CN103360493A

CN103360493A - 交叉反应性和双特异性抗-il-17a/f抗体

Info

Publication number: CN103360493A
Application number: CN2013102735648A
Authority: CN
Inventors: 陈咏梅; 胡岩(海伦); 欧阳文俊; 斯科特·斯塔维奇; 吴岩
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2008-08-29
Filing date: 2009-08-28
Publication date: 2013-10-23
Also published as: SG10201507009YA; AR073232A1; MX337684B; CA2732642A1; EP2321349A2; EP3211008A1; JP2012501186A; CL2011000397A1; TW201012478A; AU2009285616A1; WO2010025400A2; AU2015200790A1; CN102137872A; US8790642B2; KR20110055692A; US9512217B2; MX2011002073A; IL210942A0; ZA201100749B; PE20110801A1

Abstract

本发明一般涉及可与IL-17A和IL-17F交叉反应的抗体，和双特异性抗-IL-17A/F以及它们的用途。

Description

交叉反应性和双特异性抗-IL-17A/F抗体

本申请是申请日为2009年8月28日的发明名称为“交叉反应性和双特异性抗-IL-17A/F抗体”的中国专利申请No.200980133845.5的分案申请。

发明领域

本发明一般涉及与IL-17A和IL-17F交叉反应的抗体，和双特异性抗-IL-17A/F抗体，以及它们的用途。

发明背景

白介素-17(IL-17)是来自T细胞的促炎分子，其刺激上皮、内皮和成纤维细胞来产生其它的炎性细胞因子和趋化因子，包括IL-6、IL-8、G-CSF和MCP-1[参见，Yao，Z.等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，122(12)：5483-5486(1995)；Yao，Z.等人，Immunity(免疫)，3(6)：811-821(1995)；Fossiez，F等人，J.Exp.Med.(实验医学杂志)，183(6)：2593-2603(1996)；Kennedy，J等人，J.Interferon Cytokine Res.(干扰素细胞因子研究杂志)，16(8)：611-7(1996)；Cai，X.Y等人，Immunol.Lett(免疫学通讯)，62(1)：51-8(1998)；Jovanovic，D.V等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，160(7)：3513-21(1998)；Laan，M等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，162(4)：2347-52(1999)；Linden，A等人，Eur Respir J(欧洲呼吸杂志)，15(5)：973-7(2000)；和Aggarwal，S.和Gurney，A.L.，JLeukoc Biol.(白细胞生物学杂志)71(1)：1-8(2002)]。IL-17也与其他细胞因子，包括TNF-α和IL-1β协同作用来进一步诱导趋化因子的表达(Chabaud，M等人，J.Immunol.(免疫学杂志)161(1)：409-14(1998))。白介素-17(IL-17)对多种类型的细胞表现出多效的生物学活性。IL-17也具有诱导ICAM-1表面表达、T细胞增殖和CD34⁺人祖细胞的生长和向中性粒细胞的分化的能力。IL-17还参与骨代谢，并且已经表明在以存在激活的T细胞和TNF-α产生为特征的病理状态如类风湿性关节炎和骨植入体的松动中发挥重要作用(Van Bezooijen等人，J.Bone Miner.Res.(骨和矿物质研究杂志)，14：1513-1521[1999])。发现与来自正常个体或骨关节炎的患者相比，来自类风湿性关节炎患者的滑液组织的激活的T细胞分泌更高量的IL-17(Chabaud等人，Arthritis Rheum.(关节炎和风湿病)，42：963-970[1999])。人们提出这种促炎细胞因子活跃地促进类风湿性关节炎中的滑液炎症。除了其促炎作用，IL-17似乎通过另一种机制促进类风湿性关节炎的病状。例如，已经显示IL-17诱导破骨细胞分化因子(ODF)mRNA在成骨细胞中的表达(Kotake等人，J.Clin.Invest.(临床研究杂志)，103：1345-1352[1999])。ODF刺激祖细胞分化成破骨细胞(参与骨吸收的细胞)。由于IL-17在类风湿性关节炎患者的滑液中显著升高，似乎显示IL-17诱导的破骨细胞的形成在类风湿性关节炎的骨吸收中发挥重要作用。IL-17也被认为在某些其它自身免疫性病症如多发性硬化(Matusevicius等人，Mult.Scler.(多发性硬化)，5：101-104(1999)；Kurasawa，K等人，Arthritis Rheu(关节炎和风湿病）43(11)：2455-63(2000))和银屑病(Teunissen，M.B等人，JInvest Dermatol(皮肤病学研究杂志)111(4)：645-9(1998)；Albanesi，C等人，J Invest Dermatol(皮肤病学研究杂志)115(1)：81-7(2000)；和Homey，B等人，J.Immunol.(免疫学杂志)164(12：6621-32(2000))中发挥关键作用。

还进一步显示通过细胞内信号传导IL-17刺激人巨噬细胞中Ca²⁺内流和[cAMP]_i的降低(Jovanovic等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，160：3513[1998])。IL-17处理的成纤维细胞诱导NF-κB的激活[Yao等人，Immunity(免疫)，3：811(1995)，Jovanovic等人，见上文]，而其处理的巨噬细胞激活NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(Shalom-Barek等人，J.Biol.Chem.(生物学和化学杂志)，273：27467[1998])。此外，IL-17还与参与骨和软骨生长的哺乳动物细胞因子-样因子7具有序列相似性。与IL-17多肽具有序列相似性的其它蛋白为人胚胎衍生白介素相关因子(EDIRF)和白介素-20。

与IL-17广泛的效应一致，已经发现IL-17的细胞表面受体在许多组织和细胞类型中广泛表达(Yao等人，Cytokine(细胞因子)，2：794[1997])。尽管人IL-17受体(IL-R)的氨基酸序列(866个氨基酸)预测了带有单跨膜结构域和长的、525个氨基酸的胞内结构域的蛋白质，该受体序列是独特的且与来自细胞因子/生长因子受体家族的任何一种受体不相似。这一点并结合IL-17本身与其它已知蛋白缺乏相似性表明IL-17及其受体可能是新的信号传导蛋白和受体家族的一部分。已经证明IL-17的活性通过结合至其独特的细胞表面受体(本文称为人IL-17R)介导，其中以前的研究已经显示通过可溶形式的IL-17受体多肽接触T细胞抑制了PHA、伴刀豆球蛋白A和抗-TCR单克隆抗体诱导的T细胞增殖和IL-2产生(Yao等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，155：5483-5486[1995])。因此，对鉴定并表征新的与已知细胞因子受体(特别是IL-17受体)具有同源性的多肽十分感兴趣。

现在认为白介素-17是刚出现的细胞因子家族的原型成员。人和其它脊椎动物基因组的大规模测序已经揭示存在编码与IL-17明确相关的蛋白的其它基因，因而定义了一个新的细胞因子家族。在人和小鼠中存在至少六个IL-17家族的成员，包括IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F以及新的受体IL-17RH1、IL-17RH2、IL-17RH3和IL-17RH4(参见2001年6月28日公开的WO01/46420)。已经证明一种此类IL-17成员(称为IL-17F)结合至人IL-17受体(IL-17R)(Yao等人，Cytokine(细胞因子)，9(11)：794-800(1997))。最初的表征显示如IL-17一样，数个这些新鉴定的分子具有调节免疫功能的能力。已经鉴定的数个这些因子的强力的炎性作用，以及正在显现的与主要人类疾病的关联表明这些蛋白可能在炎症过程中具有重要作用并且可能提供了治疗性干预的机遇。

编码人IL-17F的基因位于IL-17附近(Hymowitz，S.G等人，Embo J.20(19)：5332-41(2001))。IL-17和IL-17F共享44％的氨基酸同一性而IL-17家族的其它成员共享更有限的15-27％的氨基酸同一性，表明IL-17和IL-17F在IL-17家族内形成不同的亚组(Starnes，T.等人，JImmunol(免疫学杂志).167(8)：4137-40(2001)；Aggarwal，S.和Gurney，A.L.，J.Leukoc Biol(白细胞生物学杂志)，71(1)：1-8(2002))。IL-17F似乎具有与IL-17相似的生物学作用，且能够促进多种细胞产生IL-6、IL-8和G-CSF。与IL-17相似，它能够诱导软骨基质的释放并抑制新软骨基质的合成(参见2002年11月28日公开的美国-2002-0177188-A1)。因此，如IL-17一样，IL-17F可能潜在地促进炎性病症的病状。最近，这些作者已经观察到通过白介素23(IL-23)的作用IL-17和IL-17F两者在T细胞中均被诱导(Aggarwal，S等人，J.Biol.Chem.(生物学和化学杂志)，278(3)：1910-4(2003))。IL-17和IL-17F共享相似的染色体定位和显著的序列相似性的观察，以及IL-17和IL-17F似乎在应答特异性刺激时在相同细胞群中被诱导的观察，导致鉴定了新的人细胞因子，该细胞因子由IL-17和IL-17F共价异二聚体(本文称为IL-17A/F)构成。

现在认识到IL-17A和IL-17F是Th17T细胞亚组分泌的主要促炎因子。它们靶向几乎体内所有细胞类型并诱导炎症和组织损伤。

人IL-17A/F是不同的新细胞因子，在蛋白结构和基于细胞的活性测定两者中均可与人IL-17和IL-17F相区别。通过使用纯化的重组人IL-17A/F作为标准，已经开发了人IL-17A/F-特异性ELISA。通过使用这种特异性ELISA，检测了人IL-17A/F的诱导表达，确认了IL-17A/F从培养的激活的人T细胞中天然产生。因而，IL-17A/F是不同的新细胞因子，作为分离的激活的人T细胞的天然产物是可检测的，已经在蛋白结构和基于细胞的测定两者中均表征了其重组形式，其与相关细胞因子不同并且可与相关细胞因子相区别。

在2006年11月30日公开的美国申请公开号No.20060270003和2007年7月12日公开的20070160576中公开了IL-17A/F。IL-17A/F已经被描述为治疗多种免疫介导的疾病的靶点(Chang和Dong，Cell Res.(细胞研究)17(5)：435-40(2007))；已经显示小鼠Th17细胞产生的IL-17A/F蛋白诱导气道中性粒细胞的募集，并因而在气道中性粒细胞增多症中具有体内功能(Liang等人，J Immunol(免疫学杂志)179(11)：7791-9(2007))；已经报道人IL-17A/F异二聚化的细胞因子通过IL-17RA/IL-17RC受体复合物进行信号传导(Wright等人，J Immunol(免疫学杂志)181(4)：2799-805(2008))。

考虑到IL-17A和IL-17F两者的促炎性质，期望产生可高效阻断IL-17A和IL-17F两者的交叉反应性和双特异性抗体。此类交叉反应性和双特异性抗体提供了治疗炎性和免疫相关疾病(包括自身免疫性疾病)和治疗癌症中新的治疗机遇。

发明概述

本发明至少部分地基于产生和表征与IL-17A和IL-17F两者交叉反应的抗体。本发明还涉及结合至IL-17A和IL-17F两者的双特异性抗体。

一方面，本发明涉及包含结合至IL-17A和IL-17F并抑制IL-17A和IL-17F两者的生物学功能的抗原结合结构域的抗体，或其功能片段，其中该生物学功能可以是，例如促炎活性。

在一个实施方案中，该抗体包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含CDRL1、CDRL2和CDRL3区，其中该CDRL1、CDRL2和CDRL3区的至少一个选自由下述各项组成的组：

(a)CDRL1，其包含序列DVSTAVA(SEQ ID NO：24)或SISSYLA(SEQID NO：25)，

(b)CDRL2，其包含序列SASFLYS(SEQ ID NO：26)或GASSRAS(SEQID NO：27)和

(c)CDRL3，其包含序列SYTTPPT(SEQ ID NO：28)或RYSQPIT(SEQID NO：29)，

或其亲和力成熟变体，或所述抗体或所述亲和力成熟变体的功能片段。

在另一个实施方案中，所述CDRL1、CDRL2和CDRL3区的每个选自由下述各项组成的组：

(a)CDRL1，其包含序列DVSTAVA(SEQ ID NO：24)或SISSYLA(SEQID NO：25)，

(b)CDRL2，其包含序列SASFLYS(SEQ ID NO：26)或GASSRAS(SEQID NO：27)和

(c)CDRL3，其包含序列SYTTPPT(SEQ ID NO：28)或RYSQPIT(SEQID NO：29)。

在另一个实施方案中，

(a)CDRL1包含序列DVSTAVA(SEQ ID NO：24)，

(b)CDRL2包含序列SASFLYS(SEQ ID NO：26)，和

(c)CDRL3包含序列SYTTPPT(SEQ ID NO：28)。

在又一个实施方案中，

(a)CDRL1包含序列SISSYLA(SEQ ID NO：25)，

(b)CDRL2包含序列GASSRAS(SEQ ID NO27)，和

(c)CDRL3包含序列RYSQPIT(SEQ ID NO：29)。

在还一个实施方案中，在该亲和力成熟变体中，CDRL3包含序列SYTAKLT(SEQ ID NO：30)。

在还有又一个实施方案中，在该亲和力成熟变体中，

(a)CDRL1包含序列DVSTAVA(SEQ ID NO：24)，和

(b)CDRL2包含序列SASFLYS(SEQ ID NO：26，且CDRL3可包含序列YYIYPAT(SEQ ID NO：31)，或其功能片段。

在又一个实施方案中，在该亲和力成熟变体中，

(a)CDRL1包含序列DVSTAVA(SEQ ID NO：24)，和

(b)CDRL2包含序列SASFLYS(SEQ ID NO：26)，和CDRL3可包含序列HNDLPLT(SEQ ID NO：32)。

在另外一个实施方案中，在该亲和力成熟变体中，

(a)CDRL1包含序列VISSSLA(SEQ ID NO：33)，和

(b)CDRL2包含序列GASFLYS(SEQ ID NO：34)。

在另一个实施方案中，在该亲和力成熟变体中，CDRL3包含序列SYTPRST(SEQ ID NO：75)，或其功能片段。

在又一个实施方案中，在该亲和力成熟变体中，

(a)CDRL1包含序列DVSTAVA(SEQ ID NO：24)；和

(b)CDR2包含序列SASFLYS(SEQ IS NO：26)。

在还一个实施方案中，在该亲和力成熟变体中，CDRL3包含序列QYYSTTTT(SEQ ID NO：76)，或其功能片段。

在还有又一个实施方案中，在该亲和力成熟变体中，

(a)CDRL1包含序列DVSTAVA(SEQ ID NO：24)；和

(b)CDR2包含序列SASFLYS(SEQ ID NOT：26)。

在一个不同的实施方案中，在该亲和力成熟变体中，CDRL3包含序列QQSQNPQTT(SEQ ID NO：77)，或其功能片段。

在另外一个实施方案中，在该亲和力成熟变体中，

(a)CDRL1包含序列DVSTAVA(SEQ ID NO：24)；和

(b)CDRL2包含序列SASFLYS(SEQ ID NO：26)。

在另一个实施方案中，在该亲和力成熟变体中，CDRL3包含序列RFSQHIT(SEQ ID NO：78)，或其功能片段。

在又一个实施方案中，在该亲和力成熟变体中，

(a)CDRL1包含序列RIKRYLA(SEQ ID NO：89)；和

(b)CDRL2包含序列GASSRAS(SEQ ID NO：27)。

在还一个实施方案中，在该亲和力成熟变体中，CDRL3包含序列RYSWHTT(SEQ ID NO：79)，或其功能片段。

在还有又一个实施方案中，在该亲和力成熟变体中，

(a)CDRL1包含序列SISSYLA(SEQ ID NO：25)；和

(b)CDRL2包含序列GASSRAS(SEQ ID NO：27)。

在一个不同的实施方案中，在该亲和力成熟变体中，CDRL3包含序列RYSLPIT(SEQ ID NO：80)，或其功能片段。

在又一个实施方案中，在该亲和力成熟变体中，

(a)CDRL1包含序列SISSYLA(SEQ ID NO：25)；和

(b)CDRL2包含序列GASSRAS(SEQ ID NO：27)。

在又一些的实施方案中，该抗体包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含CDRH1、CDRH2和CDRH3区，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3区的至少一个选自由下述各项组成的组：

