JP2000511429A

JP2000511429A - 真菌メタロプロテアーゼ遺伝子

Info

Publication number: JP2000511429A
Application number: JP10500243A
Authority: JP
Inventors: デンホンベルグヨハネスペートルステオドルスウィルヘルムスファン; ヤコブヴィッセル
Original assignee: ギストブロカデスベスローテンフェンノートシャップ
Priority date: 1996-06-05
Filing date: 1997-06-05
Publication date: 2000-09-05
Also published as: AU3256397A; EP0907744A1; WO1997046689A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、低下した細胞外酸プロテアーゼ活性を有する、プロテアーゼ欠損糸状菌変異体に関し、さらにまた、低下したメタロプロテアーゼ活性を有する糸状菌を与えるＤＮＡのサイト選択的分裂に関する。好ましくは、糸状菌はAspergillus属である。本発明はさらに、真菌メタロプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む。該ＤＮＡ配列は糸状菌のメタロプロテアーゼ遺伝子の分裂、並びに真菌メタロプロテアーゼの組換え的生産に使用される。

Description

【発明の詳細な説明】真菌メタロプロテアーゼ遺伝子発明の技術的分野本発明は分子生物学の分野に関する。特に本発明は糸状菌から得られるメタロプロテアーゼ及び前記プロテアーゼをコードする遺伝子に関する。発明の背景 Aspergillus属及び特にAspergillus njgerは食物加工工業において使用される酵素の工業的製造に使用される。A．nigerは大量にタンパク質を分泌すること及び系がその分子遺伝学的操作に使用可能であることから、組換え蛋白質の製造のための宿主として有用である。しかし、培養液、細胞膜周辺腔、小胞体及びゴルジ体中のプロテアーゼの存在がA．njgerにおける相同的及び非相同的タンパク質の発現に有害であることが判明した。実際にAspergilliはプロテアーゼの生産に商業的に使用されている。多数のAspergilli由来の細胞外プロテアーゼが文献的に報告されている。Aspergillus awamori由来のアスペルギロペプシンＡ(asperg illopepsin A)をコードする遺伝子pepＡがクローン化された。pepＡ遺伝子生産物は、A．nigerの分泌酸プロテアーゼの主要部分であり、pepＡ遺伝子が削除された菌株では、Ａ．niger変異体awamori中の非相同的タンパク質の発現は増大する(EP-A-0 429 490)。他のプロテアーゼ遺伝子もまた最近Aspergilljからクローン化されており、他のプロテアーゼとしては、A．oryzaeのアルカリアスパルギン酸プロテアーゼ、Ａ．fumigatusのアルカリアスパルギン酸プロテアーゼ、A． niger変異体マクロポーラス(macrosporus)(pepＢ)の非ペプシン型酸プロテアーゼ、A．niger（pepＥ）のアスパルギン酸プロテアーゼ、A．oryzae由来の中性プロテアーゼIIと呼ばれるメタロプロテアーゼ、A．fumigatus及びA．flavus 由来メタロプロテアーゼ、A．niger(pepＣ，pepＤ)由来の二種類のセリンプロテアーゼ及びA.niger(pepＦ and cpy)由来の二種類のセリンカルボキシペプチダーゼが挙げられる。また、A．nidulans由来のアルカリプロテアーゼ（prtＡ)もクローン化されている。単離及び変異化されたA．nigerのプロテアーゼ遺伝子を遺伝子分裂実験、すなわち、相当する天然遺伝子が破壊されている変異体菌株の製造に使用することができる。例えば、アスペルギロペプシン(aspergillopepsin)Ａ欠損菌株を作製するために、Aspergillus awamori由来のpepＡ遺伝子を、遺伝子分裂により破壊した。同様にpepＢ及びpepＥ遺伝子を遺伝子分裂により破壊し、またこの三種類の分裂物を有する組換え菌株を作製した。しかし、上述したように、Aspergilliは非常に多数の異なるプロテアーゼを産生する。そのためタンパク質の工業的生産のための他のプロテアーゼが欠損しているAspergillus属菌株の要求が依然として存在する。またこの目的において、インビトロの突然変異誘発（例えば遺伝子分裂）によりプロテアーゼ欠損菌株の作製に使用することができる他のプロテアーゼ遺伝子の要求がある。さらに、タンパク質の加工に工業的に使用できる組換えプロテアーゼタンパク質に対する要求も存在する。 A．nigerの分泌されるプロテアーゼ活性の他の主要な成分はメタロプロテアーゼである。メタロプロテアーゼは幾つかの真菌類中でクローン化がなされている。メタロプロテアーゼによりコードされる中性プロテアーゼIIはA．oryzae及びA ．fumigatus及びA．flavusからクローン化されており、これに対し、中性プロテアーゼIコード遺伝子はA．fumigatusからクローン化された。突然変異誘発により単離されたA．nigerプロテアーゼ欠損変異体（prt変異体）、及び一種または全ての酸性プロテアーゼ遺伝子が分裂を受けた菌株は、依然としてメタロプロテアーゼ活性を有しており、この活性は驚くべきことに親野生型A．niger菌株と比較して上昇すらしており、これは明らかに酸性プロテアーゼ活性の欠失を補う目的であることが見いだされた。これは例えばA.niger.のprtＦ及びprtＤにおけるケースである。 Aspergllus nidulansはまた非相同性タンパク質の発現に適する宿主である。単離及び突然変異化されたA．nidulansのプロテアーゼ遺伝子もまた、遺伝子分裂実験に使用することができる。クローン化されたA．nidulansプロテアーゼ遺伝子の数は非常に限られており、そのため、プロテアーゼ遺伝子をクローン化し、相当する天然遺伝子を破壊するための、プロテアーゼスペクトルを確立する必要がある。図面の簡単な説明図1aはA.niger pepＨの部分的ヌクレオチド配列及びＰＥＰＨの推定アミノ酸配列部分を示している。図1bはＰＥＰＨ及びＭＥＰの部分的整列化アミノ酸配列を示す。図2aはA.nidulans pepＩ及びpepＪのヌクレオチド配列、並びにＰＥＰＩ及びＰＥＰＪの推定アミノ酸配列を示す。図2bはA.nidulansメタロプロテアーゼ及び幾つかの他のメタロプロテアーゼのアミノ酸配列間の相同性を示す。図3a及び3bは、A.nidulans ＰＥＰＩ及びＰＥＰＪが糸状菌のプロテアーゼの新規なクラスであることを示すデータの要約を示している。発明の詳細な説明本発明は、低下したメタロプロテアーゼ活性を有する糸状菌を提供する、ＤＮＡのサイト選択的分裂である突然変異を含む糸状菌のプロテアーゼ欠損突然変異を提供する。該糸状菌は相同性及び非相同性の両方のタンパク質の製造において有用である。何故なら低下したプロテアーゼ活性は、そのようなタンパク質が産生中に分解する可能性及び速度の両方を最小化するからである。本発明の糸状菌は、タンパク質の工業的生産に使用できる真菌類であることが好ましい。そのような真菌類は非病原性であり、事実上マイコトキシンを生産せず、及び真菌類により生産される酵素と関連してしばしば獲得ＧＲＡＳ状態を有する。そのような真菌類の例としては、Trichoderma、Penicillium、Fusarium、 Mucor、Rhjzopus及び最も好ましくはAspergillusに属するものが挙げられる。