JPH03108487A - ペクチンリアーゼ発現系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は遺伝子工学の分野に関し、そしてアスペルギル
ス・ニガー（匙月月山四用　１■」）の幾つかのペクチ
ンリアーゼをコードするＤＮＡ配列及び／又はそのプロ
モーター、シグナル及びターミネータ−配列を含んで成
る新規なりＮＡ分子を提供する。この新規なりＮＡ分子
は、アスペルギルス（八ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）におけ
るペクチンリアーゼの過剰生産のため、及び／又は糸状
真菌及び他の真菌において外来遺伝子を発現せしめるハ
イブリドベクターの作製のために有用である。今や、他
のペクチンリアーゼが夾雑していない単一ペタチンリア
ーゼを製造することが可能である。

（従来の技術〕 遺伝子工学技術において原核性及び真核性宿主のための
多くのポリペプチド発現系が知られているが、既知の系
に比べて有利な新規な系の必要性が常に存在する。

原核性大腸菌（Ｅｓｃ１１６ｒ　ｉｃｈ　ｉａ匹旦）宿
主及び真核性酵母宿主、例えばサツカロミセス・セレビ
シェ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）が非常に広範に使用されており、これらのため
の非常に多数の異る発現バイブリド系、はとんどの場合
プラスミド、が開発されている。大腸菌宿主の欠点は、
それらが、生成したポリペプチドをグリコジル化するこ
とができないこと、及び分泌の欠如のために外来ペプチ
ドが宿主細胞内に蓄積しそして更なる増殖を妨害するこ
とである。酵母宿主はグリコジル化を行うが、しかしな
がら大腸菌と同様に、それらはポリペプチドを極少量し
た培地中に分泌しない。酵母はべりブラズム空間にのみ
分泌を行う。

高等真核性宿主は哺乳類癌細胞であり、これはグリコジ
ル化及び培地中への分泌を行うことができるが、しかし
ながらその培養は非常に緩慢でありそして高価であり、
さらに発癌性遺伝子が目的ペプチドと一緒に単離され目
的ポリペプチドから発癌性遺伝子を除去できない危険性
がある。

他の宿主の必要性のため、さらに糸状真菌、例えばニュ
ーロスポラ・クラッサ（籾肛並匹胆ｃｒａｓｓａ）　、
アスペルギルス・ニドランス（ハ匹り紅旦旦ｎ１ｄｕｌ
ａｎｓ）　及ヒアスベルギルス・ニガー（匙Ｂコ匡■弛
　恒１虹）が研究されている。これらの真菌類はすでに
広く工業的目的のために知られているが、しかしながら
主として適切な形質転換系が存在しないため、遺伝子工
学技術におけるそれらの用途は遅れたままである。サツ
カロミセス・セレビシェ−とは異り、糸状真菌は外来遺
伝子の導入及び表現型選択のために使用し得るプラスミ
ドを含有しない。しかしながら、糸状真菌を選択マーカ
ー遺伝子を含有する外来プラスミドにより形質転換する
ことが可能である。糸状真菌のために今まで記載されて
いるすべてのベクターは、酵母用ベクターとは異って自
律複製せず、真菌染色体に組み込まれる。この現象は非
常に低頻度においてのみ起こる。他方、有利なことには
、組込み（ｉｎ　ｔｅｇｒａ　ｔｉｖｅ）形質転換は非
選択的条件下においてさえ形質転換体を有糸分裂的に非
常に安定なものとする。１００コピーを超える安定な組
込みが報告されている。

糸状真菌のための最初に記載されたベクターは選択マー
カーとしてニューロスポラ・クラッサのｑａ−２遺伝子
を含有していた。この遺伝子は酵素力タボリック・デヒ
ドロキナーゼをコードしており、そしてＮ、クラソサの
ａｒｏ変異株の機能的補完のために使用することができ
る（Ｃａｓｅ、　Ｍ、Ｈ。

Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ、　Ｍ、、　Ｋｏｓｈｎｅｒ、　Ｓ
、Ｒ，及びＧ１１ｅｓ、　Ｎ、ｌＩ。

（Ｉ９７９）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、　ＵＳＡ　７６、５２５９−５２６３　）。ａｒｏ
変異株は芳香族アミノ酸の補完を伴わない最少培地上で
増殖することができない。

このｑａ−２ベクターによるＮ、クラッサの形質転換は
染色体への該プラスミドの単一コピーの組込みにより起
った。安定な組込体（ｉ　ｎ　Ｌｅｇｒａｎ　ｔ）の３
０％が組込まれたｑａ−２遺伝子を細菌プラスミド配列
になおリンクしたままに保持した（Ｃａｓｅ、　Ｍ、Ｅ
。

（Ｉ９８２）、　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｆｏｒ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ　（ｌｌｏｌｌａｎｄｅｒ、　Ａ、、
　ＤｅＭｏｓｓ、　ＤｌＫａｐｌａｎ、　Ｓ、＋　Ｋｏ
ｎｉｓｋｙ＋　Ｊ、、　Ｓａｖａｇｅ、　Ｄ、及びＷｏ
ｌｆｅ＋１１．３．ｉ集）　、８７−１００頁、Ｐｌｅ
ｎｏｍ）　ａ　この観察は選択配列を伴う非−選択性Ｄ
ＮＡ配列の同時形質転換（ｃｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎ）を実行可能な課題にした。

性周期を有しそしてそれ故に古典的な遺伝操作が可能な
アスペルギルス・ニドランスにおいて、負の選択系及び
正の選択系の両者が同定されている。Ｎ、クラッサから
の異種性ＤＮＡ又は同種性ＤＮＡを用いて、ｄ遺伝子を
含有するプラスミドを用いる形質転換によるＡ、ニドラ
ンスｍ−変種株の機能的補完が得られた（Ｂａｌｌａｎ
ｃｅ等、ＢＢＲＣ１１２，２８４，１９８３；　Ｔｉ１
ｂｕｒｎ等、Ｇｅｎｅ　２６．２０５゜１９８３）。他
の系において、厚又は鉦訃座における変異が適切なプラ
スミドによる形質転換によって機能的に補完された（Ｙ
ｅｌｔｏｎ等、ＰＮＡＳ　ｌ、　１４７０゜１９８４；
　Ｙｅｌｔｏｎ　ｅｔ　Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ、　Ｊ、
Ｃｅ１１．Ｂｉｏｃｈｅｍ。

５ｕｐｐ１．９ＣＩ？３．１９８５；　Ｊｏｈｎｓｔｏ
ｎｅ等、ＥＭＢＯＪ、土。

１３０７、１９８３）。

優性正選択系もまた、Ａ、ニドランスから単離されたａ
ｍｄＳ遺伝子（これにより形質転換されたＡ。

ニガーは唯一の窒素源としてのアセトアミド上で増殖す
ることが可能となる）を用いて開発されている（Ｔｉｌ
ｂｕｒｎ等、Ｇｅｎｅ　２６．２０５．１９８３；　Ｗ
ｅｒｎａｒｓ等、Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、　９＋　３６
１．１９８５；　Ｋｅｌｌｙ、　Ｊ、Ｍ、等、ＥＭＢＯ
Ｊ、　　４．４７５．１９８５）。

Ｎ、クラッサ又はＡ、ニドランスに比較して、Ａ、ニガ
ーは一層重要な生物である。これは、例えば食品工業で
使用するための酵素の製造において広く使用されている
。Ａ、ニガーは、それが種々の加水分解酵素、例えばグ
ルコアミラーゼ、αアミラーゼ、ペクチナーゼ、セルラ
ーゼ、β−グルカナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ナリ
ンジナーゼ、ベントサナーゼ、酸性プロテアーゼ及びリ
グナーゼ（グルコアミラーゼ及びペクチナーゼ複合体が
最も重要な酵素である）を分泌する点において、その分
泌能力によりＡ、ニドランスと異る。

Ａ、ニガーでは性周期が知られていない。従って、減数
分裂組換えによって変異を導入することはできない。し
かしながら、古典的な変異及び選択法により加水分解酵
素の分泌における高度な菌株の改良が達成されている。

Ａ、ニガーの酵素の遺伝子の内、プロモーター及びシグ
ナル配列を伴うアルコール及びアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼ（Ｗｏ　８６１０６０９７）並びにグルコアミラー
ゼ（Ｂｏｅｌ等、ＥＨＢ（Ｉ　Ｊ、　３．１５８１．１
９８４）の遺伝子のみが特徴付けられており、そしてそ
れぞれＡ、ニガー及びＡ、ニドランスを用いる形質転換
実験において使用されている。

Ａ、ニガーのための選択マーカーとして、いずれもＡ、
ニドランスから得られる異種性ａｍｄｓ遺伝子（Ｋｅｌ
ｌｙ及びＨｙｎｅｓ、　ＥＭＢＯ３，４、４７５，１９
８５）及び肛飢遺伝子（Ｂｕｘｔｏｎ等、Ｇｅｎｅ　３
７．２０７．１９８５；　ＥＰ１８４４３８；　Ｗｏ　
８６１０６０９７）が使用されている。

Ａ、ニガーは、ペクチン分解酵素の工業的製造のために
最も重要な生物である。ペクチンは、α−１，４−グリ
コシド結合したＤ−ガラクチュロン酸ポリマーから成る
高分子量（２００００〜４００００　Ｄ）のポリガラク
チュロニドであり、そして高等植物細胞の構成成分とし
て天然に存在し、そこでそれらはセルロース分子に結合
しておりそして主として一次細胞壁（ｐｒｉｍａｒｙ　
ｃｅｌｌ　ｗａｌｌ）及び中間ラメラ（ｍｉｄｄｌｅ　
ｌａｍｅｌｌａ）中に存在する。最も豊富なペクチン源
はレモン及びオレンジの外皮であり、これらは約３０％
の該ポリサッカライドを含有する。

ペクチン分解酵素（ｐｅｃｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅ）はこ
の炭水化物ポリマー基質をα−１，４−グリコシド結合
の加水分解により（ポリガラクチュロナーゼ）又はペク
チン分子からのα−４，５不飽和ガラクチユロン酸残基
のトランスエリミネーションにより（種々のペクチンリ
アーゼ）分解する。ペクチンリアーゼの組織的名称はペ
クチントランスエリミナーゼ（ＥＣ４，２，２，１０）
である。

Ａ、ニガーにおいては、ペクチン分解複合体の蛋白質は
構成的には発現されない。ペクチン又はその分解生成物
を用いる誘導条件下で、他の炭素源、例えばグルコース
又はシュークロースが制限される場合、Ａ、ニガーはＰ
ＬＩを包含する上記の酵素を発現する。表面培養におい
て、ペクチン分解酵素は外細胞壁に結合したままである
傾向を有する。培地中のペクチン及びＣａ”　６度の増
加が完全な分泌を導く。

ＰＬＩのごときペクチナーゼは食品工業により、主とし
て果汁の清澄化のために使用される。

Ｆ、Ｅ、Ａ　Ｖａｎ　Ｈｏｕｄｅｎｈｏｖｅｎ（２２）
により、Ａ、ニガーから２種類の異るペクチンリアーゼ
ＰＬＩ及びＰ　１．、　ＩＩが精製されそして部分的に
特徴付けられている。ＰＬｒはマンノースの４個の残基
を含有し、他方ＰＬＩＩはそれぞれマンノース及びグル
コースの２個ずつの残基を含有する。これらの酵素は異
る分子量（ＰＬ　Ｉ　：　３７．５ｋＤ、　ＰＬＩＩ　
：　３６ｋＤ）を有する。

ＥＰ　８８１０１３９７．３においてＰＬＩのアミノ酸
配列が決定されそして開示されている。本発明は、該蛋
白質の適切な部分をコードするＤＮＡプローブの合成を
可能にするペクチンリアーゼＩ（ＰＬＩ）の部分的構造
決定に基いている。ＤＮＡプローブを用いることにより
、Ａ、ニガーの遺伝子ライブラリーから、最終的にはプ
レ配列及びプロ配列と共に、ＰＬＩをコードするＤＮＡ
をスクリーニングしそして単離することが可能であった
。

Ａ、ニガーのゲノムライブラリーへのｐＨｌｌ伝子の部
分のハイブリダイゼーションにより、本発明の対象であ
る更なるＰＬ遺伝子が検出された。

Ａ、ニガーＮ５７６から得られたＮ−末端フランキング
領域を伴うＰＬＩ構造遺伝子はそのＮ−末端において、
Ａ、ニガーＮ４００から得られたＰＬＤ遺伝子と同じで
ある。従って、後者は本発明の部分ではない。本発明の
ＰＬＡは、すでに精製されているＰＬＩＩと称するＰＬ
混合物の一部分のようである。

以後、Ｐ　Ｌ　ＩはＰＬＤとも称し、そしてＰＬＩ構造
遺伝子を凪りと称する。

〔本発明の対象］ 本発明の対象は、新規なペクチンリアーゼ発現系及びそ
の誘導体をコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換ＤＮ
Ａ分子、例えば前記ペクチンリアーゼの構造遺伝子並び
に対応する制御配列、例えばプロモーター、シグナル及
びターミネータ−配列、並びに対応するＤＮＡを含んで
成るハイブリドベクター、例えば同種性又は異種性ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを含むハイブリドベクター
該ヘクターにより形質転換されＤＮＡ配列、特に糸状真
菌宿主、例えばアスペルギルス宿主、該組換ＤＮＡ分子
及び該宿主の製造方法、並びに新規発現系の製造のため
の組換ＤＮＡ分子の使用である。

他の対象は前記ＤＮＡ及び前記宿主によるポリペプチド
の製造である。

新規なペクチンリアーゼ発現系は前記新規なペクチンリ
アーゼ遺伝子のプロモーター、シグナル配列、構造遺伝
子及びターミネーター、をコートするＤＮＡ配列を含ん
で成る。この新規なペクチンリアーゼはＰＬＡ、　ＰＬ
Ｂ、　ＰＬＣ，ＰＬＥ及びＰＬＦ　と称される。

さらに詳しくは、本発明の１つの対象は、ＰＬＡ。

ＰＬＢ、　ＰＬＣ，ＰＬＥ及びＰＬＦのプロモーター、
場合によってはこれらの蛋白質のシグナル配列並びに場
合によってはこれらのターミネータ−１をコードするＤ
ＮＡ配列を含んで成るハイブリドベクターの作製である
。これらのハイブリドベクターは特定の蛋白質をコード
する遺伝子の導入のため、並びに糸状真菌、例えばアス
ペルギルス、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）
及びセファロスポリウム（江匝旺並匹丘二）の形質転換
のために使用される。

２種類の異るプラスミドによるＡ、ニガーの同時形質転
換を行うことができ、この場合プラスミドの一方は本発
明の新規なハイブリドベクターの群から選択され、そし
て他の一つは糸状真菌の変異した株と関連して機能する
特に構成された選択プラスミドである。

本発明はまた、アスペルギルスの種における前記新規ペ
クチンリアーゼの過剰生産（０νｅｒｐｒｏｄｕｃＬｉ
ｏｎ）　、及び他のＰＬ、を夾雑しない単一ＰＬ。

又はこれらの所望の人為的混合物の製造に関する。

本発明はさらに、本発明の組換ＰＬ　ＤＮＡの存在下又
はその制御のもとてその構造遺伝子が発現され得る任意
の蛋白質の製造に関する。

本発明の種々の対象は、本発明の以後の詳細な説明によ
り明らかになろう。

〔具体的な記載〕

■良旦凡へ芳ヱ さらに詳しくは、本発明はペクチンリアーゼＰＬＡ　　
ＰＬＢ　　ＰＬＣ，ＰＬＥ又はＰＬＦの発現系又はその
誘導体をコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換ＤＮＡ
分子に関する。

「発現系」なる用語は、ポリペプチドを発現することが
できそしてプロモーター、シグナル配列、構造遺伝子及
びターミネータ−を含んで成るＤＮＡ分子を意味する。

「誘導体」なる語は、新規なりＮＡ配列について使用す
る場合、フランキング配列を含有するより大きな誘導体
、該ＤＮＡ配列の断片、変異体、が意図される。

新規な組換ＤＮＡ分子の大きな誘導体はＡ、ニガーのゲ
ノムから切り出すことができそして第１図〜第３図、第
５図及び第６図に与えられたＤＮＡ配列を含んで成り、
例えば、核酸の断片化、該断片の適当な制限酵素、例え
ばＥｃｏＲＩ　、　ＢａｍＨＩ又は１ｌｉｎｄｌｌＩに
よる処理、適当なベクター、例えばλファージ及びｐＢ
Ｒ３２２への連結、例えば大腸菌へのクローニング、及
び同じ制限酵素による再度の切り出しにより得られたＡ
、ニガーＮ４００のゲノムライブラリー中に見出すこと
ができるものである。

この様な誘導体は例えば第１図、第２図、第３図、第４
図、第５図及び第６図に示すプラスミドｐＧＷ８２０．
　ｐＧＷ８３０．　ｐＧＷ８４０．　ｐＧＷ８５０．　
ｐＧＷ８６Ｑ及びｐＧＷ８８０の挿入部である。

式（■）（第９図）のＤＮＡ配列の断片はこれらのプラ
スミドの２個の制限部位間に延び、そしてプロモーター
、シグナル、構造及びターミネータ−機能を維持してい
るものである。

好ましい断片は、プロモーター配列、シグナル配列、新
規ＰＬの構造遺伝子又はターミネータ−配列、あるいは
これらの組み合わせを含むものである。

ＤＮＡ配列の断片は他のＤＮＡ分子への好結果の連結を
もたらすリンカ−を含有することができる。

ＰＬプロモーター配列は構造遺伝子の前のＤＮＡ領域に
含まれ、そして約２０００まで、好ましくは１０００−
１４０００までのヌクレオチドを含んで成る。

ｐＧＷ８２０中でプロモーターはＳａｌ　Ｉ　（Ｉ２４
０）及びＰ　ｓｔ　Ｉ　（２４２０）制限部位間の配列
上に位置する。プロモーター配列のために、ＴＡＴＡＡ
ボックスがＲＮＡポリメラーゼ認識部位として重要であ
る。止佳Ａ上でＴＡＴＡＡボックスは１２２１位（第１
０図）に、爪Ｂ上で９５１位（第１１図）に、そして正
性Ｃ上で１２６１位（第１２図）に位置する。ＴＡＴＡ
Ａボックスの近くからシグナル配列の開始までの短いプ
ロモーターがポリペプチドの非誘導発現のために特に興
味深い。ペクチンにより誘導される発蛸しく必要であれ
ば、プロモーターの強さを制御するためにＴＡＴＡＡボ
ックスの上流の配列が必要である。これらの配列に適当
なリンカ−を付加することができる。

Ａ、ニガーのＰＬＩのプロモーターは誘導性である。す
なわち、それに付加された構造遺伝子、例えばＰＬをコ
ードする構造遺伝子又は任意の外来遺伝子の発現は培地
へのペクチン又はペクチン分解生成物の添加により誘導
される。ペクチンの非存在下及び十分なグルコースの存
在下ではこのプロモーターは機能しない。上流の制御配
列が存在しなければこのプロモーターは構成的となる。

シグナル配列をコードするＤＮＡはプロモーターの末端
と成熟蛋白質のコード配列の始まりの間に延びる。ＰＬ
Ａ及びＰＬＢにおいてシグナル配列は約２０アミノ酸を
含有し、ＬｉＣにおいて約１８アミノ酸を含有する。対
応するコード領域はＰｉＬＡにおいて１３１位のＡＴＧ
コドンがら１０００位のＰｓｔｌ開裂部位に延び、ルｄ
Ｂにおいて１１３４位から少なくとも１１９１位に延び
、そしてＰ壮Ｃにおいて１３６８位から１４２２位に延
びる。

式（Ｉ）、　（ｎ）及び（ＩＩＩ）から明らかなように
、ＰＬＡ、　ＰＬＢ及びＰＬＣの構造遺伝子は幾つかの
イントロンを含有する。さらに、構造遺伝子は適当なリ
ンカ−を含有することができる。

ターミネータ−は終止コドン、例えばＴＡＡがら始まり
、そして前記配列中の制限部位の１つにまで延びること
ができる。ターミネータ−断片は少なくとも３００ｂｐ
を含有し、そして適当なリンカ−を含有することができ
る。

上記断片への適当なリンカ−は、該断片が連結されるべ
きＤＮＡの制限部位に適合するＤＮＡ配列を有する。こ
れらはあらかじめ定められた制限部位を含有することが
できる。

本発明のＤＮＡ配列の断片はまたより小さい断片から成
るもの、例えばプロモーター、プロモーターヒシグ″ｆ
、Ｌｉ）シ＜は構造配列、ジグプールと構造配列、又は
イントロンを含まない構造遺伝子等、を含有するもので
ある。

本発明のＤＮＡ配列の変異体は例えば自然に生ずる変異
体である。本発明はさらに、類似の又は同一の疎水性プ
ロフィールを有するシグナル配列の自然変異体又は合成
変異体、例えば極性アミノ酸であるリジン（Ｋδ°）、
チロシン（Ｙδ−）及びアルギニン（Ｒσ゛）のコドン
が類似の電荷を有する他のアミノ酸のコドンにより交換
されており、そして疎水性アミノ酸アラニン（Ａ）、ロ
イシン（Ｌ）及びスレオニン（Ｔ）が他の疎水性アミノ
酸のコドンにより置き換えられているものを包含する。

例えば、正に荷電したリジンのコドンをアルギニンのコ
ドンで置き換えることができそしてこの逆も可能であり
、負に荷電したチロシンのコドンをグルタミン酸又はア
スパラギン酸のコドンにより置き換えることができ、そ
して／又は非極性疎水性のアラニンのコドンを、スレオ
ニン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メ
チオニン又はフェニルアラニンのコドンのいずれが１つ
により置き換えることができる、等である。

他の変異は「サイレント変異」であり、この場合１個又
は少数個の、例えば約３０個までのヌクレオチドが１個
又は複数個の他のヌクレオチドに置き換えられており、
新たなコドンは同じアミノ酸をコードしている。

縮重している本発明のＤＮＡ配列は、サイレント変異と
類似しており、無制限の数のヌクレオチドが他のヌクレ
オチドにより置き換えられていてそれらがコードしてい
るアミノ酸配列の変化を伴わないという意味において遺
伝子コードの意味内で縮重しているものである。このよ
うな縮重ＤＮＡ配列は、それらの制限部位が異る故に有
用である。

本発明のＤＮＡ配列又はその誘導体を含んで成る組換え
ＤＮＡ分子は特に組換ベクター、あるいはこの様なりＮ
Ａ配列を挿入部として含有するいわゆるハイブリドベク
ターである。これらは宿主、例えば細菌、真菌又は動物
細胞でのクローニングのために使用できる。この様なハ
イブリドベクターは遺伝子工学の分野において有用な任
意のベクター、例えばファージ、コスミド、プラスミド
又は染色体ＤＮＡに由来し、例えばファージλの誘導体
、例えばＮＭ９８９、又はファージＭ１３の誘導体、飼
犬ばＢａｍＨＩ消化により線状化されたＭ１３ｍρ８フ
ァージＤＮＡ　（参考文献１５）、細菌プラスミド、例
えばｐＢＲ３３２，ｐＵＮ１２１．　ｐＨｃ１８　、又
は酵母プラスミド、例えば酵母２μプラスミド、又はさ
らに、例えばアスペルギルスから、例えばＡ、ニガーに
由来する染色体ＤＮＡ、例えばＥＰ　１８４４３８によ
り提供されるもの、あるいは欠陥ファージ又はプラスミ
ドの複製を可能にするヘルパーファージ又はヘルパープ
ラスミドの存在下での欠陥ファージ又は欠陥プラスミド
、例えば、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーフアージの存在下での
Ｍ１３（＋）ＫＳベクターである。

本発明のハイブリドベクターは本発明のＤＮＡ配列又は
その誘導体に加えて複製部位、及び場合によってはＤＮ
Ａ誘導体のタイプに依存して、発現制御配列、例えばエ
ンハンサ−配列、上流活性化部位、プロモーター及びシ
グナル配列及び／又は構造遺伝子であって対応するＡ、
ニガー由来配列とは異るものを含有する。この様なエン
ハンサ−配列はフィザルム・ポリセファルム（ハ■肛堕
止ＩＴ四且１□匡りの染色体外リボゾームＤＮＡから誘
導することができ（ＰＣＴ／ＥＰ　８５００２７８）　
、あるいはこれは酸性スホファターゼＰＨ０５遺伝子（
ＥＰ出願Ｎ（Ｉ８６１１１８２０，６）、又はＰＨ０５
，ｔｒｐ、　ｐＨ０５ＧＡＰＤＩＩバイブリド（ＢＰ出
願Ｎα１１１８２０．６）又は類似のプロモーターから
の上流活性化部位であることができる。

本発明のプロモーター、シグナル及び／又はターミネー
タ−配列に連結される構造遺伝子は、イントロンを含む
か又は含まないペクチンリアーゼＰＬＡ、　ＰＬＢ、　
ＰＬＣ，ＰＬＥ及びＰＬＦをコードする遺伝子のほかに
、さらに同種性の他のペクチンリアーゼ遺伝子、例えば
ＰＬＤ（又はＰＬ　Ｉ）遺伝子、又は他のアスペルギル
ス遺伝子、及び異種性構造遺伝子であり、これらの構造
遺伝子はウィルス、原核細胞又は真核細胞に由来し、そ
してゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡルートを介して調製され
るｃＤＮＡに由来することができあるいは化学的に合成
されてもよく、広範囲の種類の有用なポリペプチド、例
えばグリコジル化されたポリペプチドであって特に高等
真核生物、特に呻乳頚、例えば動物又は特にヒト由来の
もの、例えば栄養の製造のためにそして化学における酵
素を行うために使用することができる酵素又はヒト及び
動物の疾患の治療のためもしくはその予防のため有用で
あり且つ価値があるポリペプチド、例えばホルモン、免
疫調節性、抗ウイルス性又は抗−腫瘍性を存するポリペ
プチド、抗体、ウィルス抗原、ワクチン、凝血因子、食
品等をコードするものである。

