ES2584237T3

ES2584237T3 - Anticuerpos monoclonales anti-IL-21 humana

Info

Publication number: ES2584237T3
Application number: ES08878088.7T
Authority: ES
Inventors: Stephen R. Jaspers; Mark W. Rixon; Stacey R. Dillon; Frederick J. Ramsdell; Cecile M. Krejsa; Eugene C. Yi
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2007-12-07
Filing date: 2008-12-08
Publication date: 2016-09-26
Anticipated expiration: 2028-12-08
Also published as: EP2426146B1; IL205976A0; ES2572231T3; BRPI0821168B1; KR20100097724A; CN103772502A; BRPI0821168B8; CA2910933C; IL239947A0; AU2008364115B2; JP5745274B2; BRPI0821168A2; WO2010055366A3; CN102027011A; RU2010123049A; PL2217268T3; HUE027828T2; JP2011506422A; EP2217268B1; IL205976A

Abstract

Anticuerpo monoclonal anti-IL-21 humana o fragmento del mismo, en el que dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo comprende: (a) una región de cadena pesada que comprende: (i) una CDR1 de la región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 31; (ii) una CDR2 de la región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 33; y (iii) una CDR3 de la región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 35; y (b) una región de cadena ligera que comprende: (i) una CDR1 de la región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 39; (ii) una CDR2 de la región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 41; y (iii) una CDR3 de la región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 43.

Description

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actividad, la activación o la función de otra molécula. Los antagonistas de IL-21 causan por lo menos una de las siguientes acciones: función inmune reducida de las células NK, células dendríticas, subgrupos de células T y subconjuntos de células B; unión a IL-21 de manera que la interacción de la proteína IL-21 con su receptor se bloquea, inhibe, reduce o neutraliza.

[0035] "Anticuerpos" (Abs) e "inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos presentan especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que carecen de especificidad antigénica. Los polipéptidos de la última clase son, por ejemplo, producudos a niveles bajos por el sistema linfático y a niveles altos por los mielomas. Por lo tanto, tal como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" o "péptido o péptidos de anticuerpo" se refiere a un anticuerpo intacto, o un fragmento de unión del mismo, que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica e incluye anticuerpos quiméricos, humanizados, totalmente humanos, y biespecíficos. En ciertas realizaciones, los fragmentos de unión se producen mediante técnicas de ADN recombinante. En realizaciones adicionales, los fragmentos de unión se producen por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, y anticuerpos de cadena única, ScFv. Los "anticuerpos e inmunoglobulinas nativas" son usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracadena regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácido particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y pesada (Chothia et al, J. Mol Biol 186: 651 (1985); Novotny y Haber, Proc Natl Acad Sci. USA. 82: 4592 (1985)).

[0036] El término "anticuerpo quimérico" o "anticuerpos quiméricos" se refiere a anticuerpos cuyos genes de cadena ligera y pesada se han construido, típicamente por ingeniería genética, a partir de genes de la región variable y constante de inmunoglobulina que pertenecen a diferentes especies. Por ejemplo, los segmentos variables de los genes de un anticuerpo monoclonal de ratón pueden unirse a segmentos constantes humanos, tales como gamma 1 y gamma 3. Un anticuerpo típico quimérico terapéutico es por tanto una proteína híbrida compuesta del dominio variable o de unión a antígeno de un anticuerpo de ratón y el dominio constante de un anticuerpo humano, aunque pueden utilizarse otras especies de mamíferos. Específicamente, un anticuerpo quimérico se produce por tecnología de ADN recombinante en el que todo o parte de las regiones bisagra y constante de una cadena ligera, cadena pesada, o ambas, de inmunoglobulina se han sustituido por las regiones correspondientes de la cadena ligera o cadena pesada de inmunoglobulina de otro animal. De esta manera, la porción de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal padre se injerta en el esqueleto del anticuerpo de otra especie.

[0037] El término "epítopo" se refiere a cualquier determinante de proteína que puede unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de células T específica. Los determinantes epitópicos consisten habitualmente en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas, tales como cadenas laterales de aminoácidos o azúcares y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Más específicamente, el término "epítopo de IL-21", como se usa en el presente documento, se refiere a una porción del polipéptido IL-21 que tiene actividad antigénica o inmunogénica en un animal, preferiblemente en un mamífero, y más preferiblemente en un ratón o un ser humano. Un epítopo que tiene actividad inmunogénica es una porción de un polipéptido IL-21 que provoca una respuesta de anticuerpos en un animal. Un epítopo que tiene actividad antigénica es una porción de un polipéptido IL-21 a la que un anticuerpo se une inmunoespecíficamente como se determina por cualquier método bien conocido en la técnica, por ejemplo, mediante inmunoensayos. Los epítopos antigénicos no necesitan ser necesariamente inmunogénicos. Los "epítopos discontinuos" son epítopos conformacionales formados a partir de al menos dos regiones separadas de la secuencia primaria de la proteína IL-21. Los epítopos conformacionales pierden la capacidad de unirse específicamente en presencia de disolventes desnaturalizantes (por ejemplo, en los análisis de transferencia Western).

[0038] La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpos, tal como se describen en las reivindicaciones, que se unen específicamente a proteínas y polipéptidos IL-21, como se define en las reivindicaciones. Los polipéptidos, proteínas y polinucleótidos que codifican los polipéptidos de IL-21 humanos y de ratón se describen en Parrish-Novak y otros, Nature 408: 57-63, 2003; las patentes de Estados Unidos nº

6.307.024 y 6.686.178; y 7.250.274. Se describen en este documento las características estructurales y funcionales que definen regiones (epítopos) de la proteína IL-21 humana que han sido identificadas como dianas para un anticuerpo monoclonal terapéutico. Se presentan anticuerpos monoclonales anti-IL-21 humanas de humanos de ejemplo. Algunos de estos anticuerpos tienen la capacidad de unirse a IL-21 humana nativa, IL-21, IL-21 humana de tipo salvaje recombinante, una proteína de IL-21 mutante recombinante y/o regiones peptídicas de IL-21 humana.

[0039] La presente invención proporciona anticuerpos anti-IL-21 tal como se definen en las reivindicaciones, que son útiles en el tratamiento terapéutico de enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Por ejemplo, los anticuerpos anti

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IL-21 son útiles en el tratamiento de la psoriasis, pancreatitis, diabetes tipo I (IDDM), enfermedad de Graves, enfermedad inflamatoria del intestino (EII), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome del intestino irritable, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, artritis reactiva, artritis enteropática, espondiloartropatía, miocarditis autoinmune, enfermedad de Kawasaki, enfermedad celíaca, uveítis, enfermedad de Behcet, enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad pulmonar intersticial, enfermedad de músculo inflamatorio (polimiositis, dermatomiositis), poliangeítis microscópica, anemia aplásica autoinmune, tiroiditis autoinmune, hepatitis autoinmune, síndrome de Wegener, diverticulosis, lupus eritematoso sistémico, espondilitis anquilosante, esclerodermia, esclerosis sistémica, artritis psoriática, osteoartritis, dermatitis atópica, vitíligo, enfermedad injerto contra huésped (EICH), linfoma cutáneo de células T (LCCT), síndrome de Sjogren, glomerulonefritis, nefropatía IgA, nefritis autoinmune, pénfigo vulgar, miastenia gravis, pérdida de audición autoinmune, neuromielitis óptica, síndrome de Goodpasture, crioglobulinemia, síndrome de Guillain Barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), anemia hemolítica autoinmune, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), rechazo de trasplante, pacientes de trasplante altamente sensibilizados, síndrome anti-fosfolípido, alergia y asma, y otras enfermedades autoinmunes, u otras enfermedades mediadas por IL-21 y agonistas de receptores de IL -21.

[0040] Se han identificado cinco clases de inmunoglobulinas, IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, en los vertebrados superiores. Las proteínas IgG, IgD, e IgE son característicamente heterotetrámeros unidos por enlaces disulfuro que consisten en dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. Típicamente, IgM se encuentra como un pentámero de un tetrámero, mientras que IgA se produce como un dímero de un tetrámero. Se pueden introducir modificaciones en el resto de inmunoglobulina.

