BRPI0821168B1

BRPI0821168B1 - Anticorpo isolado que se liga ao il-21 humano, ou um fragmento deste, usos de ditoanticorpo ou fragmento, e, hibridoma

Info

Publication number: BRPI0821168B1
Application number: BRPI0821168-0A
Authority: BR
Inventors: Stephen R. Jaspers; Mark W. Rixon; Stacey R. Dillon; Frederick J. Ramsdell; Cecile M. Krejsa; Eugene C. Yi
Original assignee: Zymogenetics, Inc.
Priority date: 2007-12-07
Filing date: 2008-12-08
Publication date: 2021-01-12
Also published as: CN103772502B; US20120225065A1; EP2426146A2; DK2217268T3; JP6027668B2; EP2217268B1; CA2910933C; EP2426146A3; AU2008364115A1; CA2707026C; EP3103813A1; KR101615215B1; CN103772502A; AU2008364115B2; PL2217268T3; US20100041873A1; WO2010055366A3; CN102027011B; KR20100097724A; WO2010055366A4

Abstract

ANTICORPO ISOLADO QUE SE LIGA AO IL-21 HUMANO, OU UMA PORÇÃO DESTE QUE SE LIGA AO ANTÍGENO, USOS DE DITO ANTICORPO, E, HIBRIDOMA. Anticorpos monoclonais IL-21 anti-humanos humanos e os hibridomas que os produzem são apresentados. Alguns destes anticorpos têm a capacidade de ligar um IL-21 humano natural, uma proteína IL-21 recombinante humana e/ou regiões de peptídeo de IL-21 humano. Estes anticorpos anti-IL-21 humanos são úteis no tratamento terapêutico de doencças antoimunes e inflamatórias, particularmente doenças mediadas por células auxiliares foliculares T, células B, células TH ou células TH 17

Description

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

O sistema imune é a defesa primária corporal contra doenças causadas por patogênios, isto é, bactérias, vírus, fungos etc, bem como contra doenças causadas pelo desenvolvimento anormal das células e tecidos próprios do corpo (isto é, tumores cancerosos). Normalmente, o sistema imune é capaz de distinguir entre as células normais do corpo ou patogênios “próprios” e estranho ou células anormais ou “não próprias”. Os processos pelos quais o sistema imune abstenha-se da reação de um anticorpo próprio é denominado tolerância. Algumas vezes, o sistema imune perde a capacidade de reconhecer “a si mesmo” como normal e a resposta subsequente direcionada contra o tecido ou células, resulta em perda de tolerância, um estado de autoimunidade. As patologias que resultam da autoimunidade frequentemente têm consequências clínicas e são um dos problemas de saúde principais no mundo, especialmente em nações desenvolvidas.

IL-21 é uma citocina do tipo I de feixe quatro-a-hélico imunomodulador potente que liga-se a um receptor heterodimérico composto de IL-21R e a cadeia gama comum (revisto por Spolski and Leonard, Annu Rev Immunol. Nov 8; 2007). O IL-21 é produzido por células NK-T e CD4+ T (incluindo células Th17 pró-inflamatórias e células TFH auxiliares foliculares que são importantes para respsotas do centro germinal) e tem efeitos pleiotrópicos tanto em respostas imunes inatas e adaptativas, incluindo a proliferação intensificada de células B e T, citotoxicidade aumentada de células CD8+ T e células matadoras naturais (NK), diferenciação de células B células de plasma secretoras de imunoglobulina e regulação da linhagem de célula Th17 (ver abaixo). O IL-21 também podem inibir a função de representação de antígeno de células dendríticas e pode induzir a apoptose em células B e células NK sob certas condições. O IL-21 tem atividade antitumor potente, mas também foi associado com o desenvolvimento de várias doenças autoimunes, incluindo lúpus eritematoso sistêmico (SLE), artrite reumatóide (RA), doença do intestino inflamatório (IBD) e psoríase (revisto 5 por Spolski and Leonard, Annu Rev Immunol. Nov. 8, 2007).

O IL-21 foi mostrado modular respostas de anticorpo pela atuação direta em células B. (Mehta et al., J. Immunol., 170:4111-4118, 2003; Ozaki et al., Science, 298:1630-1634, 2002; Suto et al., Blood, 100:4565- 4573, 2002). O IL-21 pode induzir a diferenciação das células B humanas 10 simples em células de plasma secretoras de anticorpo (Ozaki et al. J.

Immunol. 173:5361, 2004; Ettinger et al., J Immunol. 175:7867-79, 2005; Ettinger et al, J Immunol. 178:2872-82, 2007; Kuchen et al. J Immunol. 179:5886-96, 2007) e para estimular a produção de IgE em célula B humana (Kobayashi et al. Human Immunol. doi:10:1016/j.humimm.2008.10.). Em -15 animais deficientes de IL-21 ou IL-21 R, poucas células de secreção de anticorpo são geradas da reação central germinal e maturação por afinidade é reduzido são reduzidos (Zotos et al., apresentado). As células formadoras de anticorpo extrafoliculares, que são implicadas em autoimunidade, requer auxílio cognado de uma subsérie de células CD4 T especializadas que 20 secretam o IL-21 (Odegard, et at., JEM 205(12):2873-2886, 2008).

A geração de anticorpos contra MHC alogênico é um fenômeno pivotal na rejeição ao transplante. Os receptores de transplant que desenvolveram tituladores de anticorpos anti-MHC (pacientes de transplante altamente sensibilizados) estão em risco quanto à rejeição crônicas e são 25 candidatos deficientes para novos enxertos devido à propabilidade da rejeição mediada por anticorpo do novo transplante (Smith, et al., Am J Transplantation 8: 1-11, 2008). Em um modelo de rato de rejeição de aloenxerto renal agudo, IL-21 e IL-21 R foram unicamente aumentados em células moleculares intravasculares de aloenxertos renais mas não isoenxertos (Hecker, et at., Immunobiology: doi: 10.1016/j.imbio.2008.04.004, (2008)). Em transplantes cardíacos humanos que sofrem rejeição, os níveis de expressão de IL-21 e IL-21R correlacionam com o grau de rejeição ISHLT e expressão mais alta está presente em IR e 2R (Baan, et at., Transplantation 5 83(11): 1485-1492, 2007).

Em doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD), a resposta anti-alo é mediada pela ativação não controlada de linfócitos T do enxerto, que direciona uma resposta inflamatória contra os tecidos hospedeiros. As células T reguladoras (Treg) podem modular sua resposta em modelos de "10 animais. O IL-21 foi mostrado contra-reagir as funções reguladoras de Treg (Clough et at., J Immunol 180: 5395-5401, 2008). Em modelos de camundongos de GVHD, transferência de células T deficientes em IL-21 resultaram em sinais clínicos significantemente reduzido e registros histológicos e sobrevivência aumentada, comparado com células WT T. A .15 frequência diminuída de células T secretoras de IFN-gama e Tregs aumentados foram observados na mucosa do cólon. O bloqueio de IL-21 usando-se anti-mIL-21 mAb e a transferência de célula WT T produziu resultados similares (Bucher et at., Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2008 112: Abstract #2342). 20 Foi recentemente mostrado que o IL-21 é tanto produzido por quanto requerido para a diferenciação de células Th 17 pró-inflamatórias de camundongo (Kom et at. Nature. 448:484-487, 2007; Nurieva et at. Nature 448:480-483, 2007; Zhou et al., Nat Immunol. 8:967-974, 2007 ; Wei et at. J Biol Chem. 282:34605-34610, 2007). As células Thl7 humanas também 25 produzem IL-21 e os estudos estão adiantados para determinar se o IL-21 atua como um fator autócrino para as células de Thl7 humanas, como é para as células Thl7 de camundongo. Ozaki et at. (J. Immunol. 173:5361, 2004) demonstrou que a expressão de IL-21 é elevada em camundongos BXSB-Yaa propensos ao lúpus, um modelo para lúpus eritematoso sistêmico (SLE), em uma idade quando as características precoces de processos autoimunes tomam-se primeiro evidentes. O tratamento destes camundongos BXSB-Kαα com um receptor de IL-21 de camundongo solúvel (mIL-21 R-Fc) inibe parcialmente vários parâmetros de doença, incluindo glomerulonefríte (Bubier 5 et al., Ann N Y Acad Sci. 1110:590-601, 2007). O tratamento com mIL-21 R- Fc também foi mostrado ser eficaz em um outro modelo de doença pré-clínica de SLE, os camundongos de MRL//pr (Herber et at. J. Immunol. 178: 3822- 3830, 2007), bem como no modelo de artrite induzido por colágeno (CIA) de artrite reumatóide (Young et at., Arthr Rheum 56:1152-1163, 2007). Os dados '10 humanos preliminares também sugerem a desregulação de IL-21 e IL-21 R em SLE (Mitoma et al. Int J Mol Med. 16:609-615. 2005; Wang et al., Chinese J. Cell. Mol, Immunol. 23(111:1041-1042, 2007; Sawalha et al. Ann Rheum Dis 67: 458-461, 2008). Mais recentemente, Rus et al. dados obtidos de 24 pacientes SLE e 15 controles saudáveis (Nguyen et al., ACR/ARHP Scientific -15 Meeting, 1760/482, 2008 Oct 24-29 San Francisco, CA). Rus et al. mostrou que 1) a expressão de IL-21 mRNA é significantemente aumentada em células de CD4+ T de pacientes com lúpus comparados com o controle, 2) níveis de IL-21 são significantemente elevados em soros de pacientes com o ativo em comparação com o SLE inativo ou controles, 3) o IL-21 intensifica a 20 proliferação de células CD4+ T e das células CD 19+ B em pacientes e controles de uma maneira dependente de dose, 4) o IL-21 intensifica a diferenciação de célula de plasma induzida por anti-CD40 em controles normais e pacientes SLE e 5) níveis elevados de IL-21 podem contribuir com a proliferação de células CD4+ T auto-reativas e diferenciação de célula de 25 plasma em SLE.

Monteleone et al demonstraram que IL-21 RNA e a expressão de proteína é aumentado em tecido inflamado mas não não inflamado de pacientes com doença de Crohn (CD) (e, a um grau menor, colite ulcerativa) e que a produção IL-21 por células CD3+ de células mononucleares de lamina propria de pacientes CD também é intensificada (Monteleone et al. Gastroenterology 128:687-694, 2005; Monteleone et al. Gut 55:1774-1780, 2006; Peluso et al., J Immunol 178:732-739, 2007). Estes autores sugerem que o IL-21 regula a colite experimental pela modulação do equilíbrio entre as 5 células T reguladoras (Tregs) e células Thl7 (Fantini et al. Eur. J. Immunol. 37:3155-3163, 2007). A inibição de IL-21 in vivo com um recpeitor de IL-21 solúvel em modelos de camundongo ou rato de colite leva às reduções significantes em sinais clínicos de colite (Young et al. US 2006/0039902).

O receptor de IL-21 é expressado por células NK e as células 10 NK foram mostradas serem responsivas ao tratamento com IL-21 tanto in vivo quanto in vitro. Em pacientes de oncologia tratados com IL-21 humano recombinante, os padrões de recirculação alterados em sub-séries de linfócitos incluindo células NK e expressão aumentada de marcadores de ativação de célula NK e capacidade atuadora citolítica foram observadas (Frederiksen, et -15 al., Cancer Immunol Immunother 57(10): 1439-1449, 2008). Em doenças autoimunes, a atividade de célula NK pode desempenhar um papel na promoção de inflamação e dano de tecido associado. O retomo ao tecido de células NK é direcionado por células quimioatraentes liberadas no local de inflamação (Morris and Ley, Curr Mol Med.;4(4):431-8, 2004). As células 20 NK de Lamina propria de pacientes com Doença de Crohn liberaram quantidades maiores de IFN-y e TNF-oc quando estimualdos in vitro com IL- 21 e IgG, em comparação com as células LPNK dos controles (Liu and Jiu, Chronic Inflammation of Liver and Gut, Falk Symposium abst. No. 163, 2008 Mar 14-15). As células NK também são relatadas regular a autoimunidade e a 25 rejeição ao transplante através de suas interações com as células dendríticas (DC), pela morte imatura ou DC ativado e pela liberação de citocinas que afetam a ativação e as funções de apresentação de antígeno do DC (Vivier et al., Nat Immunol 9(5):503-510, 2008; Laffont et al., Blood 112:661-671, 2008). Uma comparação de células mononucleares de sangue periférico a partir de receptores de aloenxerto de fígado tolerante e não tolerante apresentaram mudanças no programa de transcrição de células NK (Martinez- Llordella et al., J Clin Invest 118(8):2845-2857, 2008). Desta maneira, o bloqueio de IL-21 pode modular a ativação do estado de células NK, reduzir a 5 inflamação de tecido em doenças autoimunes e alterar o curso clínico da rejeição ao transplante. As células NK tmbém são relatadas regular a autoimunidade e rejeição ao transplante através de suas interações com as células dendríticas (DC), pela morte imatura ou DC ativado e pela liberação de citocinas que afetam o estado de ativação e alterar as funções de

T.0 apresentação de antígeno do DC. Desta maneira, o bloqueio de IL-21 pode modular a ativação de células NK e reduzir sua contribuição para a inflamação do tecido em doença autoimunes. A presente invenção fornece anticorpos monoclonais IL-21 anti-humanos e métodos de usar aqueles anticorpos que inibem os sintomas e -15 as atividades biológicas que manifestam como distúrbios autoimunes e inflamatórios e são associados com as interações de receptor de IL-21/IL-21. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é um alinhamento de resíduos de aminoácido que compreende as regiões de cadeia pesada variáveis de anticorpos designados 20 pelos números de clone 362.78.1.44 (78), 362.597.3 (597), 362.75.1.1 (75), 366.552.11 (552), 366,328.10 (328). A Figura 2 é um alinhamento de resíduos amino que compreende a região de cadeia leve variável dos anticorpos descritos neste. A Figura 3 ilustra os espectros de massa MALDI/TOF de 25 regiões de sequência de peptídeo IL-21 obtido de IL-21 sozinho e o complexo imune de IL-21. As sequências de peptídeo de IL-21, EKKPPKEF (SEQ ID N°: 2 do resíduo 129 a 136) (m/z, 1002.5619 Da) e LERFKSLL (SEQ ID N°: 2 do resíduo 137 a 144) (m/z, 1005.6091 Da) do estado livre de IL-21 (A). A mudança de massa de peptídeo devido à retenção de deuteração de amida na presença de IL-21 mAb (B). Uma outra região de sequência de peptideo de IL-21, KSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS (SEQ ID N°: 2 do resíduo 141 a 162) (m/z, 2519.2451) do estado livre de IL-21 (C). Uma massa de peptideo parcial que muda devido à retenção de deuteração de amida na presença de 5 IL-21 mAb (D). A Figura 4 ilustra cromatogramas de íon selecionado de peptídeos acetilados e não acetilados. O cromatograma de íon simples selecionado de TCPSCDSYEKKPPKEF acetilado (SEQ ID N°: 2 do resíduo 119 a 136) (m/z, 1986 Da) isolado de IL-21 sozinho (A) e o mesmo traço 10 cromatográfico do complexo imune de IL-21 (B). o espectro de massa incluído é o estado triplamente carregado da massa de peptideo (m/z, 662.9). O terceiro traço mostra o cromatograma de íon selecionado doíon de peptideo em m/z 1018 Da, que é KSLLQKMI acetilado (SEQ ID N°: 2 do resíduo 141 a 148) isolado de IL-21 sozinho (C) e o mesmo traço cromatográfico do -15 complexo imune de IL-21 (D), o espectro de massa incluído é o estado duplamente carregado do peptideo de massa (m/z, 509,1) BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal humano anti-IL-21 que compreende pelo menos 80 % de 20 identidade aos resíduos de aminoácido 20 a 145 da SEQ ID N°: 29 e pelo menos 80 % de identidade aos resíduos de aminoácido 21 a 126 da SEQ ID N°: 37. Em certas formas de realização, os anticorpos compreendem mudanças de pelo menos 80 % de identidade que estão na região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID N°: 31. 25 Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal humano anti-IL-21 que compreende: (a) uma região de cadeia pesada que compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende SEQ ID N°: 31; (ii) uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende SEQ ID N°: 33 e (iii) uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende SEQ ID N°: 35 e (b) uma região de cadeia leve que compreende: (i) uma região variável de cadeia leve CDR1 que compreende SEQ ID N°: 39; (ii) uma região variável de cadeia leve CDR2 que compreende SEQ ID N°: 41 e (iii) uma região variável de cadeia leve 5 CDR3 que compreende SEQ ID N°: 43. Em certas formas de realização, a invenção fornece um anticorpo monoclonal humano anti-IL-21 que compreende resíduos de aminoácido 20 a 145 da SEQ ID N°: 29 e resíduos de aminoácido 21 a 126 da SEQ ID N°: 37. Em outras formas de realização, o anticorpo é que ainda compreende resíduos de aminoácido 1 a 145 da SEQ ID 10 N°: 29 e resíduos de aminoácido 1 a 126 da SEQ ID N°: 37. Uma outra forma de realização da presente invenção fornece um hibridoma denominado 362.78.1.44, em que o hibridoma é depositado com o American Type Culture Collection tendo a denominação de Depósito de Patente ATCC PTA-8790 e a invenção inclui o anticorpo produzido pelo hibridoma. -15 Um outro aspecto da presente invenção fornece um anticorpo monoclonal humano anti-IL-21 que compreende: (a) uma região de cadeia pesada que compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende SEQ ID N°: 47; (ii) uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende SEQ ID N°: 49 e (iii) uma região variável de cadeia pesada 20 CDR3 que compreende SEQ ID N°: 51 e (b) uma região de cadeia leve que compreende: (i) uma região variável de cadeia leve CDR1 que compreende SEQ ID N°: 55; (ii) uma região variável de cadeia leve CDR2 que compreende SEQ ID N°: 57 e (iii) uma região variável de cadeia leve CDR3 que compreende SEQ ID N°: 59. Em certas formas de realização, a invenção 25 fornece um anticorpo monoclonal humano anti-IL-21 que compreende resíduos de aminoácido 20 a 145 da SEQ ID N°: 45 e resíduos de aminoácido 21 a 126 da SEQ ID N°: 53. Em outras formas de realização, a invenção é a que ainda compreende resíduos de aminoácido 1 a 145 da SEQ ID N°: 45 e resíduos de aminoácido 21 a 126 da SEQ ID N°: 53. Uma outra forma de realização da presente invenção fornece um hibridoma denominado 362.597.3, em que o hibridoma é depositado com o American Type Culture Collection tendo a denominação de Depósito de Patente ATCC PTA-8786 e a invenção inclui o anticorpo produzido pelo hibridoma.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal humano anti-IL-21 que compreende pelo menos 80 % de identidade aos resíduos de aminoácido 20 a 141 da SEQ ID N°: 13 e pelo menos 80 % de identidade aos resíduos de aminoácido 21 a 126 da SEQ ID N°: 21. Em uma forma de realização, a invenção inclui um anticorpo monoclonal onde quaisquer mudanças de aminoácido são mudanças de aminoácido conservativas.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal humano anti-IL-21 que compreende: (a) uma região de cadeia pesada que compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende SEQ ID N°: 15; (ii) uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende SEQ ID N°: 17 e (iii) uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende SEQ ID N°: 19 e (b) uma região de cadeia leve que compreende: (i) uma região variável de cadeia leve CDR1 que compreende SEQ ID N°: 23; (ii) uma região variável de cadeia leve CDR2 que compreende SEQ ID N°: 25 e (iii) uma região variável de cadeia leve CDR3 que compreende SEQ ID N°: 27. Em certas formas de realização, a presente invenção inclui um anticorpo monoclonal humano anti-IL-21 que compreende resíduos de aminoácido 20 a 141 da SEQ ID N°: 13 e resíduos de aminoácido 21 a 126 da SEQ ID N°: 21. Em uma outra forma de realização, a invenção é a que ainda compreende resíduos de aminoácido 1 a 141 da SEQ ID N°: 13 e resíduos de aminoácido 1 a 126 da SEQ ID N°: 21. Uma outra forma de realização da presente invenção fornece um hibridoma denominado 362.75.1.1, em que o hibridoma é depositado com o American Type Culture Collection tendo a denominação de Depósito de Patente ATCC PTA-8791 e o anticorpo produzido pelo hibridoma.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal humano anti-IL-21 que compreende: (a) uma região de cadeia pesada que compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada 5 CDR1 que compreende SEQ ID N°: 79; (ii) uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende SEQ ID N°: 81 e (iii) uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende SEQ ID N°: 83 e (b) uma região de cadeia leve que compreende: (i) uma região variável de cadeia leve CDR1 que compreende SEQ ID N°: 87; (ii) uma região variável de cadeia leve CDR2 10 que compreende SEQ ID N°: 89 e (iii) uma região variável de cadeia leve CDR3 que compreende SEQ ID N°: 91. Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal humano anti-IL-21 que compreende resíduos de aminoácido 20 a 136 da SEQ ID N°: 77 e resíduos de aminoácido 23 a 129 da SEQ ID N°: 85. Em uma outra forma de realização, a -15 invenção é a que ainda compreende resíduos de aminoácido 1 a 136 da SEQ ID N°: 77 e resíduos de aminoácido 1 a 129 da SEQ ID N°: 85. Uma outra forma de realização da presente invenção fornece um hibridoma denominado 366.552.11, em que o hibridoma é depositado com o American Type Culture Collection tendo a denominação de Depósito de Patente ATCC PTA-8787 e o 20 anticorpo produzido pelo hibridoma.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal humano anti-IL-21 que compreende: (a) uma região de cadeia pesada que compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende SEQ ID N°: 63; (ii) uma região variável de cadeia 25 pesada CDR2 que compreende SEQ ID N°: 65 e (iii) uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende SEQ ID N°: 67 e (b) uma região de cadeia leve que compreende: (i) uma região variável de cadeia leve CDR1 que compreende SEQ ID N°: 71; (ii) uma região variável de cadeia leve CDR2 que compreende SEQ ID N°: 73 e (iii) uma região variável de cadeia leve CDR3 que compreende SEQ ID N°: 75. Em certas formas de realização, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal humano anti-IL-21 que compreende resíduos de aminoácido 20 a 139 da SEQ ID N°: 61 e resíduos de aminoácido 23 a 129 da SEQ ID N°: 69. Em outras formas de realização, a 5 presente invenção é a que ainda compreende resíduos de aminoácido 1 a 139 da SEQ ID N°: 61 e resíduos de aminoácido 1 a 129 da SEQ ID N°: 69. Uma outra forma de realização da presente invenção fornece um hibridoma denominado 366.328.10, em que o hibridoma é depositado com o American Type Culture Collection tendo a denominação de Depósito de Patente ATCC 10 PTA-8789 e o anticorpo produziu o hibridoma.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um hibridoma denominado 366.345.6.11, em que o hibridoma é depositado com o American Type Culture Collection tendo a denominação de Depósito de Patente ATCC PTA-8788 e inclui o anticorpo produzido pelo hibridoma. ■15 Em um outro aspecto da presente invenção, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado que liga-se a um epítopo descontínuo que compreende pelo menos duas regiões em uma proteína IL- 21, em que a primeira região consiste de pelo menos um aminoácido do resíduo Ile45 ao resíduo Leu56 da SEQ ED N°: 2 e a segunda região consiste 20 de pelo menos um resíduo de aminoácido Glul29 ao resíduo Leul44 da SEQ ID N°: 2. Em uma forma de realização, a invenção fornece que a primeira região consiste entre 1 e 12 aminoácidos do resíduo Ile45 ao resíduo Leu56 da SEQ ID N°: 2 e a segunda região consiste de entre 1 e 16 aminoácidos do resíduo Glul29 ao resíduo Leul44 da SEQ ID N°: 2. 25 Em cada aspecto das invenções descritas acima, é incluída uma forma de realização onde o anticorpo monoclonal ainda compreende uma porção Fc e uma outra forma de realização, em que a porção Fc é selecionada do grupo que consiste de IgGl, IgG2 e IgG4 e uma outra forma de realização, em que a porção Fc tem função atuadora reduzida.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratar doenças mediadas por célula auxiliar folicular T ou mediadas por célula B em um paciente pela administração de uma quantidade terapêutica dos anticorpos monoclonais IL-21 anti-humanos reivindicados descritos neste, 5 em que as doenças mediadas por célula auxiliar folicular T ou mediadas por célula B são selecionadas do grupo que consiste de lúpus eritematoso sistêmico, perda de audição autoimune, Doença de Graves, pênfigo vulgar, miastenia grave, neuromielite ótica, síndrome de Goodpasture, nefrite autoimune, crioglobulinemia, síndrome de Guillain Barre, polineuropatia 10 desmielinante inflamatória crônica (CIDP), anemia hemolítica autoimune, e púrpura tromcitopênica idiopática (ITP).

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratar doenças mediadas pela célula TH1 ou mediadas pela célula TH 17 em um paciente pela administração de uma quantidade terapêutica dos anticorpos .15 monoclonais IL-21 anti-humanos reivindicados descritos neste, em que as doenças mediadas pela célula TH1 ou mediadas pela célula TH 17 são selecionadas do grupo que consiste de psoríase, espondiloartropatia, artrite reativa, arrite enteropática, miocardite autoimune, doença de Kawasaki, doença celíaca, uveíte, doença de Behcet, doença da artéria coronária, doença 20 pulmonar obstrutiva crônica (COPD) e doença pulmonar intersticial.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratar doença do intestino inflamatório (IBD) em um paciente pela administração de uma quantidade terapêutica dos anticorpos monoclonais IL- 21 anti-humanos reivindicados descritos neste, em que a doença do intestino 25 inflamatório é selecionada do grupo que consiste de Doença de Crohn, colite ulcerativa e síndrome do intestino irritável.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratar artrite reumatóide em um paciente pela administração de uma quantidade terapêutica dos anticorpos monoclonais IL-21 anti-humanos reivindicados descritos neste.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratar esclerose múltipla em um paciente pela administração de uma quantidade terapêutica dos anticorpos monoclonais IL-21 anti-humanos 5 reivindicados descritos neste.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratar diabete tipo I (IDDM) em um paciente pela administração de uma quantidade terapêutica dos anticorpos monoclonais IL-21 anti-humanos reivindicados. 10 Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratar síndrome de Sjogren em um paciente pela administração de uma quantidade terapêutica dos anticorpos monoclonais IL-21 anti-humanos reivindicados descritos neste.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método -15 de tratar um paciente de transplante pela administração de uma quantidade terapêutica dos anticorpos monoclonais IL-21 anti-humanos reivindicados descritos neste, em que rejeição ao transplante é suprimida, tolerância no regime terapêutico pré-transplante é estabelecida ou tituladores de aloanticorpo no paciente são reduzidos. 20 Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratar uma doença autoimune em um paciente pela administração de uma quantidade terapêutica dos anticorpos monoclonais IL-21 anti-humanos reivindicados descritos neste, em que a doença autoimune é selecionada do grupo que consiste de pancreatite, doença muscular inflamatória (polimiosite, 25 dermatomiosite), poliangiite microscópica, anemia aplástica autoimune, tiroidite autoimune, hepatite autoimune, síndrome de Wegener, diverticulose, espondilite ancilosante, escleroderma, esclerose sistêmica, artrite psoriática, osteoartrite, dermatite atópica, vitiligo, doença enxerto versus hospedeiro (GVHD), linfoma de célula T cutânea (CTCL), glomerulonefrite, neffopatia de IgA, pacientes de transplante altamente sensibilizados, síndrome anti- fosfolipídeo e asma e outras doenças autoimunes ou outras doenças mediadas por IL-21 e agonistas receptores de IL-21.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método 5 de tratar lúpus eritematoso sistêmico (SLE) em um paciente pela administração de uma quantidade terapêutica dos anticorpos monoclonais IL- 21 anti-humanos reivindicados descritos neste.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratar psoríase em um paciente pela administração de uma quantidade 10 terapêutica dos anticorpos monoclonais IL-21 anti-humanos reivindicados descritos neste.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

As seguintes definições são fornecidas para facilitar o entendimento das invenções descritas neste. -15 Os termos “terminal amino” e “terminal carboxila” são usados neste para indicar posições dentro dos polipeptídeos. Onde o contexto permite que estes termos são usados com referência a uma sequência ou porção particular de um polipeptídeo para indicar a proximidade ou posição relativa. Por exemplo, uma certa sequência posicionou o terminal carboxila a uma 20 sequência de referência dentro de um polipeptídeo está localizado proximal ao terminal carboxila da sequência de referência, mas não está necessariamente no terminal carboxila do polipeptídeo completo.

O termo “antagonista” refere-se a qualquer composto incluindo uma proteína, polipeptídeo, peptídeo, anticorpo, fragmento de 25 anticorpo, molécula grande ou molécula pequena (menos do que 10 kD), que diminui a atividade, ativação ou função de uma outra molécula. Os antagonistas de IL-21 causam pelo menos um dos seguintes: função imune diminuída de células NK, células dendríticas, sub-séries de célula T e sub- séries de célula B; liga IL-21 tal que a interação de proteína IL-21 com seu receptor é bloqueado, inibido, reduzido ou neutralizado.

Os “anticorpos” (Abs) e “imunoglobulinas” (Igs) são glicoproteínas tendo as mesmas características estruturais. Enquanto os anticorpos apresentam a especificidade de ligação a um antígeno específico, 5 imunoglobulinas incluem tanto anticorpos quanto outras moléculas semelhantes a anticorpo que precisam da especificidade de antígeno. Os polipeptídeos do último tipo são, por exemplo, produzido em níveis baixos pelo sistema de linfa e em níveis aumentados por mielomas. Desta maneira, como usado neste, o termo “anticorpo” ou “peptídeo(s) de anticorpo” refere- 10 se a um anticorpo intacto ou um fragmento de ligação deste que comprete com o anticorpo intacto para a ligação específica e inclui anticorpos quiméricos, humanizados, totalmente humanos e biespecíficos. Em certas formas de realização, os fragmentos de ligação são produzidas pelas técnicas de DNA recombinante. Nas formas de realização adicionais, os fragmentos de •15 ligação são produzidas pela clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Os fragmentos de ligação incluem, mas não são limitados a, Fab, Fab', F(ab')2, Fv e anticorpos de cadeia simples, ScFv. Os “anticorpos naturais e imunoglobulinas” são usualmente glicoproteínas de cerca de 150.000 daltons, composto de duas cadeias leves idênticas (L) e duas cadeias pesadas 20 idênticas (H). Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação de bissulfeto covalente, enquanto o número de ligações de bissulfeto entreas cadeias de isotipos de imunoglobulina diferentes. Cada cadeia pesada e leve também tem pontes de bissulfeto intracadeia regularmente espaçada. Cada cadeia pesada tem, em uma extremidade, um domínio variável (VH) seguido 25 por diversos domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante em sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhada com o primeiro domínio constante do domínio de cadeia pesada e de cadeia leve é alinhada com o domínio variável da cadeia pesada. Os resíduos de aminoácido particulares são acreditados formar uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e pesada (Chothia et al., J, Mol. Biol. 186:651 (1985); Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:4592 (1985)).