As pergillus属では、Aspergillus nigerグループ、Aspergillus nidulansグループ及びAspergillus flavusグループに属する真菌類が好ましい(ここで“グループ ”はRaper及びFennell(1965，ln: The Genus Aspergillus，The Williams & Wil kins Company，Baltimore)により定義されており、この著書らによると、特定のグループに含まれる全ての種属及び変異株を含む)。従って、用語A.niger,A.njd ulans及びA.oryzaeはこの明細書において全てのAspergillus nigerグループ、As pergillus nidulansグループ及びAspergillus flavusグループをそれぞれ意味する。さらなる態様において、本発明の糸状菌はまた低下した細胞外酸プロテアーゼ活性を有する。低下した細胞外酸プロテアーゼ活性を有する変異体糸状菌とは、本明細書において、メタロプロテアーゼではない一種以上の細胞外酸プロテアーゼの活性が野生型の糸状菌の活性と比較して低下したいずれの真菌変異株を含むものとする。本明細書において酸プロテアーゼとは最適ｐＨがｐＨ7.0より酸性であるプロテアーゼを意味する。変異株及び野生型真菌の細胞外酸プロテアーゼ活性レベルは、van den Hombergh et al．（19 95，Curr．Genet．28: 299-308)に記載される方法により決定できる。好ましい態様において、低下した細胞外プロテアーゼ活性は、A.niger pepＡ、pepＢ、pepＣ、pepＤ、pepＥ、pepＦ、cpy遺伝子またはA.nidulans prtＡ遺伝子によりコードされる一種以上の生産物の低下した活性の結果である。当業者は、A.nigerまたはA.nidulans以外の真菌類において相当するこれらの遺伝子（遺伝学的変異体)の相同体が意図されることを理解するであろう。これらの遺伝子生産物の活性の低下は、好ましくは相当する遺伝子のサイト選択的分裂により行われる。または、低下した細胞外酸プロテアーゼ活性はvan den Hombergh et al．（上述）に定義されるように一種以上のprt変異体の結果である。好ましくは、低下した細胞外酸プロテアーゼ活性はprtＤまたはprtＦの突然変異の結果である。驚くべきことに、本発明者らは低下した細胞外酸プロテアーゼ活性を有する幾つかの真菌変異体が上昇したメタロプロテアーゼ活性を示すことを見いだしたが、これは恐らく酸プロテアーゼ活性の欠失を補償するためである。その結果として、これらの変異体真菌類宿主により産生されるタンパク質は依然としてこれらのメタロプロテアーゼによるタンパク分解酵素による分解を受ける。好ましい態様において、本発明の変異体糸状菌は細胞外酸プロテアーゼ及びメタロプロテアーゼの両方において低下した活性レベルを有する。真菌類メタロプロテアーゼは本明細書において、(i)糸状菌から誘導される、( ii)金属イオン(通常Zn²⁺)によりプロテアーゼ活性を示す (これは通常ＥＤＮＡ、ＥＧＴＡまたはフェナンスロリンのようなキレート剤に対してプロテアーゼが感受性を示すという事実により証拠付けられる)、(iii)メタロプロテアーゼファミリーの一種のグループとして既知のメタロプロテアーゼのアミノ酸配列と十分な位置的同一性を有するアミノ酸配列を有する、ものであると理解される。糸状菌におけるメタロプロテアーゼレベルを低下させることができるように、発明者らは、実施例1、2、及び3に記載されるように非相同的ハイブリダイゼーションを用いて、A.niger（pepＨ）及びA.nidulans(pepＩ及びpepＪ)由来のメタロプロテアーゼ遺伝子をクローン化した。これらのクローン化したメタロプロテアーゼ遺伝子のさらなるキャラクタリゼーション及び配列分析は実施例4及び5に記載されている。この配列分析の結果は、配列表に記載されている;配列番号:1 、部分的Ａ.niger pepＨ遺伝子;配列番号:2、部分的A.niger pepＨcDNA;配列番号:3、部分的A.nigerＰＥＰＨアミノ酸配列;配列番号:4、A.nidulans pepＩ遺伝子;配列番号:5、A.nidulans peplcＤＮＡ;配列番号:6、A.nidulans ＰＥＰＩアミノ酸配列;配列番号:7、A.nidulans pepＪ遺伝子;配列番号:8、A.nidulans pep ＪcDNA;配列番号:9、A.nidulansＰＥＰＪアミノ酸配列。本発明のA.niger及びA.nidulansのメタロプロテアーゼ遺伝子の記載は、これら及び現在知られていない他の真菌類における付加的メタロプロテアーゼ遺伝子の同定の誘因となるものを提供する。この点において好ましい候補は、上述した工業的に重要な真菌類である。本発明の新規なメタロプロテアーゼ配列は、既に得られているメタロプロテアーゼ配列と共に、メタロプロテアーゼアミノ酸配列における保存領域及びそこで発生する置換型をより正確に特定するために使用することができる。これは改良された変性オリゴヌクレオチドの設計を容易にし、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーション法において新規なメタロプロテアーゼ遺伝子を得る機会を上昇させる。本発明の方法、すなわちゲノミックＤＮＡ上のＰＣＲにおける変性オリゴヌクレオチドの使用、は新規なメタロプロテアーゼをクローン化する好ましい方法であるが、新規なメタロプロテアーゼをクローン化する他の方法をまた使用することもできる。そのような方法としては、非相同性ハイブリダイゼーション、（変性）オリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーション、メタロプロテアーゼ -ネガティブ変異体の(非相同性)補完、または適する抗体を用いる発現ライブラリーのスクリーニングも挙げられる。本発明は従って、糸状菌から入手可能なメタロプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。好ましいＤＮＡ配列は配列番号:1および2に部分的に示されているAspergillus nigerのpepＨ遺伝子、配列番号:4及び5に示されるAspergillus nidulansのpepＩ遺伝子のＤＮＡ配列、配列番号:7及び8に示されるAspergillus nidulansのpepＪ遺伝子のＤＮＡ配列、並びにこれらのＤＮＡ配列の遺伝子変異体が挙げられる。さらなる実施態様において、本発明はまた、糸状菌から得られ、かつpepＨ，pepＩ及びpepＪ配列の一種以上とハイブリダイズすることができるメタロプロテアーゼ活性を有するＤＮＡ配列を提供する。本発明のメタロプロテアーゼＤＮＡ配列は、低下したプロテアーゼレベルを与える破壊されたメタロプロテアーゼ遺伝子を有する変異体糸状菌を作製するために使用される。この目的において、活性なメタロプロテアーゼをコードすることができないＤＮＡ配列を与える破壊を含むメタロプロテアーゼＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物が提供される。活性なタンパク質をコードするＤＮＡ配列の破壊のための多数の方法を当業者が利用することができる。そのような破壊は、メタロプロテアーゼコード配列を機能的に不活化するために活性なコード配列の欠失、挿入、置換、復帰及び切断を含んでいてもよい。この破壊は、例えば、コード配列の(大部分の)欠失による非復帰性のものであることが好ましい。メタロプロテアーゼ遺伝子の破壊のためのＤＮＡ構築物はさらに形質変換の選択のための選択可能なマーカー遺伝子を含む。当業者は、そのような様々な遺伝子(例えば、真菌amdＳ,argＢ，trpＣ,niaＤ及びpyrＧ遺伝子及び幾つかの抗生物質耐性遺伝子など)を入手することが可能である。形質転換においてメタロプロテアーゼ遺伝子の破壊のためのＤＮＡ構築物は、相同性組換えによって、ゲノミックメタロプロテアーゼ遺伝子座に挿入される。破壊構築物の様々な成分をアレンジして、一段階または二段階遺伝子置換のような現象を最適化する。