この様な異種性構造遺伝子の例は、例えばホルモン、例
えばセクレチン、チモシン、レラキシン、カルシトニン
、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、アドレノコル
チコトロピン、メラノサイト刺激ホルモン、β−リボト
ロピン、ウロガステロン又はインシュリン、増殖因子、
例えば上皮増殖因子、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ
）　、例えばＩＧＦ−１及びＩＧＦ−Ｉｔ、マスト細胞
増殖因子、神経増殖因子、ダリア由来神経細胞増殖因子
、又は形質転換増殖因子（ＴＧＦ）　、例えばＴＧＦβ
、成長ホルモン、例えばヒト又はウシ成長ホルモン、イ
ンターロイキン、例えばインターロイキン−１もしくは
−２、ヒトマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、イ
ンターフェロン、例えばヒトα−インターフェロン、例
エバインターフェロン−αＡ、αＢ。

αＤもしくはαＦ１β−インターフェロン、Ｔインター
フェロン又はバイブリドインターフェロン、例えばαＡ
−αＤ〜もしくはαβ−αＤ−バイブリドインターフェ
ロン、特にバイブリドインターフェロンＢＤＢＢ、プロ
テイナーゼ阻害剤、例えばα、−アンチトリプシン、Ｓ
ＬＰ　Ｉ等、肝炎ウィルス抗原、例えば肝炎Ｂウィルス
表面抗原又はコア抗原、又は肝炎Ａウィルス抗原、又は
肝炎非Ａ−非Ｂ抗原、プラスミノーゲン活性化因子、例
えば組織プラスミノーゲン活性化因子又はウロキナーゼ
、ｌ［！壊死因子、ソマトスタチン、レニン、β−エン
ドルフィン、免疫グロブリン、例えば免疫グロブリンＤ
、Ｅ又はＧの軽鎖及び／又は重鎖、ヒト−マウスバイブ
リド免疫グロブリン、免疫グロブリン結合因子、例えば
免疫グロブリンＥ結合因子、カルシトニン、ヒトカルシ
トニン−関連ペプチド、血液凝固因子、例えばファクタ
ー■又は■０、エリスロボイエチン、ニグリン、例えば
ニグリンＣ、ヒルジン、デスルファトヒルジン、例えば
デスルファトヒルジン変形体ＨＶＩ、　ＨＶ２又はＰＡ
。

ヒトスーパーオキシドディスムターゼ、ウィルスチミジ
ンキナーゼ、β−ラクタマーゼ、グルコースイソメラー
ゼ、をコードする遺伝子である。好ましい遺伝子は、ヒ
トα−インターフェロン又はバイブリドインターフェロ
ン、ヒト組繊プラスミノーゲン活性化因子（Ｌ−ＰＡ）
、肝炎Ｂウィルス表面抗原（ＨＢＶｓＡｇ）、インシュ
リン様増殖因子Ｉ及び■、ニグリンＣ及びデスルファト
ヒルジン、例えば変形体ＨＶＩをコードする遺伝子であ
る。本発明のハイブリドベクターにおいて、存在するプ
ロモーター及び／又はシグナル配列はポリペプチドの効
果的な発現を保証するようにポリペプチドコード配列に
作用可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結される。

本発明のＤＮＡ分子は、形質転換され、選択されそして
クローン化されるべき宿主に依存して選択マーカーを含
有することができる。マーカーの表現型発現に基く形質
転換体の選択を促進する任意のマーカー遺伝子を使用す
ることができる。適当なマーカーは特に、抗生物質耐性
、例えばテトラサイクリン又はアンピシリンに対する耐
性を発現するもの、又は栄養要求酵母変異株の場合には
宿主の欠陥を補完する遺伝子である。対応する遺伝子は
例えば抗生物質シクロヘキシミドに対する耐性を付与し
、又は栄養要求変異株において原栄養性、例えば面、　
皿、　ｈ　ｉ　ｓ　３又はｔｒｐｌ遺伝子を付与する。

形質転換されるべき宿主がマーカーによって発現される
生成物について栄養要求性である場合には、自律複製セ
グメントと関連する構造遺伝子をマーカーとして使用す
ることも可能である。

特に重要なのは、Ａ、ニガー宿主の欠陥を補完するマー
カー遺伝子、例えばＡ、ニガー又はＡ。

−１−）−’ｙンスに由来するオルニチンカルバモイル
トランスフェラーゼをコードするａＵ、Ｂ遺伝子（ＥＰ
１８４３４８）、又はＮ、クラッサ血遺伝子（２６）と
相同なＡ、ニドランスＤＮＡ断片である。

本発明の好ましい態様は、構造遺伝子、特に異種性構造
遺伝子が本発明のプロモーター及びシグナル配列に作用
可能に連結されているハイブリドベクターである。この
様な好ましいハイブリドベクターは例えばｐｌＪｃ１９
／ｐｅｌＡ−ＩＦＮ　ＡＭ１１９である。

他のこの様な好ましいハイブリドベクターは例えばＭ１
３（＋）　ＫＳ／ｐｅｌＡ−ＩＦＮ　ＡＭ１１９である
。

本発明の他の好ましい態様においては、構造遺伝子、特
に異種性構造遺伝子が本発明のプロモーター配列に作用
可能に直接連結されている。この様な好ましいハイブリ
ドベクターは例えばＭ１３（十）ＫＳ／ｐｅｌＡΔ、、
−ＩＦＮ　ＡＭ１１９である。

断片を包含する本発明のＤＮＡ分子及びその誘導体は、
さらなる類似のＤＮＡ又はｍＲＮＡのためにＤＮＡ遺伝
子バンク又はｎ＋ＲＮＡをスクリーニングするために使
用することができる。

、　　ＤＮＡゝ　のＵ　　ゞ 本発明はまた、ペクチンリアーゼＰＬＡ、　ＰＬＢ。

ＰＬＣ，ＰＬＥ又はＰＬＦ発現系又はその誘導体をコー
ドする組換ＤＮＡ分子の調製方法に関し、この方法はペ
クチンリアーゼ発現系又はその誘導体をコードするＤＮ
Ａ配列を含有するＤＮＡ分子により形質転換されＤＮＡ
配列を培養し、そして所望のＤＮＡ分子又はその誘導体
を単離するか、あるいは生体外合成により調製する、こ
とを特徴とする。

宿主の培養は、非−形質転換体すなわち目的のＤＮＡ分
子を欠く宿主からの形質転換体すなわち選択マーカーと
共に目的のＤＮＡ分子を含有する宿主の負の又は正の選
択を可能にするように化学物質が補充されているか又は
除去されている常用の栄養培地中で行われる。

当業界において有用な任意の形質転換可能な宿主、例え
ば細菌、例えば大腸菌、真菌、例えばサツカロミセス・
セレビシェ−１又は特に糸状真菌、例えばアスペルギル
ス、例えばＡ、ニドランス、Ａ、オリゼー（Ａ、　　肛
Ｈ並）、Ａ、カルボナリウス（Ａ、　　ｃａｒｂｏｎａ
ｒｉｕｓ）　、Ａ、アワモリ（Ａ、　　ａｗａ−触ユ）
及び特にＡ、ニガーを使用することができる。好ましい
宿主は、後でさらに記載するように、ハエＡ遺伝子を欠
く新規な変異株であるＡ、ニガーＡｎ８である。宿主の
形質転換は常法に従って行われる。

ＰＬ発現系をコードするＤＮＡ配列はこの様な系を含有
する糸状真菌から、特にゲノムライブラリーから、又は
さらにｍＲＮＡを介して得られる。

次に、本発明のＰＬ発現系の調製をさらに詳細に記載す
る。

ゲノムライブラリーは、Ａ、ニガーの株、例えばＮ７５
６又はＮ４００のゲノムＤＮＡを例えば５ａｕ３Ａ　１
又はＭｂｏｌにより部分消化し、そしてこの高分子量Ｄ
ＮＡ断片を座ｑな宿主ベクター、例えば大腸菌プラスミ
ドｐ（ｌＮ１２１又はλベクター、例えばＥＭＢＬ４中
でクローニングすることにより調製することができる。

目的のＰＬ、を生産する任意の他のＡ２　ニガー株をゲ
ノムライブラリー源として使用することができ、そして
同様に、他の適当なベクターを断片の受容体として使用
することができる。

ＰＬ、をコードするＤＮＡ配列についてゲノムライブラ
リーを好結果にスクリーニングするために、ハイブリダ
イズするＤＮＡプローブが必要である。目的のＰＬの配
列が知られていればこのプローブは合成りＮＡプローブ
であることができ、あるいはこれは既知のＰＬ遺伝子又
はその部分であることができる。ＥＰ　８８１０１３９
７．３に記載されているようにＰＬＩ遺伝子を見出すた
め第一のアプローチが用いられた。本発明においては第
二のアプローチを用いた。ＰＬＩ遺伝子の全ＤＮＡ配列
が入手可能となっているので、完全な遺伝子又は少なく
とも約１４ｂｐを有するその任意の断片をスクリーニン
グのために用いることができ、このスクリーニングには
ＰＬ系をコードするａ＋ＲＮＡのスクリーニングも含ま
れる。

スクリーニング目的のためには、ＤＮＡフ”ローブを当
業界において知られている方法によりＴ　′ＪｚＰＡＴ
Ｐ及びＴ４キナーゼを用いて５′を放射能ラベルする。

挿入部として本発明の核酸を担持する宿主微生物は、遺
伝子ライブラリーのフィルターレプリカ上でのラベルさ
れたＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションにより
同定される。

■又は複数のＤＮＡプローブに対してハイブリダイゼー
ション応答を示すクローンを単離しそして増幅する。

用いるハイブリダイゼーション条件は、例えば単に異る
温度を選択することにより、そしてＰＬＩ　（又はＰＬ
Ｄ）に由来する異るＤＮＡプローブの使用の組み合わせ
により高ストリンジェント又は低ストリンジェントであ
ることができる。例えば、完全な１．６ｋｂｐ　Ｂａｍ
１ｌ　Ｉ　／　Ｐ　ｓｔ　Ｔ断片、６４９ｂｐＢａｍＨ
Ｉ　／　Ｘ　ｈａ　Ｉ断片（Ｎ−末端断片）及び２４４
ｂｐχｈｏ■／ＰｓｔＩ断片（Ｃ−末端断片）　　（ｐ
ｃＧ３Ｂ１１又はｐＧＷａ４ｏ　（第４図）からの〕へ
の種々のハイブリダイゼーション応答を測定することに
より、その相同性の程度に基いて異るクラスに分けるこ
とができる（第２表又は第４表）。５種類のλ−ベクタ
ー（λ−ＰＬ１１３　、　　λ−ＰＬ１２２　、　　λ
−ＰＬ１０９　。

λ−ＰＬ１０２及びλ−ＰＬ１１６）を最終的に同定し
、制限酵素処理し、そしてｐＢＲ３２２中に調製された
これらの−Ｌｋ」−遺伝子のサブクローンがそれぞれプ
ラスミドｐＧＷ８２０．　ｐＧＷ８３０．　ｐＧＷ８５
０．　ｐＧＷ８６０及びｐＧＷｓａｏ　（第１図〜第３
図、第５図及び第６図）を導いた。これらのクローンの
５種類の遺伝子をそれぞれル江ＡＩ　　Ｌ’佳Ｂ、化１
．Ｃ，ル江Ｅ及び止＝ｌＦと称する。

これらの遺伝子を配列決定することができる。

ル佳Ａｌ　　ｕ壮Ｂ及び稈＝ＩＣの全配列を式（Ｉ）、
（ＩＩ）及び（■）（第１０図、第１１図及び第１２図
）に示す。

エクソン／イントロン−スプライス連結部位の共通配列
及びイントロン内部配列のコンピューターサーチ（Ｂｏ
ｅｌ　Ｅ、等、（２４）、及びＭｏｕｎｔ　Ｓ、Ｍ（２
５）　）は、ＰｉＬＤと同様に、シ＝ＩＡ及びル佳Ｂ中
の４個のイントロン（第１０図及び第１１図）、並びに
１Ｃ中の３個のイントロン（第１２図）を予想させる。

プラスミ）−ｐＧＷ８２０．　ｐＧＷ８３０．　ｐＧＷ
８５０．　ｐＧＷ８６０及びｐＧＷｓａｏを用いて本発
明の他の組換ＤＮＡ分子を調製する。この様な他のＤＮ
Ａ分子は常法に従って、常用の制限酵素、リンカ−１連
結、増幅及び単離法を用いることにより調製される。

例えば、ｐＧＷ８２０を旧ｎｄｌｌｒで制限酵素処理す
る。

３．９ｋｂｐ　　Ｈ４ｎｄ　ｍ断片をｐＢＲ３２２の旧
ｎｄ１１部位にサブクローニングする。ｐ！３ｉ＾遺伝
子を含有する得られたプラスミドｐＧＷ８２２の３．３
ｋｂｐ　ＢａｍＨＩ　−ＨｌｎｄＩ［［断片をベクター
ｐｔｌｃ１９のＢａｍＨＩ及び旧ｎｄ１１１部位にクロ
ーニングしてｐＵＣ１９／ｐｅｌＡと称するベクターを
得る。Ｊｌ！ＬＬへの構造遺伝子を、５ａ１１及びＰｓ
ｔｌＮ、：よる消化によって切り出す。銀ｌＡプロモー
ター、シグナル及びターミネータ−配列を含有する残り
の断片のシグナル配列とターミネータ−配列との間に、
適当なリンカ−を用いてインターフェロンバイブリドＢ
ＤＢＢをコードする遺伝子を連結する。

得られるプラスミドをｐｌＪｃ１９／ｐｅｌＡ−ＩＦＮ
　ＡＭ１１９と称しく第１１図）、このものは凪Ａのプ
ロモーター及びシグナル配列、ＩＦＮ　ＢＤＢＢ遺伝子
並びに正佳Ａターミネータ−を含有し、ｐＵＣ１９の旧
ｎｄ　ｎ［−ＢａｍＨＩ断片に付加されている。このプ
ラスミドを、ｐＣＧ５９Ｄ７と共にウリジン要求性Ａ、
ニガー変異株Ａｎ８（ＤＳＭ　３９１７）に同時形質転
換する。アルギニン及びバクトーアガーを含有する最少
培地中で形質転換体を選択し、そしてインターフェロン
の発現について分析する。

本発明の他の態様においては、ｐｅｌＡのシグナル配列
を除去することができる。得られるプラスミドをＨ１３
（＋）　ＫＳ／ｐｅｌＡΔ、、−ＩＦＮ　ＡＭ１１９　
と称し、このものはと江Ａのプロモーター配列、ＩＦＮ
　ＢＤＢＢ遺伝子及び凪Ａのターミネータ−を含有し、
ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）Ｈ１３（＋
）ＫＳベクターのＨｉｎｄ　ｍ　　Ｂａｍｔｌ　Ｉ断片
に付加されている。このプラスミドをｐｃｃ５９Ｄ７と
共にウリジン要求性Ａ、ニガー変異株Ａｎ８（ＤＳＭ　
３９１７）に同時形質転換する。アルギニン及びバクト
ーアガーを含有する最少培地中で形質転換体を選択し、
そしてインターフェロンの発現について分析する。

例えば生体外で部位特定変異誘発により常法に行って新
たな制限部位を含有する変異体を調製することができる
（Ｍ、Ｊ、Ｚｏｌｌｅｒ及びＭ、Ｓｎ＋ｉｔｈ、　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、１００．４６８（Ｉ９８３
）の総説；　Ｄ、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ及びり、５ｈｏｒｔ
ｌｅ、　５ｃｉｅｎｃｅ　　２２９．１１９３（Ｉ９８
５）；　又はＫ。

Ｎｏｒｒｉｓ等、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１
１．５１０３（Ｉ９８３）を参照のこと〕。

より高い発現速度のために任意の真核性ターミネータ−
配列を構造遺伝子の末端に連結することができる。

細菌は常法に従って形質転換され、そして形質転換体は
例えばテトラサイタリンに対する耐性により同定される
。

特に、記載される発現ベクターは適当な大腸菌宿主、例
えばＩＩ　Ｂ　１０１株中で増幅され、形質転換されそ
して常法により選択される。増幅されたプラスミドＤＮ
Ａは常法により、特にＢｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ（
２３）により記載されている方法により細菌から単離さ
れる。

同様にして、他の同種性又は異種性遺伝子を有する他の
プラスミドを作製することができる。

本発明のＤＮＡ分子は常法に従って生体外合成によって
も調製することができる。生体外合成は、ＰＬ発現系の
小さい断片、例えばＰＬ、のプロモーター又はシグナル
配列をコードするＤＮＡ配列あるいはその変異体の調製
のために特に適用できる。

ＰＬプロモーター及び場合によってはＰＬシグナル配列
、ＰＬ構造遺伝子、他の異種性構造遺伝子及び／又はＰ
Ｌターミネータ−を含有する本発明のＤＮＡ分子は糸状
菌、例えばアスペルギルス、ペニシリウム又はセファロ
スポリウム、例えばＡ。

ニドランス、Ａ、オリゼー、Ａ、カルボナリウス、Ａ、
アワモリ及び特にＡ、ニガーを形質転換するためにも使
用することができる。

未形質転換菌からの形質転換菌の選択を可能にするため
、本発明のＤＮＡ分子は選択マーカーを担持し、又は別
の方法として、菌をこのようなマーカーを含有する第二
のベクターと共に同時形質転換する。他の系として、こ
の様な選択マーカーは発現可能な構造遺伝子であり、そ
の発現されたポリペプチド（酵素）が形質転換体に対し
て毒性の化合物に対する耐性を提供し、又はそれがこの
ような必須のポリペプチドを欠（変異体の酵素系を補完
する。この様なマーカー遺伝子は例えば既知のエヒ二亀
、肛匹、肛ｒ４　、４工匹、憇並又は皿遺伝子である。

ＢＰ　８８１０１３９７．３に記載されているようにし
て、Ａ、ニドランスのｍ及びＮ、クランサのｍに関連し
そしてそれらと同様の機能を有する、すなわち酵素オロ
チジン−５′−ホスフェートデカルボキシラーゼを生産
するｍと称する新規なマーカー遺伝子を、Ａ、ニガーの
ゲノムライブラリーから単離した。この酵素は、オロチ
ジン−５′ホスフエートのウリジンＭ（ウリジン−５′
−ホスフェート）への、及びフルオロ−オロチン酸の毒
性フルオロ−ウリジンへの脱炭酸を触媒する。

ｍ遺伝子を含有する大腸菌クローンを、ρｙｒ４遺伝子
の部分を含有するｐＤＪＢ２　（２４）の１．１ｋｂ　
Ｈｉｎｄ［Ｉ［断片とのハイブリダイゼーションにより
同定した。

しかしながら、オロチジン−５′−ホスフェートデカル
ボキシラーゼをコードする他の任意の且１１遺伝子のＤ
ＮＡを使用することができる。大腸菌Ｂ７５１８３／　
ｐｃＧ５９Ｄ７　と称する陽性クローンから紅ｕ遺伝子
を含有するプラスミドｐｃＧ５９［１７を単離し、そし
てＡ、ニガーｐｙｒＡ−変異体の形質転換のために使用
した。このようなｐｙｒＡ−変異株はオロチジン−５′
−ホスフェートデカルボキシラーゼ遺伝子を欠き、そし
てそれ故に対応する酵素を製造することができない。こ
の様な変異株はＡ、ニガーＮ７５６の分生胞子を変異性
ＵＶ照射により処理し、フルオロ−オロチン酸及びウリ
ジンの存在下で生存するコロニーを選択することにより
得た。

フルオロ−オロチン酸の存在下、且つウリジンの非存在
下で生存するコロニーは除去される。残りのウリジン要
求変異株は、形質転換可能なその能力に従って２種類の
補完グループ損工＾及びツェＢに属し、これはそれぞれ
変異株Ａｎ８及びＡｎｌＯにより代表される。これらを
そのプロトプラストの形で形質転換条件下でｄ含有プラ
スミドルＣＧ５９Ｄフにより処理する。Ａｎ８のみが形
質転換され、そしてその消化されたＤＮＡとｐＵＮ１２
１のＤＮＡとのハイブリダイゼーション能力により証明
されるＩＡ遺伝子を含有することが見出された。

本発明はさらに、本発明のハイブリドベクターにより形
質転換されＤＮＡ配列及びその製造方法に関する。この
様な形質転換体は例えば細菌、例えば大腸菌、又は糸状
菌、例えばアスペルギルス、ペニシリウム又はセファロ
スポリウム、そして特にＡ、ニドランス、Ａ、オリゼー
、Ａ、カルボナリウム、Ａ、アワモリ又は特にＡ、ニガ
ー、例えばＡ、ニガーＡｎ８である。本発明はさらに、
この様な形質転換体の製造方法に関し、この方法は宿主
を形質転換条件下で本発明の組換ＤＮＡ分子、特にハイ
ブリドベクターにより、場合によっては選択マーカー遺
３４処理し、そして形質転換体を選択することを特徴と
する。

本発明はさらに、有用な同種性又は異種性ポリペプチド
を発現するハイブリドベクターの製造のための、組換Ｄ
ＮＡ又はその誘導体の使用に関する。

本発明はさらに、本発明のベクターを適当な宿主中で発
現せしめることを特徴とするポリペプチド製造方法に関
する。必要な場合にはポリペプチドが常法に従って単離
される。ベクターの構成に依存して、生成物は発現され
、あるいはシグナル配列が存在する場合には発現されそ
して分泌される。

この方法は、発現ベクターにより形質転換されＤＮＡ配
列を培養することによって適当な宿主、例えばアスペル
ギルスの種において有用な同種性又は異種性蛋白質を生
産せしめることを特徴とする。

今や、純粋な形でありそして他のいずれのＰＬも夾雑し
ていないことを意味する単一ポリペプチドＰＬ八、　Ｐ
ＬＢ、　ＰＬＣ，ＰＬＤ、　ＰＬＥ又はＰＬＦを製造す
ることが可能である。例えば、ＰＬＡ、　ＰＬＢ、　Ｐ
ＬＣ，ＰＬＤ。

ＰＬＥ及びＰＬＦから成る群から選択された単一ポリペ
プチドの製造のための１つの方法は、いずれのペクチン
リアーゼＰＬも発現することができない宿主を、ＰＬＡ
、　ＰＬＢ、　ＰＬＣ，ＰＬＤ、　ＰＬＥ又はＰＬＦの
生成物を発現するＤＮＡ発現ベクターにより形質転換す
ることを特徴とする。

いずれのペクチンリアーゼＰＬをも発現することができ
ない宿主は、対応する遺伝子を有しない微生物、例えば
ＰＬ−アスペルギルスの株、非アスペルギルス糸状菌又
は他の任意の真核性又は原核性微生物、あるいはそのＰ
Ｌの生産が適切に条件調節された培地中で抑制されるア
スペルギルスの株である。例えば、単一ＰＬ遺伝子がグ
ルコアミラーゼプロモーターの制御のもとでＡ、ニガー
又はＡ、アワモリにおいて、ＰＩ＋０５プロモーターの
もとでＳ、セレビシェ−において、あるいはＰＬプロモ
ーターの制御のもとてＰＬ−Ａ、ニガーの株において発
現され得る。

次に、例により本発明を説明するが、これにより本発明
の範囲を減縮するものではない。

１は゛の、　を　する Ａｍρ　アンピシリン ＡＴＰ　　アデノシントリホスフェート５Ａ ＣＩＰ ＮＡ ＴＴ ＥＤＴＡ ＧＴＡ ｂｐ ＭＰ ｏｓｍ ＥＧ １？ＮＡ ｐｍ ＤＳ ｃ Ｔｒｉｓ ■ ウシ血清アルブミン ウシ腸アルカリホスファターゼ デオキシリボ核酸 １．４−ジチオスレイトール エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩ビス−（アミノ
エチル）−（グリコールエーテル）Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ
’−四酢酸キロ塩基対 低融点 ミリオスモル ポリエチレングリコール リボ核酸 分当り回転数 ドデシル硫酸ナトリウム テトラサイタリン トリス（ヒドロキシメチル）−アミノエタン ユニット ボルト １１直履工劣■Ｌ」畿王 １１１１八　Ｂ／ｇ　　　　　　ＢａｍＨＩ　　、　　
Ｂｇｌ　ＩＩ　　、　　旧ｎｄＩＩＩ　　、　　Ｍｂｏ
　Ｉ　　。

Ｐｓｔｌ及びＸｈｏｌによる消化のた めに使用される１０×制限酵素緩衝 液；６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃ！（ｐＨ７，４）。

６０ｍＭ　　β−メルカプトエタノール、６０ｍＭ　Ｍ
ｇＣｊ２ｚ、５００ｍＭ　ＮａＣｌ２．　０．１％ＢＳ
Ａ、０．１％ゼチランを含有。

ＥｃｏＲＩ　Ｎ１衝液　ＥｃｏＲＩによる消化のために
使用される５×制限酵素緩衝液；　５００ｍＭＴｒｉｓ
−ＩＩＣ１（ｐＨ７，２）、　２５ｍＭ　ＭｇＣｌ　ｚ
２５０ｍＭ　　ＮａＣｌ２　　、　０．０５％　ＢＳＡ
　　　Ｏ，０５％ゼチランを含有。

水中１００ｍＦＩイソプロピル−β−チオ−ガラクトピ
ラノシド（２３，８ｍｇ／ｍｌ）。

１％トリブチカーゼペプトン（ＢＢＬ）０．５％酵母エ
キス（ＢＢＬ）、　　０．８％ＮａＣｌ！、、　　１　
ｍｌ／　Ｉ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）。

ＬＣ培地 ＰＴＧ 最少培地　　　１．０５％ＫｚＨＰ（Ｉ４＋　　０．４
５％にＨ２ＰＯ。

０６１％（ＮＨｉ）ｚＳＯｎ、０．０５％クエン酸ナト
リウム・Ｎ２０（大腸菌用）、 １　ｍＭ　ＭｇＳＯ４，１ｍＭチアミン−）ＩＣＡ。

０、２％グルコース。

２ＸＴＹ培地　　ｌ！当り１６ｇトリブチカーゼペプト
ン（ＢＢＬ）　、　　１０　ｇ酵母エキス、５ｇ　Ｎａ
Ｃ１゜ ＴＢＥｉｌ衝液　１１当り１０．８　ｇ　Ｔｒｉｓ、　
５．５　ｇ硼酸、４ｄの０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ（ｐＨ８
，０）。

ＴＥ緩衝液　　１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ
８，０）、　１ｍＭＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）。

低濃度ＴＥ緩衝液 １０ＩＩＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐ）１８．０）、
　０．１ｍＭＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）。