(a)CDRH1，其包含选自由下述各项组成的组的序列：GFTFTDYDIS(SEQ ID NO：35)、GFSFIDYDIS(SEQ ID NO：36)、GFSFTSYMMS(SEQ IDNO：81)、GFSFPSYFIS(SEQ ID NO：82)；和GFTFYDYDIS(SEQ ID NO：88)；

(b)CDRH2，其包含选自由下述各项组成的组的序列：SDGYTYYADSVKG(SEQ ID NO：37)、PDCYTYYADSVKG(SEQ ID NO：38)、PDAYTYPDCYTYYADSVKG(SEQ ID NO：39)、PDSYTTYYADSVKG(SEQ ID NO：90)、YDGYTYYADSVKG(SEQ ID NO：41)、YEGYTYYADSVKG(SEQ ID NO：44)、ESGATDYADSVKG(SEQ ID NO：83)、VSGATVYADSVKG(SEQ ID NO：84)、YDGYAYYADSVKG(SEQ IDNO：85)；和LDGYSYYADSVKG(SEQ ID NO：86)；和

(c)CDRH3，其包含序列YLYWSYV(SEQ ID NO：40)和EGYYYSTSIKYYPW(SEQ ID NO：87)，

或其功能片段。

在还有一些的实施方案中，该抗体包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含CDRH1、CDRH2和CDRH3区，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3区的每个选自下述各项组成的组：

(a)CDRH1，其包含选自由下述各项组成的组的序列：GFTFTDYDIS(SEQ ID NO：35)、GFSFIDYDIS(SEQ ID NO：36)、GFSFTSYMMS(SEQID NO：81)和GFSFPSYFIS(SEQ ID NO：82)，

(b)CDRH2，其包含选自由下述各项组成的组的序列：SDGYTYYADSVKG(SEQ ID NO：37)、PDCYTYYADSVKG(SEQ ID NO：38)、PDAYTYPDCYTYYADSVKG(SEQ ID NO：39)、PDSYTTYYADSVKG(SEQ ID NO：90)、YDGYTYYADSVKG(SEQ ID NO：41)、YEGYTYYADSVKG(SEQ ID NO：44)、ESGATDYADSVKG(SEQ ID NO：83)和VSGATVYADSVKG(SEQ ID NO：84)；和

(c)CDRH3，其包含序列YLYWSYV(SEQ ID NO：40)或EGYYYSTSIKYYPW(SEQ ID NO：87)，

或其功能片段。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3区的抗体，其中

(a)CDRL1包含序列DVSTAVA(SEQ ID NO：24)，

(b)CDRL2包含序列SASFLYS(SEQ ID NO：26)，

(c)CDRL3包含序列SYTTPPT(SEQ ID NO：28)，和

(d)CDRH1包含序列GFTFTDYDIS(SEQ ID NO：35)，

(e)CDRH2包含序列SDGYTYYADSVKG(SEQ ID NO：37)，和

(f)CDRH3包含序列YLYWSYV(SEQ ID NO：40)，

或其功能片段。

在又一个实施方案中，本发明涉及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3区的抗体，其中

(a)CDRL1包含序列SISSYLA(SEQ ID NO：25)，

(b)CDRL2包含序列GASSRAS(SEQ ID NO：27)，

(c)CDR3包含序列RYSQPIT(SEQ ID NO：29)，

(d)CDRH1包含序列GFTFTDYDIS(SEQ ID NO：35)，

(e)CDRH2包含序列SDGYTYYADSVKG(SEQ ID NO：37)，和

(f)CDRH3包含序列YLYWSYV(SEQ ID NO：40)，

或其功能片段。

在又一个实施方案中，该抗体还包含CDRH1、CDRH2和CDRH3区，其中

(d)CDRH1包含序列GFSFIDYDIS(SEQ ID NO：36)，

(e)CDRH2包含序列PDCYTYYADSVKG(SEQ ID NO：38)，和

(f)CDRH3包含序列YLYWSYV(SEQ ID NO：40)。

在还有又一个实施方案中，该抗体还包含CDRH1、CDRH2和CDRH3区，其中

(d)CDRH1包含序列SFSGIDYDIS(SEQ ID NO：91)，

(e)CDRH2包含序列YDGYTYYADSVKG(SEQ ID NO：41)，和

(f)CDRH3包含序列YLYWSYV(SEQ ID NO：40)。

在另外一个实施方案中，该抗体还包含CDRH1、CDRH2和CDRH3区，其中

(d)CDRH1包含序列GFTFTDYDIS(SEQ ID NO：35)，

(e)CDRH2包含序列SDGYTYYADSVKG(SEQ ID NO：37)，和

(f)CDRH3包含序列YLYWSYV(SEQ ID NO：40)。

在另一个实施方案中，该抗体还包含CDRH1、CDRH2和CDRH3区，其中

(d)CDRH1包含序列GFSFIDYDIS(SEQ ID NO：36)，

(e)CDRH2包含序列PDAYTYYADSVKG(SEQ ID NO：42)，和

(f)CDRH3包含序列YLYWSYV(SEQ ID NO：40)。

(d)CDRH1包含序列GFSFIDYDIS(SEQ ID NO：36)，

(e)CDRH2包含序列PDSYTYYADSVKG(SEQ ID NO：43)，和

(f)CDRH3包含序列YLYWSYV(SEQ ID NO：40)。

在还一个实施方案中，该抗体还包含CDRH1、CDRH2和CDRH3区，其中

(d)CDRH1包含序列SFSGIDYDIS(SEQ ID NO：91)，

(e)CDRH2包含序列YEGYTYYADSVKG(SEQ ID NO：44)，和

(f)CDRH3包含序列YLYWSYV(SEQ ID NO：40)。

在另一个实施方案中，该抗体作为交叉反应性抗体结合至IL-17A和IL-17F的基本相同的表位，该抗体选自由YW241.47、YW278.15、YW279.1组成的组，或其亲和力成熟变体，或此类抗体或此类亲和力成熟变体的功能片段。

在又一个实施方案中，该亲和力成熟变体选自由下述各项组成的组：抗体YW278.15.18、YW178.15.2、YW278.15.3、YW278.15.18C55A、YW278.15.18C55S和YW278.15.2.D54E。

在还一个实施方案中，该抗体包含以基本相同的结合亲和力结合至IL-17A和IL-17F的抗原结合结构域，或其功能片段。

在还有又一个实施方案中，该抗体包含以至少大约10^-10至10^-11M的结合亲和力结合至IL-17A和IL-17F的抗原结合结构域，或其功能片段。

在另外一个实施方案中，本发明涉及包含结合至均作为单体和同型二聚体或异二聚体的IL-17A和IL-17F的抗原结合结构域的抗体，或其功能片段。

在还一个实施方案中，本发明涉及结合人IL-17A/F和非人灵长类动物的IL-17A/F的抗体，或其功能片段。非人灵长类动物可以是，例如，食蟹猴(Cynomolgus(Cyno))或恒河猴(Rhesus monkey)。在另一个实施方案中，该抗体结合至人IL-17A/F和可选地非人灵长类动物IL-17A/F，但不结合啮齿动物例如大鼠或小鼠IL-17A/F。

在还有又一个实施方案中，该抗体能够减少炎性或免疫相关疾病中的脱髓鞘。

本发明的抗体可以是单克隆的，且可以是嵌合的、人源化的或人的。

本发明的抗体片段非限制性地包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

在不同方面，本发明涉及双特异性抗体，该抗体包含结合至IL-17A的第一抗原结合位点和结合至IL-17F的第二抗原结合位点，其中

(1)该第一抗原结合位点包含第一重链可变结构域，该第一重链可变结构域包含CDRH1、CDRH2和CDRH3区，其中该CDRH1、CDRH2和CDRH3区的至少一个选自由下述各项组成的组：

(a)CDRH1，其包含序列TSYEIS(SEQ ID NO：45)，

(b)CDRH2，其包含序列WVGSIYLWGG(SEQ ID NO：46)和

(c)CDRH3，其包含序列ARFGQRYA(SEQ ID NO：47)和

(2)该第二抗原结合位点包含第二重链可变结构域，该第二重链可变结构域包含CDRH1、CDRH2和CDRH3区，其中该CDRH1、CDRH2和CDRH3区的至少一个选自由下述各项组成的组：

(a)CDRH1，其包含序列TSPYIS(SEQ ID NO：48)，

(b)CDRH2，其包含序列WVASIFYYSG(SEQ ID NO：49)和

(c)CDRH3，其包含序列ARGGYGYNQWFYSIYQSY(SEQ ID NO：50)，

或其亲和力成熟变体，或该抗体或该亲和力成熟变体的功能片段。

在一个实施方案中，该双特异性抗体包含CDRH1、CDRH2和CDRH3区，其中

(1)在该第一抗原结合位点中，

(a)CDRH1包含序列TSYEIS(SEQ ID NO：45)，

(b)CDRH2包含序列WVGSIYLWGG(SEQ ID NO：46)和

(c)CDRH3包含序列ARFGQRYA(SEQ ID NO：47)和

(2)在该第二抗原结合位点中，

(a)CDRH1包含序列TSPYIS(SEQ ID NO：48)，

(b)CDRH2包含序列WVASIFYYSG(SEQ ID NO：49)和

(c)CDRH3包含序列ARGGYGYNQWFYSIYQSY(SEQ ID NO：50)，

在另一个实施方案中，该双特异性抗体还包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含CDRL1、CDRL2和CDRL3区，其中该CDRL1、CDRL2和CDRL3区的至少一个选自由下述各项组成的组：

(a)CDRL1，其包含序列SISSYLA(SEQ ID NO：25)，

(b)CDRL2，其包含序列GASSRAS(SEQ ID NO：27)和

(c)CDRL3，其包含序列YYSSPLT(SEQ ID NO：21的残基91-97)，

在又一个实施方案中，在该双特异性抗体或其亲和力成熟变体，或该抗体或该亲和力成熟变体的功能片段的轻链可变结构域中，

(a)CDRL1包含序列SISSYLA(SEQ ID NO：25)，

(b)CDRL2包含序列GASSRAS(SEQ ID NO：27)和

(c)CDRL3包含序列YYSSPLT(SEQ ID NO：21的残基91-97)。

在另一个实施方案中，该双特异性抗体，或其功能片段，以基本相同的结合亲和力结合至IL-17A和IL-17F。

在又一个实施方案中，该双特异性抗体，或其功能片段，以至少大约10^-10至10^-11M的结合亲和力结合至IL-17A和IL-17F。

在另外一个实施方案中，该双特异性抗体，或其功能片段，结合至均作为单体和同型二聚体或异二聚体两者的IL-17A和IL-17F。

在还有另一个实施方案中，该双特异性抗体，或其功能片段，结合人和非人灵长类动物两者的IL-17A/F，其中非人灵长类动物可以是，例如，食蟹猴(Cynomolgus(Cyno))或恒河猴(Rhesus monkey)。在另一个实施方案中，该抗体结合至人IL-17A/F和任选地非人灵长类动物IL-17A/F但不结合啮齿动物，例如大鼠或小鼠IL-17A/F。

在不同实施方案中，该双特异性抗体，或其功能片段，能够减少炎性或免疫相关疾病中的脱髓鞘。

如前文一样，该双特异性抗体也可以是单克隆的、嵌合的、人源化的或人的，且该抗体片段非限制性地包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和该抗体片段形成的多特异性抗体。

在不同方面，本发明涉及前文描述的交叉反应性和双特异性抗体，其以大约10∶1至大约1∶10，或大约5∶1至大约1∶5，或大约1∶1至大约1∶5，或大约1∶1至大约1，或大约1∶1至大约1∶2的抗体与IL-17A的摩尔比抑制IL-17A的生物学功能，其中IL-17A代表IL-17A同型二聚体。

在又一方面，本发明涉及前文描述的交叉反应性和双特异性抗体，其以大约10∶1至大约1∶10，或大约5∶1至大约1∶5，或大约1∶1至大约1∶5，或大约1∶1至大约1∶3，或大约1∶1至大约1∶2的抗体与IL-17F的摩尔比抑制IL-17F的生物学功能，其中IL-17F代表IL-17F同型二聚体。

在还一方面，本发明涉及前文描述的交叉反应性和双特异性抗体，其以大约10∶1至大约1∶10，或大约5∶1至大约1∶5，或大约1∶1至大约1∶5，或大约1∶1至大约1∶3，或大约1∶1至大约1∶2的抗体与异二聚体的摩尔比抑制异二聚体形式的IL-17A和IL-17F的的生物学功能。

在另一方面，本发明涉及分离的核酸分子，其编码如前文描述的交叉反应性或双特异性抗体或抗体片段的轻链。

在又一方面，本发明涉及重组宿主细胞，其包含编码如前文描述的交叉反应性或双特异性抗体或抗体片段的轻链的核酸分子。该宿主细胞可以是真核的或原核的，包括，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和大肠杆菌(E.Coli)细胞。

本发明还涉及药物组合物，其包含与药学上可接受的赋形剂混合的如前文描述的交叉反应性或双特异性抗体或抗体片段。

此外，本发明涉及治疗炎性或免疫相关疾病的方法，包括向有需要的哺乳动物受试者施用有效量的本发明的交叉反应性或双特异性抗体，或其功能片段。该哺乳动物受试者优选是人患者。

炎性或免疫相关病症可以，例如选自由下述各项组成的组：系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，幼年型慢性关节炎，脊柱关节病，系统性硬化病(硬皮病)，特发性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)，舍格伦综合征(Sjogren’ssyndrome)，系统性血管炎，结节病，自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白尿)，自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)，甲状腺炎(格雷夫斯病(Graye’s disease)、桥本甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)，糖尿病，免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)，中枢和周围神经系统的脱髓鞘疾病诸如多发性硬化、特发性脱髓鞘性多神经病或急性特发性多神经炎(Guillain-Barre syndrome)、和慢性炎性脱髓鞘多神经病，肝胆疾病诸如传染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、肉芽肿性肝炎、和硬化性胆管炎，炎性肠病(IBD)包括溃疡性结肠炎、局限性回肠炎(Crohn′s disease)、麸质敏感性肠病、和惠普尔氏病(Whipple′sdisease)，自身免疫性或免疫介导的皮肤疾病包括大疱性皮肤疾病、多形性红斑和接触性皮炎、银屑病，变应性疾病诸如哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏和荨麻疹，肺的免疫学疾病诸如嗜酸细胞性肺炎、特发性肺纤维化和过敏性肺炎，移植相关疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主疾病，感染性疾病包括病毒疾病如AIDS(HIV感染)、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎和戊型肝炎、疱疹等、细菌感染、真菌感染、原生动物感染和寄生虫感染。

