Enden verbunden oder die gelöschte Sequenz vorzugsweise durch eine inaktive Sequenz ersetzt (d. h. eine, die nicht für ein aktives Proteinasenenzym kodiert). Eine bevorzugte Ersatzsequenz enthält einen selektierbaren Marker, um die Identifizierung der späteren transformierten Mutanten zu ermöglichen. Geeignete Selektionsmarker umfassen argB, pyrG, trpC oder wirkstoff-beständige Marker, wie z. B. Hygromycin- oder Bleomycin-Resistenzgene. Falls kein selektierbarer Marker verwendet wird, ist es möglich, Transformanten-Kolonien genau auf Aktivität des gewünschten Proteinasenenzyms oder deren Fehlen zu screenen.
d) Transformation von filamentösen Pilzen, die Aspartat-Proteinase produzieren, mit mutiertem Gen
Die mutante Aspergillopepsin-Gensequenz wird anschließend in ein Wildtyp-Genom eingebaut. Ein bevorzugtes Verfahren ist homologe Rekombination, wobei ein lineares DNA-Fragment, das das mutante Aspergillopepsin-Gen umfaßt, das einen Selektionsmarker für filamentöse Pilze enthält (z. B. argB, pyrG), verwendet wird, um einen Wirtspilz mit einem geeigneten genetischen Hintergrund (z. B. argB- oder pyrG-Auxotrophe) zu transformieren. Durch selektiven Druck für den auf dem mutanten Aspergillopepsin-Gen enthaltenen Marker entstanden ungefähr 20% der erhaltenen Transformanten durch homologe Integration am Aspergillopepsin-Genlocus und produzierten eine genetische Löschung des Aspergillopepsin-(Aspartat-Proteinase)-Gens. Nach Transformation und Reinigung kann der geeignete Stamm durch nach dem Stand der Technik bekannte Verfahren transformiert werden, um heterologe Protein-Genprodukte, wie z. B. Chymosin, zu produzieren.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Es wurden unter Verwendung einer synthetischen Oligonukleotid-Sonde genomische DNA-Sequenzen kloniert, die für das Aspergillopepsin A aus Aspergillus awamori kodieren. Die Nukleotidsequenz des Gens zeigte, daß für das Aspergillopepsin vier Exone mit 320, 278, 248 und 308 bp kodieren. Drei Introne, die die Kodiersequenz unterbrechen, sind 50, 52 und 59 bp lang. Direkt stromabwärts des vermutlichen Startkodons liegt eine Sequenz, die für 69 Aminosäuren kodiert, die im reifen Aspergillopepsin-Protein nicht vorhanden sind. Auf der Basis von Ähnlichkeiten zu anderen Aspartat-Proteinasen kann dieser Bereich ein 20-Aminosäuren-Signalpeptid, gefolgt von einem 49-Aminosäuren-Propeptid darstellen, das reich an basischen Resten ist. Northern-Blots der gesamten aus A. awamori-Zellen extrahierten Zell-RNA zeigen, daß das Aspergillopepsin-Gen als einzelne 1,4 kb-mRNA transkribiert wird. Mutanten von A. awamori, denen das Aspergillopepsin A-Strukturgen fehlt, wurden durch die folgende Genersetzungs-Strategie erhalten: Zuerst wurde ein Plasmid konstruiert, worin ein 2,4 kb-SalI-Fragment, das den gesamten Aspergillopepsin-Kodierbereich enthielt, aus einem genomischen 9 kb-EcoRI-DNA-Klon gelöscht und durch einen synthetischen DNA-Polylinker ersetzt wurde. Zweitens wurde ein selektierbares argB-Gen in den Polylinker eingefügt. Drittens wurde das EcoRI-Fragment, das das gelöschte Aspergillopepsin-Gen und den argB-Marker enthielt, aus dem Plasmid herausgeschnitten und verwendet, um ein argB-Auxotroph von A. awamori zu transformieren. 16–40% der resultierenden prototrophen Transformanten zeigten beim Screenen mittels eines Immunoassays unter Verwendung von für Aspergillopepsin spezifischen Antikörpern einen aspergillopepsin-defizienten Phenotyp. Hybridisierungs-Versuche nach Southern bestätigten, daß diese Mutanten aus Genersetzung am Aspergillopepsin-Genlocus resultierten.
BEISPIELE
(a) Pilzstämme
Aspergillus awamori UVK143f, ein Mutant mit Glucoamylase-Überproduktion des Stammes NRRL 3112, wurde als Quelle von genomischer DNA für Klonierversuche verwendet. Zum Isolieren von aspergillopepsin-defizienten Mutanten wurde A. awamori-Stamm GC12 (argB3, pyrG5) verwendet. A. awamori-Stamm GC12 wurde von Stamm UVK143f durch parasexuelle Kreuzung der folgenden beiden auxotrophen Mutanten erhalten: A. awamori GC5 (PyrG5), der ein Uridin benötigendes Auxotroph ist, das durch Selektion mittels 5-Fluororotsäure (Mol. Gen. Gent., 206, S. 71–75, 1987), gefolgt von Mutagenese von UVK143f mit UV-Licht isoliert wurde (diesem Mutanten fehlt Orotidin-5'-monophosphat-Decarboxylase); A. awamori GC3 (argB3), das ein Arginin benötigendes Auxotroph ist, das durch Filtrationsanreicherung (Gene, 37, S. 207–214, 1985), gefolgt von Nitrosoguanidin-Mutagenese von UVK143f isoliert wurde (diesem Mutanten fehlt besonders Ornithin-Carbamoyltransferase).
(b) Bakterienstämme, Kloniervektoren und Plasmide
Escherichia coli 294 (ATCC 31446) wurde zur Konstruktion von DNA-Sammlungen und zur normalen Plasmidvermehrung verwendet. E. coli JM101 (Nucl. Acids Res., 9, S. 309–321, 1981) wurde als Wirt für die Bakteriophagen-M13-Sequenziervektoren mp18, mp19, (Gene, 33, S. 103–119, 1985), um30 und um31 (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT) verwendet. Die Plasmide pBR322 (Gene, 2, S. 95–113, 1977) und pUC4K (J. Vieira und J. Messing, Gene, 19, S. 259–268, 1982) wurden bereits früher beschrieben. Das Plasmid pUC4K-argB besteht aus einem 1,7 kb-Segment von genomischer A. nidulans-DNA, die für das Ornithin-Carbamoyltransferase-(argB)-Gen kodiert, eingefügt in den Kloniervektor pUC4K. Das argB-Gensegment umfaßte ein 1714 bp-StuI-Restriktionsfragment, das aus Plasmid pBB116 herausgeschnitten (Gene, 25, S. 109–117, 1983) und in SmaI-gespaltenen und dephosphorylierten pUC4K ligiert wurde.