Ｘ　−ｇａｌ　　　　　ジメチルホルムアミド中２％５
ブロモ−４−クロロ−３−インド ツルーβ−ガラクトシド Ｓ　Ｓ　ＣＯ，１５Ｍ　ＮａＣｉ　、　　０．０１５Ｍ
クエン酸ナトリウム Ａ、ニガー用最少培地 Ｉｆ中１．５ｇ　Ｋｌｌ□ＰＯａ、　０．５１５　ＫＣ
ｌ、。

０．５８　Ｍｇ５Ｏａ・７ＨｚＯ９４，０ｇ　Ｎｌ１４
Ｃβ１０．０ｇグルコース、微量のＦｅＳＯ４Ｍｇ５Ｏ
ａ＋　ＺｎＣ１２２，Ｎａ０１１によりｐｌ＋６．５に
調整。

Ａ、ニガー用完全培地 最少培地＋０．２％トリブチカーゼ ペプトン（ＢＢＬ）　、０．１％カザミノ酸（デイフコ
）、０．１％酵母エキ ス（ＢＢＬ）　、０．０５％酵母由来リボ核酸ナトリウ
ム塩（ＩＣＩＩ、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ。

米国）、２滅／℃ビタミン溶液。

ビタミン溶液　１００成当りｌＯ■チアミン、　１１０
０ｔｎリボフラビン、１０ｍｇパントテン酸、２■ビオ
チン、ｌ０ｍｇ　　ｐ−アミノ安息香酸、　１００ｍｇ
ニコチンアミド、５０■ピリドキシン−肛！。

プレートのためにはいずれの培地も１．５％寒天（ＢＢ
Ｌ）の添加により固化し、上層のためには０．７％寒天
（ＢＢＬ）又はアガロース（Ｓｅａｋｅｍ）を使用する
。

ＰＢＳ　　　ｌ当り０．３７ｇ　　ＮａＨｚＰＯａ＋　
２．７ｇ　　ＮａｚＨＰＯ４＋８．５ｇ　ＮａＣ１゜ ＰＳＢ　　１１０１ｎ　　Ｔｒｉｓ−ｆｌｃｊ２（ｐＨ
７，６）、　１００ｍＭＮａ（ｆ！。

１０ｍＭ　ＭｇＣ１！ｚ、　　０．０５％ゼチラン。

ＬＤＢ　　１０ｎ＋Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ！　（ｐＨ
７，６）、　１００ｍＭ　ＮａＣ１。

１０ｍＭ　Ｍｇ（、ｅ　ｚ。

下ｌお列１株ｍ丈ｊよ アスペルギルス・ニガーＮ４００野性型（Ａ、　　恒ｌ
扛） Ａ、　　ニガーＮ５９３　　　ｃ工≦」１へ＋ｍじ【八
人。ニガーＮ７５６　　ペクチナーゼ複合酵素の高生産
性のために選択された。

Ａ、ニガーＡＮ８　　ＤＳ？ｌ　３９１７、Ａ、ニガー
Ｎ７５６のウリジン要求変異株 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＮＭ５３９ ｍｅｔｅ、　■Ｅ、　ｈｓｄＭ”　、　ｈｓｄＲ赳ケ、
　（Ｐ２ｃｏｘ３） 大腸菌ＭＨＩ　　　　ａｒａＤ１３９．Δ里×７４．幻
壮Ｕ。

ｆＬＬＬＫ・　力ｓｒ−・　力」口！°　　・　　５」
ニ【八・大腸菌ＪＭ１０３ 大腸菌ＪＭ１０９ 大腸菌ＣＪ２３６ 大腸菌ＭＶＬ１９０ Δお朽−程１．封戊、灸ばＡ・Ｕ郁・ 緬＾ｌ担ＫＢＩ稍可Ｒ４、Ｆ　’　＋　　ＬｒａＤ３６
゜月１ＡＢ、暉５ｃｌｑ、ＺΔＭ１５ Δ吐匹−但１ＡＢ）　、息瓜Ａ１．亜卦ＩＩ…Ａ９６．
川工、罫Ｒ１７，ｓ且１４４゜ｒｅｌＡｌ、　　　　λ
　−＋（Ｆ’＋　　　↓ＪコａＤ３６゜辺１ＡＢ、里１
’　、ＺΔ旧５〕 け吋−１，ｕｙ、−１＋止、−１，息佳Ａ−１；　　ｐ
ｃＪ１０５（Ｃｍ’）；　　８１０　−ＲＡＤＭｕｔａ
−Ｇｅｎｅ　？１１３生体外変異誘発キット 〔Δ（迅−胆ΔＢ）ｌ貝住、　■Ｅ。

Δ　（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０６：：ＴｎｌＯ（Ｌｅｔ
’）（Ｆ’：地Ｄ３６．但１ＡＢ、υ２ｃ　１　ｑＺ、
１１５）］　。ＭＶ１１９０株はＢＴＯＲＡＤ　ＭＵＴ
Ａ−ＧＥＮＥ　Ｍ１３生体外変異誘発キットの手引きに
記載され ている。

−のベク　−　　　　る 財１μ ［ＭＢＬ４は９〜２３ｋｂρのクローニング容量を有す
るλ置換ベクターである（Ｆｒｉｓｃｈａｕｆ等、参考
文献２）。このベクターはλアームと非必須スタッファ
−（５ｔｕｆｆｅｒ）領域との間に多重クローニング領
域を含有する。これは、外来ＤＮＡ挿入体が挿入される
場合に該ベクターアームへの該スタッファ−の再連結が
減少するように、多重制限酵素消化が行われることを可
能にする。このベクターはまた組換体の直接選択をもた
らすためにΣＬ±表現型を用いる（Ｚｉｓｓｌｅｒ等、
参考文献２０）。

四北３Ｂ１１ このプラスミドはヨーロッパ特許出願８８１０１３９７
．３に記載されており、ｐＢＲ３２２中にクローン化さ
れたＡ、ニガーＮ７５６のＰ佳Ｄ（ＰＬ　Ｉ　）遺伝子
を含有する。

研具七」 このプラスミドはヨーロッパ特許出願８８１０１３９７
．３に記載されており、正佳Ｄ　（＋’Ｌ　Ｉ　）遺伝
子のＮ−末端ＥｃｏＲＩ断片を含有する。

此只［づ このプラスミドはヨーロッパ特許出願８８１０１３９７
．３に記載されており、Ｊｌ！ｉＬＤ　（ＰＬ　ｌ　）
遺伝子のＣ末端ＥｃｏＲＩ断片を含有する。

ｌ形υ プラスミドｐＢＲ３２２は抗生物質アンピシリンに対す
る耐性のための遺伝子（ａｍｐ’　）及びテトラサイク
リンに対する耐性のための遺伝子（Ｌｅｔ”　）を有す
る。このプラスミドは幾つかのユニーククローニング部
位を有し、その幾つかは該ａｍｐ遺伝子又はｔｅｔ遺伝
子中に存在し、その結果クローン化ＤＮＡの挿入が抗生
物質感受性細菌を導く。

ＥＭＢＬ１８びＥＭＢＬ−１９ これらのプラスミドはＤｅｎ　ｔｅ等（参考文献７゜８
）により記載されている。

匹粍■ このプラスミドはＧｏｏｓｅｎ等（参考文献１２）に記
載されている。

Ｕ山旺フｌニー区 Ｍ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９ベクター（Ｎｏｒｒ
ａｎｄｅｒ等、文献２１）は単鎖Ｄ　Ｎ　Ａバタテリオ
ファージＭ１３の誘導体であり、そして多能なポリリン
カ一部位におけるＤＮＡ断片のクローニングを可能にす
ることによるＤＮＡ配列決定及び同じ制限断片の可能な
両方向でのクローニングを容易にするように設計されて
いる。これらのベクターにクローニングされた配列は配
列決定反応のための、並びに標準的オリゴデオキシリボ
ニクレオチドプライマー及び大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
■のＫｌｅｎｏ−断片を用いる単鎖プローブの製造のた
めの鋳型として容易に用いることができる。このベクタ
ーＤＮＡは大ｉＡ菌１ａｃ−オペロンプロモーター及び
β−ガラクトシダーゼの最初の１４５アミノ酸の遺伝情
報を担持する。多重制限部位を含有するポリリンカー部
位はＩａｃＺ配列に挿入されている。このポリリンカー
は１ａｃＺリーデイングフレームを保持しており、そし
てこのベクターはＬａｃＺα宿主株に対立遺伝子補完を
与え、ＩＰＴＧ及びＸ−ｇａｌを含有するプレート上に
青色のプラークをもたらす。このリーディングフレーム
を破壊するか又は１ａｃＺαペプチドの発現を妨害する
挿入部を含有する組換ファージは無色のプラークとして
示される。

匹艶匝近 このプラスミドはＥＰ　８８１０１３９７．３中に記載
されており、そして大腸菌ＢＪ５１８３／　ｐＣＧ　５
９Ｄ７　（ＤＳＭ３９６８）から得ることができる。こ
のプラスミドはｍ遺伝子を含んで成り、そしてＡ、ニガ
ーｐｙｒＡ変異株の同時形質転換のために使用される。

Ｍ１３　＋　　ＫＳ　Ｂｌｕｅｓｃｒｉ　ｔ）　（ＳＴ
ＲＡＴＡＧＥＮＥ、　サンジエゴ、　ＣＡ、米国） Ｍ１３ファージの複製起点を含有するｄｓＤＮＡベクタ
ーである。ヘルパーファージ、例えばＭ１３ＫＯ？（参
考文献２９）又はＲ４０８（参考文献９）の存在下で、
このベクターの（＋）−鎖は複製され、パッケージされ
、そして培地に遊離される。

■３に０７ Ｍ１３（＋）ＫＳ用のヘルパーＭ１３ファージである。

Ｍｅａｄ等（参考文献２９）に記載されている。

…餞 Ｍ１３（＋）ＫＳ用のヘルパーＭ１３ファージである。

Ｒｕ５ｓｅ１１等（参考文献９）に記載されている。

泄 アスペルギルス・ニガーＮ４００株の分生胞子を２００
−の最少培地に１０”胞子／ｄの最終胞子密度になるよ
うに接種し、そしてニュー・プランスウィック（Ｎｅ賀
Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）　　ロータリーシェーカーを用い
て２８°Ｃ、３００ｒｐｍにて２４時間１１のエルシン
マイヤーフラスコ中で振とうする。ミラクロス（Ｍｙｒ
ａｃｌｏｔｈ）を有するブフナー漏斗を用いる濾過によ
り菌糸を収得し、冷無菌塩溶液により洗浄し、液体窒素
中で凍結し、そして−６０°Ｃで貯蔵するか又は直接使
用する。このゲノムライブラリーの調製のためのＤＮＡ
の単離のために使用される方法はＹｅ　Ｉ　ｔｏｎ等（
参考文献ｌ）により記載されている方法に基く。この方
法によるＤＮＡの収量は約５０〜ｔｏｏ　ｎ／　ｇ菌糸
である。

ライブラリーの作製のため、１０ｇの菌糸を液体窒素中
でＩｇずつブラウン（Ｂｒｏｕｎ）マイクロ−ディスメ
ンプラーター中で粉砕する。粉砕した菌糸を、２００戚
の抽出１１衝液（５０ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐｔ１８．２．
０．２％５Ｏ５）　及び２００μｌのジエチルピロカー
ボネートを収容する１ｆの無菌エルレンマイヤーフラス
コに移す。この混合物を徐々に室温に加熱し、そして次
に時々撹拌しながら６８゛Ｃに２０分間加熱する。懸濁
液を室温に冷却し、そして１２，０ＯＯＸ　ｇにて１５
分間遠心分離する。１７１６容量の８Ｍ酢酸カリウム溶
液（ｐＨ４，２）を上清に加え、そしてこの混合物を氷
上に１時間置く。遠心分離（２０分間ｉ１６．０００Ｘ
ｇ；４°Ｃ）により沈澱を除去する。０．６容量のイソ
プロパツールと共に氷上で１５分間インキュベートする
ことにより上清から核酸を沈澱せしめる。

遠心分離（Ｉ０分間；　６０００Ｘ　ｇ　ｉ　４°Ｃ）
によりペレットを集め、７０％エタノールで洗浄しそし
て短時間乾燥する。ベレットを２０ｎ／ｄのＲＮアーゼ
Ａ（ベーリンガー・マンハイム）を含有するｌａｄのＴ
Ｅ中に懸濁し、そして３７°Ｃにて１５分間インキュベ
ートする。ＤＮＡを、ヌクレアーゼを含有しないプロナ
ーが（最終濃度１■／成）　（Ｋｏｃｈｌｉｇｈｔ。

Ｃｏ１ｎｂｒｏｏｋ）により３７°Ｃにて１時間処理す
る。ＴＥ緩衝液中プロナーゼストック溶液は２０■／ｄ
の酵素を含有し、これを３７°Ｃにて１時間インキュベ
ートしてヌクレアーゼを消化する。

８．５ｇのＣｓＣｌを９−のＤＮＡ溶液に溶解し、０．
２−のｌＯ■／Ｉｄ臭化エチジウムを添加し、そしてこ
の溶液をベックマンＳ−４１０−ター中で３３．００Ｏ
ｒｐｍにて６０時間遠心するか、又はベックマン５０Ｔ
　ｉローター中でクイックシールチューブを用いて４５
、００Ｏｒｐｍにて４０時間遠心分離する。チューブの
側壁穿孔によりＤＮＡバンドを集める。水−及びＮａＣ
ｌ−飽和イツブロバノールでの複数回の抽出により臭化
エチジウムを除去する。５容量のＴＥを添加し、そして
ＤＮＡをＴＥ飽和フェノール、フェノール／クロロホル
ム／イソアミルアルコール２５：２４：１、及びクロロ
ホルム／イソアミルアルコール２４：１により抽出する
。０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐｉ（５，２）及
び２．５容量のエタノールの添加並びに−２０°Ｃにて
一夜のインキュベーションによりＤＮＡを沈澱せしめる
。沈澱を遠心分離（Ｉ時間；　３０，０ＯＯＸ　ｇ　；
　４°Ｃ）により集め、７０％エタノールにより洗浄し
、乾燥し、そして４００μｌの低濃度ＴＥに溶解する。

１３．６〜２３ｋｂｐ　ノ断片を最大量与えルＭ　ｂｏ
　Ｉ　ｉ４　ｊ、ｆを試験するため、ＩｎずつのＡ、ニ
ガーＮ４００　ＤＮＡを、減少する量のＭｂｏ　Ｉ　（
０，５〜Ｏ，０ＯＩＵ）を含む適切な緩衝液中で１０μ
ｌの容量で３７°Ｃにて１時間消化する。ＩＩＪｌの０
．２５Ｍ　ＥＤＴＡの添加により反応を停止し、そして
サンプルを、１ｇｇ　／　ｍｌ臭化エチジウムを含有す
るＴＢＥ中０．６％アガロースゲルに負荷する。便利な
マーカーは、４９．２２．８．１３．６．９．８２．３
ｋｂｐ及び見えない０．４５ｋｂｐの断片を与えるＢｇ
ｌ■消化λＤＮＡ並びにλＤＮＡの混合物である。高収
量の目的とする１３．６〜２３ｋｂｐ断片を与えるのに
必要なＭｂｏｌの濃度は０．０２Ｕ／ｉ　ＤＮ八である
。従って、全容２ｄ中２０ＯｎのＤＮＡが消化され、そ
して酵素添加の直後に同じ量の２０個口に分けられる。

３７°Ｃにて１時間の後、消化物を氷上に置き、そして
Ｌｎのサンプルをゲル上で泳動して適当な消化について
試験する。結果が陽性である場合、ＥＤＴＡを最終濃度
２５ｍＭに加えて反応を停止せしめ、酵素を６５°Ｃに
て１０分間熱失活せしめ、サンプルをプールし、そして
ＤＮＡを沈澱せしめ、洗浄し、乾燥しそして４００μｌ
のＴＥに溶解する。

断片化されたＤＮＡを０．４％分取用アガロースゲル（
センターウェル１２０Ｘ　１．５　ｍｍ）上で一夜分離
する。ＢｇｌＩＩにより消化されたλＤＮ八をマーカー
として用いて４°Ｃ及び４０Ｖ（３Ｖ／Ω）での電気泳
動により部分消化ＤＮＡ断片のサイズを決定する。

正しいサイズの断片を含有するゲル領域をゲルから切り
出し、そして無菌透析チューブ内で２ｄのＴＢＥ中テ１
００ｖニテ２〜３時間、ＤＮＡをゲルから電気溶出する
。電流を３０秒間逆転せしめ、そしてＤＮＡを含有する
緩衝液を集める。次に、断片をエタノール沈澱により濃
縮しそして１００４の低濃度ＴＥ中に溶解する。

ローニング Ａ、ニガーＮ４００株のゲノムライブラリーをλヘクタ
ーＥＭＢＬｄ中に作製する。９〜２４ｋｂｐのクローニ
ング容量を有するこのベクターはＦｒ１ｓｃｈａｕｆ等
（参考文献２）及びＫａｒｎ等（参考文献３）により記
載されており、そしてプロメガ・バイオチク社（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ）により販売されて
いる。

ゲノムの異る部分に由来する二重挿入を回避するため、
本発明者等はクローニングのため１３．６ｋｂｐの最少
断片長を用いた。

１０鱈のλＥＭＢＬ４　ＤＮＡを５０ユニツトのＢａｍ
ＨＩにより適切な緩衝液中で１００＃の容量で３７゛ｃ
にて２時間消化する。酵素を６５°Ｃにて１ｏ分間不活
性化する。

ＮａＣｌ　ｅ４度を１５０ｍＭに上げそして５ｏユニツ
トの５ａｌｌを加え、そして３７°Ｃにてさらに２時間
インキュベートする。ＥＤＴＡを２５ｍＭとなるように
添加しそして酵素を不活性化（６５°Ｃ，１０分間）し
た後、溶液を同容〒のフェノール（ＴＥ飽和）、フェノ
ール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２
４：ｌ）、及びクロロホルム／イソアミルアルコールに
より抽出する。小Ｂａｍ１ｌ　Ｉ　／　Ｓ　ａｌ　Ｉポ
リリンカー断片を除去するため、０．１容量の３Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ５，２）の添加の後０．６容量のイソ
プロパツールによりＤＮＡを沈澱せしめる。氷上に１５
分間置きそして１２，０００Ｘｇ及び４°Ｃにて１５分
間遠心分離した後、沈澱を７０％エタノールにより十分
に洗浄し、乾燥しそして４０ＩＪ１の低濃度ＴＥに溶解
する。

連結反応に先立って、例１．３．に従って調製されたベ
クターのＣＯＳ部位がアニールされることが必須である
。　１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣｌ３　（ｐＨ７，５
）及びｌＯ＋＋＋ＭＭｇＣＱ　ｚ中のベクターを６５°
Ｃにて１０分間加熱しそして次に４２°Ｃにて１時間ア
ニールせしめる。試験連結から、約１：１　（重量比）
のベクタ一対断片の比率が最も多くの組換体を与えるこ
とが見出される。連結を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＩＣｆ
ｆ　（ｐＨ７，５）、　１０ｍＭＭｇＣＱ　ｚｌｌｏｍ
Ｍ　ＤＴＴ及び１ｍＭ　ＡＴＰ中で、９．５　ｐｇのベ
クター及び１０■のＤＮＡ断片を用いて全容１００μ！
で行う。次に、ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）を０．５ｔｌ
／ｆｆ　ＤＮＡの濃度で加え、そして連結混合物を１４
゛Ｃにて一夜インキユベートする。連結について試験す
るため、連結されたＤＮＡのサンプルをアガロースゲル
上で泳動せしめる。０．５硝量のベクターを５Ｉ！ｌの
容量中で断片の添加を伴わないで連結する。

大容量の連結混合物をエタノール沈澱により濃縮しそし
て２０Ｉｌｌの低濃度ＴＥに溶解した後にパッケージン
グを行う。生体外パンケージングは、プロメガ・パッカ
ジーン（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｐａｃｋａｇｅｎｅ）エクス
トラクトを用いて製造者の指示に従って、ＤＮＡのパッ
ケージＩＩ４に１Ｏｐｌずつ用いて行う。エクストラク
トと共に提供される高分子量λ。■８５７Ｓａｍ７の内
１蛸を別にパッケージして対照とする。

パッケージングの後、５００μｌのファージ溶液緩衝液
（ＰＳＢ）を添加し、そして５１１１のクロロホルムを
添加する。組換えファージストックは４°Ｃにて貯蔵す
ることができる。得られたライブラリーは、２回の別々
の連結実験により作製されたものである。

大腸菌ＮＭ５３９の細胞を、０．２％マルトース、１０
ｍＭ　ＭｇＳＯ４及びＩｎ＋ＭＣａＣｊ２．を含有する
ＬＣ培地で１、０の光学濃度（６００ｎｍ）に増殖せし
める。次に、この培養物の０．２　ｕｒｌのアリコート
をＰＳＢ中ファージ稀釈シリーズ０．１　ｄに加える。

３７°Ｃにて２０分間にわたるファージの吸着の後、３
ｄの０．６％ＬＣ上層寒天（４５°Ｃ）を加え、この混
合物をＬＣ寒天プレート上にプレートし、そしてこれら
を３７°Ｃにて一夜インキユベートする。ファージ懸濁
液ｄ当すファージ形成ユニット（ｐｆｕ）の数として示
されるタイトレージョンの結果は、例１．４に従って調
製された２個のファージストックにっき１２　Ｘ　１０
’及び４．２　Ｘ　１０’ｐｆｕ／　ｒａｉｌである。

断片を用いない対照連結から算出されるバックグラウン
ド（それぞれ１７％及び４０％）を差引いた後、組換え
体の絶対数は６Ｘ１０’であり、これはゲノムの長さの
２００倍を超える。

ライブラリーを増幅するため両方のパッケージストック
の８０μ！の部分を用いて大腸菌ＮＭ５３９細胞に感染
せしめ、これをＬＣ上層アガロース中でＬＣ寒天プレー
ト上にプレートし、そして３７°Ｃにて一夜インキユヘ
ートする。このプレートをプレート当り５ｄのＰＳＢと
共に穏やかに振とぅすることによりファージをアガロー
スから溶出する。

ＰＳＢを集め、遠心しテ（６０００Ｘ　ｇ　ニア１０分
間）細菌を除去し、そしてクロロホルムを０．５％の最
終濃度になるように加える。次に、およそ同じ程度に増
幅された両ファージストックを混合しく４０紙ストック
）、タイトレージョンしく８　Ｘ１０’ｐｆｕ／ｍｌ）
そして４℃にて貯蔵する。

例１に記載したようにして得られたλゲノムライブラリ
−から稈１．Ｄ遺伝子を単離するため、２．５×１０４
のファージを液化したＬＣ上層アガロースと混合し、そ
して５枚のＬＣ寒天プレート上にプレートする。プレー
トを３７°Ｃにて一夜インキユベートシ、そして４°Ｃ
にて２時間冷却する。Ｂｅｎｔｏｎ及びＤａｖｉｓ（参
考文献４）のプラークハイブリダイゼーション法に従っ
て、各プレートから２枚のレプリカを作る。第一フィル
ター（Ｓｃｈ　Ｉｅｉｃｈｅｒ及び５ｃｈｉｉｌｌ　Ｂ
Ａ８５又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　ＨＡＴＰ　０８５）を
プレートの上に１分間置き、第二レプリカを２分間置き
、そしてレプリカの位置をインディアインクを用いて印
す。

フィルターを外した後、これらを、１００ｄの変性溶液
（ＬＭ　ＮａＣ１、０，５Ｍ　Ｎａ０Ｈ）を収容した皿
に１分間置き、そして１００Ｉｄの再生溶液（０，５Ｍ
　Ｔｒｉｓ−）ＩＣｆ（ｐＨ７，５）、　　１．５ＭＮ
ａＣｆ）中に１分間置く。

次に、これらのフィルターを、３　Ｘ５ＳＣ（ＳＳＣ−
０，１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０１５Ｍクエン酸ナトリウ
ム（ｐＨ７、０）　）を収容する皿に移す。手袋をはめ
た手でフィルターを穏やかにこすって細菌破片を除去し
、３ｘｓｓｃを入れた新たな皿に移し、そして室温にて
穏やかに２００分間置うする。フィルターをワットマン
３ＭＭペーパー上にプロットしそして１０分間室温にて
乾燥する。フィルターをワットマン３ＭＭペーパー上オ
ーブン中で８０°Ｃにて２時間乾燥する。次に、これら
を６ｘｓｓｃ中で０．５時間室温にて洗浄し、そして次
に５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）１（、ｉ！、（ｐＨ７，５）
、　　１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、　　　ＬＭ　　ＮａＣ１
，０，５％ＳＯＳ、　　０．１％ピロリン酸ナトリウム
、１０×デンハート〔５０×デンハ一トー１％ＢＳＡ　
（ベーリンガー・フラクション■）、１％ポリビニルピ
ロリドン−４０，１％フィコール４００〕から成る予熱
（５６°Ｃ）　したプレハイブリダイゼーション混合物
５０ｍ１に移す。このプレハイブリダイゼーション混合
物に０．１　ｍｇ　／　ｍｌの変性したサケ精子ＤＮＡ
（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、３２７頁、参考文献５）及び０
　、０１　ｍｇ　／　ｍｌのｐｏｌｙ　ｒＡを新たに加
える。

プレハイブリダイゼーションを５６゛Ｃにて４時間、穏
やかに振とうしながら行う。ハイブリダイゼーションに
使用したプローブはｐＰＬ３５−５のニック・トランス
レーションされた３、５ｋｂｐ　ＥｃｏＲＩ断片であり
、このものはＡ、ニガーＮ７５６株の耐り遺伝子のＣ−
末端領域を含有する（大腸菌ＢＪ５１８３／ｐｃＧ３Ｂ
１１．０５Ｍ３９１６．　ＥＰ　８８１０１３９７．３
から入手可能である）。この断片を低融点アガロースゲ
ルからあらかじめ単離し、そして０．３肩の断片をニッ
ク・トランスレーションする（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、ｐ
ｐｔｏ９−１１２　；参文献５）。ニック・トランスレ
ーションされたＤＮＡを沸騰浴中で１０分間変性せしめ
、氷上で冷却し、そして５０１ｄの予熱したプレハイブ
リダイゼーション混合物に添加する。プレハイブリダイ
ズ処理されたフィルターを１枚ずつハイブリダイゼーシ
ョン混合物に移す。ハイブリダイゼーションは５６°Ｃ
にて一夜、穏やかに振とうしながら行う。フィルターを
、０．５！の４　Ｘ５ＳＣ，０，１％ｘ　ｓｏｓにより
２×３０分間、そして２　Ｘ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳに
より２×３０分間洗浄する。フィルターを３ＭＭペーパ
ー上にプロットし、そして１時間空気乾燥する。これら
を３ＭＭペーパー上にはり付け、そして放射性インクに
より標識した後、フィルターをサランダップで包み、そ
してコニカＸ−線フィルム及びコダックＸ−Ｏｍａｔｉ
ｃカセントを通常の増強スクリーンと共に用いて一７０
°Ｃにて一夜オートラジオグラフィー処理する。こうし
て、スクリーニングした５枚のプレートから４４個の陽
性シグナルが得られる。インクマーカーを用いて正しく
オートラジオグラム上にプレートを注意深く置くことに
より、無菌パスツールピペットを用いて陽性プラークを
拾い上げる。陽性プラークを含む寒天片を０．１　ｄの
ＰＳＢ中に分配する。時々渦動しながら室温にて１時間
、ファージを寒天から拡散せしめる。５分間遠心するこ
とにより寒天及び細菌細胞片を除去し、１０μｌのクロ
ロホルムを加え、そしてファージストックを４　’Ｃに
て貯蔵する。

