JPH08228779A - 組換え胆汁酸塩活性化リパーゼの高収率発現方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 Ｃ末端のアミノ酸の繰り返し構造の一部を欠
失させた又は欠失させない胆汁酸塩活性化リパーゼ遺伝
子を組込んだピキア酵母を、炭素源を十分供給して増殖
させ、次に１５〜３０℃、溶存酸素２０％飽和以下でメ
タノール誘導により胆汁酸塩活性化リパーゼを発現せし
める。 【効果】 天然の胆汁酸塩活性化リパーゼと同等の活性
を有する遺伝子組換えによる胆汁酸塩活性化リパーゼを
高収率で発現せしめる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は組換え胆汁酸塩活性化リ
パーゼの高収率発現方法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】胆汁酸
塩活性化リパーゼ（Bile salt-activated Lipase; 以下
ＢＡＬということがある）は、脂質加水分解酵素（リパ
ーゼ）の一つであり、消化管にあっては膵臓から分泌さ
れ、乳汁中にも見出される。ＢＡＬは小腸内において胆
汁酸塩によって活性化され、トリグリセライドを脂肪酸
とグリセリンにまで完全に加水分解し、コレステロール
やビタミンのエステルも加水分解する。

【０００３】ＢＡＬの欠乏は、乳児にあっては乳脂肪の
消化不良による発育不全をもたらすため、ＢＡＬを添加
した食品が提唱されている（特開平1-231848号）。ま
た、血清コレステロールや中性脂肪を測定するための検
査薬としての利用法もある。さらに、ＢＡＬの投与によ
り嚢胞性繊維症（cystic fibrosis）などの膵臓不全の
症状を、脂質消化の観点から軽減することが期待され
る。一方、ＢＡＬを乳から抽出しようとする場合、原料
となる母乳の確保、精製に要するコスト、ウィルスのコ
ンタミネーション等の問題があり、十分な量を確保する
のは容易ではない。このため、遺伝子組換え技術を用い
るＢＡＬの製造が期待されており、ＢＡＬの乳からの単
離精製が既になされ（Wang and Johnson: Anal. Bioche
m. 133, 457-461（1983））、さらにＢＡＬをコードす
るｃＤＮＡも知られている。その配列から、ＢＡＬ蛋白
質は７２２個のアミノ酸からなり、Ｃ末端には１６回の
１１アミノ酸からなる繰り返し構造が存在することが判
明している（WO91/15234号）。

【０００４】しかし、上記ｃＤＮＡを用いる遺伝子組換
えＢＡＬを培地中に高収率で分泌発現させる方法は未だ
見出されていない。

【０００５】そこで、上記組換えＢＡＬを高収率で発現
させる方法の開発が望まれていた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】酵母による異種蛋白質発
現系の一つとして、ピキア・パストリス（Pichia pasto
ris、以下ピキア酵母という）を宿主として用いる方法
が知られており（特開昭61-108383号、特開昭61-173781
号、特開昭63-44899号、特開平1-128790号等）、具体的
な物質生産の例としては、ストレプトキナーゼ（特開昭
62-296881号）、ＴＮＦ（特開昭63-164891号）、ＨＩＶ
２４ｋＤＡ ｇａｇ蛋白質（特開平2-20286号）、ヒ
トＩＬ−２（特開平2-104292号）、Ｂ型肝炎のｐｒｅ
Ｓ２蛋白質（特開平2-84176号、特開平2-27990号）等が
知られている。本発明者らはこれらの知見をもとに、ピ
キア酵母を宿主としてＢＡＬのｃＤＮＡを用い、組換え
ＢＡＬの高収率発現方法について鋭意研究した結果、本
発明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明者らは、組換えＢＡＬの
発現に上記ピキア・パストリスの系を用いる場合、ピキ
ア酵母染色体由来のアルコール酸化酵素遺伝子のプロモ
ーター及びターミネーターを含む発現ベクター（プラス
ミドｐＨＩＬ３０１）に、ＢＡＬ蛋白質のＣ末端領域に
存在する１６回の繰り返し構造が一部又は全部欠損した
又は欠損しないＢＡＬ遺伝子を組込んで、ピキア酵母を
形質転換し、当該形質転換体を用いて組み換えＢＡＬを
発現させるに際し、形質転換体を十分に増殖させた後、
メタノールによるＢＡＬの誘導発現を行うが、ＢＡＬを
高収率で発現させるためには、増殖段階の培養条件と誘
導段階の培養条件とは異なり、増殖段階では、増殖を制
限しない量の炭素源を含み、溶存酸素が空気で飽和させ
た時の（以下、飽和という）３０〜５０％、温度３０〜
３７℃、pH２．５〜６が適当であるが、誘導段階ではメ
タノール及び蛋白質を含有する培地で、温度１５〜３０
℃、溶存酸素２０％飽和以下が適当であり、このように
すると高収率の発現量が得られることを見出した。