O termo “anticorpo quimérico” ou “anticorpos quiméricos” 5 refere-se a anticorpos cujos genes de cadeia leve e pesada foram construídos, tipicamente pela engenharia genética, a partir dos genes de região variável e constante de imunoglobulina que pertencem às espécies diferentes. Por exemplo, os segmentos variáveis dos genes a partir de um anticorpo monoclonal de camundongo pode ser unido a segmentos constantes humanos, 10 tais como gama 1 e gama 3. Um anticorpo quimérico terapêutico típico é, desta maneira, um composto de proteína híbrida do domínio de ligação variável ou de antígeno a partir de um anticorpo de camundongo e o domínio constante a partir de um anticorpo humano, embora outras espécies de mamífero possam ser usada. Especificamente, um anticorpo quimérico é •15 produzido por tecnologia de DNA de recombinante em que todos ou parte das regiões de junta e constantes de uma cadeia leve, cadeia pesada ou ambas de imunoglobulina, foram substituídos pelas regiões correspondentes a partir de uma outra cadeia leve ou cadeia pesada de imunoglobulina do animal. Desta maneira, a porção de ligação de antígeno do anticorpo monoclonal precursor é 20 enxertada na cadeia principal de uma outra espécies de anticorpo.

O termo “epítopo” refere-se a qualquer determinante de proteína capaz de ligação específica a uma imunoglobulina ou receptor de célula T. Os determinantes epitópicos usualmente consistem de agrupamentos de superfície quimicamente ativa de moléculas, tais como aminoácidos ou 25 cadeias secundárias de açúcar e, usualmente têm características estruturais de três dimensões specíficas, bem como características de carga específicas. Mais especificamente, o termo “epítopo de IL-21” como usado neste refere-se a uma porção do polipeptídeo IL-21 tendo atividade antigênica ou imunogênica em um animal, preferivelmente em um mamífero e, mais preferivelmente em um camundongo ou um ser humano. Um epítopo tendo atividade imunogênica é uma porção de um polipeptídeo IL-21 que evoca uma resposta de anticorpo em um animal. Um epítopo tendo a atividade antigênica é uma porção de um polipeptídeo IL-21 ao qual um anticorpo liga- 5 se imunoespecificamente como determinado por qualquer método bem conhecido na técnica, por exemplo, por imunoensaios. Os epítopos antigênicos não necessitam ser necessariamente imunogênicas. Os “epítopos descontínuos” são epítopos conformacionais formados de pelo menos duas regiões separadas na sequência primária da proteína IL-21. Os epítopos 10 conformacionais perdem a capacidade para ligar-se especificamente na presença de solventes de desnaturação (p°r exemplo, nas análises de western blot).

A presente invenção fornece anticorpos monoclonais e fragmentos de anticorpo que ligam-se especificamente a proteínas IL-21 e -15 polipeptídeos. O IL-21 de polipeptídeo humano e camundongo, proteínas e polinucleotides que codificam os polipeptídeos são divulgados em Parrish- Novak et al., Nature 408:57-63, 2003; Patentes U. S. N°. 6.307.024 e 6.686.178 e 7.250.274. São descritas neste, regiões de definição características estruturais e funcionais (epítopos) da proteína humana IL-21 20 que foi identificada como alvos para um anticorpo monoclonal terapêutico.

Os anticorpos monoclonais IL-21 anti-humanos humanos exemplares são apresentados. Certos destes anticorpos têm a capacidade de ligar o IL-21 humano natural, IL-21 humano do tipo selvagem recombinante, uma proteína IL-21 recombinante mutante e/ou regiões de peptídeo de IL-21 humano. 25 A presente invenção fornece anticorpos anti-IL-21 que são úteis no tratamento terapêutico de doenças autoimunes e inflamatórias. Por exemplo, anticorpos anti-IL-21 são úteis no tratamento de psoríase, pancreatite, diabete tipo I (IDDM), Doença de Graves, doença do intestino inflamatório (IBD), Doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome do intestino irritável, esclerose múltipla, artrite reumatóide, artrite reativa, arrite enteropática, espondiloartropatia, miocardite autoimune, doença de Kawasaki, doença celíaca, uveíte, doença de Behcet, doença da artéria coronária, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), doença pulmonar intersticial, doença 5 muscular inflamatória (polimiosite, dermatomiosite), poliangiite microscópica, anemia aplástica autoimune, tiroidite autoimune, hepatite autoimune, síndrome de Wegener, diverticulose, lúpus eritematoso sistêmico, espondilite ancilosante, escleroderma, esclerose sistêmica, artrite psoriática, osteoartrite, dermatite atópica, vitiligo, doença enxerto versus hospedeiro 10 (GVHD), linfoma de célula T cutânea (CTCL), síndrome de Sjogren, glomerulonefrite, nefropatia de IgA, nefrite autoimune, pênfigo vulgar, miastenia grave, perda de audição autoimune, neuromielite ótica, síndrome de Goodpasture, crioglobulinemia, síndrome de Guillain Barre, polineuropatia desmielinante inflamatória crônica (CIDP), anemia hemolítica autoimune, -15 púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), rejeição ao transplante, pacientes de transplante altamente sensibilizados, síndrome anti-fosfolipídeo, alergia e asma e outras doenças autoimunes ou outras doenças mediadas por IL-21 e agonistas receptores de IL-21.

Cinco classes de imunoglobulina, IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, 20 foram identificados em vertebrados superiores. As proteínas IgG, IgD e IgE são caracteristicamente heterotetrâmeros ligados por bissulfeto que consistem de duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. Tipicamente, o IgM é observado como um pentâmero de um tetrâmero, visto que o IgA ocorre como um dímero de um tetrâmero. As modificações podem ser 25 introduzidas na porção de imunoglobulina.

O IgG compreende a classe principal como está existe normalmente como a segunda proteína mais abundante encontrada em plasma. Em seres humanos, IgG consiste de quatro subclasses, IgGI, IgG2, IgG3 e IgG4 designado. Cada cadeia pesada de imunoglobulina possui uma região cosntante que consiste de domínios de proteína de região constante (CHI, junta, CH2 e CH3) que são invariantes para uma dada subclasse. As regiões constantes de cadeia pesada da classe de IgG são identificadas com o símbolo grego y. Por exemplo, as imunoglobulinas da subclasse IgGl contém 5 uma região constante de cadeia pesada yl.

O fragmento Fc ou o domínio Fc, consiste das regiões de junta de cadeia pesada ligada por bissulfeto, domínios CH2 e CR3. Nas proteínas de fusão de imunoglobulina, os domínios Fc da subclasse IgGl são frequentemente usados como a porção de imunoglobulina, porque o IgGl tem 10 a vida média de soro mais longo de qualquer uma das proteínas de soro. A vida média do soro mais comprido pode ser uma característica de proteína desejável para estudos animais e uso terapêutico humano potencial. Além disso, a subclasse IgGl possui a capacidade mais forte para realizar as funções atuadoras mediadas por anticorpo. A função atuadora primária que ■15 pode ser mais útil em uma proteína de fusão de imunoglobulina é a capacidade para um anticorpo de IgGl para mediar a citotoxicidade celular dependente e anticorpo. Por outro lado, esta pode ser uma função indesejável para uma proteína de fusão que funciona primariamente como um antagonista. Diversos dos resíduos de aminoácido específicos que são 20 importantes para a atividade mediada pela região constante de anticorpo na subclasse de IgGl foram identificados. A inclusão ou a exclusão destes aminoácidos específicos, portanto, permite a inclusão ou a exclusão de atividade mediada por região constante de imunoglobulina específica (ver, Patentes U. S. 5.648.260; 5.624.821). 25 O IgGl Fc humano modificado foi gerado pela criação de proteínas de fusão Fc. Por exemplo, as mutações Fc4, Fc5 e Fc6 para reduzir as funções atuadoras mediadas pelo Fc pela redução da ligação de FcyRI e ligação de Clq complementar são descritas no Pedido de Patente U. S. 2006- 0034852, incorporado por referência aqui, em sua totalidade.

Especificamente, três substituições de aminoácido foram introduzidas para reduzir a ligação de FcyRI. Existem as substituições em posições de índice EU 234, 235 e 237. As substituições nestas posições foram mostradas reduzir a ligação ao FcyRI (Duncan et al., Nature 332:563 (1988)). Estas substituições 5 de aminoácido também podem reduzir a ligação de FcyRIIa, bem como a ligação FcyRIII (Sondermann et al., Nature 406:267 (2000); Wines et al., J. Immunol. 164:5313 (2000)). Estas mutações não alteram a ligação a FcRn, que promove a vida média longa de soro salvando IgG através de um caminho de reciclagem endocítica. 10 Diversos grupos descreveram a relevância de posições de índice de EU 330 e 331 em ligação de Clq complementar e fixação de complemento subsequente (Canfield and Morrison, J, Exp. Med. 173:1483 (1991); Tao et al., J. Exp. Med. 178:661 (1993)). As substituições de aminoácido nestas posições foram introduzidas em in Fc4 para reduzir a -15 fixação complementar. O domínio CR3 de Fc4 é idêntico àqueles encontrados no polipeptídeo do tipo selvagem correspondente, exceto para o códon de interrupção, que foi mudado do TGA para TAA para eliminar um local de metilação de dam potencial quando o DNA clonado está se desenvolvendo em dam mais cepas de E. coli. Em Fc5, o resíduo de arginina na posição de índice 20 de EU 218 é uma lisina e o remanescente da sequência de Fc5 iguala-se com a descrição acima para Fc4.

A presente invenção também inclui anticorpos geneticamente alterados que são funcionalmente equivalentes para os anticorpos descritos acima. Os anticorpos modificados que fornecem a estabilidade melhorada 25 e/ou eficácia terapêutica são preferidos. Os exemplos de anticorpos modificados incluem aqueles com as substituições conservativas de resíduos de aminoácido e uma ou mais anulações ou adições de aminoácidos que não alteram-se de maneira significativamente nociva a utilidade de ligação do antígeno. As substituições podem variar a partir da mudança ou modificações de um ou mais resíduos de aminoácido para completar o reprojeto de uma região contanto que a utilidade terapêutica seja mantida. Os anticorpos da presente invenção podem ser modificados de maneira de pós-trandução (por exemplo, acetilação e fosforilação) ou pode ser modificado de maneira sintética (por exemplo, a ligação de um grupo de rotulação).

Os anticorpos da presente invenção podem ser descritas ou especificadas em termos dos epítopos ou porções de um polipeptídeo IL-21 da presente invenção que estes reconhecem ou ligam-se especificamente. As porções de epítopos ou polipeptídeo podem ser especificadas como descrito neste, por exemplo, pelas posições de terminal N e de terminal C ou por dimensão em resíduos de aminoácido contíguos. Os anticorpos da presente invenção também podem ser descritos ou especificados em termos de sua reatividade cruzada. Os anticorpos que não ligam-se qualquer outro análogo, ortólogo ou homólogo, de um polipeptídeo da presente invenção estão incluídos.

O agrupamento de armazenagem de epítopo refere-se ao uso de ensaios de ligação competitivos para identificar pares de anticorpos que são ou não são capazes de ligar a proteína IL-21 simultaneamente, desse modo, identificando os anticorpos que ligam-se aos mesmos ou epítopos de sobreposição na proteína. As famílias de anticorpos (ou grupos) tendo a mesma especificidade de ligação de sobreposição podem ser então usadas para ajudaer a definir os epítopos específicos em IL-21. Os experimentos de agrupamento de epítopo fornecem evidência que os epítopos antigenicamente distintos estão presentes. Entretanto, por si próprios, estes não identificam ou “mapeiam” o epítopo a uma sequência de aminoácido específica ou localziação na molécula de proteína IL-21.

A competição para a ligação pode ser avaliada para qualquer par de anticorpos ou fragmentos. Por exemplo, usando-se os reagentes de detecção apropriada, a especificidade de ligação de anticorpos ou fragmentos de ligação de quaisquer espécies/fontes pode ser comparada com a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais divulgados nestes. O agrupamento de epítopo pode ser realizado com os “anticorpos isolados” ou com os sobrenadantes de cultura celular. Frequentemente, o agrupamento é 5 realizado com a primeira série de sobrenadantes clonais para guiar as escolhas de clones a serem desenvolvidas ainda. Os anticorpos a serem comparadas deve ter substancialmente os domínios de ligação de antígeno homogêneo. No caso de anticorpos “biespecíficos” ou “bifuncionais”, a especificidade de ligação de locais de ligação diferentes dos dois locais de ligação diferente 10 necessários para serem avaliados ou agrupados de maneira independente.

A presente invenção caracteriza os anticorpos específicos de ligando. Além da ligação competitiva de anticorpos, o agrupamento de epítopo também podem ser usados para identificar anticorpos a um receptor ou um ligando que interfere competitivamente com a ligação de um ligando a -15 seu receptor ou a ativação mediada por ligando de seu receptor.

Frequentemente, as propriedades favoráveis, de uma família (ou grupo) de anticorpos podem ser correlacionados com uma ligação a um epítopo específico definido pelo agrupamento de epítopo.

Os experimentos de ligação competitivos não medem 20 diretamente a afinidade de ligação, entretanto, os anticorpos a serem testados devem ligar-se de maneira suficientemente forte para atuar como competidores. Em geral, as condições experimentais são projetadas para minimizar os efeitos de diferenças na afinidade de ligação.

Os anticorpos anti-IL-21 também podem ser úteis nos ensaios 25 de diagnóstico para proteína IL-21, por exemplo, detectar sua expressão em células, tecidos ou soro específicos. Os anticorpos indicados a grupos diferentes e capazes de ligar a porções imunogênicas diferentes ou epítopos de IL-21 podem ser usados como os reagentes para ensaios sandwich. Em um ensaio sandwich, o analito da amostra de teste é capturado por um primeiro anticorpo que é imobilizado em um suporte sólido e, a seguir, detectado por um segundo anticorpo que também liga-se ao analito, desta maneira formando um complexo de três partes insolúvel. Ver, por exemplo, Pat. U. S. N° 4,376,110. O segundo anticorpo pode ser, por si próprio, rotulado com uma 5 porção detectável (ensaios de sandwich diretos) ou pode ser medido usando- se um anticorpo anti-imunoglobulina que é rotulado com uma porção detectável (ensaio de sandwich indireto). Por exemplo, um tipo de ensaio de sandwich é um ensaio de ELISA, caso no qual a porção detectável é uma enzima. 10 Os anticorpos da presente invenção podem ser estimados quanto à ligação específica por qualquer método conhecido na técnica. Muitos formatos de ensaio de ligação competitivos diferentes podem ser usados para o agrupamento de apítopo. Os imunoensaios que podem ser usados incluem, mas não são limitados a, sistemas de ensaio competitivos e não competitivos -15 usando-se técnicas, tais como western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado por enzima), imunoensaios “sandwich”, ensaios de imunoprecipitação, reações de precipitina, reações de precipitina de difusão de gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, os ensaios de fixação de complemento, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios 20 fluorescentes, imunoensaios de proteína A, para nomear alguns. Tais ensaios são de rotina e bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York). Os imunoensaios exemplares são descritos resumidamente abaixo (mas não são pretendidos por meio de limitação). 25 adicioalmente, um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como aqueles descritos em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988), pode ser realizado.

O BIACORE® (GE Healthcare, Piscataway, NJ) é apenas um de uma variedade de formatos de ensaio de ressonância de plasmon de superfície que são rotineiramente usados para os painéis de agrupamento de epítopo de anticorpos monoclonais. Muitas referências (por exemplo, The Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, Volume 66 Glenn E. Morris ed. Humana Press, 1996) descreve os métodos alternativos 5 que podem ser usados para agrupar os anticorpos e deve ser esperado fornecer a informação comparável com respeito à especificidade de ligação dos anticorpos para a proteína IL-21. Quando usando-se o sistema BIACORE®, os experimentos de agrupamento de epítopo são realizados com antígeno solúvel, natural ou recombinante. Os estudos de agrupamento de epítopo '10 podem ser realziados em um sistema BIACORE 1000® (GE Healthcare, . Piscataway, NJ). O software BIAlogue® v. 1.2 pode ser usada para programar os métodos de funcionamento. Para o exemplo de usar o BIACORE® para agrupar os anticorpos monoclonais de camundongos evocados contra IL-21. O anticorpo de IgG Fc anti-camundongo de cabra policlonal (Jackson -15 ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) pode ser covalentemente imobilizado a um chip sensor de CM5 BIACORE® e usado para agrupar (capturar) o anticorpo monoclonal primário de séries de teste ao chip. Os locais de ligação de Fc não ocupados no chip são então bloqueados usando-se um fragmento de IgG Fc policlonal (Jackson ImmunoResearch Laboratories, 20 West Grove, PA). Subsequentemente, a proteína IL-21 é injetada e deixada ligar-se especificamente ao anticorpo monoclonal primário capturado. O instrumento BIACORE® mede a massa da proteína ligada ao chip de sensor e a ligação tanto do anticorpo primário quanto o antígeno de IL-21 pode ser verificado para cada ciclo. Seguindo a ligação do anticorpo primários e 25 antígeno ao chip, o anticorpo secundário solúvel é injetado e deixado ligar-se ao antígeno pré-ligado. Se o anticorpo monoclonal secundário é capaz de ligar o antígeno IL-21 simultaneamente com o anticorpo monoclonal primário, sua ligação é detectada pelo BIACORE®. Se, entretanto, o anticorpo monoclonal secundário não é capaz de ligar o antígeno IL-21 simultaneamente com o anticorpo monoclonal primário, nenhuma ligação adicional é detectada. Cada anticorpo monoclonal é testado contra si próprio como um controle negativo para estabelecer o nível do sinal fundamental (sem ligação).

Um formato ELISA competitivo isento de rótulo (LFC- 5 ELISA) também podem ser usados para agrupar os anticorpos. Este método é descrito por Nagata et al., J. Immuno Methods 292:141-155, 2004. Este método para o agrupamento de epítopo utilizou o IL-21 biotinilado. Para o exemplo de agrupamento de anticorpos monoclonais de camundongo evocado contra IL-21, as placas microtituladoras são revestidas em 100 μl/reservatorio '10 com 1 μg/ml de anticorpo específico de IgG Fc-y of a anti-camundongo de cabra (Jackson ImmunoResearch) diluído em ELISA B (PBS, 0,1 % de Tween 20, 1 % de BSA). Após a ligação deste anticorpo de revestimento por 3 horas em temperatura ambiente, cada meio condicionado contendo mAb é diluído em ELISA B para a produção de uma concentração de mAb -15 aproximada de 0,5 μg/ml e deixado ligar às placas revestidas com IgG anti- camundongo de cabra durante a noite a 4o C (mAb#l). Em paralelo, uma segunda série de meios condicionados (mAb#2) é diluída em tubos de teste de poliestireno por aproximadamente 0,5 μg/ml de mAb em ELISA B, misturado com 50 ng/ml de antígeno IL-21 biotinilado e incubado durante a noite em 4o 20 C. Após a incubação de mAb#l com o anticorpo de revestimento, as placas são bloqueadas com um anticorpo não relacionado para saturar os locais de ligação não ocupados na placa. As misturas mAb#2-biotin-IL-21 são adicionadas às placas e deixadas ligar. Como um controle para (não competição) no ensaio, 50 ng/ml de IL-21 biotinilado são adicioandos 25 diretamente (sem a pré-incubação com mAb#2) aos reservatórios contendo mAb#l imobilizado. Após a incubação com o complexo de biotininilado-IL- 21-mAb#2, estreptavidina-HRP (Pierce, Rockford, IL) é adicionado à placa em 0,5 μg/ml. as placas são desenvolvidas com o substrato TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e a absorbância dos reservatórios individuais a 450 nm é medida com um leitor de placa (Molecular Devices SPECTRAMAX®340, Sunnyvale, CA). Se o mAb#l liga-se ao epítopo diferente de mAb#2, o complexo de biotin-IL-21-mAb#2 irá ligar-se à placa resultando em uma leitura de absorbância alta. Se o mAb#l ligar-se ao 5 mesmo epítopo como mAb#2, o complexo de biotin-IL-21-MAb#2 não irá ligar-se à placa resultando em uma leitura de absorbância alta.

Os anticorpos específicos de ligando da presente invenção podem ligar-se simplesmente a ou atuar como antagonistas de IL-21. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos que não interrompem as 10 interações receptor/ligando do IL-21 parcial ou totalmente. A invenção caracteriza os anticorpos específicos de ligando que evitam a ativação do receptor. A invenção inclui a neutralização dos anticorpos que ligam-se ao ligando e evita a ligação do ligando ao receptor, bem como anticorpos que ligam-se ao ligando, desse modo evitando a ativação do receptor, mas não -15 evita que o ligando ligue o receptor. A ativação do receptor (isto é, sinalização) pode ser determinada pelas técnicas descritas neste ou de outra maneira conhecida na técnica. Por exemplo, a ativação do receptor pode ser determinada pela detecção da fosforilação (por exemplo, tirosina ou serina/treonina) do receptor ou seu substrato pela imunoprecipitação seguido 20 peça análise de western blot ou com base em luminex (por exemplo, como descrito supra). Nas formas de realização específicas, os anticorpos são fornecidos inibindo a atividade do ligando ou do receptor por pelo menos 90 %, pelo menos 80 %, pelo menos 70 %, pelo menos 60 % ou pelo menos 50 % da atividade na ausência do anticorpo. 25 Produção de Anticorpos Anti-IL-21

Os anticorpos para IL-21 podem ser gerados, por exemplo, usando-se a proteína que é o produto de um vetor de expressão IL-21 ou IL- 21 isolado de uma fonte natural como um antígeno. Os anticorpos anti-IL-21 da presente invenção “ligam-se especificamente” a IL-21. Os anticorpos são considerados serem especificamente ligação se os anticorpos apresentarem pelo menos uma das seguintes duas propriedades: (1) os anticorpos ligam-se a IL-21 com um nível de limiar de atividade de ligação e (2) os anticorpos não reagem de maneira significante com os polipeptídeos relacionados com IL-21. 5 Os polipeptídeos relacionados podem incluir aqueles de outros membros das citocinas do tipo 1 que ligam os receptores contendo acadeia de gama comum (yc), tais como IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15.

Com respeito à primeira característica, os anticorpos ligam-se especificamente e sua ligação a um polipeptídeo, peptídeo ou epítopo de IL- '10 21 com uma afinidade de ligação como refletido nas constantes de afinidade medidas. Para determinar as caracerísticas de afinidade, as medições das cosntantes de taxa cinética, as constantes de associação de equilíbrio e as constantes de dissociação de euilíbrio foram estimadas para a interação de antagonistas de IL-21 com o antígeno de IL-21 por intermédio da ressonância -15 de plasmon de superfície. A constante da taxa de associação (ka (NT’s’1)) é um valor que reflete a taxa da formação do complexo de agonista de antígeno. A constante da taxa de dissociação (ka (s’1)) é um valor que reflete a estabilidade deste complexo. A afinidade de ligação de equilíbrio é tipicamente expressada como uma constante de euilíbrio de dissociação (KD (M)) ou uma constante 20 de equilíbrio de dissociação (KA (M’1)). O KD é obtido pela divisão da constante de taxa de dissociação pela constante de taxa de associação (kd/ka), enquanto o KA é obtido pela divisão da constante da taxa de associação pela constante da taxa de dissociação (ka/kd). Os antagonistas com KD similar (ou um KA similar) podem ter constantes de taxa de associação e de dissociação 25 amplamente variáveis. Consequentemente, a medição do ka e do kj bem como do KA OU KD ajuda a descrever mais unicamente a afinidade da interação de antagonista-antígeno. A afinidade preferida de um um anticorpo é refletida em um KA (constante de associação de equilíbrio) de 106 M’1 ou maior, preferivelmente 107 M’1 ou maior, mais preferivelmente 108 M’1 ou maior e mais preferivelmente 109 M'1 ou maior. A afinidade de ligação de um anticorpo pode ser facilmente determinada por uma pessoa habilitada na técnica, por exemplo, pela análise de Scatchard (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660, 1949) ou usando-se um instrumento de bio-sensor 5 comercialmente disponível. Com respeito à segunda característica, os anticorpos não reagem de maneira significante com as moléculas de polipeptídeo relalcionadas, por exemplo, se estes detectarem o IL-21, mas não outros polipeptídeos conhecidos usando-se uma análise de Western blot padrão ou capturar ELISA. Os exemplos de polipeptídeos relacionados '10 conhecidos incluem membros conhecidos da família de IL-2 à qual o IL-21 « pertence (por exemplo, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15).

Os anticorpos monoclonais anti-IL-21 podem ser produzidos usando-se peptídeos e polipeptídeos que carregam epítopo de IL-21 antigênico. Os anticorpos da presente invenção ligam os peptídeos e os -15 polipeptídeos que carregam epítopo antigênico contendo uma sequência de pelo menos nove ou entre 15 e cerca de 30 aminoácidos contidos dentro da SEQ ID N°: 2 ou outra sequência de aminoácido divulgada neste. Entretanto, os peptídeos ou polipeptídeos que compreende uma porção maior de uma sequência de aminoácido contendo de 30 a 50 aminoácidos ou qualquer 20 comprimento até e incluindo a sequência de aminoácido inteira de um polipeptídeo também são úteis para induzir os anticorpos que ligam-se com IL-21. E desejável que a sequência de aminoácido do peptideo que carrega epítopo seja selecionada para fornecer solubilidade substancial em solventes aquosos (isto é, a sequência inclui resíduos relativamente hidrofílicos, 25 enquanto os resíduos hidrofóbicos são tipicamente evitados). Além disso, as sequências de aminoácido contendo resíduos de prolina também podem ser desejáveis para a produção de anticorpo em grande escala.

Os anticorpos monoclonais anti-IL-21 podem ser gerados pelos métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Os anticorpos monoclonais de roedor para antígenos específicos podem ser obtidos por métodos conhecidos (ver, por exemplo, Kohler et al., Nature 256:495 (1975), Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, pages 2.5.1- 2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) [“Coligan”], Picksley et al., “Production of 5 monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli,” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2o Edição, Glover et al. (eds.), página 93 (Oxford University Press 1995)).

Os anticorpos da invenção podem ser produzidos por quaisquer métodos conhecidos na técnica para a síntese de anticorpos, em '10 particular, pela síntese química ou, preferivelmente, pelas técnicas de w expressão recombinantes. A expressão recombinante de um anticorpo da invenção ou fragmento, derivado ou análogo deste, por exemplo, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo da invenção, requer a construção de um vetor de expressão contendo um polinucleotídeo que codifica o anticorpo. Uma vez -15 que um polinucleotídeo que codifica uma molécula de anticorpo ou uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo ou porção deste (preferivelmente contendo o domínio variável de cadeia pesada ou leve), da invenção foi obtido, o vetor para a produção da molécula de anticorpo pode ser produzido pela tecnologia de DNA recombinante usando-se técnicas bem conhecidas na 20 técnica. Desta maneira, os métodos para a preparação de uma proteína pela expressão de um polinucleotídeo contendo um anticorpo que codifica a sequência de nucleotídeo são descritos neste. Os métodos que são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão contendo as sequências codificadoras de anticorpo e 25 sinais de conrole de transcrição e de tradução apropriados. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinantes in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. A invenção, desta maneira, fornece vetores replicáveis que compreendem uma sequência de nucleotídeo que codifica uma molécula de anticorpo da invenção ou uma cadeia pesada ou leve desta ou um domínio cariável de cadeia pesada ou leve, operacionalmente ligado a um promotor. Tais vetores podem incluir a sequência de nucleotídeo que codifica a região constante da molécula de anticorpo (ver, por exemplo, publicação PCT WO 86/05807; publicação PCT 5 WO 89/01036 e Pat. U. S. N° 5,122,464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado em um tal vetor para a expressão da cadeia pesada ou leve total. O vetor de expressão é transferido a uma célula hospedeira pelas técnicas convencionais e as células transfectadas são então cultivadas '10 por técnicas convencionais para produzir um anticorpo of a invenção. Desta w maneira, a invenção inclui células hospedeiras contendo um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da invenção ou uma cadeia leve ou pesada deste, operacionalmente ligado a um promotor heterólogo. Nas formas de realização preferidas para a expressão de anticorpos de cadeia dupla, os vetores que -15 codificam tanto as cadeias pesadas quanto leves podem ser co-expressados na célula hospedeira para a expressão da molécula de imunoglobulina total, como detalhado abaixo.

Uma variedade de sistemas de vetor de expressão de hospedeiro podem ser utilizados para expressar as moléculas de anticorpo da 20 invenção. Tais sistemas de expressão de hospedeiro representam veículos pelos quais as sequências codificadoras de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também representa células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências codificadoras de nucleotídeo apropriadas, expressam uma molécula de anticorpo da invenção 25 in situ. Estes incluem mas não são limitados a microorganismos, tais como bactérias (p°r exemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas com o DNA de bacteriofago recombinante, vetores de expressão de DNA de plasmídeo ou de DNA de cosmídeo contendo sequências codificadoras de anticorpo; levedura (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformado com os vetores de expressão de levedura recombinantes contendo sequências codificadoras de anticorpo; os sistemas celulares de inseto com vetores de expressão recombinane (por exemplo, baculovírus) contendo sequências codificadoras de anticorpo; sistemas celulares vegetais infectados com vetores de expressão 5 de vúris recombinante (por exemplo, vírus mosáico de couve-flor, CaMV; vírus mosaico do tabaco, TMV) ou transformado com vetores de expressão de plasmídeo recombinantes (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo sequências codificadoras de anticorpo ou sistemas celulares de mamífero (por exemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 3T3 cells) que abrigam construções de 10 expressão recombinante contendo promotores derivados do genoma de células de mamífero (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamífero (por exemplo, MPSV, CMV, o promotor posterior de adenovirus; o promotor de 7,5 K do vírus vaccinia). Preferivelmente, as células bacterianas, tais como Escherichia coli e mais preferivelmente, células eucarióticas, -15 especialmente para a expressão de molécula de anticorpo recombinante total, são usados para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante. Por exemplo, células de mamífero, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), em conjunção com um vetor, tal como o lemento de promotor de gene precoce intermediário principal de citomegalovírus humanos, intensificador 20 de CMV ou promotor de MPSV é um sistema de expressão eficaz para anticorpos (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et at., 1990, Bío/Technology 8:2).

Nos sistemas bacterianos, diversos vetores de expressão podem se vantajosamente selecionados dependendo do uso pretendido para a 25 molécula de anticorpo sendo expressada. Por exemplo, quando uma grande quantidade de uma tal proteína deve ser produzida, para a geração de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, os vetores que direcionam a expressão de níveis altos de produtos de proteína de fusão que são facilmente purificados podem ser desejáveis. Tais vetores incluem, mas não limitam-se ao vetor de expressão de E. coli pUR278 (Ruther et at., 1983, EMBO J. 2:1791), em que a sequênci de anticorpo pode ser ligada individualmente no vetor na estrutura com a região codificadora de lacZ de modo que uma proteína de fusão é produzida; os vetores pIN (Inouye & 5 Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109, 1985; Van Heeke & Schuster, J.Biol. Chem. 24:5503-5509, 1989) e outros. Os vetores pGEX também podem ser usados para expressar os polipeptídeos estranhos como proteínas de fusão com a glutationa S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir das células lisadas pela 10 absorção e ligação à pérolas de glutationa-agarose de matriz seguido pela elução na presença de glutationa livre. Os vetores de pGEX são projetados para incluir trombina ou locais de divagem de protease de Xa de modo que o produto de gene alvo clonado pode ser liberado a partir da proteína de GST.

Em um sistema de inseto, o vírus de poliedrose nuclear de -15 Autographa californica (AcNPV) é usada como um vetor para expressar os genes estranhos. O vírus desenvolve-se as células de Spodoptera frugiperda. A sequência codificadora de anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (p°r exemplo, o gene de poliedrina) do vírus e colocado sob o controle de um promotor de AcNPV (por exemplo, o 20 promotor de poliedrina).