陽性クローンをλＰＬＩ〜λＰＬ４４と命名する。ファ
ージが高密度でプレートされるので、これらを低密度（
±１００ファージ／プレート；１０’［釈のファージス
トック０．１ｄ）でプレートし、そしてレプリカプレー
ト、ハイブリダイゼーション及び陽性プラークの拾い上
げの全工程を反復することにより、陽性プラークを２回
精製しなければならない。

±ｌ支　久ｍ恨」旧１岨 組換クローンからＤＮＡを単離するため、ファージをま
ず、例１．５に記載したようにして精製されたクローン
からのファージストックにより大腸菌）ＪＭ５３９を感
染せしめそしてこの細胞をＬＣ上層寒天中でＬＣ寒天プ
レート上にプレートすることにより増幅する。これによ
り指示細菌が全面で溶解しているプレートが得られる。

５ｄのＰＳＢをプレート上に拡げ、そして２時間穏やか
に振とうしながらファージを溶出する。溶出されたファ
ージを収得し、遠心分離により細胞片を除去し、そして
クロロホルムを１％となるように加える。得られるプレ
ート細胞溶解物を４°Ｃにて貯蔵する。

このものは通常的１０”　ｐｆｕ／　ｔａｉｌのタイタ
ーを有する。

プレート細胞溶解物ストックから及び小規模液体培養か
らの小規模単離法（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、６５−６８頁
、参考文献５）が常に消化性ＤＮＡを提供するとは限ら
ないので、ファージを２５０ｄの細胞溶解物から単離す
る。これらは、宿主大腸菌ＮＭ５３９をＬＣ＋０．２％
マルトース、１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４，１ｍＭ　ＣａＣ１
ｚ中で０．３の０．０．６００まで増幅せしめそして次
に約１０”ｐｆｕのプレート細胞溶解物を添加すること
により調製される。さらに培養する場合、細胞は４時間
以内に溶解する。

細胞溶解物に２　ｔｒｉ　／　ｒｒｄｌの最終濃度にな
るようにＲＮアーゼ及びＤＮアーゼを加え、そして細胞
熔解物を室温にて１時間放置する。細胞破片を遠心分！
（２０分間、室温、１０．０００　Ｘ　ｇ　）により除
去する。１４．８　ｇのＮａＣｌ及び２５ｇのＰＥＧ６
０００を上清中に溶解しテＩＭＮａＣｊ２及び２５％（
Ｖ／Ｖ）ＰＥＧ　ノ最終濃度とする。ファージを氷上で
１時間又は４°Ｃにて一夜沈澱せしめ、そして遠心分離
（２０分間１１０．０００ｘ　ｇ　；　４°Ｃ）により
収得する。ペレットを３　ｍｆｌのλ稀釈液（ＬＤＢ：
　１０１Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１Ｃｆｆｉ　（ｐＨ７，５）
２０ｍＭ　ＭｇＣｆ　２＋　１００ｍＭ　Ｎａ（／！　
）中に懸濁する。２．５ｇのＣｓＣｌを４−のファージ
懸濁液に溶解し、そしてこの混合物を５ＩＲ１のベック
マン・クイックシール・チューブにピペットにより移し
、次にこのチューブにＬＤＢ中同じ濃度のＣｓＣｌによ
り満たす。チューブをシールし、そしてベックマンνＴ
ｉ６ｓ、　ｚ　ローター中で５０．００Ｏｒｐｍ及び４
°Ｃにて一夜遠心する。通常の電灯の下で見ることがで
きる濁ったファージバンドをチューブの側壁に窄孔して
取り出す。無菌チューブ中で２２のｌｏｓＭ　Ｔｒｉｓ
−ＩＩＣＰ（ｐＨ７，５）、　　１０ａ＋ＭＭｇＣｊ２
ｚ、　　５０ｍＭＮａＣｌニ対して４°Ｃにて４時間透
析することによりＣｓＣｌを除去する。緩衝液を１置溝
たす。ファージを無菌グライナ（Ｇｒｅｉｎｅｔ）チュ
ーブ中に集め、容量を透析緩衝液によりｌｉｔに調整し
、５ｏＩｉの１０％ＳＯＳ。

５０μ／（７）０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ（ｐ１１８．０）
及び２５Ｉｌ！（７１２０ｍｇ／ｄ　ヌクレアーゼ不合
プロナーゼを加え、そしてチューブを３７°Ｃにて１時
間インキュベートする。容量をＴＥにより３ＪＩｉに増
加し、そしてこの溶液を等容量のＴＥ飽和フェノール、
フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２
５：２４：１）及びクロロホルム／イソアミルアルコー
ル（２４：１）により抽出する。０．１容量の３Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ５，２）及び２．５容量のエタノール
を添加した後・ＤＮＡを一２０°Ｃにて一夜沈澱せしめ
、そして遠心分離（２０，０００ｘ　ｇ　、　　４°ｃ
にて１時間）により集める。ペレットを７０％エタノー
ルで洗浄し、乾燥し、そして２００　ｕｌの低濃度ＴＥ
中に溶解する。

ファージＤＮＡの収量は約２００ｇ／　２５０戚細胞溶
解物である。

貫目り叛　ｅｌＤクローンの　　　　。

陽性ファージの内１０個を無作為に選択して更なる分析
に用いる。１■のファージＤＮＡを１０ユニツトのＥｃ
ｏＲＩ又はＢｇｌＩ［により２ｏｌｌ！の容量において
３７°Ｃにて２時間、供給者が推奨する緩衝液中で消化
する。マーカーとしてｌ１ｉｎｄｌｌ［で消化したＩｎ
のλｃ　１８５７　ＳａｍＩ　ＤＮＡ（λＸｔｌｉｎｄ
Ｉ［Ｉ）並びに対照としての１肛４　ＤＮＡ及びＥｃｏ
ＲＩで消化したｐｃＧ３Ｂ１１ＯＮＡを用いて、サンプ
ルを０．６％アガロースゲル上で分離する。ポラロイド
６６７を用いて［ＪＶｌランスイルミネーター上でゲル
を写真にとる（４ｓ。

ｄｉａｆｒａｇｍａ８）　、　Ｄ　Ｎ　Ａを５ｃｈｌｅ
ｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｊｉｌｌＢＡ８５フイルターに
Ｓｏｕ　ｔｈｅｒｎ　（Ｉ９７５）の方法に従ってＭａ
ｎｉａｔｉｓ、　　３８２　３８６頁（参考文献５）に
より記載されているようにして移す。フィルターを、全
遺伝子をカバーする限江り遺伝子の３２Ｐラベル化（ニ
ック・トランスレーション）断片のｒｌ　合物（！：ハ
イブリダイズせしめる。これらの断片はｐＰＬ２９−５
の２．９ｋｂｐ　ＥｃｏＲＩ断片及びｐＰＬ３５−５の
３．５ｋｂｐ　ＥｃｏＲＩ断片である。ハイブリダイゼ
ーション及び洗浄の条件は例２．１に記載したそれらと
同じである。

片対数紙上で既知のマーカーバンドとグラフにより比較
することにより写真及びオートラジオダラムからバンド
の長さを計算する。クローンの制限地図を第１図に示す
。クローンλ−ＰＬ４　、−１４及び−４０は、ｐｃＧ
３Ｂ１１中に見出される２、９ｋｂｐ及び３．５ｋｂｐ
のＥｃｏＲＩハイブリダイズ断片の両者を含有する。λ
−ＰＬ５　、−６　、−１０及び−３３は他のハイブリ
ダイズＥｃｏＲＩ断片と共に３，５ｋｂｐ　ＥｃｏＲ１
回片を含有する。クローンλ−ＰＬ２６及び−２８は２
．９ｋｂｐ　ＥｃｏＲＩ断片を他のハイブリダイズ断片
と共に含有し、他方λ−ＰＬ９は小１．２ｋｂｐハイブ
リダイズＥｃｏＲＩ断片のみを含有する。全構造喝佳り
遺伝子を含有するｐｃＧ３Ｂ１１の完全な５．０ｋｂｐ
　Ｂ　ｇｌ　■断片はクローンλ−ＰＬ４　、−１４及
び−４０のみに存在する。クローンλ−ＰＬ５　、−６
　、−１０．−１４゜＝３３及び−４０中には存在する
がｐｃＧ３Ｂ１１中には存在しない３．７ｋｂｐハイブ
リダイズ・バンドは５．５ｋｂｐ断片中の店佳り遺伝子
の下流に位置する。幾つかのハイブリダイズＢｇｌＩ［
断片はなおベクターの１、２　ｋｂｐの右アームを含有
する。すべてのクローンはまた同一の非ハイブリダイズ
断片を含有する。

従って、構造遺伝子及び遺伝子環境の両者の制限パター
ンはすべてのクローンにおいて同一であるから、これら
は同じ遺伝子、すなわちＡ、ニガーＮ４００株の耐り遺
伝子から生ずると結論付けられる。

プレートされたクローンの数及び３ｘｔｏ’ｂｐの予想
されるゲノムの長さから、平均挿入部長さ１．５ｋｂｐ
を有する２５，０００クローンにつき少なくとも１２個
のＰ壮Ｄクローンが見出されると期待される。分析され
た１０個のクローンの内わずか２個が同一であるからラ
イブラリーは予想以上に複雑である（例３を参照のこと
）。

ＪＭＬ土　ｅｌＤ　　　Ｏローニン それぞれＡ、ニガーＮ４００及びＮ７５６のル江り遺伝
子を含有するλ−ＰＬ４及びｐｃＧ３Ｂ１１の５．０ｋ
ｂｐ　Ｂｇｌｌｌ断片をプラスミドｐＢＲ３２２（クロ
ーニングベクターを参照のこと）のＢａｍＨＩ部位にサ
ブクローニングする。４ｎのλ−ＰＬ４及び２ｊｒｇの
ｐｃＧ３Ｂ１１を２０ｍ中でＩＯＵのＢｇｌＩＩを用い
て３７°Ｃにて２時間、完全消化する。ＴＢＥ＋　１　
ｐｇ／ｄ臭化エチジウム中１％低融点ＬＭＰアガロース
（ＢＲＬ）上で５０Ｖにて断片を分離する。５．０ｋｂ
ｐの断片をゲルから切り出し、０、４　ｊｌｌｉ！のＴ
Ｅで稀釈し、等容量のフェノールを加え、そしてこの混
合物を６５°Ｃにて１０分間加熱してアガロースを溶融
せしめる。エッペンドルフ５４１４Ｓ机上遠心機中で１
２０００ｒｐｍにて５分間の遠心分離の後、水相をフェ
ノール／クロロホルム及びクロロホルムで抽出し、エタ
ノール沈澱せしめ、洗浄し、乾燥し、そして最後に１０
Ｊ１１の低濃度ＴＥ中に溶解する。

大規模プラスミド調製法（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、８６頁
、参照文献５）により調製されそしてＣｓＣ１勾配遠心
により精製された１鱈のｐＢＲ３２２ＤＮＡを５ＵのＢ
ａｍ）Ｉ　Ｉにより３７°Ｃにて２時間、２ｏＪ１１の
容量中で消化する。２Ｉのｌ０ＸＣＩＰ　緩衝液及び０
．０２ユニツトのＣＩＰを添加し、そしてインキュベー
ションをさらに３０分間続ける。ＥＤＴＡを最終濃度２
５ｍＭに添加し、そしてこの混合物を６５°Ｃにて１０
分間加熱する。

この溶液をＴＥにより２００Ｉに稀釈し、そしてＴＥ飽
和フェノールで３回、フェノール／クロロホルムで１回
、及びクロロホルムで１回抽出する。

エタノール沈澱の後、ＤＮＡを５ｏＩＩＩの低濃度ＴＥ
に？容量する。

１１００ｎの断片ＤＮＡを２０ｎｇのベクターＤＮＡと
、２０μｌの容量において、例１．４に記載した条件下
で連結する。この連結混合物の半分を用いて、ＣａＣｌ
　ｚ法（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、参考文献５．２５０頁）
により調製した大腸菌ＭＨＩコンピテント細胞を形質転
換する。細胞を、５０ｎ／Ｉｌ！アンピシリンを含有す
るＬＣ寒天プレート上に置き、そして３７゛ｃにて一夜
インキユベートする。コロニーをまず２０μｇ／ｄのＴ
ｃを含有するＬＣプレート上にストリ−りし、そして次
にＬＣ＋　ａｍｐｍｐ−レート上トリークすることによ
り、形質転換体をテトラサイタリン感受性について試験
する。形質転換体を５ｄのＬＣ＋　ａｍｐ中で３７°Ｃ
にて一夜増殖せしめ、そしてアルカリ溶解ミニプレツブ
法（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、参考文献５．３６８頁）を用
いて１．５１の培養物からＤＮＡを単離する。

ミニプレツブＤＮＡをＢａｍ１ｌ　Ｉ及びＰｓｔｌによ
り消化し、そして断片を１％アガロースゲル上で分析す
る。５．０ｋｂｐ　Ｂ　ｇｌ　ＩＩ断片を反対方向に含
有する、λ−ＰＬ４由来の２つのプラスミドをｐＧＷ８
４０及びｐＧＷ８４１と称する。ｐＣＧ３Ｂ　１１由来
の他のプラスミドをｐＧＷ８７０及びｐＧＷ８７１と称
する。これらを有するＭＨＩ細胞をグリセロール上に一
７０°Ｃにて保持する。これらのクローンの０．５２の
培養物からのプラスミドＤＮＡを大規模に単離しくＭａ
ｎｉａｔｉｓ等、参考文献５．８６頁）、ＣｓＣ１遠心
により精製し、フェノール抽出し、エタノール沈澱せし
め、そして４００Ｉの低濃度ＴＥに溶解する。収量は約
５００汀である。これらのプラスミドを制限地図の作成
に付す。プラスミドｐＧＷ８４０のマツプを第２図に示
す。これはｐＧＷ８７０と区別できない。さらに、反応
方向に断片を含有するプラスミドｐＧＷ８４１とｐＧＷ
８７１は区別できず、Ａ、ニガーＮ４００株及びＮ７５
６株からの耐り遺伝子が同一であることが示される。

例１．１に記載したようにして単離された、Ａ。

ニガーＮ４００株のＤＮＡサンプル２ｎを２ｏＪｌｌの
容量中で３７°Ｃにて４時間、ＨＨＡＢ／ｇ緩衝液中で
ＢａｍＨ［（ＢＲＬ）又は旧ｎｄ　ｍ　（ＢＲＬ）を用
いて消化する。消化されたサンプルを０．６％アガロー
スゲル上で４０Ｖにて１８時間電気泳動的に分離する。

ＤＮＡをニトロセルロースに移し、そして例２．３に記
載したようにして乾熱する。（プレ）−ハイブリダイゼ
ーション溶液は例２．１に記載したものと同じである。

プレハイブリダイゼーションのために用いた温度は常に
ハイブリダイゼーション温度と同一である。耐り遺伝子
のコード領域を含有するｐＧＷ８４０のニック・トラン
スレーションされた１、６ｋｂｐ　ＢａｍＨＩ／Ｐｓｔ
ｌ断片をプローブとして用いた。ハイブリダイゼーショ
ンを異る温度（５２’Ｃ、６０°Ｃ及び６８°Ｃ）にお
いて１６時間及び４０時間行う。３つの異る温度におい
て次の２種類の洗浄条件を用いる：２Ｘ３０分間、５　
Ｘ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳ、次に２×３０分間、３ＸＳ
ＳＣ，０，１％ＳＤＳ　、　これに対して４×３０分間
、５ＸＳＳＣ，０，１％ＳＯ５、６８°Ｃにためには、
２ｘｓｓｃ。

０、１％ＳＯＳによる２回の洗浄及び０．２　Ｘ５ＳＣ
，０，１％ＳＯＳによる２回の洗浄も含める。６８°Ｃ
において、０．２ＸＳＳＣ洗浄を用いてホモロガス（ｈ
ｏｍｏｒａｇｏｕｓ）ハイブリダイゼーションのみ起こ
る。より高い塩濃度の使用が幾つかの他の弱いシグナル
の出現をもたらす。５２℃においてはバックグラウンド
が高く、そしてハイブリダイゼーションは弱い。［ヘテ
ロロガスＪ　（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）　Ａイブリ
ダイゼーションのために見出される最良の条件は、５ｘ
ｓｓｃと３ＸＳＳＣの組合わせ洗浄を用いて６０°Ｃに
て４０時間である。これは、５ｘｓｓｃと３ＸＳＳＣと
の組合わせの代りに４ＸＳＳＣと２ＸＳＳＣの組合わせ
を用いることにより一層最適化することができる。

ｐＧＷ８４０の１．６ｋｂｐ　ＢａｍＨＩ　／　Ｐ　ｓ
ｔ　Ｉ断片を用いてプローブする場合にＡ、ニガー皿の
これらのゲノムプロットで見られるシグナルを第１表に
まとめる。

課」」表 ｐＧＷ８４０からの１．６ｋｂｐ　ＢａｍＨＩ　／　Ｐ
　ｓｔ　ＩによりプローブされたＡ、ニガー顯のゲノム
ＤＮＡのハイブリダイゼーションシグナル 輿１１−イブ−１−のスフ１−ニング Ｎ４００λライブラリーからの２．５Ｘ１０’のファー
ジを５枚のプレート上に置き、そして例２．１に記載し
たようにして各プレートから３枚のニトロセルロースレ
プリカを作る。（プレ）ハイブリダイゼーション緩衝液
も例２．１に記載した通りである。

各プレートからの第一レプリカを６０°Ｃにて４０時間
、ｐＧＷ８４０の１．６ｋｂｐ　ＢａｍＨＩ　／　Ｐ　
ｓｔ　Ｉ断片とハイブリダイズせしめ、そしてその温度
で３０分間４ｘｓｓｃ。

０．１％ＳＯＳにより、そして３０分間２　Ｘ５ＳＣ，
０，１％ＳＤＳにより２回、例３．１に記載したように
して洗浄する。これらの条件をヘテロロガス条件と称す
る。各プレートからの第二のレプリカを６８°Ｃにて同
じ断片とハイブリダイズせしめ、２　Ｘ５ＳＣ，０，１
％ＳＯＳにより３０分間ずつ２回、そして０．２　Ｘ　
ＳＳＣ。

０、１％ＳＯＳにより３０分間ずつ２回、この温度で洗
浄する。これらの条件をホモロガス条件と称する。

各プレートからの第三のレプリカをホモロガス条件下で
ｐＧＷ８４０の０．３５ｋｂｐ　ＢａＩＩＩ）ｌ　１断
片とハイブリダイズせしめる。この断片は前記１．６ｋ
ｂｐ　Ｂａｍ１ｌ　Ｉ　／Ｐｓｔｌ断片に直接隣接した
ｍｌＤのプロモーター領域中に位置する。ヘテロロガス
条件下でノ＼イブリダイズするがホモロガス条件下では
ハイブリダイズしないか（又は非常に弱くハイブリダイ
ズする）２９個のプラークが得られる。これらをλ−Ｐ
Ｌ１０１〜λ−ＰＬ１２９と命名する。ホモロガス条件
下及びヘテロロガス条件下でＢａｍＨＩ　／　Ｐ　ｓｔ
　ｌプローブと強くハイブリダイズする１９個のプラー
クを得る。

これらをλ−ＰＬ１３０〜λ−ＰＬ１４８と命名し、そ
して止１Ｄクローンであると考える。これらの内２個（
λ−ＰＬ１４５及びλ−ＰＬ１４６）は０．３５８ａｍ
ｌｌ　ｌプローブと弱くのみハイブリダイズし、そして
それ故におそらくプロモーター領域の部分のみを含有す
る。

他のものは強くハイブリダイズする。０．３５ｋｂｐＢ
ａｍｌｌ　１プローブのみとハイブリダイズする唯一の
クローン（λ−ＰＬ１４９）が得られる。

すべてのクローンを拾い上げ、そしてプレートしそして
１．６ｋｂｐ　ＢａｍＨＩ　／　Ｐ　ｓｔ　ｌプローブ
とへテロロガス条件下でハイブリダイズせしめることに
より２回精製する。第二のスクリーニング実験において
２３個のは佳Ｄクローン及び２５個の他のクローンをさ
らに得る　（λ−ＰＬ１５１〜λ−ＰＬ１９Ｂ）。

この実験においては、Ｐ壮Ｄコード領域の異る種々の部
分をプローブとして用いることにより、単離されたクロ
ーンの分類を記載する。λ−ＰＬ１０１〜−１３０及び
−１４５が含まれ、他方λ−ＰＬ４は陽性対象として使
用する。クローンをプレートしそして１枚のみレプリカ
を作り、これを６個の部分に分ける。これは、レプリカ
間のハイブリダイゼーションシグナルの差異を排除する
ことを意味する。レプリカの別々の部分を下記の３ｚＰ
ラベル化プローブと、ホモロガス条件下及びヘテロロガ
ス条件下でハイブリダイズせしめる。

１、ｐＧＷ８４０からの完全な１．６ｋｂｐ　ＢａｍＨ
Ｉ　／　Ｐ　ｓｔ　Ｔ断片 ２、ｐＧＩＩＪ８４０からの６４９ｂｐ　Ｂａｎ＋ＨＩ
　／　Ｘｈｏ　Ｉ断片（耐りのＮ−末端コード部分） ３、　　ｐＧＷ８４０からの２４４ｂｐ　Ｘｈｏ　Ｉ　
／　Ｐ　ｓｔ　Ｉ断片卵重りのＣ−末端コード部分） λ−ＰＬ４　、−’１３０及び−１４５並びにλ−ＰＬ
１０１はこれらのプローブと、ホモロガス条件及びヘテ
ロロガス条件下で強くハイブリダイズし、ＬｉＤクロー
ンと予想される。後者のクローンλ−ＰＬ１０１は例３
．２においてフィルターの縁の部分に位置し、そしてそ
れ故に第一のスクリーニングにおいては止１０としてス
コアーされない。上記のクローンはクラスＩ　（ル壮［
１）クローンとして分類される。λ−ＰＬ１１２　、−
１２６及び−１２７はこの実験において陰性と除去され
る。他のすべてのクローンは他の２つのクラスに分ける
ことができる。クラス■は全体プローブとのみならずＮ
−末端プローブともへテロロガス条件下でハイブリダイ
ズする。ブローフトして全体は江り遺伝子を用いる場合
ホモロガスハイプリダイゼーションは弱い、クラス■プ
ローブはＮ−末端プローブとは全くハイブリダイズせず
、そして、さらにホモロガス条件下で全体プローブとハ
イブリダイズしない。Ｃ−末端プローブはクラス■クロ
ーン及びクラス■クローンの両者とハイブリダイズしな
い。これらの実験から、本発明者等は単離されたクロー
ン間に少なくとも２つの関連する遺伝子が存在すると結
論する。

クラス■のクローンにはλ−ＰＬ１０４　、−１０５　
。

−１０９、−１１３、−１１４、−１１５，−１１９，
−１２２゜１２４　、−１２５　、−１２８及び−１２
９が属する。

クラス■のクローンはλ−ＰＬ１０２．　−１０３゜−
１０７、−１０８、−１１０、−１１１，−１１６゜−
１１８、−１２０、−１２１及び−１２３である。

１０６゜ １１７゜ プレート細胞溶解物ストック、２５０ｚｆｆｉ液体細胞
熔解物、及びこれらの細胞溶解物からの大規模ファージ
ＤＮＡ調製物を例２．２に記載したようにして調製する
。これを２４クローンについて行い、その内の３クロー
ンはは佳Ｄクローン（λ−ＰＬ４゜１３０、−１４５）
である。１つのクローンＤＮＡはＤＮＡ単離の間に失わ
れる（λ−ＰＬ１２４）。これらのクローンから単離さ
れたＤＮＡを合計２０１１！中１ｎのサンプルとして１
０ユニツトの酵素により消化する。すべてのクローンを
ＥｃｏＲＩ　、　ＢａｍＨＩ　、　Ｈｉｎｄｍ　、Ｅｃ
ｏＲＩ／ＢａｍＨＩ　、ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄｌｌｌ　
、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩ［［、及び１ＥｃｏＲＩ　／
　ＢａＩＩＩＨＩ　／　ｌ１ｉｎｄ　ＩＩＩにより消化
する。断片を０．６％アガロースゲル上で分離し、そし
て例２．３に記載されているようにしてニトロセルロー
スフィルターに移す。例３．１に記載したようにして、
プロットをヘテロロガス条件下でｐＧＷ８４０の１．６
ｋｂｐ　Ｂａａ＋ＨＩ　／　Ｐ　ｓ口断片とハイブリダ
イズせしめる。２つのクローンはハイブリダイスしない
（λ−ＰＬ１１２及びλ−ＰＬ１２９）。写真及びオー
トラジオグラムの両者からのハンドの長さを計算する。

λ−ＰＬ１１３クローンを除き、すべてのクローンは完
全なマツプを導くには多過ぎる断片を含有する。

しかしながら、ハイブリダイズする領域のマツプを導く
ことができ、そして他のハイブリダイズしないバンドの
データーを組み合わせることによりどのクローンが同じ
遺伝子に由来するかを帰属せしめることができる。残っ
た１８のクラス■及びクラス■コロニーに間に５個の遺
伝子が存在することが明らかである。これらを正佳Ａ、
　部佳Ｂ、　倶佳ｃ。