実施例9及び10に、pepＨ，pepＩ及びpepＪメタロプロテアーゼ遺伝子の破壊構築物の構築及び使用について記載する。本発明は従って、低下したメタロプロテアーゼ活性を有する糸状菌の作製プロセスを提供する。該プロセスは、a)メタロプロテアーゼ遺伝子の破壊のためのＤＮＡ構築物により糸状菌を形質転換する、及びb)低下したメタロプロテアーゼ活性を有する形質転換された糸状菌を選択する、各工程を含む。上記プロセスの生産物として、本発明はメタロプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列のサイト選択された破壊によりメタロプロテアーゼ活性が低減する糸状菌を提供する。メタロプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列は、好ましくは配列表に記載される通りのpepＨ，pepＩ，及びpepＪ遺伝子、またはその遺伝学的変異体である、ＤＮＡ配列である。さらなる実施態様において、破壊されるべきＤＮＡ配列はpepＨ,pepＩ,及びpepＪ遺伝子またはその遺伝学的変異体の一種にハイブリダイズすることが可能である。好ましい態様において、破壊構築物は、メタロプロテアーゼ遺伝子の破壊が起こった後、選択マーカー遺伝子を真菌のゲノムから除去することが可能なように構築される。このアプローチの方法及び実施例はEP-A-0 635 574に記載されている。このアプローチの利点は、単一の選択マーカー遺伝子を使用して一つの菌株において、連続的形質転換ラウンドにおいて、複数の（メタロ）プロテアーゼ遺伝子を破壊できるということである。本発明において、用語"遺伝学的変異体"は、メタロプロテアーゼ遺伝子及び細胞外酸プロテアーゼをコードする遺伝子の両方に適用する場合において、同種または異種生物体由来の、プロモーター、分泌及びターミネーターシグナルのような調節領域に連結するプロテアーゼ‐コード配列を含むハイブリッドＤＮＡ配列を含むと理解される。遺伝学的変異体はまた、酵素のプロテアーゼ活性が保持される、変異体プロテアーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列及び変性ＤＮＡ配列を含む。本発明はまた、上述したように、プロテアーゼ−コードＤＮＡ配列及びその遺伝学的変異体にハイブリダイズ可能なＤＮＡ配列を含むが、遺伝学的コードの変性または交差種の変化のためコドン配列において異なっていてもよい。用語"遺伝子"は、本明細書において、配列がゲノム配列(イントロンを含んでいてもよい)、cDNA配列または合成(イソコーディング)配列であるかどうかに関係なく、いずれのコードＤＮＡ配列も含む。さらなる実施態様において、本発明は、メタロプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列が適する宿主においてＤＮＡ配列の発現に適する調節領域に操作可能なように結合するＤＮＡ構築物を提供する。適する宿主は、微生物であることが好ましい。例えば、E.coliまたはBacillus種のようなバクテリア、Saccaromyces cer evisiae及びKluyvermyces lactis属のような酵母、またはTrichoderma，Penicil lium，Fusarium，Mucor，Rhizopus属のような真菌が好ましい糸状菌類が挙げられ、及び最も好ましくはAspergillus種である。前述した宿主においてメタロプロテアーゼ遺伝子の発現を調節するのに適する様々な調節領域が、当業者に入手可能である。これらの調節領域のうち、プロモーターは最も重要である。真菌の発現宿主における使用が好ましい、強力で本質的および／または誘導可能なプロモーターの例としては、ＡＴＰ-合成酵素、サブユニット9(oliＣ)、ピルベートキナーゼ(pki)、トリオースホスフェートイソメラーゼ(tpi)、アルコールデヒドロゲナーゼ(alcＡ)、α-アミラーゼ(amy)、アミルグルコシダーゼ(ＡＧ)、アセトアミダーゼ(amdＳ)及びグリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(g pd)プロモーターが挙げられる。強力な酵母プロモーターの例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、3-ホスホグリセレートキナーゼ及びトリオースホスフェートイソメラーゼプロモーターが挙げられる。強力なバクテリアプロモーターとしては、α-アミラーゼ及びSpo2プロモーター並びに細胞外プロテアーゼ遺伝子からのプロモーターが挙げられる。従って、本発明は、本発明の糸状菌メタロプロテアーゼ遺伝子の非相同的または過剰発現が可能な宿主微生物、及びこれらのメタロプロテアーゼの作製プロセスについて記載する。このプロセスは、a)メタロプロテアーゼ遺伝子の発現が行える条件下において糸状菌メタロプロテアーゼ遺伝子の非層動的または過剰発現を行うことが可能な宿主生物を培養し、及びb)メタロプロテアーゼを再回収する、各工程を含む。本発明に従い産生されたメタロプロテアーゼの幾つかの使用が考えられる。例えば得られたメタロプロテアーゼを、真菌宿主中に生産される目的のあるタンパク質が問題のプロテアーゼに感受性であるかどうかについてインビトロで評価するのに使用できる。これによりどのメタロプロテアーゼ遺伝子を真菌宿主において不活性化するか決定できる。または、プロテアーゼが適用される多数の工業的プロセスにおいて、メタロプロテアーゼの実用性が見いだされてもよい。メタロプロテアーゼの利点は、プロテアーゼ活性のオン・オフ(切り換え)を、主に金属イオンまたはキレート剤の個々の添加により行うことができることである。本発明において、用語"真菌メタロプロテアーゼ"の意味として、メタロプロテアーゼ活性を保持するような酵素のフラグメントも含まれるが、完全長の酵素が好ましい態様である。さらにアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質に連結する本発明の真菌メタロプロテアーゼを含む融合タンパク質もまた本発明の一部であると理解される。以下の実施例は、当業者に、本発明をどのように実施し、使用するかについての完全な記載を示すためであり、本発明の観点を制限するためのものではない。実施例 1.メタロプロテアーゼプローブの作製 1.1A．oryzaeプローブの作製ＮＰIIコード遺伝子(Tatsumi et al.,1991)の配列由来の二種類の特定のＤＮＡプライマー(ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＴＧＡＧＴＧＡＡＣＴＣＧＴＧ及びＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧＴＣＡＣＣＧＡＣＴＧＣＡＡＧＧ、BamHI及びEcoRI制限サイトをそれぞれ有する)をA.oryzae ＡＣＴＴ 20386ゲノムＤＮＡ(de Graaff et al.,1988らに報告されたように単離されたもの)のＰＣＲ反応に使用した。使用したＰＣＲ条件は、初期溶融段階(94℃,3分)、1分間のアニール(68℃)、1分間の伸長(72℃)及び1分間の溶融(94℃)を30サイクルである。72℃において5分間最終伸長を行った後、ＰＣＭ混合物を1.0％(w/v)アガロースゲル、1xＴＡＥ中で分析を行った。得られた0.41kb ＰＣＲフラグメントをアガロースゲルから分離し、G eneCleanキット(Westburg)を用いて、使用マニュアルに記載されるようにして、ＤＮＡを得た。0.41kb ＰＣＲフラグメントを、以下の溶液からなる反応混合物中で、制限酵素EcoRI及びBamHIを用いて消化を行った;10μｌ(約2μｇ)ＤＮＡ溶液;5μｌの適性な10ｘ React.buffer(Life Technologies);10Uの両酵素(Life Te chnologies)及び最終体積50μｌとなるように加えた滅菌水。