在优选实施方案中，炎性或免疫相关疾病选自由类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)和哮喘组成的组。

在又一方面，本发明涉及制品，其包含(a)容器；(b)该容器上的标签；和(c)物质的组合物，其包含容纳在该容器中的本发明的交叉反应性或双特异性抗体，其中所述容器上的标签标明该物质的组合物可用于治疗炎性或免疫相关疾病。

本发明还涉及本文的抗体在制备治疗炎性或免疫相关疾病的药物中的用途。

附图简述

图1显示天然序列的人IL-17AcDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。

图2显示由图1中显示的SEQ ID NO：1的编码序列获得的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图3显示天然序列的人IL-17F cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。

图4显示由图3中显示的SEQ ID NO：3的编码序列获得的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。

图5A显示IL-17A/F交叉反应性抗体YW248.65、YW240.27、YW241.47、YW271.25、YW278.15、YW278.27、YW278.57、YW278.60、YW279.1和YW280.3的轻链序列(SEQ ID NOs：5-14)的比对。

图5B显示IL-17A/F交叉反应性抗体YW248.65、YW240.27、YW241.47、YW271.25、YW278.15、YW278.27、YW278.57、YW278.60、YW279.1和YW280.3的重链序列(SEQ I NOs：51-60)的比对。

图5C显示IL-17A/F交叉反应性抗体YW278.15.7、YW278.15.8、YW278.15.9、YW279.1.20、YW279.1.21和YW279.1.22的轻链序列(SEQ IDNos：63-68)的比对。

图5D显示IL-17A/F交叉反应性抗体YW278.15.7、YW278.15.8、YW278.15.9、YW279.1.20、YW279.1.21和YW279.1.22的重链序列(SEQ IDNos：69-74)的比对。

图6显示IL-17A/F交叉反应性抗体YW278.15(SEQ ID NO：9)及其亲和力成熟变体，YW278.15.18(SEQ ID NO：15)、YW278.15.2(SEQ ID NO：16)和YW278.15.3(SEQ ID NO：17)的轻链序列的比对。CDRL1、CDRL2和CDRL3序列加框标示。

图7显示IL-17A/F交叉反应性抗体YW278.15(SEQ ID NO：92)及其亲和力成熟变体，YW278.15.18(SEQ ID NO：93)、YW278.15.2(SEQ ID NO：94)、YW278.15.2.D54E(SEQ ID NO：95)、YW278.15.3(SEQ ID NO：92)、YW278.15.18C55A(SEQ ID NO：18)和YW278.15.18C55S(SEQ ID NO：19)的重链序列的比对。CDRL1、CDRL2和CDRL3序列加框标示。注：YW278.15.18C55A和YW278.15.18C55S具有与YW278.15.18相同的轻链。

图8A和8B显示通过三种亲和力成熟的IL-17A/F交叉反应性抗体进行的BIAcore免疫测定的结果。A.对重组人IL-17A(rhIL-17A)、重组人IL-17F(rhIL-17F)、食蟹猴IL-17F和人IL-17A/F在溶液中的结合亲和力(Kd(M))显示于最后一栏。B.对重组人IL-17A(rhIL-17A)、重组人IL-17F(rhIL-17F)、食蟹猴IL-17F、食蟹猴IL-17A(图8B)和人IL-17A/F在溶液中的结合亲和力(Kd(M))显示于最后一栏。

图9显示通过两种进一步亲和力成熟的IL-17A/F交叉反应性抗体与YW278.15.18对比进行的BIAcore免疫测定的结果。对重组人IL-17A(rhIL-17A)、重组人IL-17F(rhIL-17F)、食蟹猴IL-17F和人IL-17A/F在溶液中的结合亲和力(Kd(M))显示于最后一栏。

图10显示通过三种亲和力成熟的IL-17A/F交叉反应性抗体进行的BIAcore免疫测定的结果。对恒河猴IL-17A的结合亲和力显示于最后一栏。

图11显示IL-17A特异性抗体YW264.21(SEQ ID NO：20)和IL-17F特异性抗体YW265.01(SEQ ID NO：21)的轻链可变区序列的比对。

图12显示IL-17A特异性抗体YW264.21(SEQ ID NO：22)和IL-17F特异性抗体YW265.01(SEQ ID NO：23)的重链可变区序列的比对。

图13A和13B显示对数种IL-17A/F交叉反应性抗体的IC50和IC90数据，以及抑制靶标IL-17A/F多肽的活性所需的抗体摩尔比。

图14显示IL-17A/F双特异性抗体与抗-IL-17A抗体YW264.1和抗-IL-17F抗体YW265.01相比较的IL-17A和IL-17F结合亲和力数据。

图15显示IL-17A/F双特异性抗体(包括抗体YW264.03(SEQ ID NO：61))的轻链可变区序列(SEQ ID NOS61和20-21)的另一种比对。

图16显示IL-17A/F双特异性抗体(包括YW264.03(SEQ ID NO：62))的重链可变区序列(SEQ ID NOS62和22-23)的另一种比对。

图17显示结合至IL-17F二聚体的Fab。

图18显示IL-17F二聚体上对于Fab的表位。

发明详述

I.定义

除非另有定义，本文使用的所有专门术语、符号和其它科学术语意图具有本发明所属领域技术人员普遍理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或易于引用，本文定义了具有补片理解含义的术语，并且本文包含此类定义没有必要解释为其代表了与本领域通常理解的实质上的差异。本文中描述或提到的技术和程序一般得到了本领域技术人员的充分理解，而且利用常规方法得以普遍采用，诸如例如下列文献中记载的广泛应用的分子克隆的方法：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室指南)第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.。如果合适，涉及使用市售的试剂盒和试剂的程序一般根据制造商规定的方案和/或参数进行，除非另有说明。

“天然序列IL-17A/F多肽”包括与衍生自自然界的相应IL-17A/F多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此类天然序列IL-17A/F多肽可从自然界分离，或者可通过重组和/或合成手段生成。术语“天然序列IL-17A/F多肽”具体涵盖天然存在的截短或分泌形式的特定IL-17A/F多肽(例如胞外结构域序列)、该多肽的天然存在变体形式(例如选择性剪接形式)和天然存在等位变体。在本发明的多种实施方案中，本文中公开的天然序列IL-17A/F多肽是包含在附图中显示的全长氨基酸序列的成熟或全长天然序列多肽。在该图中，起始和终止密码子以粗体并且下划线显示。

“IL-17A/F多肽变体”指如上文或下文中所定义的有活性的IL-17A/F多肽，其与本文公开的全长天然序列IL-17A/F多肽序列、本文公开的缺少信号肽的IL-17A/F多肽序列、或本文公开的全长IL-17A/F多肽序列的任何其它片段具有至少约80％氨基酸序列同一性。此类IL-17A/F多肽变体包括，例如，其中全长天然氨基酸序列的N-或C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的IL-17A/F多肽。通常，IL-17A/F多肽变体与本文公开的全长天然序列IL-17A/F多肽序列，本文公开的缺少信号肽的IL-17A/F多肽序列，或本文公开的全长IL-17A/F多肽序列的任何其它具体定义的片段将具有至少大约80％的氨基酸序列同一性、备选地至少大约81％的氨基酸序列同一性、备选地至少大约82％的氨基酸序列同一性、备选地至少大约83％的氨基酸序列同一性、备选地至少大约84％的氨基酸序列同一性、备选地至少大约85％的氨基酸序列同一性、备选地至少大约86％的氨基酸序列同一性、备选地至少大约87％的氨基酸序列同一性、备选地至少大约88％的氨基酸序列同一性、备选地至少大约89％的氨基酸序列同一性、备选地至少大约90％的氨基酸序列同一性、备选地至少大约91％的氨基酸序列同一性、备选地至少大约92％的氨基酸序列同一性、备选地至少大约93％的氨基酸序列同一性、备选地至少大约94％的氨基酸序列同一性、备选地至少大约95％的氨基酸序列同一性、备选地至少大约96％的氨基酸序列同一性、备选地至少大约97％的氨基酸序列同一性、备选地至少大约98％的氨基酸序列同一性和备选地至少大约99％的氨基酸序列同一性。通常，IL-17A/F变体多肽为至少大约10个氨基酸的长度，备选地至少大约20个氨基酸的长度，备选地至少大约30个氨基酸的长度，备选地至少大约40个氨基酸的长度，备选地至少大约50个氨基酸的长度，备选地至少大约60个氨基酸的长度，备选地至少大约70个氨基酸的长度，备选地至少大约80个氨基酸的长度，备选地至少大约90个氨基酸的长度，备选地至少大约100个氨基酸的长度，备选地至少大约150个氨基酸的长度，备选地至少大约200个氨基酸的长度，备选地至少大约300个氨基酸的长度，或更长。相同定义适用于变体IL-17A/F多肽的更多变体。

关于本文鉴定的IL-17A/F多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”，定义为将候选序列与具体IL-17A/F多肽序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守取代视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与具体IL-17A/F多肽序列中的氨基酸残基相同的百分数。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定氨基酸序列同一性百分比，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而，为此目的，氨基酸序列同一性％值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比对计算机程序的作者是Genentech，Inc.，该源代码已经随用户文档提交至美国版权局(Washington D.C.，20559)，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众可通过Genentech，Inc.(South SanFrancisco，Calif.)得到ALIGN-2程序，或者从该源代码进行编译。ALIGN-2程序应当为在UNIX操作系统，优选在数字UNIXV4.0D上使用而进行编译。ALIGN-2程序设定了所有序列比对参数并且不变。

在ALIGN-2应用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者这样说：给定氨基酸序列A具有或含有相对于、与或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算：X/Y比值乘以100，其中X是用序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。

除非另外具体说明，在本文用的所有氨基酸序列同一性％的值都是用ALIGN-2计算机程序如前段所描述的那样得到的。然而，氨基酸序列同一性的％值也可以如下面将描述的那样用WU-BLAST-2计算机程序获得(Altschul等人，Methods in Enzymology(酶学方法)266：460-480(1996))。大部分WU-BLAST-2搜索参数设为默认值。那些没有设为默认值的参数，如可调参数，可以用下面的值来设置：重叠跨度(overlap span)＝1，重叠分数(overlap fraction)＝0.125，字阈值(word threshold)(T)＝11，评分矩阵(scoringmatrix)＝BLOSUM62。使用WU-BLAST-2时，氨基酸序列同一性％的值是这样得出的：用由WU-BLAST-2测定的，目的多肽的氨基酸序列(其具有衍生自天然多肽的序列)，和目的比较氨基酸序列(即，与目的多肽比较的序列，该序列可以是IL-17A/F变体多肽)之间完全匹配的氨基酸残基数目(a)，除以目的多肽氨基酸残基总数(b)。例如，在“包含与氨基酸序列B有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列A的多肽”的描述中，氨基酸序列A是目的“比较蛋白质”的比较氨基酸序列，氨基酸序列B是目的多肽的氨基酸序列。

氨基酸序列同一性百分比也可以用序列比对程序NCBI-BLAST2(Altschul等人，Nucleic Acids Res.(核酸研究)25：3389-3402(1997))来测定。NCBI-BLAST2序列比对程序可以从http://www.ncbi.nlm.nih.gov下载，或者从National Institute of Health(国立卫生研究所)，Bethesda，MD.得到。NCBI-BLAST2用数个搜索参数，其中所有这些搜索参数都设为默认值，包括例如未覆盖(unmask)＝是(yes)，链(strain)＝全部(all)，预计出现次数(expected occurrences)＝10，最低复杂度长度(minimum low complexitylength)＝15/5，多次通过e值(multi-pass e-value)＝0.01，多次通过的常数(constant for multi-pass)＝25，最终缺口比对的遗漏(dropoff for final gappedalignment)＝25和评分矩阵＝BLOSUM62。

用NCBI-BLAST2进行氨基酸序列比对时，给定氨基酸序列A相对于、与或针对给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者这样说：给定氨基酸序列A具有或含有相对于、与或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算：X/Y比值乘以100，其中X是用序列比对程序NCBI-BLAST2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。

“IL-17A/F变体多核苷酸”或“IL-17A/F变体核酸序列”指如下文定义的编码有活性的IL-17A/F多肽的核酸分子，并且该核酸分子与编码本文公开的全长天然序列IL-17A/F多肽序列、本文公开的缺少信号肽的全长天然序列IL-17A/F多肽序列、或本文公开的全长IL-17A/F多肽序列的任何其它片段的核苷酸序列具有至少约80％的核酸序列同一性。通常，IL-17A/F变体多核苷酸与编码本文公开的全长天然序列IL-17A/F多肽序列、本文公开的缺少信号肽的全长天然序列IL-17A/F多肽序列、或本文公开的全长IL-17A/F多肽序列的任何其它片段的核苷酸序列将具有至少大约80％的核酸序列同一性、备选地至少大约81％的核酸序列同一性、备选地至少大约82％的核酸序列同一性、备选地至少大约83％的核酸序列同一性、备选地至少大约84％的核酸序列同一性、备选地至少大约85％的核酸序列同一性、备选地至少大约86％的核酸序列同一性、备选地至少大约87％的核酸序列同一性、备选地至少大约88％的核酸序列同一性、备选地至少大约89％的核酸序列同一性、备选地至少大约90％的核酸序列同一性、备选地至少大约91％的核酸序列同一性、备选地至少大约92％的核酸序列同一性、备选地至少大约93％的核酸序列同一性、备选地至少大约94％的核酸序列同一性、备选地至少大约95％的核酸序列同一性、备选地至少大约96％的核酸序列同一性、备选地至少大约97％的核酸序列同一性、备选地至少大约98％的核酸序列同一性和备选地至少大约99％的核酸序列同一性。变体不包括天然核苷酸序列。

通常，IL-17A/F变体多核苷酸为至少大约30个核苷酸的长度，备选地至少大约60个核苷酸的长度，备选地至少大约90个核苷酸的长度，备选地至少大约120个核苷酸的长度，备选地至少大约150个核苷酸的长度，备选地至少大约180个核苷酸的长度，备选地至少大约210个核苷酸的长度，备选地至少大约240个核苷酸的长度，备选地至少大约270个核苷酸的长度，备选地至少大约300个核苷酸的长度，备选地至少大约450个核苷酸的长度，备选地至少大约600个核苷酸的长度，备选地至少大约900个核苷酸的长度，或更长。