シロ、Ｅ及び耐Ｆと称する。これらの遺伝子へのクーロ
ンの帰属を第２表にまとめる。

第１表 種々の遺伝子への単離されたクローンの帰属ｍ表 染色体プロット及び単離された遺伝子におけるハイブリ
ダイズするバンドの比較（バンドの長さｋｂｐ） （部分）は、ハイブリダイズするバンドがこれらのクロ
ーン中に部分的にのみ存在することを意味する。

単離された遺伝子のハイブリダイズする断片の長さ及び
ゲノムＤＮＡプロットからのハイブリダイズする断片の
長さの比較を第３表に示す。これらのデーターから、ゲ
ノムプロット中のすべてのハイブリダイズするバンドが
、単離されたクローン中に存在すること、及びこれらの
ハイブリダイゼーション条件下で他の関連遺伝子は単離
できないことが結論付けられる。プラークハイブリダイ
ゼーションの結果（例３．３）が示すところによれば、
部分的クローンを考慮しなければ、すべての遺伝子が試
験されたプローブとの特異的ハイブリダイゼーションパ
ターンを示す。これを第４表にまとめる。

第４表は、例３．３に記載した実験に従う、ホモロガス
ブラークハイプリダイゼーション及びヘテロロガスプラ
ークハイプリダイゼーションにおける、種々のは佳Ｄプ
ローブとの種々の遺伝子のシグナル強度の比較を示す。

ハイブリダイゼーションの程度を士印の数で示す。ポモ
ロガスｐｅｌＤ遺伝子は少なくとも１０＋印とハイブリ
ダイズする；士非常に弱いハイブリダイゼーション；−
ハイブリダイズせず。

一ニング 例３．３に記載したλクローンから得られるハイブリダ
イズする断片を、ＥｃｏＲＩ　、　Ｂａｍ１ｌ　Ｉ又は
旧ｎｄ■により消化されそして次に脱リン酸化されたベ
クターｐＢＲ３２２にサブクローニングする。ＬＭＰア
ガロースゲルからの断片の単ｆｉｌ！、ベクターの調製
、連結、大腸菌Ｍｌｌｌの形質転換、ミニプレツブＤＮ
Ａ単離及び大規模プラスミド単離はすべて例２．４に記
載した標準的方法を用いて行う。

例２．４に記載したようにして断片を適切なベクターに
連結する。形質転換された大腸菌ＭＨＩ細胞をＬＣ＋　
５０躍／ｚｆＡｍｐ上にプレートする。形質転換体をテ
トラサイクリン感受性について試験スる。

ＥｃｏＲＩクローンはすべて耐性である。次に、ミニプ
レツブＤＮＡを適切な酵素で消化して正しい挿入につい
て試験しそして断片の方向を決定する。

選択されたプラスミドを第５表にまとめる。これらを含
有する細胞を一７０°Ｃにてグリセロール上で貯蔵する
。

第１表 ｐＢＲ３２２中ｍ遺伝子のサブクローンプラスミドｐＧ
Ｗ８２０．　−８３０　、　−８５０　、　−８６０及
び−８８０を大規模に単離し、そして制限酵素地図の作
成にかける。これらのプラスミドの地図を第１図〜第６
図に示す。

遺伝子の位置及び方向を決定するため、プラスミドの消
化物のサザンプロットをヘテロロガス条件下でｐＧＷ８
４０の１．６ｋｂｐ　ＢａｍＨＩ　／　Ｐ　ｓｔ　Ｉ断
片とハイブリダイズせしめ、そして同じプロットを同じ
プラスミドのＮ−末端断片とへテロロガス条件下でハイ
ブリダイズせしめる。この断片はｐＧＷ８２０及び−８
３０のマツピングのためには６４９ｋｂ　ＢａｍＨＩ　
／ＸｈｏＩ断片であり、そしてｐＧＷ８５０及び−８６
０のためには７６６ｂｐ　ＢａｍＨＩ　／　ＥｃｏＲＩ
断片である。

プラスミドｐＧＷ８２０．　ｐＧす８３０．　ｐＧＷ８
５０．　ｐＧＷ８６０及びｐｃｈｓｇｏは大腸菌ＨＢ１
０１中にクローン化され、そして１９８８年２月１日に
、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍａｅｌｕｎｇ　ｆｉｊｒＭ
ｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｇｍｅｎ；　Ｇｒｉｓｅｂａｃ
ｈｓｔｒ、　８．３４００＋　Ｇｉｊｔ−ｔｉｎｇｅｎ
に寄託された。これらはそれぞれＤＳＭ　Ｎｏ。

４３８８、４３８９．４３９０．４３９１及び４３９２
を有する。

Ｊ！！１ＡＬｅｌＤ　　ｅｌＡ、　ｅｌＢびｅｌｃ　　
　の定 例２．４に記載したようにしてＬＭＰアガロースゲル電
気泳動の後にρＧＷ８４０からの適当な制限断片を単離
する。ＢＲＬ　Ｍ１３クローニング／ジデオキシ配列決
定指示手引（参考文献６；２６頁及び２７頁）に従って
、前記の断片をＭ１３ｍｐ１８ＲＦベクター及びＭ１３
ｎｐ１９ＲＦ　＜　’）　ターニ連結する。大腸菌ＪＭ
１０３　（７）形質転換、最少Ｘ−ｇａｌ指示プレート
上でのブレーティング、及び組換ファージがらの単ｔＪ
（Ｄ　Ｎ　Ａの単離を前記手引（２９〜３４頁）の指示
に従って行う。少数のクローンを、ＢＲＬ手引の３８〜
７４頁に記載されているＳａｎｇｅｒジデオキシチエイ
ンターミネーション法を用いて配列決定する。

ヌクレオチド−４５７と＋１００との間の決定されり配
列ハ、Ａ、ニガーＮ７５６に由来しそしてプラスミドｐ
ｃＧ３Ｂ１１（ＥＰ　８８１０１３９７．３）中に存在
するＰＬ■遺伝子の対応する配列と同一である。−４５
７位のＢａｍＨＩから＋１００位までの決定された配列
はプロモーター配列の４５７ヌクレオチド、シグナル配
列をコードする５７ヌクレオチド及び成熟ＰＬＤ蛋白質
の最初の１３個のＮ−末端アミノ酸をコードする４３ヌ
クレオチドを含んで成る。

ｐＧＷ８４０中のＮ４００耐り遺伝子及びｐｃＧ３Ｂ１
１中のＮ７５６　ｍｌＤの同じ制限地図並びに完全に同
一のＮ末端配列データーから、同遺伝子は同一であるこ
とが予想される。従って、ＰＬＤ蛋白質は以前のＰＬＩ
蛋白質と同一であることが予想される。

相ユｅｌＡ　　ｅｌＢびｅｌｃ’　　のｐＧＷ８２０．
　ｐＧＷ８３０及びｐＧＷ８５０の断片をＭ１３ｍｐ１
８ＲＦ及びＭ１３ｍｐ１９ＲＦ　（例４．１を参照のこ
と）に、又はプラスミドｐＥＭＢＬ１８及びｐＥＭＢＬ
１９　（Ｄｅｎｓｅ等、参考文献７．８）にサブクロー
ニングする。ヘルパーファージＲ４０８（Ｒｕｓｓｅｌ
ｌ等、参考文献９）の感染によりプラスミドクローンの
単鎖ＤＮＡを得る。Ｈｅｎ１−ｋｏｆｆ　（参考文献２
８）の方法によりｐＧＷ８５０からエキソヌクレアーゼ
■除去クローンを調製した。２佳Ｃ遺伝子を含有するｐ
ＧＷ８５０からの３．０ｋｂ　Ｓｍａ　Ｉ　−ＢｇｌＩ
Ｉ断片をｐＥＭＢ１９にサブクローニングする。このク
ローン５０河をＳｍａｌ及び５ａｃｌで消化し、そして
フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈澱の後
、エキソヌクレアーゼ■により消化する。サンプルを種
々の時間間隔で採取し、ＮａＣ１及びＥＤＴＡの添加並
びに７０°Ｃにて１０時間のインキュベーションにより
エキソヌクレアーゼ■を不活性化する。突出した５ｓＤ
Ｎ＾末端をＳＬヌクレアーゼで除去しそして接着末端を
Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化する。自己連結
及びこれらの除去クローンによる大腸ｊ［ＪＭ１０３の
形質転換の後、ヘルパーファージＲ４０８の感染により
単鎖ＤＮＡを得る。

ｐＧＷ８２０を１０００位のＰｖｕＩ［部位から４１７
５位のＣｌａｌ部位まで配列決定する（第１図を参照の
こと）。

ｐｃｈｓ３ｏの場合、２７７４ｂｐ　Ｘｈｏ　Ｉ断片を
配列決定する（第２図を参照のこと）　。ｐＧＷ８５０
は０位のＥｃｏＲ１部位から３１６８位までを配列決定
する（第３図を参照のこと）。

これらの遺伝子の配列決定法を第７図、第８図及び第９
図に示す。幾つかのオリゴヌクレオチドハＣａｒｕ　ｔ
ｈｅｒｓ　（参考文献１０）のホスホルアミダイト法に
より、アプライド・バイオシステム（モデル３８０Ｂ）
オリゴヌクレオチド合成機を用いて合成する。これらを
配列決定プライマーとして使用し、そしてこれらの位置
を第７図及び第８図に示す。

シ１工へ遺伝子の完全な配列を第１０図に５′→３′の
方向に示す。３１７５ｂｐ（７）配列はｐＧＷ８２０中
（７）１０００位のＰｖｕ１１部位の第一ヌクレオチド
から始まりそしてｐＧＷ８２０中の４１７５位のＣｌａ
ｌ部位の最終ヌクレオチドで本名る。

耐Ａ配列はプロモーター領域の１３６０ヌクレオチド配
列、構造部分の１３５５残基及びターミネータ−領域の
３６０ヌクレオチドから成る。

ヌクレオチド配列から推定することができるように、Ｐ
ＬＡのアミノ酸配列（例６．３を参照のこと）は２０個
のアミノ酸のシグナル配列に先行される。

★　　　　六　　　　　　　　　　　　　　★　　　　
　　　　　　　　　　六　　　　大　　　　大Ｐ壮り遺
伝子のシグナル配列との相同性を星印で示す。さらに、
成熟蛋白質の最近の５残基はＢ佳Ａ及びは江りと同じア
ミノ酸配列を示す。

凪Ｂｉ１！を転子の全配列を第１１図に、やはり５′→
３′の方向に示す。２７７４ｂｐはｐＧＷ８３０中のＸ
ｈｏ１部位の第一ヌクレオチドから始まりそして第二の
ＸｈｏＩ部位の最終ヌクレオチドで終る。

正佳Ｂ配列はプロモーター領域の１１３３ヌクレオチド
、構造部分の１３７３残基及びターミネータ−領域の２
６８残基から成る。匹」遺伝子は少なくとも２０個のア
ミノ酸のシグナル配列をコードしている。

ル壮Ｃ配列はプロモーター領域の１３６７ヌクレオチド
、構造部分の１３４０残基及びターミネータ−令頁域の
４６１から成る。Ｐ壮Ｃ１ｆｆ伝子は１８個のアミノ酸
のシグナル配列をコードしている。

耐ｃ　ＭＥＴ−ＬＹＳ−ＶＡＬ−ＰＲＯ−Ｘ−Ｘ−ＰＨ
Ｅ−ＬＥＵ−ＧＬＮ−ＬＥＤ−ＬＥＤＰｉＬＢ★大 庄Ａ★六大 庄り大大 ｐｅｌｃ　　ＣＹＳ−ＬＥＬＩ−ＡＳＮ−ＡＬＡ−ＡＬ
Ａ−ＬＥＵ−ＡＬＡ−５ＥＲ−ＡＬＡ凪Ｂ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　大　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　大　　　　大ＰＪＬＬへ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　大　　　　　　　　　　　
　　　大　　　　　　　　　大胆Ｄ　　　　　　　　★
　　　　　　　　　大　　　　　　　　　大　　　　＊
　　　　　　　　　大餌へ、ル壮Ｂ、及び耐り遺伝子の
シグナル配列との相同性を各位置において星印で示す。

Ｘは配列の整頓のために含める。

真菌のエクソン／イントロン・スプライス連結部位の共
通配列及びイントロン内部配列（Ｂａｌｌａｎｃｅ。

参考文献１１）についての研究によりＰ出入、Ｂ及びＣ
遺伝子中に４個のイントロンが存在することが予想され
る。これらの−ＬＪ」−遺伝子のコード配列内に存在す
るイントロンの位置は、各遺伝子は潜在的に５個のイン
トロン位置を有するが１個の異るイントロンを欠いてい
ると言う意味で保存的（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）である。

しがしなからＰｉＬｃ遺伝子については３個のみのイン
トロンが予想される。これらの内１個はＰ壮Ｏ及びセリ
、Ａ中のイントロン（イントロン５）の位置に相当する
位置に見出される。

これらのイントロンの位置及びそれらのそれぞれの長さ
を第６表ａにまとめる。

玉工ｌニ ジｕＤ　、　胆Ａ　、　庄Ｂ及びＰ■Ｃの配列中のイン
トロンの位置０位置は第１０図、第１１図及び第１２図
中のコード配列並びにＰ壮り配列に関する。

４種類のＵ１遺転子の間でイントロン−イントロン間の
エクソンの長さはこれらの事例において同じである。第
１３図に、ＰＬＡ、　ＰＬＢ、　ＰＬＣ及びＰＬＤの整
頓された推定アミノ酸配列を示す。ｐ！３ｉＡ　＋ｐｅ
ｌＢ及びと佳りのコード領域のＮ−末端部分において、
ヌクレオチド配列相同性に基いて約８０％の相同性が観
察され、そしてアミノ酸配列相同性に基いて８０％を超
える相同性が観察される。この％は胆ＩＣについては非
常に低い。成熟蛋白質の残基２８５（第１３図中の残基
３０５に相当する）の後の匹」。

凪Ｂ及び凹すのＣ−末端部分において、相同性はは大き
く失われそしてＣ−末端の近傍でのみもとにもどる。

スプライシングシグナル並びに５′−及び３′スプライ
シング部位の共通配列（第６表ｂ）を除き、イントロン
中に相同性は見出されない。

勇ｍ 共通イントロン配列の比較 蛋白質ＰＬＡ、　ＰＬＢ、　ＰＬＣ及びＰＬＤについて
の推定アミノ酸配列は最初の２つの蛋白質については合
計３５９残基、ＰＬＣについては３６０そしてＰＬＤに
ついては３５４を示す。Ｎ−グリコジル化部位について
は、４種類すべての蛋白質に１０９位（成熟蛋白質にお
ける）（Ｐ　Ｌ　Ｃについては、これは整頓されていな
い配列中の１０５位に相当する。）に１個の潜在的なグ
リコジル化部位が存在する。ＰＬＢにおいては第二の潜
在的部位が２３２位に存在し、他方ＰＬＣにおいては他
の２個の潜在的グリコジル化部位が残基２５５位及び３
２９位に存在する。

すべてのプラスミドを大腸菌ＭＨＩ株において増加せし
め、そしてプラスミドＤＮＡを、Ｍａｎｉａｔｉｓ等（
参考文献５；９０〜９１０）により記載されていルヨう
にして５００　ｄの一夜培養物から回収する。

１　ｍｇ以下のＤＮＡを含有するＴＥ中ＤＮＡ溶液２、
５７に、２．２ｇのＣｓＣβ及び１戚の臭化エチジウム
（水中１０■／ｍりを加える。この溶液をクイック・シ
ール・チューブに取り、そして供給者（ヘックマン）が
推奨するようにして満たしそしてシールする。遠心をＶ
Ｔｉ　６５．２０−ターにおいて２０°Ｃにて１６時間
４５．００Ｏｒｐｍで行う。紫外線の下で見える２個の
蛍光バンドの内、プラスミドＤＮＡを含有する低い方の
ハンドを、チューブの側壁に穿孔することにより単離す
る。ＤＮＡ溶液（約１ｍ１）を水飽和ブタノールで５回
抽出して臭化エチジウムを除去する。次に、ＤＮＡをエ
タノールで沈澱せしめ、ＴＥに再懸濁し、フェノール／
クロロホルム及びクロロホルムで１回抽出し、再度温蔵
せしめ、そして−２０°Ｃで貯蔵する。

５ｋｂｐ　Ａ、　ニガーＤＮＡ断片上ニＯＭ　Ｐ　−テ
カルボキシラーゼ遺転子憧■Ａ）を担持するプラスミド
ｐＧＷ６１３を用いて形質転換体を選択する（Ｇｏｏｓ
ｅｎ等、参考文献１２）。例３，５に記載されているブ
ラスミドｐＧＷ８２０．　ｐＧＷ８３０．　ｐＧＷ８４
０．　ｐＧＧａ２Ｏ３ｐＧＷ８６０及びｐＧＷ８８０を
同時形質転換プラスミドとして使用する。

親株Ｎ４００の誘導体であるＡ、ニガーＮ５９３株ｍＡ
　ｌ　ｆｆ１Ａ）をＧｏｏｓｅｎ等（参考文献１２）に
より記載されているようにウリジンの存在下で、酵母に
おけるように毒性類似体５−フルオロオロチン酸に対す
る正の選択により得た（Ｂｏｅｋｅ等、参考文献１３）
。

０．５％酵母エキス、０．２％カザミノ酸、１０ｍＭウ
リジン（Ｊａｎｓｓｅｎ　Ｃｈｉｍｉｃａ）及び５抛門
グルコースを補充した液体最少培地にＡ、ニガーＮ５９
３の分生胞子１０６個／ｄを接種し、そしてＮｅｗ　Ｂ
ｒｕｎｓｗｉｃｋ回転シェーカー中で３０″Ｃにて２０
時間インキュベートする。ミラクロス（Ｍｉｒａｃｌｏ
ｔｈ）を通しての濾過により菌糸を集め、１．３３Ｍソ
ルビトール、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓｌｌｃ　ｌ　（ｐｌ＋
７．５）　、５０ｍＭ　ＣａＣｌ　ｚの組成を有し、１
．７ＩＩｌＯ３１１１に調整された等張（ＳＴＳ）最少
培地（ＳＴＣ）により洗浄する。１ｇの菌糸を２０ｍｆ
ｌのＳＴＣに再懸濁する。フィルター除菌したノボチー
ム（Ｎｏｖｏｚｙｍ）２３４（ノボ・インダストリーズ
、デンマーク）２５０ｍｇを添加しそしてこの混合物を
３０°Ｃにて９５ｒｐｎ＋のシェーカー中でインキュベ
ートすることにより菌糸からプロトプラストを２時間以
内に放出せしめる。

ガラス綿の栓を有する漏斗を用いて濾過することにより
プロトプラストを残留菌糸から分離し、そして遠心分離
してベレット化しそしてＳＴＣに再懸濁することにより
精製する。

形質転換のため、５１０６個のプロトプラストを２００
ｔ！ｌニ取り、次ニコれを１　ｐｇノｐＧＷ６１３及び
プラスミドｐＧＷ８２０．　ｐＧＷ８３０．　ｐＧＷ８
５０．　ｐＧＷ８６０又はｐＧＷ８８０のいずれかｌＯ
が（２０μｌ未満の容量）と共にインキュベートする。

ｐＧＷ８４０のため、１：３の比率を使用して６　ｐｇ
のｐＧＷ６３１を用いる。プラスミドＤＮＡをプロトプ
ラストに加えた後、５０μｌのＰＣＴ（Ｉ０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｊ２（ｐＨ７，５）、　　５０ｍＭ　ＣａＣ
／２ｚ、　２５％ＰＥＧ　６０００）を加え、そしてイ
ンキュヘーション混合物を２０分間氷上に置く。

次に、さらに２成のＰＣＴを加え、そしてこの混合物を
さらに５分間室温にてインキュベートする。最後に、４
１１ｄｌのＳＴＣを加え、そして混合する。この最終形
質転換溶液のｌｄのアリコートを、０．９５Ｍシューク
ロースにより安定化された（Ｉ．７ｍ０ｓｉに調整）液
化した等張ＭＭ上層寒天４　ｍｆｌと混合する。このプ
ロトプラスト混合物をすぐに、同し等張最少培地を含有
する寒天プレート上にプレートし、そしてこれらを３０
°Ｃにてインキュベートする。適切な対照実験は、プラ
スミドＤＮＡを用いないで同様に処理したプラスミド及
び２．５＋ｗＭウリジンを含有する非−安定化最上培地
上でのプロトプラストを含む。

３０°Ｃにて３日間の増殖の後、良好に増殖し胞子を形
成する形質転換体が出現する（５０〜１５０個の形質転
換体／ｎｐＧＷ６１３）。他方、多数のおそらく失敗の
形質転換体が出現する。次に、個々の形質転換体の胞子
を取り、そして５０ｍＭグルコース最少培地上で別々に
プレートしてシグナルコロニーを得、これを用いて更な
る形質転換分析のために胞子を増加せしめる。

各場合において少なくとも１０個の形質転換体を液体最
少培地上で培養し、ＤＮＡを抽出し、そして同時形質転
換プラスミドＤＮＡの存在について分析する。植物ＲＮ
Ａを単離するのに使用される方法（Ｓｌａｔｅｒ等、参
考文献１４）をわずかに変更して真菌ＤＮＡを単離する
。菌糸を塩水で洗浄し、液体窒素中で凍結し、そしてマ
イクロ膜破砕機（ブラウン）を用いて０．５ｇを破砕す
る。菌糸の粉末を新しく調製した抽出緩衝液により抽出
する。

抽出緩衝液は次の様にして３ＩＹする。１　ｍｌのトリ
イソプロピルナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）　２０ｍ
ｇ／戚をｌｄのｐ−アミノサリチル酸（ＰＡＳ）　（Ｉ
２０ｍｇ／ｍ２）及び０．５　ｍｌの５ＸＲＮＢ緩衝液
（５ｘＲＮＢは１２中に１２１．１ｇのＴｒｉｓ　、　
　７３．０４　ｇのＮａＣｌ及び９５．１ｇのＥＧＴＡ
を含有する；　ｐＨ８，５）と混合する。

１、５　ｍｆｌのフェノールを加えた後、抽出緩衝液を
５５°Ｃにて１０分間平衡化する。次に、この温緩衝液
を菌糸粉末に加え、そしてこの懸濁液をポルテックスミ
キサーを用いて十分に１分間撹拌する。次に、１　ｍｆ
ｌのクロロホルムを加え、そして１分間混合する。

遠心分Ｍ（Ｉ０分間、１０，０ＯＯＸ　ｇ）により水相
を分離し、そして等容量のフェノール／クロロホルム（
Ｉ：　１）によりもう−度、そして次にクロロホルムに
より２回抽出する。

この水相はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含有する。

ＤＮＡを室温にて２容量のエタノールで沈澱せしめ、遠
心分離（Ｉ０分間、１０，０ＯＯＸｇ）により集め、無
菌蒸留水に再溶解しそしてそれをエタノールで再度沈澱
せしめることにより２回洗浄する。最終溶液にＲＮアー
ゼＡ　（２０ｎ／ｍｌ）を添加することによりＲＮＡを
除去する。この方法が高分子ＤＮＡ（Ｉ００〜２００ｋ
ｂｐ）を約３００屑ＤＮ八／ｇ菌糸の収率で提供し、そ
して実質的にＭａｎｉａｔｉｓ等（参考文献５゜９３頁
）の方法に従ってＣｓＣ１／臭化エチジウム密度勾配遠
心によりさらに精製する。

耐へ（ｐＧＷ８２０）及びル壮Ｃ（ｐＧＷ８５０）形質
転換体についてはＥｃｏＲＩと共に、胆Ｂ　（ｐＧＷ８
３０）形質転換体についてはｌ１ｉｎｄｌｎと共に、そ
してＰ壮り形質転換体についてはＥｃｏＲＩ又はＢｇｌ
ｌ［と共に、３７°Ｃにて２時間インキュベートするこ
とにより染色体ＤＮＡ　（２μｇ）の消化物を調製する
。すべての場合において、最初に２０Ｕの制限酵素を使
用し、次に再度２０Ｕの制限酵素を添加することにより
さらに２時間インキュヘーションを延長する。消化は、
ＢＲＬにより提供される適切な反応緩衝液中で行う。

次に、ＤＮＡを０．６％アガロース上で分画し、ニトロ
セルロースにプロットし、そして本質的にＭａｎｉａｔ
ｉｓ等（参考文献５．３８２〜３８６頁）により記載さ
れているようにして、対応する〔α−３２Ｐ〕ラヘル化
ゾローブを用いてハイブリダイズせしめる。

次の同時形質転換頻度が見出される：　ｐＧＷ８２０（
ｐ」し１八）７０％　；　ρＧＷ８３０　　（２旦Ｉ　
Ｂ）７０％　；　　ｐＧＷ８４０　　（耐Ｄ）１５％；
　ｐＧＷａ！５ｏ　（ｓ壮Ｃ）　６０％。

ｐＧＷ６１３対同時形質転換プラスミドｐＧＷ８２０゜
ｐＧＷ８３０．　ｐＧＧａ２Ｏ３１：　１０）及びｐＧ
Ｗ８４０（Ｉ：　３）の質量比が、観察される多くの場
合において、同時形質転換プラスミドの多コピー染色体
組み込みを導く。

３ｊ〔肩入ｅｌＡで　　　　　れたＡ　ニガーＡ１５例
５．２に記載した多数の多コピー形質転換体を分析した
。ｐｅｌＡ形質転換体Ａ１５の分析を詳細な例として記
載する。

Ａ、ニガーＮ５９３株のＤＮＡ及び多コピー形質転換体
凹↓Ａ株Ａ１５のＤＮＡを単離し、例３．１に記載した
ようにしてサザンプロットのハイブリダイゼーションに
より分析する。ｐ！ｉＬＡプローブとして７．５ｋｂｐ
　ＥｃｏＲＩ断片を使用する（第３図ａを参照のこと）
。このゲノムプロットにおいて、７．２ｋｂの強いハン
ドが、タイプＩ及び／又はタイ１０組込み現象（Ｈｉｎ
ｎｅｎ等、参考文献１４ａを参照のこと）から生ずる形
質転換された株Ａ１５中に見出される。

さらに、種々の長さの幾つかの弱いバンドが見出され、
これは再配置（ｒｅａｒａｎｇｅｍｅｎ　ｔ）のタイ１
０組込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）現象の境界断片を
代表するものである。