Em células hospedeiras de mamíferos, um número de sistemas de expressão a base de vírus pode ser usado. Em casos em que o adenovirus é usado como um vetor de expressão, a sequência codificadora de anticorpo de interesse pode ser ligada ao complexo de controle de transcrição/translação de 25 adenovirus, p.ex. o último promotor e sequência de guia do tripartido. Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma do adenovirus por recombinação in vitro ou in vivo. Inserção em uma região não-essencial do genoma virai (p.ex. região El ou E3) resultará em um vírus recombinante que é viável e capaz de expressar a molécula de anticorpo em hospedeiros infectados, (p.ex. ver Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:355- 359, 1984). Sinais de iniciação específicos podem também ser requeridos para tradução eficiente de sequências que codificam anticorpos inseridos. Estes sinais incluem o códon de iniciação ATG e sequências adjacentes. Além do 5 mais, o códon de iniciação deve estar na fase com o quadro de leitura da sequência de codificação desejada para assegurar tradução de todo inserido. Estes sinais de controle translacionais exógenos e códons de iniciação podem ser de uma variedade de origens, ambas natural e sintética. A eficiência da expressão pode ser intensificada pela inclusão de elementos intensificadores 10 de transcrição apropriados, terminadores de transcrição, etc. (ver Bittner et AL„ Methods in Enzymol. 153:51-544, 1987).

Além disso, uma cepa de célula hospedeira pode ser escolhida modulando a expressão das sequências inseridas ou modifica e processa o produto genético da maneira específica desejada. Tais modificações (p°r -15 exemplo, glicosilação) e processamento (p°r exemplo, clivagem) de produos de proteína podem ser importantes para a função da proteína. As células hospedeiras diferentes têm mecanismos característicos e específicos para o processamento e modificação pós-tradução de proteínas e produtos genéticos. As linhas celulares apropriadas ou os sistemas hospedeiros podem ser 20 escolhidos para garantir a modificação e processamento corretos da proteína estranha processada. Para este fim, as células hospedeiras eucarióticas que possuem o maquinário celular para o processamento apropriado da transcrição primária, glicosilação e fosforilação do produto genético podem ser usadas. Tais células hispedeiras de mamífero incluem, mas não são limitados a CHO, 25 VERO, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 e em particular, linhas celulares de câncer de mama tais como, por exemplo, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 e T47D e célula de glândula mamária normal, tal como, por exemplo, CRL7030 e Hs578Bst.

Para a produção de rendimento alto de longo prazo de proteínas recombinantes, a expressão estável é preferida. Por exemplo, as linhas celulares que expressam estavelmente a molécula de anticorpo podem ser projetadas. Em vez de usar vetores de expressão contém origens de replicação, as células hospedeiras pdoem ser transformadas com DNA 5 controlado pelos elementos de controle de expressão apropriados (p°r exemplo, promotor, intensificador, sequências, terminadores de transcrição, locais de poliadenilação, etc.) e um gene marcador selecionável. Seguindo a introdução do DNA extranho, as células projetadas podem ser deixadas desenvolver por 1 a 2 dias m um meio enriquecido e então são trocados por 10 um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e deixa as células integrarem estavelmente o plasmídeo em seus cromossomos e desenvolvem-se para formar os focos que, por sua vez podem ser clonados e expandidos nas linhas celulares. Este método pode ser vantajosamente usado para projetar as linhas celulares que -15 expressa a molécula de anticorpo. Tais linhas celulares projetadas podem ser particularmente úteis na triagem e avaliação de compostos que interagem direta ou indiretamente com a molécula de anticorpo.

Diversos sistemas de seleção podem ser usados, que indue mas não limitam-se à timidina cinase de vírus simples da herpes (Wigler et 20 al., Cell 11:223, 1977), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (Szybalska & Szybalski, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 48:202, 1992) e genes de adenina fosforibosiltransferase (Lowy et al., Cell 22:817, 1980) genes podem ser utilizados em células tk, hgprt ou aprt, respectivamente. Também, a resistência antimetabólito podem ser usados como a base de seleção para os 25 seguintes genes: dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:357, 1980; O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527, 1981); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072, 1981); neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo G-418 (Wu and Wu, Biotherapy 3:87- 95, 1991; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596, 1993; Mulligan, Science 260:926-932, 1993 e Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217, 1993; TIB TECH 11(5): 155-215), maio de 1993 e higro, que confere resistência à higromicina (Santerre et al., Gene 30:147, 5 1984). Os métodos comumente conhecidos na técnica de tecnologia de DNA recombinante que podem ser usados são descritos em Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY e nos Capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, 10 Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre- Garapin et al., J. Mot. Biol. 150:1, 1981; que são incorporados por referência neste em suas totalidades.

Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podem ser aumentados pela amplificação de vetor (para revisão, ver, Bebbington and -15 Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987)). Quando um marcador no sistema de vetor que expressa o anticorpo é amplificáveis, aumento no nível de inibidor presente na cultura de célula hospedeira aumentará o número de cópias do gene marcador. Visto que 20 a região amplificada é associada com o gene de anticorpo, produção do anticorpo também aumentará (Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257, 1983).

A célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois vetors de expressão da invenção, o primeiro vetor que codifica um polipeptídeo derivado de cadeia pesada e o segundo vetor que codifica que codifica um 25 polipeptídeo derivado de cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores selecionáveis idênticos que permitem a expressão igual de polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Altemativamente, um vetor simples pode ser usado codificando tanto polipeptídeos de cadeia pesada e leve, em tais situações, a cadeia leve deve ser colocada antes da cadeia pesada para evitar um um excesso de cadeia pesada livre tóxica (Proudfoot, Nature ' 322:52, 1986; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197, 1980). As sequências codificadoras para as cadeias pesadas e leves podem compreender cDNA ou DNA genômico. 5 Uma vez que uma molécula de anticorpo da invenção foi recombinantemente expressada, esta pode ser purificada por qualquer método conhecido na técnica para purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (p°r exemplo, troca iônica, afinidade, particularmente pela afinidade quanto ao antígeno específico após a Proteína 10 A e dimensionamento de cromatografia de coluna), centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Para os usos particulares, pode ser desejável preparar fragmentos de anticorpos anti-IL-21. Tais fragmentos de anticorpo podem ser -15 obtidos, por exemplo, pela hidrólise proteolítica do anticorpo. Os fragmentos de anticorpo podem ser obtidos pela digestão de pepsina ou papaína de anticorpos totais pelos métodos convencionais. Como uma ilustração, os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos pela clivagem enzimática de anticorpos com pepsina para fornecer um fragmento 5S denominado F(ab')2. 20 Este fragmento ainda pode ser clivado usando-se um agente redutor de tiol para produzir fragmentos monovalentes de 3,5S Fab'. opcionalmente, a reação de clivagem pode ser realizada usando-se um grupo de bloqueio para os grupo sulfidrila que r esulta da clivagem de ligações de bissulfeto. Como uma alternativa, uma clivagem enzimática usando-se pepsina produz dois 25 fragmentos Fab monovalentes e um fragmento Fc diretamente. Estes métodos são descritos, por exemplo, por Goldenberg, patente U. S. N° 4.331.647, Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J, 73:119, 1959; Edelman et al., em Methods in Enzymology Vol. 1, page 422 (Academic Press 1967) e por Coligan nas páginas 2.8.1-2.8.10 e 2.10.-2.10.4.

Outros métodos de clivar os anticorpos, tais como separação de cadeias pesadas para formar fragmentos de cadeia leve-pesada monovalentes, clivagem adicional de fragmentos ou outras técnicas enzimáticas, química ou genéticas também podem ser usadas, de modo que os 5 fragmentos ligam-se ao antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto.

Por exemplo, os fragmentos Fv compreendem uma associação de cadeias VH e VL. Esta associação pode ser não covalentes, como descrito por Inbar et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659, 1972. Altemativamente, as cadeias variáveis podem ser ligadas por uma ligação de biassulfeto 10 intermolecular ou reticulado por produtos químicos, tais como glutaraldeído (ver, por exemplo, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992).

Os fragmentos de Fv podem compreender as cadeias VH e VL que são conectados por um ligador de peptideo. Estas proteínas de ligação de antígeno simples (scFv) são preparadas pela construção de um gene estrutural -15 que compreende sequências de DNA que codificam os domínios VH e VL que são conectados por um oligonucleotídeo. O gene estrutural é inserido em um vetor de expressão que é subsequentemente introduzido em uma célula hospedeira, tal como E. coli. As células hospedeiras recombinantes sintetizam uma cadeia de polipeptídeo com uma ligação em ponte de peptideo ligador 20 dos dois domínios V. Os métodos para produzir os scFvs são descritos, por exemplo, por Whitlow et ah, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 (1991) (também ver, Bird et al., Science 242:423, 1988, Ladner et al., Patente U. S. N°. 4.946.778, Pack et al., Bio/Technology 11:1271, 1993 e Sandhu, supra). 25 Também é possível construir as estruturas alternativas usando- se uma coleta de proteínas monoméricas para formar um domínio de monômero. Estes domínios monoméricos pdoem ser pequenos o bastante para penetrar os tecidos. Os domínios monoméricos podem ser variantes de ocorrência natural ou nãio naturais ou combinações destes. Os domínios monoméricos podem formar multímeros de dois ou mais domínios. O domínio monomérico liga uma posição, os análogos aos epítopos descritos neste, em uma molécula alvo. Em alguns casos, o multímero pode ser formado a partir de uma variedade de domínios monoméricos. (Ver, por 5 exemplo, Pedido de Patente U. S. 2004-0132028 e Pedido de Patente U. S. 2006-0177831.)

Os anticorpos da presente invenção incluem derivados que são modificados, isto é, pela ligação de qualquer tipo de molécula ao anticorpo, tal que a ligação covalente não evita a ligação ao anticorpo ao IL-21 10 ouativação de receptor de bloqueio. Por exemplo, mas não por meio de limitação, os derivados de anticorpo incluem anticorpos que foram modificados, por exemplo, pela glicosilação, acetilação, pegilação, fosfilação, amidação, derivatização pelos grupos de proteção/bloqueio de proteção, clivagem proteolítica, ligação a um ligando celular ou outra proteína, etc. -15 qualquer uma das modificações químicas numerosas pode ser realizadas por técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitado à clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos. 20 Um anticorpo anti-IL-21 pode ser conjugado com um rótulo detectável para formar um imunoconjugado de anti-IL-21. Os rótulos selecionáveis adequados incluem, por exemplo, um radioisótopo, um rótulo fluorescente, um rótulo quimioluminescente, um rótulo de enzima, um rótulo bioluminescente ou ouro coloidal. Os métodos de fabricar e detectar tais 25 imunogonjugados detectavelmente rotulados são bem conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica e são descritos em mais detalhes abaixo. O rótulo detectável pode ser um radioisótopo que é detectado pela auto- radiografia. Os isótopos que são particularmente úteis para o propósito da presente invenção são 3H, 1251, 1311,35S e 14C.

Os imunoconjugados anti-IL-21 também podem ser rotulados com um composto fluorescente. A presença de um anticorpo fluorescentemente rotulado é determinado pela exposição do imunoconjugado à luz do comprimento de onda apropriado e detecção da fluorescência 5 resultante. Os compostos de rotulação fluorescente incluem isotiocianato de fluoresceina, rodamina, ficoeriterina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído, alexapigmentos, não partículas fluorescentes (p°r exemplo, pontos Q) e fluorescamina.

Também é possível que os imunoconjugados de anti-IL-21 10 podem ser detectavelmente rotulados pela ligação de um componente de anticorpo a um composto quimioluminescente. A presença de imunoconjugado rotulado quimioluminescentente é determinado pela detecção da presença de luminescência que aumentam durante o curso de uma reação química. Os exemplos de compostos de rotulação -15 quimioluminescentes incluem luminol, isoluminol, um éster de acridínio aromático, um imidazol, um sal de acridínio e um éster de oxalato.

Similarmente, um composto bioluminescente pode ser usado para rotular os imunoconjugados de anti-IL-21 da presente invenção. A bioluminescência é um tipo de quimioluminescência encontrada em sistemas 20 biológicos em que uma proteína catalítica aumenta a eficiência da reação quimioluminescente. A presença de uma proteína bioluminescente é determinada pela detecção da presença de luminescência. Os compostos bioluminescentes que são úteis para rotulação inclui luciferina, luciferase e aequorin. 25 Altemativamente, os imunoconjugados anti-IL-21 podem ser detectavelmente rotulado pela ligação de um componente de anticorpo anti- IL-21 a uma enzima. Quando o conjugado de anzima anti-IL-21 é incubado na presença do substrato apropriado na presença do substrato apropriado, a porção de enzima reage com o substrato para produzir uma porção química que pode ser detectado, por exemplo, por meios espectrofotométrico, fluorométrico ou visuais. Os exemplos de enzimas que podem ser usadas para rotular detectavelmente os imunoconjugados poliespecíficos incluem β- galactosidase, glicose oxidase, peroxidase e alcalino fosfatase. 5 Aqueles habilitados na técnica conhecerão outros rótulos adequados que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção. A ligação de porções marcadoras aos anticorpos anti-IL-21 podem ser realizados usando-se técnicas padrão nas técnicas padrão conhecidas na técnica. A metodologia típica neste respeito é descrito pelo seguinte: Kennedy et al., 10 Clin. Chim. Acta 70:1, 1976; Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1, 1977; Shih et al., Inti J. Cancer 46:1101, 1990; Stein et al., Cancer Res. 50:1330, 1990 e Coligan, supra.

Além disso, a conveniência e a versatilidade de detecção imunoquímica pode ser intensificada usando-se anticorpos anti-IL-21 que -15 foram conjugados com avidina, estreptavidina e biotina (ver, por exemplo, Wilchek et al. (eds.), “Avidin-Biotin Technology,” Methods In Enzymology, Vol. 184 (Academic Press 1990) e Bayer et al., “Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology,” in Methods In Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), páginas 149 a 162 (The Humana Press, Inc. 20 1992).

Os métodos para realizar imunoensaios são bem estabelecidos. Ver, por exemplo, Cook and Self, “Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays”, em Monoclonal Antibodies: Production, Engineering e Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), pages 180-208, (Cambridge 25 University Press, . 1995), Perry, “The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology,” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch and Lennox (eds.), páginas 107 a 120 (Wiley-Liss, Inc. 1995) e Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996).

Os anticorpos e o fragmentos destes tendo vidas médias in vivo aumentadas podem ser gerados por técnicas conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, anticorpos ou fragmentos destes com vidas médias in vivo aumentadas podem ser gerados pela modificação (p°r 5 exemplo, substituição, anulação ou adição) de resíduos de aminoácido identificados como envolvido na interação entre o domínio Fc e o receptor FcRn (ver, por exemplo, Publicação Internacional N° WO 97/34631 e WO 02/060919, que são incorporados nestes por referência em suas totalidades). Os anticorpos ou fragmentos destes com vidas médias in vivo aumentadas 10 podem ser gerados pela ligação aos ditos anticorpos ou fragmentos de moléculas poliméricas de anticorpos, tais como polietileno glicol de peso molecular alto (PEG). O PEG pode ser ligado aos ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpo com ou sem um ligador multifuncional através da conjugação específica de local do PEG, por exemplo, ao terminal N ou Cdos -15 ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpos ou por intermédio de grupos épsilon-amino presentes em resíduos de lisina. A derivatização de polímero linear ou ramificado que resulta na perda mínima de atividade biológica será usada. O grau de conjugação serão intimamente monitorados por SDS-PAGE e espectroscopia de massa para garantir a conjugação apropriada de moléculas 20 PEG aos anticorpos. O PEG não reagido pode ser separados dos conjugados de anticorpos PEG por, por exemplo, exclusão de tamanho ou cromatografia de troca iônica.

Composições Farmcêutícas

A presente invenção ainda inclui composições farmacêuticas, 25 que compreende um carregador farmaceuticamente aceitável e um polipeptídeo ou anticorpo descritos neste. A composição farmacêutica pode incluir agentes terapêuticos adicionais, que incluem, mas não limitam-se a agentes citotóxicos, uma citotoxina, por exemplo, um agente citostático ou citocida, um agente terapêutico ou um íon de metal radioativo. Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja nocivo às células. Os exemplos incluem paclitaxol, citocalasina B, gramicidin D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina, daunorubicina, diidróxi antracino 5 diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos destes. Os agentes terapêuticos incluem, mas não são limitados a, antimetabólitos (p°r exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6- tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (por 10 exemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorubicina (isto é daunomicina) e doxorubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (isto é actinomicina), -15 bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)) e agentes anti-mitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina). Por exemplo, uma composição farmacêutica pode compreender uma proteína ou polipeptídeo que possui uma atividade biológica desejada. Tais protéinas podem incluir, por exemplo, uma toxina, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas ou toxina da 20 difteria; uam proteína, tal como fator de necrose de tumor, oc-IFN, β-IFN, fator de desenvolvimento de nervo, fator de desenvolvimento derivado de plaqueta, ativador de plasminogênio de tecido, um agente trombótico ou um agente anti-angiogênico, por exemplo, angiostatina ou endostatina ou modificadores de resposta biológica, tais como, por exemplo, linfocinas, 25 interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), fator estimulador da colônia de macrófago de granulócito (GM-CSF), fator estimulador da colônia de granulócito (G-CSF), anticorpos designado para antagonizar os modificadores de resposta biológica, outros anticorpos, outras proteína de fusão Fc ou outros fatores de desenvolvimento.

Para os propósitos de terapia, moléculas de anticorpo anti-IL- 21 e um carregador farmaceuticamente aceitável são administrados a um paciente em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Uma combinação de uma molécula terapêutica da presente invenção e um carregador 5 farmaceuticamente aceitável é dito ser administrado em uma “quantidade terapeuticamente eficaz” se a quantidade administrada for fisiologicamente significante. Um agente é fisiologicamente significante se sua presença resultar em uma mudança detectável na fisiologia de um paciente receptor. Por exemplo, um agente usado para tratar a inflamação é fisiologicamente 10 significante se sua presença aliviar a resposta inflamatória.

As microesferas de polímero degradável foram projetadas para manter os níveis sitêmicos altos de proteína sterapêuticas. As microesferas são preparadas a partir de polímeros degradáveis, tais como poli(lactídeo-co- glicolida) (PLG), polianidridos, poli (orto ésteres), polímeros de acetato de -15 etilvinila não biodegradáveis, em que as proteínas estão presas no polímero (Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332, 1995; Ranade, “Role of Polymers in Drug Delivery,” in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), páginas 51 a 93 (CRC Press 1995); Roskos and Maskiewicz, “Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery,” em 20 Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), páginas 45 a 92 (Plenum Press 1997); Bartus et al., Science 281:1161, 1998; Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153, 1998; Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548, 1998). As nanoesferas revestidas de polietileno glicol também podem forencer carregadores para a administração intravenosa de proteínas 25 terapêuticas (ver, por exemplo, Gref et al., Pharm, Biotechnol. 10:167, 1997).

Outras formas de dosagem podem ser planejadas por aqueles habilitados na técnica, como mostrado, por exemplo, por Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5o Edição (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19°

Edição (Mack Publishing Company 1995) e por Ranade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996).

As composições farmacêuticas podem ser fornecidas como um kit que compreende um recipiente que compreende um anticorpo anti-IL-21 5 neutralizador. Os polipeptídeos terapêuticos podem ser fornecidos na forma de uma solução injetável para doses simples ou múltiplas ou como um pó estéril que será reconstituído antes da injeção. Altemativamente, um tal kit pode incluir um dispersante de pó seco, gerador de aerossol líquido ou nebulizador para a administração de um polipeptídeo terapêutico. Um tal kit 10 ainda pode compreender informação escrita nas indicações e uso de uma composição farmacêutica.

Uma composição farmacêutica que compreende anticorpos anti-IL-21 pode ser fornecida na forma líquida, em um aerossol ou na forma líquida. As formas líquidas, são ilustradas por soluções injetáveis, aerossóis, -15 gotículas, soluções topológicas e suspensões orais. As formas sólidas exemplares incluem cápsulas, tabletes e formas de liberação controlada. A última forma é ilustrada por bombas miniosmóticas e implantes (Bremer et al., Pharm. Biotechnol, 10:239,1997; Ranade, “Implants in Drug Delivery,” em Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), páginas 95 a 123 20 (CRC Press 1995); Bremer et al., “Protein Delivery with Infusion Pumps”, em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 239- 254 (Plenum Press 1997); Yewey et al., “Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant,” em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), páginas 93 a 117 (Plenum Press 1997)). 25 Outras formas sólidas incluem cremes, pastas, outras aplicações topológicas e outros. Therapeutic Uses for Anti-IL-21 Antibodies

O IL-21 é uma citocina derivada de célula CD4+ T que é importante para a imunidade mediada por célula CD8+ T ótima, a ativação de célula NK e as respostas humorais ótimas, tal como produção de anticorpo e maturação de célula B. O IL-21 foi mostrado induzir diversas quimiocinas e citocinas proinflamatórias, tais como IL-18, IL-15, IL-5, IL-6, IL-7A, IL-17F, TNFRII, sCD25 e RANTES. O IL-21 também induz uma resposta de fase 5 aguda em primatas não humanos e seres humanos quando administrado pela injeção IV ou SC (Dodds et al., Cancer Immunol Immunother 17 de outubro de 2008 [publicação eletrônica]). In vitro, estimula o desenvolvimento de certas populações de célula imune neoplástica, tais como células de mieloma múltiplo e leucemia de célula T aguda (Brenne et at Blood 99(10):3756-62 10 (2002), diCarlo E, et at Cancer Immunol Immunother 56(9): 1323-1324 (2007)). O IL-21 também é produzido por células de Hodgkin Reed-Stemberg em linfoma de Hodgkin (Lamprecht et al., Blood 112(8):3339-47, 2008). A expressão aumentada do receptor de IL-21 foi mostrado na epiderme em pacientes com esclerose sistêmica (Distler et al., Arthritis & Rheumatism -15 52:865-864, 2004) e fibroblastos sinoviais de artrite reumatóide (Jungel et al., Arthritis & Rheumatism 50:1468-1476, 2004). Além disso, camundongos NOD diabéticos autoimunes têm expressão de receptor de IL-21 aumentada (King et al., Cell 117:265-277, 2004). Foi mostrado que a expressão de IgG e de IL-21 é aumentada no modelo de camundongo BXSB-Yaa que desenvolve 20 uma doença semelhante ao lúpus eritematoso autoimune (Ozaki et al., J.

Immunol. 173:5361-5371, 2004); a expressão de IL-21 é maior em camundongos sanroque propensos ao lúpus (Vinuesa et al. Nature 435:452, 2005); A expressão de IL-21 é mais alta em tecidos do intestino inflamado vs não inflamado de pacientes com doença de Crohn (Monteleone, et al., 25 Gastroenterology 128:687-694, 2005). O IL-21 também é superproduzido na mucosa de pacientes com doença celíaca (Finn et al. Gut, PMID: 17965065, 2007).

Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-IL-21 a uma quantidade de anticorpo que quando administrada a um paciente é eficaz para prevenir, atrasar, reduzir ou inibir um snitoma, ou atividade biológica associada com uma doença ou distúrbio. A administração pode consistir de uma dose simples ou doses múltiplas e pode ser dada em combinação com outras composições farmacêuticas. 5 A presente invenção fornece composições e métodos para usar anticorpos monoclonais anti-IL-21 em doenças inflamatórias e imunes ou condições, tais como psoríase, pancreatite, diabete tipo I (IDDM), Doença de Graves, doença do intestino inflamatório (IBD), Doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome do intestino irritável, esclerose múltipla, artrite 10 reumatóide, artrite reativa, arrite enteropática, espondiloartropatia, miocardite autoimune, doença de Kawasaki, doença celíaca, uveíte, doença de Behcet, doença da artéria coronária, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), doença pulmonar intersticial, doença muscular inflamatória (polimiosite, dermatomiosite), poliangiite microscópica, anemia aplástica autoimune, -15 tiroidite autoimune, hepatite autoimune, síndrome de Wegener, diverticulose, lúpus eritematoso sistêmico, espondilite ancilosante, escleroderma, esclerose sistêmica, artrite psoriática, osteoartrite, dermatite atópica, vitiligo, doença enxerto versus hospedeiro (GVHD), linfoma de célula T cutânea (CTCL), síndrome de Sjogren, glomeruloneffite, nefropatia de IgA, nefrite autoimune, 20 pênfigo vulgar, miastenia grave, perda de audição autoimune, neuromielite ótica, síndrome de Goodpasture, crioglobulinemia, síndrome de Guillain Barre, polineuropatia desmielinante inflamatória crônica (CIDP), anemia hemolítica autoimune, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), rejeição ao transplante, pacientes de transplante altamente sensibilizados, síndrome anti- 25 fosfolipídeo, alergia e asma e outras doenças autoimunes. A presente invenção fornece composições e métodos para usar anticorpos monoclonais anti-IL-21 na terapia contra certos cânceres celulares imunes, tais como mieloma múltiplo, leucemia de célula T aguda ou Linfoma de Hodgkin. Dermatite de contato

A dermatite de contato alérgica é definida como uma reação imune mediada por célula T a um antígeno que entra em contato com a pele. A população de célula CLA+ T é acreditada estar envolvida na iniciação da dermatite, visto que as respostas de célula T dependentes de alergeno são 5 grandemente confinados à população de CLA+ de células (ver Santamaria- Babi, et al., J Exp Med 181:1935, (1995)). Dados recentes observaram que apenas as células (CD45RO+) CD4+ CLA+ e não CD8+ T de memória proliferam e produzem tanto citocinas do tipo 1 (IFN-y) quanto do tipo 2 (IL- 5) em resposta a níquel, um alergeno de hipemsensibilidade de contato 10 comum. Além disso, as células que expressam CLA em combinação com CD4, CD45RO (memória) ou CD69 são aumentatos após a estimulação específica de níquel e expressa os receptores de quimiocina CXCR3, CCR4, CCR10 mas não CCR6. Ver Moed et al., Br J Dermatol 51:32, (2004).

Em modelos animais, foi mostrado que a dermatite de contato -15 alérgica é dependente de célula T e que as células T responsivas alérgicas migram ao local de aplicação de alergeno. Ver, em geral: Engeman, et al., J Immunol 164:5207, (2000); Ferguson & Kupper, J Immunol 150:1172, (1993) e Gorbachev & Fairchild, Crit Rev Immunol. 21:451(2001).

A administração de anticorpos anti-IL-21 a modelos de 20 camundongo de hipersensibilidade de contato é usada para avaliar a utilidade clínica de anticorpos anti-IL-21 para melhorar os sintomas e alterar o curso da doença.

Dermatite Atópica

A dermatite atópica (AD) é uma doença de pele inflamatória 25 cronicamente recorrente com uma incidência dramaticamente crescente nas últimas décadas. Clinicamente, a AD é caracterizada por placas e pápulas frequentemente escoriadas altamente pruríticas, que apresentam um curso de recorrência crônica. O diagnóstico de AD é, na maior parte, fundamentado emm descobertas clínicas principais maiores e menores. Ver Hanifin J.M.,

Arch Dermatol 135:1551 (1999). A histopatologia revela espongiose, hiperparaqueratose e paraceratose focal em lesões agudas, visto que a hiperplasia epidérmica marcada com hiperparaqueratose e paraqueratose, acantose/hipergranulose e infiltração perivascular da derme com linfócitos e 5 mastócitos abundantes são as marcas de lesões crônicas.

As células T desempenham um papel central na iniciação das respostas imunes locais em tecidos e evidência sugere que as células T que se infiltram nas células, em particular, pode desempenhar um papel chave na iniciação e manutenção de respostas imunes desreguladas na pele. 10 Aproximadamente 90 % de infiltração de células T em locais inflamatórios cutâneos expressa o antígeno associado com linfócito cutâneo que liga a E- selectina, uma molécula de adesão indutível no ndotélio (revisto em Santamaria-Babi, et al., Eur J Dermatol 14:13, (2004)). Um aumento significante na circulação de células CLA+ T entre pacientes com AD em -15 comparação com os indivíduos de controle foi documentado (Ver Teraki, et al., Br J Dermatol 143:373 (2000), enquanto outros demonstraram que as células CLA+ T de memória em pacientes com AD preferivelmente respondem ao extrato de alergeno em comparação com a população de CLA- (Ver Santamaria-Babi, L.F., et al., J Exp Med. 181:1935, (1995)). Em seres 20 humanos, a patogênese de distúrbios atópicos da pele foram associados com aumentos em células CLA+ T que expressam níveis aumentados de citocinas tipo Th-2 como IL-5 e IL-13. Ver Akdis et al., Eur J Immunol 30:3533 (2000) e Hamid et al., J Allergy Clin Immunol 98: 225 (1996).

Os camundongos NC/Nga desenvolvem espontaneamente 25 lesões semelhantes ao AD que compara-se com o AD humano em muitos aspectos, incluindo curso e sinais clínicos, histopatologia e imunopatologia quando abrigado em condições isentas de patogênio não especificadas (não- SPF) em tomo de 6 a 8 semanas de idade. Em contraste, os camundongos NC/Nga mantidos sob condições SPF não desenvolvem lesões na pele.

Entretanto, o início de lesões na pele espontâneas e o comportamento de arranhar-se pode ser sincronizado em camundongos NC/Nga abrigados em uma instalação SPF pela injeção intradérmica semanal de antígeno de ácaro do pó bruto. VEr Matsuoka et al., Allergy 58:139 (2003). Portanto, o 5 desenvolvimento de AD em NC/Nga é um modelo útil para a avaliação de novos produtos terapêuticos para o tratamento de AD.

Além do modelo NC/Nga de AD espontâneo, a sensibilização epicutânea de camundongos usando-se OVA também podem ser usados como um modelo para induzir o espessamento epidérmico e dérmico dependente de 10 antígeno com um infiltrado mononuclear na pele de camundongos sensibilizados. Isto usualmente conincide com os níveis de soro elevados de IgE total e específico, entretanto, nenhuma dinsfúnção de barreira na pele ou prurido normalmente ocorre neste modelo. Ver Spergel et al., J Clin Invest, 101:1614, (1998). Este protocolo pode ser modificado a fim de induzir a -15 desregulação na barreira da pele e prurido pela sensibilização de camundongos transgênicos DO 11.10 OVA TCR com OVA. Aumentando o número de células T específicas de antígeno que podem reconhecer o antígeno de sensibilização pode aumentar o nível de inflamação na pele para induzir o comportamento de arranhar-se visível e liquenificação/escamação da 20 pele.

A administração de anticorpos anti-IL-21 aos modelos de camundongo de dermatite atópica é usada para avaliar a utilidade clínica de anticorpos anti-IL-21 para melhorar os sintomas e alterar o curso da doença. Artrite 25 Artrite, incluindo osteoartrite, artrite reumatóide, juntas artríticas como um resultado de dado e outros são condições inflamatórias comuns que devem se beneficiar a partir do uso terapêutico de anticorpos anti-inflamatórios e polipeptídeos de ligação. Por exemplo, artrite reumatóide (RA) é uma doença sistêmica que afeta o corpo todo e é uma das formas mais comuns de artrite. É caracterizada pela inflamação da membrana que reveste a junta, causando dor, inflexibilidade, calor, vermelhidão e inchaço. As células inflamatórias liberam enzimas que podem digerir o osso e a cartilagem. Como um resultado de artrite reumatóide, o revestimento da junta inflamada, o 5 sinóvia, pode invadir e danificar o osso levando à deterioração da junta e dor severa entre outros efeitos fisiológicos. A junta envolvida pode perder sua forma e o alinhamento, resultando em dor e perda de movimento.