关于本文鉴定的IL-17A/F编码核酸序列的“百分比(％)核酸序列同一性”，定义为将候选序列与目的IL-17A/F核酸序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比的序列同一性之后，候选序列中的核苷酸与该目的IL-17A/F核酸序列中的核苷酸相同的百分数。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定核酸序列同一性百分比，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。然而，为此目的，核酸序列同一性％值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生，其中ALIGN-2程序的完整源代码已经随用户资料提交至美国版权局(Washington D.C.，20559)，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众可通过Genentech，Inc.(South San Francisco，Calif.)得到ALIGN-2程序，或者从该源代码进行编译。ALIGN-2程序应当为在UNIX操作系统，优选在数字UNIX V4.0D上使用而进行编译。ALIGN-2程序设定了所有序列比对参数并且不变。

在ALIGN-2应用于核酸序列比较的情况中，给定核酸序列C相对于、与、或针对给定核酸序列D的核酸序列同一性％(或者这样说：给定核酸序列C具有或含有相对于、与或针对给定核酸序列D的某一％核酸序列同一性)如下计算：W/Z比值乘以100，其中W是用序列比对程序ALIGN-2在该程序的C和D比对中评分为相同匹配的核苷酸数，且其中Z是D中的核苷酸总数。可以理解，当核酸序列C与核酸序列D的长度不相等时，C相对于D的核酸序列同一性％将不等于D相对于C的核酸序列同一性％。

除非另外具体说明，在本文用的所有核酸序列同一性％的值都是用ALIGN-2计算机程序如前段所描述的那样得到的。然而，核酸序列同一性的％值也可以如下面将描述的那样用WU-BLAST-2计算机程序获得(Altschul等人，Methods in Enzymology(酶学方法)266：460-480(1996))。大部分WU-BLAST-2搜索参数设为默认值。那些没有设为默认值的参数，即可调参数，可以用下面的值来设置：重叠跨度(overlap span)＝1，重叠分数(overlap fraction)＝0.125，字阈值(word threshold)(T)＝11，评分矩阵(scoringmatrix)＝BLOSUM62。使用WU-BLAST-2时，核酸序列同一性％的值是这样得出的：用由WU-BLAST-2测定的，编码IL-17A/F多肽的目的核酸分子(其具有衍生自编码天然序列IL-17A/F多肽的核酸的序列)的核酸序列，和目的比较核酸序列(即，与编码IL-17A/F多肽的目的核酸分子比较的序列，该序列可以是变体IL-17A/F多核苷酸)之间完全匹配的核苷酸数目(a)，除以编码IL-17A/F多肽的目的核酸分子的核苷酸总数(b)。例如，在“一种分离的核酸分子，其包含与核酸序列B有至少80％核酸序列同一性的核酸序列A”的描述中，核酸序列A是目的比较核酸分子，核酸序列B是编码IL-17A/F多肽的目的核酸分子的核酸序列。

核酸序列同一性百分比也可以用序列比对程序NCBI-BLAST2(Altschul等人，Nucleic Acids Res.(核酸研究)25：3389-3402(1997))来测定。NCBI-BLAST2序列比对程序可以从http://www.ncbi.nim.nih.gov下载，或者从National Institute of Health(国立卫生研究所)，Bethesda，Md.得到。NCBI-BLAST2用数个搜索参数，其中所有这些搜索参数都设为默认值，包括例如未覆盖(unmask)＝是(yes)，链(strain)＝全部(all)，预计出现次数(expected occurrences)＝10，最低复杂度长度(minimum low complexitylength)＝15/5，多次通过e值(multi-pass e-value)＝0.01，多次通过的常数(constant for multi-pass)＝25，最终缺口比对的遗漏(dropoff for final gappedalignment)＝25和评分矩阵＝BLOSUM62。

用NCBI-BLAST2进行核酸序列比较时，给定核酸序列C相对于、与或针对给定核酸序列D的核酸序列同一性％(或者这样说：给定核酸序列C具有或含有相对于、与或针对给定核酸序列D的某一％核酸序列同一性)如下计算：W/Z比值乘以100，其中W是用序列比对程序NCBI-BLAST2在该程序的C和D比对中评分为相同匹配的核苷酸数，且其中Z是D中的核苷酸总数。可以理解，当核酸序列C与核酸序列D的长度不相等时，C相对于D的核酸序列同一性％将不等于D相对于C的核酸序列同一性％。

在其它实施方案中，IL-17A/F变体多核苷酸是编码有活性的IL-17A/F多肽且能够与编码本文中所公开的全长IL-17A/F多肽的核苷酸序列杂交(优选在严格杂交和洗涤条件下杂交)的核酸分子。IL-17A/F变体多肽可以是由IL-17A/F变体多核苷酸编码的那些。

在用于描述本文中所公开的各种多肽时，“分离的”指已经鉴定且与其天然环境的一种成分分开和/或从其回收的多肽。其天然环境的污染性成分指通常会干扰该多肽的诊断或治疗用途的物质，且可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将该多肽纯化至(1)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(2)通过使用考马斯蓝(或优选银染)在非还原性或还原性条件下的SDS-PAGE达到同质化。由于IL-17A/F多肽天然环境的至少一种成分不会存在，因此分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽。然而，分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制备。

编码“分离的”IL-17A/F多肽的核酸或编码其它多肽的核酸指已经鉴定，且与编码该多肽的核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。编码分离的多肽的核酸分子不同于其在自然界中被发现时的形式或情况。编码分离的多肽的核酸分子与存在于天然细胞中时的编码特定多肽的核酸分子有区别。然而，编码分离的多肽的核酸分子包括在通常表达该多肽的细胞中包含的编码多肽的核酸分子，在该细胞中，例如，该核酸分子在与天然细胞中不同的染色体位置中。

术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞能利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。

若核酸与另一核酸序列处于功能性关系中，则该核酸是“可操作连接”的。例如，若前序列或分泌前导序列的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。通常，“可操作连接″指相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导序列的情况中指相邻且处于阅读框中。然而，增强子不必相邻。连接可通过在适宜的限制性位点处的连接反应来实现。如果没有此类位点，那么可依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。

杂交反应的“严格性”可以容易地由本领域普通技术人员确定，而且通常凭经验根据探针长度、洗涤温度、和盐浓度来计算。通常，较长的探针要求较高的温度以正确复性，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新复性的能力。探针和可杂交序列之间所期望的同源性程度越高，可使用的相对温度也越高。因此可以认为，较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释，参见Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验方案)，Wiley Interscience Publishers，(1995)。

本文中所定义的“严格条件”或“高严格性条件”可如下确定：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交过程中采用变性剂，诸如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺及0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH6.5，含750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠，42℃；或(3)采用50％甲酰胺、5XSSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5XDenhardt氏溶液、超声波处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS、和10％硫酸葡聚糖(在42℃中)，在42℃下洗涤，在0.2XSSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺中在55℃下洗涤，接着在含EDTA的0.1XSSC中在55℃下进行高严格性洗涤。

“中等严格条件″可以如Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室指南)，New York：Cold Spring HarborPress，1989所述来确定，包括使用比上文所述较不严格的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的一个例子是于37℃在含20％甲酰胺、5XSSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5X Denhardt氏溶液、10％硫酸葡聚糖、和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，接着在1XSSC中于约37-50℃洗涤滤膜。技术人员将认识到如何根据需要来调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。

术语“带表位标签的”在用于本文时指包含与“标签多肽”融合的IL-17A/F多肽的嵌合多肽。标签多肽具有足够的残基以提供针对其可制备抗体的表位，但又足够短使得其不干扰与其融合的多肽的活性。标签多肽优选还是相当独特的，使得该抗体基本上不与其它表位发生交叉反应性。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基且通常在约8个到约50个氨基酸残基之间(优选在约10个到约20个氨基酸残基之间)。

本文所用的术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应器功能联合起来的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包括具有期望结合特异性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定域序列的融合物，所述期望结合特异性不同于抗体的抗原识别和结合位点(即是“异源”)。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包含受体或配体的结合位点的连续氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可从任何免疫球蛋白获得，诸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。

术语“拮抗剂”以最广义使用，包括部分或完全阻断、抑制、或中和本文中所公开的天然IL-17A/F多肽生物学活性的任何分子。以相似的方式，术语“激动剂”以最广义使用，包括模拟本文中所公开的天然IL-17A/F多肽生物学活性的任何分子。合适的激动剂或拮抗剂分子明确包括激动性或拮抗性抗体或抗体片段、天然IL-17A/F多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、反义寡核苷酸、有机小分子等。用于鉴定IL-17A/F多肽的激动剂或拮抗剂的方法可包括使IL-17A/F多肽接触候选激动剂或拮抗剂分子并测量通常与IL-17A/F多肽有关的一种或多种生物学活性的可检测的变化。

“处理(或“治疗”，treatment)”指治疗性处理及预防性或防护性措施，其中目标是预防或减缓(减轻)目标病理状态或病症的进展。需要治疗的那些受试者包括已经患有病症的那些以及易于于患病的那些或要预防病症的那些。

“长期”施用指与短期模式相反，以连续模式施用一种或多种药剂，从而将初始治疗效果(活性)维持较长一段时间。“间歇”施用指不是无间断连续进行的治疗，而是本质上周期性的。

对于治疗目的而言，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人、非人的高等灵长类动物、家畜和耕畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。哺乳动物优选指人。

“联合”一种或多种其它治疗剂的给药包括同时(共同)和以任意次序的连续给药。

本文所用的“载体”包括药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，其在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学可接受载体的例子包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS^TM。

术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖如单个抗-IL-17A/F或抗-IL-17A或抗-IL-17F单克隆抗体(包括激动性、拮抗性和中和性抗体)，具有多表位特异性的相应的抗体组合物，多克隆抗体，单链抗体，和抗体片段(见下文)，只要它们能展现出所期望的生物学或免疫学活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与抗体可互换使用。

“分离的抗体”指已经鉴定且与其天然环境的一种成分分开和/或从其天然环境的一种成分回收的抗体。其天然环境的污染性成分指会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)通过Lowry方法测定，超过95重量％，最优选超过99重量％的抗体，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)使用考马斯蓝(或优选银染)在还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质化。由于抗体天然环境的至少一种成分不会存在，因此分离的抗体包括重组细胞内原位的抗体。然而，分离的抗体通常通过至少一个纯化步骤来制备。

基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白(IgM抗体由5个基本的异四聚体单元及称作J链的附加多肽组成，因此包含10个抗原结合位点；而分泌型IgA抗体可聚合形成包含2-5个基本的4链单元及J链的多价装配物)。在IgG的情况中，4链单元通常约150,000道尔顿。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而两条重链通过一个或多个二硫键彼此相连，二硫键的数目取决于重链的同种型。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在N-末端具有一个可变结构域(V_H)，接着是三个恒定结构域(C_H)(对于α和γ链的每一个)和四个C_H结构域(对于μ和ε同种型)。每条轻链在N-末端具有一个可变结构域(V_L)，接着是其另一端处的一个恒定结构域(C_L)。V_L与V_H并排在一起，而C_L与重链的第一恒定结构域(C_H1)并排在一起。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。成对的V_H和V_L一起形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见如Basic and Clinical Immunology(基础和临床酶学)，第八版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编辑)，Appleton & Lange，Norwalk，Conn.，1994，第71页和第6章。

来自任何脊椎动物物种的轻链，根据其恒定结构域氨基酸序列，可归入两种称作κ和λ的截然不同类型中的一种。根据其重链(C.sub.H)恒定结构域氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有称作α、δ、ε、γ和μ的重链。根据C_H序列和功能的相对较小差异，γ和α类可进一步分为亚类，例如人表达下列亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。

术语“可变的”指可变结构域中的某些区段在抗体中序列广泛差异的情况。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非跨越于可变结构域的110个氨基酸跨度而均匀分布。事实上，V区由15-30个氨基酸的称作构架区(FR)的相对不变异的区段及将构架区分开的每个长度为9-12个氨基酸的称作“高变区”的高度可变的较短区域构成。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构的一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与来自另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest（免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第五版.Public Health Service(公共卫生署)，NationalInstitutes of Health(国立卫生研究所)，Bethesda，Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，如在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。

术语“高变区″在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补性决定区域”或“CDR”的氨基酸残基(例如V_L中大约为残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)附近，而V_H中大约为1-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)附近；Kabat等人，Sequences of Proteinsof Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第五版.PublicHealth Service(公共卫生署)，National Institutes of Health(国立卫生研究所)，Bethesda，Md.(1991))和/或那些来自“高变环”的残基(例如V_L中为残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，而V_H中为残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)附近；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)196：901-917(1987))。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能少量存在的天然存在的突变之外，构成群体的各个抗体相同。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单一抗原位点。另外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体的优越性体现在它们可合成而不被其它抗体污染。修饰语“单克隆”不能解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可用于本发明的单克隆抗体可通过杂交瘤方法(由Kohler等人，Nature(自然)，256：495(1975)第一次描述)制备，或可通过重组DNA法在细菌、真核细胞动物或植物细胞(参见如，美国专利No.4,816,567)中制备。“单克隆抗体”也可以使用例如在Clackson等人，Nature(自然)，352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。

本文的单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中一部分重链和/或轻链与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，还可以是此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(参见，美国专利No.4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)，81：6851-6855(1984))。本文的目的嵌合抗体包括“灵长类动物化”的抗体，其衍生自非人灵长类动物(例如旧大陆猴(Old World Monkey)、猿等)的可变结构域抗原结合序列，和人恒定区序列。

“完整”抗体是包含抗原结合位点和C.sub.L以及至少重链恒定结构域CH1，CH2和CH3的抗体。该恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，该完整抗体具有一种或多种效应器功能。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利No.5,641,870，实施例2；Zapata等，Protein Eng.(蛋白质工程)8(10)：1057-1062[1995])；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。在优选实施方案中，该片段是“有功能的”，即定性地保留了相应完整抗体结合至靶标IL-17A和IL-17F多肽的能力，并且如果完整抗体也抑制IL-17A/F的生物学活性或功能，也定性地同样保留此类抑制性质。定性地保留的意思是活性在类型上得到维持，但结合亲和力和/或活性的程度可能有差别。

用木瓜蛋白酶消化抗体产生称作“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段，和一个残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。Fab片段由完整轻链及重链可变结构域(V_H)和，一个重链的第一恒定结构域(C_H1)组成。每个Fab片段对于抗原结合是单价的，即它具有一个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大F(ab’)₂片段，它粗略相当于两个通过二硫键相连的Fab片段，具有二价抗原结合活性且仍能够交联抗原。Fab’片段因在C_H1结构域的羧基末端增加了额外的少数残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段有所不同。Fab’-SH是本文中对其中恒定结构域半胱氨酸残基携带一个游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab’)₂抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。

Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基末端部分。抗体的效应器功能是由Fc区中的序列决定的，该区还是由在某些类型细胞上发现的Fc受体(FcR)所识别的部分。

“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此片段由紧密、非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中突出了六个高变环(重链和轻链各3个环)，这些高变环贡献出用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，然而亲和力低于完整结合位点。

“单链Fv”也可缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接成单个多肽链的V.sub.H和V.sub.L抗体结构域的抗体片段。优选的是，sFv多肽还包含在V.sub.H和V.sub.L结构域之间的多肽接头，使得sFv形成用于抗原结合的期望结构。关于sFv的综述参见Pluckthun于The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies(单克隆抗体药理学)，vol.113，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)；Borrebaeck 1995，见下文。