Ａ、ニガーＰ壮Ａ形質転換体Ａ１５及びＡ、ニガーＮ５
９３のオートラジオグラムにおける７、４ｋｂ　Ｅｃｏ
ＲＩハントの光学密度をウルトロスキャン（ＩＩ　ｌ　
ｔｒｏｓｃａｎ）ＸＬ　（ＬＫＢ）を用いてスキャンニ
ングする。両菌株に単一コピーとして存在するピルベー
トキナーゼ遺伝子トハイブリダイズする第二プローブヲ
用いて得られた濃度をスキャンニングすることにより、
Ｎ５９３と形質転換体Ａ１５との間のＤＮＡｆＡ度のわ
ずかな差異に関して値を補正する。これらのデーターか
ら、部壮へ形質転換体Ａ１５中には壓佳Ａ遺伝子の約１
９個の完全なコピーが存在することが算出される。

ρ舗８３０の旧ｎｄｌｌＴ挿入部（第３図ｂ）をプロー
ブとして用いて、形質転換されたＡ１５株のサザンプロ
ットを解析した場合、ルｌＡ遺伝子の組込み（ｉｎｔｅ
ｇｒａｔｉｏｎ）は四辻Ｂ遺伝子座では起っていないこ
とが示される。同様に、適切な対応するプローブを用い
て、形質転換されたｕｉＢａ　Ｂ　１３、ｐｅｌｃ株Ｃ
１６及び耐り株ＤＩ２を解析した場合、約１０　、１５
及び１ｏのコピー数が与えられる。

ｌ土　ｅｌＡ　　　　　Ａ、　ニガーＡ１５　　の　び
５０ｍＭグルコース又は１％（Ｗ／Ｖ）のリンゴペクチ
ン（Ｂｒｏｗｎ　　Ｒｉｂｂｏｎ、　　ｄ、ｅ、７２．
８　　％、　　０ｂｉｐｅｋｔｉｎ　　ＡＧ＋Ｂ１５ｃ
ｈｏｆｓｚｅｌ　Ｉ）を含有する最少培地（２５０ｄ）
に形質転換体Ａ１５の胞子又は野性型株Ｎ４００の胞子
を１０’胞子／ｄの胞子密度で移し、そして３０°Ｃに
て３０時間の増殖の後収得する。培地のサンプル（２ｄ
　）をさらに集め、２２の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）に対して４°Ｃにて透析し、そして−２０°Ｃ
で貯蔵する。

例５．２に記載したようにして菌糸から核酸を単離する
。クロロホルム抽出の後、１／３容■の８ＭＬｉＣ１の
添加によって水相からＲＮＡを沈澱せしめる。溶液を十
分に混合し、０°Ｃにて一夜インキユヘートする。ＭＳ
Ｅ　５ｕｐｅｒ−旧７゜、遠心分離機を用いる遠心分Ｍ
　（３００ｒｐｍ、　３０分間）によりＲＮＡを集め、
そして次に冷（−２０°Ｃ）　２Ｍ　ＬｉＣｆｆ１によ
り１回、そして冷（−２０°Ｃ）９６％エタノールによ
り１回洗浄する。最後に、このＲＮＡを蒸留水に約１■
／　ｍｌの濃度で溶解する。この調製物はＤＮＡを実質
的に含有せず、菌糸ｇ当り１〜２■のＲＮＡの取計で得
られる。ｌｋのＲＮＡをＭａｎｉａｔｉｓ等（参考文献
５．２０２〜２０３頁）に従って変性ホルムアルデヒド
１％アガロースゲル上で泳動せしめ、この場合分子量マ
ーカーとして１ＩｉｎｄＩＩＩ消化λＤＮＡ又はＢＲＬ
からのＲＮＡラダー（ｌａｄｄｅｒ）を使用する。ゲル
を製造者により推奨されるようにしてニドラン（Ｎｙｔ
ｒａｎ）（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ
）上にプロットし、そして乾熱し、そして７．４ｋｂｐ
　ＥｃｏＲＩ川−Ａ　ＤＮ＾プローブと６８°Ｃにて１
６時間ハイブリダイズせしめる。ハイブリダイゼーショ
ン及び洗浄方法は例３．２に従うホモロガス条件下での
ＤＮＡハイブリダイゼーションについて記載した通りで
ある。

両Ａ、ニガー株は約１．６　ｋｂｐの長さのペクチン誘
導性ｍＲＮＡを産生ずる。２つのオートラジオグラムの
光学密度のスキャンニングが示すところによれば、Ａ１
５形質転換体と野性型株との間で１５〜２０倍の強度差
があり、これはサザンプロット分析から計算されたコピ
ー数の増加に相関する。

例５，２に従って得られたＡ、ニガーＰ江り形質転換体
Ｄ１２を、ポリガラクチュロナーゼの製造のために、ｔ
ｌｅｒｌｌｅｒｓｄ６ｒｆｅｒ等（２７）により記載さ
れている方法と同様の二段階培養法により増殖せしめる
。シュガービートシロップ（４％）及びＮ）１４ＮＯ３
（Ｉ％）を含有する前培養培地（ＰＣＭ）　（ｐＨ４，
５）への１０６胞子／ｄの接種により液体培養物の表面
に菌糸層が形成される。３０°Ｃにて５日間の増殖期間
の後、３０ｄの培地に増殖した菌糸を塩水で洗浄しそし
て５０ｄの主培養培地（ＭＣＭ）に移す。この培養物を
３０°Ｃにて１１００ｒｐの回転振とう機中で増殖せし
める。培地！当りのＭＣＭの組成はグルコース（５％）
、ペクチン（ｄ、ｅ、７２．８％、０．１％）、　ＮＨ
ＪＯｉ（０，７５％）、　　Ｋｕ、ｐｏ４（０，５％）
、　Ｆｅ５０．　’　７ＨｚＯ（０，０３％）、　Ｍｇ
５Ｏ，’　７ＨｚＯ（０，０３％）、　ＣａＣ１ｚｃｏ
、０３％）。

ＮａＮ０：＋　（０，０３％）　（ｐＨ４，５）である
。サンプルを種々の時点で２４時間にわたり採取し、そ
してＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により分析する
。ＬｉＤの発現は７時間以内の培養ですでに最高である
。この蛋白質は比較のため使用したｐＨと同じ様に泳動
する。

透析された培養濾液（例５．４）を凍結乾燥し、０、２
　ｍｌの蒸留水に再懸濁し、そして標準的方法（Ｌａｅ
ｍｍ　ｌ　ｉ等、参考文献１５）を用いて５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかける。分＾Ｕされた蛋
白質をニトロセルロースに移行せしめる（Ｔｏｗｂｉｎ
等、参考文献１６）。プロットを室温にて５時間、０．
３５Ｍ　ＮａＣ１を含有する１０ｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ１１
ｃ／２緩衝液（ｐＨ７，５）中１％ＢＳ八溶液へ飽和せ
しめる。次に室温ニア１６時間、１５０ｍＭ　ＮａＣ１
０，５％Ｂ５Ａｍ、　　１％トリトンＸｌ００．０．５
％デオキソコレート及び０．１％ＳＯＳを含有する同し
緩衝液５０ｍｊ！中で、ｖａｎ　Ｈｏｏｄｅｈｏｖｅｎ
（Ｉ９７５）に従って精製された２種類のペクチンリア
ーゼに対して生じさせたポリクローナル抗体（０，１％
）と共にインキュベートした。次に、プロットを２００
ｄのＰＢＳで５回洗浄した後、５０成当り３０．Ｊの二
次抗体としてのヤギの抗−ラビット　ＩｇＧ−ＨＲＰ（
シグマ）と共にインキュベートし、そして再びＰＢＳに
より５回洗浄する。最後に、基質として４−クロロ−１
−ナフトールを用いてプロットを染色する。４０ｍｇの
基質を０、５　ｄの９６％エタノールに溶解し、そして
次に１ｏａｄの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ
７，５）及び３０Ｉの３０％過酸化水素と混合し、そし
て次にプロ・ノドに加える。

ｌ久 耐Ａ形質転換株の分生胞子をペトリ皿当り約４０コロニ
ーの胞子密度で、０．０１％トリトン−Ｘ１００及び炭
素源としてのリンゴペクチン（Ｉ％、　ｄ、ｅ。

７２．８％、　０ｂｉｐｅｋｔｉｎ）を含有する１％寒
天で固化した最少培地の上面に置いた無菌濾紙（Ｓｃｈ
　ｌｅ　１ｃｈｅｒ＆　５ｃｈｕｅｌｌ）上に接種する
。３０“Ｃにて７２時間インキュベートして個々のコロ
ニー（２〜４ｍｍ）を生じさせる。この濾紙を他の無菌
ペトリ皿に移し、そし培地を含む皿を、蒸留水中ルテニ
ウムレッド（ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ　ｒｅｄ）　（０，１
％−／ｖ）５ｍｆ以上により染色し、２時間インキュベ
ートしそして次に蒸留水で数回洗浄して未吸着色素を除
去する。この操作は、細菌ペクテートリアーゼ酵素活性
を特徴付けるためにポリガラクチュロネートについてＲ
４ｅｄ及びＣｏ１１ｉｅｒ（参考文献１７）により記載
されている方法に本質的に従って行う。ＰＬＡ蛋白質を
過剰生産（ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｅ）する形質転換体は
、個々のコロニーの周囲のハローの直径が親株Ｎ４００
に比べて大きくなることにより検出される。

例５に記載したＡ、ニガーＰ壮Ａ形質転換体Ａ１５をベ
トリ皿中で完全培地上で２８°Ｃにて３日間増殖せしめ
ることにより分生胞子を生成せしめる。

０．００５％トウィーン８０を含有する無菌塩水５Ｉｎ
１中に胞子を懸濁することにより分生胞子を収得する。

この懸濁液をグリフイン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）振とう機上
で２０分間激しく撹拌する。１％（−／ν）のリンゴペ
クチン（Ｂｒｏｗｎ　Ｒｉｂｂｏｎ、　ｄ、ｅ、７２．
８％；　０ｂｉｐｅｋｔｉｎ　ＡＧ＋Ｂ１５ｃｈｏｆｚ
ｅｌ　ｌ）を含有する最少培地（参考文献）に、１０６
胞子／ｄの胞子密度で接種し、この場合ｌＮのシリコー
ン処理エルシンマイヤーフラスコ中２５０ｍｊ！の培地
を用いる。２００ｒｐｍのガレンカンブ（Ｇａ　ｌ　ｌ
ｅｎｋａｍｐ）回転振とう機を用いて３０°Ｃにて４０
時間増殖せしめる。培養後、菌糸を、ブフナー漏斗を用
いてミラクロス（Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）を通しての濾過
により除去する。培養上清（参考文献２１）を蒸留水（
参考文献２１）により稀釈し、濾液のｐＨ（ｐＨ３，７
）をＩＮ　ＮａＯＨによりｐ）１６．０とし、そして次
にワットマンｌ濾紙を用いて再び濾過する。

■旦２．ＰＬ人旦猜盟 稀釈された培養濾液（４１）を、２０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ６，０）によりあらかじめ平衡化され
たＤＥＡＥ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ
（ファルマシア）カラム（Ｉ０ｃｍ　Ｘ　２．６　ｃｍ
　）に適用する。２８０ｎｍでの吸光度が＜０．１０．
０．の稙に達するまで、カラムを同じ緩衝液で溶出処理
する。次に、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（Ｉ５０
ｄ）　とＬＭ　ＮａＣ１を含有する２０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（Ｉ５（ｂ＋＋ｆｆ１）　　とから成る直
線グラジェントを適用することにより、ペクチンリアー
ゼ活性をカラムから溶出する。

基質としてブラウン・リボン（Ｂｒｏｗｎ　Ｒｉｂｂｏ
ｎ）ペクチン（ｄ、ｅ、７２．８％）を用いてｖａｎ　
Ｈｏｕｄｅｎｈｏｖｅｎ（参考文献１８．１１頁）によ
り記載されている方法を用いて、活性ペクチンリアーゼ
の存在について両分を測定する。塩グラジェント中０．
４３Ｍ　ＮａＣ１の濃度付近で活性が現われる。次に、
活性画分をプールし、そして１１の２０ｆｆｉＭピペラ
ジンー１１ｉ緩衝液（ｐＨ５，５）に対して２回透析す
る（サンプルサイズ：　４５．５ｄ）。

次の段階において、透析されたサンプルを同じサイズの
３つの部分に分け、これらを、ファルマシアＦＰＬＣ系
と組み合わせた標準的ファルマシアＭＯＮＯＱカラムを
用いて３回の別個の操作において陰イオン交換クロマト
グラフィーにかける。カラムを２０ｍＭピペラジン−＋
＋ｃｌｌｌ衝液（ｐｌ＋５．５　）によりあらかじめ平
衡化する。酵素サンプルを負荷した後、カラムを同じ緩
衝液でｌｄ１分の流速により、ベースライン吸光が再び
達成されるまで溶出操作する。次に、直線塩グラジェン
トを適用する。

カラムに適用される溶出緩衝液２２ｄ内で０．６ＭＮａ
Ｃ４２の最終濃度が達成される。

活性画分（４，４ｍ１）を集め、平衡緩衝液を用いて２
５ｄに稀釈し、そして同じクロマトグラフィー操作を反
復する。

次に、活性酵素を含有する２個の両分（合計容量３ｍ１
）を２５ｍＭピペラジン緩衝液（ｐｔ＋５．０）に対し
て透析し、そしてｌｄずつを、同じ緩衝液によりあらか
じめ平衡化したＭＯＮＯＱカラム（ファルマシア）に注
入する。注入の後、ポリバッファー（ｐｏｌｙｂｕｆｆ
ｅｒ）ＴＭ７４の５％溶液（蒸留水中；４ＮＨＣｊ２を
用いてｐＨ３，０にセットしたもの）を用いてグラジェ
ントを形成する。活性酵素（３，２’＋１）がｐＨ３，
２付近に現われる。調製物を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）に対して十分に透析しそして一２０°Ｃにて
貯蔵する。精製の結果を第７表ａに要約し、そしてＡ、
ニガーＮ４００株により生産されたペクチンリアーゼに
ついての類似の精製のデーター（第７表ｂ）と比較する
。

Ａ、ニガー耐Ａ形質転換体Ｎ５９３からのペクチンリア
ーゼＡの精製過程 ＤＥＡＥセファロース　４５．５　３９．８　　　　　
　４．９（２×） 囲１ Ａ、ニガーＮ４００株からのペクチンリアーゼの精製過
程０Ｅ八εセフアロース　４３・、０ １０．１ ０．９ （２×） 蛋白質濃度はＢＣＡ蛋白質測定試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を
用いて、製造者の指示に従って測定した。

野性型の全活性に比較してｐｌＪ８２０により形質転換
されたＡ、ニガーＮ５９２の全活性は精製後約１０倍増
加しており、そして比活性は約３倍上昇している。

例６．２に従って精製された５００ｇのペクチンリアー
ゼ（ＰＬ八）を、１１のミリボラ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
）濾過した蒸留水に対して３回透析し、そして凍結乾燥
する。ｌ１ｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ（参考文献１９）によ
り記載されている方法に従って、１２０Ａ　ＰＴＩ＋ア
ナライザーにオン−ライン連結されたアプライド・バイ
オシステムズ・モデル４７０Ａプロテイン・シーケンサ
−を用いてアミノ酸配列を決定する。この酵素について
、下記のＮ−末端アミノ酸配列が決定される。

ＶＡＬ−ＧＬＹ−ＶＡＬ−５ＥＲ−ＧＬＹ−３ＥＲ−八
ＬＡ−ＧＬＵ−ＧＬＹ−ＰＨＥ−ＡＬＡＧＬＵ−？−Ｖ
ＡＬ−ＴＨＲ−ＧＬＹ−ＧＬＹ−ＧＬＹ−ＡＳＰ−ＡＬ
Ａこうして決定されたアミノ酸配列はｐｅｌＡ遺伝子の
ヌクレオチド配列（例４．２を参照のこと）に基くそれ
と正確に対応する。

捌」Ｊエ　ペクチン１アーゼＡの Ａ、ニガーＮ４００株及びは佳Ａ形質転換体Ａ１５の両
者を例６．１に記載したようにして培養し、そして例６
．２の方法に従って培養濾液から酵素を精製する。こう
して得られた２種類の酵素調製物を、ｖａｎＨｏｕｄｅ
ｎｈｏｖｅｎ　（参考文献１８）に従って精製されたペ
クチンリアーゼ■と比較した。

１０％ゲルを用いるＳＤＳポリアクリルアミドゲルミ気
泳動は、各場合において２〜５μｇの蛋白質を用いる３
つのすべての場合において、同一分子量の単一バンドを
もたらす。

標準的方法（例えば、ファルマシアの指示書ｌ５ｏｅｒ
ｅｃｔｒｉｃ　Ｆｏｃｕｓｓｉｎｇ　１９８２を参照の
こと）を用いて等電点沈澱を行った。ＦＳＢＥ　−３０
００装置及び対応する電源装置ＥＣＰＳ　３０００／１
５０（ファルマシア）を使用した。得られたＰＬＡは等
電点沈澱において均一であり、そしてｖａｎ　ｔｌｏｕ
ｄｅｎｈｏｖｅｎ（参考文献１８）により３．７５であ
るとして報告されているＰＬｎよりも低い（０，２ｐＨ
ユニツト）等電点を有する。

Ｎ４００培養濾液から精製されたＰＬＩＩは等電点沈澱
において不均一である。主バンドは位置的にＰＬＡ蛋白
質に相当する。２個の弱いバンドは陰極方向にわずかに
シフトしている。従って、Ａ、ニガー多コピー形質転換
体Ａ１５においては、Ｎ４００に見られる少い酵素形を
欠いている。

基質として９５％エステル化リンゴペクチンを用いての
、ＰＬＡ及びＰＬｎの動力学パラメーターの直接比較（
ＰＬＩ［のパラメーターはｖａｎ　Ｈｏｕｄｅｎ−ｈｏ
ｖｅｎ　（参考文献１８）により確立されている〕は、
両酵素について同一のに、値及び■。Ｘ値を示す。

例５．２に従って得られたＡ、ニガーＰ１０形質転換体
ＤＩ２をまず３０ｈ＋ｊ！中で例５．５の方法に従って
増殖せしめる。３０°ＣにてＰＣＭ中での５日間の増殖
の後、菌糸マットを、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含有す
る２０１ＩＩＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）
に移す。この菌糸を１５０　ｍｌｌ中で、回転振とう機
上で２０Ｏｒｐｍにて２時間振とうすることによりほと
んどのペクチンリアーゼが培地中に放出される。

！１ｌＬｉ−２Ｌ　　上■旦皇葺製 濾過により菌糸を除去した後、０．２Ｍ塩化ナトリウム
を含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，
０）によりあらかじめ平衡化されたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ファルマシア）カラ
ム　（２５ｃｍ　ｘ　１．２５ｃｍ）に酵素液を通用す
る。　　２８０硝ｍにおける吸光が＜０．１の値に達す
るまで同じ緩衝液によりカラムを溶出処理する。２０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）中での塩化ナ
トリウム直線グラジェント（０，２〜０．７　Ｍ）（合
計容量８００ｍｆｆ１）を適用することによりカラムか
らペクチンリアーゼ活性を溶出せしめる。例５．６に記
載したように５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
及びウェスタンブロッティング（Ｔｏｗｂｉｎ等、参考
文献１６）によりペクチンリアーゼＤの存在について両
分をスクリーニングする。ペクチンリアーゼＤを含有す
る両分をプールし、そして０．５　Ｍ塩化ナトリウムを
含有するリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）に対し
て透析し、そしてＦＰＬＣ系と組み合わせた標準ファル
マシアＭＯＮＯＱカラムを用いるイオン交換クロマトグ
ラフィーにかける。負荷した後、カラムを同じ緩衝液で
洗浄し、次に２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝’ｔ＆　（
ｐＨ６，０）生塩化ナトリウム直線グラジェント５０ｍ
ｆを適用する。活性画分を集め、そして１Ｉｎｌのアリ
コートを、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）により平衡化さ
れた、ＦＰＬＣ系に連結された１００ｍｆｆ１のスフェ
ロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）　　１２ゲル浸透カラムに
適用する。ＧＰＣカラムから得られた活性酵素画分（各
１ｄ）をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により
分析することにより、得られたペクチンリアーゼの純度
をチエツクする。

星工表 Ａ、ニガー止１４Ｄ形質転換体ＤＩ２からのペクチンリ
アーゼＤの精製過程 例６．２に従って精製された５００硝のペクチンリアー
ゼＤを、ミリポア濾過された蒸留水１！に対して３回蒸
留し、そして凍結乾燥する。ｌ１ｕｎｋａｐｉ１１ｅｒ
　（参考文献１９）により記載されている方法に従って
、１２０Ａ　ＰＴＨアナライザーとオン−ライン連結さ
れたアプライド・バイオシステムス・モデル４７〇八プ
ロテイン・シーケンサ−を用いてアミノ酸配列を決定す
る。

この酵素について下記のアミノ酸配列が決定される。

ＶＡＬ−ＧＬＹ−ＶＡＬ−５ＥＲ−ＧＬＹ−ＴＨＲ−Ｐ
ＲＯ−ＶＡＬ−ＧＬＹ−ＰＩＩＥ−ＡＬＡ−５ＥＲ−５
ＥＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＹ−ＧＬＹ−ＧＬＹ−へＳ
Ｐ−へＬＡ−ＴＨＲ決定されたアミノ酸配列はＰ壮り遺
伝子のヌクレオチド配列に基くそれと正確に一致する。

リアーゼＢ　（ＰＬＢ）の　　　　　　び−け− 例５６２に従って得られたＡ、ニガー耐Ｂ形質転換体Ｂ
１３を例５．３に従ってその多コピー性について分析す
る。例５．４に記載した方法に従って行われたナサンブ
ロ７ト分析が示すところによれば、約１．６ｋｂの長さ
のペクチン−誘導性ＴＩＩＲＮΔが生産される。１％（
ｗ／ｖ）の柑橘類ペクチン（ｄ、ｅ、７２．８％）及び
１％の小麦糠を含有する最少培地中での３０°Ｃにて３
５時間の増殖を用いて、例５．４に記載したようにして
酵素を製造する。酵母はまた、４％（−／Ｖ）シュガー
・ビート・シロップ及び１％Ｎ１１４Ｎ０３を含有する
培地を用いても製造される。

±２蛮　且上ＢＯ片製 培養濾液を蒸留水で２倍に稀釈し、そしてｌＮＮａ０Ｉ
ＩによりｐＨを６．０に調製し、そしてワンドマン１濾
紙を用いて再び濾過する。次に、稀釈された濾液（２１
）を、５０ｄ酢酸ナトリウム緩衝液ｐ＋＋５．０により
あらかしめ平衡化したεＤＴＡ−セファロース・ファス
ト・フロー（ファルマシア）カラム（９ｃｍ　Ｘ　３．
２　ｃｍ　）に適用する。ブラウン・リボンペクチン（
ｄ、ｅ、７２．８％）又は高度にエステル化されたペク
チン（ｄ、ｅ、９４％）を用いてｖａｎ　）Ｉｏｕｄｅ
ｎｈｏνｅｎ（参考文献１８　、１１頁）により記載さ
れている方法により測定できるペクチンリアーゼ活性の
一部は溶出液中に存在する。ペクチンリアーゼ活性の大
部分は塩グラジェントを適用することができる。この活
性は塩グラジェントにおいて現われ、そして例６に記載
した５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での見か
け分子量及び溶出挙動に基いてＰＬＡと同一であること
が見出される。

ＤＥＡＥファスト・フロー・カラムの溶出液を蒸留水に
対して透析し、そして２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝’１
Ｆｆｉ、　（ｐＨ４，５）によりあらかじめ平衡化され
たＭＯＮＯＳカラム（ファルマシア）に適用する。同じ
緩衝液中０〜１．　ＯＭ塩化ナトリウムグラジェントを
適用することによりカラムから酵素を溶出する。

酵素はカラムからほとんど即座に溶出される。活性画分
をプールし、そして次に蒸留水によりほぼ４倍に稀釈す
る。酵素の再クロマトグラフィーにより、５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動に基いて純粋なＰＬＢ蛋白
質を含有する両分が得られる。

！ｌ！ＬＬ３Ｌ、クチン１アーゼＢの１例８．２に従っ
て組Ｂ形質転換体Ｂ１３がら精製された酵素の性質を決
定しそしてペクチンリアーゼＡ及びＤと比較する。

１０％ゲルを用いるＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動は、３９．７ｋＤａの見かけ分子量を有する単一バ
ンドをもたらす。同じ条件下で、ＰＬＡ及びＰＬＤの見
かけ分子量はそれぞれ４９．１ｋＤａ及び５２．３ｋＤ
ａである。

等電点沈澱を例６．４に記載したようにして行う。

ｐＨ３及び７の間のｐＨグラジェントを用いて、ＰＬＢ
の等電点は６．０である。サンプルはおよそ、５．０の
ｐＩに相当する位置に適用される。

精製された酵素ＰＬＢはまた、ウェスタンプロット分析
により試験する場合、ＰＬＩ及びＰＬＩ［に対して調製
されたポリクローナル抗体と反応する。こうしてＰＬＯ
，Ａ及びＢはそれらの見かけ分子量の値により容易に区
別することができる。

Ｊ！１ｙＵＵＬＡＬＰＬＢの　　８・ 例８．２に従って精製された酵素を動力学的に特徴付け
る。この酵素はペクチンリアーゼ反応を触媒し、そして
種々のマツキルヘン緩衝液（μ−〇、５）で試験した場
合、広いｐ■範囲（ｐＨ５〜９．５）にわたって活性で
ある。（νａ　ｎ　Ｈｏ　ｕ　ｄ　ｅ　ｎ　ｂ　ｏνｅ
ｎ、参考文献１８）。最適ｐＨが広い（ｐＨ７，５〜８
．５）。ｐＨ６，０において活性はｐＨ８，０における
活性の約５５％であり、そしてｐＨ９，５においてなお
８５％である。

高度のエステル化されたペクチン（ｄ、ｅ、９４％）、
及びブラウンリボン・リンゴペクチン（ｄ、ｅ、７２．
８％、　０ｂｉｐｅｋｔｉｎ　ＡＧ、　Ｂ１５ｃｈｏｆ
ｆｚｅｌｌ）のように低い程度のエステル化を有するペ
クチンの両者を基質として使用することができる。しか
しながら、高度にエステル化されたペクチンを用いて最
高の活性が得られる。この酵素はポリガラクチュロネー
トと反応しない。