Artrite reumatóide

A artrite reumatóide (RA) é uma doença mediada imune 10 particularmente caractrerizada por inflamação e dano de tecido subsequente que leva à incapacidade severa e à mortalidade aumentada. Uma variedade de citocinas é produzida localmente nas juntas reumatóides. Numeros s estudos demonstraram que o IL-1 e o TNF-alfa, duas citocinas pro-inflamatórias prototípicas, desempenham um papel importante nos mecanismos envolvidos -15 na inflamação sinovial e na destruição de junta progressiva. De fato, a administração de inibidores de TNF-alfa e IL-1 em pacientes com RA levou a uma melhora dramática de sinais clínicos e biológicos de inflamação e uma redução de sinais radiológicos de erosão óssea e destruição de cartilagem. Entretanto, a despeito destes resultados encoraj adores, uma porcentagem 20 significante de pacientes não respondem a estes agentes, sugerindo que outros mediadores também estão envoldiso na patofisiologia de artrite (Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(21:135-149, 2002).

Existem diversos modelos animais para artrite reumatóide conhecidos na técnica. Por exemplo, no modelo de artrite induzida por 25 colágeno (CIA), os camundongos desenvolvem artrite reumatóide crônica que assemelha-se intimamente com a artrite reumatóide humana. Visto que a CIA divide características imunológicas e patológicas similares com RA, isto o toma um modelo ideal para avaliar os compostos anti-inflamatórios humanos potenciais. O modelo CIA é um modelo bem conhecido em camundongos que depende tanto de uma resposta imune quanto de uma resposta inflamatória para ocorrer. A resposta imune compreende a interação de células B e células CD4+ T em resposta ao colágeno, que é administrado como antígeno e leva à produção de anticorpos anti-colágeno. A fase inflamatória é o resultado de 5 respsotas de tecido de mediadores de inflamação, como uma consequência destes anticorpos reagirem com o colágeno natural do camundongo e com a ativação da cascata de complemento. Uma vantagem no uso do modelo de CIA é que os mecanismos básicos de patogênese são conhecidos. Os epítopos de célula T e de célula B relevantes no colágeno do tipo II foram identificados 10 e vários parâmetros imunológicos (p°r exemplo, hiper-sensibilidade do tipo atrasado e anticorpo anti-colágeno) e inflamatórios (p°r exemplo, citocinas, quimiocinas e enzimas que degradam a matriz) relacionam-se com a artrite mediada imune foram determinados e, desta maneira, podem ser usados para testar a a eficácia do composto de teste no modelo de CIA (Wooley, Curr. -15 Opin. Rheum. 3:407-20, 1999; Williams et al., Immunol. 89:9784-788, 1992; Myers et al., Life Sci. 61:1861-78, 1997 e Wang et al., Immunol. 92:8955- 959, 1995).

A administração de anticorpos anti-IL-21 a estes camundongos de modelo CIA é usada para avaliar o uso de anticorpos anti-IL-21 para 20 melhorar os sintomas e alterar o curso da doença.

Doença do Intestino Inflamatória (IBD)

Nos Estados Unidos, aproximadamente 500.000 pessoas sofrem de doença do intestino inflamatório (IBD) que pode afetar o cólon e o reto (colite ulcerativa) ou ambos, intestino delgado e grosso (Doença de 25 Crohn). A patogênese destas doenças não está clara, mas estas envolvem inflamação crônica dos tecidos afetados. A colite ulcerativa (UC) é uma doença inflamatória do intestino grosso, do comumente denominado cólon, caracterizado pela inflamação e pela ulceração da mucosa ou revestimento mais interno do cólon. Esta inflamação faz com que o cólon esvazie-se frequentemente, resultando em diarréia. Os sintomas incluem perda das fezes e caimbras abdominais associadas, febre e perda de peso. Embora a causa exata de UC seja desconhecida, pesquisa revente sugere que as defesas naturais do corpo estejam operando contra as proteínas no corpo que o 5 sistema imunes pensa serem “non-self” (uma “reação autoimune”). Talvez por causa de suas proteínas bacterianas semelhantes no intestino, estas proteínas podem instigar ou estimular o processo inflamatório que começa a destruir o revestimento do cólon. Como o revestimento do cólon é destruído, formam-se úlceras que liberam muco, pús e sangue. A doença começa, usualmente, na 10 área retal e pode, eventualmente estender-se por todo o intestino grosso.

Episódios repetidos de inflamação leva ao espessamento da parede do intestino e o reto com tecido de escoriação. A morte do tecido do cólon ou sepse pode ocorrer com a doença severa. Os sintomas da coliete ulcerativa variam em gravidade e seu início pode ser gradual ou súbito. Os ataques -15 podem ser provocados por muitos fatores, incluindo infecções ou tensão respiratórias.

Embora não exista, correntemente, cura para UC disponível, os tratamentos são focalizados na supressão do processo de inflamação anormal no revestimento do cólon. Os tratamentos incluindo corticoesteróides 20 imunosupressivos (p°r exemplo, azatioprina, mercaptopurina e metotrexato) e aminosalicilatos estão disponíveis para tratar as doenças. Entretanto, o uso a longo prazo de imunosupressivos, tais como corticosteróides e azatipirina podem resultar em efeitos colaterais sérior incluindo enfraquecimento do osso, cataratas, infecção e efeitos no fígado e medula espinhal. Nos pacientes 25 em que tetrapias correntes não são bem sucedidas, a cirurgia é uma opção.

Entretanto, a cirurgia envolve a remoção do cólon e do reto inteiros.

Existem diversos modelos animais que podem imitar parcialmente a colite ulcerativa crônica. O modelo mais amplamente usado é o modelo de colite induzido por ácido 2,4,6-trinitrobenossulfônico/etanol (TNBS), que reduz a inflamação e a ulceração crônica no cólon. Quando TNBS é introduzido no cólon de camundongos suscetíveis por intermédio da instilação intra-retal, isto induz a resposta imune mediada por célula T na mucosa colônica, neste caso levando a uma inflamação mucosal massiva 5 caracterizada pela infiltração densa de células T e macrófagos através de toda a parede do intestino grosso. Além disso, seu quadro histopatológico é acompanhado pelo quadro clínico de perda de peso progressiva (debilitante), diarréia com sangue, prolapso retal e espessamento da parede do intestino grosso (Neurath et al. Intern. Rev. Immunol. 19:51-62, 2000). A transferência 10 adotiva de células T simples em histocompatibilidade menor em desacordo ou camundongos imunocomprometidos singenéicos levam ao desenvolvimento de colite (Leach MW et al 1996, Powrie F et al, 1997) bem como lesões na pele que se parecem com psoríase (Schon MP et al., Nat Med. 2:183-8, 1997; Davenport CM et al., Int Immunopharmacol. 5:653-72, 2002). O transplante ■15 de tão poucoas quanto 0,2 milhões de células CD4+CD25- T de camundongos

BALB/C ou B10.D2 em camundongos C.B-17 SCID imunocompometidos resulta na perda de peso, defecação positiva hemoculta e desenvolvimento de lesões na pele. Os sintomas nestes camundongos variam de colônia para colônia. Este modelo de colite/psoríase tem algumas similaridades à doença 20 de Crohn humana e psoríase e e foi usada extensivamente para testar a eficácia de produtos terapêuticos para estas doenças em seres humanos.

Um outro modelo de colite usa sulfato de dextrano sódico (DSS), que induz uma colite aguda manifestada pela diarréia com sangue, perda de peso, diminuição do cólon e ulceração mucosal com infiltração de 25 neutrófilo. A colite induzida por colite induzida por DSS é caracterizada histologicamente por infiltração de células inflamatórias na lamina propria, com hiperplasia linfóide, dano da cripta focal e ulceração epitelial. Estas mudanças são pensadas desenvolver-se devido a um efeito tóxico de DSS no eptélio e por fagocitose de células de lamina propria e produção de TNF-alfa e IFN-gama. A despeito de seu uso comum, diversos tecidos relacionados com os mecanismos de doença induzida por DSS e sua relevância com a doença humana permanece não resolvida. O DSS está relacionado com um modelo independente de célula T porque este é observado em animais 5 deficientes em célula T tais como os camundongos SCID.

A administração de anticorpos anti-IL-21 para estes modelos de transferência de célula TNBS, DSS ou CD4+ T podem ser usados para avaliar o uso de antagonistas IL-21 para melhorar os sintomas e alterar o curso da doença gastrointestinal. O IL-21 pode desempenhar um papel na 10 resposta inflamatória em colite e a neutralização da atividade de IL-21 pela administração de antagonistas de IL-21 é um método terapêutico potencial para IBD.

Psoríase

A psoríase é uma condição da pele crônica que afeta mais do • 15 que sete milhões de americanos. A psoríase ocorre quando novas células da pele desenvolvem-se de maneira anormal resutlando em pele inflamada, inchada e escamada onde a diferenciação de queratinócitos terminal é alterada. A psoríase de placa, a forma mais comum, é caracterizada por pedaços inflamados de pele (“lesões”) cobertos por escamas brancas 20 prateadas. A psoríase pode ser limitada a algumas placas ou envolver áreas de maneira moderada a extensivas da pele, que aparecem mais comumente no escalpo, joelhos, cotovelos e tronco. Embora isto seja altamente visível, a psoríase não é uma doença contagiosa, a patogênese da doença envolve a ativação de célula T, apresentação de antígeno alterada e produção de citocina 25 pelas células dendríticas inflamatórias e inflamação crônica dos tecidos afetados. Os anticorpos anti-IL-21 da presente invenção, podem servir como um produto terapêutico valioso para reduzir a inflamação e efeitos patológicos na psoríase, outras doença de pele inflamatórias, alergias de pele e de mucosa e doenças relacionadas.

A psoríase em um distúrbio inflamatório mediado por célula T da pele que pode causar desconforto considerável. Este é uma doença para a qual não existe cura e afeta pessoas de todas as idades. A psoríase afeta aproximadamente dois por cento da população da Europa e da América do 5 Norte. Embora indivíduos com psoríase branda possam frequentemente controlar sua doença com agentes tópicos, mais do que um milhão de pacientes no mundo todo requerem tratamentos com luz ultravioleta ou terapia imunosupressora sistêmica. Infelizmente, a inconveniência e os riscos da radiação ultravioleta e as txicidades de muitas terapias limitam seu uso por 10 longo tempo. Além disso, os pacientes usualmente têm recorrência de psoríase e em alguns casos religados, curtamente após a interrupção da terapia de imunossupressão. Os anticorpos anti-IL-21 podem ser testados usando-se um modelo recentemente dessenvolvido de psoríase com base no modelo de transferência de CD4+CD45RB (Davenport et al., Intemat. -15 Immunopharmacol,, 2:653-672, 2002).

Além de outros modelos de doenças descritos neste, a atividade dos anticorpos anti-IL-21 no tecido inflamatório derivados de lesões psoriáticas humanas pode ser medida in vivo usando-se um modelo de camundongo com base em deficiência imune combinada severa (SCID). 20 Diversos modelos de camundongo foram desenvolvidos em que células humanas e tecidos de enxerto são implantadas em camundongos imunodeficientes (coletivamente referido como modelos de xenoenxerto); ver, por exemplo, Cattan and Douglas, Leuk. Res. 18:513-22, 1994 and Flavell, Hematological Oncology 14:67-82, 1996. Como um modelo xenoenxerto in 25 vivo para a psoríase, tecido de pele psoriática humano é enxertado camundongos SCID e os camundongos são subsequentemente desafiados com um antagonista apropriado. Além disso, outros modelos aninais de psoríase na técnica podem ser usados para avaliar os antagonistas de IL-21, tal como enxertos de pele psoriáticos humanos implantados no modelo de camundongo

AGRI 29 e desafiados com um antagonista apropriado (p°r exemplo, ver, Boyman et al., J. Exp. Med. Online publication #20031482, 2004). Similarmente, tecidos ou células derivados de colite humana, IBD, artrite ou outras lesões inflamatórias podem ser usadas no modelo SCID para estimar as 5 propriedades anti-inflamatórias dos anticorpos anti-IL-21 descritos neste.

A eficácia do tratamento é medida e avaliada estatisticamente como efeito anti-inflamatório aumentado dentro da população tratada durante o tempo usando-se métodos bem conhecidos na técnica. Alguns métodos exemplares incluem, mas não são limitados à medição, por exemplo, em um 10 modelo de psoríase, espessura epidérmica, o número de células inflamatórias na derme superior e os graus de paraqueratose. Tais métodos são conhecidos na técnica e descritos neste. Por exemplo, ver Zeigler et al., Lab Invest 81:1253, 2001; Zollner et al., J, Clin. Invest. 109:671, 2002; Yamanaka et al., Microbiol. Immunol. 45:507, 2001; Raychaudhuri et al., Br. J. Dermatol. -15 144:931, 2001; Boehncke et al., Arch. Dermatol. Res. 291:104, 1999;

Boehncke et al., J. Invest. Dermatol. 116:596, 2001; Nickoloff et al., Am. J. Pathol. 146:580, 1995; Boehncke et al., J. Cutan. Pathol. 24:1, 1997; Sugai et al., J, Dermatol. Sci. 17:85, 1998 e Villadsen et al., J. Clin. Invest. 112:1571, 2003. A inflamação também pode ser monitorada durante o tempo usando-se 20 métodos bem conhecidos, tais como citometria de fluxo (ou PCR) para quantificar o número de células inflamatórias ou de lesão presentes em uma amostra, registro (perda de peso, diarréia, sangramento retal, comprimento do cólon) para IBD, registro de doença na pata e registro de inflamação para o modelo CIA RA. 25 A administração de anticorpos anti-IL-21 a estes camundongos de modelo de psoríase é usada para avaliar o uso de anticorpos anti-IL-21 para melhorar os sintomas e alterar o curso da doença.

Lúpus Eritematoso Sistêmico

O lúpus eritematoso sistêmico (SLE) é um distúrbio relacionado com o complexo imune caracterizado pela produção de anticorpo IgG crônica direcionada em antígenos ubiquitosos por si próprios (por exemplo, anti-dsDNA). Os efeitos de SLE são sistêmicos, em vez de localizado em um órgão específico, embora a glomeruloneffite possa resultar 5 em alguns casos (isto é, neffite do lúpus). Locais cromossômicos múltiplos foram associados com a doença e podem contribuir com relação a aspectos diferentes da doença, tal como anticorpos anti-dsDNA e glomerulonefrite. As células CD4+ T foram mostradas desempenhar a parte ativa em modelos de camundongo de SLE (Horwitz, Lupus 10:319-320, 2001; Yellin and Thienel, 10 Curr. Rheumatol. Rep., 2:24-37, 2000). O papel para as células CD8+ T não está claramente definido, mas existe evidência sugerindo que a função de célula CD8+ T “supressora” é prejudicada em pacientes com lúpus (Filaci et al., J. Immunol., 166:6452-6457, 2001; Sakane et al, J. Immunol., 137:3809- 3813, 1986). -15 O IL-21 foi mostrado convincente para induzir a diferenciação de células B humanas naturais nas células de plasma secretoras de anticorpo (Ozaki et al., J. Immunol. 173:5361, 2004; Ettinger et al., J Immunol. 175:7867-79, 2005; Ettinger et al, J Immunol. 178:2872-82, 2007; Kuchen et at. J Immunol. 179:5886-96, 2007). Ozaki et at., (J. Immunol. 173:5361, 20 2004) também demonstra que a expressão IL-21 é elevada nos camundongos

BXSB-Yaa propensos ao lupus, um modelo para SLE, em uma idade quando as características precoces de processos autoimunes primeiro tomar-se evidente. O tratamento destes camundongos BXSB-Yaa com um antagonista IL-21 de murino parcialmente inibe vários parâmetros da doença, incluindo 25 glomerulonefrite (Bubier et at., Ann N Y Acad Sci. 1110:590-601, 2007). O mesmo antagonista IL-21 também foi mostrado ser eficaz em um outro modelo de doença pré-clínica SLE, o camundongo MRL/Ipr (Herber et at. J, Immunol. 178: 3822-3830, 2007). Além disso, por causa dos limites IL-21 de desenvolvimento de células Treg, a administração de anticorpos anti-IL-21 deve fornecer uma função supressora de célula T mais robusta em pacientes com lúpus onde aquela função é compromissada (Lamprecht et at. Blood. 112(8):3339-47, 2008).

Os dados obtidos de 24 pacientes SLE e 15 controles 5 saudáveis mostram que 1) expressão IL-21 mRNA é significantemente aumentada em células CD4+ T a partir de pacientes com lúpus comparados aos controles, 2) níveis IL-21 são significantemente elevados no soro a partir de pacientes com comparação ativa ao SLE inativo ou controles, como determinado usando um kit IL-21 ELISA commercial (Invitrogen, Carlsbad, 10 CA), 3) IL-21 itensifica a proliferação das células CD4+ T e células B CD 19+ nos pacientes e controle em uma dosagem de dependente maneira , 4) IL-21 intensifica a diferenciação celular de plasma induzida por anti-CD40 nos controles normais e pacientes SLE e 5) níveis elevados de IL-21 podem contribui para a proliferação de células T CD4+ T autoreativas e -15 diferenciação celular de plasma em SLE ( (Rus, V., ACR Presentation #1760, 2008 American College of Rheumatology meeting, October 24-29, 2008).

Os anticorpos anti-IL-21 podem ser administrados em combinação com outros agentes já em uso na autoimunidade incluindo moduladores imunes tal como IFNy, NOVANTRONE®, ENBREL®, 20 BETAFERON®, REMICADE®, LEUKINE® e PROLEUKIN®. Os anticorpos anti-IL-21 podem ser administrados em combinação com outros agentes já em uso na terapia de câncer de mieloma múltiplo, linfoma de Hodgkinou leukemia de célula T aguda tal como THALOMID® ou com esteróides tal como dexametasona ou prednisona. Estabeler o ótimo nível de 25 dosagem e listagem dos anticorpos anti-IL-21 que são feitos por uma variedade de meios, incluindo estudo de farmacocinéticos e farmacodinâmicos de anticorpos anti-IL-21; determinação de dosagens efetivas em modelos animais e avaliação da toxicidade de anticorpos anti-IL- 21. As medições farmacocinéticas diretas feitas em processos clínicos e primatas podem ser usados para predizer as dosagens teóricas em pacientes que atingem os níveis de anticorpo anti-IL-21 de plasma que são de magnitude suficiente e duração para atingir uma resposta biológica nos pacientes. 5 Rejeição de transplante

Os recipientes órgão sólidos transplantados podem desenvolver a rejeição crônica ou aguda do aloenxerto devido ao histocompatabilidade em desacordo. A geração de anticorpos direcionados contra as moléculas HLA (aloanticorpos) nestes pacientes resultam da 10 apresentação do antígeno estranho as células T.

Os aloanticorpos podem mediar o dano no tecido no enxerto através da formação dos complexos imunes, fixação de complemento e citotoxicidade celular mediada pelo anticorpo direcionada pela ligação de aloanticorpos. A cascata de complemento também libera os fatores locais que -15 ativam as células endoteliais e causam a vasculopatia dentro do enxerto. O produto complementar C4d é um marcador precoce tanto a rejeição de transplante agudo quanto crônico e pode ser detectado em casos sub-clínicos antes de publicar as mudanças patológicas (Racusen and Haas, Clin J Am Soc Nephrol 1: 415-420, 2006; Moll and Pascual, Am J Transplantation 5: 2611- 20 2618, 2005; Tinkam and Chandraker, Clin J Am Soc Nephrol 1: 404-414, 2006). Os pacientes são avaliados pelos aloanticorpos anti-HLA (painel de anticorpo reativo) antes do transplante. Os pacientes podem ser altamente sensibilizados devido anteriormente a falta de aloenxerto, transfusões sanguíneas, ou gestações múltiplas. A presença de aloanticorpos em pacientes 25 de transplante altamente sensibilizados complicam sua cura, como as terapias imunosupressivas aumentadas podem ser requeridas e a possibilidade de rejeição aguda é alta (Baid et al., Curr Opin Immunol 13:577-581, 2001). Em alguns casos, os agentes de alvejamento de célula B (ácido micofenólico ou rituximab) são usados, embora esta estratégia terapêutica não diretamente alveja as células de plasma que secretam o anticorpo- Plasmaferese é também usado para reduzir a circulação de imunoglobulina. Em todos os casos, os receptores de transplante são tratados com células T alvejada pelos agentes imunosupressivos para reduzir o risco de rejeição e podem ser lentamente 5 “desabituados” destes regimes como tolerância ao enxerto é estabelecida (Seyfort-Margolis and Turka, J Clin Invest 118(8): 2684-2685, 2008; Taylor et al., Crit Rev Oncol Hematol 56:23-46, 2005; Amante and Ejercito, Transplant Proc 40: 2274-2280, 2008).

O desenvolvimento das células de plasma que secreta o 10 anticorpo requer a ajuda cognata de células CD4 T em adição aos microambientadores especializados que fornecem a sobrevivência da célula de plasma (Tarlington et al., Curr Opin Immunol 20:162-169, 2008). A secreção de citocina pela célula T ativada é necessária pela diferenciação e sobrevivência das células de plasma e é conhecida afetar a natureza da -15 resposta de anticorpo e isotipo Ig. Os modelos existem para monitorar a célula T dependente das respostas de anticorpo em espécies primates de murino e não humanos. Estes método são bem entendidos por aquela pessoa habilitada na técnica. Cinéticos e magnitude de respostas de anticorpo primárias e secundárias contra os antígenos de modelo de peptideo tal como ovalbumina, 20 toxóide de tétano, células vermelhas sanguíneas de ovelha, ou hemocianina de lapa buraco de fechadura modificado por trinitrofenila são monitorados usando ensaios que detectam os anticorpos específicos por antígeno ou totais, incluindo sub tipos IgG, IgM, IgE, ou IgA no soro de animais tratados. Em alguns modelos, a maturação de afinidade dos anticorpos também podem ser 25 monitorados. Estes modelos podem ser usados para testar os efeitos dos medicamentos terapêuticos que alteram a ajuda de célula B pelas células T e que bloqueiam as citocinas embora sejam importantes para a diferenciação e sobrevivência da célula de plasma.

Os estudos de rejeição de aloenxerto são conduzidos em muitas espécies de animais. Por exemplo, um modelo de transplante renal em macacos cinomólgos podem representar os efeitos da rejeição de aloenxerto renal mediado pelo aloanticorpo crônico em humanos. Os regimes que toleram o aloenxerto são realizados antes do transplante em alguns casos. A 5 presença de aloanticorpos específicos por doadores é monitorado pela análise de citometria de fluxo do recipiente do soro com leucócitos sanguíneos periféricos em desarcordo e deposição do produto complemento C4d que é detectado nas biopsias a partir do aloenxerto renal (Smith et al., Am J Transplant 6:1790-1798, 2006; Smith et al., Am J Transplant 8:1-11, 2008). 10 Os modelos de transplante crônico ou agudo podem ser conduzidos em espécies de murino por aquela pessoa habilitada na técnica.

A administração de anticorpos anti-IL-21 em um modelo de resposta de anticorpo dependente da célula T ou um modelo de rejeição a aloenxerto é usada para avaliar a utilidade clínica de anticorpos anti-IL-21 -15 para reduzir as alorespostas de anticorpo e melhorar os sintomas de rejeição de aloenxerto, ou como partes de regime tolerado ou terapêutico pré- transplante para os receptores de transplante, incluindo pacientes de transplante altamente sensibilizados. A invenção ainda é ilustrada pelos seguintes exemplos não 20 limitantes.

EXEMPLOS

Exemplo 1- Preparação de proteínas IL-21 e anticorpos

A. Imunizações e hibridomas

A proteína IL-21 foi produzida como descrito na Patente U.S. 25 7.250.274, incorporada neste em sua totalidade. Proteínas receptoras IL-21 solúveis foram produzidas como descrito no Pedido de Patente U.S. 2007- 0122413 e Patente U.S. 6.777.539, ambos incorporados neste em sua totalidade. Anticorpos monoclonais anti-IL-21 foram produzidos nos camundongos de tipo selvagem que geram os anticorpos de murino e nos camundongos transgênicos que geram anticorpos totalmente humanos (Medarex, Princeton, NJ). Os camundongos foram imunizados com proteína IL-21 humana. Brevemente, os camundongos foram inicialmente imunizados pela injeção subcutânea com 30 μg do IL-21 recombinante purificado 5 (pr°duzido em E.coli a ZymoGenetics) conjugado com BSA (Imject Pharmalink Immunogen Kit, Pierce) e administrado em combinação com CpG (ligando TLR9 de murino oligonucleotideo e GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulatory Factor, R&D, Minneapolis, MN) e adjuvante Emulsigen® -P (MVP Laboratories, INC, Omaha, NE) como pelas 10 instruções dos fabricantes. Seguindo a imunização inicial, cada um dos camundongos recebem três 30 μg adicionais de IL-21 em adjuvante Emulsigen® -P por intermédio da via subcutânea em intervalos semanais. Sete dias após a quarta imunização, os camundongos foram sangrados por intermédio do plexo retro orbital e o soro separados a partir do sangue para -15 análise de sua capacidade para ligar-se a IL-21.

Os esplenócitos foram coletados e unidos a partir de dois camundongos BALB alto titulador/c ou camundongos transgênicos e fundido as células de mieloma de camundongo P3-X63-Ag8:653 usando PEG 1450 em um procedimento de fusão simples (2:1 razão de fusão, esplenócitos as 20 células mieloma, "Antibodies: A Laboratory Manual", E. Harlow and Diane, Cold Spring Harbor Press). Seguindo 9 dias de desenvolvimento pós fusão, grupos de hibridoma que produz o anticorpo específico foram identificados por ELISA direta e de captura usando proteína recombinante IL-21, não rotulado e IgG Fc rotulado humano, como alvo de anticorpo específico. Os 25 grupos de hibridomas positivos foram analisados ainda para sua capacidade de bloquear o ligando a ligação receptora, que é medido como o nível de fosforilação STAT3 seguindo a interação receptora de ligando ("ensaio de neutralização fosfor-STAT3 ") de proteína recombinante purificada IL-21 nas células on BaF3 que expressam a sequência receptora IL-21. Os anticorpos monoclonais purificados a partir do meio de cultura de tecido foram caracterizados por sua capacidade de bloquear a interação receptora de ligando ("ensaio de neutralização fosfor-STAT3") do IL-21 recombinante purificado nas células Baf3 que expressam as sequências receptoras. Os 5 anticorpos monoclonais de “neutralização” foram identificados nesta maneira.

Os grupos de hibridoma produziram os resultados positivos pelo "ensaio de neutralização fosfor-STAT3" e formatos ELISA foram clonados pelo menos duas vezes pela diluição limitante. Neste ensaio, as amostras foram tituladas usando diluição de baixa densidade padrão (menos 10 do que uma célula por reservatório) para ver qual clone manterão as leituras OD maiores. Usando os resultados a partir de tanto os ensaios de titulação quanto neutralização, dois clones específicos a partir de cada reservatório principal inicial foram selecionados pela análise adicional. Estes são submetidos a um ciclo adicional de clonagem para garantir homogeneidade de - 15 cultura e avaliado usando a ELISA direta. Após um ensaio de titulação adicional, dois clones IL-21 finais foram selecionados. Os clones de hibridoma foram cultivados em um meio de desenvolvimento de 90 % do meio Dulbecco modificado por Iscove com 2 mM de glutamina L, 100 μg/mL de penicilina e 100 μg/mL de sulfato de estreptomicina e 10 % de soro I de 20 clone fetal (Hyclone Laboratories). Os clones foram propagados pelas culturas de semeadura a 2 x 105 de células/ml e manutenção entre 1 x 105 e 5 x 105 célula/ml a 37° C e 5 a 6 % de CO2. As células foram adaptadas as condições livre de soro nas transferências subsequentes. As células foram congeladas em 90 % de soro, 10 % de DMSO e armazenado na fase de vapor 25 de um congelador de nitrogênio líquido.

Os anticorpos monoclonais purificados produzidos pelos clones de hibridoma foram caracterizados em diversas maneiras incluindo armazenagem (isto é, determinar se cada anticorpo deve inibir a ligação de qualquer outro anticorpo), mapeamento de epítopo usando peptídeos, ‘ afinidade relativa e neutralização.

Os métodos para a produção de anticorpos heterólogos a partir de camundongos transgênicos são conhecidos, ver por exemplo, Lonberg, Nat. Biotech. 23(9): 1117-25, 2005; Tomizuka et al. PNAS 97(2):722-727, 5 2000 e Patente U.S. 5.625.126.

Os seguintes hibridomas que produzem anticorpos monoclonais IL-21 anti-humanos de murino foram depositados com American Type Culture Collection, Manassas, VA. clone 338.5.4 ATCC N°. (PTA-8317), clone 338.11.5 ATCC N°. (PTA-8314), clone 338.14.3 ATCC 10 N°. (PTA-8313), clone 338.15.5 ATCC N°. (PTA-8315), clone 338.17.3 ■? ATCC N°. (PTA-8316), clone 338.24.5 ATCC N°. (PTA-8430), clone 338.25.6 ATCC N°. (PTA-8431), clone 338.39.5 ATCC N°. (PTA-8432), clone 338.29.2 ATCC N°. (PTA-8433), clone 338.28.6 ATCC N°. (PTA- 8434). -15 Os seguintes hibridomas que produzem os anticorpos monoclonais IL-21 anti-humanos humanos foram depositados com American Type Culture Collection, Manassas, VA. Tabela 1 fomece as sequências de aminoácido completo para as cadeias variáveis pesadas (VH) e variáveis leves (VL) dos anticorpos. Também incluído são sequências para CDR1, CDR2 e 20 CDR3 de regiões VH e VL para cada anticorpo. As sequências de nucleotídeo correspondentes são observados na listagem de sequência.

Incluído no depósito, mas não na Tabela 1, é um hibridoma denominado 366.345.6.11, ATCC N°. PTA-8788.

IB: Expressão do clone 362.78.1.44 imunoglobulina dos genes de cadeia leve e pesada em uma linha celular de mamífero para produzir 362.78-CHO

Anticorpo monoclonal IL-21 anti-humano humano (derivado a 5 partir do clone de hibridoma 362.78.1.44) foi expressado em células CHO usando dois cassetes de expressão. A cadeia VH foi fundida em uma região constante IgGl humano modificado. O IgGl modificado, IgGl.l, contendo cinco substituições de aminoácidos para reduzir as funções efetivas. A cadeia pesada IL-21 anti-humano humano foi ligado a um marcador selecionável de 10 reductase de diidrofolato (DHFR) com a sequência do local de entrada ribossômica interna (IRES). A expressão da cadeia pesada IL-21 anti-humano humano e o marcador selecionável DHFR foram direcionados por um promotor sintético constitutivo que consiste de uma fusão do intensificador de citomegalovírus humano (CMV) e o intensificador/promotor do vírus de 15 sarcoma mieloproliferativo (MPSV). O sinal de poliadenilação do vírus símio 40 (SV40) foi usado para terminar a transcrição no final do marcador selecionável DHFR. A cadeia VL foi fundido a região constante de capa de imunoglobulina humana. A cadeia leve IL-21 anti-humano humano foi ligado a um marcador selecionável (puroR) de resistência a puromicina com uma 20 sequência IRES. A expressão da cadeia leve IL-21 anti-humano humano e o marcador selecionável puroR foram direcionados por um promotor sintético constitutivo que consiste de uma fusão do intensificador CMV humano e o intensificador/promotor MPSV. O sinal de poliadenilação SV40 foi usado para terminar a transcrição no final do marcador selecionável puroR. Os 25 cassetes de expressão de cadeia leve e pesada IL-21 anti-humano humano foram co-transfectados nas células hospedeiras CHO DXB-11. A seleção de puromicina foi seguida pela seleção de metotrexato para obter alta expressão estável de anticorpo monoclonal IL-21 anti-humano humano. A versão expressada CHO de IL-21 mAb clone 362.78.1.44 será referida nos exemplos subsequentes como "362.78-CHO."