消化を行った後、制限酵素をフェノール(fenol)、フェノール-クロロホルム及びクロロホルム抽出を用いて除去し、次にＤＮＡをエタノールを用いて沈殿を行った。50ngの制限消化ＰＣＲフラグメント及び50ngのBamHI-EcoRI消化pUC19を、４μｌの5ｘ結紮バッファー(Life Technologies;組成:500ｍＭ Tris-HCl,pH 7.6,100ｍＭ MgCl₂，1 0ｍＭＡＴＰ，10ｍＭジチオスレイトール、25％（w/v）ＰＥＧ-6000)及び1μｌ（1.2 Ｕ）T₄ ＤＮＡリガーゼ(Life echnologies)と混合した。一晩14℃においてインキュベーションを行った後、混合物を滅菌水で５倍に希釈した。10μｌの希釈混合物を用いて、Sambrook et al．(1989)に記載されるように、E．coli ＤＨ5αコンピテント細胞を形質転換した。得られた(白色)コロニーから、５つを一晩、100 μｇ/mlのアンピシリン含有液体ＬＢ媒体(1000mlのＬＢ媒体あたり：10ｇトリプチカーゼペプトン(ＢＢＬ),5ｇ酵母抽出物(ＢＢＬ)，10ｇ NaCl,0.5ｍＭ Tris-H Cl ｐＨ7.5)上で生育させた。培養物から、プラスミドＤＮＡをManiatis et al. (1982)により報告されたアルカリ法により単離し、制限分析に使用して、目的のプラスミドpIM664を含む(harbouring)クローンを選択する。得られたプラスミド pIM664中の0.41kbのA．oryzae ＰＣＲフラグメントをＡ．oryzae ＮＰIIコード遺伝子のクローン部分を探索するために配列決定した。50ngのＰＣＲフラグメントを³²Ｐ-ｄＡＴＰを用いて、ランダムプライム化をSambrook et al．(1989)に報告されているように行い、サザーンまたはプラークリフトプロービング(plaqu e lift probings)のいずれかにすばやく使用した。 1.2A．fugimatusプローブの作製．プラスミドpMTL21-H5はA．fumigatus ＤＮＡの5.0kb HindIII kbフラグメントを含み、A．fumigatus ＭＥＰ遺伝子をコードする(Jaton-Ogay et al.，1994により報告されている)。成熟ＭＥＰプロテアーゼをコードするコード領域の部分をE coRIにより切除できる。プラスミドpMTL21-H5はそのためEcoRIにより消化され、またプラグメントは0.7％（w/v)アガロースゲル上で1ｘＴＡＥ中にて分離される。1.3kb EcoRIフラグメントを切断し、ＤＮＡをGeneCleanキット(Westburg)を用いて、使用マニュアルの記載に従い得た。50ngこのフラグメントをSambrook e t al．(1989)らに報告れるように、ランダムプライム化により³²Ｐ-dATPでラベル化して、サザーンまたはプラークリフトプロービングのいずれかにすばやく使用した。 2.ゲノミックライブラリのスクリーニング 2.IＡ．niger及びA．nidulansゲノムＤNＡのサザーン分析全ゲノムＤＮＡをA．nigerから単離し、及びA．nidulans野生型菌株(各々Ｎ40 0及びＷＧ096)を幾つかの制限酵素により制限消化を行い、フラグメントを0.7％ (w/v)アガロースゲル上、1x ＴＡＥ中にて分離し、次にナイロンメンブランにブロットした。一連のサザーンハイブリダイゼーション実験(Sambrook et al.,198 9)において、A．fumigatus及びA．oryzae双方のメタロプローブを使用して、A． niger及びA．nidulans中の関連遺伝子のスクリーニングに使用する。A．nigerでは、60℃において、2ｘＳＳＣ，0.5％(w/v)ＳＤＳにてよく洗浄した後、全ての消化試験を行ったうちでA．fumigatusメタロプロテアーゼプローブが明確な特異的ハイブリダイズフラグメントであることが観察された。同一の条件下において、A．oryzaeメタロプロテアーゼプローブを使用しても、ハイブリダイズシグナルは検出されなかった。しかし、A．nidulans genomicＤＮＡのA．oryzaeプローブ(at56℃，4ｘＳＳＣ，0.5％(w/v)ＳＤＳ)によるハイブリダイズは、明確なハイブリダイズシグナルを与え、A．nidulansにおけるＮＰIIコード遺伝子の存在を示唆している。これらの条件下において、A．nigerゲノムＤＮＡは（再び）ハイブリダイズシグナルを与えなかった。 A．niger pepＨ遺伝子及びA．nidulans pepＩ及びpepＪ遺伝子の単離及び性質決定後、サザーン分析をストリンジェント洗浄条件下（最終洗浄0.2ｘＳＳＣ） 0.1％(w/v)ＳＤＳ、68℃)にて繰り返し、個々のプロテアーゼ遺伝子のコピー数を確立した。これらの分析は全ての三種類のプロテアーゼ遺伝子がゲノム中に単一コピーで存在することを示している。 2.2A．niger Ｎ400ゲノミックライブラリのスクリーニング Harmsen et al.，1990らにより記載されるように構築されたA.nigerゲノミックライブラリからpepＨ遺伝子をスクリーニングするために、(Sambrook et al. ，1989)に記載されるように、E.coli ＬＥ392をプレートバクテリアとして使用し、一プレートにつき5ｘ 10³pfuを5つの85-ｍｍ-直径ＮＺＣＹＭ（1.5％アガー）プレート上に0.7％アガロースを含むＮＺＣＹＭトップ-アガロース中に、プレートした。３℃において、プレートを一晩インキュベーションした後、各プレートの二種類のレプリカをHybondN⁺フィルター(Amersham)上にManiatis et al．(1 982)に報告されるようにして作製した。フィルターを5ｘＳＳＣ中で湿らせた後、フィルターを30分間室温で5ｘＳＳＣ中で洗浄した。Sambrook et al．(1989) に記載されるように作製したA．fumigatus ＭＥＰメタロプロテアーゼ遺伝子からの³²Ｐ-標識化1.3kb EcoRIフラグメントを使用したハイブリダイゼーションを、次の方法に従い行った;6ｘＳＳＣ（20ｘＳＳＣper 100ml:175.3ｇ NaCl，10 7.1ｇクエン酸ナトリウム5.5H₂O,pH7.0),0.5％(wlv)ＳＤＳ,5ｘ（Denhardt's溶液(100ｘ Denhardt's溶液per 500ml: 10ｇ Ficoll-400，10ｇポリビニルピロリドン，10ｇボバイン血清アルブミン(Boehringer，fractionＶ)及び変性ヒーリング(heering)精子ＤＮＡ100μｇ/ml中で、60℃において3-5時間プレハイブリダイゼーションし、及び変性放射標識したプローブを含む同一のバッファー中で、60 ℃において15-18時間ハイブリダイゼーションし、次に２ｘＳＳＣ，0.5％(w/v) ＳＤＳ中で60℃において三回洗浄する。メンブランをサランラップで包み、-70 ℃にて、コニカＸ線フィルム及び通常の強度のスクリーンを有するコダックX-om aticカセットを用いて一晩オートラジオグラフを行った。このスクリーニングは、約20のポジティブファージを与え、そのうち10を精製した。各ポジティブファージをプレートからパスツールピペットを用いて採取し、そのファージを、Maniatis et al. (1982)の記載に従い、10μｌのクロロホルムを含む0.5mlのＳＭバッファー中のアガープラグから溶出した。得られたファージを、50-100プラークの単離したファージを含むプレートからのフィルターレプリカを使用して、上述した方法を繰り返すことにより精製した。 2.3A．nidulansゲノミックライブラリのスクリーニング Orr及びTimberlak(1982)に報告されたように構築されたA．nidulansゲノミックライブラリのスクリーニングのために、ライブラリを2.2に述べたようにプレートした。このライブラリー(Sambrook et al.