(c) Reinigung von Aspergillopepsin und Aminosäure-Sequenzierung
Zur Produktion von Aspergillopepsin wurde A. awamori UVK143f in einem 4 l Kulturkolben vermehrt, der 1 l des folgenden Kulturmediums enthielt: 6% Sojabohnen-Mehl, 1,2% Sojaöl und 0,6% MgSO₄. Das Medium wurde auf pH = 4,5 mit Natriumphosphat gepuffert. Mazu DF60-P (Mazur Chemicals, Inc., Gurnee, IL) wurde als Antischaummittel verwendet. Die Zellen wurden 4 d lang bei 37°C unter heftiger Belüftung vermehrt. Die Mycelien wurden mittels Filtration durch Miracloth (Cal-Biochem, LaJolla, CA) entfernt und das erhaltene Filtrat auf einer 4,8 l GFO5-Säule (Reactifs IBF, Villeneuve la Garenne, France), die mit 50 mM Natriumacetat, pH = 5,0, äquilibriert worden war, entsalzt. Das Material wurde anschließend auf DEAE-Trisacryl (Reactifs IBF) in 50 mM Natriumacetat, pH = 5,0, chromatografiert. Das Aspergillopepsin wurde mit 250 mM NaCl bei einem linearen Gradienten von 0–500 mM NaCl in demselben Puffer eluiert. Der Aspergillopepsin-Aktivitätspeak (bestimmt durch Gerinnungsaktivität in Magermilch-Agarose) wurde gepoolt und in 50 mM Natriumacetat bei pH = 4,5 auf eine Gramicidin-S-Affinitätssäule aufgebracht (Bioorg. Khim., 3, S. 831–835, 1977). Das Enzym wurde anschließend mit 1 M NaCl und 10% Isopropanol in demselben Puffer eluiert und unmittelbar danach durch Chromatografie auf einer GFO5-Säule, äquilibriert in 50 mM Natriumacetat bei pH = 5,0, entsalzt. An diesem Punkt wurde das Aspergillopepsin auf der Basis von silbergefärbten SDS-PAGE-Gelen als 90–95% homogen bewertet. Das Enzym wurde bei –70°C gelagert. Vor weiterer Analyse wurde das Aspergillopepsin-Präparat auf einer FPLC-Mono-Q-Säule (Pharmacia) in 50 mM Natriumacetat, pH = 5,0, unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0–500 mM NaCl chromatografiert.
Ein aliquoter Anteil von Aspergillopepsin wurde in Gegenwart von 0,1 mM Pepstatin hitzedenaturiert. Das Protein wurde mit 10% TCA gefällt und bei 7.000 g 10 min lang bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde einmal mit Aceton gewaschen und in 8 M Harnstoff, 50 mM Tris-HCl, pH = 8,0, solubilisiert. Dithiothreitol wurde bis zu 4 mM zugegeben und das Gemisch 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Jodessigsäure (2 M in 1 M Tris-Base) wurde bis zu 13 mM zugegeben und das Gemisch 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Dithiothreitol-Konzentration wurde auf 8 mM erhöht und das Gemisch weitere 10 min lang inkubiert. Das Protein wurde wie zuvor mit TCA gefällt und das erhaltene Pellet in 8 mM Harnstoff, 50 mM Tris-TFA, pH = 8,0, gelöst. Die Proteinlösung wurde bis zum weiteren Gebrauch bei –70°C gelagert.
Eine 2,5 nMol-Probe des reduzierten und carboxymethylierten Aspergillopepsin-Präparats wurde NH₂-terminaler Sequenzierung auf einem Multiphasen-Proteinsequenzierer (Dr. William Kohr, Genentech, Inc., South San Francisco, CA) unterzogen.
Zu einem weiteren aliquoten Anteil von Aspergillopepsin wurde Trypsin mit 1% des Gesamtproteins zugegeben und das Gemisch bei 37°C 1 h lang inkubiert. Es wurde das gleiche Volumen an HPLC-Lösung A (0,05% TEA, 0,05% TFA in Wasser) zugegeben, um das Trypsin zu stoppen. Die erhaltenen Fragmente wurden mittels Chromatografie auf einer Browlee-C-2-Säule unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0–100% HPLC-Lösung B (0,05% TEA, 0,05% TFA in n-Propanol) mit einer Rate von 1% pro Minute getrennt. Es wurden drei Peaks zum Aminosäure-Sequenzieren, wie zuvor beschrieben, gesammelt.
(d) Oligonukleotid-Sonden
Die Aspergillopepsin A-Aminosäuresequenz
Ala-Val-Thr-Thr-Pro-Gln-Asn-Asn-Asp-Glu-Glu-Tyr-Leu-Thr-Pro-Val-Thr-Val-Gly-Lys, die den Resten 5–24 des reifen Enzyms entspricht, wurde verwendet, um die folgende synthetische Oligonukleotid-Sonde mit 59 bp zu Klonierversuchen zu konstruieren:
5' dGCTGTGACCACCCCCCAGAACAACGACGAGGAGTACCTGACCCCCGTGACCGTGGGCAA 3'
Die Nukleotid-Zusammensetzung für diese Sonde basierte auf dem Kodon-Bias, der für das A. awamori-Glucoamylase-Gen existiert (J. H. Nunberg, J. H. Meade, G. Cole, F. C. Lawyer, P. McCabe, V. Schweickart, R. Tal, V. P. Whitman, J. E. Flatgaard und M. A. Innis, Mol. Cell. Biol., 4, S. 2306–2315, 1984). Die Sonde wurde nach dem Triester-Verfahren synthetisiert, beschrieben von Crea et al. (R. Crea, A. Krasyewski, T. Hirose und K. Itakura: "Chemical synthesis of genes for human insulin", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, S. 5765–5769, 1978).