[0041] IgG comprende la clase principal, ya que normalmente existe como la segunda proteína más abundante en el plasma. En los seres humanos, la IgG consta de cuatro subclases, denominadas IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Cada cadena pesada de inmunoglobulina posee una región constante que consiste en dominios de proteína de la región constante (CH1, bisagra, CH2, y CH3) que son invariantes para una subclase determinada. Las regiones constantes de cadena pesada de la clase IgG se identifican con el símbolo griego . Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la subclase IgG1 contienen una región constante de cadena pesada  1.

[0042] El fragmento Fc o el dominio Fc, consiste en las regiones de bisagra dominios CH2, CH3 de cadena pesada unidas por disulfuro. En las proteínas de fusión de inmunoglobulina, los dominios Fc de la subclase IgG1 se utilizan a menudo como el resto de inmunoglobulina, ya que IgG1 tiene la vida media más larga en suero de cualquiera de las proteínas de suero. La larga vida media en suero puede ser una característica deseable de la proteína para los estudios en animales y el potencial uso terapéutico humano. Además, la subclase IgG1 posee la capacidad más fuerte para llevar a cabo funciones efectoras mediadas por anticuerpos. La función efectora primaria que puede ser más útil en una proteína de fusión de inmunoglobulina es la capacidad de un anticuerpo IgG1 para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. Por otra parte, esto podría ser una función indeseable para una proteína de fusión que funciona principalmente como un antagonista. Se han identificado varios de los residuos de aminoácido específicos que son importantes para la actividad mediada por región constante de anticuerpo en la subclase IgG1. La inclusión o exclusión de estos aminoácidos específicos, por lo tanto permite la inclusión o exclusión de la actividad mediada por región constante de inmunoglobulina específica (véase, patentes de Estados Unidos 5.648.260; 5.624.821).

[0043] Las Fc de IgG1 humana modificada se han generado para la creación de proteínas de fusión con Fc. Por ejemplo, las mutaciones Fc4, Fc5, y Fc6 para reducir las funciones efectoras mediadas por Fc mediante la reducción de la unión a FcRI y la unión a complemento C1q se describen en la solicitud de patente US 2006-0034852. Específicamente, se introdujeron tres sustituciones de aminoácidos para reducir la unión a FcRI. Estas son las sustituciones en las posiciones de índice EU 234, 235, y 237. Las sustituciones en estas posiciones se han demostrado que reducen la unión a FcRI (Duncan et al, Nature 332:. 563 (1988)). Estas sustituciones de aminoácidos también pueden reducir la unión a FcRIIa, así como la unión a FcyRIII (Sondermann y otros, Nature

406: 267 (2000); Wines et al, J. Immunol 164: 5313 (2000)). Estas mutaciones no alteran la unión a FcRn, que promueve la larga vida media en suero mediante el rescate de IgG a través de una vía de reciclaje endocítico.

[0044] Varios grupos han descrito la importancia de las posiciones del índice de UE 330 y 331 en la unión a complemento C1q y la posterior fijación del complemento (Canfield y Morrison, J. Exp Med 173: 1483 (1991); Tao et al, J. Exp. Med. 178: 661 (1993)). Las sustituciones de aminoácidos en estas posiciones se introdujeron en Fc4 para reducir la fijación del complemento. El dominio CH3 de Fc4 es idéntico al encontrado en el polipéptido de tipo salvaje correspondiente, excepto por el codón de parada, que se cambió de TGA a TAA para eliminar un sitio potencial de metilación madre cuando el ADN clonado crece en madre más cepas de E. coli. En Fc5, el residuo de arginina en la posición del índice UE 218 es una lisina y el resto de la secuencia de Fc5 coincide con la descripción anterior para Fc4.

[0045] La presente memoria describe anticuerpos genéticamente alterados que son funcionalmente equivalentes a los anticuerpos antes descritos. Se prefieren anticuerpos modificados que proporcionen una mejor estabilidad y/o eficacia terapéutica. Como ejemplos de anticuerpos modificados, se incluyen los que tienen substituciones

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el descrito en Antibodies, A Laborator y Manual, Cold Spring Harbor Laborator y , Ed. Harlow and David Lane (1988).

[0053] El BIACORE® (GE Healthcare, Piscataway, NJ) es sólo uno de varios formatos de ensayo rutinariamente utilizados para determinar los epitopos de paneles de bins de anticuerpos monoclonales. Muchas referencias (por ejemplo, The Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, Volumen 6.6, Glenn E. Morris ed.) describen métodos alternativos que podrían ser utilizados para el binning de anticuerpos y se esperaría que proporcionaran idéntica información en cuanto a la especificidad de unión de los anticuerpos a la proteína IL-21. Al utilizar el sistema BIACORE®, se realizan experimentos de binning epitópico con antígeno nativo soluble. Se pueden realizar estudios de binning epitópico en un sistema BIACORE1000® (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Se puede usar el programa BIAlogue® v. 1.2 para programar los métodos de operación. En caso de utilizar el BIACORE® para el binning de anticuerpos monoclonales de ratón producidos frente a IL-21, se puede inmovilizar covalentemente anticuerpo Fc de IgG de cabra antirratón policlonal (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) en un chip sensor BIACORE® CM5 y utilizarlo para unir (capturar) el anticuerpo monoclonal primario de series de ensayo al chip. Los sitios de unión de Fc inocupados sobre el chip son entonces bloqueados usando un fragmento Fc de IgG policlonal (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). A continuación, se inyecta proteína IL-21 y se deja que se una específicamente al anticuerpo monoclonal primario capturado. El instrumento BIACORE® mide la masa de proteína unida al chip sensor, y se puede verificar la unión tanto del anticuerpo primario como del antígeno IL-21 para cada ciclo. Tras la unión del anticuerpo primario y del antígeno al chip, se inyecta anticuerpo secundario soluble y se deja que se una al antígeno preunido. Si el anticuerpo monoclonal secundario es capaz de unirse al antígeno IL-21 simultáneamente al anticuerpo monoclonal primario, se detecta su unión mediante el BIACORE®. Si, sin embargo, el anticuerpo monoclonal secundario no es capaz de unirse al antígeno IL-21 simultáneamente al anticuerpo monoclonal primario, no se detecta ninguna unión adicional. Cada anticuerpo monoclonal es estudiado frente a sí mismo como control negativo para establecer el nivel de la señal de fondo (ausencia de unión).

[0054] También se puede usar un formato de ELISA competitivo libre de marcaje ("LFC-ELISA") para el binning de anticuerpos. Este método está descrito por Nagata y col., J. Immuno Methods 292: 141-155, 2004. Este método para el binning epitópico utilizaba IL-21 biotinilada. Para el caso del binning de anticuerpos monoclonales de ratón producidos frente a IL-21, se revisten placas de microtitulación a razón de 100 μl/pocillo con 1 μg/ml de un anticuerpo específico Fc-Î³ de IgG de cabra antirratón (Jackson ImmunoResearch) diluido en ELISA B (PBS, Tween 20 al 0,1 %, BSA al 1 %) . Después de la unión de este anticuerpo de revestimiento durante 3 horas a temperatura ambiente, se diluye cada medio acondicionado que contiene mAb en ELISA B para obtener una concentración aproximada de mAb de 0,5 μg/ml, y se deja unir a las placas revestidas con IgG de cabra antirratón durante la noche a 4º C (mAb#1) . Paralelamente, se diluyen un segundo conjunto de medios acondicionados (mAb#2) en tubos de ensayo de poliestireno hasta aproximadamente 0,5 μg/ml de mAb en ELISA B, se mezclan con 50 ng/ml de antígeno IL-21 biotinilado y se incuban durante la noche a 4ºC. Tras la incubación de mAb#1 con el anticuerpo de revestimiento, se bloquean las placas con un anticuerpo no relacionado para saturar los sitios de unión no ocupados en la placa. Se añaden las mezclas mAb#2-biotina-IL-21 a la placa y se deja que se unan. Como control para (no competición) en el ensayo, se añaden directamente 50 ng/ml de IL-21 biotinilada (sin preincubación con mAb#2) a los pocillos que contienen mAb#1 inmovilizado. Después de incubar con el complejo IL-21 biotinilada-mAb#2, se añade estreptavidina-HRP (Pierce, Rockford, IL) a la placa a 0,5 μg/ml. Se revelan las placas con substrato TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) y se mide la absorbancia de los pocillos individuales a 450 nm con un lector de placas (Molecular Devices SpectraMax®340, Sunnyvale, CA). Si mAb#1 se une a un epitopo diferente de mAb#2, el complejo biotina-IL-21-mAb#2 se unirá a la placa, para dar como resultado una elevada lectura de absorbancia. Si mAb#1 se une al mismo epitopo que mAb#2, el complejo biotina-IL-21-MAb#2 no se unirá a la placa, lo que dará como resultado una baja lectura de absorbancia.