，1989)から作製したレプリカをハイブリダイゼーションバッファー(2.2参照)中で、56℃にて3-5時間プレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションをメタロプロテアーゼＰＣＲフラグメント由来の変性³²Ｐ放射標識化0.41kb A．oryzaeをさらに含む同一のバッファー中で行った。15-18時間のハイブリダイゼーション後、レプリカを４ｘＳＳＣ，0. 5％（w/v）ＳＤＳ中で56℃にて3回洗浄した。レプリカをサランラップで包み、- 70℃にて、コニカＸ線フィルム及び通常の強度のスクリーンを有するコダックＸ -omaticカセットを用いてオートラジオグラフを行った。このスクリーニングは少なくとも35のポジティブファージを与え、そのうちの10を2.2に記載されるように精製した。 3.ラムダクローンのキャラクタリゼーション 3.1A．nigerラムダクローンのキャラクタリゼーション精製後、ファージをＮＺＣＹＭ媒体上に５ｘ10³ファージをプレートすることにより増殖させた。37℃にて一晩インキュベーションした後、コンフルエントなプレートを得て、５mlのＳＭバッファーを添加してそこからファージを溶出し、プレートを間欠的に震盪しながら、2時間4℃で貯蔵した。上澄み液をピペットを使用して集めた後、バクテリアを遠心分離(4,000ｘｇ、10分間、4℃)により溶液から除去した。この上澄み液に0.3％(w/v)のクロロホルムを加え、pfuの数を決定した。これらのファージストックは約10⁹pfu/ml含有する。 Sambrook et al．(1989)に記載されるように単離された10の選択されたファージ(ラムダ1-10)のＤＮＡをサザーン分析により分析した。このＤＮＡを、次の溶液からなる反応混合物中で４時間37℃にて消化を行った;５μｌ(約1μｇ)のＤＮＡ溶液;２μｌの適する10x反応バッファー(Life Technologies);10Ｕ制限酵素(L ife Technologies)及び最終体積20μｌを与える滅菌水。試料を10分間65℃にてインキュベートし、すばやく氷上で冷却し、ローディングバッファーを加えて、ＴＡＥバッファー中の0.6％(w/v)アガロースゲル上に添加した。ＤＮＡフラグメントを電気泳動(25Ｖ、15-18時間、室温)により分離した。電気泳動後、VacuGene ＸＬ使用マニュアルに記載されるように(pp．25-26)、ＤＮＡを移動し、アルカリブロット法(VacuGene ＸＬ，Pharmacia ＬＫＢ)により、ナイロンメンブラン(Hybond N，Amersham)に変性を行い、次に2.2に記載したようにプレハイブリダイズ及びハイブリダイズを行った。ハイブリダイゼーションパターンは増強スクリーンを使用して-70℃にて18時間コダックＸＡＲ-5Ｘ線フィルムに露出することによりハイブリダイゼーションパターンを得た。全てのクローンにおいて、同じゲノミック領域由来のフラグメントが見いだされた。 3.2A．nidulansラムダクローンのキャラクタリゼーション純粋なファージストックを10のA．nidulans精製メタロファージのために、3.1 に記載された方法と同様に生成させた。ファージＤＮＡを単離した後、このＤＮＡを幾つかの制限酵素により消化を行い、得られたフラグメントを1ｘＴＡＥアガロースゲル中で電気泳動により分離した。得られた分離ＤＮＡフラグメントをナイロンメンブレンに電気ブロットした(参照3.1)及び次に2.1に記載されるようにプレハイブリダイズ及びハイブリダイズを行った。全てのクローンにおいて、ハイブリダイズフラグメントを同定し、これらのフラグメントを二種類の群に分けることができるので、このサザーン分析は二種類の非依存ゲノミック遺伝子座由来の二クラスのファージが単離されたことを示した。A．nidulansメタロファージのクラスIが２.4kbハイブリダイズPstIフラグメントの存在により同定され、一方クラスIIメタロファージは0.7kb EcoRIフラグメントの存在により同定された。 4.プラスミドへのpepＨのクローン化、その配列及びそのキャラクタリゼーション 4.1PIM676の構築ラムダファージのキャラクタリゼーションにおいて得られた結果に基づいて、 10kb EcoRIを、サブクローニングのために選択した。25ngのpUC18 EcoRI消化フラグメントを100ngの10kbEcoRIフラグメントと混合し、４μｌの５ｘリゲーションバッファー(組成物:500mM Tris-HCl,ｐＨ7.6; 100mM MgCl₂；10mM ＡＴＰ;10 ｍＭジチオスレイトール; 25％(w/v)ＰＥＧ-6000)及び1μｌ（1.2 U/ml）Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼ(Life Technologies)をこの混合物に加え、最終体積20μｌとした。14℃にて16時間インキュベーションを行った後、混合物を100μｌの滅菌水で希釈した。10μｌの希釈混合物をE．coli ＤＨ5αコンピテント細胞(Sambrook e t al.(1989)に記載されるように作製したもの)を形質転換するために使用した。得られた(白色)コロニーのうち10を一晩、100μｇ/mlのアンピシリンを含むＬＢ媒体中で生育させた(1000mlあたりのLB媒体:10ｇトリプチカーゼペプトン(ＢＢＬ)，５ｇ酵母抽出物(ＢＢＬ)，10ｇNaCl，0.５ｍＭ Tris-HCl ｐＨ7.5)。培養から、プラスミドＤＮＡをアルカリ法(Maniatis et al．(1982)により報告された方法)により単離し、目的のプラスミドpIM676を含むクローンを選択するための制限分析に使用した。プラスミドＤＮＡを、100μｇ/mlアンピシリン(Sambrook et al.，1989 )を含むＬＢ媒体中で生育したpIM676を含む.200mlの培養E．coli ＤＨ5αから大量に単離した。プラスミドをNucleobondAXイオン交換シリカ精製システムを使用して、NucleobondAXの使用マニュアル(pp.8)に記載されるように、精製を行った。収率は約200μｇであった。 4.2pepHのヌクレオチド配列． pUC18/19中のpIM676からのフラグメントをサブクローニングし、配列決定反応におけるプライマーとして特定のオリゴヌクレオチドを合わせて使用することにより、A．niger pepＨ遺伝子の構造部分の配列を決定した。ヌクレオチド分析のために、制限フラグメントを単離し、pUC18/19 ＤＮＡベクター中で単離及びクローン化を行い、適する制限酵素により消化を行った。ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法(Sanger et al.，1977)により、ファルマシアＴ7ＤＮＡポリメラーゼシークエンシングキットを用いて決定した。コンピューター分析を、ＰＣ/ＧＥＮＥプログラム(Inte lligenetics)を用いて行った。決定した配列を配列番号:1に示す。pepＨ遺伝子の配列は、コード領域の3'末端において圧縮のために幾つか不明瞭であったために、まだ完成していない。我々は、依然としてこの不明な点を解明する途中である。推定ＰＥＰＨタンパク質配列はA．fumigatus ＭＥＰメタロプロテアーゼと高い相同性を示す（付属書類I及びIII参照）。個々のメタロプロテアーゼクラスのメンブレンとの詳細な相同性の比較は、限定された相同性のみを示した。しかし、A．niger及びA．fumigatus両方のメタロプロテアーゼは、サーモリシン型メタロプロテアーゼの第三リガンドに若干類似する領域を含む。 5.pepＩ及びpepＪのプラスミドへのクローン化、その配列及びキャラクタリゼーション 5.1pIM667,pIM668及びpIM669の構築二種類のメタロプロテアーゼ遺伝子がA．