术语“双抗体(diabodies)”是指如下制备的小抗体片段，通过使用短接头(大约5-10个残基)在V_H和V_L结构域之间构建sFv片段(见前段)从而获得该V结构域的链间而非链内配对而产生二价片段，即具有两种抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两种“交叉”的sFv片段的异二聚体，其中该两种抗体的V_H和V_L结构域存在于不同多肽链上。双抗体在例如EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院刊)USA，90：6444-6448(1993)中有更充分的描述。

非人(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人抗体的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自该受体的高变区的残基用具有期望抗体特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区的残基替换。在有些情况中，将人免疫球蛋白的构架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上所有可变结构域，在所述可变结构域中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等人，Nature(自然)321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature(自然)332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.(结构生物学新观点)2：593-596(1992)。

“交叉反应性抗体”是识别超过一种抗原上的相同或相似表位的抗体。因而，本发明的交叉反应性抗体识别IL-17A和IL-17F两者上存在的相同或相似表位。在一个具体实施方案中，交叉反应性抗体使用相同或基本相同的互补位结合至IL-17A和IL-17F两者。优选地，本文的交叉反应性抗体也阻断IL-17A和IL-17F两者的功能(活性)。

术语“互补位(paratope)”用于本文时是指结合至靶标抗原的抗体的部分。

“物种依赖性抗体”例如哺乳动物抗-IL-17A/F抗体是这样的抗体，其对于来自第一哺乳动物物种的抗原比其对于来自第二哺乳动物物种的该抗原的同源物具有更强的结合亲和力。正常地，该物种依赖性抗体“特异性地”结合至人抗原(即具有不超过大约1x10^-7M，优选不超过大约1x10^-8M且最优选不超过大约1x10^-9M的结合亲和力(Kd)值)，但对来自第二非人哺乳动物物种的该抗原的同源物具有的亲和力比其对该人抗原的结合亲和力弱至少大约50倍，或至少大约500倍，或至少大约1000倍。物种依赖性抗原可以是上文定义的多种抗体类型的任何一种，但优选地是人源化的或人抗体。

“结合”目的抗原的抗体是以足以使该抗体用作靶向表达该抗原的细胞或组织的诊断和/或治疗剂的亲和性结合抗原且不显著与其它蛋白交叉反应的抗体。在此类实施方案中，该抗体与“非靶标”蛋白质的结合程度小于该抗体与其特定靶标蛋白结合的约10％，这可通过荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)确定。关于抗体与靶标分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位指可测量出不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可通过例如测定分子的结合并与对照分子的结合比较来确定，所述对照分子通常是结构相似但没有结合活性的分子。例如，特异性结合可通过与对照分子的竞争来测定，所述对照分子与靶标相似，例如过量的未标记靶标。在这种情况中，若经标记靶标与探针的结合受到过量未标记靶标的竞争性抑制，则指示特异性结合。用于本文时，术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位可通过下述分子显示，例如，对该靶标具有的Kd为至少大约10^-4M，备选地至少大约10^-5M、备选地至少大约10^-6M，备选地至少大约10^-7M，备选地至少大约10^-8M，备选地至少大约10^-9M，备选地至少大约10^-10M，备选地至少大约10^-11M，备选地至少大约10^-12M，或更大的分子。在一个实施方案中，该术语“特异性结合”指如下结合，其中分子结合特定多肽或特定多肽上的表位而基本上不结合任何其它多肽或多肽表位。在优选的实施方案中，特异性结合亲和力为至少大约10^-10M。

抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性，且其随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指如下细胞毒性形式，其中结合在某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使这些细胞毒性效应细胞特异性结合至携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死该靶细胞。所述抗体“武装”细胞毒性细胞，而且绝对是这类杀伤所必需的。介导ADCC的主要细胞(NK细胞)只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.(免疫学年度评论)9：457-92(1991)的464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或额外地，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国科学院院刊)95：652-656(1998)所披露的动物模型。

“Fc受体”或“FcR”描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列的人FcR。此外，优选的FcR是与IgG抗体结合的FcR(γ受体)，而且其包括FcγRI，FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和选择性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)(参见综述M.in Daeron，Annu.Rev.Immunol.(免疫学年度评论)15：203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.(免疫学年度评论)9：457-492(1991)；Capel等人，Immunomethods(免疫方法)4：25-34(1994)；和de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.(实验室临床医学杂志)126：330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括未来将会鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体(FcRn)，它负责将母体的IgG转移给胎儿(Guyer等人，J.Immunol.(免疫学杂志)117：587(1976)和Kim等人，J.Immunol.(免疫学杂志)24：249(1994))。

“人效应细胞″指表达一种或多种FcR并执行效应器功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从天然来源，例如从血液分离。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时靶细胞的溶解作用。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合至与其关联抗原结合的(适宜亚类的)抗体起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如Gazzano-Santoro等人，Immunol.Methods(免疫学方法)202：163(1996)所记载的。

词语“标记物”在用于本文时指可检测的化合物或组合物，其与抗体直接或间接缀合从而产生“经标记的”抗体。标记物可以是自身就可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化底物化合物或组合物的可检测的化学改变。

“固相”指本发明的抗体可附着其上的非水性基质。本文中所涵盖的固相的例子包括那些部分或完全由玻璃(例如可控孔径玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅酮制成的固相。在某些实施方案中，根据语境，固相可包括测定板的孔；在其它实施方案中，它指纯化柱(例如亲和色谱柱)。此术语还包括离散颗粒的不连续固相，诸如美国专利No.4,275,149中所述那些。

“脂质体”指由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的小囊泡，其可用于对哺乳动物递送药物(如IL-17A/F多肽或其抗体)。与生物膜的脂质排列相似，脂质体的成分通常排列成双层形式。

为了本文目的当述及IL-17A/F多肽时“有活性的”或“活性”或“功能”是指保留天然或天然存在的IL-17A/F多肽的生物学和/或免疫学活性的IL-17A/F多肽的一种或多种形式，其中“生物学”活性指除诱导针对天然或天然存在的IL-17A/F多肽所具有的抗原性表位的抗体生成外，由天然或天然存在的IL-17A/F多肽造成的生物学功能(或是抑制性的或是刺激性的)，而“免疫学”活性指诱导针对天然或天然存在的IL-17A/F多肽所具有的抗原性表位的抗体生成的能力。一种优选的生物学活性包括诱导激活NF-κB且刺激促炎趋化因子IL-8和IL-6的产生。另一种优选的生物学活性包括刺激外周血单核细胞或CD4⁺细胞。另一种优选的生物学活性包括刺激T淋巴细胞增殖。另一种优选的生物学活性包括，例如，从THP1细胞释放TNF-α。另一种活性包括增强关节软骨中的基质合成。备选地，另一种活性包括促进关节软骨基质降解以及抑制基质合成。另一种优选的生物学活性包括调节炎性肠病的中度至严重阶段期间或卒中期间白介素-17信号传导途径的水平。

关于抗-IL-17A/F(或抗-IL-17A或抗-IL-17F)抗体，术语“有活性的”或“活性”或“功能”及其语法变体，用于指抑制(阻断性或拮抗性抗体)或模拟(激动性抗体)至少一种前述活性的能力。被称为“有功能的”抗体和抗体片段的特征是具有此类性质。

“免疫学”活性仅指诱导抗体产生的能力，该抗体是针对天然或天然存在的IL-17A/F多肽所具有的抗原表位的抗体。

退行性软骨病描述了许多疾病，其特征主要是破坏软骨基质。其他的病理包括一氧化氮产生和蛋白多糖降解的升高。包涵在该定义内的示例性病症包括，例如，关节炎(例如骨关节炎，类风湿性关节炎，银屑病关节炎)。

术语“免疫相关疾病”指由哺乳动物免疫系统成分引起、介导、或以其它方式促成哺乳动物发病的疾病。还包括免疫应答的刺激或干预对疾病发展具有改善作用的疾病。该术语包括免疫介导的炎性疾病、非免疫介导的炎性疾病、感染性疾病、免疫缺陷疾病、瘤形成等。

术语“T细胞介导的疾病”指其中T细胞直接或间接介导或以其它方式促成哺乳动物发病的疾病。T细胞介导的疾病可能与细胞介导的效应、淋巴因子介导的效应等有关，和甚至与B细胞有关的效应，如果B细胞被刺激的话，例如被由T细胞分泌的淋巴因子刺激。

可依照本发明治疗的免疫相关和炎性疾病的例子，其中有些是免疫或T细胞介导的，包括系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，幼年型慢性关节炎，脊柱关节病，系统性硬化病(硬皮病)，特发性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)，舍格伦综合征(Sjogren’s syndrome)，系统性血管炎，结节病，自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白尿)，自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)，甲状腺炎(格雷夫斯病(Graye’s disease)、桥本甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)，糖尿病，免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)，中枢和周围神经系统的脱髓鞘疾病诸如多发性硬化、特发性脱髓鞘性多神经病或急性特发性多神经炎(Guillain-Barresyndrome)、和慢性炎性脱髓鞘多神经病，肝胆疾病诸如传染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、肉芽肿性肝炎、和硬化性胆管炎，炎性肠病(IBD)包括溃疡性结肠炎、局限性回肠炎(Crohn′s disease)、麸质敏感性肠病、和惠普尔氏病(Whipple′s disease)，自身免疫性或免疫介导的皮肤疾病包括大疱性皮肤疾病、多形性红斑和接触性皮炎、银屑病，变应性疾病诸如哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏和荨麻疹，肺的免疫学疾病诸如嗜酸细胞性肺炎、特发性肺纤维化和过敏性肺炎，移植相关疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主疾病，感染性疾病包括病毒疾病如AIDS(HIV感染)、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎和戊型肝炎、疱疹等、细菌感染、真菌感染、原生动物感染和寄生虫感染。

术语“有效量”是IL-17A/F多肽和/或激动剂/拮抗剂导致获得具体说明的目的浓度或量。IL-17A/F多肽或其激动剂或拮抗剂的“有效量”可凭经验来确定。另外，“治疗有效量”是IL-17A/F多肽和/或激动剂/拮抗剂有效获得说明的治疗效果的浓度或量。此量也可凭经验来确定。

II.详细描述

本发明提供制备与IL-17A/F交叉反应的抗体和特异性地结合至IL-17A和IL-17F的双特异性抗体。IL-17A和IL-17F是Th17T细胞亚群分泌的主要促炎性细胞因子。它们靶向几乎体内所有细胞类型并诱导组织炎症和组织损伤。由于这些细胞因子参与炎症，并且特别是免疫相关疾病，如自身免疫性疾病，例如类风湿性关节炎(RA)和炎性肠病(IBD)，期望产生能够阻断IL-17A和IL-17F两者的抗体。本发明提供此类抗体。更具体地，本发明提供与IL-17A和IL-17F交叉反应的抗体以及具有对IL-17A和IL-17F两者的结合特异性的双特异性抗体。

重组产生抗体的一般方法

本文的抗体和其它重组蛋白质可通过重组DNA技术的熟知的技术产生。因此，除了本文具体鉴定的抗体，技术人员能够(例如通过下文描述的技术)产生针对目的抗原的抗体。

根据本发明产生的抗体针对两种目的抗原，IL-17A和IL-17F。本发明的IL-17A/F交叉反应性和双特异性抗体已经通过噬菌体展示技术产生，但是也可使用其它已知用于制备双特异性抗体和具有结合至两种不同抗原的抗原结合区的抗体的技术。

交叉反应性抗体

根据一个实施方案，使具有对IL-17A之一的特异性的抗体发生多样化，从而在保留对IL-17A的特异性的同时其产生对IL-17F的特异性。备选地，使具有对IL-17F的抗体发生多样化，从而在保留对IL-17F的特异性的同时其产生对IL-17A的特异性。总体而言，这种方法包括步骤(1)使抗体轻链可变结构域(V_L)的氨基酸序列多样化，其中在多样化之前，抗体包含能够结合至第一IL-17蛋白(IL-17A或IL-17F)上的表位的V_L和重链可变结构域(V_H)，和(2)选择这样的多样化抗体，该抗体能够结合至第一IL-17蛋白(IL-17A或IL-17F)上的表位和第二IL-17蛋白(IL-17F或IL-17A)上的表位。这种方法的详细描述在2008年3月20日公开的公开号为No.20080069820的共同待决申请中提供，其公开的全文通过引用明确合并于本文。在实施例1中示例性说明了产生IL-17A/F交叉反应性抗体的具体产生和选择方法。

双特异性抗体

根据另一个实施方案，对两种IL-17多肽(IL-17A和IL-17F)具有特异性的抗体从注射以IL-17A和IL-17F的非人哺乳动物(如小鼠或大鼠)中分离。

用于制备双特异性抗体的方法是本领域中已知的。全长双特异性抗体的传统制备基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein等人，Nature(自然)，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤)生成了潜在有10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和色谱步骤进行的对正确分子的纯化，相当麻烦，且产物产量低。WO93/08829及Traunecker等人，EMBO J.(欧洲分子生物学学会志)，10：3655-3659(1991)中公开了类似的流程。

根据W096/27011中描述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，从而使从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少一部分抗体恒定结构域的C_H3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链，从而在第二抗体分子的界面上产生与一个或多个大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了提高异二聚体，而不是其它不想要的终产物如同型二聚体的产量的机制。

双特异性抗体包括交联或“异源缀合”抗体。例如，异源缀合物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体被建议用于使免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO91/00360，WO92/200373和EP03089)。可使用任何适宜的交联方法制备异源缀合抗体。合适的交联剂是本领域公知的，并且连同许多交联技术一起公开于美国专利No.4,676,980中。

关于制备双特异性抗体的综述，参见例如Holliger，P.和Winter，G.，Curr.Opin.Biotechnol.(生物技术新观点)4，446-449(1993)；Carter，P.等人，J.Hematotherapy(血液疗法)4，463-470(1995)；和Pluckthun，A.和Pack，P.，Immunotechnology(免疫技术)3，83-105(1997)。双特异性和/或二价性已经通过如下方法获得，通过柔性接头、亮氨酸拉链基序、异二聚化融合两个scFv分子，并通过scFv分子的缔合从而形成二价单特异性双抗体和相关结构。

因此，例如，为了产生双特异性抗体，人们可从两个单特异性抗体(例如，抗-IL-17A和抗-IL-17F抗体)开始。然后，可分离抗体的两臂并共价重新结合以形成双特异性抗体。此类双特异性抗体可包含共有的Fc部分和来自于每个亲本分子的Fab部分。因此，一个Fab部分对受体亚基之一是特异性的，且另一个对不同受体亚基是特异性的。当然，起始物质不必是完整的二价抗体。例如，它们可以是片段例如Fab片段，或进一步包含一个或多个重链CH2和/或CH3结构域的Fab片段(例如F(ab＝)2片段)。

也可使用化学键来制备双特异性抗体。Brennan等人，Science(科学)229：81(1985)描述了一种方法，其通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)₂片段。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab’-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。在又一个实施方案中，直接从大肠杆菌中回收的Fab′-SH片段可在体外被化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等人，J.Exp.Med.(实验医学杂志)175：217-225(1992)。