ＰＬＢにより触媒されるペクチンリアーゼ活性は、反応
混合物にＥＤＴＡを添加する（　３　ｍＭの最終濃度を
用いる）ことにより阻害することができ、酵素は過剰の
Ｃａ”イオンの添加により再活性化される。従って、献
ＢはＣａ”−依存性ペクチンリアーゼをコードしている
。２５°Ｃにおいて、この酵素は６５００のおよそのタ
ーンオーバー数及び２．５１１１ＦＩのに、値を有する
（高度にエステル化されたペクチンを基質として使用す
る場合）。これらの値は、ｐＨ８，０（μｍ０．５）の
マツキルベン緩衝液を用いてｖａｎ　ｌ１ｏｕｄｅｎｈ
ｏｖｅｎ　（参考文献１８）の方法に従って決定される
。

プラスミドｐＧＷ８２０の３．９ｋｂ　１ｌｉｎｄＩＩ
Ｉ断片をｐＢＲ３２２の旧ｎｄ［１１部位にサブクロー
ニングする。アンピシリン耐性形質転換体プラスミドＤ
ＮＡをｌ１ｉｎｄ［［及び５ａｌｌ制限酵素消化により
分析する。時計まわり方向に耐Ａ挿入部を含有する１つ
のクローンをｐＧＷ８２２と称する。旭Ａの誘導性プロ
モーターを使用してＡ、ニガーで外来遺伝子を発現せし
める。

完全な■佳Ａ遺伝子がプラスミドｐＧＷ８２２上に存在
する。プロモーター及び耐へシグナル配列はｌｋｂＢａ
ｍｌｌ　Ｉ　　Ｐ　ｓｔ　Ｉ断片上に存在する。ヌクレ
オチド位置１４２０のＰｓｔＩ開裂部位（第１０図）は
シグナル配列の３′末端と一致し、そしてこれを外来蛋
白質のコード配列へのフレーム内融合のために用いるこ
とができる。Ｐ壮Ａの転写終止シグナルは１．３ｋｂＳ
ａｌ　Ｉ　　ＨｉｎｄＩ［［断片上に存在する。

血孟玉　ヘン　−ＵＣ１９でのｅｌＡ’　　　のサブク
ローニング プラスミドｐＧＷ８２２の３．３ｋｂ　ＢａｍＨＩ　−
Ｈ１ｎｄＩＩＩ断片は匹↓へ遺伝子を含有する。この断
片を、Ｂａｍ１ｌ　Ｉ及び旧ｎｄｌ［Ｉにより切断され
たベクターｐＨｃ１９（ファルマシア）にクローニング
する。精製された断片を連結する。連結混合物を用いて
、Ｃａ”で処理されたコンピテントＪＭＩＯ９細胞を形
質転換する。

ｐＵＣ１９への３．３ｋｂ　Ｂａｍ）Ｉ　Ｉ　　Ｈｉｎ
ｄＩ［Ｉ断片の好結果のクローニングを、Ｘ−Ｇａ１及
びＩＰＴＧの存在下、アンピシリンプレート上で選択す
る（Ｔ、　ＭａｎｉａＬｉｓ等、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ
ｎｕａｌ’。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、　１９８２＋　５２頁）。

白色のアンピシリン耐性形質転換体を拾う。これらのコ
ロニーのプラスミドＤＮＡをＢａＩＩＩＩ　Ｉ　／　Ｈ
ｉｎｄ■二重消化により分析する。正しい挿入部を有す
る１つの形質転換体をｐＬＩｃ１９／ｐｅｌＡと称する
。

ｐＵＣ１８を用いる類似の作製法によりｐｕｃ１８／ｐ
ｅｔΔを得る。

光互 プラスミドｐｔｌｃ１９／ｌ１ｌｅｌ八を５ａｌｌで消
化する。

この線状断片の接着末端を、０．１ｍＭずつのｄＣＴＰ
　。

ｄＧＴＰ　、　ｄＡＴＰ及びｄＴＴＰ　、　　６０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−１１Ｃｆｆｉ　（ｐＨ７，５）。

１０ｍＭ　ＭｇＣ１、の存在下、Ｋｌｅｎｏｗ　ＤＮＡ
ポリメラーゼ１　（ＢＲＬ）との、室温にて３０分間の
反応によりフィルインする。ＥＤＴＡを１２．５ｍＭの
最終濃度に添加することにより反応を停止せしめる。Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱せしめる。線状Ｄ　Ｎ　Ａ　断片
をＰｓｔｌニより消化する。フェノール／クロロホルム
挿出の後、ＤＮＡをエタノールで沈澱せしめる。

次の式； Ｐｓｔｌ　　　　　　　　　　Ｄｄｅｌ（Ｉ）　　　５
’　　−ＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣ−３’（ＩＩ）　　３
　’　　−ＡＣＧＴＡＣＡＣＴＡＧＡＣＧＧＡＧＴ−５
’で表わされるオリゴデオキシヌクレオチドリンカーを
、線状化されたプラスミドのＰｓｔ１部位に連結する。

このリンカ−は、ｌ壮Ａシグナル配列の末端に一致する
ＰｓｔＩ部位の３′のくぼんだ末端を満たしそしてイン
ターフェロンＢＤＢＢのコード配列へのインフレーム融
合を達成する。（Ｉ）はインターフェロンＢＤＢＢ遺伝
子のＤｅｌＩ制御部位までの５′−末端ヌクレオチド配
列を示す。２００ｐｍｏ　ｅずつのオリゴヌクレオチド
（Ｉ）及び（ＩＩ）をリン酸化し、そしてアリールせし
める。Ｐｓｔｌにより切断したｐ［Ｉｃ１９／ｐｅｌＡ
プラスミド及び１００倍モル過剰の二本鎖リンカ−ＤＮ
Ａを６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ７，５）、　
　１０ｍＭ　Ｍｇ（／！ｚ、１ｍＭ　ＡＴＰ、　５ｍＭ
　ＤＴＴ及び４００ユニツトのＴ４　ＤＮＡリガーゼ中
で１５°Ｃにて１時間連結する。ＤＮＡリガーゼを８５
°Ｃにて１０分間不活性化する。１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、
　３００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６，０）及び０．５
４容量のイソプロパツールの存在下での沈澱により過剰
のリンカ−を除去する。

大きな５　ｋｂｔｔ）ｒ片を分取用０．６％アガロース
ゲル上で単離する。この断片はル壮Ａプロモーター及び
シグナル配列（Ｂａｍｔｌ　Ｉ　　（Ｐｓ口］／リンカ
−）並びに史江Ａターミネータ−（（Ｓａｌｌ）平滑−
ｔ＋１ｎｄｌＩ［）をベクターｐＵＣ１９中に含んで成
る。

プラスミドｐＪＤＢ２０７／Ｐ）ＩＯ３−ＩＦＮ　ＡＭ
ｌ１９　（ＢＰ２０５４０４）は、酵母酸性ホスファタ
ーゼ（鷹）の制御されるプロモーターの制御のもとにα
−インターフェロンＢＤＢＢの遺伝子を含有する。この
プラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ及び旧ｎｄＨ［を消化し
、ＰＨ０５プロモーター、ＩＦＮ　ＢＤＢＢのコード配
列及びＰ）１０５転写停止配列を含有する１、３ｋｂ　
ＢａｍＨＩ　−１１ｉｎｄＩ［［断片を単離する。断片
をＤＥ５２クロマトグラフィー及びエタノール沈澱によ
り断片を精製し、そしてさらにＴａｑｌにより消化する
。Ｔａｑｌ制限断片の接着末端を、０．１ｍＭずつのｄ
ＣＴＰ及びｄＧＴＰ　、　　６０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣ１
（ｐＨ７，５）　、　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ　２の存在
下、室温にて３０分間のＫｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ　（ＢＲＬ）　との反応によりフィルインする。

ＥＤＴＡを１２．５ｍＭの最終濃度に添加することによ
り反応を停止する。ＤＮＡ断片をエタノール沈澱せしめ
そしてＤｄｅｌによりさらに消化する。ＤＮＡ断片を分
取用０．８％アガロースゲル上で分離する。５４９ｂｐ
　Ｄｄｅ　Ｉ　−（Ｔａｑｌ）平滑断片をゲルから電気
溶出し、そしてＤＥ５２イオン交換クロマトグラフィー
及びエタノール沈澱により精製する。ＤＮＡを水中に約
０．１ｐｍｏ　ｌ　／　ａｌの濃度で再懸濁する。

０．２１）＋１１０１の５４９ｂｐ　Ｄｄｅ　Ｉ　　　
（Ｔａｑ　Ｉ　］平滑断片及び０．１ｐｍｏｆｆｉの５
ｋｂベクタ一断片を１０ｊ１１の６０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｊｌ！（ｐＨ７，５）、　　１０ＩＩＩＭ　ＭｇＣ１
ｚ、　３．５ｍＭ＾ＴＰ。

５ｍＭ　ＤＴＴ及び２００ユニツトの７４　ＤＮＡリガ
ーゼ（バイオラプス）中で１５°Ｃにて１６時間連結す
る。連結混合物の１　ｐｉのアリコートを用いて、Ｃａ
　ｔ　＋処理されたコンピテントＨＢ１０１細胞を形質
転換する。

１２個のアンピシリン耐性形質転換コロニーからプラス
ミドＤＮＡを調製し、そしてＥｃｏＲＩ　、　　Ｐ　ｖ
ｕＩＩ、Ｃ１ａｌ、及びＥｃｏＲＩ　／旧ｎｄｌＩ［消
化により分析する。予想通りの制限パターンを有するク
ローンを選択する。稈壮Ａシグナル配列とインターフェ
ロ７　ＢＤＢＢの成熟コード配列との正しいインフレー
ム（ｉｎ　ｆｒａｍｅ）融合をＤＮＡ配列決定により確
認する。

選択されたクローンのプラスミドＤＮＡをｐＵＣ１９／
ｐｅｌＡ−ＩＦＮ　ＡＭ１１９と称する。

ｐＵＣ１８／ｐｅｌＡを用いる類似の作製法によりプラ
スミドｐＵＣ１８／ｐｅｌＡ−ＩＦＮ　ＡＭ１１９が得
られる。

ウリジン要求性変異株Ａｎ８（ＤＳＭ　３９１７．　Ｅ
Ｐ　８８１０１３９７．３）に開示されている）をプラ
スミドｐＣＧ５９Ｄ７により形質転換してウリジン・プ
ロトプラストを得る。形質転換プラスミドと共に非選択
性プラスミドｐＵＣ１９／ｐｅｌＡ−ＩＦＮ　ＡＭ１１
９を加えて同時形質転換の際に同時組込み体（ｃｏ　ｉ
ｎ　ｔｅｇｒａｎ　ｔ）を得る。

Ａ、ニガーＡｎ８の分生胞子を完全培地中で十分に胞子
を形成するまで２８°Ｃにて４日間増殖せしめる。２Ｘ
１０”個の分生胞子を用いて、１ｇ／ｌのアルギニン及
びウリジンを採光した最少培地２０（Ｉ＋＋１に接種す
る。

２８°Ｃ及び１８０ｒｐｍにて２０時間の増殖の後、ミ
ラクロスを通しての濾過により菌糸を集排し、１０　ｍ
ｆｌの０．８Ｍ　ＫＣＱ　、　５０ｍＭ　ＣａＣＱ　２
で２回洗浄し、そして２０Ｉｎ１の０．８Ｍ　ＫＣ４２
、５０ｍＭ　ＣａＣｉ　２＋　０．５ｍｇ／　ｍｌのノ
ボチーム（Ｎｏνｏｚｙｍ）２３４　（ノボ社）中に再
懸濁する。

プロトプラストの懸濁を、漏斗中のガラス綿栓を通して
濾過して菌糸破片を除去する。プロトプラストを、室温
での穏やかな遠心分離（Ｉ０分間、２０００ｒｐｍ）に
よりペレット化し、そして１０ｄの０．８ＭＫＣｅ　、
　５０ｍＭ　ＣａＣＩ！、２により２回洗浄する。最後
に、プロトプラストを２００〜５００μｌの０．８Ｍ　
ＫＣｆｆｉ、　５０ｉＭｃａｃｆｆｚに再懸濁してｌＸ
ｌ０”／ｍρの濃度とする。

形質転換のため、プロトプラスト分散体の２００μノの
アリコートを５鱈のρＣＧ５９Ｄ７及び１０Ｊ１ｇのｐ
ＵＣ１９／ｐｅｌ八−ＩＦＮ　４Ｍ１１９　ＤＮＡ並び
に５０μｌのＰＣＴ　（Ｉ０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｆｆｉ
　（ｐｔ１７．５）、　５０ｍＭ　ＣａＣｆ　！＋　２
５％ＰＥＧ　６０００）と共にインキュベートする。イ
ンキュベーション混合物を氷上に２０分間置き、さらに
２ｄのＰＣＴを添加し、そしてこの混合物を室温にてさ
らに５分間インキュベートする。４ｄの０．８Ｍ　ＫＣ
ｊ２．５０ｍＭｃａｃｆｆｉｚを添加し、そして最終形
質転換溶液の１　ｍｌのアリコートをＱ、８Ｍ　Ｋｃｌ
ｌ、により安定化され、液化された最少寒天培地〔最少
培地＋１ｇ／ｌアルギニン＋１０ｇ／ｆバクトーアガ−
（デイフコ）〕と混合する。この混合物を即座に同じ培
地の寒天プレート上に注ぎ、そして２８°Ｃにてインキ
ュベートする。

２８°Ｃにて２〜３日間の増殖の後、数百の小さいおそ
らく失敗の形質転換体のハックグラウンド増殖の上に、
安定な形質転換体が旺盛に増殖しそして胞子を形成する
コロニーとして出現する。

同時形質転換実験（例９．２．２　）の３７個の形質転
換体を拾い、そしてインターフェロンの発現について分
析する。インターフェロン活性は、ヒトＣＣＬ　−２３
細胞及びチャレンジウィルスとしての水泡性口内炎ウィ
ルス（ＶＳＶ）を用いてＡｒ＋ｎｓ　ｔｒｏｎｇ（Ｊ、
八、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ、　　Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ、　　　２１＋　　７３２（Ｉ９７１））の方法
に従って測定する。

形質転換体からの分生胞子を前培養培地〔ペクチン・ス
ロー・セット（Ｐｅｃｔｉｎ　Ｓｌｏｗ　５ｅｔ）Ｌ　
（ＩＩｎｉｐｅｃｔｉｎ、　ＳＡ、　Ｒｅｄｏｎ、　　
フランス）　３　ｇ　／　１　、　Ｎ１１４ＣＱ２ｇ／
Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４０，５ｇ／ｌ、　　ＮａＣｆｆ１　Ｏ
，５／ｌＭｇ５Ｏｎ　’　７８ｚＯ０，５ｇ　／　ｌ、
　ＣａｚＳＯ４・２Ｈｚ００．５ｇ／／　１　、　ｐＨ
７，０）　５０ｍｆ中で前培養する。この前培養物を２
５０ｒｐ１１１及び２８°Ｃにて７２時間インキュベー
トする。１０％の前培養物を用いて５０Ｉｎ１の主培養
培地（大豆粉２０　ｇ　／　ｆ、ペクチン・スローセッ
ト５ｇ／ｌ）に接種する。培養物を２５Ｏｒｐｍ及び２
８°Ｃにて７２〜９６時間増殖せしめる。種々の時点（
２０時間毎）にサンプルを採取し、遠心分離により細胞
をペレット化し、そして超音波処理により破砕する。

上清及び細胞抽出物の両者を記載されている（前掲）よ
うにしてインターフェロン活性について試験する。

ＩＬブースミ゛Ｍ１３　＋　ＫＳ　　ｅｌＡΔ　−ＩＦ
ＮプラスミドＭ１３（＋）ＫＳ　／ｐｅｌＡΔ、、−Ｉ
ＦＮ　４Ｍ１１９の２．８ｋｂ発現カセットは誘導性Ｐ
壮ＡプロモーターバイブリドインターフェロンＢＤＢＢ
のコート配列及び２壮Ａ転写ターミネータ−をブルース
クリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｎ１３（＋）ＫＳヘ
クツタ−上含んで成る。

バイブリドインターフェロンＢＤＢＢが発現されそして
宿主細胞中に位置する。プラスミドＭ１３（＋）ＫＳ／
ｐｅｌ八Δ、、−へＦＮ　　４Ｍ１１９　　は　ｐＵＣ
１８／ｐｅｌＡ　−ＩＦＮＡＭ１１９（例９．２．１を
参照のこと）に由来する。凪Ａシグナル配列（ｓｓ）を
部位特定変異誘発によりプールアウトする　（第１５図
を参照のこと）。シグナル配列を有しないこの構成物か
ら発現されるバイブリドインターフェロンはサイドシル
中に存在すると予想される。

プラスミドｐＵＣ１８／ｐｅｌＡ−ＩＦＮ　４Ｍ１１９
（例９゜２．１を参照のこと）をＢａｍｔｌ　Ｉ及び旧
ｎｄｌｌ［により消化する。２．８ｋｂ　ＢａｍＨＩ　
−Ｈｌｎｄｎ［断片は止佳Ａプロモータ、シグナル配列
、ＩＦＮ　ＢＤＢＢコード配列及びト佳Ａターミネータ
−を含有する。ＢａｍＨＩ　−Ｈ１ｎｄＩＩＩ断片を単
離し、そしてＢａｎ＋）ｌ　Ｉ及び旧ｎｄＩＩｌにより
切断されたブルースクリプトＭ１３（＋）にＳ　（Ｓ　
ｔｒａ　ｔａｇｅｎｅ）　ヘクターに連結する。この連
結混合物のアリコートを使用して、Ｃａ　２　＋処理コ
ンピテントＪＭ１０９細胞を形質転換する。Ｍ１３（＋
）ＫＳへの２．５ｋｂ　ＢａｍＨＩ　−旧ｎｄｌｌｌ断
片の好結果のクローニングをＸ−Ｇａ１及びＩＰＴＧの
存在下、アンピシリンプレート上で選択する。白色のア
ンピシリン耐性コロニー１２個ヲ拾う。これらのコロニ
ーのプラスミドＤＮＡをＢａｍ１１１／ＢｇｌＩに重油
化により分析する。正しい挿入部を有する１つの形質転
換体をＭ１３（＋）ＫＳ　／ｕｕＡＩＦＮ　ＡＭ１１９
　と称する。

いて、コンピテント大腸菌ＣＪ２３６株（ｄｕｔ−Ｌ狙
１Ｌ　ｔｈｉ−１，ｒｅｌＡ−１；　ｐｃＪ１０５（Ｃ
ｍ’）；　ｎｒｏ−ＲＡＤＭｕｔａ−Ｇｅｎｅ　Ｍ１３
インビトロ変異誘発キット）を形質転換する。この株は
ＤＮＡへのウラシルの導入を許容する。ＣＪ２３６を、
１００■／！のアンピシリンを含有するＬＢ培地１０ｍ
１中で増殖せしめる。

０．５のＯＤ、。。において、細胞を５０の多重感染度
においてファージＭ１３ＫＯ７（Ｍｅａｄ等、参考文献
２９）により超感染（ｓｕｐｅｒｉｎｆｅｃｔ）する。

３７”Ｃにて１時間の後、カナマイシン（５０ｍｇ／ｊ
りを加え、そして培養物を３７°Ｃにて振とう機上で５
〜６時間インキュベートする。プラスミドＭ１３（＋）
ＫＳ　／ρｅｌＡ−ＩＦＮ　ＡＭ１１９のル住Ａ−ＩＦ
Ｎ　ＡＭ１１９挿入部に関する非コード鎖が合成され、
パッケージされ、そして培地中に放出される。Ｋｕｎｋ
ｅｌ等（参考文献３０）に従って培養上清から単鎖ＤＮ
Ａを調製する。

プラスミドＭ１３（＋）ＫＳ　／ｐｅｌＡ−ＩＦＮ　Ａ
Ｍ１１９を用部位特定除去変異誘発を非コード単鎖正性
Ａ−ＩＦＮＡＭ１１９鋳型上で行って正佳Ａシグナル配
列をプールアウトする　（第１５図）。

変異原プライマーは、ＡＴＧを含むは佳Ａプロモーター
配列の部分（第１０図におけるヌクレオチド位置１３４
３〜１３６３）及び成熟ＩＦＮ　ＢＤＢＢのアミノ酸１
〜７をコードする２１ヌクレオチドから成る。

変異誘発のため、２００ｐｍｏ　ｉの変異原プライマー
を２０ａｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃＬ！（ｐ）１
７．５）、　１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ！、ｚ。

５ｍＭ　ＤＴＴ及び０．５ｍＭ　ＡＴＰ中で８ユニツト
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー）を用
いてリン酸化する。３７°Ｃにて１時間の後、６５°Ｃ
にて１０分間加熱することにより反応を停止せしめる。

０．２ｐｍｏｆｆｉの単鎖鋳型を１０ｐｍｏ　ｌのリン
酸化された変異原オリゴデオキシリボヌクレオチドプラ
イマー及び１０ｐＩＩＩｏＩ２のユニバーサルＭ１３配
列決定プライマーと共に３０１１！の２０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ　−）Ｉｃ　ｌ　（ｐＨ７，５）　。

１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、　５０ｍＭ　　ＮａＣＣ１ｍＭ
　ＤＴＴ中で８０°Ｃにて５分間インキュベートする。

溶液を３０分間にわたって徐々に室温に冷却する。アニ
ールされた混合物に、ｌ　Ｉｌノの緩衝液（０，２Ｍ　
Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ！　（ｐＨ７，５）　。

０．１Ｍ　ＭｇＣｌ！、ｚ　）　、　５μｌの２ｍＭ　
ｄＮＴＰ混合物、０．５　Ｊｔｌの２０ｍＭ　ＡＴＰ、
　　ｌ　ｔｔｌの０．２台ｏｔｒ、０．５ＩｌｌのＴ４
　ＤＮＮクリガーゼバイオラプス、４０００／１１１）
及び１．２μ！のＫｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼ（
ＢＲＬ、　５［１／ｍ）を含有する酵素−ｄＮＴＰ（ｄ
ＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰ）溶液１
０μｌを加える。この混合物を１５°Ｃにて１６時間イ
ンキュベートする。６５°Ｃにて１０分間インキユヘー
トすることにより反応を停止せしめる。

１ｕ！及び３ＩＪＩの連結混合物を用いて、修復マイナ
ス（ｒｅｐａｉｒ−ｍｉｎｕｓ）株大腸菌ＭＶ１１９０
　（Δ（Ｉａｃ−稈１＾Ｂ）＋　　ｔｈｉ、■Ｅ、Δ（
ｓｒｌ　−ｒｅｃＡ）３０６：　ＴｎｌＯ（ｔｅｔつ　
（Ｆ’　：　ｔｒａＤ３６．　　稈ＩＡＢ、　　Ｉａｃ
　ｒｑＺΔ旧５）］のコンピテント細胞０．２戚を形質
転換する。

ＭＶ１１９０株は、ｑｌＯ−ＲＡＤ　ＭＵＴＡ−ＧＥＮ
　Ｍ１３　イア　−ヒドロ変異誘発キットの手引に記載
されている。１２個のアンピシリン耐性コロニーを拾う
。プラスミドを調製しそして５ｃａｌ消化により分析す
る。

１１−Ａシグナル配列の好結果のループアウトが５ｃａ
１部位を除去する。正しいプラスミドをブルースクリプ
ト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）　ベクター中の５ｃａ１部
位において線状化する。１つのプラスミドをさらに分析
する。凪ＡプロモーターとＡＴＣを含むＩＦＮＢＤＢＢ
のコード配列との間の正しい連結部をＤＮＡ配列決定に
より確認する。１つの正しい構成物をＭ１３（＋）ＫＳ
　／ｐｅｌＡΔｓｓ−ＩＦＮ　ＡＭ１１９　と称する。

プラスミドＭ１３（＋）ＫＳ　／ｐｅｌＡΔ、、−ＩＦ
Ｎ　ＡＭ１１９及びｐＣＧ５９Ｄ７を用いて例８．２．
２に従ってＡ、ニガーＡｎ８変異体を同時形質転換する
。形質転換体を例８．２．３に記載したようにして培養
する。種々の時間（２０時間毎）にサンプルを採取し、
遠心分離により細胞をペレット化し、そして超音波によ
り破砕する。細胞抽出物をインターフェロン活性につい
て試験する（前掲）。インターフェロン活性の大部分が
細胞内に見出される。

微生■夏衣圧 下記の微生物がブダペスト条約のもとにＤｅνｔｓｃｈ
ｅＳａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉ
ｓｍｅｎ、　Ｇｒｉｓｅｂａｃｈｓｔｒ。

８、　Ｄ−３４００Ｇｉｉｔｔｉｎｇｅｎに寄託されて
いる。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　　ＨＢ
１０１／ｐＧＷ８２０寄託番号　ＤＳＭ　４３８８ 寄託臼　　１９８８年２月１日 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　　ＩＩ
Ｂ１０１／ｐＧＷ８３０寄託番号　ＤＳＭ　４３８９ 寄託臼　　１９８８年２月１日 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　　８８
１０１／ｐＧＷ８５０寄託番号　ＤＳＭ　４３９０ 寄託臼　　１９８８年２月１日 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　　ＨＢ
１０１／ｐｆＪ８６０寄託番号　ＤＳＭ　４３９１ 寄託臼　　１９８８年２月１日 大腸菌（ｉｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　　ＨＢ
１０１／ｐＧＷ８８０寄託番号　ＤＳＭ　４３９２ 寄託臼　　１９８８年２月１日 参考文献 １、　　Ｙｅｌｔｏｎ、　Ｍ、Ｍ、＋　Ｈａｍｅｒ、　
Ｊ、Ｅ、及びＴｉｍｂｅｒｌａｋｅＷ、Ｅ、（Ｉ９８４
）　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ
　　８↓。

１４７０−１４７４゜ ２、　Ｆｒ１ｓｃｈａｕｆ、　Ａ、Ｍ、＋　Ｌｅｈｒａ
ｃｈ、　Ｈ，、Ｐｏｕｓｔｒａ、＾。

及びＭｕｒｒａｙ、　Ｎ、（Ｉ９８３）　Ｊ、Ｍｏ１．
Ｂｉｏｌ、　１７０．８２７３゜ ４゜ ５゜ ６゜ ７゜ ８゜ ９゜ −８４２。

Ｋａｒｎ、　Ｊ、、　Ｂｒｅｎｎｅｒ、　Ｓ、、　Ｂａ
ｒｎｅｆｆ、　Ｌ、及びＣａ５ａｒｅｎｉ＋　　Ｇ、（
Ｉ９８０）　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
。