[0055] Los anticuerpos específicos de ligando de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, se pueden unir simplemente a o actuar como antagonistas de IL-21. La presente memoria incluye anticuerpos que no alteran las interacciones receptor/ligando de IL-21 o alteran las interacciones receptor/ligando de IL-21 parcial o totalmente. La invención incluye anticuerpos específicos de ligando que previenen la activación de los receptores. La invención incluye anticuerpos neutralizantes que se unen al ligando y previenen la unión del ligando al receptor, así como anticuerpos que se unen al ligando, evitando así la activación del receptor, pero que no evitan que el ligando se una al receptor. La activación del receptor (es decir, la señalización) puede ser determinada por técnicas descritas en el presente documento o por lo demás conocidas en este campo. Por ejemplo, la activación del receptor puede ser determinada detectando la fosforilación (por ejemplo, tirosina o serina/treonina) del receptor o de su substrato por inmunoprecipitación seguida de transferencia Western o análisis basado en luminex (por ejemplo, como se ha descrito anteriormente). En realizaciones específicas, se proporcionan anticuerpos que inhiben la actividad del ligando o del receptor en al menos un 90 %, al menos un 80 %, al menos un 70 %, al menos un 60 % o al menos un 50 % de la actividad en ausencia del anticuerpo.

Producción de anticuerpos anti-IL-21

[0056] Los anticuerpos para IL-21 se pueden generar, por ejemplo, utilizando proteína que es el producto de un vector de expresión de IL-21 o IL-21 aislado de una fuente natural como un antígeno. Los anticuerpos anti-IL-21 de la presente invención "se unen específicamente" a la IL-21. Los anticuerpos se considera que se unen específicamente si los anticuerpos exhiben al menos una de las dos propiedades siguientes: (1) anticuerpos se unen

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a IL-21 con un nivel umbral de actividad de unión, y (2) los anticuerpos reaccionan de forma cruzada de forma significativa con los polipéptidos relacionados con IL-21. Los polipéptidos relacionados podrían incluir los de otros miembros de las citoquinas de tipo 1 que se unen a receptores que contienen la cadena gamma común (c), tales como IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15.

[0057] Con respecto a la primera característica, los anticuerpos se unen específicamente si se unen a un polipéptido, péptido o epítopo de IL-21, con una afinidad de unión como se refleja en las constantes de afinidad medidas. Para determinar las características de afinidad, se evaluaron las mediciones de las constantes de velocidad cinética, las constantes de equilibrio de asociación, y constantes de equilibrio de disociación para la interacción de antagonistas de IL-21 con el antígeno de IL-21 a través de resonancia de plasmón superficial. La constante de velocidad de asociación (ka (M-1s-1)) es un valor que refleja la velocidad de la formación del complejo antígeno-antagonista. La constante de velocidad de disociación (kd (s-1)) es un valor que refleja la estabilidad de este complejo. La afinidad de unión en equilibrio se expresa típicamente como una constante de equilibrio de disociación (KD(M)) o una constante asociación de equilibrio (KA (M-1)). KD se obtiene dividiendo la constante de velocidad de disociación por la constante de velocidad de asociación (kd/ka), mientras que KA se obtiene dividiendo la constante de velocidad asociación por la constante de velocidad de disociación (ka/kd). Los antagonistas con KD similar (o una KA similar) pueden tener constantes de velocidad de asociación y disociación muy variables. En consecuencia, la medición de la ka y kd, así como de KA o KD ayuda a describir más de forma exclusiva la afinidad de la interacción antagonista-antígeno. La afinidad preferida de un anticuerpo se refleja en una KA (constante de equilibrio de asociación) de 106 M-1 o mayor, preferiblemente 107 M-1 o mayor, más preferiblemente 108 M-1 o mayor, y lo más preferiblemente 109 M-1 o mayor. La afinidad de unión de un anticuerpo puede ser determinada fácilmente por un experto ordinario en la técnica, por ejemplo, por análisis Scatchard (Scatchard, Ann NY Acad Sci 51: 660, 1949), o utilizando un instrumento biosensor disponible comercialmente. Con respecto a la segunda característica, los anticuerpos que no reaccionan de forma cruzada significativamente con moléculas de polipéptidos relacionados, por ejemplo, si detectan IL-21, pero no otros polipéptidos conocidos usando un análisis de transferencia Western estándar o ELISA de captura. Los ejemplos de polipéptidos relacionados conocidos incluyen miembros de la familia IL-2 a la que pertenece IL-21 (por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15).

[0058] Se pueden producir anticuerpos anti-IL-21 usando péptidos y polipéptidos portadores portadores de epitopos de IL-21 antigénicos. Los anticuerpos de la presente invención se unen a péptidos y polipéptidos portadores de epitopos antigénicos que contienen una secuencia de al menos nueve, o de entre 15 y aproximadamente 30, aminoácidos contenidos en el SEQ ID NO: 2 u otra secuencia de aminoácidos divulgada en el presente documento. Sin embargo, los péptidos o polipéptidos que comprendan una porción mayor de una secuencia de aminoácidos de que contenga de 30 a 50 aminoácidos, o cualquier longitud hasta, e inclusive, la totalidad de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, son también útiles para inducir anticuerpos que se unan a IL-21. Es deseable seleccionar la secuencia de aminoácidos del péptido portador de epitopo de manera que proporcione una solubilidad substancial en disolventes acuosos (es decir, que la secuencia incluye residuos relativamente hidrofílicos, mientras que normalmente se evitan los residuos hidrofóbicos). Además, también pueden ser deseables secuencias de aminoácidos que contengan residuos de prolina para la producción de anticuerpos.

[0059] Se pueden generar anticuerpos anti-IL-21 monoclonales por métodos conocidos para los expertos en la técnica. Se pueden obtener anticuerpos monoclonales de roedores para antígenos específicos por métodos conocidos (véanse, por ejemplo, Kohler y col., Nature 256: 495 (1975) , Coligan y col. (eds.) , Current Protocols in Immunology, Vol. 1, páginas 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) ["Coligan"], Picksley y col., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª Edición, Glover y col. (eds.) , página 93 (Oxford University Press 1995)) .

[0060] Los anticuerpos de la invención pueden ser producidos por cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, en particular, por síntesis química, o preferentemente, por técnicas de expresión recombinante. La expresión recombinante de un anticuerpo de la invención, o de un fragmento, derivado o análogo del mismo, por ejemplo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo de la invención, requiere la construcción de un vector de expresión que contenga un polinucleótido que codifique el anticuerpo. Una vez obtenido un polinucleótido codificante de una molécula de anticuerpo o de una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o de una porción del mismo (preferentemente que contenga el dominio variable de cadena pesada o ligera) de la invención, se puede producir el vector para la producción de la molécula de anticuerpo por tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en este campo. Así, se describen en el presente documento métodos para preparar una proteína expresando un polinucleótido que contiene una secuencia nucleotídica codificante de un anticuerpo. Se pueden usar métodos que son bien conocidos para los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen secuencias codificantes de anticuerpos y señales de control de la transcripción y de la traducción apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. La invención, por lo tanto, proporciona vectores replicables que comprenden una secuencia nucleotídica codificante de una molécula de anticuerpo de la invención, o de una cadena pesada o ligera del mismo, o de un dominio variable de cadena pesada o ligera, operativamente unida a un promotor. Dichos vectores pueden incluir la secuencia nucleotídica codificante de la región constante de la molécula de anticuerpo (véanse, por ejemplo, la Publicación PCT WO 86/05807, la Publicación PCT WO 89/01036 y la Patente EE.UU. Nº 5.122.464), y se puede clonar el dominio variable del anticuerpo en dicho vector para expresión de la totalidad de la

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expresión mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción, finalizadores de la transcripción, etc. apropiados (véase Bittner y col., Methods in Enzymol. 153: 51-544, 1987).