双特异性抗体包括交联或“异源缀合”的抗体。例如，异源缀合物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。可使用任何适宜的交联方法制备异源缀合抗体。合适的交联剂是本领域公知的，并且连同许多交联技术一起公开于美国专利No.4,676,980中。

还已使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体。Kostelny等人，J.Immunol.(免疫学杂志)148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′-部分连接。抗体同型二聚体在铰链区还原而形成单体，然后重新氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同型二聚体。由Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)90：6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头连接至轻链可变结构域(V_L)的重链可变结构域(V_H)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的V_H和V_L结构域与另一个片段上的互补的V_L和V_H结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等人，J.Immunol.(免疫学杂志)152：5368(1994)。备选地，双特异性抗体可以是如Zapata等人Protein Eng(蛋白质工程).8(10)：1057-1062(1995)所述产生的“线性”抗体。

多种常规方法中的任何一种可用于化学偶联(交联)两条多肽链(例如抗体结构部分)。共价结合可通过直接缩合现有侧链(例如在两个半胱氨酸残基之间形成二硫键)或通过并入外部桥接分子而获得。许多二价或多价试剂在偶联多肽中是有用的。关于可用于化学交联抗体的一些方法的描述，参见例如Cao等人(1988)Bioconjugate Chemistry(生物缀合化学)9，635-644；Shalaby等人(1992)J.Exp.Med.(实验医学杂志)175，217-225；Glennie等人(1987)J.Immunol.(免疫学杂志)139，2367-2375；Jung等人(1991)Eur.J.Immunol.(欧洲免疫学杂志)21，2431-2435；VanDijk等人(1989)Int.J.Cancer(国际癌症杂志)44，738-743；Pierce ImmunoTechnologyCatalog&Handbook(皮尔斯免疫技术目录和手册)(1991)E8-E39；Karpovsky等人(1984)J.Exp.Med.(实验医学杂志)160，1686；Liu等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)82，8648；Kranz等人(1981)，PNAS 78，5807；Perez等人(1986)，J.Exp.Med.(实验医学杂志)163，166-178；Brennan(1986)Biotech(生物技术).4，424；和美国专利Nos.4,676,980，6,010,902和5,959,083。

此外，重组技术可用于产生单链双特异性抗体，例如，如下描述：Whitlow等人(1991)，Methods：A Companion to Methods in Enzymology(方法：酶学方法指南)，Vol.2，第97页；Bird等人(1988)，Science(科学)242，423-426；美国专利No.4,946,778；Pack等人(1993)，Bio/Technology(生物技术)11，1271-77；和Sandhu(1992)，Crit.Rev.Biotech.12，437。特别地，产生双特异性单链抗体的方法在例如美国专利No.5,892,020；Gruber等人(1994).J.Immunol.(免疫学杂志)152，5368-74；Mallender等人(1994).Biochemistry(生物化学)33，10100-10108；Winter等人(1991).Nature(自然)349，293-299；Schmidt等人(1996).International Journal of Cancer(国际癌症杂志)65，538-546；和Thirion等人(1996).Eur.J.of Cancer Prevention(欧洲癌症预防杂志)5，507-511中描述。

制备双特异性抗体的具体方法在本文实施例2中描述。

重组生产抗体

为了重组生产抗体，可以分离编码它的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。在另一个实施方案中，该抗体可通过同源重组产生，例如如美国专利No.5,204,244中所描述，其通过引用具体并入本文。可使用常规流程容易地分离编码单克隆抗体的DNA并测序(如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体成分一般包括但不限于下述各项中的一种或多种：信号序列，复制起点，一种或多种标记基因，增强子元件，启动子和转录终止序列，例如，如1996年7月9日授权的美国专利No.5,534,615中所描述，并且其通过引用具体并入本文。

用于克隆或表达编码抗体链的DNA的适当宿主细胞包括哺乳动物宿主细胞。对哺乳动物宿主细胞已经有很大兴趣，并且脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的实例有SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)、人胚肾系(293细胞或用于在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等人，J.GenVirol.36：59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)77：4216(1980))、小鼠sertoli细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))、猴肾细胞(CV1，ATCC CCL70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)、水牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A，ATCCCRL1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL75)、人肝细胞(Hep G2，HB8065)、小鼠乳房肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)、TRI细胞(Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.(纽约科学院年报)383：44-68(1982))、MRC5细胞、FS4细胞、和人肝细胞瘤(hepatoma)系(Hep G2)。

使用用于生成抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。

哺乳动物宿主细胞可在多种培养基中培养。可商购的培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、最小必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等人，Meth.Enz.58：44(1979)，Barnes等人，Anal.Biochem.(生物化学年报)102：255(1980)，美国专利Nos.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO90/03430；WO87/00195；或美国再颁专利30,985。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCIN^TM)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以适宜浓度含有本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、pH等是为表达而选择的宿主细胞先前所用的，这对于普通技术人员是显而易见的。

可使用例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱来纯化从细胞制备的抗体组合物，亲和色谱是一种优选的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、人γ2、或人γ4重链的抗体(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.(免疫学方法杂志)62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3((Guss等人，EMBO J.(欧洲分子生物学学会志)5：15671575(1986))。亲和配体所附着的基质最通常是琼脂糖，但是可使用其它基质。机械稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯能获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅石上的色谱、肝素SEPHAROSE^TM上的色谱、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE、疏水相互作用色谱和硫酸铵沉淀。

在任何初步纯化步骤之后，可将含有目的抗体和污染物的混合物进行额外的纯化步骤以获得期望水平的纯度。

人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变结构域。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法(Jones等人，Nature(自然)，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature(自然)，332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science(科学)，239：1534-1536(1988))，通过用啮齿动物CDRs或CDR序列替代人抗体的相应序列来进行。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中基本少于整个人可变结构域被来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下的人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基替代。

用于制备人源化抗体的人可变结构域(包括轻链和重链)的选择，对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳适合(best-fit)″方法，用啮齿动物抗体的可变结构域序列对已知人可变结构域序列的整个文库进行筛选。然后，与啮齿动物最接近的人序列被用作人源化抗体的人FR(Sims等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，151：2296(1993))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚类的所有人抗体的共有序列衍生的特定构架。同一构架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)，89：4285(1992)；Presta等人，J.Immnol.，151：2623(1993))。

更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力以及其它有利的生物学特性。为了实现这一目的，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域熟练技术人员所熟悉。还可获得计算机程序，其能图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得所需抗体特征，如对一种或多种靶抗原的增加的亲和力。通常，CDR残基直接且最实质地参与对抗原结合的影响。

备选地，现在有可能生成转基因动物(例如小鼠)，其在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够由免疫而生成完全的人抗体谱(repertoire)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(J_H)基因的纯合缺失，其能导致内源抗体生成的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到此类种系突变小鼠中将导致在抗原激发后生成人抗体。参见如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)，90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature(自然)，362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Yearin Immuno.，7：33(1993)；和Duchosal等人Nature(自然)355：258(1992)。人抗体也可衍生自噬菌体展示文库(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，222：581-597(1991)；Vaughan等人Nature Biotech(自然：生物技术)14：309(1996))。

治疗用途

本发明的抗体在治疗与IL-17A和/或IL-17F的产生有关的炎性和免疫相关疾病中是有用的。如之前所讨论的，考虑到IL-17A和IL-17F两者的促炎性质，能够高效阻断IL-17A和IL-17F两者的交叉反应性和双特异性抗体提供了炎性和免疫相关疾病(包括自身免疫性疾病)的治疗中的新的治疗机遇。

本发明的交叉反应性和双特异性抗体靶向的示例性炎性和免疫相关疾病可以是但不是必需是免疫或T细胞介导的，包括系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，幼年型慢性关节炎，脊柱关节病，系统性硬化病(硬皮病)，特发性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)，舍格伦综合征(Sjogren’s syndrome)，系统性血管炎，结节病，自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白尿)，自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)，甲状腺炎(格雷夫斯病(Graye’s disease)、桥本甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)，糖尿病，免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)，中枢和周围神经系统的脱髓鞘疾病诸如多发性硬化、特发性脱髓鞘性多神经病或急性特发性多神经炎(Guillain-Barre syndrome)、和慢性炎性脱髓鞘多神经病，肝胆疾病诸如传染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、肉芽肿性肝炎、和硬化性胆管炎，炎性肠病(IBD)包括溃疡性结肠炎、局限性回肠炎(Crohn′sdisease)、麸质敏感性肠病、和惠普尔氏病(Whipple′s disease)，自身免疫性或免疫介导的皮肤疾病包括大疱性皮肤疾病、多形性红斑和接触性皮炎、银屑病，变应性疾病诸如哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏和荨麻疹，肺的免疫学疾病诸如嗜酸细胞性肺炎、特发性肺纤维化和过敏性肺炎，移植相关疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主疾病，感染性疾病包括病毒疾病如AIDS(HIV感染)、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎和戊型肝炎、疱疹等、细菌感染、真菌感染、原生动物感染和寄生虫感染。

在具体实施方案中，抗体用于治疗类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)包括溃疡性结肠炎和局限性回肠炎、哮喘或其它变应性或自身免疫性疾病。

剂量和制剂

可以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用本发明的抗体或抗体片段组合物。在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状况、病症的起因、递送药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排、和医学从业人员知道的其它因素。确定待施用的抗体或抗体片段的“治疗有效量”需要考虑以上因素，这是预防、缓解或治疗靶标疾病(诸如上文列举的疾病和病症中的任何一种)所需的最小量。抗体或抗体片段不是必需而是任选地与目前用于预防或治疗靶标疾病的一种或多种药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于制剂中存在的本发明抗体或抗体片段的量、病症或治疗的类型、和上文讨论的其它因素。这些通常以与上文所用相同剂量和施用途径使用，或是迄今所用剂量的大约1-99％。

一般而言，对靶标疾病的治疗涉及减轻与该靶标疾病相关的一种或多种症状或医学问题，例如，如果靶标疾病是炎性疾病或病症，该治疗可减少和/或减轻与炎症相关的一种或多种症状。

在类风湿性关节炎的情况中，症状包括(非限制性地)肌肉和关节疼痛、强直、肿胀、关节痛或压痛，其中一种或多种可通过施用本发明的抗体减轻。此外，本发明的交叉反应性和双特异性抗-IL-17A/F抗体可预防、减轻或延缓靶标疾病的体征(physical manufestations)。例如，如果靶标疾病是类风湿性关节炎，治疗可预防、减轻、减少或延缓结构损伤(如该疾病特征性的骨质侵蚀和关节损伤)的发展。对于这种适应症，本发明的交叉反应性和双特异性抗体可与临床实践中使用的其它治疗形式(如单独或与甲氨蝶呤联合施用

(利妥昔单抗，rituximab))联用以治疗患有中度-至-重度的活动性类风湿性关节炎(RA)的患者。其它可与本发明的抗体联合的治疗选择非限制性地包括非甾体抗炎药(NSAIDs)、皮质激素、TNF拮抗剂疗法如依那西普(etanercept)、英夫利昔单抗(infliximab)、或阿达木单抗(adalimumab)。

如果靶标疾病是炎性肠病(IBD)，包括溃疡性结肠炎和局限性回肠炎，治疗可预防、减轻、减少或延缓炎症的发展，和/或一种或多种伴随症状包括腹痛、腹泻或便秘、疲倦和发热。通过本发明的交叉反应性和双特异性抗体的治疗可联合处理IBD的传统治疗包括氨基水杨酸盐、皮质激素、抗生素和其它生物或治疗选择如TNF拮抗剂疗法如依那西普、英夫利昔单抗、或阿达木单抗。

治疗制剂可通过将具有期望纯度的活性成分与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences(第20版)，编辑A.Gennaro，2000，Lippincott，Williams & Wilkins，Philadelphia，Pa.)使用本领域已知的标准方法混合而制备。可接受的载体包括盐水或缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇、或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或PEG。

任选地，但优选地，制剂含有药学上可接受的盐，优选为氯化钠，且优选大约为生理浓度。任选地，本发明的制剂可包含药学上可接受的防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂浓度范围在0.1至2.0％，典型地以v/v计。适当的防腐剂包括药学领域中已知的那些。优选的防腐剂是苯甲醇、酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。任选地，本发明的制剂可包含浓度为0.005至0.02％的药学上可接受的表面活性剂。

本文中的制剂还可含有超过一种所治疗的具体适应症所必需的活性化合物，优选具有互补活性且彼此没有不利影响的那些。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合而存在。

活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物递送系统中(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington′sPharmaceutical Sciences，见上文。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质是成形制品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919、L-谷氨酸与L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当封装的抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和可能的免疫原性改变。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫-二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定。

本文描述的抗体和抗体片段依照已知的方法施用给人类受试者，诸如，作为推注或通过一段时间的连续输注的静脉内施用，通过肌肉内的、腹膜内的、脑脊内的、皮下的、关节内的、滑膜内的、鞘内的、经口的、局部的、或吸入途径。如果本文的抗体的拮抗作用与广泛的副作用或毒性相关，局部施用可以是特别期望的。离体(ex vivo)策略也可在治疗性应用中使用。离体策略涉及通过编码抗体或抗体片段的多核苷酸转染或转导从受试者获得的细胞。该转染或转导的细胞然后回输至受试者。该细胞可以是许多类型，包括但不限于造血细胞(例如骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞或B细胞)、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞或肌细胞。

制品和试剂盒

本发明另一个实施方案是制品，其含有在本发明的抗体所靶向的疾病或病症的治疗中有用的材料。该制品包括容器和在容器上或与容器一起的标签或包装说明书(package insert)。适合的容器包括，例如，瓶子、玻璃小瓶、注射器等。所述容器可以由各种材料诸如玻璃或塑料制成。容器装有对于所述病症的治疗有效的组合物，并且可以具有无菌的取用口(例如，所述容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉溶液袋或玻璃小瓶)。组合物中至少一种活性试剂是本发明的交叉反应性或双特异性抗体或抗体片段。标签或包装说明书标明该组合物是用于治疗特定的病症。标签和包装说明书还包括向患者施用该抗体组合物的说明书。也考虑了包含本文描述的联合疗法的制品和试剂盒。

包装说明书是指常规地在治疗产品的商业化包装中包含的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或关于使用此类治疗产品的警告的信息。在一个实施方案中，包装说明书标明该组合物是用于治疗炎性或免疫相关病症，诸如例如上文所列举的病症中的任何一种，包括多种形式的关节炎，例如类风湿性关节炎、炎性肠病(IBD)，其它自身免疫性疾病，或变应性病症，如哮喘。

另外，制品可以进一步包括第二容器，其中装有制药学可接受的缓冲液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户立场出发的其它可取的材料，包括其它的缓冲液、稀释剂、滤器、针和注射器。

认为前文的书面描述足以使本领域技术人员实施本发明。提供下述实施例仅为了说明用途，且无意以任何方式限制本发明的范围。事实上，根据前文描述，对本文显示和描述的发明以外的多种修改对本领域技术人员来说是明显的并落入所附权利要求的范围。