(e) Isolierung und Analyse von Nukleinsäuren
A. awamori-DNA und -RNA wurden wie zuvor beschrieben isoliert (Cell, 26, S. 29–37, 1981). Genomische DNA wurde mit einem geeigneten Restriktionsenzym digeriert, auf 1% Agarosegelen fraktioniert und auf Nytran-Membranen (Schleicher & Schuell, Keene, NH) geblottet. Die Membranen wurden auf die Gegenwart von Aspergillopepsin-Gensequenzen nach jedem von zwei Verfahren sondiert. Falls das zuvor beschriebene synthetische Oligonukleotid als Sonde verwendet wurde, wurden die folgenden Hybridisierungs-Bedingungen verwendet: Die Membranen wurden 1 h lang bei 42°C in der von J. P. Adelman, J. S. Hayfick, M. Vasser und P. H. Seeburg (DNA, 2, S. 183–193, 1983) beschriebenen Hybridisierungs-Lösung inkubiert. Als nächstes wurde das Oligonukleotid, das mit γ-[³²P]ATP (Amersham, Arlington Heights, IL) und T4-Polynukleotid-Kinase (New England Biolabs, Beverly, MA) radioaktiv markiert worden war, mit einer Aktivität von ungefähr 1 × 10⁶ cpm/ml zugegeben. Die Membranen wurden anschließend bei 42°C über Nacht unter mäßigem Rühren inkubiert. Die Membranen wurden bei 45°C 20 min lang in 0,5 × SSPE mit 0,1% SDS gewaschen (T. Maniatis, E. F. Fritsh und J. Sambrook: "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982), gefolgt von 30 min Waschen in 0,5 × SSPE ohne SDS. Zuletzt wurden die Membranen getrocknet, mit Kunststoff-Folie bedeckt und bei –70°C Röntgenfilm ausgesetzt (Kodak X-Omat). Unter Verwendung von nick-translatierten (T. Maniatis, E. F. Fritsh und J. Sambrook: "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982) Restriktionsfragmenten als Sonden wurden die von R. W. Davis, D. Botstein und J. R. Roth ("Advanced Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1980) beschriebenen Hybridisierungs- und Wasch-Bedingungen verwendet.
Die gesamte DNA aus A. awamori-Zellen wurde durch Formaldehyd-Agarosegel-Elektrophorese (L. G. Davis, M. D. Dibner und J. F. Battey: "Basic Methods in Molecular Biology", Elsevier, New York, 1986) fraktioniert und auf Nytran-Membran in 20 × SSPE geblottet. Die Hybridisierungs- und Wasch-Bedingungen waren dieselben, wie zuvor für DNA-Xybridisierungen beschrieben.
(f) Klonieren des Aspergillopepsin-Gens
Blotting-Analyse nach Southern von genomischer A. awamori-DNA ergab, daß die zuvor beschriebene synthetische Oligonukleotid-Sonde an ein einzelnes 9 kb-EcoRI-Fragment hybridisierte (1). Daher wurde die DNA hinsichtlich dieses Fragments angereichert, indem genomische Fraktionen, die 6,5–9,5 kb-EcoRI-Fragmente enthielten, unter Anwendung von präparativer Agarosegel-Elektrophorese isoliert wurden (T. Maniatis, E. F. Fritsh und J. Sambrook: "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982). Die DNA aus diesen Fraktionen wurde aus Gelschnitten elektroeluiert (T. Maniatis, E. F. Fritsh und J. Sambrook: "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982) und an EcoRI-gespaltenen und dephosphorylierten pBR322 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde für Transformationen von E. coli 294 verwendet und die Transformanten nach den von R. W. Davis, D. Botstein und J. R. Roth ("Advanced Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1980) beschriebenen Kolonie-Hybridisierungsverfahren auf die Gegenwart von Aspergillopepsin A-Sequenzen gescreent. Die Filter wurden mit radioaktiv markierten Oligonukleotid-Sonden unter den zuvor beschriebenen Hybridisierungs- und Wasch-Bedingungen inkubiert.
(g) Charakterisierung von Aspergillopepsin-Klonen
Restriktionskartierung von Aspergillopepsin-Klonen erfolgte wie zuvor beschrieben (T. Maniatis, E. F. Fritsh und J. Sambrook: "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982). Alle verwendeten Restriktionsenzyme wurden von Boehringer Mannheim Biochemicals (Indianapolis, IN), New England Biolabs (Beverly, MA) und Bethesda Research Laboratories (Gaithersburg, MD) geliefert und gemäß den Angaben des Herstellers eingesetzt.
Die DNA-Sequenzanalyse erfolgte nach dem Dideoxy-Kettenterminations-Verfahren (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, S. 5463–5467, 1977).
(h) Konstruktion des Genersetzungs-Vektors
Die Konstruktion des Aspergillopepsin-Genersetzungs-Vektors pUC4ΔAP-argB ist in 2 dargestellt. Kurz gesagt, wurde das 9 kb-EcoRI-Fragment, das das genomische Aspergillopepsin-Gensegment enthielt, zuerst in pUC4K subkloniert. Als nächstes wurde ein 2,4 kb-SalI-Fragment, das das gesamte Aspergillopepsin-Gen enthielt, herausgeschnitten und durch den folgenden 36 bp-Linker ersetzt:
5' TCGACGGATCCCTCGAGTCTAGAGCATGCCCCGGGG 3'
3' GCCTCGGGAGCTCAGATCTCGTACGGGGCCCCCAGCT 5'
Dieser Linker enthält einzige Restriktionsstellen für BamHI, XhoI, XbaI, SphI und SmaI. In die BamHI-Stelle dieses Linkers wurde ein selektierbares argB-Gen aus A. nidulans eingefügt. Das erhaltene Plasmid, genannt pUC4ΔAP-argB, wurde mit EcoRI gespalten und das lineare Fragmentgemisch verwendet, um ein Arginin benötigendes Auxotroph von A. awamori zu transformieren.