[0066] Además, se puede seleccionar una cepa de células huésped que module la expresión de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto génico en la forma específica deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células huésped tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento y la modificación posteriores a la traducción de proteínas y productos génicos. Se pueden seleccionar líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña expresada. Con este fin, se pueden usar células huésped eucarióticas que posean la maquinaria celular para el apropiado procesamiento del transcripto primario, la glicosilación y la fosforilación del producto génico. Dichas células huésped de mamíferos incluyen, aunque sin limitación, CHO, VERO, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 y, en particular, líneas celulares de cáncer de mama, tales como, por ejemplo, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, y líneas celulares de glándula mamaria normal, tales como, por ejemplo, CRL7030 y Hs578Bst.

[0067] Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden someter a ingeniería líneas celulares que expresen de manera estable la molécula de anticuerpo. Más que utilizar vectores de expresión que contengan orígenes de replicación víricos, las células huésped pueden ser transformadas con ADN controlado por elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, finalizadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN extraño, se puede dejar que las células sometidas a ingeniería crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido y se las cambia a continuación a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar de manera estable el plásmido en sus cromosomas y crecer para formar focos, los cuales, a su vez, pueden ser clonados y expandidos en líneas celulares. Este método puede ser ventajosamente utilizado para someter a ingeniería líneas celulares que expresan la molécula de anticuerpo. Dichas líneas celulares sometidas a ingeniería pueden ser particularmente útiles en el cribado y la evaluación de compuestos que ínteraccionan directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo.

[0068] Se pueden usar una serie de sistemas de selección, incluyendo, aunque sin limitación, los genes de la timidina kinasa del virus Herpes simplex (Wigler y col., Cell 11: 223, 1977), de la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 202, 1992) y de la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy y col., Cell 22: 817, 1980), que pueden ser empleados en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Además, se puede usar la resistencia antimetabolitos como base de selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 357, 1980; O’Hare y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527, 1981); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072, 1981); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Wu y Wu, Biotherapy 3: 87-95, 1991; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596, 1993; Mulligan, Science 260: 926-932, 1993; y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217, 1993; TIB TECH 11 (5): 155-215), mayo de 1993; e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre y col., Gene 30: 147, 1984) . Se describen métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología del ADN recombinante que pueden ser utilizados en Ausubel y col. (eds.) , 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; en Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laborator y Manual, Stockton Press, NY; y en los Capítulos 12 y 13, Dracopoli y col. (eds) , 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapin y col., J. Mol. Biol.

150: 1, 1981.

[0069] Se pueden aumentar los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo por amplificación de vectores (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)) . Cuando un marcador en el sistema vector que expresa anticuerpo es amplificable, el aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula huésped aumentará el número de copias del gen marcador. Como la región amplificada está asociada con el gen de anticuerpo, también aumentará la producción del anticuerpo (Crouse y col., Mol. Cell. Biol. 3: 257, 1983).

[0070] La célula huésped puede ser cotransfectada con dos vectores de expresión, codificando el primer vector un polipéptido derivado de cadena pesada y codificando el segundo vector un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permitan igual expresión de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente, se puede usar un solo vector que codifique ambos polipéptidos de cadena pesada y ligera. En tales situaciones, la cadena ligera debería situarse antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, Nature 322: 52, 1986; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2197, 1980). Las secuencias codificantes para las cadenas pesadas y ligeras pueden comprender ADNc o ADN genómico.

[0071] Una vez se ha expresado recombinantemente una molécula de anticuerpo de la invención, tal como se define en las reivindicaciones, ésta puede ser purificada por cualquier método conocido en la técnica para la purificación de

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una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, cromatografía columna de intercambio iónico, de afinidad, particularmente por afinidad para el antígeno específico tras Proteína A, y de exclusión por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas.

[0072] Para usos particulares, puede ser deseable preparar fragmentos de anticuerpos anti-IL-21. Dichos fragmentos de anticuerpo pueden ser obtenidos, por ejemplo, por hidrólisis proteolítica del anticuerpo. Se pueden obtener fragmentos de anticuerpo por digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos por métodos convencionales. Como ilustración, se pueden producir fragmentos de anticuerpo por escisión enzimática de anticuerpos con pepsina, para obtener un fragmento 5S denominado F (abâ?) 2. Se puede volver a escindir este fragmento usando un agente reductor tiol, para producir fragmentos monovalentes Fab' 3, 5S. Eventualmente, la reacción de escisión puede ser llevada a cabo usando un grupo bloqueante para los grupos sulfhidrilo que resultan de la escisión de uniones disulfuro. Como alternativa, una escisión enzimática usando pepsina produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos métodos están descritos, por ejemplo, por Goldenberg, Patente EE.UU. Nº 4.331.647; Nisonoff y col., Arch Biochem. Biophys. 89: 230, 1960; Porter, Biochem.

J. 73: 119, 1959; Edelman y col., Methods in Enzymology Vol. 1, página 422 (Academic Press 1967), y Coligan, en las páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10. 2.10.4.

[0073] Se pueden usar también otros métodos de escisión de anticuerpos, tales como la separación de las cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera-pesada monovalentes, una mayor escisión de fragmentos u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, siempre que los fragmentos se unan al antígeno reconocido por el anticuerpo intacto.

[0074] Por ejemplo, los fragmentos Fv comprenden una asociación de cadenas VH y VL. Esta asociación puede ser no covalente, como describen Inbar y col., Proc. Natâ?l Acad. Sci. USA 69: 2659, 1972. Alternativamente, se pueden unir las cadenas variables por un enlace disulfuro intermolecular o entrecruzar mediante agentes químicos, tales como el glutaraldehído (véase, por ejemplo, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437, 1992).

[0075] Los fragmentos Fv pueden comprender cadenas VH y VL que se conectan por un conector peptídico. Estas proteínas de unión a antígeno de una sola cadena (scFv) son preparadas construyendo un gen estructural que comprende secuencias de ADN codificantes de los dominios VH y VL que se conectan mediante un oligonucleótido. El gen estructural es insertado en un vector de expresión, que se introduce posteriormente en una célula huésped, tal como E. coli. Las células huésped recombinantes sintetizan una sola cadena polipeptídica con un péptido conector que hace puente entre los dos dominios V. Se describen métodos para producir scFv, por ejemplo, en Whitlow y col., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 97 (1991) (véanse también Bird y col., Science

242: 423, 1988; Ladner y col., Patente EE.UU. Nº 4.946.778; Pack y col., Bio/Technology 11: 1271, 1993, y Sandhu, antes citado).

[0076] Es también posible construir marcos alternativos utilizando una colección de proteínas monoméricas para formar un dominio monomérico. Estos dominios monoméricos pueden ser lo suficientemente pequeños como para penetrar en los tejidos. Los dominios monoméricos pueden ser variantes naturales o no naturales o una combinación de las mismas. Los dominios monoméricos pueden formar multímeros de dos dominios más. El dominio monomérico se une a una posición, de manera análoga a los epitopos descritos en el presente documento, sobre una molécula diana. En algunos casos, el multímero puede formarse a partir de varios dominios monoméricos. (Véanse, por ejemplo, la Solicitud de Patente EE.UU. 2004-0132028 y la Solicitud de Patente EE.UU. 2006-0177831).

[0077] Los anticuerpos de la presente invención, tal como se definen en las reivindicaciones, incluyen derivados que están modificados, a saber, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo de tal forma que la unión covalente no impida que el anticuerpo se una a IL-21 o bloquee la activación del receptor. Por ejemplo, aunque no a modo de limitación, los derivados de anticuerpos incluyen anticuerpos que han sido modificados, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosfilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular o a otra proteína, etc. Se puede realizar cualquiera de numerosas modificaciones químicas por técnicas conocidas, incluyendo, aunque sin limitación, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

[0078] Se puede conjugar un anticuerpo anti-IL-21 con un marcaje detectable para formar un inmunoconjugado antiIL-21. Como marcajes detectables adecuados, se incluyen, por ejemplo, un radioisótopo, un marcaje fluorescente, un marcaje quimioluminiscente, un marcaje enzimático, un marcaje bioluminiscente u oro coloidal. Los métodos de preparación y detección de dichos inmunoconjugados detectablemente marcados son bien conocidos para quienes tienen conocimientos ordinarios en la técnica y se describen con más detalle a continuación. El marcaje detectable puede ser un radioisótopo que se detecta por autorradiografía. Son isótopos particularmente útiles para los fines de la presente invención 3H, 125I, 131I, 35S y 14C.