【０００８】すなわち、本発明は、胆汁酸塩活性化リパ
ーゼをコードする遺伝子、又はその遺伝子配列のカルボ
キシ末端領域に存在する１１個のアミノ酸残基からなる
ペプチドを単位とした１６回の繰り返し構造のアミノ酸
配列をコードする遺伝子の一部もしくは全部を欠失させ
た欠損遺伝子断片と分泌シグナルをコードする遺伝子と
を連結した遺伝子を、プラスミドｐＨＩＬ３０１のＥｃ
ｏＲＩ部位に組み込んでなる組換えプラスミドにより形
質転換したピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔ
ｏｒｉｓ）ＧＳ１１５株の形質転換体を用い、当該形質
転換体を増殖を制限しない量の炭素源を含み、溶存酸素
３０〜５０％飽和、温度３０〜３７℃、pH２．５〜６の
条件下で増殖させた後、メタノール及び蛋白質を含有す
る培地で、温度１５〜３０℃、溶存酸素２０％飽和以下
の条件下で培養して培地中に胆汁酸塩活性化リパーゼを
誘導発現させることを特徴とする組換え胆汁酸塩活性化
リパーゼの高収率発現方法を提供するものである。

【０００９】本発明の組換えＢＡＬは配列番号１記載の
アミノ酸配列（当該アミノ酸配列に相当するｃＤＮＡの
塩基配列は配列番号３に記載。）、当該アミノ酸配列の
Ｃ末端に配列番号２記載のアミノ酸配列（１）〜（７）
から選ばれたアミノ酸配列が１〜１５個結合してなるア
ミノ酸配列、又は、配列番号４記載のＢＡＬ全長アミノ
酸配列を有していてもよい。

【００１０】本発明に用いるｃＤＮＡは、泌乳している
ヒト乳房組織から作製したｃＤＮＡライブラリー（Clon
tech社製）から、WO91/15234号記載の方法に従ってｃＤ
ＮＡをクローニングしてもよく、WO91/15234号記載の配
列から化学合成してもよい。

【００１１】欠損遺伝子断片は、前記の如く、ＢＡＬの
全長ｃＤＮＡからＢＡＬ蛋白質のＣ末端領域の１６回の
繰り返し構造のうち、１〜１６回分をコードする部分を
取り除いた遺伝子断片を用いる。このような欠損遺伝子
断片は、WO91/15234号記載の方法に従ってＢＡＬｃＤＮ
Ａを調製し、これから１〜１６回分の繰り返し構造を除
去してもよく、また該ｃＤＮＡを含むプラスミドベクタ
ーを宿主内で増殖させるうちに自然に生じた欠損ｃＤＮ
Ａを用いてもよい。なお、欠損遺伝子断片は配列番号２
に示すアミノ酸配列（１）〜（７）が任意の順序で結合
していてもよい。

【００１２】本発明の組換えＢＡＬの発現に用いる宿主
・ベクター系としては、上記の特開昭61-108383号、特
開昭61-173781号、特開昭63-44899号及び特開平1-12879
0号等に記載されている、ヒスチジノール脱水素酵素活
性が欠如しているピキア酵母であるピキアＧＳ１１５
（寄託番号NRRL Y-15851）を宿主として用い、ｐＡ０８
０４（寄託番号NRRL B-18114の大腸菌株より抽出・調製
する）にカナマイシン耐性遺伝子を導入したｐＨＩＬ３
０１（特開平2-104292号参照）を発現ベクターとして用
いるのが好ましい。

【００１３】これらを用いて本発明に用いる組換えＢＡ
Ｌを製造するには、全長ＢＡＬをコードする遺伝子又は
前記欠損遺伝子断片と分泌シグナル遺伝子とを連結した
遺伝子を、前記発現ベクターｐＨＩＬ３０１のユニーク
サイトであるＥｃｏＲＩに挿入した組換え発現ベクター
を調製する（図１）。ここで分泌シグナル遺伝子として
は、ＢＡＬ自身のものを用いてもよいが、パン酵母（Sa
ccharomyces cerevisiae）インベルターゼの分泌シグナ
ル（ＳＵＣ２）をコードするＤＮＡが好ましい。