ＵＳＡ　７７、　５１７２−５１７６゜ＢｅｎＬｏｎ、
　Ｗ、Ｄ、及びＤａｖｉｓ、　Ｒ，Ｗ、（Ｉ９７７）　
５ｃｉｅｎｃｅＰ坦、　　１８０−１８２゜ Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ｌ　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、
Ｆ、及びＳａｓ＋ｂｒｏｏｋ。

Ｊ、（Ｉ９８２）＋　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎ
ｉｎｇ＋　　ａ　　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ
＋　コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク。

ＢＲＬ、Ｍ１３　ｃｌｏｎｉｎｇ／ｄｉｄｅｏｘｙ　ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　１ｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｍａｎ
ｕａｌ　。

Ｄｅｎｔｅ、　Ｌ、、　Ｃｅ５ａｒｅｎｉ、　Ｇ、及び
Ｃｏｒｔｅｓｅ、　Ｒ１（Ｉ９８３）　Ｎｕｃｌ、Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅｓ、■、　１６４５−１６５５゜Ｄｅｎｔ
ｅ、　Ｌ、＋　５ｏｌｌａｚｚｏ、　Ｍ、、　Ｂａ１ｄ
ａｒｉ、　Ｃ，、Ｇ。

Ｃｅ５ａｒｅｎｉ及びＲ，Ｃｏｒｔｅｓｅ、ｉｎ：ＤＮ
Ａ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｏｌ。

１、ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ　Ｄ、
Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ　１ｍ集、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０
ｘｆｏｒｄ　１９８５゜Ｒｕ５ｓｅｌｌ、　Ｍ、＋　Ｋ
ｉｄｄ＋　Ｓ、及びＫｅｌｌｅｙ、　Ｍ、Ｒ。

（Ｉ９８６）　Ｇｅｎｅ　４５．３３３　３３８゜１０
、　　Ｃａｒｕｔｈｅｒ、　　Ｍ、Ｈ，、Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　　ａｎｄ　ＥｎｚｙｍａｔｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ：　ａ　ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ、　　ｖｅｒｌａｇ　Ｃ
ｈｅｍｉｅ（Ｉ９８２）　　。

１１、　Ｂａ１ｌａｎｃｅ、　Ｄ、Ｊ、（Ｉ９８６）　
Ｙｅａｓｔ　　２．２２９−２３６゜１２、　　Ｇｏｏ
ｓｅｎ、　　Ｔ、、　　Ｂｌｏｅｍｈｅｕｖｅｌ、　　
Ｇ、＋　　Ｇｙｓｌｅｒ、　　Ｃｈ、。

ｄｅ　Ｂｉｅｒ、　Ｄ、Ａ、、　ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒ
ｏｅｋ、　Ｈ，Ｗ、Ｊ、及びＳｗａｒｔ、　　Ｋ、（Ｉ
９３７）　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ＩＬ　
４９９−５０３゜ １３、　Ｂｏｅｋｅ、　Ｊ、Ｄ、、　Ｌａｃｒｏｕｔｅ
、　Ｆ、及びＦｉｎｋ、　Ｇ、Ｒ。

（Ｉ９８４）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　　１９
７．．３４５−３４６゜１４、　５ｌａｔｅｒ、　　Ｒ
，Ｊ、（Ｉ９８４）　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ、２．　Ｊ、Ｍ
、Ｗａｌｋｅｒ　編集、Ｔｈｅ　ＨｕｍａｎＰｒｅｓｓ
　　Ｉｎｃ　　０ １４ａ、）Ｉｉｎｎｅｎ　Ａ、、　Ｈｉｃｋｓ　Ｊ、Ｂ
、及びＦｉｎｋ　Ｇ、Ｒ，（Ｉ９７８）Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７５．　１９２９
−１９３３゜１５、　ＬａｅｍＩｌｌｉ、　１１．に、
（Ｉ９７０）　Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８１−６８２
゜１６、　Ｔｏｗｂｉｒ＋＋　Ｉｌ、、　５ｔａｅｈｅ
ｌｉｎ、　Ｔ、及びＧｏｒｄｏｎ＋　Ｊ。

（Ｉ９７９）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＬＩＳＡ　７６、４３５０−４３５４゜ １７、　Ｒ４ｅｄ、　Ｊ、Ｌ、及びＣｏｌｌｍｅｒ、　
Ａ、（Ｉ９８５）　Ａｐｐｌｉｅｄａｎｄ　Ｅｎｖｉｒ
ｏｎｍ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５０＋　６１５　６２
２゜１８．　　ｖａｎ　Ｈｏｕｄｅｎｈｏｖｅｎ、　　
Ｆ、Ｅ、Ａ、（Ｉ９７５）　　Ｐｈ、Ｄ、Ｔｈｅｓｉｓ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｗ
ａｇｅｎｉｎｇｅｎ、　ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
　　０ １９、　１ｌｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、　　Ｍ、Ｗ、（Ｉ
９８５）　　ＰＴＩＩ　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄ八ｎａｌ
ｙｓｉｓ、　　Ｕｓｅｒ　　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　　ｎｏ
、１４　　八ｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ。

２０、　Ｚｉｓｓｌｅｒ、　　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、（Ｉ
９７１）、　　Ｔｈｅ　Ｂａｃｔｅｒｉ。

ｐｈａｇｅ　Ｌａｍｂｄａ、コールドスプリングハーバ
−・ラプス、ニューヨー先へ、Ｄ、ｌ１ｅｒｓｌｅｙ　
’１Ｈ集。

２１、　Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ、　Ｊ、、にｅｍｐｅ、　
Ｔ、及びＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ。

（Ｉ９８３）　Ｇｅｎｅ　２６．１０１−１０６゜２２
、　　Ｆ、Ｅ、八、ｖａｎ　　Ｈｏｕｄｅｎｈｏｖｅｎ
、Ｐｈ、Ｄ、Ｔｈｅｓｉｕｓ　　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒ
ａｌ　Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｗａｇｅｎｉｎｇｅ
ｎ　ｉｎ　Ｃｏｍｍｕ−ｎｉｃａｔｉｏｎｓ　Ａｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｗａｇｅｎ
ｉｎｇｅｎ、　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ　７５
　１３（Ｉ９７５）。

２３、　Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　Ｈ，Ｃ６及びＤｏｌｙ　Ｊ
、（Ｉ９７９）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　
７．１５１３−１５２３゜２４、　Ｂｏｅｌ　Ｅ、、　
Ｈａｎｓｅｎ　Ｍ、Ｔ、、　Ｈｊｏｒｔ　１．、　ｌｌ
ｏｅｇｈ　１．。

Ｆｉｉｌ　Ｎ、Ｐ、（Ｉ９８４）、　ＥＭＢＯＪ、３．
１５８１　１５８５゜２５、　Ｍ（ＢＢｌｉ　　Ｓ、ｌ
’ｌ、（Ｉ９３２）、ＮＬＩＣｌｅｌＣＡｃ１ｄｓ　　
Ｒｅｓ、１０゜４５９−４７２　　。

２６、８ａｌｌａｎｃｅ　Ｄ、Ｊ、及びＴｕｒｎｅｒ　
Ｇ、（Ｉ９８５）＋　Ｇｅｎｅ３６、　３２１−３３１
　　。

２７、　　ＩｌｅｒｍｅｒｓｄＯｒｆｅｒ　Ｈ，）Ｉｅ
ｕｃｈｔｅｎｂｅｒｇｅｒ　Ａ、　　Ｗａｒｄｓａｃｋ
　Ｃｈ及びＲｕｔＬＩｏｆｆ　Ｈ（Ｉ９０７）　Ｉｎｆ
ｌｕｅｎｃｅ　ｏｆｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏ
ｎｓ　　ｏｎ　　ｍｙｃｅｌｉａｌ　　５ｔｒｕｃｔｕ
ｒｅａｎｄ　ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ　５
ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ａ。

ｎｉｇｅｒ、Ｊ、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２
７．　３０９　３１５゜２８、　　ｆｌｅｎｉｋｏｆｆ
、　　Ｓ、（Ｉ９８４）　　Ｇｅｒｎｅ　２Ｂ、　　３
５１−３５９　。

２９、　Ｍｅａｄ等、（Ｉ９８６）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　
Ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ　Ｌ　６７゜３０、Ｋｕｎｋｅ
ｌ等、（Ｉ９８５）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、ＵＳＡ８２．４８５　　。

【図面の簡単な説明】

第１図はシ１−Ａ遺伝子を含有するｐＧＷ８２０の制限
地図を示す。 第２図は凪Ａ遺伝子を含有するｐＧＷ８３０の制限地図
を示す。 第３図はｍｌＣ遺伝子を含有するｐＧＷ８５０の制限地
図を示す。 第４図は凪り遺伝子を含有するｐＧＷ８４０の制限地図
を示す。 第５図は凪Ｅ遺伝子を含有するｐＧＷ１３８０の制限地
図を示す。 第６図は凪Ｅ遺伝子を含有するｐＧＷ８６０の制限地図
を示す。 第７図は凪Ａ遺伝子の配列決定法を示す。図中、Ｂｅ　
ｊＡ遺伝子を棒で示し、非コード領域を白で示し、そし
て斜線部分はコード領域を示す。ｓｓシグナル配列；１
〜５：イントロンの位置。制限部位の位置を線で示し、
線の下の番号はｐＧＷ８２０　（第１図）上の位置を示
し、酵素名の後の番号は決定された配列（第１０図）上
の位置を示す。生成したサブクローンを二重矢印（−〉
）で示し、５’−３’方向におけるｎｌ−ｎ１３及び３
’−５’方向におけるｒ１〜ｒ１４は遺伝子の方向に関
する。ユニバーサル配列決定プライマーを用いて決定さ
れた配列を１木矢（□）で示す。ぬりつぶした小さい箱
は特に合成したプライマーを示し、配列及びその方向を
矢印で示す。Ａ　：　ＨＲ５７６、Ｂ　：　１ｌＲ５６
３６，Ｃ：ＨＲ５８０３，ロ　：　　Ｉ（ｌ’１５７６
４．　　Ｅ　：　ｌｌＲ５７６７Ｆ　　：　　ｌＩＩ？
５７６３．　　Ｇ　：ＨＲ５８０４，Ｈ：　ＨＲ５７６
３゜ 第８図は脈８遺伝子の配列決定法を示す。図中、止壮Ｂ
遺伝子を棒で示し、白い部分は非コード領域を示し、そ
して斜線部分はコード領域を示す。 ＳＳはシグナル配列を示し；１〜５はイントロン部位を
示す。制限部位の位置を線上に示し、線の下の番号はｐ
ＧＷ８３０　（第２図）上の位置を示し、線上の番号は
決定された配列（第１１図）上の位置を示す。生成した
サブクローンを二重矢印（−〉）で示し、５’−３’方
向におけるｎ１〜ｎ１３及び３’−５’方向におけるｒ
１〜ｒ１２は遺伝子の方向に関する。ユニバーサル配列
決定プライマーにより決定された配列を１本鎖（□）で
示す。ぬりつぶされた小さい箱は特に合成されたブライ
マーを示し、配列及び方向を矢印で示す。Ａ　：　ＨＲ
５７６７゜Ｂ　：　ＨＲ５７７０，Ｃ：　ＨＲ５８２６
，Ｄ　：　ｌｌＲ５８２７Ｅ　：　Ｈ１？５８２８Ｆ　
：　ＨＲ５Ｂ２９゜点線を伴う矢印は延長されたＫｌｅ
ｎｏｗ配列決定法（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ　Ｆｏｃｕｓ　
ＬＬＩ、　ｌ　　４）により決定された配列に関する。 ＊は、爪Ｂ配列上の内部Ｍ１３配列決定プライマー開始
部位（Ｉ７塩基中１４）を示す。 第９図は匹耳遺伝子の配列決定を示す。図中、ｐｅｌＧ
遺伝子を棒で示す。遺伝子の方向は左から右であり、１
３６８位のＡＴＧから２７０８位の終止コドンまでであ
る。示される制限酵素部位の位置の番号付与はｐＧＷａ
ｓｏ　（第３図）上の位置の番号付与とは逆であるが、
配列（第１２図）中に示される番号付与に一致する。生
成したサブクローンを二重矢印（−〉）で示し、５　ｒ
　　３　＋方向におけるｎ１〜ｎ１７、及び３’−５’
方向におけるｒｌ−ｒｌ２は遺伝子の方向に関する。決
定され・た配列の長さを棒で示す。エキソヌクレアーゼ
■クローンを実線の矢印ｅ１〜ｅ１４（→）により示す
。 第１Ｏ図はＰＬＡをコードする遺伝子を含有する、式（
［）により示されるＤＮＡ分子ｐｅｌＡの配列を示す。 第１１図はＰＬＢをコードする遺伝子を含有する、式（
Ｉｔ）により示されるＤＮＡ分子ル壮Ｂの配列を示す。 第１２図はＰＬＣをコートする遺伝子を含有する、式（
［［）により示されるＤＮＡ分子Ｐ壮ｃの配列を示す。 第１３図は、ＰＬＯ，ＰＬＡ及びＰＬＣ間のアミノ酸配
列のレヘルでの相同性を示す。囲みの中は相同のアミノ
酸を示す。ダッシュ印は配列を合わせるために挿入され
ている。 第１４図はバイブリドインターフェロンＢＤＢＢをコー
ドする遺伝子を含有するベクターｐＵＣ１９／ρｅｌＡ
ＩＦＮ　ＡＭ１１９の作製を示す。 第１５図は、プールアウトされたシグナル配列を伴うプ
ラスミドＰ壮へ−ＩＦＮ　ＡＭ１１９上の耐へ−ＩＦＮ
融合の部分の非コード鎖と、Ｐ壮Ａシグナル配列を除去
する変異のために使用されたオリゴヌクレオチドブライ
マーとを並べて示す。 Ｆｉｇｕｒｅ　１：　　ｐｅｌＡ、を含有マるプラスミ
ドｐＧ〜Ｖ　８２０の１」限地図本〜−掃 Ｐ ｇ　ＩＡ Ａ　ニガー　Ｎ４００　ＤＮＡ アンピシリン　耐性遺伝子　（ρ８Ｒ３２２）且釘△　
コード領誠 矢印は遺伝子の方向 埜−一一畢 ｐ ｅＩＢ Ａ、ニガー　トｊ４００　ＤＮＡ アンピシリン　耐性遺伝子 且鮒旦コード領誠 矢印（よ遺伝子の方向 Ｆｘａｕｒｅ　　３： ｅｌｃを含有するプラスミド ＧＷ８５０の制限地図 墜−一一畢 ｐ Ａ、ニガー アンピシリン ４００ ＮＡ 耐性遺伝子 Ｆｉ詐ｒｅ　５： ｐｅ旧を含有するプラスミ！：ｐＧＷ８８０の制限地図
性−−キ ｐ ｅｌＥ Ａ　ニガー　〜４００　　ＤＮＡ アンピシリン　ご性遺伝子 以転旦コードＣ列 Ｆｉｇｕｒｅ　４： ｐｅｌＤを含有するプラスミドｐＧＷ８４０の制限地図
ｅ　ＬＤ アンピシリン　耐性遺伝子 且耐ｑニード領誠 矢印（よ遺伝子の方向 Ｆｉｇｕｔｅ　６：　　ｐｅｌＦを含有するプラスミド
ｐＧＷ８６０のＦ：Ｉ　Ｖｎ　Ｒ’Ｊ２ＪｅＬＦ ｐｅｌＤ遺伝子とハイブリダイズする且斂旦の最小断片
、矢印は遺伝子の方向 く ２≧ トく ｙｉｇｕｒ＊　１０　（Ｙの６） （現く Ｐｉ露υｒ＠Ｉ＋　（％のぢ） ２４１０ ４３０ ４５０ ４７０ ５１０ 丁子ＴＣ丁ＡＧＣＡＧＡＣＣＡＴＧＡＣＧＣＧＴＡＣＧ
ＣＡＡＣＡＴＡＧＡＣＣＧＣＴＣＣＡＴＧＴＴＡＣ丁Ｇ
ＡＣＴＧＣＧＡＣτＧＴ１ｕｒ＠１２　　　式　　！Ｉ
ｌ：店１０（７ら ） ０ ３゜ ０ ０ ０ ＋１０ ９０ １０ ３０ ５０ ２フ０ ９０ １０ ３０ ５０ ７０ ９０ １０ ３０ ５０ ７０ ９０ １０ ３０ ７０ ９０ （就く ） ×く 一一＜　・ Ｆｉｇｕｒｅ　１２　（王の６） ３０１０ ０３０ ０５０ ＣＡＡＴＣＡＡ ０７０ ０９０ ＡＴＡＴＧ丁丁ＡＣＡＡＡＡ １１０ ＧＡＡＡＣＡＴＡＣＡＡＣＡＧＡＡＧＧＡＡＴＡＴＧＴ
ＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＴＧＡＡＣＡＴＴＡＣＡＡＡ３１
３０　　　　　　　　　３１５０ ハ左囚り口＝ ＰＬＤ、ＰＬＡ、ＰＬＢ及びＰＬＣ間の相同性とマ＾ ） ０ ０ ０ ＋１０ ＋５０ 〈続く　） Ｆｉｇｕｒ＠＋３　（′＋−？３　） ３１０ ４０ ２０ ３０ ６０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ペクチンリアーゼＰＬＡ、ＰＬＢ、ＰＬＣ、ＰＬＥ
   又はＰＬＦ発現系又はその誘導体をコードするＤＮＡ配
   列を含んで成る組換ＤＮＡ分子。 ２、ＰＬ発現系のいずれかの、プロモーター、シグナル
   配列、構造遺伝子もしくはターミネーター又はこれらの
   断片の任意の組み合わせを含んで成る請求項１に記載の
   組換ＤＮＡ分子。 ３、式（ I ）のＤＮＡ配列又はその誘導体を含んで成
   る請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子。 ４、式（II）のＤＮＡ配列又はその誘導体を含んで成る
   請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子。 ５、式（III）のＤＮＡ配列又はその誘導体を含んで成
   る請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子。 ６、ｐＧＷ８２０である請求項１に記載の組換ＤＮＡ分
   子。 ７、ｐＧＷ８３０である請求項１に記載の組換ＤＮＡ分
   子。 ８、ｐＧＷ８５０である請求項１に記載の組換ＤＮＡ分
   子。 ９、ｐＧＷ８８０である請求項１に記載の組換ＤＮＡ分
   子。 １０、ｐＧＷ８６０である請求項１に記載の組換ＤＮＡ
   分子。 １１、プラスミドｐＧＷ８２０、ｐＧＷ８３０、ｐＧＷ
   ８５０、ｐＧＷ８８０もしくはｐＧＷ８６０の２個の制
   限部位の間に延びそしてプロモーター機能、シグナル機
   能、構造機能もしくはターミネーター機能を保持してい
   る断片又はこれらの断片の組み合わせを含んで成る請求
   項１に記載の組換ＤＮＡ分子。 １２、￥ｐｅｌ￥Ａのプロモーター配列を含んで成る請
   求項１に記載の組換ＤＮＡ分子。１３、￥ｐｅｌ￥Ａ、
   ￥ｐｅｌ￥Ｂ、￥ｐｅｌ￥Ｃ、￥ｐｅｌ￥Ｅ又は￥ｐｅ
   ｌ￥Ｆのプロモーター配列を含んで成る請求項１に記載
   の組換ＤＮＡ分子。 １４、￥ｐｅｌ￥Ａ、￥ｐｅｌ￥Ｂ、￥ｐｅｌ￥Ｃ、￥
   ｐｅｌ￥Ｅ又は￥ｐｅｌ￥Ｆのシグナル配列を含んで成
   る請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子。 １５、￥ｐｅｌ￥Ａ、￥ｐｅｌ￥Ｂ、￥ｐｅｌ￥Ｃ、￥
   ｐｅｌ￥Ｅ又は￥ｐｅｌ￥ＦのＰＬＩ構造遺伝子を含ん
   で成る請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子。 １６、イントロンを含有しない￥ｐｅｌ￥Ａ、￥ｐｅｌ
   ￥Ｂ、￥ｐｅｌ￥Ｃ、￥ｐｅｌ￥Ｅ又は￥ｐｅｌ￥Ｆの
   構造遺伝子を含ん成る請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子
   。 １７、￥ｐｅｌ￥Ａ、￥ｐｅｌ￥Ｂ、￥ｐｅｌ￥Ｃ、￥
   ｐｅｌ￥Ｅ又は￥ｐｅｌ￥Ｆのターミネーターを含んで
   成る請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子。 １８、アスペルギルス・ニガー（￥Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
   ｕｓ￥￥ｎｉｇｅｒ￥）に対して異種性である構造遺伝
   子を含んで成る組換ハイブリドベクターである請求項１
   に記載の組換ＤＮＡ分子。 １９、ハイブリドインターフェロンＢＤＢＢをコードす
   る異種性構造遺伝子を含んで成るハイブリドベクターで
   ある請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子。 ２０、ハイブリドベクターｐＵＣ１９／ｐｅｌＡ−ＩＦ
   ＮＡＭ１１９である請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子。 ２１、ハイブリドベクターＭ１３（＋）ｐｅｌＡΔ＿ｓ
   ＿ｓ−ＩＦＮＡＭ１１９である請求項１に記載の組換Ｄ
   ＮＡ分子。 ２２、ハイブリドベクターＭ１３（＋）ＫＳ／ｐｅｌＡ
   −ＩＦＮＡＭ１１９である請求項１に記載の組換ＤＮＡ
   分子。 ２３、請求項１の組換ＤＮＡ分子の製造方法であって、
   ペクチンリアーゼＰＬＡ、ＰＬＢ、ＰＬＣ、ＰＬＥもし
   くはＰＬＦ発現系又はその誘導体をコードするＤＮＡ配
   列を含有するＤＮＡ分子により形質転換された宿主を培
   養しそして所望の組換ＤＮＡ分子を単するか、あるいは
   生体外合成により調製する、ことを含んで成る方法。 ２４、請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子を含有する形質
   転換された宿主。 ２５、大腸菌（￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ￥）
   ＨＢ１０１／ｐＧＷ８２０（ＤＳＭ４３８８）である請
   求項２４に記載の形質転換された宿主。 ２６、大腸菌（￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ￥）
   ＨＢ１０１／ｐＧＷ８３０（ＤＳＭ４３８９）である請
   求項２４に記載の形質転換された宿主。 ２７、大腸菌（￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ￥）
   ＨＢ１０１／ｐＧＷ８５０（ＤＳＭ４３９０）である請
   求項２４に記載の形質転換された宿主。 ２８、大腸菌（￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ￥）
   ＨＢ１０１／ｐＧＷ８６０（ＤＳＭ４３９１）である請
   求項２４に記載の形質転換された宿主。 ２９、大腸菌（￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ￥）
   ＨＢ１０１／ｐＧＷ８８０（ＤＳＭ４３９２）である請
   求項２４に記載の形質転換された宿主。 ３０、請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子と選択マーカー
   プラスミドｐＣＧ５９Ｄ７とにより形質転換されたアス
   ペルギルス・ニガー（￥Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇ
   ｅｒ￥）Ａｎ８（ＤＳＭ３９１７）である請求項２４に
   記載の形質転換された宿主。 ３１、プラスミドｐＵＣ１９／ｐｅｌＡ−ＩＦＮＡＭ１
   １９と選択マーカープラスミドｐＣＧ５９Ｄ７とにより
   形質転換されたアスペルギルス・ニガー（￥Ａｓｐｅｒ
   ｇｉｌｌｕｓ￥ｎｉｇｅｒ￥）Ａｎ８（ＤＳＭ３９１７
   ）である請求項２４に記載の形質転換された宿主。 ３２、Ｍ１３（＋）ＫＳ／ｐｅｌＡΔ＿ｓ＿ｓ−ＩＦＮ
   ＡＭ１１９と選択マーカープラスミドｐＣＧ５９Ｄ７と
   により形質転換されたアスペルギルス・ニガー（￥Ａｓ
   ｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ￥）Ａｎ８（ＤＳＭ３９
   １７）である請求項２４に記載の形質転換された宿主。 ３３、Ｍ１３（＋）ＫＳ／ｐｅｌＡ−ＩＦＮＡＭ１１９
   と選択マーカープラスミドｐＣＧ５９Ｄ７とにより形質
   転換されたアスペルギルス・ニガー（￥Ａｓｐｅｒｇｉ
   ｌｌｕｓｎｉｇｅｒ￥）Ａｎ８（ＤＳＭ３９１７）であ
   る請求項２４に記載の形質転換された宿主。３４、請求
   項２４に記載の形質転換された宿主の製造方法であって
   、場合によっては選択マーカー遺伝子と共に、請求項１
   に記載の組換ＤＮＡ分子により宿主を処理することを含
   んで成る方法。 ３５、請求項１の組換ＤＮＡ分子と選択マーカープラス
   ミドｐＣＧ５９Ｄ７とによりアスペルギルス・ニガー（
   ￥Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ￥）Ａｎ８を同時
   形質転換する、請求項３４に記載の方法。 ３６、請求項１に記載のハイブリドベクターを適当な宿
   主中で発現せしめることを特徴とするポリペプチドの製
   造方法。 ３７、請求項１８に記載のハイブリドベクターを適当な
   宿主中で発現せしめることを特徴とするポリペプチドの
   製造方法。 ３８、ペクチンリアーゼＰＬＡ、ＰＬＢ、ＰＬＣ、ＰＬ
   Ｅ又はＰＬＦをアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
   ｓ）の種において過剰生産せしめるための、該ペクチン
   リアーゼの発現のための発現ハイブリドベクターにより
   形質転換されたアスペルギルス宿主を培養することを特
   徴とする請求項３６に記載の方法。 ３９、ハイブリドインターフェロンＢＤＢＢをアスペル
   ギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種において製造す
   るための、該ハイブリドインターフェロン発現用の発現
   ハイブリドベクターにより形質転換されたアスペルギル
   ス宿主を培養することを特徴とする請求項３７に記載の
   方法。 ４０、純粋な形のペクチンリアーゼＰＬＡ、ＰＬＢ、Ｐ
   ＬＣ、ＰＬＥ又はＰＬＦ。