[0079] Los inmunoconjugados anti-IL-21 pueden ser también marcados con un compuesto fluorescente. Se determina la presencia de un anticuerpo fluorescentemente marcado exponiendo el inmunoprecipitado a luz de la

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longitud de onda apropiada y detectando la fluorescencia resultante. Como compuestos marcadores fluorescentes, se incluyen isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído, colorantes Alexa, nanopartículas fluroescnetes (por ejemplo, puntos Q) y fluorescamina.

[0080] Es también posible poder marcar los inmunoconjugados anti-IL-21 detectablemente copulando un componente de anticuerpo con un compuesto quimioluminiscente. Se determina la presencia del inmunoconjugado con marcaje quimioluminiscente detectando la presencia de luminiscencia que surge en el curso de una reacción química. Como ejemplos de compuestos marcadores quimioluminiscentes, se incluyen luminol, isoluminol, un éster de acridinio aromático, un imidazol, una sal de acridinio y un éster de oxalato.

[0081] De forma similar, se puede usar un compuesto bioluminescente para marcar los inmunoconjugados anti-IL-21. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que se encuentra en sistemas biológicos, en donde una proteína catalítica aumenta la eficacia de la reacción quimioluminiscente. Se determina la presencia de una proteína bioluminescente detectando la presencia de luminiscencia. Como compuestos bioluminescentes útiles para marcaje, se incluyen luciferina, luciferasa y aecuorina.

[0082] Alternativamente, se pueden marcar detectablemente inmunoconjugados anti-IL-21 uniendo un componente de anticuerpo anti-IL-21 a una enzima. Cuando se incuba el conjugado anti-IL-21-enzima en presencia del substrato apropiado, el resto enzimático reacciona con el substrato para producir un resto químico que puede ser detectado, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Como ejemplos de enzimas que pueden ser usadas para marcar detectablemente inmunoconjugados poliespecíficos, se incluyen Î²-galactosidasa, glucosa oxidasa, peroxidasa y fosfatasa alcalina.

[0083] Los expertos en la técnica conocerán otros marcajes adecuados que pueden emplearse en el presente documento. Se puede conseguir la unión de restos marcadores a anticuerpos anti-IL-21 usando técnicas estándar conocidas en este campo. Se describe metodología típica en este sentido en Kennedy y col., Clin. Chim. Acta 70: 1, 1976; Schurs y col., Clin. Chim. Acta 81: 1, 1977; Shih y col., Intâ?l J. Cancer 46: 1101, 1990; Stein y col., Cancer Res. 50: 1330, 1990; y Coligan, antes citado.

[0084] Además, se pueden aumentar la conveniencia y la versatilidad de la detección inmunoquímica usando anticuerpos anti-IL-21 que han sido conjugados con avidina, estreptavidina y biotina (véanse, por ejemplo, Wilchek y col. (eds.) , "Avidin-Biotin Technology", Methods In Enzymology, Vol. 184 (Academic Press 1990) , y Bayer y col., "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology", en Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), páginas 149-162 (The Humana Press, Inc. 1992).

[0085] Los métodos para realizar inmunoensayos están bien establecidos. Véanse, por ejemplo, Cook y Self, "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays", en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter y Ladyman (eds.) , páginas 180-208, (Cambridge University Press, 1995) ; Perr y , "The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology", en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch and Lennox (eds.), páginas 107-120 (Wiley-Liss, Inc. 1995), y Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996).

[0086] Se pueden generar anticuerpos o fragmentos de los mismos con mayores vidas medias in vivo por técnicas conocidas para los expertos en la materia. Por ejemplo, se pueden generar anticuerpos o fragmentos de los mismos con mayores vidas medias in vivo modificando (por ejemplo, substituyendo, suprimiendo o añadiendo) residuos de aminoácido identificados como implicados en la interacción entre el dominio Fc y el receptor FcRn (véanse, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Nº WO 97/34631 y WO 02/060919, incorporadas en el presente documento como referencia en su totalidad). Se pueden generar anticuerpos o fragmentos de los mismos con mayores vidas medias in vivo uniendo a dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos moléculas poliméricas, tales como polietilenglicol (PEG) de alto peso molecular. Se puede unir el PEG a dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos con o sin un conector multifuncional por conjugación específica de sitio del PEG al extremo N o C de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos o por medio de grupos épsilon-amino presentes en residuos de lisina. Se utilizará derivatización de polímeros lineales o ramificados que dé lugar a una mínima pérdida de actividad biológica. El grado de conjugación será estrechamente monitorizado por SDS-PAGE y espectrometría de masas para asegurar la apropiada conjugación de moléculas de PEG con los anticuerpos. Se puede separar el PEG no reaccionado de los conjugados anticuerpo-PEG por, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño o de intercambio iónico.

Composiciones farmacéuticas

[0087] La presente memoria describe composiciones farmacéuticas, que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y un polipéptido o anticuerpo descrito en el presente documento. La composición farmacéutica puede incluir agentes terapéuticos adicionales, incluyendo, aunque sin limitación, agentes citotóxicos o citotoxinas, por ejemplo, un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ion metálico radiactivo. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea nocivo para las células. Como ejemplos, se incluyen paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina,

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vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracinodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y sus análogos u homólogos. Como agentes terapéuticos, se incluyen, aunque sin limitación, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiaminoplatino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). Por ejemplo, la composición farmacéutica puede incluir una proteína o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina, tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas o toxina de la difteria; una proteína, tal como el factor de necrosis tumoral, IFN-, IFN-, el factor de crecimiento de los nervios, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el activador del plasminógeno de los tejidos, un agente trombótico o un agente antiangiogénico, por ejemplo, angiostatina o endostatina; o modificadores de la respuesta biológica, tales como, por ejemplo, linfoquinas, interleuquina-1 ("IL-1") , interleuquina-2 ("IL-2") , interleuquina-6 ("IL-6"), factor estimulante de las colonias de granulocitos y macrófagos ("GM-CSF"), factor estimulante de las colonias de granulocitos ("G-CSF"), anticuerpos diseñados para antagonizar modificadores de respuestas biológicas, otros anticuerpos, otras proteínas de fusión Fc u otros factores de crecimiento.

[0088] Con fines de terapia, se administran moléculas de anticuerpo anti-IL-21 y un vehículo farmacéuticamente aceptable a un paciente en una cantidad terapéuticamente efectiva. Se dice que se administra una combinación de una molécula terapéutica de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable en una "cantidad terapéuticamente efectiva" si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia da lugar a un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor. Por ejemplo, un agente usado para tratar la inflamación es fisiológicamente significativo si su presencia alivia la respuesta inflamatoria.

[0089] Se han diseñado microesferas de polímeros degradables para mantener elevados niveles sistémicos de proteínas terapéuticas. Se preparan las microesferas a partir de polímeros degradables, tales como poli (lactida-coglicolida) (PLG) , polianhídridos, poli (orto-ésteres) y polímeros de acetato de etilvinilo no biodegradables, en los que las proteínas están atrapadas en el polímero (Gombotz y Pettit, Bioconjugate Chem. 6: 332, 1995; Ranade, "Role of Polymers in Drug Deliver", y en Drug Deliver y Systems, Ranade and Hollinger (eds.) , páginas 51-93 (CRC Press 1995); Roskos y Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Deliver”, y en Protein Deliver: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), páginas 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus y col., Science

281: 1161, 1998; Putney y Burke, Nature Biotechnology 16: 153, 1998; Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 548, 1998). Las nanoesferas revestidas de polietilenglicol (PEG) pueden también proporcionar vehículos para administración intravenosa de proteínas terapéuticas (véase, por ejemplo, Gref y col., Pharm. Biotechnol. 10: 167, 1997).

[0090] Otras formas de dosificación pueden ser concebidas por los expertos en la técnica, como muestran, por ejemplo, Ansel y Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Deliver y Systems, 5ª Edición (Lea & Febiger 1990); Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19ª Edición (Mack Publishing Company 1995) , y Ranade y Hollinger, Drug Deliver y Systems (CRC Press 1996).

[0091] Las composiciones farmacéuticas pueden ser suministradas como un kit que comprende un envase que contiene un anticuerpo anti-IL-21 neutralizante. Se pueden presentar los polipéptidos terapéuticos en forma de una solución inyectable para dosis única o múltiple, o como un polvo estéril que será reconstituido antes de su inyección. Alternativamente, dicho kit puede incluir un dispersor de polvo seco, un generador de aerosol líquido o un nebulizador para la administración de un polipéptido terapéutico. Dicho kit puede además incluir información escrita sobre las indicaciones y el uso de la composición farmacéutica.