【００１４】ピキア酵母を形質転換するには、細胞壁を
酵素で消化してスフェロプラストとした後、カルシウム
イオンとポリエチレングリコールの存在下で、前記組換
え発現ベクターと混合する。さらにヒスチジンが欠損し
た選択培地でスフェロプラストを再生させ、カナマイシ
ンを含有する培地で培養して生育するコロニーを選択す
る。

【００１５】組換えＢＡＬ蛋白質の発現においては、形
質転換したピキア酵母株に増殖を制限しない量の炭素源
を与え、溶存酸素３０〜５０％飽和（溶存酸素量は、培
地を空気で飽和させた時を１００％とした場合の相対量
（％飽和）で示す。）、温度３０〜３７℃、pH２．５〜
６の条件で十分に増殖させた後、メタノール及び蛋白質
を含有する誘導培地で温度を約１５〜３０℃に下げ、溶
存酸素を２０％飽和以下とし、組換えＢＡＬ蛋白質の発
現を誘導する。

【００１６】増殖相における増殖を制限しない炭素源の
量は、酵母株の増殖が律速とならない十分な量であり、
培養槽の大きさや形態によって異なるが、当初の培地に
約３〜７％濃度で含み、炭素源が消費された後に、一定
量、例えば１０ｇ／培地・Ｌ／ｈ以上、好ましくは、２
５ｇ／培地・Ｌ／ｈ以上、５時間以上の連続添加、ある
いは、当初の培地の炭素源濃度の３倍以上の濃度の一時
添加等が好ましい。かかる炭素源としては、グリセロー
ルの他に、Ｄ−グルコース、α，α−トレハロース、Ｌ
−ラムノース、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、スク
シネート、エチルアミン、Ｌ−リジン、１，５−ジアミ
ノペンタンが挙げられる。

【００１７】増殖相におけるより好ましい温度は３０〜
３５℃であり、特に好ましい温度は３３℃付近である。
また、より好ましいpHは３〜５であり、特に好ましいpH
は４付近である。

【００１８】誘導培地へのメタノール及び蛋白質の添加
は、誘導開始前に一時に添加しても連続的に添加しても
よいが、メタノールについては培地中における濃度が
０．０１〜８％となるように連続添加するのが好まし
い。また蛋白質については脱脂粉乳やペプトン等を用い
るのが特に好ましい。

【００１９】誘導相においては温度は１５〜２５℃、特
に２０℃付近が好ましい。また溶存酸素は２０％飽和以
下であればよいが、０％飽和付近がより好ましい。

【００２０】かかる培養条件を用いれば、Ｃ末端の繰り
返し構造を欠失したＢＡＬのみならず、WO91/15234号記
載の全長ＢＡＬ（天然ＢＡＬ）の発現量も増大する。

【００２１】

【発明の効果】本発明によれば、天然のＢＡＬと同等の
活性を有する遺伝子組換えによるＢＡＬを高効率で発現
せしめることができる。

【００２２】

【実施例】以下に本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００２３】実施例１〜３、（組換えＢＡＬの製造） （１）ＢＡＬ発現ベクターの構築 ＢＡＬの全長ｃＤＮＡはWO91/15234号記載の方法に従っ
て調製し、これをプラスミドｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部
位に挿入して組換えプラスミドを得た。これを大腸菌Ｍ
Ｃ１０６１に導入して増殖させ、プラスミドをBirnboim
らの方法（Birnboim and Doby, Nucleic Acids Researc
h, 7, 1513（1979））により単離した。ＢＡＬのｃＤＮ
ＡからＢＡＬ蛋白質のＣ末端領域の繰り返し構造の一部
が取り除かれたｃＤＮＡは、ＢＡＬのｃＤＮＡを含むプ
ラスミドを大腸菌内で増殖させることによって自発的に
生じた１６回の繰り返し構造のうち９回分が欠損してい
るＢＡＬ ｃＤＮＡを選択して得た。このようにして得
られた欠損ＢＡＬ ｃＤＮＡからＢＡＬ自身の分泌シグ
ナルをコードする部分とその５′上流の非翻訳領域を取
り除き、代わりにパン酵母（Saccharomyces cerevisiu
e）のインベルターゼの分泌シグナル(SUC2)をコードす
るＤＮＡを連結した。