(i) Transformations-Vorgangsweise
Konidien des A. awamori-Stamms GC12 wurden durch Inkubation in YEG-Medium (0,5% Hefe-Extrakt, 2% Glucose), ergänzt mit 100 mg/ml Uridin, 100 mg/ml Arginin und 50 μg/ml Streptomycin, zum Keimen gebracht. Es wurden gemäß Bio/Technol., 5, S. 369–376, 1987, Protoplasten isoliert, zweimal durch Zentrifugation und erneute Suspension in 0,7 M KCl und einmal in Elektroporations-Puffer (7 mM Natriumphosphat-Puffer, pH = 7,2, 1 mM MgSO₄, 1,2 M Sorbit) gewaschen. Aliquote von 2 × 10⁷ Protoplasten wurden schließlich erneut in 0,8 ml Elektroporations-Puffer in Gen-Pulser-Küvetten (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) suspendiert und 10 min auf Eis gehalten. Kurz vor der Abgabe des Stromstoßes wurde DNA in weniger als oder in genau 20 μl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH = 7,4, 1 mM EDTA) zugegeben. Die Elektroporation erfolgte unter Verwendung einer Bio-Rad Gen-Pulser-Vorrichtung gemäß den Angaben des Herstellers. Es wurde unter Verwendung eines 25 μF-Kondensators ein einzelner Impuls von 2125 V/cm abgegeben. Nach 10 min Inkubation auf Eis wurden die Protoplasten geschmolzenem Aspergillus-Minimalmedium (Mol. Gen. Genet., 154, S. 311–318, 1973) mit 2% Agar, 100 mg/ml Uridin, 50 μg/ml Streptomycin und 1,2 M Sorbit zugegeben und auf feste Platten aus demselben Medium gegossen. Die Transformanten erschienen als Kolonien an der Oberfläche des Mediums nach ungefähr 5 d Inkubation bei 37°C. Es wurden Sporen aus einzelnen Kolonien auf Platten aus frischem Medium transferiert.
(j) Analyse der aspergillopepsin-defizienten Mutanten
Sporen aus einzelnen Transformanten wurden in 1,2 ml SCM (Aspergillus-Minimalmedium mit 2% Malzextrakt, 0,5% Hefeextrakt, 0,1% Bacto-Pepton, 100 mg/ml Uridin, 100 mg/ml Arginin und 50 μg/ml Streptomycin) eingeimpft und in den Näpfen von Mikrotiterplatten mit 24 Näpfen 4 d lang kultiviert. Medien-Proben wurden unter Verwendung eines Enzym-Immunoassays (ELISA) (Methods Enzymol., 70, S. 419–439, 1980) auf der Basis von Hasen-Anti-Aspergillopepsin-Antikörpern auf Aspergillopepsin getestet. Die Absorption bei 490 nm wurde nach Entwickeln der Farbreaktion durch meerrettich-peroxidase-konjugierte Ziegen-Anti-Hasen-Antikörper aufgezeichnet und zu Vergleichszwecken verwendet. Die absolute Menge an Aspergillopepsin wurde nicht bestimmt.
Um Proteinase-Aktivität in Kulturfiltraten nachzuweisen, wurden Stämme 3 d lang in 50 ml flüssigem SCM vermehrt. Filtrate wurden auf einer Sephadex-G-25-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden), mit 0,5 M Natriumacetat, pH = 5,5, äquilibriert, entsalzt. Aliquote (3 μl) wurden auf verfestigte 1%-ige Agarose, die 0,2 M Natriumacetat, pH = 5,3, und 1% Magermilch enthielt, aufgebracht. Falls nötig, wurden die Proben durch Zugabe der folgenden Reagentien und Inkubieren über 1 h bei Raumtemperatur vorbehandelt: Pepstatin mit einer Endkonzentration von 1 mM aus einer Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO); PMSF mit einer Konzentration von 10 mM aus einer Stammlösung in Ethanol; EDTA, pH = 5,5, mit einer Endkonzentration von 50 mM. Die Behandlung der Proben mit DAN (J. Biol. Chem., 241, S. 4295–4297, 1986) erforderte anfängliche Behandlung mit CuSO₄ mit 10 mM während 1 h, gefolgt von Zugabe von 12 mM DAN aus einer Stammlösung in Ethanol über 1 h bei Raumtemperatur.
ERGEBNISSE
(a) Isolierung des Aspergillopepsin A-Gens
Obwohl die Primärstruktur von Aspergillopepsin A aus A. awamori bereits veröffentlicht wurde (Bioorg. Khim., 8, S. 1030–1047, 1986), gibt es mehrere Reste des Proteins, die einer Aufklärung bedürfen. Daher wurde das Enzym aus den Kulturfiltraten gereinigt und die NH₂-terminale Sequenz und die Aminosäuresequenz von drei tryptischen Peptiden bestimmt (Tabelle 1). Alle dieser Daten stimmen mit jenen von Ostoslavskaya et al. (Bioorg. Khim., 8, S. 1030–1047, 1986) gut überein. Um die DNA-Sequenzen, die für Aspergillopepsin A kodieren, zu klonieren, wurde die Anwendung eines einzelnen langen Oligonukleotids ausgewählt und die Kodone gemäß der bei einem anderen A. awamori-Gen (Glucoamylase) beobachteten Anwendung ausgewählt. Folglich wurde ein 59 bp-Oligonukleotid synthetisiert, das den Aminosäureresten 5–24 des reifen Aspergillopepsins entspricht. Dieses Oligonukleotid wurde radioaktiv markiert und verwendet, um genomische A. awamori-DNA auf die Gegenwart von Aspergillopepsin-Gensequenzen zu sondieren. Die in 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die 59 bp-Sonde bei jedem von verschiedenen Restriktionsenzym-Digesten von genomischer A. awamori-DNA an ein einzelnes Fragment hybridisierte. Die Größe des Aspergillopepsin-Gens wurde auf ungefähr 1,2 kb geschätzt, basierend auf dem reifen Polypeptid mit 328 Aminosäuren und unter der Annahme eines Signalpeptids/propeptids von ungefähr 60–70 Aminosäuren, wie beim entsprechenden Mucor miehei-Gen zu sehen (Gene, 48, S. 41–53, 1986). Deshalb wurde überlegt, daß das 9 kb-EcoRI-Fragment mit hoher Wahrscheinlichkeit das gesamte Aspergillopepsin A-Gen enthalten könnte.
Es wurde genomische DNA mit EcoRI digeriert und die 6,5–9,5 kb-Fragmente durch präparative Agarosegel-Elektrophorese isoliert. Diese Fragmente wurden anschließend an EcoRI-gespaltenen und dephosphorylierten pBR322 ligiert, und das Ligationsgemisch wurde verwendet, um kompetente E. coli 294-Zellen zu transformieren. Die erhaltenen Transformanten-Kolonien wurden auf die Gegenwart von Aspergillopepsin-DNA-Sequenzen durch Kolonie-Hybridisierung sondiert. Mehrere Kolonien, die starke Hybridisierungssignale zeigten, wurden für weitere Analysen ausgewählt. Wie sich zeigte, enthielten alle diese Isolate pBR322-Derivate mit einer identischen 9 kb-EcoRI-Einfügung. Eine partielle Restriktionskarte eines dieser Klone ist in 2 dargestellt. Anschließende Kartierungs- und Hybridisierungs-Versuche unter Verwendung der 59 bp-Oligonukleotid-Sonde lokalisierte das Aspergillopepsin-Gen an einem 2,4 kb-SalI-Segment, das in dem 9 kb-EcoRI-Fragment enthalten ist. Eine Restriktionskarte dieses 2,4 kb-SalI-Fragments ist auch in 2 dargestellt.