除非另有说明，实施例中提及的商业上可获得的试剂根据厂家的说明书使用。在以下实施例中及在整个说明书中以ATCC登记号鉴定的那些细胞的来源是美国典型培养物保藏中心(American Type CuIture Collection，Manassas，VA)。除非另有说明，本发明使用重组DNA技术的标准程序，如上文描述的和下述教科书中的那些：Sambrook等人，见上文；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验方案)(Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.，1989)；Innis等人，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(PCR实验方案：方法和应用指南)(Academic Press，Inc.：N.Y.，1990)；Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室指南)(Cold Spring Harbor Press：ColdSpring Harbor，1988)；Gait，Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)(IRLPress：Oxford，1984)；Freshney，Animal Cell Culture(动物细胞培养)，1987；Coligan等人，Current Protocols in Immunology(现代酶学实验方案)，1991。

实施例

提供以下实施例仅是为了说明的目的，绝非意图限制本发明的范围。

在本说明书中引用的所有专利和参考文献全文通过引用并入本文。

实施例1

抗-IL-17A/F交叉反应性抗体

材料和方法

文库分选和筛选以鉴定抗-IL-17A/F抗体

人IL-17A(R&D Systems，cat# 317-IL-050/CF)和IL-17F(R&DSystems，cat# 1335-IL-025/CF)用作文库分选的抗原。对于常规分选，噬菌体文库针对单独的IL-17A或IL-17F分选四轮。对于备选的分选，噬菌体文库针对IL-17A和IL-17F可互换地在相互间隔的轮次中分选。Nunc 96孔Maxisorp免疫板在4℃用靶标抗原(10μg/ml)包被过夜，并通过噬菌体封闭缓冲液PBST(磷酸盐缓冲盐水(PBS)和1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)和0.05％(v/v)tween-20)在室温封闭1小时。抗体噬菌体文库VH(参见如Lee等人，J.Immunol.Meth.(免疫学方法杂志)284：119-132，2004)和VH/VL(参见Liang等人，JM.366：815-829，2007)单独添加至抗原板并在室温下孵育过夜。下一天抗原包被的板用PBT(含有0.05％Tween-20的PBS)洗涤十次，结合的噬菌体通过50mM HCl和500mM NaCl洗脱30分钟并通过等体积的1M Tris碱(pH7.5)中和。回收的噬菌体在大肠杆菌(E.coli)XL-1Blue细胞中扩增。在随后的选择轮次中，抗体噬菌体与抗原包被的板的孵育降至2-3小时，板洗涤的严格性逐渐升高。

4轮淘洗之后，观察到显著的富集。从VH和VH/VL每个文库分选中挑选96个克隆以确定它们是否特异性结合至人IL-17A和IL-17F两者。这些克隆的可变区通过PCR测序以鉴定独特序列克隆。

噬菌体抗体的亲和力使用样点竞争ELISA(spot competition ELISA)评级。使用竞争性噬菌体结合ELISA(competitive phage-binding ELISA)进一步确定噬菌体抗体的IC50值。选择具有最高IC50的结合人IL-17A和IL-17F两者的独特噬菌体抗体并重新格式化(reformatted)成全长IgG用于在体外细胞测定中评价。

通过将单个克隆的V_L和V_H区分别克隆至LPG3和LPG4载体，在哺乳动物CHO细胞中瞬时表达，并通过蛋白A柱纯化将感兴趣的克隆重新格式化成IgG。

确定交叉反应性抗体的IC50/90

在第一天将人新生儿包皮成纤维细胞(Invitrogen)以2x104细胞/150μl培养基/孔接种于96-孔板。在第二天培养基替换为含有细胞因子/抗体的培养基(150μl)。重组人IL-17A以5ng/ml使用。重组人IL-17F以50ng/ml使用。重组人IL-17A/F异二聚体自行(in-house)纯化并以25ng/ml使用。24小时后收获上清并进行G-CSF ELISA以测量G-CSF的诱导。数据在PRISM中作图并且使用同样的软件计算IC50/90值。

用于衍生自V _H 文库的克隆的亲和力改善的构建体文库

噬菌粒pW0703(衍生自噬菌粒pV0350-2b(Lee等人，J.Mol.Biol(分子生物学杂志)340，1073-1093(2004))，在所有CDR-L3位点含有终止密码子(TAA)并在M13噬菌体表面上展示单价Fab)用作文库模板，用于从V_H文库移植感兴趣克隆的重链可变结构域(V_H)以用于亲和力成熟。硬性随机化策略和软性随机化策略两者均用于亲和力成熟。对于硬性随机化，具有三个轻链CDR的选定位点的一个轻链文库使用设计用于模拟天然人抗体的氨基酸进行随机化，设计的DNA简并性在Lee等人(J.Mol.Biol(分子生物学杂志)340，1073-1093(2004))中描述。对于软性随机化，位点为CDR-L3的91-94和96，CDR-H1的28-31和34-35，CDR-H2的50，52和53-58，CDR-H3的95-99和100A处的残基被靶向；选定两种不同的CDR环的组合L3/H1/H2和L3/H3进行随机化。为获得软性随机化的条件(其在选定的位点引入大约50％的突变率)，通过支持野生型核苷酸的碱基的70-10-10-10混合物合成突变DNA(Gallop等人，Journal of MedicinalChemistry(医学化学杂志)37：1233-1251(1994))。

产生亲和力改善的噬菌体分选策略

对于亲和力改善选择，对噬菌体文库进行第一轮板分选，然后进行四或五轮溶液分选。该文库分别独自地针对人IL-17A和IL-17F进行分选。对于第一轮板分选，该文库用在1％BSA和0.05％Tween20中大约3O.D./ml的噬菌体输入针对靶标包被板(NUNC Maxisorp plate)在室温下分选2小时。第一轮分选之后，进行溶液分选以增加选择的严格性。对于溶液分选，由第一轮板分选繁殖的1O.D./ml的噬菌体与100nM生物素化的靶标蛋白(浓度基于亲本克隆噬菌体的IC50值)在含有1％Superblock(Pierce Biotechnology)和0.05％Tween20的100μl缓冲液中室温下一起孵育30分钟。混合物进一步通过1％Superblock稀释10X，施用100μl/孔至neutravidin-包被的孔中(5μg/ml)在室温下温和振荡15分钟以便生物素化的靶标结合噬菌体。该孔通过PBS-0.05％Tween20洗涤十次。为确定背景结合，含有具有未生物素化的靶标的噬菌体的对照孔在neutravidin-包被的板上捕获。结合的噬菌体通过0.1N HCl洗脱20分钟，通过1/10体积的1M TrispH11中和、滴定并繁殖以用于下一轮。此后，通过增加的选择严格性一起进行另外五轮的溶液分选。其中第一轮是结合-速率(on-rate)选择，其通过将生物素化靶标蛋白的浓度从10nM降低至1nM进行，其中第二轮是解离-速率(off-rate)选择，其通过添加过量的非生物素化靶标蛋白(多100倍)以将较弱的结合物竞争下来，均在室温下进行。另外，降低噬菌体的输入(0.1～0.5O.D/ml)以降低背景噬菌体的结合。

高通量亲和力筛选ELISA(单样点竞争)

从第五或第六轮筛选中挑选菌落。菌落在37℃于含50μg/ml羧苄青霉素和1E10/ml KO7的150μl/孔的2YT培养基在96-孔板(Falcon)中生长过夜。从相同的板中，挑选XL-1感染的亲本噬菌体的菌落作为对照。96-孔Nunc Maxisorp板通过100μl/孔的人IL-17A和IL-17F(2μg/ml)各自于PBS在4℃下包被过夜或在室温下包被2小时。该板通过65μl的1％BSA封闭30分钟并通过40μl的1％Tween20封闭另外30分钟。

噬菌体上清在100μl总体积中在含有或不含有10nM靶标蛋白的ELISA(酶联免疫吸附测定)缓冲液(含0.5％BSA，0.05％Tween20的PBS)中以1∶10稀释，在室温下于F板(NUNC)中孵育至少1小时。75μl的含有或不含有靶标蛋白的混合物并排转移至靶标蛋白包被的板上。该板温和振荡15分钟以允许将未结合的噬菌体捕获至靶标蛋白包被的板上。该板通过PBS-0.05％Tween20洗涤至少五次。结合通过将辣根过氧化物酶(HR)-缀合的抗-M13抗体加入至ELISA缓冲液(1∶5000)中并于室温孵育30分钟进行定量。该板通过PBS-0.05％Tween20洗涤至少五次。此后，将100μl/孔的1∶1比率的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)过氧化物酶底物和过氧化物酶溶液B(H₂O₂)(Kirkegaard-Perry Laboratories(Gaithersburg，MD))加入至孔中并在室温下孵育5分钟。通过添加100μl 1M磷酸(H₃PO₄)至每孔并允许在室温下孵育5分钟终止反应。使用标准ELISA板读数器在450nm确定每孔中黄色的OD(吸光度)。通过下述方程计算OD的降低(％)。

OD_450nm降低(％)＝[(含竞争物的孔的OD_450nm)/(无竞争物的孔的OD_450nm)]*100

与亲本噬菌体的孔的OD_450nm降低(％)(100％)相比，挑选对人和鼠靶标两者具有低于50％的OD_450nm降低(％)的克隆进行序列分析。对噬菌体制备物选择独特克隆以通过与亲本克隆的比较来确定对于人IL-17A和IL-17F两者的结合亲和力(噬菌体IC50)。然后将亲和力最改善的克隆重新格式化成人IgG1用于产生抗体和进一步的BIAcore结合动力学分析以及其它体外或体内测定。

表征抗IL-17A/F抗体(Biacore)

抗IL-17A/FIgG的结合亲和力通过表面等离子共振(Surface PlasmonResonance，SRP))使用BIAcore^TM-3000仪器测量。抗IL-17A/F人IgG通过包被于CM5生物传感器芯片上的小鼠抗人Fc抗体(GE Healthcare，cat#BR-1008-39)捕获以获得大约200应答单位(response units，RU)。对于动力学测量，人IL-17A(R&D Systems，cat# 317-IL-050/CF)，IL-17F(R&D，cat#1335-IL-025/CF)，IL-17A/F(GNE)，恒河猴IL-17F(GNE)，食蟹猴IL-17A(PUR17200)的两倍连续稀释液(0.98nM至125nM)在25℃以30μl/min的流速注入PBT缓冲液(含0.05％Tween20的PBS)中。使用简单一对一Langmuir结合模型(BIAcore评价软件3.2版(BIAcore Evaluation Softwareversion 3.2))计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(K_D)以比率k_off/k_on计算。

结果

如前面所讨论的，IL-17A和IL-17F是Th17T细胞亚群分泌的主要促炎性细胞因子。它们靶向几乎体内的所有细胞类型并诱导组织炎症和组织损伤。本实施例中描述的工作的目的是产生可高效并具有交叉物种反应性地阻断IL-17A和F两者的交叉反应性抗体。

交叉反应性抗-IL-17A/F克隆的轻链可变区序列显示于图5A(SEQ IDNOs：5-14)中，包括CDRL1、CDRL2和CDRL3序列。交叉反应性抗-IL-17A/F克隆的重链可变区序列显示于图5B(SEQ ID NOs：51-60)中。在交叉反应性克隆中鉴定的YW241.47、YW278.15和YW279.1对同型二聚体和异二聚体两种形式的IL-17A和IL-17F两者均显示特别强的结合。值得注意的是交叉反应性抗体YW278.15和279.1显示几乎对IL-17A和F相等的阻断。这些之中，选定交叉反应性抗体YW278.15进行亲和力成熟。

进一步的交叉反应性抗-17A/F抗体的轻链可变区序列，包括YW278.15和YW279.1的亲和力成熟变体，显示于图5C(SEQ ID Nos：63-68)中。

进一步交叉反应性抗-A/F抗体的重链可变区序列，包括YW278.15和YW279.1的亲和力成熟变体显示于图5D(SEQ ID Nos：69-74)中。

图7显示IL-17A/F交叉反应性抗体YW278.15(SEQ ID NO：92)及其亲和力成熟变体，YW278.15.18(SEQ ID NO：93)、278.15.2(SEQ ID NO：94)、YW278.15.2.D54E(SEQ ID NO：95)、YW278.15.3(SEQ ID NO：92)、YW278.15.18C55A(SEQ ID NO：18)和YW278.15.18C55S(SEQ ID NO：19)的重链序列的比对。CDRL1、CDRL2和CDRL3序列加框标示。YW278.15.18C55A和YW278.15.18C55S具有与YW278.15.18相同的轻链，且在抗体重链中引入C55A和C55S突变以有助于制备。

图8A显示通过三种亲和力成熟的IL-17A/F交叉反应性抗体，YW278.15.2、YW278.15.18和YW278.15.3进行的BIAcore^TM免疫测定的结果。对重组人IL-17A(rhIL-17A)、重组人IL-17F(rhIL-17F)、食蟹猴IL-17F和人IL-17A/F在溶液中的结合亲和力(Kd(M))显示于最后一栏。

图8B显示通过亲和力成熟的IL-17A/F交叉反应性抗体，YW278.15.2.D54E；YW278.15.3；YW278.15.9；YW279.1.20；YW279.1.21；YW279.1.22进行的BIAcore^TM免疫测定的结果。对重组人IL-17A(rhIL-17A)、重组人IL-17F(rhIL-17F)、食蟹猴IL-17A，食蟹猴IL-17F和人IL-17A/F在溶液中的结合亲和力(Kd(M))显示于最后一栏。

图9显示通过两种进一步亲和力成熟的IL-17A/F交叉反应性抗体，YW278.15.18.C55A和YW278.15.18.C55S，与YW278.15.18对比的BIAcore^TM免疫测定的结果。对重组人IL-17A(rhIL-17A)、重组人IL-17F(rhIL-17F)、食蟹猴IL-17F和人IL-17A/F在溶液中的结合亲和力(Kd(M))显示于最后一栏。

图10显示通过三种亲和力成熟的IL-17A/F交叉反应性抗体进行的BIAcore^TM免疫测定的结果，使用恒河猴IL-17A作为靶标。对恒河猴IL-17A的结合亲和力显示于最后一栏。

图13A和13B显示对一组交叉反应性抗体通过重复测定确定的IC50和IC90数据。也显示了抗体对靶标细胞因子的摩尔比。

结果显示通过对IL-17A和IL-17F两者的CDR随机化，YW278.15和279.1的亲和力得以改善。在测试的交叉反应性抗体中，YW278.15.2和YW278.15.18显示在亲和力和细胞阻断活性方面最佳的改善。YW278.15.2和YW278.15.18两者对IL-17A和IL-17F均具有相似的活性。

实施例2

抗-IL-17A/F双特异性抗体

材料和方法

文库分选和筛选以鉴定抗-IL-17A/F抗体

人IL-17A(R&D Systems，cat# 317-IL-050/CF)和IL-17F(R&DSystems，cat#1335-IL-025/CF)用作文库分选的抗原。对于常规分选，噬菌体文库针对单独的IL-17A或IL-17F分选四轮。对于备选的分选，噬菌体文库针对IL-17A和IL-17F可互换地在相互间隔的轮次中分选。Nunc96孔Maxisorp免疫板在4℃用靶标抗原(10μg/ml)包被过夜，并通过噬菌体封闭缓冲液PBST(磷酸盐缓冲盐水(PBS)和1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)和0.05％(v/v)tween-20)在室温封闭1小时。抗体噬菌体文库VH(参见如Lee等人，J.Immunol.Meth.(免疫学方法杂志)284：119-132，2004)和VH/VL(参见Liang等人，JMB.366：815-829，2007)单独添加至抗原板并在室温下孵育过夜。下一天抗原包被的板用PBT(含有0.05％Tween-20的PBS)洗涤十次，结合的噬菌体通过50mM HCl和500mM NaCl洗脱30分钟并通过等体积的1M Tris碱(pH7.5)中和。回收的噬菌体在大肠杆菌(E.coli)XL-1 Blue细胞中扩增。在随后的选择轮次中，抗体噬菌体与抗原包被的板的孵育降至2-3小时，板洗涤的严格性逐渐升高。