【００２４】すなわちＮ末端が成熟ＢＡＬと同じである
欠損ＢＡＬを製造するために酵母インベルターゼ遺伝子
ＳＵＣ２の分泌シグナル（表１）、

【００２５】

【表１】

【００２６】の矢印の切断部位の直上流の２個のアミノ
酸配列を変えずに、塩基配列のみを表２のように制限酵
素Ａｏｒ５１ＨＩの認識部位（AGCGCT）に変えた。さら
に、上記のＢＡＬ遺伝子を制限酵素Ａｐａ Ｉで切断
し、生じた繰り返し部分の断片を除き、ＢＡＬ構造遺伝
子の大部分を含む５′側の断片とＣ末端を含む断片を再
結合させることにより、Ｃ末端付近の１１回分の繰り返
し構造を欠損したＢＡＬ ｃＤＮＡを構築した。このＢ
ＡＬ ｃＤＮＡを発現ベクターｐＨＩＬ３０１のＥｃｏ
ＲＩ部位に組込んで組換え発現ベクターを得た（図
１）。すなわち、ｐＨＩＬ３０１をＥｃｏＲＩで消化
し、アルカリ性フォスファターゼで処理して脱燐酸化
し、このベクターにＢＡＬｃＤＮＡを挿入した。

【００２７】（２）細胞増殖 ＧＳ１１５のコロニーを１０mlのＹＰＤ培地（１Ｌの組
成：イースト・エキス１０ｇ、ペプトン２０ｇ及び２０
ｇのグルコース）に接種し、３０℃で飽和になるまで振
盪培養して種培養を得た。５００mlの培養フラスコに２
００mlのＹＰＤ培地を入れ、これに前記種培養を１０μ
ｌ加え、撹拌しつつ培養液の６００nmにおける吸光度が
０．２〜０．３になるまで３０℃で培養した。培養終了
後１５００×ｇで５分間室温で遠心して細胞を集菌し
た。この細胞を以下の形質転換に用いた。

【００２８】（３）スフェロプラストの調製 集菌した細胞を１０mlの滅菌水で一度洗い、１５００×
ｇで５分間室温で遠心して上清を捨てた。続いて１０ml
の新鮮なＳＥＤ（１Ｍのソルビトール、２５mMのＥＤＴ
Ａ及び５０mMのＤＴＴ、pH８．０）で一度洗い、１５０
０×ｇで５分間室温で遠心して上清を捨てた。さらに１
０mlの１Ｍのソルビトールで一度洗い、１５００×ｇで
５分間室温で遠心して上清を捨てた。１０mlのＳＣＥ緩
衝液（１Ｍのソルビトール、１０mMのクエン酸ナトリウ
ム、１mMのＥＤＴＡ、pH５．８）に細胞を懸濁した。続
いて３mg／mlのチモリアーゼ６０，０００溶液（Zymoly
ase、Miles Laboratories社製）７．５μｌを加え、ゆ
っくりかき混ぜて３０℃に１０分間保って細胞壁を消化
した。形成されたスフェロプラストを集菌し、１０mlの
１Ｍのソルビトールを加えて１，０００×ｇで５分間遠
心した。上清を捨て、１０mlのＣａＳ（１Ｍのソルビト
ール、１０mMのＣａＣｌ₂及び１０mMのトリス塩酸（pH
７．５））で１回洗い、０．６mlのＣａＳに懸濁した。

【００２９】（４）形質転換 ＢＡＬ ｃＤＮＡを含む組換え発現ベクター１０μｇを
Ｂｇ１IIで完全消化して線状とし、これをＴＥ緩衝液
［１．０mMのＥＤＴＡを含む０．０１Ｍ（pH７．４）の
トリス緩衝液］１０μｌに懸濁して１２×７５mm滅菌ポ
リプロピレン管に入れ、スフェロプラスト１００μｌを
加えて室温で約２０分間インキュベートした。次いでＰ
ＥＧ溶液［２０％ポリエチレングリコール３３５０、１
０mM ＣａＣｌ₂及び１０mMトリス塩酸（pH７．４）］
１mlを加えて室温で約１５分インキュベーションし、７
００×ｇで５分間遠心して上清を捨てた。ＳＯＳ溶液
（１Ｍソルビトール、１０mM ＣａＣｌ₂及び３３．３
％ＹＰＤ培地）１５０μｌを加え、室温で３０分間イン
キュベートした後、８５０μｌの１Ｍソルビトール溶液
を加えた。

【００３０】（５）スフェロプラストの再生 再生寒天培地［１Ｌの組成：yeast nitrogen base with
ammonium sulfate ６．７ｇ、ビオチン４００μｇ、、
ソルビトール１８６ｇ、デキストロース１０ｇ、アガロ
ース２０ｇ、グルタミン酸、メチオニン、リジン、ロイ
シン及びイソロイシン各々５０mg、ヒスチジンアッセイ
培地(Difco)２ｇ］１０mlをオートクレーブにて溶解
し、プレートに流し込んで固化しておいた。一方で、１
Ｌあたり１０ｇのアガロースを含む再生寒天培地１０ml
をオートクレーブにて溶解し、４５℃に保った状態で１
０又は９９０μｌの形質転換サンプルを加え、前記の固
化させておいた再生寒天培地の上に流し込んだ。このプ
レートを３０℃で、３〜５日間インキュベートした。