nidulansから実際に単離されているかどうか証明するために、ラムダクローン1から2.4kbハイブリダイズPstIフラグメント及びラムダクローン5から0.7kbハイブリダイズEcoRIフラグメントを、4.1 においてA．nigerpepH遺伝子のクローニングについて記載した方法に従い、最初にサブクローンを行った。これはプラスミドpIM665及びpIM666をそれぞれ与えた。両方のpIM665及びpIM666中の挿入物の配列決定を行い、その推定アミノ酸配列が両方ともA．oryzaeＮＰＩＩプロテアーゼと相同性を有していることを見いだした。両方のA．nidulansファージクラスがメタロプロテアーゼ配列を含むことを確認した後、より大きなフラグメントをサブクローン化し、両方の遺伝子の配列決定を完了した。ファージクラスIから二つのEcoRIフラグメント(1.4kb及び2. 0kb)並びにファージクラスIIから6.5kb HindIII-XhoIフラグメントをpUC19中でサブクローン化し、プラスミドpIM667，pIM668及びpIM669をそれぞれ得た。 5.2pepＩのヌクレオチド配列ヌクレオチド分析のために、特異的制限フラグメントを単離し、pUC18/19ＤＮＡベクター中にクローン化し、適する制限酵素で消化した。ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法(Sanger et al.，1977)により、ファルマシアT7ＤＮＡポリメラーゼシークエンシングキットを用いて決定した。コンピューター分析をＰＣ/ＧＥＮＥプログラム(Intelligenetics)を用いて行った。決定した配列を配列番号:2に示す。 5.3pepＪのヌクレオチド配列ヌクレオチド分析のために、特異的制限フラグメントを単離し、pUC18/19ＤＮＡベクター中にクローン化し、適する制限酵素で消化した。ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法(Sanger et al.，1977)により、ファルマシアT7ＤＮＡポリメラーゼシークエンシングキットを用いて、決定した。コンピューター分析をＰＣ/ＧＥＮＥプログラム(Intelligenetics)を用いて行った。決定した配列を配列番号:3に示す。 5.4新規なクラスの酵素である、A．njdulansメタロプロテアーゼ両方のA．nidulansメタロプロテアーゼは領域ＨＥＸＸＨを含み、この領域において、二つのヒスチジン残基が他のメタロプロテアーゼと同様の理由で、活性中心においてZn²⁺カチオンを配位結合するのに使用されており、及びグルタメートは結合-切断プロセスに関連している(Jongeneel et al.，1989)。今までにキャラクタライズされた全てのメタロプロテアーゼが、金属イオンリガンドの付近の相同性に基づいて幾つかの独立のクラスであることが認められた(Jiang and B ond，1992)。第一の二つのリガンド（全ての今までに研究されたメタロプロテアーゼではヒスチジン残基である)はＨＥＸＸＨまたはＨＸＸＥＨモチーフ(Append ix Ｖ-Ａ)のいずれかに存在する。ＨＥＸＸＨ-含有メタロプロテアーゼであるサーモリシン型メタロプロテアーゼでは、第三金属イオンリガンドはグルタミン酸残基であり、ＧＡＸＮＥＡＦＳＤ配列中に位置するが、これに対し、第四リガンドは水分子であることが示されている(Kester及びMatthews，1977)。ＨＥＸＸＨモチーフを含む他のメタロプロテアーゼにおいて、第三リガンドもまたヒスチジン残基であり、第四リガンドはチロシン残基である。第三金属イオンリガンドの後に存在するアミノ酸及び第四リガンドのすぐ前に存在する4アミノ酸は、それぞれ4クラス、アスタシン(Astacin)、セラチア(Serratia)、マトリキシン(Matri xin)及びスネークベノム(Snake Venom)に分化させる(Jiang and Bond，1992)。A．nidula ns及びA.oryzae由来のメタロプロテアーゼは記載したいずれのクラスにも属さない。明らかに、これらのメタロプロテアーゼはＨＥＦＴＨＡ配列における二種類のヒスチジン残基を除けば、成熟プロテアーゼにさらなるヒスチジン残基を有さないので、第三リガンドとしてヒスチジンを有さない。また、サーモリシン型メタロプロテアーゼを示唆しえるＧＡＸＮＥＡＦＳＤ配列も見いだされた。A.njge r及びA．fumigatusメタロプロテアーゼコード遺伝子(各々pepＨ及びＭＥＰ)もまた、クローン化され、配列決定された。その推定アミノ酸配列は、ＨＥＹＴＨ亜鉛リガンドに加えて、サーモリシンＥＳＧＧＭＧＥＧＷＳＤの第三リガンド領域に類似する領域を含む(appendix III参照)。この型のメタロプロテアーゼはA．n idulansメタロプロテアーゼの二倍のサイズを有しており、A．nidulansＰＥＰＩ及びＰＥＰＪメタロプロテアーゼに全く相同性を示さず、恐らくサーモリシン型メタロプロテアーゼである(4.2も参照)。これらの知見に基づき、糸状菌由来のメタロプロテアーゼは、サーモリシン様、及び酸メタロプロテアーゼの二種類の異なるクラスに分類できる。酸メタロプロテアーゼの第三及び第四金属イオンリガンドは知られていないが、(他のメタロプロテアーゼクラスと比較して）ほぼ同じＣ末端距離のＨＥＦＴＨボックスにおいて保存配列ＳＹＡＬＹが見いだされ、これはアスタシン、セラチア、マトリキシン及びスネークベノムクラスの第四のリガンドの前の領域に部分的に相似している(付属書類III)。 6.pepＨのA.niger.への過剰発現 6.1複数コピー A.niger ＮＷ219(cspＡ1,ＩeuＡ1,pyrＡ6,nicA1)を１μｇのpGW635プラス10μ ｇのpIM676を用いて形質転換し、ウリジン原栄養株を産生させる。コロニーを精製し、上述したようにＤＮＡを作製する。pepＨからの内部HindIIIフラグメントをプローブとして用いたサザーンブロットにより、幾つかの形質転換体はそのゲノムに組み込まれたplM676の単一コピーを有するが、その他のものは10の余剰コピーまで及びそれより多くをそのゲノムに有することが示される。これらの株は、対応してよりタンパク質分解活性を産生し、かつ有糸分裂的に安定である。 6.2遺伝子融合 A．niger pkiＡプロモーター及びターミネーターに基づく発現カセットをA．n iger pepＨ遺伝子用に、Bartling et al．(1996)らに記載されるようにして作製した。pUC18中にクローン化された（かつプラスミドpPKIPEPHに得られた）発現カセットの正確な構造は制限消化及び配列決定により確認される。pPKIPEPHは、 pUC18内に挿入されたフラグメントを有し、これはA．nigerのpepＨ遺伝子のＡＴＧスタートコドンに融合されたA．nigerのピルベートキナーゼプロモーターからなる発現カセットを含み、これはピルベートキナーゼターミネーターにより終結する。pPKIPEPHをpGW635（A．niger pyrＡ遺伝子を含む)と共に用いてA.niger ＮＷ219をウリジン原栄養株に形質転換する。 pki-pepＨ融合の存在を個々の形質転換体からのＤＮＡを精製し、及びpki及び pepＨ遺伝子由来のプローブを使用するサザーン分析にそれを用いることにより確認される。ゲノム中に組み込まれた遺伝子融合の一種以上のコピーを有する株は、細胞をＣ源であるグルコース上で迅速に育成する際に、より高いタンパク分解活性の産生を示す。このアプローチは、他の細胞外プロテアーゼコーディング遺伝子の発現を抑制する条件下（高グルコース濃度）においてpepＨプロテアーゼ遺伝子を発現させる。 7.A．nidulans.におけるpepＩ及びpepＪの過剰発現 7.1複数コピー A．nidulans pepＪ及びpepＩ遺伝子のための複数コピー形質転換体の構築のために、プラスミドpIM669及びpIM667-8をそれぞれ使用した。