Exemplo 2- Anticorpos monoclonais anti-IL-21 que ligam-se as proteínas IL- 21 humanas e peptídeos 2A. Ligação e neutralização de Peptídeos 5 A capacidade da ligação IL-21 anti-humano e neutralização dos anticorpos monoclonais para ligar-se a IL-21 humano, proteína IL-21 humana mutante e sequência IL-21 humana derivado de peptídeos sintéticos foi demonstrado em um formato de ensaio direto ELISA. Os seguintes peptídeos foram usados: 10 peptídeo #1 ((SEQ ID N°:3) pyroGlu GQDRHMIRMRQLIDIVDQLKC; peptídeo #2 ((SEQ ID N°: 4) NDLVPEFLPAPEDVETNC, peptídeo #3 ((SEQ ID N°: 5) WSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTC, -15 peptídeo #4 ((SEQ ID N°:6) CDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLS e

IL-21 humano recombinante (SEQ ID N°: 2), sequência IL-21 humana derivado de peptídeos sintéticos: e IL-21 humano mutante recombinante (SEQ ID N°: 7) foram separadamente imobilizado na superfície 20 de placas ELISA de poliestireno de 96 reservatórios em um volume de 100 μL/reservatorio em uma concentração de 1 μg/mL no tampão de revestimento (O,1M de Na2CO3, pH 9.6). As placas foram incubadas durante a noite a 4o C após qualquer proteína de não ligação ser aspirada e as placas lavadas duas vezes com 300 μL /reservatório de tampão de lavagem (PBS-Tween definido 25 como 0,137M de NaCl, 0,0022M de KC1, 0,00067M de Na2HPO4, 0,0020M de KH2PO4, 0,05 % de polisorbato 20 p/v, pH 7.2). Os reservatórios foram bloqueados com 200 μL /reservatório do tampão de bloqueamento (PBS- Tween mais 1 % de albumina de soro bovino p/v (BSA)) por 1 hora, após que as placas foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem. As diluições de anticorpo foram preparadas em 5 % de soro bovino fetal (FBS)ZMeio médio Dulbecco (IMDM) modificado por Iscove e ajustado a 1 ug/ml. As amostras duplicadas de cada diluição de anticorpo foram então transferidas as placas de ensaio, 100 μL /reservatório, a fim de ligar-se as proteínas IL-21 anti- 5 humano. Seguindo 1 hora de incubação em temperatura ambiente, os reservatórios foram aspirados e as placas lavadas duas vezes como descrito acima. IgG de camundongo anti-cabra rotulado por peroxidase de rábano silvestre (HRP), IgG de rato anti-coelho ou específico por Fc, IgG humano anti-cabra ou específico por Fc, específico por Fc (Jackson ImmunoResearch 10 Laboratories, West Grove, PA) em uma diluição de 1:5000 com 5 % de meio

FBS/IMDM foi então adicionado em cada reservatório, 100 μL /reservatório e as placas incubadas em temperatura ambiente por 1 hora. Após a remoção de anticorpo conjugado HRP não ligado, as placas foram lavadas cinco vezes, 100 μL /reservatório de tetra metil benzidina (TMB) (BioFX Laboratories, -15 Owings Mills, MD) adicionado em cada reservatório e as placas incubadas por 3 minutos em temperatura ambiente. O desenvolvimento da cor foi interrompida pela adição de 100 μL /reservatório de reagente de interrupção 450 nm TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e os valores de absorbância dos reservatórios lidos em um instrumento Molecular Devices 20 Spectra MAX 340 a 450nm. Tabela 2

Tabela 3

Reatividade de anticorpo IL-21 anti-humano monoclonal a proteína IL-21 humana, proteína IL-21 humana mutante e a sequência IL- 21 humana derivada de peptídeos Clone Ab# IL-21 anti- humano humano Isotipo (N) de neutralização de ligação (B) LottfAb purificado IL-21 Peptídeo 1

2B Medição de afinidades de ligação do anticorpo monoclonal anti-IL-21 humano 362.78-CHO a IL-21 humano e IL-21 de macaco cinomólgo pela resonância de plasmon de superfície (Biacore)

O anticorpo monoclonal anti-IL-21 362.78-CHO foi avaliado por sua afinidade de ligação a IL-21 recombinante humano e IL- 21 recombinante cinomólgo usando resonância de plasmon de superfície.

Determinação de afinidade: Constantes de taxa cinética e constantes de dissociação de equilíbrio foram medidos pela interação do anticorpo monoclonal IL-21 anti-humano 362.78-CHO com IL-21 humano e IL-21 cinomólgo por intermédio da resonância de plasmon de superfície. A constante da taxa de associação (ka (M'V1)) é um valor que reflete a taxa da formação do complexo de anticorpo-antígeno. A constante da taxa de dissociação (kd (s'1)) é um valor que reflete a estabilidade deste complexo. Pela divisão de uma constante da taxa de dissociação por uma constante da taxa de associação (kd/ka) a constante de dissociação de equilíbrio (KD (M)) é obtida. Este valor descreve a afinidade de ligação da interação. Os anticorpos com KD similar pode ter amplamente a associação variável e constantes de taxa de dissociação. Consequentemente, medido tanto o ka quanto kd dos anticorpos ajudam mais unicamente descrever a afinidade da interação de antígeno-anticorpo.

Materiais e métodos: Cinéticos de ligação e estudos de afinidade foram realizados em um sistema Biacore TIOO™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Métodos para Biacore TIOO™ foram programados usando BIACORE TIOO™ Control Software, v 1.1.1. Para estes experimentos, o anticorpo 362.78-CHO foi capturado em um sensor chip CM4 por intermédio de um anticorpo de gama Fc IgG anti-humano de cabra (Jackson

ImmunoResearch, West Grove, PA), ou foi minimamente biotinilado com „ uma razão de massa 1:100 de Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce, Rockford, IL) em um tampão de PBS pH 7.4 então captirado em um chip (SA) de estreptavidina. Todos os experimentos de ligação foram realizados a 25° C 5 em um tampão de 10 mM de HEPES, 300 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2, 0,05 % de tensoativo P20 (Biacore), 1 mg/mL de albumina de soro bovino, pH 8.0.

Para os experimentos com o anticorpo gama Fc IgG anti- humano de cabra, o anticorpo de captura foi diluído na concentração de 50 μg/mL no acetato de sódio 10 mM pH 5.0 e então covalentemente 10 imobilizado a todas as quatro células de fluxo de um sensor chip CM4 usando química de ligação de amina (EDC:NHS). Após a imobilização do anticorpo, os locais ativos remanescentes na célula de fluxo foram bloqueados com 1 M de etanolamina. Uma densidade do anticorpo de captura de aproximadamente 3500 RU foi obtido. O anticorpo anti-IL-21 362.78-CHO foi capturado na - 15 célula de fluxo 2, 3 e 4 do chip CM4 nas três densidades diferentes (que varia de 25 a 150 RU). A captura do anticorpo 362.78-CHO a superfície imobilizada foi realizada em uma taxa de fluxo de 10 μL/minutos. O instrumento Biacore mede a massa de proteína ligado a superfície de chip sensor e desta maneira, captura o anticorpo testado foi verificado para cada 20 ciclo. Séries de diluições de IL-21 recombinante humano ou IL-21 recombinante cinomólgo (ZymoGenetics) foram preparados de 40 nM a 0,003 nM (1:5 séries de diluições). As séries de diluições foram injetadas na superfície e permitidos para ligar-se especificamente ao anticorpo 362.78- CHO capturado no sensor chip. Injeções duplicatas de cada concentração de 25 antígeno IL-21 foram realizados com um período de associação de 6,5 ou 7 minutos e período de dissociação de 10, 15, ou 60 minutos. Estudos de ligação cinético foram realizados com uma taxa de fluxo a 50 μL/minutos. Entre os ciclos, a célula de fluxo foi lavado com 20 mM de ácido clorídrico para regenerar a superfície. Esta etapa de lavagem removido tanto no anticorpo testado capturado quanto qualquer antígeno de ligação a partir da * superfície de anticorpo imobilizado. O anticorpo 362.78-CHO foi subsequentemente capturado novamente no próximo ciclo.

Para os experimentos com o 362.78-CHO minimamente 5 biotinilado, o anticorpo biotinilado foi capturado na célula de fluxo 2, 3 e 4 do chip SA nas três densidades diferentes (que varia de 150 a 1200 RU). A captura de anticorpo -362.78-CHO biotinilado na superfície foi realizada em uma taxa de fluxo de 10 μL/minutos. As séries de diluições de IL-21 recombinante humano ou IL-21 recombinante cinomólgo (ZymoGenetics) 10 foram preparados de 50 nM a 0,001 nM (1:4 séries de diluições) ou de 40 nM a 0,003 nM (1:5 séries de diluições). Estas séries de diluições foram injetadas na superfície e permitidos para ligar-se especificamente ao anticorpo 362.78- CHO capturado no sensor chip. Injeções duplicatas de cada concentração de antígeno IL-21 foram realizadas com um período de associação de 6,5 ou 7 • 15 minutos e período de dissociação de 10, 15, ou 60 minutos. Os estudos de ligação cinético foram realizados com uma taxa de fluxo a 50 μL/minutos. Entre os ciclos, a célula de fluxo foi lavada com 20 mM de ácido clorídrico para regenerar a superfície. Esta etapa de lavagem removida qualquer antígeno de ligação a partir da superfície de anticorpo imobilizado. O ciclo de 20 lavagem não remove o anticorpo 362.78-CHO biotinilado a partir da superfície sensor e o anticorpo foi subsequentemente disponível para ligar a próxima amostra de antígeno.

Os dados foram colecionados usando o software de avaliação BIACORE TI00™ (versão 1.1.1). O dado foi processado subtraindo as 25 referências da célula de fluxo e injeções em branco. A estabilidade linha de base foi avalida para garantir que a etapa de regeneração fornece uma superfície de ligação consistente em toda parte da sequência de injeções. As curvas de injeções duplicatas foram checadas pela reprodutividade. Com base na ligação de IL-21 monovalente a um anticorpo bivalente, o modelo de interação de ligação 1:1 foi determinado a ser apropriado. As curvas de ligação subtraida de referência a partir de três células de fluxo (FC2-1, FC3-1, FC4-1) foram ajustados globalmente a modelo de ligação 1:1 com um Rmax múltiplo e com a série RI a zero. O reservatório de ajuste de dados 1:1 modelo de ligação com bom atendimento entre as curvas de ligação teórica e experimental. Os erros padrão e chi2 associados aos ajustes inferiores. Não houve tendência nos resíduos.

Resultados: Para a interação de 362.78-CHO com IL-21 humano, os dados foram colecionados a partir de quatro experimentos separados. O ka dos experimentos múltiplos que varia de 3E+07 a 5+07 (M-1s' enquanto o kd que varia de 3E-06 a 3E-05 (s’1). O KD calculado que varia de 0.9E-13 a 8E-13 (M).

Para a interação de 362.78-CHO com IL-21 cinomólgo, os dados foram colecionados a partir de três experimentos separados. O ka foi 3E+07 (M’ls) para cada experimento, enquanto o kd que varia de 2E-04 a 5E- 04 (s-'). O KD calculado que varia de 0.9E-11 a 2E-11 (M).

Exemplo 3- Experimentos de reatividade cruzada de espécies

Determinação da capacidade de anticorpos anti-IL-21 humano a reatividade e liga-se a proteína IL-21 de macaco cinomólgo ou murino ou sequência IL-21 humana derivado de peptídeos sintéticos.

Os estudos de reatividade cruzada de espécies podem ser importantes para demonstrar as especificidades pelas estratégias de desenvolvimento do antagonista terapêutico. A fim de determinar se a ligação IL-21 anti-humano e a neutralização intitula descrito neste pode reagir e liga- se ao IL-21 cinomólgo ou murino (e portanto, justificar o camundongo ou macaco cinomólgo como uma espécie de teste viável), foi necessário demonstrar a ligação comparável dos anticorpos a IL-21 de macaco cinomólgo, humano recombinante e murino nos vários formatos de ensaio.

Um dos métodos para a ligação testada dos anticorpos monoclonais é seu desempenho em ensaios imunoblot (Western blot). O IL-21 humano recombinante (SEQ ID N°:2), IL-21 murino recombinante (SEQ ID N°:ll), IL-21 cinomólgo recombinante (SEQ ID N°:9), sequência IL-21 humana derivado de peptídeos sintéticos: peptideo #1 pyr30-K50 (Seq ID 3), peptideo #2 N54-C71 (SEQ ID N°:4), peptideo #3 N97-C122 (SEQ ID N°:5), peptideo #4 C125-S153 (SEQ ID N°:6) conjugado a ovalbumina, ou uma citocina de controle irrelevante, IFN-A, humano recombinante. (ZymoGenetics) foram submetidos a eletroforese em gel de dodecil sulfatopoliacrilamida sódico (SDS-PAGE) usando 4 a 12 % de géis de poliacrilamida BisTris (Invitrogen, Inc.) e transferido as membranas de nitrocelulose usando métodos padrão e um tampão contendo 25 mM de Tris, 186 mM de glicina e 40 % de metanol.

Para Western blots, os locais não específicos nas membranas foram bloqueados com um tampão contendo 20 mM de Tris, pH 7.4, 0,5 mM de EDTA, 0,5 % de IGEPAL CA-630, 150 mM de NaCl, 0,25 % de gelatina e 1 % de solução de bloqueamento de hidrolisado de caseína (Western Blocking Reagent, Roche Diagnostics, Inc., Basel Switerzerland) (tampão de bloqueamento). As membranas foram então incubadas por 2 horas em temperatura ambiente com o anticorpo monoclonal purificado (10 ng/ml ou 100 ng/ml) no tampão de bloqueamento seguido por uma incubação de 2 horas com IgG anti-humano de burro conjugado por peroxidase (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). As membranas foram lavadas 5 vezes com o tampão de bloqueamento Tris/EDTA/IGEPAL/NaCI/gelatina que necessita do hidrolisado de caseína e desenvolvimento com DuraWest Luminol/intensificador/solução de Peroxidase SUPERSIGNAL™ e (Pierce, Rockford, IL) para a detecção quimioluminescente. Os blots foram visualizados usando métodos padrão com base na película de raio X. Tabela 4

Reatividade de anticorpo IL-21 anti-humano humano monoclonal na análise Western Blot

Exemplo 4- Avaliação da capacidade de anticorpos IL-21 anti-humano a reatividade e liga-se as citocinas da família ye humana IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 5 Uma outra característica importante do anticorpo específico é a capacidade do anticorpo para ligar-se e antagoniza as proteínas alvos mas não liga-se as proteínas relacionadas (não alvos) a um grau significante. A capacidade de anticorpos anti-IL-21 humano para ligar-se a citocinas relacionadas foi testado no formato Western blot. As amostras de todos os 10 membros da família de citocina yc foram obtidos e realizados em SDS-PAGE e transferidos nas membranas de nitrocelulose para fingimento. IL-2 humano recombinante (202-IL/CF), IL-4 humano (204-IL/CF), IL-7 humano (207- IL/CF), IL-9 humano (209-IL/CF), IL-15 humano (247-IL/CF) todos obtidos dos sistemas R&D, Minneapolis MN), IL-21 humano (ZymoGenetics) e IFN- X humano. (Patentes U.S. 6.927.040; 7.252.969) foram usados para a especificidade dos anticorpos. Todos dos anticorpos testados não mostraram a ligação detectável acima do fundamento das citocinas de família yc exceto pelo IL-21 humano onde a ligação clara foi observada, consiste com Western blots prévia usando estes anticorpos (ver Exemplo 3). Tabela 5:

Reatividade de anticorpo IL-21 anti-humano monoclonal a citocinas yc em análise Western Blot

Reatividade de anticorpo IL-21 anti-humano de rato e camundongo monoclonal na análise Western Blot

Clone* Hu IL-21 Cino

Exemplo 5- Estudos de armazenagem de epítopo competitivo

Experimentos de armazenagem de epítopo foram realizadas para determinar que os anticorpos monoclonais anti-IL-21 são capazes da ligação simultaneamente a IL-21 humano. Tantos anticorpos de camundongo quanto humano foram representados. Os anticorpos monoclonais anti-IL-21 que competem para o mesmo, ou uma sobreposição, local de ligação (epítopo) no antígeno não são capazes de ligar simultaneamente e são funcionalmente agrupados em uma família simples ou "epítopo bin". Os anticorpos monoclonais anti-IL-21 que não compentem para o mesmo local de ligação no antígeno são capazes de ligar-se simultaneamente e são agrupados nas famílias separadas ou "epítopo bins". Os experimentos foram realizados usando um instrumento BIACORE TIOO™. Os experimentos de armazenagem de epítopo foram realizados com IL-21 humano solúvel (ZymoGenetics) como o antígeno.

Os estudos de armazenagem de epítopo foram realizados em um sistema BIACORE TIOO™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Os métodos foram programados usando o software de controle BIACORE TIOO™, v 1.1.1. Os anticorpos monoclonais anti-IL-21 individuais foram covalentemente imobilizados para separar as células de fluxo do BIACORE sensor chip CM4. Subsequentemente, o antígeno IL-21 foi injetado e permitido para ligar-se especificamente ao anticorpo monoclonal imobilizado no sensor chip. O instrumento Biacore mede a massa de proteína ligado a superfície de chip sensor e desta maneira, imobilização do anticorpo primária de um par testado e ligação específica do antígeno IL-21 ao anticorpo primário foram verificados por cada ciclo testado. Seguindo a ligação do antígeno IL-21, um anticorpo monoclonal anti-IL-21 secundário foi injetado e permitido ligar-se. Se o anticorpo monoclonal anti-IL-21 secundário foi capaz de ligação do antígeno simultaneamente com o anticorpo monoclonal primário, um aumento na massa da superfície do chip, ou ligação, foi detectado. Se, entretanto, o anticorpo monoclonal anti-IL-21 secundária não foi capaz de ligação do antígeno simultaneamente com o anticorpo monoclonal primário, nenhuma massa adicional, ou ligação, foi detectado. Cada anticorpo monoclonal anti-IL-21 testada contra o mesmo foi usado como o controle negativo para estabelecer o nível do sinal do fundamento (nenhuma ligação).

Uma série de experimentos foi considerado testar as propriedades de ligação de anticorpos monoclonais anti-IL-21 purificados obtidos a partir das fusões de hibridoma dos baços de camundongos imunes a IL-21 humano. O primeiro anticorpo monoclonal anti-IL-21 de um par testado foi covalentemente imobilizado usando EDC:NHS a uma densidade de aproximadamente 1000 RU. O antígeno IL-21 foi diluído a 100 nM e permitido fluir na superfície do anticorpo imobilizado. Subsequentemente, o anticorpo secundário de um par testado foi diluído a 5 μg/mL (aproximadamente 32,2 nM) e permite para ligar-se ao antígeno IL-21 capturado. Uma subsérie de anticorpos monoclonais anti-IL-21 foi testado como o anticorpo primário em combinação com o painel total de anticorpos monoclonais anti-IL-21 secundários. Os experimentos de ligação foram realizados com uma taxa de fluxo a 30 μL/minutos a 25° C. O tampão para estes estudos que consiste de 10 mM de Hepes, 0,3 M de NaCl, 0,05 % de tensoativo P20, 5 mM de CaCl2, 1 mg/mL de albumina de soro bovino, pH 8.0. Entre os ciclos, o anticorpo no chip foi regenerado com 20 mM de ácido clorídrico. Os dados foram colecionados usando software de avaliação BIACORE TIOO™ (versão 1.1.1), então carregado em EXCEL ™ para o processamento de dados adicionais.

Os anticorpos monoclonais anti-IL-21 purificados foram caracterizados e determinados em epítopo bins. O sinal (RU, unidades de resposta) relacionados pela BIACORE é diretamente correlacionado a massa na superfície do sensor chip. Uma vez do nível do sinal de fundamento (RU) associado com os controles negativos foi estabelecido (o mesmo anticorpo monoclonal anti-IL-21 usado como tanto o anticorpo primário quanto secundário), os resultados de armazenagem foram relacionados como ligação positiva ou negativa. A ligação positiva indica que dois anticorpos monoclonais anti-IL-21 diferentes são capazes de ligar-se ao antígeno simultâneo. A ligação negativa indica que dois anticorpos monoclonais anti- IL-21 diferentes não são capazes da ligação do antígeno simultâneo. O diferencial entre valores de resposta positiva e negativa neste experimento foi significante e permitido por uma indicação indefinida dos anticorpos monoclonais anti-IL-21 em seis famílias distintas, ou epítopos bin. O primeiro epítopo bin foi representado pelos anticorpos monoclonais anti-IL-21 de, por exemplo, clones 338.5.4; 362.78.1 e 362.597.3. O segundo bin foi representado pelos anticorpos monoclonais anti-IL-21 de, for exemplo, clones 338.14.3; 362.75.1.1 e 366.328.10. Um terceiro bin adicional foi observado para a sobreposição dos epítopos de ligação de anticorpos bin #1 e bin #2. Foi representado pelo anticorpo monoclonal de, por exemplo, clone 366.552.11. Os anticorpos que neutralizam IL-21 são observados em cada um destes três bins.

Três epítopos bins adicionais foram identificados. Cada um destes bins foi representado pelo anticorpo monoclonal de, por exemplo, os clones de hibridoma 366.345.6.11 (bin #4), 338.28.6 (bin#5) e 338.39.5 (bin#6). Os anticorpos identificados nestes três bins não neutraliza a bioatividade IL-21 humana.

Exemplo 6- Estudos de competição receptora solúvel

Experimentos de competição foram realizados para determinar pelo qual os anticorpos monoclonais IL-21 anti-humanos são capazes de ligar- se IL-21 simultaneamente com o receptor solúvel IL-21. Os anticorpos monoclonais IL-21 anti-humanos que competem com o receptor solúvel para o mesmo, ou uma sobreposição, local de ligação (epítopo) no antígeno não são capazes de ligar simultaneamente. Os anticorpos monoclonais anti-IL-21 que não contem com o receptor solúvel para o mesmo local de ligação no antígeno são capazes de ligar-se simultaneamente. Os experimentos competição foram realizados com IL-21 humano recombinante solúvel como o antígeno. O antígeno IL-21 foi deixado ligar o anticorpo monoclonal antes da competição com o receptor solúvel IL-21. Duas versões do receptor solúvel IL-21 (ambos produzidos por ZymoGenetics) foram utilizados pela análise de anticorpo monoclonal nestes estudos: uma versão do receptor consiste de um receptor homodimérico (IL-21R-Fc) composto do domínio extracelular do receptor IL-21 fundido a uma molécula Fc derivado a partir do imunoglobulina humana. A segunda forma receptora solúvel foi um receptor heterodímero (IL-21R/yc-Fc) composto de uma subunidade que compreende o domínio extracelular do receptor IL-21 fundido a uma molécula Fc derivado a partir do imunoglobulina humana e uma segunda subunidade que compreende o domínio extracelular da cadeia comum y comum fundido a uma molécula Fc derivado a partir do imunoglobulina humana, como descrito na Patente U.S. co-reconhecido 6.777.539 incorporado por referência neste em sua totalidade.

Estudos de competição foram realizados em um sistema BIACORE TIOO™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Os métodos foram programados usando software de controle BIACORE TIOO™, v 1.1.1. Os anticorpos monoclonais anti-IL-21 individuais foram covalentemente imobilizados para separar as células de fluxo de um sensor chip CM4 BIACORE. Subsequentemente, o antígeno IL-21 (SEQ ID N°: 2) foi injetado e permitido para ligar-se especificamente ao anticorpo monoclonal imobilizado no sensor chip. O instrumento Biacore mede a massa de proteína ligado a superfície de chip sensor e desta maneira, imobilização do anticorpo primária e ligação específica do antígeno IL-21 ao anticorpo primário foram verificados por cada ciclo testado. Seguindo a ligação do antígeno IL-21, o receptor solúvel foi injetado e permitido ligar-se. Se o receptor solúvel foi capaz de ligação do antígeno simultaneamente com o anticorpo monoclonal primário, um aumento em massa na superfície do chip, ou ligação, foi detectado. Se, entretanto, o receptor solúvel não foi capaz de ligação do antígeno simultaneamente com o anticorpo monoclonal primário, nenhuma massa adicional, ou ligação, foi detectado. Cada anticorpo monoclonal anti- IL-21 testada contra o mesmo foi usado como o controle negativo para estabelecer o nível do sinal do fundamento (nenhuma ligação). Como um controle positivo, cada anticorpo monoclonal anti-IL-21 fois testada contra um anticorpo anti-IL-21 a partir de um epítopo bin diferente para determinar o nível de sinal positivo (ligação).

Uma série de experimentos foram completados para testar as propriedades de ligação de 5 anticorpos monoclonais anti-IL-21 purificados (a partir dos clones de hibridoma 362.78.1, 366.75.1.1, 366.328.10, 366.552.11.31 e 366.345.6.11) que ligam-se ao IL-21 humano. O primeiro anticorpo monoclonal anti-IL-21 de um par testado foi covalentemente imobilizado usando uma mistura de 0,4 M de EDC [N-etil-N-(3-dietilamino- propil) carbodiimida] e 0,1 M de NHS (N-hidroxisuccinimida) a uma densidade de aproximadamente 1000 RU. Após a imobilização do anticorpo, os locais ativos na célula de fluxo foram bloqueados com 1M de etanolamina. O antígeno IL-21 foi diluído a 100 nM e permitido fluir na superfície do anticorpo imobilizado. Subsequentemente, o receptor solúvel foi diluído a 10 μg/mL e permitido para ligar-se ao antígeno IL-21 capturado. Os experimentos de ligação foram realizados com uma taxa de fluxo a 30 μL/minutos a 25° C. O tampão para estes estudos que consiste de 10 mM de

Hepes, 0,3 M de NaCl, 0,05 % de tensoativo P20, 5 mM de CaCl2, 1 mg/mL de albumina de soro bovino, pH 8.0. Entre os ciclos, a célula de fluxo foi lavado com 20 mM de ácido clorídrico para regenerar a superfície. Esta etapa de lavagem removido do antígeno IL-21 e qualquer ligação do receptor solúvel a partir da superfície de anticorpo imobilizado e permite a ligação subsequente da próxima amostra testada. Os dados foram colecionados usando software de avaliação BIACORE TIOO™ (versão 1.1.1).

Os anticorpos monoclonais anti-IL-21 purificados foram caracterizados por sua capacidade de competir com o receptor solúvel IL-21 humano para a ligação ao antígeno IL-21. O sinal (RU, unidades de resposta) relacionados pela BIACORE é diretamente correlacionado a massa na superfície do sensor chip. Uma vez do nível do sinal de fundamento (RU) associado com os controles negativos foi estabelecido (o mesmo anticorpo monoclonal anti-IL-21 usado como tanto o anticorpo primário quanto secundário), os resultados de competição foram relacionados como ligação positiva ou negativa. A ligação positiva indica que o anticorpo monoclonal anti-IL-21 e receptor solúvel IL-21 são capazes de ligar-se o antígeno simultâneo. A ligação negativa indica que o anticorpo monoclonal anti-IL-21 e o receptor solúvel IL-21 não são capazes da ligação do antígeno simultâneo. O diferencial entre valores de resposta positiva e negativa neste experimento foi significante e permitido por uma determinação indefinida de competição entre os anticorpos monoclonais anti-IL-21 e receptor solúvel IL-21.

Os anticorpos monoclonais a partir dos clones de hibridoma 362.78.1 e 366.552.11.31 competidos com as ambas as versões do receptor solúvel IL-21 (IL-21R-Fc homodimérico e IL-21R/yc-Fc heterodimérico) para a ligação ao antígeno IL-21 humano. Os anticorpos monoclonais a partir dos clones de hibridoma 366.328.10 e 366.345.6.11 não competem com a versão do receptor solúvel para a ligação ao antígeno. O anticorpo monoclonal a partir do clone de hibridoma 362.75.1.1 mostrou a competição parcial para a ligação com ambos as formas do receptor solúvel. Estes estudos foram realizados com o antígeno IL-21 pré-ligados ao anticorpo monoclonal. Três destes anticorpos (362.78.1, 366.328.10, 366.552.11.31) foram mostrados para neutralizar IL-21 humano enquanto os anticorpos de anticorpo monoclonal a partir dos clones de hibridoma 362.75.1.1 e 366.345.6.11 são, depedendo do ensaio, muito fraco, ou não neutralizadores de Biatividade IL- 21 humano.

Exemplo 7- Ensaio de bioatividade IL-21 Baf3/huIL-21R STAT3

O seguinte bioensaio STAT3 fosforilado foi usado como uma avaliação primária para mediar a neutralização dos tituladores anti-IL-21 no soro de murino bem como níveis relativos de neutralização IL-21 pelos sobrenadantes de hibridoma e anticorpos anti-IL-21 purificados. A atividade IL-21 foi determinada pela medição do nível de fosforilação STAT3 seguindo a interação receptora de ligando em células Baf3/KZ134/hulL-21R (ver Spolski and Leonard, Annu Rev Immunol. Nov 8; 2007). Atividade de neutralização relativa foi determinada com base na diminuição em níveis STAT3 fosforilados usando uma concentração EC50 de IL-21 e uma titulação de antagonista.

As células Baf3/KZ134/hulL-21R foram lavadas duas vezes com meio de ensaio (RPMI 1640 com 5 % de soro bovino fetal, lx Glutamax, 1 % de piruvato de sódio e 2 μM β-Mercaptoetanol; todos de Invitrogen, Carlsbad, CA) antes de ser colocado a 40.000 células/reservatório em placas de cultura do tecido de fundo redondo de 96 reservatórios (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). As células foram colocadas em um incubador de cultura do tecido a 37° C enquanto as soluções testadas foram preparadas. Para determinar as concentrações EC50 e EC90 de IL-21 neste ensaio, as séries de diluições de IL-21 humano recombinante foram preparadas em meio de ensaio e colocado em uma placa de funda em U de 96 reservatórios separados. Altemativamente, para testar pela neutralização IL-21, uma concentração

EC5O de IL-21 (determinado ser 33 pM) foi pré-incubado com as séries de diluições de soro de camundongo IL-21 imunizado, meio de hibridoma consumido, IL-21R humano solúvel purificado/yc-Fc ou anticorpos anti-IL-21 monoclonal purificado. Tanto a placa celular quanto a placa de solução foram então incubados em uma câmara de cultura de tecido umidificado para equilibrar por 30 minutos a 37° C e 5 % de CO2. Após 30 minutos, a reação foi iniciada pela transferência das soluções IL-21 a placa celular e incubação por 10 minutos a 37° C e 5 % de CO2.

Seguindo a incubação de 10 minutos, as reações foram interrompidas pela colocação da placa em gelo e adição 125 μL de tampão de lavagem da célula gelado (BIO-PLEX Cell Lysis Kit, BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA) a cada reservatório. As células foram então rotacionadas em 1500 rpm a 4° C por 5 minutos e o meio aspirado. Para lisar as células, 50 μL/reservatorio de tampão de líse (preparada de acordo com as instruções de fabricantes, BIO-RAD Labs) foi adicionado em cada reservatório. Os lisados celular foram então pipetados para cima e para baixo cinco vezes enquanto em gelo e agitado em um agitador de plataforma de microplaca por 20 minutos a 600 rpm a 4o C. As placas foram então centrifugadas a 3000 rpm em 4o C por 20 minutos. Os sobrenadantes foram coletados e transferidos a uma nova placa microtituladora e mistura 1:1 com tampão de ensaio (BIO- RAD) pela armazenagem a -20° C.