【００３１】（６）ＢＡＬ産生クローンの同定 再生寒天培地（ヒスチジンを含んでいない）で生育して
きたコロニーを採取することにより、Ｈｉｓ＋形質転換
株を得た。形質転換株をＢＭＧＹ培地［１Ｌの組成：１
Ｍリン酸カリウム緩衝液（pH６．０）１００ml、yeast
nitrogen base with ammonium sulfate １３．４ｇ、ビ
オチン４００μｇ、酵母エキス１０ｇ、グリセロール１
０ml、ペプトン２０ｇ］で２日間培養後、培地をＢＭＭ
Ｙ培地（ＢＭＧＹ培地においてグリセリンの代わりにメ
タノール５mlを加えたもの）で２日間培養した。遠心し
て１０μｌの培養上清を取り、ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）にかけ、抗ＢＡＬ抗体に
よるウェスタンブロット分析を行った。この結果から、
全長ＢＡＬのｃＤＮＡを導入した形質転換株は全長のＢ
ＡＬに対応する約１１０kdのＢＡＬを、繰り返し構造が
１１回分欠損したＢＡＬのｃＤＮＡを導入した形質転換
株は繰り返し構造が１１回分欠損したＢＡＬに対応する
約８０kdのＢＡＬを産生していることが認められた。ま
た、エステラーゼ活性の測定によりタウロコール酸で活
性化される蛋白質の存在が確認された。さらに、培養上
清からヘパリンを担体としたアフィニティーカラムクロ
マトグラフィーにかけてＢＡＬを精製し、Ｎ末端のアミ
ノ酸分析を行ったところ、Ｎ末端から１０アミノ酸ま
で、成熟ＢＡＬのｃＤＮＡ配列から予想される配列と一
致していた。

【００３２】

【表２】

【００３３】（ファーメンター培養による高効率発現） （１）ＢＡＬ発現ベクターのコピー数の増大 上記で得られた繰り返し構造が１１回分欠損したＢＡＬ
を産生する株の中から、ＧＳ１１５の染色体に多くのＢ
ＡＬ遺伝子が導入された株を得るために、カナマイシン
耐性（１．５mg／ml）で選択したところ、１つの耐性株
（８Ｍ２５）が得られた。この耐性株からゲノムＤＮＡ
を抽出し、サザンブロットハイブリダイゼーションによ
り挿入されたＢＡＬ遺伝子のコピー数を検討したとこ
ろ、８Ｍ２５には４コピーの挿入が確認された。８Ｍ２
５を上記と同じ方法でＢＡＬを発現させ、培養上清を直
接ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてＢＡＬの発現量を調べたと
ころ、ＢＡＬ遺伝子が１コピーしか導入されていない株
と比べて約４倍の発現が見られた。この８Ｍ２５を以下
のファーメンターでのＢＡＬ発現に用いた。

【００３４】（２）ファーメンター培養における高効率
発現 １０Ｌ容のジャーに３．５Ｌの培地（１Ｌ当たりの組成
は、グリセロール５０．０ｇ、Ｈ₃ＰＯ₄（８５％）２１
ml、ＣａＳＯ₄・２Ｈ₂Ｏ ０．９ｇ、Ｋ₂ＳＯ₄１４．２
８ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １１．７ｇ、ＫＯＨ ３．
９ｇ）及び５mlの微量金属溶液（１Ｌ当たりの組成は、
ＫＩ ０．８ｇ、ＮａＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ ０．２ｇ、Ｈ
₃ＢＯ₃ ０．０２ｇ、ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ ０．５ｇ、
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ６５．０ｇ、ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ
６．０ｇ、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２０ｇ、ＭｎＳＯ₄
３．０ｇ、Ｈ₂ＳＯ₄ ５．０ml、Ｂｉｏｔｉｎ０．２
ｇ）を入れ、ＹＰＤ培地で培養した前培養液７０mlを加
えて培養を開始した。培養条件を表３及び表４に、結果
を図２に示す。

【００３５】

【表３】

【００３６】

【表４】

【００３７】増殖時のグリセロールを十分に加えること
により、好ましくは、さらに誘導時のメタノール添加を
連続とし、さらに図２から、増殖時の培養温度あるいは
pHを変化させることにより、ＢＡＬの発現量を大幅に増
加させることが示された。