(b) Struktur des Aspergillopepsin A-Gens
Die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Aspergillopepsin A-Gens aus A. awamori ist in 3 dargestellt. Der Kodierbereich besteht aus 1342 bp, einschließlich dreier kleiner Introne mit 50, 52 und 59 bp. Diese Introne wurden auf der Basis der veröffentlichten Aminosäuresequenz für Aspergillopepsin A zugeordnet (Bioorg. Khim., 8, S. 1030–1047, 1986) und aufgrund der folgenden Merkmale, die in den intervenierenden Sequenzen von filamentösen Pilzen übereinstimmend gefunden werden (S. J. Gurr, S. E. Unkles und J. R. Kinghorn in "Gene Structure in Eukaryotic Microbes", J. R. Kinghorn, Hrsg., IRL Press, Oxford, S. 93–139, 1987): Zuerst, wie im A. awamori-Glucoamylase-Gen beobachtet (Mol. Cell. Biol., 4, S. 2306–2315, 1984), beginnen alle diese Introne mit der Sequenz GTA/G und enden mit C/TAG. Zweitens liegt innerhalb jedes Introns eine PuCTPuAC-Konsens-Sequenz, von der angenommen wird, daß sie für das Intron-Spleißen notwendig sind (S. J. Gurr, S. E. Unkles und J. R. Kinghorn in "Gene Structure in Eukaryotic Microbes", J. R. Kinghorn, Hrsg., IRL Press, Oxford, S. 93–139, 1987). Interessanterweise enthält das dritte Intron des Aspergillopepsin-Gens einen gemeinsamen Bereich perfekter Homologie mit der inneren TACTAAC-Konsens-Sequenz von Saccharomyces cerevisiae-Intronen (S. J. Gurr, S. E. Unkles und J. R. Kinghorn in "Gene Structure in Eukaryotic Microbes", J. R. Kinghorn, Hrsg., IRL Press, Oxford, S. 93–139, 1987).
Der untranslatierte 5'-Bereich des Aspergillopepsin-Gens zeigt verschiedene Kennzeichen, die für einen niedrigen eukaryotischen Promotor typisch sind. Beispielsweise zeigte sich der Beginn der Sequenz TATAA bei Position –123, relativ zum Startkodon. Es gibt eine Anzahl von stark exprimieten Genen in filamentösen Pilzen, bei denen die Transkription am zweiten A-Rest in der Sequenz C/GAAC/G beginnt (EMBO J., 3, S. 1581–1585, 1984; S. J. Gurr, S. E. Unkles und J. R. Kinghorn in "Gene Structure in Eukaryotic Microbes", J. R. Kinghorn, Hrsg., IRL Press, Oxford, S. 93–139, 1987). Die Autoren der vorliegenden Erfindung fanden drei derartige Sequenzen im untranslatierten 5'-Bereich des Aspergillopepsin A-Gens, beginnend an den Positionen –83, –65 und –32, vor dem Startkodon. Interessanterweise werden diese Elemente an beiden Seiten von einem pyrimidin-reichen CT-Motiv flankiert. Die Transkriptionseinleitungsstellen für eine Reihe von filamentösen Pilz-Genen treten in den oder unmittelbar stromabwärts von derartigen CT-Boxen auf (S. J. Gurr, S. E. Unkles und J. R. Kinghorn in "Gene Structure in Eukaryotic Microbes", J. R. Kinghorn, Hrsg., IRL Press, Oxford, S. 93–139, 1987).
Die Translation der meisten Pilzgene beginnt am ersten ATG, und es gibt üblicherweise eine Übereinstimmung der DNA um das Startkodon herum. Dieser Konsensbereich schließt die –3-Position (relativ zum Startkodon) ein, die meistens (83%) ein A-Rest ist (S. J. Gurr, S. E. Unkles und J. R. Kinghorn in "Gene Structure in Eukaryotic Microbes", J. R. Kinghorn, Hrsg., IRL Press, Oxford, S. 93–139, 1987). Die –3-Position stromaufwärts vom vermutlichen Startkodon für Aspergillopepsin ist ebenso A.
Die Konsenssequenz AAUAAA ist vermutlich an der Polyadenylierung des 3'-Terminus von eukaryotischer mRNA beteiligt. Obwohl diese Sequenz kein notwendiges Merkmal ist, tritt doch eine gute Annäherung an das AAUAAA-Motiv in den 3'-flankierenden Bereichen von verschiedenen Pilzgenen auf (S. J. Gurr, S. E. Unkles und J. R. Kinghorn in "Gene Structure in Eukaryotic Microbes", J. R. Kinghorn, Hrsg., IRL Press, Oxford, S. 93–139, 1987). Unter diesem Gesichtspunkt ist die 48 bp stromabwärts vom Stopkodon für Aspergillopepsin gefundene Sequenz ATGAA eine gute Annäherung und kann ein mögliches Polyadenylierungssignal darstellen. Eine ähnliche Abkürzung (AUAA) des Polyadenylierungskonsenssignals ist 36 bp stromaufwärts von der Poly-A-Additionsstelle von A. awamori-Glucoamylase-mRNA zu finden (Mol. Cell. Biol., 4, S. 2306–2315, 1984). Interessanterweise ist auch ein konserviertes Hexanukleotid, GAAAUG, 11 bp stromabwärts vom vermutlichen Aspergillopepsin-Polyadenylierungssignal zu sehen. Die tatsächliche Stelle für Poly-A-Addition bei A. awamori-Glucoamylase-mRNA liegt innerhalb der Sequenz GUAAU, die 26 bp stromabwärts vom Hexanukleotid GAAAUG liegt (Mol. Cell. Biol., 4, S. 2306–2315, 1984). Eine ähnliche Sequenz, GUGAU, ist in der Aspergillopepsin-Sequenz 20 bp stromabwärts vom Hexanukleotid GAAAUG zu finden und kann eine mögliche Polyadenylierungs-Stelle darstellen.