As pérolas de captura (BIO-PLEX Phospho-STAT3 Assay, BIO-RAD Laboratories) foram diluídas e colocadas em uma placa de filtro de 96 reservatórios (Millipore Corporation, Ireland) de acordo com as instruções de fabricante. As placas foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem (BIO-RAD) e 50 μL da mistura do lisado celular foi transferido a cada reservatório. Cada placa foi então empacotada na folha de alumínio e agitado durante a noite em temperatura ambiente e 300 rpm. O dia seguinte, a placa foi transferida a um mecanismo à vácuo microtitulador e lavada duas vezes com tampão de lavagem. Após a adição de anticorpo de detecção 25 μL/reservatorio (BIO-RAD), a placa coberta com folha foi incubada em temperatura ambiente por 30 minutos com agitação a 300 rpm. A placa foi filtrada e lavada duas vezes com tampão de lavagem. PE estreptavidina (BIO- RAD; 50 μL/reservatorio) foi adicionado e a placa coberta com folha foi incubada em temperatura ambiente por 15 minutos com agitação a 300 rpm. A placa foi filtrada e lavadas duas vezes e recolocadas em suspensão em 125 μL/reservatorio de tampão de resuspensão de pérola (BIO-RAD). O nível de STAT3 fosforilado foi então avaliado usando um leitor de arranjo (BIO- PLEX, BIO-RAD Laboratories) de acordo com as instruções de fabricantes. Os dados foram analisados usando software analítico (BIO-PLEX MANAGER 3.0, BIO-RAD Laboratories). O aumento no nível do fator de transcrição STAT3 fosforilado presente no lisado foram indicados de uma interação do ligando-receptor IL-21. Pelo ensaio de neutralização, diminui o nível do fator de transcrição STAT3 fosforilado presente no lisado foram indicados pela neutralização da interação do ligando-receptor IL-21. Os valores IC50 (concentração de antagonista que produz 50 por cento de inibição de atividade ligando) foram calculados usando software GraphPad Prism®4 (GraphPad Software, Inc., San Diego CA) e expressado como as concentrações molares para cada reagente no ensaio de neutralização.

A fosforilação STAT3 induzida por IL-21 humana em uma maneira dependente da dosagem com uma concentração EC50 determinado ser aproximadamente 33 pM. Tabela 7 resume os valores IC50 pelo controle positivo (IL-21R humano solúvel/proteína fusão yc-Fc) e o IL-21 que neutraliza as entidades descritas neste. Estes dados que indicam que os IL-21 que neutralizam os anticorpos foram ativos e foram iguais ou melhor do que o controle positivo na redução da fosforilação STAT3 induzida por IL-21. Tabela 7: Valors IC50 no ensaio de fosforilação STAT3

* Experimento 3 conduzindo usando-se 96 pM IL-21

Exemplo 8- Ensaio de bioatividade de luciferase IL-21 Baf3/huIL- 21R STAT

Este ensaio 24 hora mede a atividade de luciferase STAT induzido por IL-21 em células transfectadas Baí3/KZ134/huIL-21 R. As células transfectadas Baf3/KZ134/huIL-21R foram lavadas duas vezes com meio de ensaio (RPMI isento de fenol vermelho 1640 com 5 % de soro bovino fetal, lx Glutamax, 1 % de piruvato de sódio e 2 μM (3- Mercaptoetanol; todos de Invitrogen, Carlsbad, CA) antes sendo colocado em 40.000 células/reservatório em uma placa de cultura branca opaco de plano fundo de 96 reservatórios (Coming/Costar, Lowell, MA). As células foram então colocadas em um incubador de cultura do tecido enquanto as soluções testadas foram preparadas. Em uma placa preparada, IL-21 humano foi misturado com o meio ou um faixa de antagonistas IL-21 (anticorpos monoclonais ou receptor IL-21 humano solúvel/yc-Fc). Uma vez misturado, esta placa também foram transferidas a incubador de cultura do tecido 37° C umidificado. Após 30 minutos as soluções testadas foram transferidas à placa celular e mistura. Esta placa foi então colocada novamente no incubador por 24 horas. Após 24 horas, as células foram removidas a partir do incubador e permitido para esfriar até a temperatura ambiente. Cada reservatório foi então diluído 1:1 com um volume de 100 gL de reagente Steady-Gio Luciferase (Promega, Madison, WI) e misturado cuidadosamente. A placa foi revestida e agitada em temperatura ambiente por 10 minutos e unidades de luciferase relativa (RLU) foram medidas em um luminometro.

Para determinar as concentrações EC5o e EC5o de IL-21 neste ensaio, as séries de diluições de IL-21 humano recombinante que varia de 0 a 100 ng/mL foram testados. A concentração EC5o de IL-21, ~15 ng/mL (961 pM), foi usado nos experimentos de neutralização subsequente. Nestes exerimentos, os clones 362.78.1 (e seu subclone 362.78.1.44 e contraparte expressado de CHO, 362.78-CHO; ver Exemplo I) e 362.328.10.63 demonstrou a atividade IL-21 anti-A mais potente, com as concentrações IC50 na faixa de 300 a 850 pM, enquanto os valores IC50 para o receptor IL- 21R humano solúvel/controle yc-Fc que varia de 650 a 1830 pM. As atividades relatives que neutralizam as entidades descritos neste são resumidos na Tabela 8.

Tabela 8: IC5o Values in 24 hr STAT-Luciferase Assa

Exemplo 9- Reação cruzada a atividade IL-21 de rato, murino ou macaco cinomólgo

Os estudos de reação cruzada das espécies (especialmente pela reatividade humana) são importantes para completar antes dos estudos de toxicologia/farmacologia pré-clínica quando um desenvolvimento de antagonista terapêutico. A fim de determinar se um anti-IL-21 humano que neutraliza as entidades descrito neste podem reagir cruzado e neutralizar a atividade induzida por IL-21 cinomólgo, IL-21 de murino ou IL-21 de rato (e portanto, justificar macacos cinomólgos, camundongos e/ou ratos como espécies testadas viáveis), foi primeiro necessário para demonstrar bioatividade de 11-21 de rato, de murino, cinomólgo recombinante. Os

métodos para ensaios de atividade de luciferase IL-21 STAT- descritos no Exemplo 8 foram usados para determinar os valores EC5o e EC5o para o IL-21 humano recombinante, IL-21 cinomólgo, IL-21 de murino e IL-21 de rato (todo produzido no ZymoGenetics). Os resultados indicam que os níveis de atividade de luciferase STAT induzida por IL-21 de murino, cinomólgo e humano neste ensaio amplamente diferem-se. Os valores EC50 usados nos experimentos subsequentes foram determinados ser como seguem: 961 pM para IL-21 humano; 102 pM para IL-21 de macaco cinomólgo; 6,41 nM para IL-21 de camundongo e 1,08 nM para IL-21 de rato. O receptor solúvel IL-21 (hIL-21 R/yc-Fc) neutraliza os efeitos de rato, murino e cinomólgo.

IL-21. Adição dos anticorpos monoclonais purificados anti-IL- 21 mostrados na Tabela 9 neutralizam o IL-21 cinomólgo que variam o grau mas não neutraliza o IL-21 de rato ou murino (nota-se que apenas 362.78- CHO e 366.552.11 foram testados contra IL-21 de rato). Os valores IC50 para a neutralização de IL-21 cinomólgo pelo qual neutraliza as entidades descritas neste que varia de -100 pM a 431 pM e são resumidos na Tabela 9. Deve ser notado que o melhor IL-21 humano que neutraliza os anticorpos que foi todos capazes de neutralizar efetivamente o IL-21 cinomólgo mas não IL-21 de murino ou IL-21 de rato. Adicionalmente, a célula CHO produzida IL-21 mAb (362.78-CHO) foi testado em um experimento separado usando uma concentração de 800 pM de IL-21 de macaco cinomólgo.

Tabela 9: Reação cruzada de antagonistas hIL-21 a macaco cinomólgo, IL-21 de rato e murino no ensaio de luciferase STAT.

* Nota-se: O Clone 362.78-CHO (Exemplo 1 b) foi testado usando uma concentração 800 pM de cIL-21 em vez de 100 pM como foi usado em outros experimentos. N/T = não testado.

Exemplo 10- Avaliação de reação cruzada potencial a IL-4 em um ensaio com 5 base celular

Quando o desenvolvimento de um antagonista de citocina terapêutica, é importante conhecer se este reativará com e neutraliza estruturalmente as citocinas relacionadas. Este ensaio de proliferação de célula B primária foi projetado para testar o IL-21 que neutraliza as entidades 10 descrito neste para a reação cruzada e neutralização de IL-4 humano.

O isolamento de células B primárias: Para obter as células B primárias, 200 rnL de sangue periférico foi coletado a partir de voluntários humanos saudáveis (ZymoGenetics). O sangue foi diluído a 400 ml com temperatura ambiente PBS e 35mL de alíquotas foram feitas em tubos cônicos 15 de 50 ml. Quatorze mL de Ficoll/Hypaque em temperatura ambiente (Pharmacia, Uppsala, Sweden) foi sustentado e os tubos foram rotacionados por 20 minutos a 2000rpm. A camada de interface PBMC é aspirada e lavada duas vezes com tampão MACS (PBS, HEPES 20 mM e 1 % de BSA; Invitrogen, Carlsbad, CA). As células foram contadas e células B foram 20 negativamente selecionadas usando o kit de isolamento de célula B a partir de Miltenyi Biotec (Aubum, CA) seguindo o protocolo resumido pelo fabricante. Uma pequena amostra das células B purificadas foram testados pela pureza para a análise FACS e observado ser >97 % CD 19 puro+ células B em todos os experimentos.

Ensaio de proliferação: células B proliferativas em resposta a IL-4 co-cultura com anti-IgM imobilizado. Para determinar a reação cruzada potencial e neutralização de IL-4 pelos mAbs anti-IL-21, células B previamente isolados foram primeiro colocados a 40.000 a 50.000 células/reservatório em uma placa de cultura de tecido com fundo em U com 96 reservatórios (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) que foram pré- revestidos com 1,0 μg/mL anti-IgM (Southern Biotech, Birmingham, AL). As células foram então tratadas com 10 ng/mL IL-4 humano recombinante (Sistemas R&D; Minneapolis, MN) e uma série de titulação de um antagonista IL-21 (anticorpos testados ou controles). As células foram então incubadas por 3 dias a 37° C e 5 % de CO2 em um incubador umidificado de cultura do tecido. Após três dias, as células foram pulsadas com 1 μCi/reservatorio de [3H]-Timidina (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Após 16 horas, as células foram coletadas em filtros de fibra de vidro e a quantidade de [3H]-incorporação foi quantificado usando um contador beta (Topcount NXT, Packard). Nenhum dos três anticorpos monoclonais anti-IL- 21 testados (362.78.1, 366.328.10.6 e 366.552.11.31) mostraram qualquer neutralização de proliferação induzida por IL-4 em até 250 vezes o excesso molar.

Exemplo 11 A. Avaliação de Reação cruzada potencial a IL-2 e IL-15 em um ensaio com base celular Quando o desenvolvimento de um antagonista de citocina terapêutica, é importante para determinar se reativará com e neutraliza estruturalmente as citocinas relacionadas. A linha de célula T de murino, CTLL-2, pode ser induzido a proliferativa em resposta a IL-2 humano ou IL- 15. Portanto, este ensaio foi escolhido testar o IL-21 que neutraliza as entidades descrito neste para a reação cruzada e neutralização de IL-2 humano e IL-15.

As células CTLL-2 foram lavadas três vezes em meio de bioensaio de proliferação (RPMI 1640, 2x Glutamax, 10 % de FBS, 2x NaPyr, lx B-mercaptoetanol e 20 mM de Hepes; Invitrogen, Carlsbad, CA) e colocado nas células 50000 por reservatório em placas de cultura de tecido de fundo redondo de 96 reservatórios (Becton Dickinson, Franklin Falls, NJ). A estas células, uma dosagem EC50 pré-determinada IL-2 (3,0 ng/mL) ou IL-15 (0,5 ng/mL) em combinação com uma série de diluição de IL-21 que neutraliza as entidades foi adicionado. A razão de citocina a anticorpo que varia de 250 vezes o excesso molar a uma razão 1:1. Anti-IL-2 ou anti-IL-15 que neutralizam os anticorpos (ambos de Sistemas R&D, Minneapolis, MN) foram usados como controles positivos. As células foram então incubadas por 24 horas a 37° C e 5 % de CO2 em um incubador umidificado de cultura do tecido. Após 24 horas, as células foram pulsadas com 1 μCi/reservatorio de [3H]-Timidina (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Dezesseis horas depois, as células foram coletadas em filtros de fibra de vidro e a quantidade de [3H]-incorporação foi quantificada usando um contador beta (Topcount NXT, Packard).

Resultados: Nenhum dos três anticorpos monoclonais anti-IL- 21 testados (362.78.1, 366.328.10.6 e 366.552.11.31) mostraram qualquer neutralização de IL-2 ou proliferação induzida por IL-15. 11B- Confirmação usando a resonância de plasmon de superfície (Biacore) que IL-21 mAb 362.78-CHO não liga-se a citocinas humanas relacionadas IL-21 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 ou IL-15.

O anti-IL-21 mAb 362.78-CHO foi avaliado por intermédio da resonância de plasmon de superfície pela reatividade cruzada potencial a IL-2 humano, IL-4 humano, IL-7 humano, IL-9 humano e IL-15 humano.

Materiais e métodos: experimentos foram completados para testar a reatividade cruzada do anticorpo monoclonal anti-IL-21 362.78-CHO para IL-2 humano, IL-4 humano, IL-7 humano, IL-9 humano e IL-15 humano. Os estudos de ligação foram realizados em um BIACORE TIOO™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Os métodos foram programados usando software de controle BIACORE TIOO™, v 2.0. O anticorpo específico de gama Fc IgG anti-humano de cabra (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) foi covalentemente imobilizado as células de fluxo 1 e 2 de um sensor chip CM4 usando química de ligação de amina (EDC:NHS). O anticorpo monoclonal anti-IL-21 purificado 362.78-CHO foi subsequentemente capturado na célula de fluxo 2 do sensor chip em uma densidade de aproximadamente 240 RU. A célula de fluxo I foi usada como a superfície de referência.

IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15 (todos adquiridos de Sistemas R&D, Minneapolis, MN) foram injetados na superfície de anticorpo capturada (pela célula de fluxo 2) e a referência da célula de fluxo (pela célula de fluxo 1) em concentrações de 100, 20 e 4 nM. Como um controle positivo para esta série de experimentos, IL-21 (produzida a ZymoGenetics) também foi injetado nas concentrações idênticas. Os estudos de ligação foram realizados com uma taxa de fluxo a 25 μL/minutos, um período de associação de 2 minutos e um período de dissociação de 3 minutos. Todos os experimentos de ligação foram realizados a 25° C em um tampão de 10 mM de HEPES, 300 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2, 0,05 % de tensoativo P20 (Biacore), 1 mg/mL de albumina de soro bovino, pH 8.0. Entre os ciclos, a célula de fluxo foi lavada com 20 mM de ácido clorídrico para regenerar a superfície. Esta etapa de lavagem remove tanto o anticorpo 362.78-CHO captura quanto qualquer antígeno de ligação a partir da superfície chip. Os dados foram colecionados usando software de avaliação BIACORE TIOO™ (versão 2.0). O dado foi processado subtraindo as referências da célula de fluxo e injeções em branco. A estabilidade linha de base foi avalida para garantir que a etapa de regeneração fornece uma superfície de ligação consistente em toda parte da sequência de injeções.

Resultados: Nenhuma ligação de IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, ou IL- 15 ao anticorpo 362.78-CHO foi observada. Em constraste, o controle positivo IL-21 demonstrou uma ligação dependente da dosagem que consite com estudos prévios.

A falta da reatividade cruzada foi subsequentemente explicada pelo mapeamento dos estudos de epítopo de clone 362.78 (ver Exemplo 17). Os aminoácidos localizados em e próximos a Hélice D de IL-21 mostrou ser ligado por clone 362.78 (EKKPPKEFLERFKSLL; SEQ ID N°: 2 do resíduo 129 a 144)) não são bem conservados entre as citocinas de cadeia gama humana relacionada, não dentro de IL-21 de camundongo, como mostrado abaixo na Tabela 10. Tabela 10 IL21_HUMANO TCPSCDSYEKK--PPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSTHGSEDS IL21_CAMUNDONGO KCPSCDSYEKR--TPKEFLERLKWLLQKMIHQHLS IL15_HUMANO CKECEELEEK--NIKEFLQSFVHIVQMFINTS IL2_HUMANO TTFMCEYADET-ATIVEFLNRWITFCQSIISTLT IL4_HUMANO ---GLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSS IL7_HUMANO SLEENKSLKEQKK-LNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH IL9_HUMANO CEQPCNQTTAG--NALTFLKSLLEIFQKEKMRGMRGKI IL-21 human é mostrado como SEQ ID N°:2; IL-21 de camundongo é mostrado como a SEQ ID N°:11; IL-15 humano é mostrado como SEQ ID N°:92; IL-2 humano é mostrado como SEQ ID N°:93; IL-4 humano é mostrado como SEQ ID N°:94; IL-7 humano é mostrado como SEQ ID N°:95; IL-9 humano é mostrado como SEQ ID N°:96.

Exemplo 12-Ensaios de proliferação da célula B

Ensaios de célula B primários

Para adicionar o teste da atividade de IL-21 que neutraliza as entidades, dois ensaios de célula B primário foram desenvolvidos. O ensaio de proliferação de célula B foi usado para demonstrar neutralização de proliferação induzida por IL-21 em 4 dias no ensaio de diferenciação da célula B que demonstra a neutralização da diferenciação de célula de plasma induzido por IL-21 em 8 dias. Estes experimentos demonstram a neutralização de IL-21 nos ensaios biologicamente relevantes de termo longo.

Isolamento de células B humanas primárias: Para obter células B primárias, 200 mL de sangue periférico foi coletado a partir de voluntários humanos saudáveis (ZymoGenetics). O sangue foi diluído com 200 mL de temperatura ambiente PBS e alíquotas a 35 mL foram feitas em tubos cônicos de 50 ml. Quatorze mL de Ficoll/Hypaque em temperatura ambiente (Pharmacia, Uppsala, Sweden) foi sustentado e os tubos foram rotacionados por 20 minutos a 2000rpm. A camada de interface PBMC é aspirada e lavada duas vezes com tampão MACS (PBS, HEPES 20 mM e 1 % de BSA; Invitrogen, Carlsbad, CA). As células foram contadas e células B foram negativamente selecionadas usando o kit de isolamento de célula B de Miltenyi Biotec (Aubum, CA) seguindo o protocolo resumido pelo fabricante. Uma pequena amostra das células B purificadas foram testadas pela pureza para as análise FACS e observadas ser > 97 % pura em todos os experimentos.

Ensaio de proliferação: células B proliferativas em resposta a co-cultura com anti-CD40 e IL-21. Para determinar a atividade de neutralização de mAbs anti-IL-21; as células B foram colocadas nas 40000 a 50000 células/ reservatório em uma placa tratada com cultura de tecido de fundo em U de 96 reservatórios (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). As células foram então tratadas com 0,1 μg/mL anti-CD40 (CD40 policlonal anti- humano de cabra; Sistemas R&D, Minneapolis, MN), 50 ng/mL (3,2InM) IL- 21 recombinante (ZymoGenetics, AI207F) e uma titulação de um antagonista IL-21 (mAbs testados ou controles). A placa de células foi então incubada por 3 dias a 37° C e 5 % de CO2 em um incubador umidificado. Após três dias, as células foram pulsadas com 1 μCi/reservatorio de [3H]-Timidina (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Após 16 horas, as células foram então coletadas em filtros de fibra de vidro e a quantidade de [3H]-incorporação foi quantificado usando um contador beta (Topcount NXT, Packard). As curvas IC5o medem a neutralização efetiva de proliferação induzida por IL-21 foram calculados e expressados como uma concentração molar. Os valores IC50 para a neutralização da parte superior de mAbs descrito neste que varia de 0,71 nM a 6,55 nM e são resumidos na Tabela 11:

Tabela 11: Neutralização de IL-21 in B Cell Ensaio de proliferação

Ensaio de diferenciação da célula B: A diferenciação das células B naturais no anticorpo que produzem as células de plasma é numerosamente facilitado in vitro quando IL-21 é combinado com anti-CD40 e IL-4 (Ettinger et al., J Immunol, 175:7867-79, 2005; Ettinger et al, J Immunol. 178:2872-82, 2007; Kuchen et al. J Immunol. 179:5886-96, 2007). Para demonstrar a atividade em um ensaio de termo mais longo do que os dois ensaios de avaliação com base em Baf3 descritos nos Exemplos 7 e 8, que neutraliza as entidades descritas neste foram usadas para neutralizar IL-21 e inibir uma diferenciação da célula de plasma humana. Para companhar estas células B humanas primárias foram colocadas nas 150.000 células/reservatório em uma placa tratada pela cultura de tecido de superfície plana funda com 96 reservatórios (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). As células foram então tratadas com 0,lμg/mL anti-CD40 (CD40 policlonal anti- humano de cabra; Sistemas R&D, Minneapolis, MN), lOng/mL IL-4 humano recombinante (Sistemas R&D) e 25ng/mL (l,6nM) IL-21 humano recombinante (ZymoGenetics). Os antagonistas IL-21 (mAbs testados ou controles) foram então adicionados e as células incubadas a 37° C e 5 % de CO2 por oito dias em um incubador umidificado. No final dos oito dias, os meios condicionados foram coletados (pelos tituladores de anticorpo) e células granuladas pela análise de citometria de fluxo subsequente.

Análise da célula B usando citometria de fluxo: As células foram recolocadas em suspensão em tampão FACS humano (HBSS, 20mM de HEPES, 1 % de BS A (todos de Invitrogen) e 2 % de soro Ab humano (Gemini Bio-Products, Woodland, CA)) por cinco minutos para bloquear os receptores Fc. As células foram então centrifugadas (5 minutos a 1200 rpm) e aspiradas. As cepas foram preparadas pela diluição dos anticorpos 1:100 em tampão FACS humano e dispersão 100 μL por amostra. As cepas simples (para ajustar a regulação de compensação de citômetro) e uma mistura de multicepa foram preparadas usando os segundos anticorpos: anti-CD138- FITC, anti-IgD-PE, anti-CD38-PE-Cy5.5 e anti-CD19-APC. As células de plasma foram definidas como células amplas CD19+, IgD10, CD38+e CD138+ (avaliado por dispersão leve avançada). A porcentagem das células de plasma relativas a células B totais foi usada para determinar a efetividade que neutraliza as entidades descritas neste.

Resultados: quando IL-21 foi combinado com IL-4 e anti- CD40, aproximadamente 50 % das células B amplas vivas no dia 8 foram as células de plasma IgDlow, CD138+. Sem IL-21, a proporção das células de plasma foi ~8 % das células B amplas. A adição de várias antagonistas IL-21 as culturas contendo IL-21 diminui a proporção das células de plasma em uma maneira dependente da dosagem. O clone 362.78.1 foi o neutralizador mais efetivo e quase completamente neutralizado na atividade IL-21 como antagonista:razões de ligando 10:1 e 2.5:1. Os outros anticorpos testados, clones 366.328.10.63 e 366.552.11.31 foram próximo como efetivo na neutralização de IL-21 conduzindo a diferenciação. Este dado é resumido na Tabela 12.

Tabela 12: Inibição da diferenciação da célula de plasma humana pela neutraliza de anti-hIL-21 mAbs

Nota-se que o antagonista atual: razões de ligando pelo clone 366.552.11.31 foram 14,4, 3,6, 0,9 e 0,22:1

Exemplo 13- Modelo de camundongo DTH

As respostas DTH são respostas imunes clássicas que são iniciadas pelas células CD4+ T e mediada pelas células T, neutrófilos e macrófagos. Uma resposta DTH é um bom indicador de uma resposta mediada pela célula CD4+ T. Os camundongos são imunizados subcutaneamente com proteína de ovalbumina de galinha (OVA) em nennhum dos dois adjuvantes, Complete Freunds Adjuvant (CFA; Sigma) ou Ribi (Sigma; aka MPL + TDM + CWS adjuvant). Esta fase é denominada a fase de sensibilização (dias 0-6). As medições auditivas foram realizadas sete dias depois. Os camundongos são então injetados em cada ouvido com PBS de controle (ouvido esquerdo) ou OVA (ouvido direito). Esta fase é denominada a fase de desafio (dias 7 a 8). Respostas imunes geradas a inflamação que induz OVA no ouvido resultando um aumenbto na espessura do ouvido em 24 horas no ouvido tratado por OBS mas não no tratado por OVA. Este é medido usando paquímetros.

Camundongos C57BL/6 (n=8/grupo) são imunizados no dorso com 100 μg de ovalbumina de galinha (OVA) emulsificado em CF A em um volume total de 200 μl. Se Ribi é usado em vez de CF A, 0,5mg/ml de ovalbumina é adicionado ao frasco simples de RIBI e vertido vigorosamente por 2 minutos para formar uma emulsão que é usada para injetar os camundongos. Sete dias após a imunização, os camundongos são injetados com 10 RI de PBS no ouvido esquerdo (controle) e com 10 pg OVA em PBS no ouvido direito em um volume de 10 μl. A espessura do ouvido de todos os camundongos é medido antes da injeção dos camundongos no ouvido (0 de medição). Espessura do ouvido é medido 24 horas após o desafio. A diferença na espessura do ouvido entre a medição 0 e a medição de 24 horas é calculada e é refletivo da inflamação no ouvido. Grupos dos camundongos são injetados com PBS ou concentração diferente de anticorpo anti-IL-21 intraperitoneamente de dias 0-6 (fase de sensibilização) ou de dias 7-8 (fase de desafio). A injeção no dia 7 e 8 é dada 2 horas antes da medição da espessura do ouvido no período de tempo 0 e 24 horas. No final do período de 24 horas, uma vez que a espessura do ouvido seja medida, os ouvidos foram cortados e colocados em formalina para a análise histológica.

Exemplo 14- Modelo de camundongo para Esclerose múltipla

Para testar se anti-IL-21 tem qualquer efeito em esclerose múltipla, a capacidade de anticorpos anti-IL-21 inibir a encefalomielite auto imune experimental (EAE-MS), um modelo de camundongo para MS é testado. O modelo de imunização de peptídeo 35-55 (MOG) de glicoproteína oligodendrócito de mielina dependente da célula T bem caracterizada em camundongos C57BL/6 é usada. O experimento é realizado para determinar que o anticorpo anti-IL-21 deve atrasar e/ou inibir as contagens da doença em EAE pela inibição da apresentação de antígeno mediado por DC ou pela itensificação das respostas da célula CD8 T. Ausência da resposta eficiente da célula CD8 T neste modelo exacerbado EAE (Malipiero et. al., Eur. J. Immunol., 27:3151-3160, 1997). No início atrasado da doença no modelo EAE em uma maneira dependente da dosagem sugere que o uso de anticorpo anti-IL-21 pode ser benéfico em MS.

O EAE é um modelo de camundongo para MS. Em um tal modelo, C57BL/6 os camundongos são imunizados com 100 μg de peptídeo MOG (MOG35-55) ou 100 μg de proteína MOG recombinante emulsificado em adjuvante CF A. dois mililitros de uma preparação a 0,5 mg/ml de MOG35-55 em PBS é adicionado a um frasco de CFA e vigorosamente vertido para emulsificar a solução ou uma razão 1:1 de MOG recombinante em CFA é preparada. Os dorsos dos camundongos são raspados e 100 μg de MOG/CFA é injetado subcutâneo nos dorsos dos camundongos. A pesagem dos camundongos foi realizada 2 dias antes e cada dia após a imunização. Os camundongos são então injetados no dia 2 intravenosa com 200 μl de toxina de coqueluche (PT), uma concentração final de 200 ng/camundongo. Os camundongos monitorados diariamente pelas contagens clínicas. Os grupos dos camundongos são injetados intraperitoneal com 200 μl de PBS, 100 μg de

BSA, 10 μg a 200 μg de anticorpo anti-IL-21 em um volume de 200 μl dos dias 0-20, ou 3x uma semana por 3 semanas. Os pesos dos camundongos, contagens clínicas e incidência são avaliadas e plotadas pela análise.

Exemplo 15: Anticorpo anti-mlL-21 diminui a incidência da doença e progressão em um modelo de camundongo de colite e psoríase de transferência adotiva de célula T

Células adotivas de células T naturais em camundongos imunocompromissados singenéicos ou divergido pela histocompatibilidade menor leva o desenvolvimento de colite (Leach MW et al 1996, Powrie F et al, 1997) bem como lesões de pele semelhante a psoríase (Schon MP et al., Nat Med. 2:183-8, 1997; Davenport CM et al., Int Immunopharmacol. 5:653- 72, 2002). O transplante somente 0,2 milhões das células T CD4+CD25- de camundongos BALB/C ou B10.D2 em camundongos C.B-17 SCID imunocompromissados resultados na perda de peso, evacuação positiva hemoculta e desenvolvimento das lesões de pele. Os sintomas nestes camundongos variam de colônia a colônia.

Este modelo de colite/psoríase tem algumas similaridades a doença de Crohn humana e psoríase e foi usado extensivamente para testar a eficácia dos terapêuticos para estas doenças em humanos. Para este experimento, os camundongos (8 B10.D2 doadores de camundongos fêmeas; 50 C.B-17 SCID receptores fêmeas) foram obtidas de Jackson Laboratories or Charles River Laboratories, respectivamente. Os baços de camundongos 8 B10.D2 foram coletados. A célula CD4+ CD25- T foi isolada de baços unidos usando metodologia padrão conhecida na técnica. A pureza da população da célula T foi avaliada pela citometria de fluxo.

Os camundongos C.B-17 SCID simples recebem as células T 5x105 CD4+ CD25- (isolada de baços de camundongos B10.D2) por intermédio da injeção no dia 0. Todos os camundongos foram pesados pelo menos cinco vezes por semana e cuidadosamente observado pela perda de peso, que pode ser associada com colite. Além disso, uma contagem de colite clínica [consistência de evacuação e sangue na evacuação] foi realizado pelo menos um dia por semana. Os camundongos foram também cuidadosamente monitorado pelo menos cinco dias por semana e denominado uma contagem por sinais de sintomas psoriáticos (perda de cabelo, esfoladura, calvície, etc).

Um anticorpo anti-IL-21 de camundongo (mIL-21) de rato, um anticorpo de controle de isotipo de rato, ou veículo (PBS) foi administrado aos grupos de camundongos iniciando no dia 0. Os tratamentos foram liberados como injeções intraperitoneal, duas vezes por semana, com os anticorpos sendo administrado a 0,2 ou 0,8 mg por camundongo por dosagem. Estes devem ser liberados usando um regime de dosagem similar ou outras vias de administração. Existem 9 a 10 camundongos por grupo nos grupos de anticorpo anti-IL21, 6 a 7 camundongos por grupo nos grupos de anticorpo de controle de isotipo e 10 camundongos por grupo no grupo PBS. Este regime de dosagem é referido como "dosagem profilática".

Em um experimento separado, os grupos de camundongos dosados com os mesmos anticorpos e dosagens descritas acima (10 camundongos por grupo) iniciado em seus tratamentos no dia 12 seguindo a transferência celular, que é aproximadamente do dia que os camundongos iniciam as mostras de sinais de psoríase e/ou colite. Este regime de dosagem é referido como "dosagem terapêutica".

No final do estudo (dia 45), tecido colônico foi submetido pela evidência histológica de colite e soro para a análise de citocina e níveis de quimiocina.