【００３８】なお、ＢＡＬの発現量は精製した組換えＢ
ＡＬの蛋白質量をＬｏｗｒｙ法で求め、リパーゼ活性を
pHスタットで測定して決定した比活性を基に計算した。
リパーゼ活性は、エマルジョンにしたトリオレインの分
解をラジオメーター社製のpHスタット装置を用いて測定
した。反応液には２mMトリオレイン、３０mMＮａＣｌ及
び２５mMのタウロコール酸を含み、反応温度は３７℃、
pHは８．２であった。

【００３９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：５３８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val 5 10 15 Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly 20 25 30 Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His 35 40 45 Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys 50 55 60 Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly 100 105 110 Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu 115 120 125 Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg 130 135 140 Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly 145 150 155 160 Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg 165 170 175 Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly 180 185 190 Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr 195 200 205 Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu 210 215 220 Ser Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val 225 230 235 240 Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln 245 250 255 Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val 260 265 270 Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val 275 280 285 Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr 290 295 300 Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp 305 310 315 320 Gly His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn 325 330 335 Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr 340 345 350 Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr 355 360 365 Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val 370 375 380 Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala 385 390 395 400 Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr 405 410 415 Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly 420 425 430 Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala 435 440 445 Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met 450 455 460 Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly 465 470 475 480 Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser 485 490 495 Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg 500 505 510 Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala 515 520 525 Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln Glu Ala Thr 530 535

【００４０】配列番号：２ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 （１）Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Thr （２）Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala （３）Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro （４）Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ala Gly Pro Pro （５）Pro Val Thr Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala （６）Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Ala （７）Pro Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Lys Glu Ala

【００４１】配列番号：３ 配列の長さ：１６１４ 配列の型：核酸 配列の数：１本鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GCGAAGCTGG GCGCCGTGTA CACAGAAGGT GGGTTCGTGG AAGGCGTCAA TAAGAAGCTC 60 GGCCTCCTGG GTGACTCTGT GGACATCTTC AAGGGCATCC CCTTCGCAGC TCCCACCAAG 120 GCCCTGGAAA ATCCTCAGCC ACATCCTGGC TGGCAAGGGA CCCTGAAGGC CAAGAACTTC 180 AAGAAGAGAT GCCTGCAGGC CACCATCACC CAGGACAGCA CCTACGGGGA TGAAGACTGC 240 CTGTACCTCA ACATTTGGGT GCCCCAGGGC AGGAAGCAAG TCTCCCGGGA CCTGCCCGTT 300 ATGATCTGGA TCTATGGAGG CGCCTTCCTC ATGGGGTCCG GCCATGGGGC CAACTTCCTC 360 AACAACTACC TGTATGACGG CGAGGAGATC GCCACACGCG GAAACGTCAT CGTGGTCACC 420 TTCAACTACC GTGTCGGCCC CCTTGGGTTC CTCAGCACTG GGGACGCCAA TCTGCCAGGT 480 AACTATGGTC TTCGGGATCA GCACATGGCC ATTGCTTGGG TGAAGAGGAA TATCGCGGCC 540 TTCGGGGGGG ACCCCAACAA CATCACGCTC TTCGGGGAGT CTGCTGGAGG TGCCAGCGTC 600 TCTCTGCAGA CCCTCTCCCC CTACAACAAG GGCCTCATCC GGCGAGCCAT CAGCCAGAGC 660 GGCGTGGCCC TGAGTCCCTG GGTCATCCAG AAAAACCCAC TCTTCTGGGC CAAAAAGGTG 720 GCTGAGAAGG TGGGTTGCCC TGTGGGTGAT GCCGCCAGGA TGGCCCAGTG TCTGAAGGTT 780 ACTGATCCCC GAGCCCTGAC GCTGGCCTAT AAGGTGCCGC TGGCAGGCCT GGAGTACCCC 840 ATGCTGCACT ATGTGGGCTT CGTCCCTGTC ATTGATGGAG ACTTCATCCC CGCTGACCCG 900 ATCAACCTGT ACGCCAACGC CGCCGACATC GACTATATAG CAGGCACCAA CAACATGGAC 960 GGCCACATCT TCGCCAGCAT CGACATGCCT GCCATCAACA AGGGCAACAA GAAAGTCACG 1020 GAGGAGGACT TCTACAAGCT GGTCAGTGAG TTCACAATCA CCAAGGGGCT CAGAGGCGCA 1080 AAGACGACCT TTGATGTCTA CACCGAGTCC TGGGCCCAGG ACCCATCCCA GGAGAATAAG 1140 AAGAAGACTG TGGTGGACTT TGAGACCGAT GTCCTCTTCC TGGTGCCCAC CGAGATTGCC 1200 CTAGCCCAGC ACAGAGCCAA TGCCAAGAGT GCCAAGACCT ACGCCTACCT GTTTTCCCAT 1260 CCCTCTCGGA TGCCCGTCTA CCCCAAATGG GTGGGGGCCG ACCATGCAGA TGACATTCAG 1320 TACGTTTTCG GGAAGCCCTT CGCCACCCCC ACGGGCTACC GGCCCCAAGA CAGGACAGTC 1380 TCTAAGGCCA TGATCGCCTA CTGGACCAAC TTTGCCAAAA CAGGGGACCC CAACATGGGC 1440 GACTCGGCTG TGCCCACACA CTGGGAACCC TACACTACGG AAAACAGCGG CTACCTGGAG 1500 ATCACCAAGA AGATGGGCAG CAGCTCCATG AAGCGGAGCC TGAGAACCAA CTTCCTGCGC 1560 TACTGGACCC TCACCTATCT GGCGCTGCCC ACAGTGACCG ACCAGGAGGC CACC 1614