[0092] Una composición farmacéutica que contiene anticuerpos anti-IL-21 puede ser presentada en forma líquida, en un aerosol o en forma sólida. Las formas líquidas son ilustradas mediante soluciones inyectables, aerosoles, gotitas, soluciones topológicas y suspensiones orales. Como ejemplos de formas sólidas, se incluyen cápsulas, comprimidos y formas de liberación controlada. Esta última forma es ilustrada mediante bombas miniosmóticas e implantes (Bremer y col., Pharm. Biotechnol. 10: 239, 1997; Ranade, "Implants in Drug Deliver y ", en Drug Deliver y Systems, Ranade and Hollinger (eds.) , páginas 95-123 (CRC Press 1995) ; Bremer y col., "Protein Deliver y with Infusion Pumps", en Protein Deliver y : Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.) , páginas 239-254 (Plenum Press 1997) ; Yewey y col., "Deliver y of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant", en Protein Deliver y : Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), páginas 93-117 (Plenum Press 1997) ) . Otras formas sólidas incluyen cremas, pastas, otras aplicaciones topológicas y similares.

Usos terapéuticos para anticuerpos anti-IL-21

[0093] La IL-21 es una citoquina derivada de células T CD4+ que es importante para una inmunidad mediada por células T CD8+ óptima, la activación de células NK, y respuestas humorales óptimas, tales como la producción de

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del tiempo usando métodos bien conocidos, tales como citometría de flujo (o PCR) , para cuantificar el número de células inflamatorias o lesionales presentes en una muestra, puntuación (pérdida de peso, diarrea, sangrado rectal, longitud del colon) para la EII y puntuación de la enfermedad de la pata y puntuación de la inflamación para el modelo de AR AIC.

[0117] La administración de anticuerpos anti-IL-21 a estos ratones modelo con psoriasis se utiliza para evaluar la utilización de anticuerpso anti-IL-21 para mejorar los síntomas y alterar la evolución de la enfermedad.

Lupus eritematoso sistémico

[0118] El lupus eritematoso sistémico (LES) es un trastorno relacionado con inmunocomplejos caracterizado por producción crónica de anticuerpos IgG dirigidos a autoantígenos ubicuos (v.g., anti-ADNdc). Los efectos del LES son sistémicos, en lugar de estar localizados en un órgano específico, aunque en algunos casos puede dar lugar la glomerulonefritis (es decir, lupus nefritis). Se han asociado con la enfermedad de múltiples loci cromosómicos, y éstos pueden contribuir a diferentes aspectos de la enfermedad, tales como anticuerpos anti-ADNdc y glomerulonefritis. Se ha visto que las células T CD4+ tienen una parte activa en modelos murinos de LES (Horwitz, Lupus 10: 319-320, 2001; Yellin y Thienel, Curr. Rheumatol. Rep., 2: 24-37, 2000). El papel de las células T CD8+ no está claramente definido, pero existe evidencia que sugiere que la función de la célula T CD8+ "supresora" está alterada en pacientes con lupus (Filaci y col., J. Immunol., 166: 6452-6457, 2001; Sakane y col., J. Immunol., 137: 3809-3813, 1986).

[0119] Se ha sido observado convincentemente que IL-21 induce la diferenciación de células B humanas sin tratar en células plasmáticas secretoras de anticuerpos (Ozaki et al, J. Immunol 173: 5361, 2004; Ettinger et al, J Immunol

175: 7867-79, 2005; Ettinger et al, J Immunol 178: 2872-82, 2007; Kuchen et al J Immunol 179: 5886-96, 2007). (Ozaki et al, (J. Immunol. 173: 5361, 2004) también demostró que la expresión de IL-21 es elevada en ratones BXSB-Yaa propensos al lupus, un modelo para LES, a una edad cuando las primeras características de los procesos autoinmunes resultan evidentes. El tratamiento de estos ratones BXSB-Yaa con un antagonista de IL-21 murino inhibe parcialmente diversos parámetros de la enfermedad, incluyendo la glomerulonefritis (Bubier et al, Ann NY Acad Sci 1110: 590-601, 2007). El mismo antagonista de IL-21 también ha demostrado ser eficaz en otro modelo de la enfermedad pre-clínica de LES, el ratón MRL/lpr (Herber et al J. Immunol. 178: 3822-3830, 2007). Además, dado que IL-21 limita el desarrollo de células Treg, la administración de anticuerpos anti-IL-21 podría proporcionar una función supresora de las células T más robusta en pacientes con lupus donde esta función está comprometida (Lamprecht et al Blood 112 (8): 3339-47, 2008).

[0120] Los datos obtenidos de 24 pacientes con LES y 15 controles sanos mostraron que 1) la expresión de ARNm de IL-21 es significativamente mayor en las células T CD4 + de los pacientes de lupus en comparación con los controles, 2) los niveles de IL-21 son significativamente elevados en los sueros de pacientes con LES activo en comparación con LES inactivo o controles, tal como se determina utilizando un kit ELISA de IL-21 comercial (Invitrogen, Carlsbad, CA), 3) IL-21 aumenta la proliferación de células T CD4+ y células B CD19+ en pacientes y se controla de una manera dependiente de la dosis, 4) IL-21 aumenta la diferenciación de células plasmáticas inducidas por anti-CD40 en los controles normales y pacientes con LES, y 5) los niveles elevados de IL-21 pueden contribuir a la proliferación de células T CD4+ autorreactivas y la diferenciación de células plasmáticas en LES ((Rus, V., ACR Presentation # 1760, 2008 del reunión del colegio americano de reumatología, 24-29 de octubre de 2008).

[0121] Los anticuerpos anti-IL-21 se pueden administrar en combinación con otros agentes que ya están en uso en la autoinmunidad incluyendo moduladores inmunes, tales como IFN, NOVANTRONE®, ENBREL®, BETAFERON®, REMICADE®, LEUKINE® y PROLEUKIN®. Los anticuerpos anti-IL-21 se pueden administrar en combinación con otros agentes que ya están en uso en la terapia del cáncer de mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin o leucemia aguda de células T, tales como THALOMID® o con esteroides, tales como la dexametasona o prednisona. Establecer el nivel de dosis óptima y la programación para los anticuerpos anti-IL-21 se realiza mediante una variedad de medios, incluyendo el estudio de la farmacocinética y la farmacodinámica de anticuerpos anti-IL-21; determinación de las dosis eficaces en animales modelos, y la evaluación de la toxicidad de los anticuerpos anti-IL

21. Las mediciones farmacocinéticas directas realizadas en primates y ensayos clínicos pueden ser usados para predecir las dosis teóricas en pacientes que logran los niveles de anticuerpos anti-IL-21 en plasma que son de magnitud suficiente y duración para lograr una respuesta biológica en los pacientes.

Rechazo del trasplante

[0122] Los receptores de órganos sólidos trasplantados pueden desarrollar rechazo agudo o crónico del aloinjerto debido a la falta de coincidencia de histocompatibilidad. La generación de anticuerpos dirigidos contra las moléculas de HLA (aloanticuerpos) en estos pacientes resulta de la presentación del antígeno extraño a las células T. Los aloanticuerpos pueden mediar el daño tisular en el injerto a través de la formación de complejos inmunes, la fijación del complemento, y la citotoxicidad celular mediada por anticuerpo dirigida por aloanticuerpos unidos. La cascada del complemento también libera factores locales que activan las células endoteliales y causan vasculopatía dentro del injerto. El producto de complemento C4d es un marcador temprano en el rechazo agudo y crónico de trasplantes, y se puede detectar en los casos subclínicos antes de manifestar cambios patológicos (Racusen y Haas, Clin J Am

21

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ratón Clon #: (N) Isotipo Lote#

338.5.4: B/N E10274 +/ 0 0 0 0 +/-

IgG1

338.11.5: B E10276 +++ 0 +++ 0 0 +++

IgG1

338.14.3: B E10273 +/ 0 0 0 0 0

IgG1

338.15.5: B E10275 +++ 0 0 0 +++ 0

IgG1

338.28.6: B E10329 +++ 0 0 0 0 +

IgG1

339.39.5: B E10330 +++ 0 0 +++ 0 +++

IgG1

Reactividad:: Ninguna (0) Débil (+) Moderada (++) Fuerte (+++)