プラスミドpIM667-8 は、1.4kb及び2.0kb EcoRIフラグメントを、pepI遺伝子のプロモーター、コーディング領域及びターミネーター配列を含む3.4kbフラグメント中へ連結することにより作製される。両プラスミドは個々に、プラスミドpGW635を用いて、ウリジン栄養要求性A.nidulans ＷＧ096株中へ、共形質転換される。選択され、かつ精製された形質転換体をpepＨ複数コピー形質転換体(6.2)に対して記載したように分析が行われる。最終的に、単一及び複数コピー形質転換体を選択し、A．nidul ans ＰＥＰＩ及びＰＥＰＪタンパク質をA．nigerＰＥＰＨタンパク質に対して記載したように得る。 7.2遺伝子融合 6.2の記載と同様にして、A．nidulans pepＩ及びpepＪ遺伝子の遺伝子融合を構築することが可能である。ウリジン栄養要求株ＷＧ096の形質転換において、ウリジン原栄養株性形質転換体を単離及び精製する。サザーン分析により、単離された形質転換体中の発現カセットのコピー数を決定することができる。選択された形質転換体を、培地含有高グルコース上で生育して、A．nidulansメタロプロテアーゼを産生することができる。A.niger中のＰＥＰＨの産生と同様に、使用した生育条件は相同性細胞外プロテアーゼのA．nidulans中の発現を抑制する。 8.他の微生物におけるpepＨ,pepＩ及びpepＪの発現 8.1.1.A．nidulansにおけるpepＨ（７の説明を参照） 8.1.2A．ｎigerにおけるpepＩｐepＪ A．nidulans pepＩ及びpepＪ遺伝子に対して構築された発現カセット(これは非融合の場合(参照7.1)及び遺伝子‐融合(参照7.2)の両方の場合に複数コピー形質転換体を作製するために使用される)を使用してA．niger ＮＷ219中に(6.1に記載されるように)複数コピー形質転換体を産生するために使用される。選択された形質転換体をサザーン分析(参照6.1)により分析して、単一及び複数コピー形質転換体を選択し、これらは次にＰＥＰＩ及びＰＥＰＪタンパク質を産生するために使用される。 9.A．niger prt突然変異体における残余メタロプロテアーゼ活性 Van den Hombergh et al．(1995)は、少なくとも７種類の相補グループを含む一連のプロテアーゼ欠損(prt)変異体の単離及び精製について報告した。全てのp rt相補グループは、低下した細胞外タンパク質分解活性を与え、タンパク質分解性の分解を受けやすいタンパク質について、低下したタンパク質分解をインビトロで試験を行った。これらのprt変異体における残余タンパク質分解スペクトルは、コムギのふすまを使用したプロテアーゼ発現に誘導された培地中において特定のプロテアーゼ酵素アッセイを用いて、特性決定された。メタロプロテアーゼの特定の抑制剤(ＥＤＴＡ及び1,10フェナントロリン)を共同して用いる酵素アッセイは、透明な培養上澄み液中に、野生型Ｎ400と比較して、プロテアーゼ変異体ＮＷ228(bioＡ1，prtＦ28)，ＮＷ229（bioＡ1，prtＦ29）及びＮＷ232(bioＡ1 ，prtＤ32)の上昇したＥＤＴＡ及び1,10フェナントロリン抑制活性を示す。 van den Hombergh et al．(1995)に報告されたようにインビトロ分解実験を、 prtＦ28プロテアーゼ（株ＮＷ228)変異体及びその親野生株(Ｎ573; bioＡ1)を用いて、ＥＤＴＡ及び1,10フェナントロリンの存在下または非存在下において繰り返し、メタロプロテアーゼ活性を抑制した。両Ｎ573及びＮＷ228中において、精製したＰＥＬＢタンパク質（タンパク分解性の分解の受けやすさに起因して、テスタータンパク質として使用される)の分解の低下をこれらの抑制剤存在下において観察する。 9.1pepＨ分裂構築物の構築 A.niger pepＨ中のＨＥＹＴＨＧコーディング配列は、EcoRI制限サイト(ＧＡＡＴＴＣ)に類似する配列GAATaCを有する。”変異(altered)サイトIIインビトロ突然変異システム”（Promega)を用いて、GAATaC配列をＧＡＡＴＴＣに変化させ、Zn²⁺イオンの結合に関連するＰＥＰＨ活性サイト領域内にあるEcoRIサイトを生成させる。この内部EcoRIサイトを生成させた後、10kb EcoRIフラグメントをE coRIで消化して、二つの(2.5及び7.5kb)EcoRIフラグメントを得る。7.5kb EcoRI フラグメントをpUC18(EcoRIにより線状化されたもの)中にクローン化し、正しい位置(orientation)にEcoRI挿入物を含むプラスミドを選択して、pIM676-3'と命名した。プラスミドpIM676-3'をXbaIにより消化し、6.3 kb XbaIフラグメント（ pepＨの左フランキング領域を含む)を単離した。プラスミドpIJ16(A．nidulans argＢ遺伝子(Johnstone et al.,1985)を含む) をBamHIにより消化し、特定のプライマーを用いてこのBamHIサイトをNotIサイトに変換し、プラスミドpIJ16-Notを作製する。プラスミドpIJ16-NotをPstIを用いて消化し、特定のプライマーを用いてPstIサイトをXbaIサイトに変換し、プラスミドpIJ16-NotXbaを得る。プラスミドpIJ16-NotXbaをEcoRIを用いて線状化し、E coRIフラグメントを含む最初の10kbのpepＨから得られた2.5kbのEcoRIフラグメントをその中にクローンした。得られたプラスミドのEcoRI挿入物の位置について分析を行い、正しい位置のプラスミドをpIM676-5'-disと命名した。pIM676-5' -disを XbaIを用いて線状化し、プラスミドpIM676-3'由来の6.3kbフラグメントをその中にクローンした。pIM676-disはオリジナル10kb EcoRI pepＨ含有フラグメント由来の8.8kbを有し、その中へ、ＨＥＹＴＨＧコーディング配列中の導入されたEco RIサイトにおいて、A.nidulans argＢ遺伝子が挿入される。pIM676-disのNotI及びXbaIによる消化は11.5kbの線状分裂フラグメントを生成する。この分裂フラグメントは、一段階遺伝子‐分裂構築物として機能することが示される。線状フラグメントは、A．nigerへの形質転換及び相同性pepＨ遺伝子座の二重交差発生の後、pepＨ分裂株を与える。 9.2A.niger.の形質転換 A．niger pepＨ遺伝子の分裂構築物をA．niger株ＮＷ205(cspＡ1,argＢ13,pyr Ａ6,nicＡ1)及び株ＮＷ155(cspＡ1,argＢ13,pyrＡ6,prtＦ28,nicＡ1)中で形質転換する。アルギニン原栄養性形質転換体を選択し、精製した。 9.3遺伝子分裂の同定ＤＮＡを精製した形質転換体から単離し、特定のpepＨ及びA.nidulans argＢプローブを用いてサザーン分析により分析し、相同性(pepＨ)遺伝子座における分裂構築物の二重交差組込みを同定し、このようにpepＨ遺伝子を分裂する。選択した分裂物をプロテアーゼ発現に対して最適化された培地上で(van den H ombergh et al.，1995の記載に従い)生育し、特定の酵素アッセイ及びインビトロ分裂アッセイにより分析を行い、pepＨ遺伝子が分裂を受けていない株と比較した場合、細胞外ＥＤＴＡ-及び1,10フェナントロリン抑制可能活性の低下を明らかにし、かつインビトロＰＥＬＢ分裂の低下を明らかにする。 10.A．nidulansにおけるメタロプロテアーゼ活性 A．nidulans野生型株ＷＧ096を0.5ｇ MgSO₄、1.5ｇＫＨ₂ＰＯ₄、0.5g KCI、微量の元素(Vishniac及びSanter，1957)、1％(w/v)ＢＳＡ(Boehringer、フラクションＶ)及び1％(w/v)エラスチン(Fluka)を含む液体培地上で、72時間、37℃にて生育を行う。透明な培養上澄み液のタンパク質分解活性をvan denHombergh et al．