【００４２】配列番号：４ 配列の長さ：２１６６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の数：１本鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GCG AAG CTG GGC GCC GTG TAC ACA GAA GGT GGG TTC GTG GAA GGC GTC Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val 5 10 15 AAT AAG AAG CTC GGC CTC CTG GGT GAC TCT GTG GAC ATC TTC AAG GGC Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly 20 25 30 ATC CCC TTC GCA GCT CCC ACC AAG GCC CTG GAA AAT CCT CAG CCA CAT Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His 35 40 45 CCT GGC TGG CAA GGG ACC CTG AAG GCC AAG AAC TTC AAG AAG AGA TGC Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys 50 55 60 CTG CAG GCC ACC ATC ACC CAG GAC AGC ACC TAC GGG GAT GAA GAC TGC Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys 65 70 75 80 CTG TAC CTC AAC ATT TGG GTG CCC CAG GGC AGG AAG CAA GTC TCC CGG Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg 85 90 95 GAC CTG CCC GTT ATG ATC TGG ATC TAT GGA GGC GCC TTC CTC ATG GGG Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly 100 105 110 TCC GGC CAT GGG GCC AAC TTC CTC AAC AAC TAC CTG TAT GAC GGC GAG Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu 115 120 125 GAG ATC GCC ACA CGC GGA AAC GTC ATC GTG GTC ACC TTC AAC TAC CGT Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg 130 135 140 GTC GGC CCC CTT GGG TTC CTC AGC ACT GGG GAC GCC AAT CTG CCA GGT Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly 145 150 155 160 AAC TAT GGT CTT CGG GAT CAG CAC ATG GCC ATT GCT TGG GTG AAG AGG Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg 165 170 175 AAT ATC GCG GCC TTC GGG GGG GAC CCC AAC AAC ATC ACG CTC TTC GGG Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly 180 185 190 GAG TCT GCT GGA GGT GCC AGC GTC TCT CTG CAG ACC CTC TCC CCC TAC Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr 195 200 205 AAC AAG GGC CTC ATC CGG CGA GCC ATC AGC CAG AGC GGC GTG GCC CTG Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu 210 215 220 AGT CCC TGG GTC ATC CAG AAA AAC CCA CTC TTC TGG GCC AAA AAG GTG Ser Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val 225 230 235 240 GCT GAG AAG GTG GGT TGC CCT GTG GGT GAT GCC GCC AGG ATG GCC CAG Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln 245 250 255 TGT CTG AAG GTT ACT GAT CCC CGA GCC CTG ACG CTG GCC TAT AAG GTG Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val 260 265 270 CCG CTG GCA GGC CTG GAG TAC CCC ATG CTG CAC TAT GTG GGC TTC GTC Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val 275 280 285 CCT GTC ATT GAT GGA GAC TTC ATC CCC GCT GAC CCG ATC AAC CTG TAC Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr 290 295 300 GCC AAC GCC GCC GAC ATC GAC TAT ATA GCA GGC ACC AAC AAC ATG GAC Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp 305 310 315 320 GGC CAC ATC TTC GCC AGC ATC GAC ATG CCT GCC ATC AAC AAG GGC AAC Gly His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn 325 330 335 AAG AAA GTC ACG GAG GAG GAC TTC TAC AAG CTG GTC AGT GAG TTC ACA Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr 340 345 350 ATC ACC AAG GGG CTC AGA GGC GCA AAG ACG ACC TTT GAT GTC TAC ACC Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr 355 360 365 GAG TCC TGG GCC CAG GAC CCA TCC CAG GAG AAT AAG AAG AAG ACT GTG Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val 370 375 380 GTG GAC TTT GAG ACC GAT GTC CTC TTC CTG GTG CCC ACC GAG ATT GCC Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala 385 390 395 400 CTA GCC CAG CAC AGA GCC AAT GCC AAG AGT GCC AAG ACC TAC GCC TAC Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr 405 410 415 CTG TTT TCC CAT CCC TCT CGG ATG CCC GTC TAC CCC AAA TGG GTG GGG Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly 420 425 430 GCC GAC CAT GCA GAT GAC ATT CAG TAC GTT TTC GGG AAG CCC TTC GCC Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala 435 440 445 ACC CCC ACG GGC TAC CGG CCC CAA GAC AGG ACA GTC TCT AAG GCC ATG Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met 450 455 460 ATC GCC TAC TGG ACC AAC TTT GCC AAA ACA GGG GAC CCC AAC ATG GGC Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly 465 470 475 480 GAC TCG GCT GTG CCC ACA CAC TGG GAA CCC TAC ACT ACG GAA AAC AGC Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser 485 490 495 GGC TAC CTG GAG ATC ACC AAG AAG ATG GGC AGC AGC TCC ATG AAG CGG Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg 500 505 510 AGC CTG AGA ACC AAC TTC CTG CGC TAC TGG ACC CTC ACC TAT CTG GCG Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala 515 520 525 CTG CCC ACA GTG ACC GAC CAG GAG GCC ACC CCT GTG CCC CCC ACA GGG Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly 530 535 540 GAC TCC GAG GCA ACT CCC GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCC GAG ACC GCC Asp Ser Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala 545 550 555 560 CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr 565 570 575 GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala 580 585 590 CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro 595 600 605 ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly 610 615 620 GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGC GCC CCC CCC GTG CCG Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro 625 630 635 640 CCC ACG GGT GAC GCC GGG CCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC Pro Thr Gly Asp Ala Gly Pro Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser 645 650 655 GGC GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val 660 665 670 ACC CCC ACG GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC Thr Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp 675 680 685 TCC GGG GCC CCC CCT GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCT GAG GCT GCC CCT Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Ala Pro 690 695 700 GTG CCC CCC ACA GAT GAC TCC AAG GAA GCT CAG ATG CCT GCA GTC ATT Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Lys Glu Ala Gln Met Pro Ala Val Ile 705 710 715 720 AGG TTT Arg Phe