Tabla 3

Reactividad del anticuerpo monoclonal anti-IL-21 humana de ratón a la proteína IL-21 humana, proteína IL-21 humana mutrante y péptidos derivados de la secuencia de IL-21 humana

Ab ani-IL-21 humana de ratón Clon #: Unión (B) Neutralizante (N) Isotipo Ab purificado Lote# IL-21 Péptido 1 Péptido 2 Péptido 3 Péptido 4 C-term Mutante de IL-21

362.75.1.1: B/N E10364 +++ 0 0 0 +++ 0

IgG

362.78.1.44: B/N E10554 ++ 0 0 0 0 +

IgG

362.597.3: B/N E10336 +++ 0 0 0 0 ++

IgG

366.328.10: B/N E10416 +++ 0 0 0 0 +++

IgG

366.345.6.11: B E10476 +++ 0 0 0 0 ++

IgG

366.552.11: B/N E10435 +++ 0 0 0 ++ 0

IgG

Reactividad:: Ninguna (0) Débil (+) Moderada (++) Fuerte (+++)

5 2B Medición de las afinidades de unión de anticuerpo monoclonal anti-IL-21 362.78-CHO a IL-21 humana e IL-21 de mono cynomolgus por resonancia de plasmón superficial (Biacore)

[0138] El anticuerpo monoclonal anti-IL-21 362.78-CHO se evaluó por su afinidad de unión a IL-21 recombinante humana y IL-21 recombinante de cynomolgus utilizando resonancia de plasmón superficial.

10 [0139] Determinación de afinidad: se midieron las constantes de velocidad cinética y las constantes de equilibrio de disociación para la interacción del anticuerpo monoclonal anti-IL-21 humana 362.78-CHO con IL-21 humana y IL-21 de cynomolgus a través de resonancia de plasmón superficial. La constante de velocidad de asociación (ka (M-1s-1)) es un valor que refleja la velocidad de la formación del complejo antígeno-anticuerpo. La constante de velocidad de

28

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[0146] Determinación de la capacidad de anticuerpos anti-IL-21 humana a reacción cruzada y unión a proteína de IL21 murino o de mono cynomolgus o péptidos sintéticos derivados de secuencia de IL-21 humana.

5 [0147] Los estudios de reactividad cruzada de especies pueden ser importantes para demostrar la especificidad de las estrategias de desarrollo de antagonistas terapéuticos. Con el fin de determinar si los elementos de unión y neutralización de anti-IL-21 humana descritas en este documento pueden reaccionar de forma cruzada y unirse a IL21 murino o de Cynomolgus (y por lo tanto, justificar el mono cynomolgus o ratón como una especie de ensayo viables), era necesario demostrar la unión comparable de los anticuerpos frente a IL-21 recombinante humano,

10 murino y de mono cynomolgus en los diversos formatos de ensayo. Uno de los métodos para ensayos de unión de los anticuerpos monoclonales es por su rendimiento en los ensayos de inmunotransferencia (transferencia Western). La IL-21 recombinante humana (SEQ ID NO: 2), IL-21 recombinante murina (SEQ ID NO: 11), IL-21 recombinante de cynomolgus (SEQ ID NO: 9), péptidos sintéticos derivados de la secuencia de IL-21: péptido # 1 pyr30-K50 (SEQ ID 3), péptido # 2 N54-C71 (SEQ ID NO: 4), péptido # 3 N97-C122 (SEQ ID NO: 5), péptido # 4 C125-S153 (SEQ ID

15 NO: 6) conjugado a ovoalbúmina, o una citoquina control irrelevante, IFN- recombinante humana (ZymoGenetics) se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) utilizando geles de poliacrilamida 4-12% BisTris (Invitrogen, Inc.) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa utilizando métodos estándar y un tampón que contenía Tris 25 mM, glicina 186 mM y 40% de metanol.

20 [0148] Para las transferencias Western, los sitios no específicos en las membranas se bloquearon con un tampón que contiene Tris 20 mM, pH 7,4, EDTA 0,5 mM, Igepal CA-630 al 0,5%, NaCl 150 mM, gelatina al 0,25%, y solución de bloqueo hidrolizado de caseína al 1% (reactivo de bloqueo Western, Roche Diagnostics, Inc., Basilea Suiza) (tampón de bloqueo). Las membranas se incubaron a continuación durante 2 horas a temperatura ambiente con el anticuerpo monoclonal purificado (10 ng/ml o 100 ng/ml) en el tampón de bloqueo seguido por una incubación de 2 h

25 con anti-IgG humana de burro conjugada con peroxidasa (Jackson Laboratories, Bar Harbor, YO). Las membranas se lavaron 5 veces con el tampón de bloqueo Tris/EDTA/IGEPAL/NaCl/gelatina que carecía de hidrolizado de caseína y se reveló con solución de luminol/potenciador/peroxidasa SUPERSIGNAL® DuraWest (Pierce, Rockford, IL) para la detección de quimioluminiscencia. Las transferencias se visualizaron utilizando métodos estándar en base a películas de rayos X.

30 Tabla 4

Reactividad de anticuerpos monoclonales humanos anti-IL-21humana en análisis de transferencia Western

Clon*: Il-21 hu IL-21 cyno Il-21 mu Péptido IL-21 +hu A1744 Péptido IL-21 +hu A1750 Péptido IL-21 +hu A1751 Péptido IL-21 +hu A1752

362.35.1.2: 0 0 0 0 0 0 0

362.37.3: +++ +++ +++ 0 0 0 0

362.75.1.1: +++ +++ +++ 0 0 0 +++

362.78.1: ++ ++ 0 0 0 0 0

362.108.1.2: 0 0 0 0 0 0 0

362.172.2: +++ +++ +++ 0 0 0 0

362.216.2: 0 +/ 0 0 0 0 0

362.256.1: 0 0 0 0 0 0 0

362.303.1.1: 0 0 0 0 0 0 0

362.378.1: +++ +++ +++ 0 0 0 +

362.468.3: +/ + 0 0 0 0 0

362.564.1.4: ++ ++ 0 0 0 0 0

362.597.3: ++ ++ +/ 0 0 0 0

362.632.2: +++ +++ +++ 0 0 0 +++

366.328.10: + + 0 0 0 0 0

366.342.8: +++ +++ +++ 0 0 0 0

366.345.6.1: 0 0 0 0 0 0 0

366.353.11.12: + ++ 0 0 0 0 0

366.398.36: +++ +++ +++ 0 0 0 0

366.453.30: +++ +++ +++ 0 0 0 0

366.462.24.10: +++ +++ +++ 0 0 0 0

366.479.13: +++ +++ +++ 0 0 0 0

366.552.11: +++ +++ +++ 0 0 0 0

366.565.7: 0 0 0 0 0 0 0

366.617.7: +++ +++ +++ 0 0 0 0

366.618.20: ++ ++ + 0 0 0 0

367.752.5: +++ +++ +++ 0 0 0 0

368.626.24: +++ +++ ++ 0 0 0 0

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Reactividad: Ninguna (0): Ninguna (0) Débil (+) Moderada (++) Intensa (+++) * No se observaron señales con IFN- + Pépotidos conjugados a ovalbúmina

Ejemplo 4 Evaluación de la capacidad de anticuerpos anti-IL-21 humana para reaccionar de forma cruzada y unirse a citosinas de la familia c humana IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15

5 [0149] Otra característica importante de un anticuerpo específico es la capacidad del anticuerpo para unirse a y antagonizar la proteína o proteínas diana, pero no unirse a proteínas relacionadas (no diana) en un grado significativo. La capacidad de los anticuerpos anti-IL-21 humana de unirse a citoquinas relacionadas se puso a prueba en el formato de transferencia de Western. Se obtuvieron muestras de todos los miembros de la familia de citoquinas c y se ejecutaron en SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa para la transferencia.

10 Se usaron IL-2 humana (202-IL/CF), IL-4 humano (204-IL/CF), IL-7 humana (207-IL/CF), IL-9 humana (209-IL/CF), IL-15 humana (247-IL/CF), todas obtenidas de R & D Systems, Minneapolis MN), IL-21 humana (ZymoGenetics) y IFN- humana recombinantes (Patentes de Estados Unidos 6.927.040; 7.252.969) para evaluar la especificidad de los anticuerpos. Todos los anticuerpos ensayados no mostraron unión detectable por encima del fondo de las citoquinas de la familia c, excepto IL-21 humana, donde se observó una unión clara, coherente con las

15 transferencias Western anteriores utilizando estos anticuerpos (véase el Ejemplo 3).