Resultados de Dosagem profilática:Camundongos que recebem o anticorpo anti-mIL-21 tanto nas dosagens 0,2 quanto 0,8 mg foram caracterizados pelas reduções significantes (pelo menos p < 0,05 ou maior) na perda de peso corporal e reduções significantes na pele psoriática e sintoma de colite inteiramente pelo período experimental comparado aos camundongos administrado em PBS ou 0,2 mg de anticorpo monoclonal de controle de isotipo. No final do estudo (dia 45), os camundongos tratados com dosagem de anticorpo mIL-21 foram em aproximadamente 100 % do peso corporal de partida, considerando camundongos tratados por PBS tem perda na média de 16 % do peso corporal de partida e camundongos tratados com um anticorpo de controle de isotipo tem perda de 10 a 15 % do peso corporal de partida. No dia 45, os camundongos tratados com dosagem de anticorpo mIL-21 tem aproximadamente 6,5 a 7 vezes inferiores a média das contagens clínicas de colite e aproximadamente 5 a 7 vezes inferiores a média das contagens de pele psoriática. Apenas 20 % dos camundongos tratados com 0,2 mg de psoríase desenvolvida por anticorpo anti-mIL-21, que foi brando, considerando nenhum dos camundongos tratados com a dosagem a 0,8 mg desenvolve qualquer sintoma de pele psoriática. De outra maneira, 100 % dos camundongos tratados por PBS desenvolvem a psoríase, com aproximadamente 50 % destes camundongos desenvolvendo os diversos sintomas. No final do estudo, existem também uma redução significante nos índices de colite histológico (contagem pela inflamação intestinal, lesões e arquitetura) nos camundongos tratados por anticorpo anti-mIL-21 comparados a PBS e camundongos tratados pelo controle de isotipo a 0,2 mg.

Os camundongos tratados com anticorpo anti-mIL-21 tem significantemente menor o IL-6 de soro, RANTES, TNF-oc e níveis MIP-lβ comparados aos camundongos tratados por PBS, ainda fornecendo um papel anti-inflmatório para o anticorpo anti-mIL-21.

Resultados de Dosagem terapêutica: Camundongos que recebem o anticorpo anti-mIL-21 tanto nas dosagens 0,2 quanto 0,8 mg, iniciando a partir do dia 12 seguindo a transferência da célula T, foram caracterizados pelas reduções na perda de peso corporal e reduções significantes em sintomas de colite inteiramente pelo período experimental comparado aos camundongos administrado o anticorpo monoclonal de controle de isotipo. No dia 45, os camundongos tratados com dosagem de anticorpo anti-mIL-21 tem aproximadamente 3,5 a 4 vezes inferiores a média de contagem clínicas de colite comparados os camundongos tratados de anticorpo de controle de isotipo. Os camundongos tratados com a dosagem 0,8 mg de anticorpo anti-mIL-21 tem menores contagens de psoríase do que o anticorpo de controle de isotipo ou camundongos tratados por PBS.

Resumo: Quando juntos, estes resultados indicam que a administração in vivo de um anticorpo anti-mIL-21 foi eficácia na redução de colite e começo de psoríase e na gravidade em um modelo de transferência de célula T de murino e sugere que os anticorpos anti-IL-21 podem ser eficazes no tratamento de doença do intestino inflamatório humano e/ou psoríase. Exemplo 16- Hipersensibilidade de contato Mouse Model

Hipersensibilidade de contato pode ser induzido nos camundongos usando uma variedade de alérgenos de contato incluindo dinitrofluorobenzeno (DNFB) e oxazolona. Os camundongos são sensibilizados topicamente com o - alérgeno em um veículo de acetona e óleo de oliva e então desafiados no ouvido com o alérgeno no óleo de oliva sozinho. A mudança na espessura do ouvido é uma medida da resposta imune contra o alérgeno. Os anticorpos anti-IL-21 são administrados na fase de sensibilização (dias 0-5) ou durante a fase de desafio (dias 5-6). A inibição de espessura do ouvido para antagonizar o IL-21 que indica um papel para IL-21 na indução da hipersensibilidade de contato.

Os camundongos C57BI/6 são pintados no dorso com 0,5 % de DNFB em acetona:óleo de oliva (4:1) ou acetona:óleo de oliva sozinho no dia 0. No dia 5, espessura do ouvido de camundongos é medido usando paquímetros e os camundongos são desafiados nos ouvidos com óleo de oliva sozinho (controle) ou 0,25 % de DNFB no óleo de oliva pelo gotejamento de uma solução de 25 μl no ouvido. A mudança na espessura do ouvido é medida no dia 6 e a inflamação calculado como uma diferença em espessura do ouvido entre dia 5 e dia 6. Grupos dos camundongos são injetados intraperitoneais com PBS ou 10 a 100 μg anticorpos anti-IL-21 nos dias 0-5 ou dias 5-6.

A inibição de espessura do ouvido pelos anticorpos anti-IL-21 demonstram que anticorpos anti-IL-21 podem ser úteis na inibição de hipersensibilidade de contato.

Exemplo 17- Mapeamento de epítopo

A. Experimento trocador de hidrogênio-deutério

Em um esforço para identificar as regiões de epítopo de IL-21 reconhecido pela neutralização de anti-IL-21 362.78.1.44 , 362.597.3, 366.328.10, 366.552.11 e o hIL-21R solúvel/yc-Fc um método trocador de deutério de hidrogênio com base em imunoafmidade (HDx) foi aplicado seguido pela análise de espectrometria de massa. Especificamente, os mAbs purificados foram imobilizados em pérolas de sefarose ativado CNBr e trocado no tampão de deutério. IL-21 deuterado foi ligado as pérolas de imunoafmidade pela incubação e as pérolas foram lavadas com tampão deuterado para remover as proteínas não ligadas. O complexo de anticorpo- antígeno foi então submetido a solução PBS para iniciar novamente a troca a hidrogênio amida nas regiões não ligadas de IL-21. Troca de hidrogênio deutério foi então apagado e IL-21 foi eluído no tampão pH inferior, que foi então submetido a digestão proteolítica pela pepsina imobilizada. Os mapas de massa de peptídeo foram então gerados pela espectrometria de massa MALDI-TOF e comparado com aquela amostra de controle, gerado a partir do estado livre de IL-21, que foi trocado novamente a hidrogênio amida a partir do IL-21 deuterado pela diluição com solução PBS. A Figura 3 mostra o espectro expandido de peptídeos digeridos por pepsina de ambos os estados livres de IL-21 (Figura 3A e 3C) e o IL-21 de ligação de anticorpo (Figura 3B e 3D). Como indicado na Figura 3 A, isótopo de peptídeo de sobreposiçãoi foi indicado a peptídeos correspondentes EKKPPKEF (SEQ ID N°: 2 do resíduo 129 a 136) (m/z, 1002.5619 Da) e LERFKSLL (SEQ ID N°: 2 do resíduo 137 a 144) (m/z, 1005.6091 Da) do estado livre de IL-21 com massas de peptídeo teóricas dentro de 10 ppm de precisão de massa. Uma pequena quantidade de peptídeo deuterado residual foi observada em tomo de m/z, 1002.5619 Da, devido ao trocador de amida de hidrogênio incompleto.

Figura 3B é um espectro da mesma faixa de massa de Figura 3A que mostra os dois envelopes de isótopos de peptídeos de sobreposição tendo íons de monoisótopos a 1014.49 m/z e 1015.00 m/z. Por causa de dois íons de peptídeos foram cortados em tomo da mesma faixa de massa, foi difícil para projetar cada identidade de peptídeo entre os dois íons. Entretanto, dados de espectrometria de massa tandem dos íons de peptídeos de Figura 3A e B mostrou que estes tem os modelos de fragmentação de peptídeo idêntico (dados não mostrados). Embora existe uma pequena porcentagem de peptídeo não deuterado detectado a partir das amostras obtidas do complexo de anticorpo-antígeno, a maioria de íons de peptídeos retido por deutério e mudado a região massa mais alta em virtude da acessibilidade de solvente limitado as regiões de ligação de anticorpo/antígeno, que indica que o mAb local de ligação semelhante contém a região EKKPPKEFLERFKSLL (SEQ ID N°: 2 do resíduo 129 a 144).

Um outro peptídeo digerido por pepsina a partir dos ambos estados livres de IL-21 e o complexo de anticorpo-antígeno foi, observado como mostrado na Figura 3C e D e foi identificado como KSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS (SEQ ID N°: 2 do resíduo 141 a 162) (m/z, 2519.2451) com base na massa teórica de fragmento de peptídeo digerido por pepsina de IL-21. Como mostrado na Figura 3D, que compara a mudança de massa deste 22 peptídeos de resíduo de aminoácido (Amassa = 9.0 Da) com a mudança de massa daqueles dois resíduos a montante (Figura 2B, EKKPPKEF (SEQ ID N°: 2 do resíduo 129 a 136) e LERFKSLL (SEQ ID N°: 2 do resíduo 137-144), esta região foi apenas marginalmente protegido na ligação de mAb, indicando que apenas uma porção deste peptideo pode ser envolvido na ligação ao mAb. Em fato esta sequência de peptideo é a calda do terminal C e este contém quatros resíduos de aminoácido de sobreposição com o peptideo (LERFKSLL (SEQ ID N°: 2 do resíduo 137 to 144), que parece ser significantemente protegido pelo mAb. Com base nestas medições espectrométrica de retenção de deutério, estimamos que o epítopo IL-21 para a ligação do mAb EKKPPKEFLERFKSLL (SEQ ID N°: 2 do resíduo 129 a 144) e a sequência a montante de KSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS (SEQ ID N°: 2 do resíduo 141a 162).

B. Experimento de proteção de rotulação de lisina

Usando o ensaio HDx, a região de epítopo de ligação IL-21 mAb foi estimado e foi observada que cinco resíduos de lisina (a partir de um total de 12 resíduos de lisina em IL-21) reside na região de epítopo de ligação estimado. Visto que os resíduos de lisina são mais semelhantes estar presente em regiões acessíveis de solventes de proteínas devido a sua característica carregada, lisina parece ser uma escolha ideal pela modificação química seletiva por uma determinação paralela da região de epítopo de antígeno. O conceito atrás da estratégia da modificação química é que a proteção da modificação de lisina em um antígeno na presença e ausência de anticorpo correlação deste epítopo de ligação (Scholten et al., J. Amer. Soc. Mass Spectr. 17: 983-994, 2006). Portanto, para a caracterização adicional da região de epítopo e para a determinação destes resíduos de lisina envolvido na ligação de mAb, acetilação seletivo em resíduos de lisina foi realizado tanto na ligação de afinidade quanto nos estados livres de IL-21. O local de modificação de lisina/proteção foi determinada pela massa total e análise de mapeamento de peptideo usando MALDI-TOF e espectrometria de massa da ionização da electropulverização.

Scholten et al., (Scholten et al., J. Amer. Soc. Mass Spectr. 17: 983-994, 2006) investiga a razão molar entre o reagente de acetilação (acetato de NHS) e um antígeno para a acetilação total dos resíduos de lisina acessível e observado que a rotulação foi efetiva a 250 vezes o excesso molar do reagente em 3 minutos de reação. Para determinar o epítopo de ligação, o mesmo condição de reação de rotulação foi utilizado tanto pelo estado livre IL-21 quanto IL-21 de ligação de afinidade com a neutralização de diversos IL-21 mAbs, bem como a proteína receptora heterodímero IL-21 (IL-21 R/yc- Fc). Com a condição de reação de rotulação dada, acessibilidade de solvente diferente dos resíduos de lisina do IL-21 sozinho e o IL-21 de ligação por afinidade deu origem a distribuição de acetilação de lisina (ocupação de acetila) na molécula IL-21. O número de resíduos de lisina protegido no IL-21 de ligação por afinidade foi comparado ao IL-21 sozinho por mais íon intenso. O alinhamento espectro com base em mais íons intensos claramente mostrado que o número de acetilações de lisina nos antígenos isolados de complexos imunes diferentes é variado. Foi evidente que o reagente de rotulação de lisina foi menos acessível no IL-21 de ligação por afinidade. Visto que a acetilação foi reduzida pela ligação do antígeno ao anticorpo.

As lisinas protegidas por acetilação, que pode ser envolvido na ligação do mAb, ainda foram sondados pela digestão de protease e seguido pela análise de mapeamento de massa de peptídeo usando espectrometria de massa de cromatografia líquida. Visto que os resíduos de lisina covalentemente modificados são resistentes a digestão tríptica, enzima proteolítica de pepsina foi usado para gerar os peptídeos detectáveis de mais espectrometria de massa para estudar a modificação de lisina em mais detalhes. A modificação de peptídeos individuais usando cromatografia de íon de peptídeo de sinal foi investigado. Como mostrado na Figura 4, cromatogramas de pion selecionado foram gerados a partir de ambos o controle (IL-21 sozinho) e as amostras testadas (moléculas IL-21 de ligação de afinidade) para determinar resíduos de lisina acetilado e não acetilado. Figura 4A é um cromatograma de íon selecionado de um peptídeo proteolítico eluindo-se a 56,22 minutos na condição cromatográfica dada e a massa de ion de peptídeo de monoisótopo foi a 662,9 Da, que pareceu estar em um estado triplamente carregado (Δm = 0,3 Da) como indicado espectro de massa incluído. A identificação deste peptídeo em um estado triplamente carregado como o fragmento de peptídeo digerido pela pepsina acetilada de lisina, TCPSCDSYEKKPPKEF (SEQ ID N°: 2 do resíduo 119 a 136) (m/z, 1986 Da) foi feito, considerando a massa de peptídeo não acetilada é 1860 Da (m/z). A diferença da massa (peptídeo acetilado / peptídeo não acetilado) foi de 126 Da, indicando que todos os três resíduos de lisina neste peptídeo foram acetilados no estado livre de IL-21. Entretanto, um cromatograma de íon selecionado de IL-21 de ligação por afinidade não mostrou traço do peptídeo (Figura 4B) indicando que os três resíduos de lisina foram completamente protegidos pela ligação de anticorpo IL-21.

Um peptídeo digerido por pepsina adicional (KSLLQKMI (SEQ ID N°: 2 do resíduo 141 a 148) foi observado ser protegido na ligação de IL-21 mAb (Figura 4C e 4D). O íon monoisotópico foi a 509 Da (m/z) como um íon duplamente carregado (Δm — 0,5 Da) e a diferença da massa (peptídeo acetilado / peptídeo não acetilado) foi de 42 Da, indicando que apenas um dos dois resíduos de lisina neste peptídeo foi protegido. Os experimentos de troca HID precoces indicam que a montante de lisina da calda de terminal C da sequência de peptídeo, KSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS (SEQ ID N°: 2 do resíduo 141 a 162), foi mais provavelmente protegido pela ligação de anticorpo. Desta maneira é mais provável que Kl 13 em vez de Kl 19 seja envolvido na ligação de anticorpo.

Quatro resíduos de lisina (K102, K103, K106 e Kl 13) foram protegidos a partir da acetilação pela ligação dos clones 362.78.1.44 e 362.597.3 e estes foram localizados dentro da região de epítopo de ligação IL- 21 mAb estimado como determinado do ensaio HDx. Coletivamente, o ensaio de proteção de acetilação fornece o envolvimento dos resíduos específicos de lisina na interação de anticorpo de antígeno e ainda confirma a sequência de epítopo estimada a partir do ensaio HDx. 17C- Comparação de sequências de aminoácidos IL-21 a partir de várias espécies

Para melhor entendimento da reatividade cruzada das espécies os resultados nos Exemplos 3 e 9, na luz dos epítopo definidos em ligação IL- 21 pelos mAbs IL-21 (Exemplo 17A e B), sequências de aminoácidos foram obtidos e comparados para espécies múltiplas cruzadas por IL-21 (Tabela 13). A sequência humana total foi mais do que 96 % idêntica as sequências de macaco reso e cinomólgo, enquanto apenas 61 a 65 % idêntica as sequências IL-21 de roedor. Notavelmente, a ligação de epítopo descontínuo pelos clones 362.78.1.44 e 362.597.3 como descritos no Exemplo 17 (sublinhado na Tabela 13) é idêntico no IL-21 de macaco reso e ginomólgo humano, enquanto a sequência IL-21 de rato difere-se de IL-21 humano em 6 resíduos nestas regiões e a sequência IL-21 de camundongo difere-se por 7 resíduos.

Tabela 13: alinhamento de sequência de aminoácido IL-21 macaco reso, macaco cinomólgo, humano, rato e IL-21 de camundongo.

IL-21 humano é mostrado como SEQ ID N°:2; IL-21; o camundongo é mostrado como SEQ ID N°:I 1; IL-21 cinomólgo é mostrado como SEQ ID N°:9; IL-21 reso é mostrado como SEQ ID N°:9; rato IL-21 é mostrado como SEQ ID N°:97.

O epítopo descontínuo determinado por anti-hIL-21 mAbs altamente relacionados 362.78.1 e 362.597.3 é sublinhado acima.

Exemplo 18- Anticorpos monoclonais anti-idiotipo a 362.78-CHO para o uso em imunoensaios clínicos e pré-clínicos.

Os mAbs anti-idiotipos foram gerados específicos por 362.78- CHO para a aplicação em imunoensaios clínicos e pré-clínicos, tal que as respostas de anticorpos anti-362.78-CHO potencial em indivíduos tratados com este anti-IL-21 mAb terapêutico pode ser especificamente medido.

Para distinguir o imunogênio (362.78-CHO), que é por si só um anticorpo e os anticorpos anti-idiotipos neste Exemplo, o imunogênio será projetado como Abl e um anticorpo anti-idiotipo será projetado como Ab2. Um anticorpo anti-idiotípico deve inibir a ligação (neutralizar) de Abl a este antígeno (IL-21). Entretanto, deve ser notado no processo, os anticorpos anti- Abl serão gerados e que não são anti-idiotípicos. Em definição, estes serão ligação anti-362.78-CHO, não para neutralizar os anticorpos e também será de uso nos imunoensaios clínicos e pré-clínicos.

Métodos: Para imunizar os camundongos com 362.78-CHO, cinco camundongos de 6 a 8 semanas de idade BALB/c (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) foram imunizados com 362.78-CHO. Os camundongos foram inicialmente imunizados pela injeção subcutânea com ~50 μg de 362.78-CHO purificado (Lot# A2125F) em combinação com adjuvante Emulsigen® -P (MVP Laboratories INC, Omaha, NE) como pelas instruções de fabricante. Seguindo a imunização inicial, cada um dos camundongos recebem um 50 μg adicional de 362.78-CHO no adjuvante Emulsigen® -P por intermédio da via subcutânea a cada duas semanas em um período de seis semanas. Sete dias após as terceiras e quartas imunizações os camundongos foram sangrados por intermédio do plexo retro orbital e o soro foi separado a partir do sangue para análise de sua capacidade para ligar-se a 362.78-CHO.

A seleção do animal de fusão usando tanto o ensaio de captura quanto um ensaio de neutralização:

Ensaio de captura: A capacidade de anticorpos anti-362.78- CHO camundongo (Ab2, anti-idiotipo) no anti-soro para ligar-se a 362.78- CHO (Abl, produzido em células CHO, lote # El0569) foi avaliado usando um ensaio ELISA estilo de captura. Neste ensaio, os reservatórios de placas ELISA de poliestireno de 96 reservatórios foram primeiro revestidos com 100 pL/reservatório de IgG anti-humano de cabra, específico por anticorpo Fc (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) em uma concentração de 1 μg/mL no tampão de revestimento (0,1 M de Na2CO3, pH 9.6). As placas foram incubadas durante a noite a 4o C após cujo o anticoro não ligado ser aspirado e as placas lavadas duas vezes com 300 pL/reservatório de tampão de lavagem (PBS-Tween definido como 0,137M de NaCl, 0,0022M de KC1, 0,0067M de Na2HPO4, 0,0020M de KH2PO4> 0,05 % de polisorbato 20 p/v, 7.2). Os reservatórios foram bloqueados com 200 pL/reservatório do tampão de bloqueamento (PBS-Tween mais 1 % de albumina de soro bovino p/v (BSA) por 60 minutos em temperatura ambiente (RT), aspirados e as placas lavadas duas vezes com 300 pL/reservatório de PBS-Tween. os reservatórios foram incubados com 362.78-CHO (Abl, ZGI produzido em células CHO, lote # El0569) em uma concentração de lpg/ml (em 1 % de BSA em PBS-Tween). Após 1 hora de incubação em tempertura ambiente, os reservatórios foram aspirados e as placas lavadas duas vezes como descrito acima. 10 vezes em diluição em série (em 1 % de BSA em PBS-Tween) do antisoro (Ab2) foram preparadas começando com uma diluição inicial de 1:1000 e variação a 1:1.000.000. As amostras duplicadas de cada diluição foram então transferidas a placa de ensaio, 100 pL/reservatório. Normal mouse sera served as a negative control. Following a 1 hour incubation at RT, os reservatórios foram aspirados e as placas lavadas duas vezes como descrito acima. Goat anti-mouse IgG, específico por Fc, HRP conjugated antibody (Jackson ImmunoResearch Laboratories) em uma diluição de 1:5000 was then added to the wells, 100 μL/reservatorio. Seguindo 1 hora de incubação em temperatura ambiente, o anticorpo de detecção não ligado será aspirado a partir dos reservatórios e as placas lavadas duas vezes. Após a aspiração, 100 μL/reservatorio de tetrametil benzidina (TMB) (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) foi adicionado em cada reservatório e as placas incubadas por 1 minutos em temperatura ambiente. O desenvolvimento da cor foi interrompida pela adição de 100 μL/reservatorio de Stop Reagent (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e os valores de absorbância dos reservatórios lidos em um instrumento Molecular Devices Spectra MAX 340 a 450nm.

Ensaios de neutralização: A capacidade de anticorpos anti- idiotipos anti-362.78-CHO de camundongo (Ab2) no antisoro para inibir (neutralizar) a atividade de ligação de 362.78-CHO (Abl) foi avaliado usando uma placa com base no ensaio de neutralização. Neste ensaio, os reservatórios de placas ELISA de poliestireno de 96 reservatórios foram primeiro revestidos com 100 μL/reservatorio de IL-21 ligando humano (lote # A1207F) em uma concentração de 1 μg/mL no tampão de revestimento (0,lM de Na2CO3, pH 9.6). As placas foram incubadas durante a noite a 4o C, após o qual ligando não ligado ser aspirado e as placas lavadas duas vezes com 300 μL/reservatorio de tampão de lavagem (PBS-Tween definido como 0,137M de NaCl, 0,0022M de KC1, 0,0067M de Na2HPO4, 0,0020M de KH2PO4, 0,05 % de polisorbato 20 p/v, pH 7.2). Os reservatórios foram bloqueados com 200 μL/reservatorio do tampão de bloqueamento (PBS-Tween mais 1 % de albumina de soro bovino (BSA)) p/v por 1 hora, após que as placas foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem. 10 vezes em diluição em série (em 1 % de BSA em PBS-Tween) do antisoro (Ab2) foram preparadas começando com uma diluição inicial de 1:100 e variação a 1:100.000. O camundongo normal serve como um controle negativo. As amostras duplicadas de cada diluição foram então transferidas a placa de diluição de 96 reservatórios, 100 pL/reservatório. Abl foi adicionado como uma solução 2x, 100 pL/reservatório. Seguindo uma incubação de 45 minutos em temperatura ambiente, 100 pL/reservatório foi transferido a placa de ensaio após o tampão de bloqueamento ser aspirado. Seguindo a incubação de 1 hora em temperatura ambiente, os reservatórios foram aspirados e as placas lavadas duas vezes como descrito acima. IgG anti-humano de cabra rotulado por peroxidase de rábano silvestre, específico por Fc, conjugado por HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) em uma diluição de 1:5000 foi então adicionado em cada reservatório, 100 pL/reservatório e as placas incubadas em temperatura ambiente por 1 hora. Após a remoção de anticorpo de detecção não ligado, as placas foram lavadas duas vezes, 100 pL/reservatório de tetra metil benzidina (TMB) (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) adicionado em cada reservatório e as placas incubadas por 2 minutos em temperatura ambiente. O desenvolvimento da cor foi interrompida pela adição de 100 pL/reservatório de Stop Reagent (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e os valores de absorbância dos reservatórios lidos em um instrumento Molecular Devices Spectra MAX 340 a 450nm.

Fusão: Dois camundongos com os tituladores de neutralização anti-362.78-CHO mais altos foram imunizados em um período final com aproximadamente 50 pg de 362.78-CHO (Abl) em PBS sem adjuvante por intermédio da injeção subcutânea. Por dias depois, o baço e linfonodos destes camundongos foram coletados. A eletrofiisão foi realizada usando métodos padrão conhecido na técnica para fundir os linfócitos com as células P3-X63- Ag8.653 de mileoma de camundongo (American Type Culture Collection, CRL 1580) em uma razão de mieloma linfócito 1:1, usando o mecanismo de Cyto-pulse CEEF-50 (Cyto Pulse Sciences Inc., Glen Bumie, MD). A mistura de fusão foi distribuída em placas de superfície plana funda de 96 reservatórios. Os reservatórios de fusão das placas foram alimentados três vezes com uma substituição de 70 % do meio de desenvolvimento de hibridoma (IMDM com lx glutamina L (100x), lx penicilina - estreptomicina (100x), todos de Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA, 10 % de soro Fetalclonel, inativado por não calor (HyClone,Logan, UT), 10 % de fator de clonagem de hibridoma (BM Condimed HI Roche Diagnostic, Indianapolis, IN), lx suplemento HAT (50x ,Gibco Invitrogen). Os reservatórios foram submetidos ao ensaio dez dias após a colocação de fusão.

Seleção de reservatórios principais: as placas de fusão de 96 reservatórios foram avaliadas pela presença de anticorpos idiotipo anti- 362.78-CHO de camundongo usando um ELISA de estilo de captura como descrito acima exceto que os sobrenadantes de hibridoma sejam testados não diluídos a partir das placas de cultura. As células de hibridoma de reservatórios positivos foram sucessivamente expandidas em cultura nas placas de 24 reservatórios. Quando a densidade de culturas de 24 reservatórios foi aproximadamente 4-6 x 105 células/ml, o sobrenadante (aproximadamente 1,5 mL) foi individualmente coletado e interrompido para cada reservatório e as células a partir de cada reservatório criopreservadas. O meio de congelamento consiste de 90 % de soro Fetalclone 1 e 10 % de DMSO. Cada um dos sobrenadantes de 24 reservatórios foi analisado novamente tanto no ELISA de captura quanto quanto no ensaio ELISA de neutralização com base em placa descrita acima. Os resultados indicam que a seguinte expansão, todos dos sobrenadantes dos reservatórios principais tem retido sua capacidade de reconhecer o anticorpo 362.78-CHO (Abl) na solução. Sete dos sobrenadantes dos reservatórios principais retém sua capacidade de neutralizar a ligação de Abl a IL-21 ligando humano.

Clonagem: as células de 5 de reservatórios principais foram escolhidos de acordo com como sua atividade de neutralização e clonado no meio de desenvolvimento de hibridoma suplementado com lx HT (100x, Gibco Invitrogen) a fim de isolar um hibridoma clonal que produz mAb de neutralização de interesse. As células foram clonadas em placas celulares microtituladoras de 96 reservatórios usando um método de diluição de baixa densidade padrão (menos do que 1 células por reservatório) e monoclonalidade foi avaliado pelo exame microscópico de reservatórios para um foco simples de desenvolvimento antes do ensaio. Seis dias após a colocação, todas as placas foram avaliadas pela ELISA de neutralização pelos anticorpos de inibição anti-362.78-CHO anti-idiotipo. As células de hibridoma a partir de reservatórios positivos foram sucessivamente expandidas em placas de 24 reservatórios.

A seleção de clones de primeiro ciclo: Sobrenadantes de aproximadamente 6 dos reservatórios de cada linha de hibridoma clonado que foram positivos por mAb específico e originado a partir de reservatórios com apenas uma colônia simples de desenvolvimento de hibridoma e foram coletados a partir de cada série de clonagem e reavaliado em várias diluições em ELISA de neutralização para identificar um melhor neutralização de mAb que produz o clone. Quando a densidade do melhor clone das culturas de 24 reservatórios foram aproximadamente 4 a 6 x 105 células/ml, o sobrenadante foi individualmente coletado e armazenado para cada reservatório e as células de cada reservatório criopreservadas.

Resumo: anticorpos monoclonais de camundongo (Ab2) reativo contra o anticorpo 362.78-CHO recombinantemente expressado (Abl) foram gerados e exibem a atividade de neutralização capaz de bloquear a ligação de anticorpo 362.78-CHO a IL-21 humano. Estes anticorpos podem ser usados como reagentes nos imunoensaios clínicos e pré-clínicos.

Exemplo 19- Ligação de IL-21 de macaco cinomólgo e humano intracelular natural (mas não camundongo ou IL-21 de rato) por IL-21 mAb 362,78.1.44

A neutralização dos anticorpos monoclonais anti-IL-21 descritos neste foram gerados a partir de camundongos transgênicos que expressam os genes humanos de imunoglobulina e imunizados com IL-21 humano recombinante (ver Exemplo 1). Foi importante confirmar que o clone IL-21 mAb 362.78.1.44 pode ligar e neutralizar o IL-21 humano natural em adição a forma recombinante de IL-21. Adicionalmente, a fim de fornecer os estudos de toxicologia pré-clínico, é util para entender a capacidade de ligação do clone IL-21 mAb 362.78.1.44 ao IL-21 natural em uma variedade de espécies. A fim de testar este, um método é rotulado ao clone IL-21 mAb 362.78.1.44 com um pigmento fluorescente e uso para detectar o IL-21 intracelular em células T ativadas pela citometria de fluxo. Neste estudo, os leucócitos de sangue periférico de macaco cinomólgo e humano frescamente isolado bem como esplenócitos de rato e camundongo foram ativados in vitro com PMA e ionomicina por 24 horas para induzir a produção de IL-21. As células foram coletadas, fixadas, permeabilizadas e tingidas para a expressão de CD3 ou CD4 (para definiri as populações de células T auxiliares) e IL-21 usando o clone IL-21 mAb 362.78.1.44 rotulado com ALEXA FLUOR-647 (AF-647) e comparados a intensidade induzida por um anticorpo de controle comparado ao isotipo. Um sinal positivo neste ensaio, acima que observa para o mAb de controle de isotipo, demonstra ligação de clone IL-21 mAb 362.78.1.44 específico a IL-21 endógeno nas espécies testadas, embora não seja indicador de atividade de neutralização IL-21. Ainda os estudos são requeridos para demonstrar neutralização IL-21 nas espécies que testam positivo para a ligação IL-21 com o clone anti-IL-21 humano mAb 362.78.1.44 (ver Exemplo 20).

Isolamento de PBMC humano: 100 mL de sangue periférico foi coletado a partir de voluntários humanos saudáveis (ZymoGenetics) em tubos Vacutainer de heparina com a tampa verde (Becton Dickinson, San Jose, CA). O sangue foi diluído com 100 mL of temperatura ambiente PBS e 35 mL de alíquotas foram distribuídos em 50 mL de tubos cônicos. 14 mL de temperatura ambiente Ficoll/Paque MAIS (Pharmacia, Uppsala, Sweden) foi sustentado e os tubos foram rotacionados por 20 minutos a 2000rpm. A camada de interface PBMC foi removida e lavada duas vezes com meio de ensaio (RPMI 1640 com penicilina/estreptomicina suplementai, 10 % de soro bovino fetal, piruvato de sódio, 2 μM de β-Mercaptoetanol, todos de Invitrogen, Carlsbad, CA). As células viáveis foram contadas em tripano azul usando técnicas padrão.