Beim Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz mit den Daten aus der NH₂-terminalen Sequenzierung von Aspergillopepsin A wurde ein offener Leserahmen beobachtet, der für 60 Aminosäurereste kodiert, die im reifen Aspergillopepsin nicht vorhanden waren. Auf der Basis eines Vergleichs mit anderen Aspartat-Proteinasen wird angenommen, daß die ersten 20 Reste ein Signalepeptid für die Sekretion umfassen und die übrigen 49 Reste einen Propeptid-Bereich darstellen, der reich an basischen Aminosäuren ist, wie z. B. Lys und Arg (B. Foltmann und V. B. Pederson in "Acid Proteases: Structure, Function and Biology", J. Tang, Hrsg., Plenum, New York, S. 3–22, 1977; Nucl. Acids Res., 10, S. 2177–2187, 1982; Gene, 48, S. 41–53, 1986; J. Biol. Chem., 263, S. 1382–1385, 1988). Das Signalpeptid enthält einen positiv geladenen Lys-Rest nahe dem NH₂-terminalen Met, gefolgt von 11 aufeinanderfolgenden hydrophoben Resten vor einer potentiellen Spaltstelle Val-Ser-Ala (als Überblick über Signalpeptid-Spaltstellen, siehe D. Perlman und H. O. Halvorson, J. Mol. Biol., 167, S. 391–409, 1983). Die abgeleitete und die direkt bestimmte (Bioorg. Khim., 8, S. 1030–1047, 1986) Primärsequenz für den reifen Bereich von Aspergillopepsin unterscheiden sich an den folgenden Positionen: (1) Gln statt Arg bei +51; (2) Asp-Leu statt Asn-Val bei +55–56; (3) Asp statt Asn bei +72, 77, 149 und 196; (4) Thr-Asn statt Asn-Thr bei +97–98; (5) Gln statt Glu bei +100, 188 und 316; (6) Glu statt Gln bei +103; (7) Asp-Asp statt Asx-Asx bei +171–172; (8) Asn-Pro statt Ser-Thr bei +194–195; (9) fünf Ser statt vier bei +204–208; (10) die Reste +113–126 sollten lauten Val-Gln-Asn-Thr-Ala-Asn-Asp-Gly-Leu-Leu-Gly-Leu-Ala-Phe; (11) Ser-Ala-Tyr-Tyr-Glu-Gln statt Leu-Asn-Gly-Ser-Gly bei +229–234; (12) Ala-Ser-Gly-Glu-Thr-Glu statt Gln-Asn-Gln-Glu-Ala-Asp bei +238–243; (13) Ser statt Asx bei +250; (14) Asn statt Thr bei +254; (15) Val-Val statt Gly-X bei +260–261; (16) Val statt Gly bei +269; (17) Einfügung von Gly zwischen Pro-Lys bei +271; (18) Einfügung von Ile zwischen Pro-Ser bei +279; (19) kein Asx nach Ser bei +280; (20) Gly statt Pro bei +282; (21) zwei Ser statt einem bei +284–285; (22) Asn statt Asp bei +314.
Der vom Aspergillopepsin A-Gen gezeigte Kodon-Bias (Tabelle 2) ist ähnlich zu jenem für das A. awamori-Glucoamylase-Gen beobachteten (Mol. Cell. Biol., 4, S. 2306–2315, 1984). Wie bei den stark exprimierten Genen von A. nidulans und Neurospora crassa zu sehen ist, gilt eine Reihe von Verallgemeinerungen (S. J. Gurr, S. E. Unkles und J. R. Kinghorn in "Gene Structure in Eukaryotic Microbes", J. R. Kinghorn, Hrsg., IRL Press, Oxford, S. 93–139, 1987) für das übliche Kodon-Muster von Aspergillopepsin. Zuerst gibt es eine bemerkenswerte Präferenz (71,8%) für Kodone, die ein Pyrimidin an der dritten Position verwenden. Falls Purine an der dritten Position verwendet werden, wird G gegenüber A bevorzugt, mit Ausnahme der Gly-Kodone, worin GGA gegenüber GGG bevorzugt wird. Dieselbe Ausnahme ist im A. awamori-Glucoamylase-Gen zu beobachten (Mol. Cell. Biol., 4, S. 2306–2315, 1984). Zuletzt werden die Kodone AGU und AGC für Ser selten verwendet.
Basierend auf der abgeleiteten Aminosäuresequenz weist Aspergillopepsin A 62% Homologie zu Penicillopepsin, 56% zu Endothiapepsin, 37% zu Rhizopuspepsin und 29% zu Mucor-Aspartat-Proteinase auf. Zusätzlich weist es begrenzte Homologie zu Säugetier-Aspartat-Proteinasen, Schweinepepsin (32%) und Rinderchymosin (28%) auf.
(c) Isolierung und Charakterisierung von aspergillopepsin-defizienten Mutanten
Um A. awamori-Stämme zu erzeugen, die bezüglich der Produktion von Aspergillopepsin spezifisch defizient sind, wurde eine Genersetzungs-Strategie angewandt, die ähnlich zu jener in (Mol. Cell. Biol., 5, S. 1714–1721, 1985) beschriebenen war. Zuerst wurde ein Genersetzungs-Vektor, genannt pUC4ΔAP-argB, wie in 4 dargestellt, konstruiert. Plasmid pUC4ΔAP-argB enthält ein selektierbares argB-Gen aus A. nidulans, das in den genomischen 9 kb-DNA-Klon anstelle des Aspergillopepsin-Kodierbereichs eingefügt ist. Dieser Vektor wurde durch Digestion mit EcoRI linearisiert und verwendet, um ein argB-Auxotroph von A. awamori zu transformieren.
Es wurden 24 Transformanten auf einen aspergillopepsin-defizienten Phenotyp mittels ELISA gescreent, und 10 dieser Transformanten ergaben vergleichsweise niedrige Werte. Vier der Transformanten (ΔAP3, ΔAP4, ΔAP5 und ΔAP6 genannt), die die niedrigsten Absorptionswerte im Screening-Assay zeigten, wurden für weitere Untersuchungen ausgewählt. Die ELISA-Werte für Stämme, die mangelhafte Aspergillopepsin-Synthese aufwiesen, fielen wegen nichtspezifischer Kreuzreaktion zwischen den Antikörpern und Komponenten der Kulturüberstände nicht auf Null ab. Diese Kreuzreaktivität konnte durch Western-Blotanalyse unter Verwendung derselben Anti-Aspergillopepsin-Antikörper sichtbar gemacht werden. Wegen dieser Kreuzreaktion wurden keine absoluten Werte für die Konzentration von Aspergillopepsin in Kulturproben erhalten.