(1995)に記載されるように、ＢＳＡ(フラクションＶ)を基質として用い、1 ,10フェナントロリンをメタロプロテアーゼ活性の特定抑制剤として使用して測定した。A．nidulans野生型培養上澄み液中の非抑制及び抑制プロテアーゼ活性の比較から、メタロプロテアーゼ活性の存在が示される。 11.A．nidulansメタロプロテアーゼ遺伝子の分裂 11.1A．nidulans pepＩ分裂構築物の構築プラスミドpIJ16(A．nidulans argＢ遺伝子を含む(Johnstone et al.，1985) )をPstIを用いて線状化する。特定の制限サイトXhoI及びPstIを含むプライマーを、線状化したpIJ16中に結紮し、プラスミドｐIJ16-Xhoを作製する。プラスミドpIM668をEcoRIを用いて消化を行い、2.0kb EcoRI挿入物を単離する。プラスミドpIJ16‐XhoIをEcoRIを用いて消化を行い、2.0kbのEcoRIフラグメント(プラスミドpIM６６８から得る)をそのプラスミド中へ結紮し、プラスミドpIM668-5'dis を得る。pIM668-5'dis中の2.0kb挿入物の位置の分析に基づいて、該2.0kbのフラグメントが正しい位置に挿入されたpIM668-5'プラスミドを選択し、次にPstIを用いて消化する。プラスミドｐIM667をPstIを用いて消化し、kb PstIフラグメントを単離する。このPstIフラグメントをプラスミドpIM668-5'dis中へ結紮したpI M668-disを作製する。プラスミドpIM668-disにおいて、その内部EcoRI-PstIフラグメント(ＰＥＰＩプロテアーゼの部分をコードする)をA．nidulans argＢ遺伝子により置換を行い、このようにして不活性A.nidulans pepＩ遺伝子を生成する。XhoI及びBamHIを用いた制限酵素消化は2.7kbベクター配列を除去し、線状分裂フラグメントを与える。この分裂フラグメント(一段階遺伝子‐分裂構築物として機能するようにデザインされた)は、A．nidulansへの形質転換において、及び相同性pepI遺伝子座における二重交差発生後において、pepI分裂株を与える。 11.2A.nidulans pepI分裂構築物の構築プラスミドpIM669をEcoRV及びSmaIを用いて消化し（ポリリンカーPstIサイトを除去する)、9.5kbフラグメントを単離する。このフラグメントのバックリゲーション(backIigation)の後、プラスミドpIM669-Pstを産生する。プラスミドpIM6 69-dPstをPstI及びBamHIを用いて制限消化し、完全pepIコーディング領域を除去する。プラスミドpIJ16(Johnstone et al.，1985)から、A．nidulans argＢ遺伝子を含む2.7kb BamHI-PstIフラグメントを単離する。フラグメントを含むこのar gＢをPstI-BamHI内に結紮した後、消化したpIM669-dPst，プラスミドpIM669-dis を得る。XhoI及びEcoRIを用いた制限酵素消化により3.0kb pBluescriptベクター配列を除去し、直線分裂フラグメントを得る。この分裂フラグメント(一段階遺伝子‐分裂構築物として機能するように設計された)は、A．nidulans pepＪ遺伝子の5'及び3'フランキング領域間に挿入されたA．nidulans argＢ遺伝子を含む。この線状フラグメントを、A．nidulansへ形質転換し、及び相同性pepＪ遺伝子座における二重交差発生後にpepJ分裂株を得る。微生物寄託プラスミドpIM676、pIM667、pIM668及びpIM669を含むE.coli株を、1996年6月5 日、Centraal Bureau voor Schimmelcultures(Baarn，Netherlands)にブダペスト条約に基づいて、受託番号ＣＢＳ 619.96、ＣＢＳ 620,96、ＣＢＳ 621.96及び622.96としてそれぞれ寄託を行った。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】 1.プロテアーゼ欠損糸状菌であって、低下したメタロプロテアーゼ活性を有する糸状菌を与えるサイト選択的ＤＮＡ分裂を含むことを特徴とする、上記糸状菌。 2.該糸状菌がタンパク質の工業的生産に適するものである、請求項1に記載の糸状菌。 3.該真菌が低下した細胞外酸プロテアーゼ活性を有することをさらに特徴とする、請求項2に記載の糸状菌。 4.該糸状菌がAspergillus属に属することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の糸状菌。 5.該糸状菌がAspergillus nigerグループ、Aspergillus nidulansグループ及びA spergillus flavusグループからなる群から選択される、請求項4に記載の糸状菌。 6.該低下した細胞外酸プロテアーゼ活性が、pepＡ、pepＢ、pepＣ、pepＤ、pep Ｅ、pepＦ、cpy及びprtＡからなる群から選択される遺伝子によりコードされる遺伝子生産物の低下した活性の結果である、請求項3〜5のいずれか一項に記載の化合物。 7.該低下した細胞外酸プロテアーゼ活性がprt突然変異の結果である、請求項3〜 5のいずれか一項に記載の糸状菌。 8.該低下したメタロプロテアーゼ活性が、以下のものからなる群から選択されるメタロプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列のサイト選択的分裂の結果である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の糸状菌: a)pepＨ,pepＩ,及びpepＪ;及び b)部分a)のＤＮＡ配列の遺伝学的変異体;及び c)上記部分a)及びb)の配列の一種とハイブリダイズ可能なＤＮＡ配列。 9.糸状菌から得ることができ、かつ以下のものからなる群から選択される、メタロプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ配列: a)配列番号:Ｘに示されるAspergillus nigerのpepＨ遺伝子のＤＮＡ配列;及び b)部分a)のＤＮＡ配列の遺伝学的変異体;及び c)上記部分a)及びb)の配列の一種とハイブリダイズ可能なＤＮＡ配列。 10.糸状菌から得ることができ、かつ以下のものからなる群から選択される、メタロプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ配列: a)配列番号:Ｘ及び配列番号:Ｘにそれぞれ示されるAspergillus nidulansのpep Ｉ及びpepＪ遺伝子のＤＮＡ配列;及び b)部分a)のＤＮＡ配列の遺伝学的変異体;及び c)上記部分a)及びb)の配列の一種とハイブリダイズ可能なＤＮＡ配列。 11.請求項7または8に記載のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物。 12.該ＤＮＡ配列が、活性メタロプロテアーゼをコードすることができないＤＮＡ配列を与える分裂物を含む、請求項11に記載のＤＮＡ構築物。 13.以下の工程を含む、メタロプロテアーゼ欠損糸状菌を製造するプロセス: a)請求項12に記載のＤＮＡ構築物を含む糸状菌変異体を形質転換する;及び b)低下したメタロプロテアーゼ活性を有する形質転換された糸状菌を選択する。 14.該ＤＮＡ配列が糸状菌宿主のＤＮＡ配列の発現に適する調節領域に操作可能なように結合する、請求項11に記載のＤＮＡ構築物。 15.請求項14に記載のＤＮＡ構築物を含む糸状菌。 16.以下の工程を含む、糸状菌メタロプロテアーゼを製造するプロセス: a)請求項15に記載の糸状菌をＤＮＡ配列の発現が行える条件下において培養し、及び b)メタロプロテアーゼを回収する。