Isolamento de PBMC de macaco cinomólgo: 40 mL de sangue periférico foi coletado nos tubos de coleta de sangue Vacutainer de heparina de tampa verde (BD Biosciences) a partir de um macaco cinomólgo alojado na University of Washington in Seattle. O sangue foi diluído com 40 mL de temperatura ambiente PBS e 35 mL de alíquotas foram distribuídas em 50 mL de tubos cônicos. Quatorze mL de temperatura ambiente Ficoll/Paque MAIS (Pharmacia, Uppsala, Sweden) foi sustentado e os tubos foram rotacionados por 25 minutos a 2000rpm. A camada de interface PBMC foi removida e lavadas duas vezes com meio de ensaio (RPMI 1640 com Penicilina/estreptomicina suplementai, 10 % de soro bovino fetal, Piruvato de sódio, 2μM de β-Mercaptoetanol). As células viáveis foram contadas em tripano azul usando técnicas padrão.

Isolamento de murine e esplenócitos de rato: tanto os esplenócitos de rato quanto de camundongo foram preparados de acordo com o seguinte protocolo. Um baço frescamente coletado foi gentilmente rompido por uma suspensão celular simples usando as extremidades de dias lâminas de vidro congeladas. As células foram então passadas através de um filtro de náilon de trama de 70-μM para remover os pedaços. As células vermelhas sanguíneas foram lisadas pela resuspensão do grânulo celular em 2 mL de tampão de líse ACK por 10 minutos a temperatura ambiente. Esta reação foi interrompida pela adição de meio de ensaio, as células foram então centrifugadas (1200 RPM por 5 minutos), recolocados e passados em um outro filtro de náilon de trama para remover fragmentos. As células viáveis foram contadas em tripano azul usando técnicas padrão.

Ativação durante a noite das células com PMA e ionomicina: as células a partir de todas as espécies foram recolocadas em suspensão em 2,0 x 10e6 células por mL. Um mL das células foi então colocado com ou sem a adição de 20 ng/mL PMA e 200 ng/mL de ionomicina em uma placa de 24 reservatórios e incubadas a 37° C por 20 horas em 5 % umidificado de CO2 incubador de cultura do tecido. Após 20 horas, 1,0 μL de GolgiPlug (BD Pharmingen) foi adicionado em cada reservatório e as células foram incubadas em quatro horas adicionais.

A célula coletada e pigmento de superfície: seguindo 24 horas de incubação descrito acima, células foram coletadas, lavadas com tampão de FACS frio e colocado nas 2,0 x 105 a 5,0 x 10e5 células por reservatório em uma placa de cultura de tecido de 96 reservatórios (Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ). As células foram então tingidas com 1 μg/mL de um ou mais dos segundos anticorpos, como apropriado: CD4-PE anti-murino, CD3-PE anti-rato, B220-PE anti-rato, ou CD4-PE anti-macaco ou CD4-PE anti-humano por 20 minutos em gelo. As células foram então lavadas duas vezes em PBS na preparação para a fixação.

A fixação celular e permeabilização: para fixar as células, cada grânulo celular foi recolocado em suspensão em 200 μL de 2 % de paraformaldeído e incubado em temperatura ambiente por 5 minutos. As células foram então centrifugadas (5 minutos a 1200 rpm) e os sobrenadantes aspiradas e as células foram recolocadas em suspensão em um tampão de permeabilização [PBS suplementado com 0,1 % de saponina (Calbiochem) e 0,5 % de BSA (Sigma)] por 10 minutos em temperatura ambiente.

Cepa intracelular: seguinte fixação e permeabilização, as células foram tingidas com -Iμg/mL de um dos seguintes anticorpos rotulados: anti-IL-21 de camundongo-AF647, clone anti-IL-21 humano 362.78.1.44-AF647 (ambos produzidos em ZymoGenetics) ou um anticorpo comparator anti-IL-21 humano-AF647 de BD Pharmingen. As células foram então incubadas em temperatura ambiente no escuro por 40 minutos. Após 40 minutos, as células foram lavadas duas vezes com tampão FACS (HBSS suplementado com 1 % de BSA, 2 % de soro Ab humano e 0,05 % de HEPES)

A aquisição de dados e análise: na conclusão do tingimento e lavagem, as células foram recolocadas em suspensão em 400μL de tampão FACS e os dados foram coletados usando um software CellQuest de realização FACS Calibur (BD Pharmingen). Os dados foram analisados usando software de análise de dados que expressam FCS (De Novo Software, Los Angeles, CA).

Resultados: detecção de IL-21 humano em PMA+ionomicina estimulada por células T humanas: Enquanto apenas 0,015 % das células CD3+ T tingidas positivas usando o controle de isotipo, aproximadamente 9 % da célula CD4+ T tingida positiva para IL-21 usando o clone IL-21 mAb 362.78.1.44 rotulado com AF-647. A mesma fração das células IL-21+ foi detectada usando o IL-21 mAb comercialmente disponível de eBiosciences. Este demonstra que o IL-21 mAb pode ligar-se endogenamente produzido IL- 21 em células CD4+ T humanas.

Detecção de IL-21 de macaco cinomólgo em PMA+ionomicina estimulado nas células mononucleares de sangue periférico mononuclear: Aproximadamente 3,6 % das células cino CD3+ T tingidas positivo para IL-21 usando o clone IL-21 mAb 362.78.1.44 rotulado com AF- 647, comparados a 0,1 % positivo usando o controle de isotipo. Este número é maior do que detectado usando um anti-IL-21 humano mAb comercialmente disponível de eBiosciences. Esta discrepância pode ser devido a afinidade de ligação mais fraca de anticorpo eBiosciences para IL-21 cinomólgo. Estes resultados demonstram que o clone anti-IL-21 humano mAb 362.78.1.44 pode ligar-se endogenamente produzido por IL-21 em células CD3+ T de macaco cinomólgo.

Detecção de IL-21 de murino em PMA+ionomicina estimulada por esplenócitos: Usando um anticorpo monoclonal de murino anti-IL-21 de rato gerado em ZymoGenetics como um controle positivo, aproximadamente 13,5 % de células T CD4+ de camundongo ativado foram positivos para IL- 21. Entretanto, como predito a partir de western blots e neutralização de ensaio de bioatividades que mostram que o clone anti-IL-21 humano mAb 362.78.1.44 não liga-se ou neutraliza IL-21 de camundongo (ver Exemplos 3 e 9), o clone anti-IL-21 humano mAb 362.78.1.44 rotulado com AF647 não detecta qualquer célula IL-21-positiva. Este ainda demonstra que o clone anti- IL-21 humano mAb 362.78.1.44 não liga-se ao IL-21 de murino.

Detecção de IL-21 de rato em PMA+ionomicina estimulada por esplenócitos: esplenócitos de rato foram estimuladas durante a noite na presença de PMA e ionomicina. Estas condições de estimulação foram suficientes para produzir IL-21 as células T positivas em macaco hinomólgo, humano e células T de murino. Neste experimento, nenhum dos anti-IL-21 de camundongo mAb ou o clone de anti-IL-21 humano mAb 362.78.1.44 detecta qualquer célula que foi positiva para IL-21. Entretanto, por essa razão não existe nenhum controle positivo neste experimento, este resultado negativo não conclusivamente elimina a possibilidade que o clone anti-IL-21 humano mAb 362.78.1.44 possa liga-se ao IL-21 de rato. Entretanto, estes dados, considerados junto com a perda de neutralização de bioatividade IL-21 de rato pelo clone anti-IL-21 humano mAb 362.78.1.44 em outros ensaios (ver Exemplo 9), não fortemente sugere que este mAb provavelmente não liga-se IL-21 de rato.

Conclusão: o clone IL-2l mAb 362.78.1.44 descrito neste claramente liga-se claramente as formas de macaco cinomólgo e humano natural de proteína IL-21 mas não a IL-21 de rato ou murino. Tabela 14

*(este mAb não liga-se fortemente a cino IL-21)

Exemplo 20- Ligação e neutralização da bioatividade de IL-21 humano natural pelo clone 362,78.1.44

A neutralização dos anticorpos monoclonais anti-IL-21 (IL-21 mAb) descrito neste foram gerados de camundongos transgênicos que expressam os genes humanos de imunoglobulina e imunizados com IL-21 humano recombinante (ver Exemplo 1). E importante confirmar que o clone IL-21 mAb 362.78.1.44 pode ligar-se e neutraliza IL-21 humano natural em adição a forma recombinante de IL-21. Para demonstrar neutralização de IL- 21 natural, o ensaio com base celular Baf3/IL-21 R pSTAT previamente descrito (ver Exemplo 7) foi utilizado e a as amostras do meio condicionado da célula T CD4+ ativada foram usadas como a fonte de IL-21 natural. Neste experimento, as amostras de meio condicionado de célula T foram pré- incubadas com variação de quantidades de clone IL-21 mAb 362.78.1.44 e o nível de IL-21 induzido por fosforilação STAT3 (pSTAT3) nos transfectantes Baf3/hIL-21R foi então medido. A neutralização de IL-21 natural foi demonstrado usando as amostras de meio condicionado de célula T ativada a partir de quatro doadores humanos saudáveis separados.

Isolamento de PBMC humano e geração de amostras de meio de célula T condicionada: 100 mL de sangue periférico foi coletado a partir de 4 voluntários humanos saudáveis (ZymoGenetics) em tubos Vacutainer de heparina de tampa verde (Becton Dickinson, San Jose, CA). O sangue foi então diluído com 100 mL de temperatura ambiente PBS e 35 mL de alíquotas foram distribuídas em 50 mL tubos cônicos. 14 mL de temperatura ambiente Ficoll/Paque MAIS (Pharmacia, Uppsala, Sweden) foi sustentado e os tubos foram rotacionados por 20 minutos a 2000rpm. A camada de interface PBMC foi removida e lavadas duas vezes com meio de ensaio (RPMI 1640 com Penicilina/estreptinomicina suplementai, 10 % de soro bovino fetal, Piruvato de sódio, 2 μM de β-Mercaptoetanol, todos de Invitrogen, Carlsbad, CA) As células viáveis foram contadas em tripano azul usando técnicas padrão. As células T foram negativamente selecionadas usando um kit de seleção de célula T CD4+ humana de Miltenyi Biotec (Aubum, CA) seguindo o protocolo resumido pelo fabricante. Usando as técnicas de imunofenotipagem padrão, as células T CD4+ foram subsequentemente determinadas ser > 95 % puro pela citometria de fluxo. As células T foram então incubadas por três dias a 5x10e5 células por reservatório em uma placa de 24 reservatórios pré-revestidas com 5,0 μg/mL de anticorpo anti-CD3 no meio Thl skewing contendo 5,0 μg/mL de anti- IFNy, 1,0 μg/mL anti-CD28 (todos de Becton Dickinson) e 10 ng/mL de IL- 12 recombinante (Sistemas R&D, Minneapolis, MN). Após três dias, as células foram lavadas, recolocadas em meio contendo 25 ng/mL de PMA e 500 ng/mL de ionomicina e incubada por cinco horas a 37° C. Após cinco horas, as amostras do meio condicionado foram coletadas e congeladas e armazenadas a -80° C até o dia do experimento.

Para estimar a concentração IL-21 aproximada nas amostras do meio condicionado da célula T, 1:4 séries de diluições foram preparadas e testados pela indução de fosforilação STAT3 nos transfectantes Baf3/hIL- 21R. Seguindo 10 minutos de protocolo de bioensaio pSTAT3 resumido no Exemplo 7, a concentração relativa de IL-21 em cada amostra de meio condicionado foi estimado pela comparação no nível de pSTAT3 aquele gerado usando uam titulação de IL-21 recombinante. Usando estes dados, a cocnentração de IL-21 em cada uma das quatro amostras de meio condicionado foi determinada ser entre 5,0 e 10,0 ng/mL.

Para demonstrar a neutralização de fosforilação STAT3 induzida por IL-21 natural, diluições 1:10 (concentrações IL-21 finais entre 0,5 e 1,0 ng/mL) de quatro amostras de meio condicionado de célula T foram pré incubadas por 30 minutos a 37° C com uma série de diluição 1:4 de IL-21 mAb clone 362.78.1.44. A concentração do clone 362.78.1.44 que varia de 0,4 a 400 ng/mL. Após 30 minutos, as amostras de meio condicionado + IL- 21 mAb foram transferido placa celular /hIL-21R e incubada por 10 minutos adicionais a 37° C. Após 10 minutos, as reações foram interrompidas com tampão de lavagem frio, as células lisadas e quantidade de medida pSTAT3 usando o método descrito no Exemplo 7.

Em todos as quatro amostras de meio condicionado, o clone 362.78.1.44 IL-21 mAb efetivamente neutraliza a atividade IL-21 (dados resumidos na Tabela 15). Estes dados claramente demonstram a ligação efetiva e neutralização de IL-21 humano natural por clone 362.78.1.44.

Tabela 15: Neutralização de IL-21 natural pelo clone mAb IL-21 362.78.1.44

Exemplo 21 A. Estudo de toxicicidade piloto com mAb IL-21 362.78- CHO em macacos cinomólgos

A especicidade de epítopo de mAb IL-21 362.78-CHO é formado pelos humanos, macacos cinomólgos e reso (ver Exemplos 17 e 17b), portanto tolerabilidade e toxicidade de IL-21 mAb foi testado nos macacos cinomólgos, uma espécie relevante para segurança da avaliação.

Os macacos cinomólgos foram tratados com uma injeção simples de IL-21 mAb 362.78-CHO e monitorados pelos sinais clínicos por 4 a 8 semanas seguindo o tratamento. O IL-21 mAb foi liberado pela injeção intravenosa ou subcutânea nas dosagens de 5 ou 100 mg/kg. Nenhum sinal clínico foi observado. Nenhuma mudança significativa no peso corporal ou coagulação foi observado. Nenhuma mudança na química do soro ou hematologia atribuída a toxicidade de medicamento foi observada. Este tratamento simples com IL-21 mAb 362.78-CHO a 5 ou 100 mg/kg foi bem tolerado por todos os animais.

A necropsia foi realizada nos animais de alta dosagem (100 mg/kg). nenhuma mudança anatômica grosseira foi observada. A análise de histopatologia de animais de alta dosagem mostrou a hiperplasia linfóide mínima em tecidos linfóides. A análise imunohistoquímica de tecido linfóides mostrou um aumento moderado no tamanho do folículo em tipos celulares associados ao folículo. Estas mudanças devem relatar a atividade farmacológica de IL-21 mAb 362.78-CHO, visto que o IL-21 é conhecido por diretamente afetar o desenvolvimento e saída das células B a partir de folículos linfóides e fornece a mudança de classe, maturação por afinidade e desenvolvimento celular de plasma.

Comportamento farmacocinético e biodisponibilidade de IL-21 mAb 362.78-CHO foi monitorado em um estudo de dosagem simples nos macacos cinomólgos. Oito macacos cinomólgos machos foram tratados com IL-21 mAb 362.78-CHO. Estes foram tratados pela injeção subcutânea de 5 mg/kg e três foram tratados pela injeção intravenosa de 5 mg/kg. Dois foram tratados pela injeção intravenosa de 100 mg/kg. as amostras de soro foram tiradas para a análise de níveis IL-21 mAb 362.78-CHO durante quatro semanas seguindo o tratamento para o grupo 100 mg/kg e durante oito semanas seguindo o tratamento para dois grupos de 5 mg/kg. Noncompartmental a análise de perfis farmacocinéticos mostraram que a exposição aumenta em uma maneira proporcional da dosagem com administração intravenosa de 5 ou 100 mg/kg IL-21 mAb. A biodisponibilidade de IL-21 mAb 362.78-CHO foi aproximadamente 50 % da seguinte administração subcutânea. A vida média do terminal estimada para IL-21 mAb foi 10 a 14 dias. A vida média terminal estimada de IL-21 mAb *inserção: 362.78-CHO em macacos cinomólgos foi de 10 a 14 dias. 21B. Estudo de farmacologia piloto com 362.78-CHO em macacos cinomólgos

A especificidade de epítopo de IL-21 mAb 362.78-CHO é formado por humanos, macacos cinomólgos, reso (ver Exemplos 17 e 17b), portanto farmacologia in vivo de IL-21 mAb foi testado em macacos cinomólgos, uma espécie relevante para a avaliação farmacodinâmica.

Os macacos cinomólgos foram tratados com uma injeção simples de IL-21 mAb 362.78-CHO e monitorados para os sinais clínicos por 4 a 8 semanas seguindo o tratamento. O IL-21 mAb 362.78-CHO foi liberado pela injeção subcutânea ou intravenosa nas dosagens de 5 ou 100 mg/kg. Todos os animais foram monitorados pela mudança na composição de leucócito do sangue periférico pela citometria de fluxo. Nas mudanças relacionadas ao tratamento em monócitos ou concentração de célula B e nenhuma mudança em célula T CD4 e subséries CD8, ou na razão de células CD4 a CD8, foram observadas. Uma redução na concentração celular NK foi observada seguindo a administração IL-21 mAb 362.78-CHO. Em todos os grupos de tratamento, as células NK de sangue periférico foram diminuídas em 24 horas pós tratamento, relativo aos valores de linha de base. Em cinco de oito animais, os níveis NK permanecem abaixo de 60 % do valor de linha de base por pelo menos duas semanas. Um estudo confirma com os controles adequados para a tensão do tratamento e outras fontes de variabilidade na concentração da célula NK do sangue periférico será requerida para confirmar esta observação.

Exemplo 22 Anticorpo anti-mIL-21 diminui a incidência da doença e progressão no modelo de artrite induzida por colágeno de camundongo (CIA) Modelo de artrite induzido induzida por colágeno de camundongo (CIA):

Existe diversos modelos de animais para artrite reumatóide conhecida na técnica. Por exemplo, no modelo de artrite induzida por colágeno (CIA), camundongos que desenvolvem a artrite inflamatória crônica que reune próximo a artrite reumatóide humana. Visto CIA forma as características patológicas e imunológicas com RA, este fabrica um modelo ideal para a avaliação potencial de compostos anti-inflamatórios humanos. O modelo CIA é um modelo bem conhecido nos camundongos que dependem tanto de uma resposta imune quanto de uma resposta inflamatória, a fim de ocorrer. A resposta imune que compreende a interação de células B e células CD4+ T em resposta ao colágeno, que é dado como antígeno e leva a produção de anticorpos de anti-colágeno. A fase inflamatória é o resultado das respostas do tecido a partir dos mediadores de inflamação, como uma consequência de alguns destes anticorpos de reatividade do colágeno natural de camundongo e ativação de cascata de complemento. Uma vantagem no uso do modelo CIA é que os mecanismos básicos de patogênese são conhecidos. Os epítopos de célula B e célula T relevantes no colágeno de tipo II foram identificados e vários parâmetros imunológicos (por exemplo hipersensibilidade de tipo atrasado e anticorpo anti-colágeno) e inflamatório (por exemplo, citocinas, quimiocinas e enzimas de degradação da matriz) que relaciona a artrite mediada imune foi determinada e pode ser desta maneira usada para avaliar a eficácia do compostos testado no modelo CIA (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999; Williams et al., Immunol. 89:9784-788, 1992; Myers et al., Life Sei. 61:1861-78, 1997 e Wang et al., Immunol. 92:8955-959, 1995). A eficácia potencial de um anti-IL-21 de rato de camundongo mAb produzida em ZymoGenetics foi testada no modelo CIA, como descrito abaixo.

Camundongos machos de dez semanas de idade DBA/1J (Jackson Labs) foram usados para a dosagem terapêutica (isto é como camundongos que estabelecem a doença). No dia 21, todos os animais foram dados em uma injeção cauldal intradérmica de 100 microlitros de 1 mg/mL de colágeno de tipo II chick formulado em adjuvante completo de Freund (preparadas by Chondrex, Redmond, WA) e três semanas após o dia 0 estes foram dadas a mesma injeção exceto preparada no adjuvante Freund incompleto. Um anticorpo anti-IL-21 ou veículo (PBS) foi administrado comouma injeção intraperitoneal a cada um outro dia para um total de 6 dosagens tão logo que for possível um camundongo estabelecer a doença estabelecida. Os camundongos (n = 7 por tratamento) recebem 0,15 mg de um anticorpo anti-IL-21 por animal por dosagem, ou o controle do veículo, PBS (Life Technologies, Rockville, MD). Os animais começam a mostrar os sintomas de artrite seguindo a segunda injeção de colágeno, com mais animais que desenvolvem a inflamação dentro de 1 a 2 semanas. A extensão da doença foi avaliada em cada pata pelo uso de um paquímetro de espessura de pata e pela determinação de uma contagem clínica (0-3) em cada pata (ver abaixo). Monitoramento da doença:

Os animais podem começar mostrar os sinais de inflamação na pata logo após a segunda injeção de colágeno e alguns animais ainda podem comerçar a ter sinais de inflamação antes da segunda injeção de colágeno. Mais animais desenvolvem a artrite dentro de 1 a 2 semanas de injeção de intensificação, mas alguns podem requerer um longo período de tempo. A incidência da doença no modelo é tipicamente 90 a 100 % e 0 a 5 não respostas (determinadas após 6 semanas de observação) são tipicamente visto no estudo usando 60 animais. Visto que este estudo apenas inclui os camundongos com a doença estabelecida, os camundongos que não desenvolvem a doença de artrite não foram usados. Nota-se que a inflamção começa, uma ocorrência transitória comum de inflamação de pata ou dedo de grau baixo transitória pode ocorrer. Por esta razão, um animal não foi considerado ter a doença estabelecida até um inchaço da pata persistente marcada terem desenvovido. 5 Todos os animais foram observados diariamente para avaliar o estado da doença em suas patas, que foi feito pela indicação de uma contagem clínica qualitativa de cada uma das patas. A cada dia, cada animal tem suas 4 patas contadas de acordo com seu estado de doença clínica. Para determinar a contagem clínica, a pata pode ser considerada como tendo 3 zonas, os dedos, 10 as patas por si só mãos ou pés e a junta to pulso ou tornozelo. A extensão e a gravidade da inflamação relativa a estas zonas foi levada em conta incluindo: anotação de cada dedo pelo inchaço; unhas cortadas ou vermelhidão dos pés; a anotação de qualquer evidência de edema ou vermelhidão qualquer uma das patas; anotação de qualquer perda da demarcação anatômica fina dos tendões 15 ou ossos; avaliação do pulso ou tornozelo por qualquer edema ou vermelhidão e anotação se a inflamação extende-se próxima a perna. Uma contagemd e pata de 1, 2, ou 3 foi com base na primeira impressão total da gravidade e segundo como muitas zonas foram envolvidas. A escala usada para a contagem clínica é mostrada abiaxo. 20 Contagem clínica: 0 = Normal 0,5 = Um ou mais dedos envolvidos, mas apenas os toes são inflamados. 1 = inflamação branda que envolve a pata (1 zona) e podem 25 incluir um dedo ou dedos 2 = inflamação moderada na pata e pode incluir alguns dos dedos e/ou pulso/tomozelo (2 zonas) 3 = inflamação grave na pata, pulso/tomozelo e alguns ou todos dos dedos (3 zonas) Doença estabelecida foi definida como uma contagem qualitativa da inflamação da pata classificação 1 ou mais, que persiste de dois dias em um série. Uma vez que a doença estabelecida esteja presente, o dado é registrado e projetado como aquele primeiro dia dos animais com "doença 5 estabelecida". Os camundongos que recebem um anticorpo anti-mIL-21 foram caracterizados por uma redução no inchaço da pata no curso do experimento e tem aproximadamente 25 % contagem de artrite média menor comparado aos camundongos que recebem PBS. Estes resultados indicam que 10 um anticorpo anti-mIL-21 reduz o inchaço da pata e progressão da doença associada com este modelo de artrite e sugere que um anticorpo anti-IL-21 pode ser eficaz no tratamento de artrite humana. V

Exemplo 23 Expressão de IL-21R em amostras de pele psoriática humana

Expressão de IL-21R é geralmente limitado as células de 15 origem hematopoiética. Entretanto, na colocação da doença inflamatória, a expressão IL-21R em células hematopoiéticas podem fornecer um estímulo direto aos tipos de células que mediam as mudaças funcionais nos tecidos afetados. Em psoríase o desenvolvimento queratinócito é desregulado, com hiperplasia epidérmica psoriaforma, diferenciação de terminal aberrante e 20 desenvolvimento incompleto da camada da córnea. O IL-21 produzido pela infiltração das células Thl e Th 17 na pele psoriática devem promover as mudanças funcionais em queratinócitos, incluindo a proliferação celular, produção de quimiocinas e diferenciação alterada. A presença de IL-21 R em queratinócitos nas lesões de pele psoriáticas foi portanto investigadas. 25 Métodos: análise de imunohistoquímica de 18 amostras de biopsia de pele a partir dos 4 doadores humanos normais e 9 pacientes com psoríase foi realizado, usando um anticorpo IgG 1 de camundongo contra IL- 21R humano produzida em ZymoGenetics. Para os pacientes com psoríase patients, uma subsérie (5) fornece as amostras a partir tanto da pele lesionai quanto não lesionai. Um alto grau de hiperplasia epidérmica foi notado no exame de histopatologia da pele lesionai de todos os doadores. A imunoreatividade (tingimento) de IL-21R nos tipos de células específicas foi contado com base na frequência de células positivas e intensidade de tingimento. Resultados :Na pele normal e pele não lesionai de pacientes com psoríase, o tingimento para IL-21R foi positivo na occasional macrófagos dispersados mononucleares intra-epidérmicos (MNC) e células semelhantes ao fibroblasto. O tingimento positivo para IL-21R está presente nos números altos de MNC em todas as amostras lesionais de pacientes com psoríase. As amostras tingidas com um anticorpo de controle de isotipo de camundongo foram negativas. Mínimo ou nenhum tingimento para IL-21R está presente em queracinócitos epidérmicos de pele normal. Nas biopsias de pele não lesionai a partir de pacientes com psoríase, tingimento brando foi observado nos queracinócitos epidérmicos em 4 amostras e tingimento moderado foi observado na camada spinosum na quinta amostra. Existe tingimento brando a forte nas áreas focadas de queracinócinas amostras lesionais a partir de 8 de 9 pacientes com psoríase. Conclusão: Nas lesões de pele psoriáticas, a expressão de IL- 21R não é limitado pela infiltração de leucócitos mas é também super regulado nos queracinócitos epidérmicos. A presença de tingimento aumentado para IL-21R em queracinócitos epidérmicos em pele não lesionai de pacientes com psoríase, comparado com os controle normais, que sugere que ainda em pele não envolvida, o queracinótico pode responder extravagente ao estímulo IL-21. Na presença de inflamação, IL-21R aumentado em iniltração MNC e na camada epidérmica hiperplástica foi notada. O tratamento de psoríase com um anticorpo de bloqueio IL-21 pode portanto inibir a inflamação pelo bloqueamento dos sinais IL-21 tanto para as células inflamtórias quanto para os queracinócitos epidérmicos. Tabela 16

Claims

1. Anticorpo monoclonal anti-IL-21 humano, ou um fragmento deste, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma região de cadeia pesada compreendendo: (i) uma região variável de cadeia pesada CDR1 consistindo na SEQ ID N°: 31; (ii) uma região variável de cadeia pesada CDR2 consistindo na SEQ ID N°: 33; e (iii) uma região variável de cadeia pesada CDR3 consistindo na SEQ ID N°: 35; e (b) uma região de cadeia leve, compreendendo: (i) uma região variável de cadeia leve CDR1 consistindo na SEQ ID N°: 39; (ii) uma região variável de cadeia leve CDR2 consistindo na SEQ ID N°: 41; e (iii) uma região variável de cadeia leve CDR3 consistindo na SEQ ID N°: 43.

2. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende resíduos de aminoácidos de 20 a 145 da SEQ ID N°: 29 e e resíduos de aminoácidos de 21 a 126 da SEQ ID N°: 37.

3. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que é produzido por um hibridoma designado 362.78.1.44, em que o hibridoma está depositado no American Type Culture Collection tendo a denominação de Depósito de Patente ATCC PTA-8790.

4. Anticorpo monoclonal anti-IL-21 humano, ou um fragmento deste, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma região de cadeia pesada compreendendo: (i) uma região variável de cadeia pesada CDR1 consistindo na SEQ ID N°: 47; (ii) uma região variável de cadeia pesada CDR2 consistindo na SEQ ID N°: 49; e (iii) uma região variável de cadeia pesada CDR3 consistindo na SEQ ID N°: 51; e (b) uma região de cadeia leve, compreendendo: (i) uma região variável de cadeia leve CDR1 consistindo na SEQ ID N°: 55; (ii) uma região variável de cadeia leve CDR2 consistindo na SEQ ID N°: 57; e (iii) uma região variável de cadeia leve CDR3 consistindo na SEQ ID N°: 59.

5. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende os resíduos de aminoácidos de 20 a 145 de SEQ ID N°: 45 e resíduos de aminoácidos de 21 a 126 de SEQ ID N°: 53.

6. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que é produzido por um hibridoma designado 362.597.3.15, em que o hibridoma está depositado no American Type Culture Collection tendo a denominação de Depósito de Patente ATCC PTA-8786.

7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo tem uma porção Fc.

8. Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma ou mais modificações na porção Fc para reduzir a função atuadora selecionada do grupo de modificações que consiste de Fc4, Fc5 e Fc6.

9. Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a porção Fc de dito anticorpo é selecionado do gurpo consistindo de IgG1, IgG2 e IgG4.

10. Hibridoma, caracterizado pelo fato de ser denominado 362.78.1.44, em que o hibridoma está depositado no American Type Culture Collection tendo a denominação de Depósito de Patente ATCC PTA-8790.

11. Uso de um anticorpo ou fragmento de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 -9, caracterizado pelo fato de ser para manufatura de um medicamento para tratamento de doença do intestino inflamatório (IBD), em que IBD é selecionado do grupo que consiste de Doença de Crohn, colite ulcerativa e síndrome do intestino irritável.

12. Uso de um anticorpo ou fragmento de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 -9, caracterizado pelo fato de ser para manufatura de um medicamento para tratar artrite reumatóide.

13. Uso de um anticorpo ou fragmento de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 -9, caracterizado pelo fato de ser para manufatura de um medicamento para tratar esclerose múltipla.

14. Uso de um anticorpo ou fragmento de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado pelo fato de ser para manufatura de um medicamento para tratar diabete tipo I (IDDM).

15. Uso de um anticorpo ou fragmento como definido em qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado pelo fato de ser para manufatura de um medicamento para tratar síndrome de Sjogren.

16. Uso de um anticorpo ou fragmento de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de ser para manufatura de um medicamento para tratar uma doença autoimune.

17. Uso de um anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato da doença autoimune ser selecionada do grupo que consiste de pancreatite, doença muscular inflamatória (polimiosite, dermatomiosite), poliangiite microscópica, anemia aplástica autoimune, tiroidite autoimune, hepatite autoimune, síndrome de Wegener, diverticulose, espondilite ancilosante, escleroderma, esclerose sistêmica, artrite psoriática, alopecia, osteoartrite, dermatite atópica, vitiligo, doença enxerto versus hospedeiro (GVHD), linfoma de célula T cutânea (CTCL), glomerulonefrite, nefropatia de IgA, pacientes de transplante altamente sensibilizados, síndrome anti-fosfolipídeo e asma.

18. Uso de um anticorpo ou fragmento de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado pelo fato de ser para manufatura de um medicamento para tratar lupus eritematoso sistêmico (SLE) ou psoríase.

19. Uso de um anticorpo ou fragmento de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 -9, caracterizado pelo fato de ser para manufatura de um medicamento para tratar uma doença mediada por célula auxiliar folicular T ou mediada por célula B selecionada do grupo que consiste de lupus eritematoso sistêmico, perda de audição autoimune, Doença 5 de Graves, pênfigo vulgar, miastenia grave, neuromielite ótica, síndrome de Goodpasture, nefrite autoimune, crioglobulinemia, síndrome de Guillain Barre, polineuropatia desmielinante inflamatória crônica (CIDP), anemia hemolítica autoimune e púrpura tromcitopênica idiopática (ITP).