Um zu untersuchen, ob der augenscheinlich aspergillopepsin-defiziente Phenotyp das Ergebnis einer Genspaltung war, wurde die gesamte Zell-DNA aus den Transformanten ΔAP3, ΔAP4, ΔAP5 und ΔAP6 und Stamm GC12 extrahiert, mit SalI digeriert und durch Agarosegel-Elektrophorese fraktioniert. Nach Blotten auf Nytran-Membranfilter wurde die DNA mit einer radioaktiv markierten Sonde, bestehend aus dem 9 kb-EcoRI-Fragment von A. awamori-DNA, das das Aspergillopepsin A-Gen enthielt, hybridisiert. Diese Sonde hybridisierte an drei SalI-Fragmente in der DNA aus Stamm GC12 (5, Spalte A). Diese Hybridisierungs-Signale stellen das 2,4 kb-Fragment dar, das das Aspergillopepsin-Gen und zwei flankierende DNA-Fragmente enthält. Falls jedoch das 2,4 kb-SalI-Fragment im Genom eines gegebenen Transformanten durch das 1,7 kb-Fragment von A. nidulans-DNA ersetzt wurde, das das argB-Gen enthielt, wurde erwartet, daß die Sonde nur an die beiden flankierenden DNA-Fragmente hybridisiert. Aus den in 5 (Spalte B) dargestellten Daten ist ersichtlich, daß das 2,4 kb-SalI-Fragment des Aspergillopepsin-Gens in allen vier durch ELISA identifizierten Transformanten fehlte, was zeigt, daß das Aspergillopepsin-Gen durch das argB-Gen ersetzt worden war. Es ist wahrscheinlich, daß manche oder alle anderen Transformanten, die bei ELISA niedrige Absorptionswerte ergaben, demselben Genersetzungs-Vorgang unterzogen worden waren. Die Häufigkeit der Genersetzung unter den Transformanten beträgt daher zumindest 16% und könnte sogar 40% betragen.
Aus Transformant ΔAP6 und Stamm UVK143f isolierte RNA wurde durch Elektrophorese aufgetrennt und durch Northern-Blotting analysiert. Die Hybridisierung erfolgte mit einem radioaktiv markierten 9 kb-EcoRI-Fragment von A. awamori-DNA, das das Aspergillopepsin-Gen enthielt. Wie in 5 (Spalte B) dargestellt, ist es offensichtlich, daß die überschüssige aspergillopepsin-spezifische mRNA in Stamm UVK143f in der RNA aus Stamm ΔAP6 nicht nachgewiesen werden konnte.
Es wurden Proben aus 50 ml-Schüttelkolben-Kulturen der Transformanten ΔAP3, ΔAP4 und Stamm GC12 gezogen und auf Magermilch-Agarose-Platten aufgespottet.
Nach 6-stündiger Inkubation bei 37°C wurden die resultierenden Koagulationszonen fotografiert (6). Weitgehende Milchgerinnung wurde durch das GC12-Kulturfiltrat induziert, während bei den Proben aus den beiden Transformanten nur leichte Gerinnung beobachtet wurde. Der Großteil der Milchgerinnungs-Aktivität von GC12 wurde durch Einbau von Pepstatin in das Medium inhibiert, was auch für Aspartat-Proteinase erwartet wurde (J. Biol Chem., 251, S. 7095–7102, 1976), was eine proteolytische Restaktivität ähnlich jener der Stämme ΔAP3 und ΔAP4 ergab. Weder die Aspartat-Proteinase-Aktivität von GC12 noch die Restaktivität der Stämme ΔAP3 oder ΔAP4 wurden durch PMSF oder EDTA inhibiert. Es wurde jedoch keine proteolytische Aktivität bei den Proben aus den Stämmen ΔAP3 oder ΔAP4 beobachtet, die bei pH = 6,8 auf Milchplatten aufgespottet worden waren. Die geringe Menge an proteolytischer Restaktivität von ΔAP3 und ΔAP4 spiegelt vermutlich die Gegenwart einer oder mehrerer anderer ausgeschiedener Proteinasen als des gelöschten Aspergillopepsins wider. Die Autoren der vorliegenden Erfindung fanden, daß, obwohl diese zusätzliche Proteinasenaktivität nicht durch Pepstatin inhibiert wurde (6), sie teilweise durch Diazoacetyl-DL-norleucinmethylester (DAN) inhibiert wurde, obwohl trotzdem eine gewisse Aufhellung beobachtet wurde. Daher kann eine pepstatin-unempfindliche Aspartyl-Proteinase vorliegen, ähnlich jener in Scytalidium lignicolum beschriebenen (S. Murao und K. Oda in "Aspartic Proteinases and Their Inhibitors", V. Kostka, Hrsg., Walter de Gruyter, New York, S. 379–399, 1985).
Verwendung von aspergillopepsin-defizienten Mutanten zur Produktion eines heterologen Polypeptids – Rinderchymosin
Um die Vorteile der Verwendung von aspergillopepsin-defizienten Mutanten zu illustrieren, wurde die Produktion von Rinderchymosin im Wildtyp und in Mutanten von A. awamori verglichen, denen spezifisch das Aspergillopepsin-Gen fehlte. Die Stämme wurden unter Verwendung eines Vektors transformiert, der ähnlich jenem von Cullen et al. (Bio/Technol., 5, S. 369–376, 1987) beschriebenen war, wobei transkriptionale, translationale und Sekretions-Komponenten des Glucoamylase-Gens verwendet wurden, um Chymosin-Expression und -Sekretion zu bewirken. Einzelne Transformanten wurden anschließend in Sojamehl-Medium (6% Sojabohnenmehl, 0,1% NaH₂PO₄, 0,1% MgSO₄, 1,5% (NH₄)₂SO₄, 0,1% Tween 80, 0,2% Mazu, 7% Natriumcitrat, pH = 6,2, 15% Maltose, 100 mg/ml Uridin, 100 mg/ml Arginin, 50 μg/ml Streptomycin) bei 37°C 7 d lang kultiviert und die Menge an extrazellulärem Chymosin während der Wachstumsperiode unter Anwendung eines Aktivitäts-Assays bestimmt.