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明組換え発現ベクターの１例を示す図であ
る。

【図２】ファーメンター培養の条件によるＢＡＬの発現
量の変化を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 胆汁酸塩活性化リパーゼをコードする遺
   伝子、又はその遺伝子配列のカルボキシ末端領域に存在
   する１１個のアミノ酸残基からなるペプチドを単位とし
   た１６回の繰り返し構造のアミノ酸配列をコードする遺
   伝子の一部もしくは全部を欠失させた欠損遺伝子断片と
   分泌シグナルをコードする遺伝子とを連結した遺伝子
   を、プラスミドｐＨＩＬ３０１のＥｃｏＲＩ部位に組み
   込んでなる組換えプラスミドにより形質転換したピキア
   ・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ
   １１５株の形質転換体を用い、当該形質転換体をその増
   殖を制限しない量の炭素源を含み、溶存酸素が空気で飽
   和させた時の３０〜５０％、温度３０〜３７℃、pH２．
   ５〜６の条件下で増殖させた後、メタノール及び蛋白質
   を含有する培地で、温度１５〜３０℃、溶存酸素が空気
   で飽和させた時の２０％以下の条件下で培養して培地中
   に胆汁酸塩活性化リパーゼを誘導発現させることを特徴
   とする組換え胆汁酸塩活性化リパーゼの高収率発現方
   法。
2. 【請求項２】 メタノールの連続添加により培地にメタ
   ノールを含有させるものである請求項１記載の高収率発
   現方法。
3. 【請求項３】 欠損遺伝子断片が、胆汁酸塩活性化リパ
   ーゼをコードする遺伝子からそのカルボキシ末端領域に
   存在する１１個のアミノ酸残基からなるペプチドを単位
   とした１６回の繰り返し構造のアミノ酸配列をコードす
   る遺伝子の１１回の繰り返し構造を欠失させたものであ
   る請求項１又は２記載の高収率発現方法。
4. 【請求項４】 分泌シグナルをコードする遺伝子が、パ
   ン酵母インベルターゼの分泌シグナルをコードする遺伝
   子である請求項１〜３のいずれかに記載の高収率発現方
   法。