Tabla 5:

Reactividad de anticuerpos monoclonales anti-IL-21 humana a citosinas c en análisis de transferencia Western

Clon: IL-2 hu IL-4 hu IL-7 hu IL-9 hu IL-15 hu IL-21 hu Control negativo IFN hu

362.597.3: 0 0 0 0 0 ++ 0

362.75.1.1: 0 0 0 0 0 +++ 0

362.78.1: 0 0 0 0 0 + 0

362.564.1.4: 0 0 0 0 0 ++ 0

366.328.10.63: 0 0 0 0 0 ++ 0

366.552.11.31: 0 0 0 0 0 +++ 0

366.617.7: 0 0 0 0 0 +++ 0

Reactividad:: Ninguna (0) débil (+) moderada (++) Intensa (+++)

20 Tabla 6:

Reactividad de anticuerpos monoclonales de ratón y rata anti-IL-21 humana en análisis de transferencia Western

Clon#: IL-21 hu IL-21 cyno IL-21 Mu Péptido IL21 +hu A1744 Péptido IL21 +hu A1750 Péptido IL-21 +hu A1751 Péptido IL21 +hu A1752

Clones de ratón

338.5.4: 0 0 0 0 0 0 0

338.11.5: +++ +++ +/ 0 +++ 0 0

338.14.3: + + 0 0 0 0 0

338.15.5: +++ +++ ++ 0 0 0 +++

338.17.3: +++ ++ + 0 0 ++ 0

338.24.5: +++ + 0 0 0 ++ 0

338.25.6: +++ +++ +++ 0 0 0 0

338.28.6: +/ 0 0 0 0 0 0

338.29.2: +++ +++ 0 +++ 0 0 0

338.39.5: +++ +++ 0 0 0 0 0

Clones de rata

272.19.1.1. 4.2: +++ +++ +++ ++ 0 0 0

272.21.1.3. 4.2: +++ +++ + 0 0 0 0

Reactividad:: Ninguna débil (+) moderada Intensa (+++) *No se +péptidos se

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muy débiles o no neutralizadores de la bioactividad de IL-21.

Ejemplo 7 Ensayo de bioactividad de IL-21 Baf3/huIL-21R STAT3

[0160] El siguiente bioensayo STAT3 fosforilado se utilizó como cribado principal para medir la neutralización de títulos de anti-IL-21 en suero murino, así como los niveles relativos de neutralización de IL-21 por sobrenadantes de hibridoma y los anticuerpos anti-IL-21 purificados. La actividad de IL-21 se determinó midiendo el nivel de fosforilación de STAT3 después de la interacción ligando-receptor en las células Baf3/KZ134/huIL-21R (véase Spolski y Leonard, Annu Rev Immunol, 8 de noviembre 2007). Se determinó la actividad de neutralización basado en la disminución de los niveles de STAT3 fosforilado utilizando una concentración EC50 de IL-21 y una titulación de antagonista.

[0161] Las células Baf3/KZ134/huIL-21R se lavaron dos veces con medio de ensayo (RPMI 1640 con suero bovino fetal al 5%, 1x Glutamax, 1% de piruvato sódico, y 2 M beta-mercaptoetanol; todos de Invitrogen, Carlsbad, CA) antes de sembrarse a 40.000 células/pocillo en placas de cultivo de tejido de base redonda de 96 pocillos (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Las células se colocaron en una incubadora de cultivo de tejidos a 37ºC mientras se prepararon las soluciones de ensayo. Para determinar las concentraciones EC50 y EC90 de IL-21 en este ensayo, se prepararon diluciones en serie de IL-21 humana recombinante en medio de ensayo y se sembraron en una placa separada de base U de 96 pocillos. Alternativamente, para la prueba de neutralización de IL-21, se preincubó una concentración EC50 de IL-21 (se determinó que era 33 pM) con diluciones en serie de suero de ratón inmunizado con IL-21, medios de hibridoma agotados, anticuerpos IL-21R/c-Fc humanos solubles purificados o anticuerpos monoclonales anti-IL-21 purificados. Tanto la placa de células como la placa de solución se incubaron a continuación en una cámara de cultivo de tejidos humidificada para equilibrarse durante 30 minutos a 37ºC y 5% CO2. Después de 30 minutos, la reacción se inició mediante la transferencia de las soluciones de IL-21 a la placa de células e incubando durante 10 minutos a 37ºC y CO2 al 5%.

[0162] Después de la incubación de 10 minutos, las reacciones se detuvieron mediante la colocación de la placa en hielo y añadiendo 125 l de tampón de lavado celular enfriado en hielo (BIO-PLEX Cell Lysis Kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) a cada pocillo . Las células fueron centrifugadas a 1500 rpm a 4ºC durante 5 minutos y los medios se aspiraron. Para lisar las células, se añadió a cada pocillo 50 l/pocillo de tampón de lisis (preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante, Bio-Rad Labs). Los lisados celulares se pipetearon arriba y abajo cinco veces, mientras estaban en hielo, y se agitaron en un agitador de plataforma de microplacas durante 20 minutos a 600 rpm a 4ºC. Las placas se centrifugaron a 3000 rpm a 4ºC durante 20 minutos. Se recogieron los sobrenadantes y se transfirieron a una nueva placa de microtitulación y se mezclaron 1:1 con tampón de ensayo (BIO-RAD) para el almacenamiento a -20ºC.

[0163] Las microesferas de captura (BIO-PLEX ensayo fosfo-STAT3, Bio-Rad Laboratories) se diluyeron y se sembraron en una placa de filtro de 96 pocillos (Millipore Corporation, Irlanda) según las instrucciones del fabricante. Las placas se lavaron dos veces con tampón de lavado (BIO-RAD) y se transfirieron a cada pocillo 50 l de la mezcla de lisado celular. A continuación, cada placa se envolvió en papel de aluminio y se agitó durante la noche a temperatura ambiente y 300 rpm. El día siguiente, la placa se transfirió a un aparato de microtitulación de vacío y se lavó dos veces con tampón de lavado. Después de la adición de 25 l/pocillo de anticuerpo de detección (BIO-RAD), la placa cubierta con papel aluminio se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación a 300 rpm. La placa se filtró y se lavó dos veces con tampón de lavado. Se añadió estreptavidina-PE (50 l/pocillo; BIO-RAD) y la placa cubierta con papel aluminio se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos con agitación a 300 rpm. La placa se filtró y se lavó dos veces y se resuspendió en 125 l/pocillo de tampón de resuspensión de microesferas (BIO-RAD). El nivel de STAT3 fosforilado se evaluó a continuación usando un lector de matrices (BIO-PLEX, Bio-Rad Laboratories) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos fueron analizados utilizando el software de análisis (BIO-PLEX Manager 3.0, Bio-Rad Laboratories). Los aumentos en el nivel del factor de transcripción STAT3 fosforilado presente en los lisados eran indicativos de una interacción receptor de IL-21-ligando. Para el ensayo de neutralización, las disminuciones en el nivel del factor de transcripción STAT3 fosforilado presente en los lisados eran indicativos de la neutralización de la interacción receptor de IL-21-ligando. Los valores de IC50 (concentración de antagonista que produce una inhibición del 50 por ciento de la actividad del ligando) se calcularon usando GraphPad Prism®4 (GraphPad Software, Inc., San Diego CA) y se expresaron como concentraciones molares para cada reactivo en el ensayo de neutralización.

[0164] IL-21 indujo la fosforilación de STAT3 de una manera dependiente de la dosis con una concentración EC50 que se determinó que era de aproximadamente 33 pM. La Tabla 7 resume los valores de IC50 para el control positivo (proteína de fusión de IL-21R/c-Fc humana soluble) y los elementos de neutralización de IL-21 descritos en este documento. Estos datos indican que los elementos neutralizantes de IL-21 se mantuvieron activos y eran igual o mejor que el control positivo en la reducción de la fosforilación de STAT3 inducida por IL-21.

Tabla 7: Valores IC50 en ensayo de fosforilación de STAT-3

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Claims

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