Die in 8 dargestellten Ergebnisse zeigen klar, daß die Chymosin-Produktion in einem Stamm größer ist, dem spezifisch das Aspergillopepsin-Gen fehlt. Bemerkenswert ist, daß ab Tag 7 der Kultivierung die Menge an Chymosin im Stamm 12-Transformanten eines aspergillopepsin-produzierenden Stammes abnahm, während sie beim aspergillopepsin-defizienten Stamm weiterhin zunahm (Stamm ΔAP4-1). Diese Daten legen nahe, daß wahrscheinlich weniger Abbau des Chymosins in Stämmen erfolgt, die aspergillopepsin-defizient sind, weshalb die Ausbeute an heterologem Protein größer ist.
Um zusammenzufassen, zeigten die Autoren der vorliegenden Erfindung, daß die Produktion eines heterologen Genprodukts, wie z. B. Rinderchymosin, unter Verwendung eines Wirtsstammes verbessert wird, der hinsichtlich der Produktion von proteolytischen Enzymen (z. B. Aspergillopepsin) defizient ist, die das heterologe Produkt abbauen könnten. Weiters könnten proteolytische Enzyme, wie z. B. Aspergillopepsin in einem Chymosin-Präparat durch enzymatische Digestion von Milchproteinen zu unerwünschtem untypischem Geschmack in Käse führen.
TABELLE 1: Aminosäuresequenz von Abschnitten von Aspergillopepsin A aus A. awamori:
TABELLE 2: Vergleich der Kodon-Häufigkeit zwischen den Glucoamylase- und den Aspergillopepsin-Genen von A. awamori:

Claims

Fadenpilz-Mutante, die zur Herstellung von heterologen Polypeptiden daraus geeignet ist, worin ein Gen für Aspartoprotease im Pilz irreversibel inaktiviert oder eliminiert ist, sodass die dadurch erzeugte Mutante unfähig ist, enzymatisch aktive Aspartoprotease abzusondern.
Fadenpilz nach Anspruch 1, worin die Mutante das Ergebnis einer irreversiblen Deletion der Gesamtheit oder eines Teils des Gens für Aspartoprotease ist.
Fadenpilz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, der eine Trichoderma ist.
Fadenpilz nach Anspruch 3, worin die Trichoderma T. reesei oder T. viride ist.
Fadenpilz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, der ein Aspergillus ist.
Fadenpilz nach Anspruch 5, der Aspergillus awamori ist.
Fadenpilz nach Anspruch 5 oder 6, worin die Aspartoprotease ein Aspergillopepsin ist.
Fadenpilz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, der Mucor ist.
Fadenpilz nach Anspruch 8, worin die Aspartoprotease Mucor-Aspartoprotease ist.
Fadenpilz nach Anspruch 8, worin der Mucor Mucor miehei oder Mucor pusillus ist.
Fadenpilz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, der ein Rhizopus ist.
Fadenpilz nach Anspruch 11, worin die Aspartoprotease Rhizopuspepsin ist.
Fadenpilz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, der eine Endothia parasitica ist.
Fadenpilz nach Anspruch 13, worin die Aspartoprotease Endothiapepsin ist.
Fadenpilz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, der fähig ist, ein heterologes Polypeptid zu sekretieren.
Aspergillus nach Anspruch 15, der fähig ist, Chymosin zu sekretieren.
Mutante nach Anspruch 1, worin die Deletion im Wesentlichen durch ein DNA-Segment ersetzt ist, das für andere Aminosäurereste als jene kodiert, die deletiert wurden.
Mutante nach Anspruch 17, worin das Ersetzungs-DNA-Segment für einen selektierbaren Marker kodiert.
Mutante nach Anspruch 18, worin das Ersetzungs-DNA-Segment für argB kodiert.
Mutante nach Anspruch 17, worin das deletierte DNA-Segment für zumindest 2 Aminosäuren an aktiven Stellen kodiert.
Mutante nach Anspruch 17, worin das deletierte DNA-Segment eine zusammenhängende Sequenz ist, die zumindest etwa 100 Aminosäuren lang ist.
Verfahren zur Herstellung eines heterologen Polypeptids in einem Fadenpilz, umfassend das Kultivieren eines Fadenpilzes, der fähig ist, das heterologe Polypeptid zu exprimieren, und der eine irreversible stellenselektierte Deletion von Aminosäuren enthält, die dazu führt, dass der Fadenpilz unfähig ist, enzymatisch aktive As partoprotease abzusondern, bis sich eine Menge des heterologen Polypeptids in der Kulturlösung angesammelt hat, und anschließendes Gewinnen des Polypeptids.
Heterologes Polypeptidpräparat, umfassend eine nach Anspruch 22 hergestellte Kulturlösung.
Präparat nach Anspruch 23, worin das Polypeptid Chymosin ist.
Verfahren zur Herstellung von Käse, umfassend a) das Herstellen eines aktiven Chymosinpräparats durch Expression aus einem Wirtsfadenpilz, der die DNA für Chymosin exprimiert und unfähig ist, aktive Aspartoprotease abzusondern; b) das Hinzufügen des Chymosinpräparats zu Milch; c) das Gerinnenlassen der Milch zur Herstellung von geronnener Milch und Molke; und d) das Umwandeln der geronnenen Milch von Schritt c) zu Käse.
Verfahren zur Herstellung von Käse, umfassend a) das Selektieren eines aktiven Chymosinpräparats, das aus einem Wirtsfadenpilz gewonnen wird, der die DNA für Chymosin exprimiert und unfähig ist, aktive Aspartoprotease abzusondern, worin das aktive Chymosinpräparat die Kulturlösung ist, die für den das Polypeptid exprimierenden Fadenpilz verwendet wird; b) das Hinzufügen des Chymosinpräparats zu Milch; c) das Gerinnenlassen der Milch zur Herstellung von geronnener Milch und Molke; und d) das Umwandeln der geronnenen Milch von Schritt c) zu Käse.
Genersetzungsvektor, umfassend Linker am 3'- und 5'-Ende eines DNA-Inserts in einem Aspartoprotease-Gen, sodass der Vektor fähig ist, zumindest einen Abschnitt des Aspartoproteasegens eines Fadenpilzes durch eine Sequenz zu ersetzen, die unfähig ist, Aspartoprotease zu sekretieren.
Genersetzungsvektor nach Anspruch 27, worin die Ersetzungssequenz, die unfähig ist, Aspartoprotease zu sekretieren, ein selektierbarer Marker ist.
Genersetzungsvektor nach Anspruch 27, welcher der in 4 dargestellte pUC4ΔAP-argB ist.