噬菌体抗体的亲和力使用样点竞争ELISA评级。噬菌体上清在100μl总体积中在含有或不含有50nM靶标蛋白的ELISA(酶联免疫吸附测定)缓冲液(含0.5％BSA，0.05％Tween20的PBS)中以1∶5稀释，在室温下于F板(NUNC)中孵育至少1小时。75μl的含有或不含有靶标蛋白的混合物并排转移至靶标蛋白包被的板(1ug/ml IL-17A或IL-17F包被过夜)上。该板温和振荡15分钟以允许将未结合的噬菌体捕获至靶标蛋白包被的板上。该板通过PBS-0.05％Tween20洗涤10次。结合通过将辣根过氧化物酶(HR)-缀合的抗-M13抗体加入至ELISA缓冲液(1∶5000)中并于室温孵育30分钟进行定量。该板通过PBS-0.05％Tween20洗涤10次。此后，将100μl/孔的1∶1比率的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)过氧化物酶底物和过氧化物酶溶液B(H₂O₂)(Kirkegaard-Perry Laboratories(Gaithersburg，MD))加入至孔中并在室温下孵育5分钟。通过添加100μl0.1M磷酸(H₃PO₄)至每孔并允许在室温下孵育5分钟终止反应。使用标准ELISA板读数器在450nm确定每孔中黄色的OD(吸光度)。通过下述方程计算OD的降低(％)。

与亲本噬菌体的孔的OD_450nm降低(％)(100％)相比，挑选对IL-17A或IL-17F之一的靶标具有低于60％的OD_450nm降低(％)的克隆并如下将其重新格式化成全长人IG：将单个克隆的V_L和V_H区分别克隆至LPG3和LPG4载体、在哺乳动物CHO细胞中瞬时表达、并通过蛋白A柱纯化。双特异性抗体(该抗体一个臂对IL-17A特异且另一个对IL-17F特异)使用knob-and-hole技术(参见Merchant等人，Nature Biotechnology(自然：生物技术)，16：677-681，1998和Atwell S.等人，J Mol Biol(分子生物学杂志)270(1)：2635(1997))构建。然后将这些单-和双特异性抗体用于在体外细胞测定评价和用于BIAcore结合动力学分析。

表征抗IL-17A/F抗体(Biacore)

抗IL-17A/FIgG的结合亲和力通过表面等离子共振(Surface PlasmonResonance，SRP))使用BIAcore^TM-3000仪器测量。抗IL-17A/F人IgG通过包被于CM5生物传感器芯片上的小鼠抗人Fc抗体(GE Healthcare，cat#BR-1008-39)捕获以获得大约200应答单位(response units，RU)。对于动力学测量，人IL-17A(R&D Systems，cat# 317-IL-050/CF)或IL-17F(R&D，cat# 1335-IL-025/CF)的两倍连续稀释液(0.245nM至500nM)在25℃以30μl/min的流速注入PBT缓冲液(含0.05％Tween20的PBS)中。使用简单一对一Langmuir结合模型(BIAcore评价软件3.2版(BIAcore EvaluationSoftware version 3.2))计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(K_D)以比率k_off/k_on计算。

结果

图14显示IL-17A和IL-17F对IL-17A/F双特异性抗体与抗-IL-17A抗体YW264.21和抗-IL-17F抗体YW265.01相比较的结合亲和力数据。

图15显示IL-17A特异性抗体YW264.21(SEQ ID NO：20)和YW264.03(SEQ ID NO：61)和IL-17F特异性抗体YW265.01(SEQ ID NO：21)的轻链可变区序列的比对。

图16显示IL-17A特异性抗体YW264.21(SEQ ID NO：22)和YW264.03(SEQ ID NO：62)和IL-17F特异性抗体YW265.01(SEQ ID NO：23)的重链可变区序列的比对。

实施例3

IL-17F-Fab复合物的晶体结构

材料和方法

蛋白表达：

IL-17F如Hymowitz SG，等人，EMBO J.(欧洲分子生物学学会志)，2001，20：5332-5341的描述进行表达和纯化。简言之，编码IL-17F的DNA亚克隆至pET15b(Novagen)位点中以引入N-末端His-标签和凝血酶切割位点。在另一个PCR步骤后，编码区亚克隆至杆状病毒转移载体pAcGP67B(PharMingen)中，其然后与BaculoGold DNA(PharMingen)共转染至Sf9细胞中，分离重组病毒并在Sf9细胞中扩增。对于蛋白产生，通过扩增的杆状病毒感染Hi5细胞。通过离心收获培养基并调节pH至7.0。过滤培养基并上样至Ni-NTA柱上。含有IL-17F的级分通过咪唑洗脱、混合并透析至PBS(pH6.5)中，与凝血酶一起在4℃过夜。然后浓缩蛋白样品并在尺寸排阻柱(size exclusion column)上通过纯化除去凝血酶和His-标签。

YW278.15.18.C55S的Fab片段(此后称为“fab”)在大肠杆菌中表达，使用Protein G-Sepharose纯化，并通过0.58％的乙酸洗脱。然后使用SPHiTrap柱(GE Healthcare)通过20mM MES pH5.5和NaCl梯度纯化含有Fab的级分。终缓冲液是25mM Tris，100mM NaCl，pH7.5。

复合物纯化：

纯化的fab与过量的纯化的重组IL17F混合。复合物通过尺寸排阻柱纯化。含有复合物的级分混合并浓缩至25mg/mL。

结晶：

IL-17F-fab复合物使用悬滴汽相扩散结晶。悬滴通过在19℃下混合2ul的蛋白和2ul的well溶液(40％MPD，5％PEG8000和0.1M甲次砷酸钠pH6.5)而形成。孵育5天后结晶生长，洗涤并在液氮中直接在母液中冰冻。

晶体学数据和精修(refinement)：

晶体学数据在位于Stanford Synchtron Radiation Laboratory(斯坦福Synchtron放射实验室)以光束线(beamline)11-1收集。数据集使用HKL包(HKL，Charlottesville，VA)中的程序进行处理。结构如下解析：使用作为检索模型的人源化的4D5Fab的变体(PDB代码1FVE)使用程序PHASER(CCP4)通过分子置换，随后通过REFMAC5(CCP4)精修。最终模型具有优异的几何形状，其中99.6％的所有残基处于拉氏图(Ramachandran plot)的最佳或额外允许区，并且仅0.6％(6个残基)在一般允许或不允许区。

表1 X线数据汇集和精修统计表

*括号内数值针对最高-解析度外围程序(highest-resolution shell)。

图17显示Fab结合至IL-17F二聚体，且图18显示了IL-17F二聚体上对于Fab的表位。该表位以半胱氨酸结点为中心，且在L17A和IL17F之间大部分是保守的(括号中的残基是F和A之间的序列差异)。

认为前文的书面描述足以使本领域技术人员能够实施本发明。本发明不限于所保藏的构建体的范围，因为保藏的实施方案意图作为本发明某些方面的单一示例，且任何功能上等同的构建体均落入本发明的范围。事实上，根据前文描述，对本文显示和描述的发明以外的本发明的多种修改对本领域技术人员来说是明显的，并落入所附权利要求的范围。

Claims

1.一种结合IL-17A的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含三个重链和三个轻链互补性决定区域(CDR)，所述三个重链和三个轻链互补性决定区域包括：

(a)CDRH1，所述CDRH1包含：序列TSYEIS(SEQ ID NO：45)，或SEQ ID NO：62的氨基酸残基30-35，

(b)CDRH2，所述CDRH2包含：序列WVGSIYLWGG(SEQ ID NO：46)，或SEQ ID NO：62的氨基酸残基47-56，和

(c)CDRH3，所述CDRH3包含：序列ARFGQRYA(SEQ ID NO：47)，或SEQ ID NO：62的氨基酸残基96-103，和

(d)CDRL1，所述CDRL1包含序列SISSYLA(SEQ ID NO：25)，

(e)CDRL2，所述CDRL2包含序列GASSRAS(SEQ ID NO：27)，和

(f)CDRL3，所述CDRL3包含序列YYSSPLT(SEQ ID NO：20的氨基酸残基91-97)或SYSSPLT(SEQ ID NO：61的氨基酸残基91-97)。

2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其包含：

(a)CDRH1，所述CDRH1包含序列TSYEIS(SEQ ID NO：45)，

(b)CDRH2，所述CDRH2包含序列WVGSIYLWGG(SEQ ID NO：46)，和

(c)CDRH3，所述CDRH3包含序列ARFGQRYA(SEQ ID NO：47)，和

(d)CDRL1，所述CDRL1包含序列SISSYLA(SEQ ID NO：25)，和

(e)CDRL2，所述CDRL2包含序列GASSRAS(SEQ ID NO：27)，和

(f)CDRL3，所述CDRL3包含序列YYSSPLT(SEQ ID NO：20的氨基酸残基91-97)。

3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其包含：

(a)CDRH1，所述CDRH1包含序列SEQ ID NO：62的氨基酸残基30-35，

(b)CDRH2，所述CDRH2包含SEQ ID NO：62的氨基酸残基47-56，和

(c)CDRH3，所述CDRH3包含SEQ ID NO：62的氨基酸残基96-103，和

(d)CDRL1，所述CDRL1包含序列SISSYLA(SEQ ID NO：25)，

(e)CDRL2，所述CDRL2包含序列GASSRAS(SEQ ID NO：27)，和

(f)CDRL3，所述CDRL3包含SYSSPLT(SEQ ID NO：61的氨基酸残基91-97)。

4.一种结合IL-17A的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区与SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：62具有至少95％序列同一性，所述轻链可变区与SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：61具有至少95％序列同一性。

5.根据权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区与SEQ ID NO：22具有至少95％序列同一性，所述轻链可变区与SEQ ID NO：20具有至少95％序列同一性。

6.根据权利要求5所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区与SEQ ID NO：22具有至少98％序列同一性，所述轻链可变区与SEQ ID NO：20具有至少98％序列同一性。

7.根据权利要求6所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区与SEQ ID NO：22具有至少99％序列同一性，所述轻链可变区与SEQ ID NO：20具有至少99％序列同一性。

8.根据权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：22的重链可变区和SEQ ID NO：20的轻链可变区。

9.根据权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区与SEQ ID NO：62具有至少95％序列同一性，所述轻链可变区与SEQ ID NO：61具有至少95％序列同一性。

10.根据权利要求9所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区与SEQ ID NO：62具有至少98％序列同一性，所述轻链可变区与SEQ ID NO：61具有至少98％序列同一性。

11.根据权利要求10所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区与SEQ ID NO：62具有至少99％序列同一性，所述轻链可变区与SEQ ID NO：61具有至少99％序列同一性。

12.根据权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：62的重链可变区和SEQ ID NO：61的轻链可变区。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其是单克隆的。

14.根据权利要求13所述的抗体或抗原结合片段，其是嵌合的、人源化的或人的。

15.根据权利要求1-12中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其是双特异性的。

16.根据权利要求15所述的抗体或抗原结合片段，其是嵌合的、人源化的或人的。

17.根据权利要求14所述的抗体或抗原结合片段，其中所述片段选自由以下组成的组：Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

18.根据权利要求16所述的抗体或抗原结合片段，其中所述片段选自由以下组成的组：Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

19.根据权利要求13所述的抗体或抗原结合片段，其抑制IL-17A的生物学功能。

20.根据权利要求15所述的抗体或抗原结合片段，其抑制IL-17A的生物学功能。

21.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码根据权利要求13所述的抗体的重链，或其抗原结合片段。

22.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码根据权利要求13所述的抗体的轻链，或其抗原结合片段。

23.一种重组宿主细胞，其包含根据权利要求21所述的核酸。

24.一种重组宿主细胞，其包含根据权利要求22所述的核酸。

25.一种重组宿主细胞，其包含根据权利要求21和权利要求22所述的核酸。

26.根据权利要求23-25中任一项所述的重组宿主细胞，其是真核宿主细胞。

27.根据权利要求26所述的重组宿主细胞，其中所述真核宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

28.根据权利要求23-25中任一项所述的重组宿主细胞，其是原核宿主细胞。

29.根据权利要求28所述的重组宿主细胞，其中所述原核宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞。

30.一种药物组合物，其包含与药学上可接受的赋形剂混合的根据权利要求14所述的抗体或抗体片段。

31.一种药物组合物，其包含与药学上可接受的赋形剂混合的根据权利要求15所述的抗体或抗体片段。

32.根据权利要求15所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其用于制备用于治疗炎性疾病或免疫相关疾病的药物。

33.根据权利要求32所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其中所述炎性疾病或免疫相关疾病选自由以下组成的组：系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，幼年型慢性关节炎，脊柱关节病，系统性硬化病(硬皮病)，特发性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)，舍格伦综合征，系统性血管炎，结节病，自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白尿)，自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)，甲状腺炎(格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)，糖尿病，免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)，中枢和周围神经系统的脱髓鞘疾病，包括多发性硬化、特发性脱髓鞘性多神经病或急性特发性多神经炎和慢性炎性脱髓鞘多神经病，肝胆疾病，包括传染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、肉芽肿性肝炎、和硬化性胆管炎，炎性肠病(IBD)，包括溃疡性结肠炎、局限性回肠炎、麸质敏感性肠病、和惠普尔氏病，自身免疫性或免疫介导的皮肤疾病，包括大疱性皮肤疾病、多形性红斑和接触性皮炎、银屑病，变应性疾病，包括哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏和荨麻疹，肺的免疫学疾病，包括嗜酸细胞性肺炎、特发性肺纤维化和过敏性肺炎，移植相关疾病，包括移植物排斥和移植物抗宿主疾病，感染性疾病，包括病毒性疾病，包括AIDS(HIV感染)和甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎和戊型肝炎、疱疹、细菌感染、真菌感染、原生动物感染和寄生虫感染。

34.根据权利要求33所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其中所述炎性疾病或免疫相关疾病选自由类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)和哮喘组成的组。

35.一种制品，其包含：(a)容器；(b)所述容器上的标签；和(c)物质的组合物，该物质的组合物包含用所述容器容纳的根据权利要求15所述的抗体或抗原结合片段，其中所述容器上的所述标签标明所述物质的组合物可用于治疗炎性疾病或免疫相关疾病。

36.根据权利要求15所述的抗体或抗原结合片段在制备用于治疗炎性疾病或免疫相关疾病的药物中的用途。

37.一种用于治疗炎性疾病或免疫相关疾病的药物组合物，其包含根据权利要求15所述的抗体或抗原结合片段。